WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи







Караваева Ольга Александровна


Детекция бактерий рода Azospirillum с помощью бактериофагов, выделенных из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75

03.01.06 – биотехнология

(в том числе бионанотехнология)

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук






Саратов – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)


Научные руководители:        доктор биологических наук, доцент

Гулий Ольга Ивановна

доктор биологических наук, профессор

Игнатов Олег Владимирович

Официальные оппоненты:        Золотухин Сергей Николаевич

       доктор биологических наук, профессор

ФГБОУ ВПО Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия

имени П. А. Столыпина

профессор кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы

       Ксенофонтова Оксана Юрьевна

       кандидат биологических наук, доцент

ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

доцент кафедры микробиологии и физиологии растений

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН).

Защита состоится «25» декабря 2012 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ».

Автореферат диссертации разослан «  » ноября 2012 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл. 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор                Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы. Одной из актуальных проблем современной биотехнологии является разработка новых подходов для детекции бактерий с помощью бактериофагов (Schofield, Sharp, Westwater, 2012; Smartt et al., 2012; Wang, Ye, Ying, 2012). Этому вопросу посвящено сравнительно большое количество научных статей, однако, развитию методов детекции почвенных микроорганизмов, уделяется недостаточное внимание, хотя роль этих микроорганизмов весьма значительна как для развития фундаментальных исследований, так и для современной сельскохозяйственной биотехнологии.

Важную роль в процессах азотфиксации играют грамотрицательные рост-стимулирующие бактерии рода Azospirillum. Впервые эти бактерии были выделены в Нидерландах более 80-ти лет назад (Beijerinck, 1925), однако в сферу интенсивного изучения попали после опубликования работы «Ассоциативный симбиоз у тропических трав…» (Dbereiner, Day, 1976), став одним из наиболее интенсивно исследуемых ассоциативных партнеров растений (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000; Bashan, Holguin, de-Bashan, 2004). Среди азоспирилл наибольшее внимание исследователей привлекает вид Azospirillum brasilense как модельный объект при изучении ассоциативных и эндофитных ризосимбиозов, образуемых бактериями и высшими растениями (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000; Bashan, Holguin, de-Bashan, 2004; Мулюкин и др., 2009). Эти ризобактерии могут способствовать развитию растений как непосредственно (азотфиксация, гормональный эффект, улучшение минерального и водного питания растений), так и опосредованно, путем подавления развития бактериальных патогенов. В последнее время азоспириллы рассматриваются как перспективный компонент консорциума ризобактерий для инокуляции в качестве компонентов бактериальных удобрений (Чернова, Бурыгин, 2008).

Прогресс в исследовании азоспирилл в качестве экологически безопасных стимуляторов роста растений в значительной степени зависит от развития быстрых и надежных способов определения данных микроорганизмов в почве. Кроме того, значительный интерес при исследовании собственно феномена ассоциативной микрофлоры представляет изучение их сезонных колебаний, а также изменения их численности, вызванные антропогенными воздействиями. В целом, развитие подходов, позволяющих осуществлять мониторинг состава ризосферных бактерий, представляется одной из актуальных задач современной экологической микробиологии (Красов, 2009).

Бактериофаги представляют собой наиболее многочисленную, широко распространенную в биосфере и, предположительно, наиболее эволюционно древнюю группу вирусов (Фильчиков и др., 2009). Бактериофаги широко распространены в природе и выполняют важную роль в контроле численности микробных популяций, в автолизе стареющих клеток, в переносе бактериальных генов, выступая в качестве векторных «систем» (Шестаков, 2007), они представляют собой один из основных подвижных генетических элементов. Несмотря на то, что история изучения и использования бактериофагов имеет много десятилетий, бактериофаги почвенных микроорганизмов изучены мало, хотя их роль в контроле численности бактерий и способствовании переносу генов весьма значительна (Boyer et al., 2008).

Перспективным направлением дальнейших исследований по изучению ассоциативных и эндофитных ризосимбиозов, образуемых бактериями и высшими растениями, является выделение и изучение бактериофагов почвенных микроорганизмов, в том числе бактериофагов Azospirillum brasilense, а также разработка новых методов индикации почвенных бактерий с помощью бактериофагов.

Цель работы выделение и изучение бактериофагов из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75, и их применение для детекции бактерий рода Azospirillum с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:

  1. Выделить бактериофаги из A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 и изучить их биологические свойства.
  2. Исследовать изменения электрооптических параметров микробных суспензий различных штаммов A. brasilense при их инфицировании бактериофагами из A. brasilense штаммов Sp7 и SR75.
  3. Изучить возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для определения спектра литического действия бактериофагов на примере бактерий рода Azospirillum.
  4. Использовать метод электроакустического анализа клеточных суспензий для детекции клеток Azospirillum при их инфицировании специфическими бактериофагами.
  5. Исследовать возможность применения миниантител, специфичных к липополисахариду и флагеллину A. brasilense Sp245, для детекции бактерий с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

Научная новизна работы.

Из микробных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с использованием индуцирующего фактора – низкой температуры выделены бактериофаги
Ab-Sp7 и Ab-SR75. У клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 обнаружено явление лизогении. Представлена характеристика выделенных бактериофагов и определено их таксономическое положение, они относятся к семейству Podoviridae.

Впервые выделенные бактериофаги были использованы для детекции бактериальных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий. На примере микробных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 показано, что с помощью измерения ориентационных спектров микробных суспензий возможно определение спектра литической активности и специфичности действия бактериофагов.

Впервые применены миниантитела для детекции бактерий A. brasilense Sp245 с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа клеточных суспензий. Установлено, что взаимодействие миниантител с бактериальными клетками A. brasilense Sp245 приводит к изменению электрооптических параметров микробной суспензии и изменению величины значения электрического импеданса.

Практическая значимость работы.

Выделение и изучение бактериофагов из клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 открывает перспективы для их использования при разработке высокочувствительных и ускоренных методов детекции гомологичных бактериофагам бактерий.

Материалы, представленные в диссертации, используются при чтении лекций по биотехнологии и микробиологии для студентов и аспирантов в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.И. Вавилова» и ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского».

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. У микробных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 выявлено явление лизогении. Использование индуцирующего фактора – низкой температуры позволяет выделять бактериофаги из A. brasilense штаммов Sp7 и SR75.
  2. Изменения электрооптических параметров микробных суспензий при их инфицировании специфическими бактериофагами позволяют определять литическую активность бактериофагов.
  3. Изменения электрооптических и электроакустических свойств микробных суспензий азоспирилл при их инфицировании специфическими бактериофагами применимы для детекции клеток азоспирилл.
  4. Методы электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий позволяют проводить детекцию бактерий с применением миниантител.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на: 13-ой, 14-ой и 16-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009; 2010; 2012); 5-ой и 6-ой Всероссийских конференциях молодых ученных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010; 2012);
6-ой и 8-ой Молодежных школах-конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010; 2012);
III Региональной научной конференции «Исследование молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2011); 6-ом Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); European Congress of clinical microbiology and infectious disease (London, 2012); IV Съезде биофизиков России. Симпозиуме IV «Новые тенденции и методы в биофизике» (Нижний Новгород, 2012); Международной конференции «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012).

Работа выполнена в лаборатории физиологии микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) в соответствии с плановыми темами НИР «Исследование электрофизических свойств микробных клеток при их инфицировании бактериофагами» 2009-2012 гг. (№ гос. регистрации 01200904393, научный руководитель зав. лаб. д.б.н., профессор Игнатов О.В).

Работа поддержана грантами РФФИ №09-02-12442-офи_м, президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых – докторов наук МД-57.2008.4 (2008-2009 гг.), а также Госконтрактом с СФИРЭ им. В.А. Котельникова РАН, г. Саратов от 05 октября 2009 г. и Госконтрактом с СФИРЭ им. В.А. Котельникова РАН, г. Саратов от 29 июня 2010 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 20 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей объекты, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников, состоящего из 215 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 173 страницах компьютерного текста, включающего 36 рисунков и 13 таблиц.





ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ


ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. В работе использовали микроорганизмы
A. brasilense штаммов Sp7, Cd, Sp107, Sp245, Jm6B2, Br14, KR77, S17, S27, SR55, SR65, SR75, A. amazonense Am14, A. halopraeferans Au4, A. irakense штаммов KBC1, KА3, A. lipoferum штаммов Sp59b, RG20a, Escherichia coli штаммов B-878, XL-1, из коллекции культур Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) (Саратов). Микроорганизмы хранились при +4°С на чашках Петри с картофельным агаром (3%) и пересевались каждые 2 недели.

Условия культивирования микробных клеток: культуры бактерий выращивали в 250 мл колбах Эрленмейера на жидкой среде LB (Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989) – следующего состава (г/л): NaCl (Becton, Dickinson and Company, Франция) – 10,0, пептон (Becton, Dickinson and Company, Франция) – 5,0, дрожжевой экстракт (DIFCO, США) – 5,0. Инкубирование клеток оcуществляли на круговой качалке при интенсивности перемешивания 160 об/мин при температуре 30±1°С в течение 18-20 ч.

Методы. В ходе выполнения работы применяли традиционные методы культивирования микроорганизмов на питательных средах (Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984). Выделение бактериофагов проводили методами, предложенными (Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984). Изучение биологических свойств полученных бактериофагов осуществляли методами, предложенными: (Адамс, 1961; Гольдфарб, 1961; Габрилович, 1968; Ганюшкин, 1988; Пожарникова, 2006; Григорьева, Кузин, Азизбекян, 2007; Васильев и др., 2011). Инфицирование клеток бактериофагом проводили согласно (Bunin et al., 2004b). Изучение электрооптических параметров суспензий клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с использованием выделенных бактериофагов проводили согласно методике (Bunin et al., 2004b). Исследование электроакустических параметров суспензий клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с применением выделенных бактериофагов осуществляли в соответствии с (Зайцев и др., 2011). Селекцию бактериофагов, несущих антитела к целым клеткам, проводили согласно (Charlton et al., 2000). Специфичность и чувствительность выделенных бактериофагов определяли методом дот-анализа (Дыкман, Богатырев, 1997). Титр сыворотки определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа по общепринятой методике (Beatty, Beatty, Vlahos, 1987). Исследование электрооптических параметров суспензии клеток A. brasilense Sp245 при взаимодействии с различным количеством миниантител (миниАт), специфичных к липополисахариду (ЛПС) и флагеллину клеток A. brasilense Sp245, проводили согласно методике (Гулий и др., 2010). Изучение электроакустичеких параметров суспензии клеток A. brasilense Sp245 при взаимодействии с разным количеством миниАт, специфичных к ЛПС клеток
A. brasilense Sp245, по методу (Зайцев и др., 2011).

Кривые на рисунках строились по средним значениям, полученным в результате не менее 5 повторностей. Статистическую обработку результатов измерений проводили стандартным методом (Чарыков, 1984; Лакин, 1990). Для статистической обработки экспериментальных данных также использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel 2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ


Выделение бактериофагов из клеток бактерий Azospirilum brasilense штаммов Sp7 и SR75

Для выполнения исследований изучали возможность выделения бактериофагов из клеток Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75. Для этого предварительно исследовали штаммы на наличие в них профага. Результаты исследований свидетельствуют, что культуры A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 в опытах по выделению бактериофагов без воздействия на них индуцирующего фактора не проявили лизогенных свойств. Во второй серии опытов на культуры A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 воздействовали индуцирующим фактором – низкой температурой, как описано в работах (Лурия, Дарнелл, 1970; Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984). В результате были выделены бактериофаги из клеток
A. brasilense штаммов Sp7 – Ab-Sp7 и SR75 – Ab-SR75 и изучены их биологические свойства. Таким образом, у исследованных культур A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 показано явление лизогении.

Характеристика бактериофагов, выделенных из клеток бактерий
A. brasilense Sp7 и SR75


Морфология негативных колоний


Для определения морфологии негативных колоний высевали исследуемые бактериофаги в разведении 10-7–10-9 на чашки Петри методом агаровых слоев по методу Грациа (Адамс, 1961; Мурадов и др., 1990; Григорьева, Кузин, Азизбекян, 2007). Для формирования газона на поверхности агара использовали клетки штаммов Sp7 и SR75, для каждого выделенного бактериофага, соответственно. Посевы культивировали в термостате при температуре 32°С. Изучение морфологии негативных колоний проводили через 24 часа. Было показано, что бактериофаг Ab-Sp7 на газоне индикаторного штамма Sp7 образует округлые, с ровным четким краем, прозрачные негативные колонии одного типа диаметром от 0,1 до 0,2 см. Бактериофаг Ab-SR75 на газоне индикаторного штамма SR75 образует прозрачные, овальные (вытянутые) негативные колонии, с ровным нечетким краем, диаметром 0,3-0,5 см. Анализ выращенных культур после длительного культивирования (до 5 суток) показал, что пятна остаются прозрачными.

Литическая активность бактериофагов, выделенных из
A. brasilense Sp7 и SR75


Литическая активность бактериофагов оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры и выражается степенью максимального разведения, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки активности бактериофага является определение количества активных корпускул бактериофага в единице объема. Активность бактериофага Ab-Sp7 варьировала от 2105 до 1,61010 корпускул в 1 мл, а бактериофага Ab-SR75 – от 3,5105 до 7,81011 корпускул в 1 мл.

Спектр литической активности бактериофагов, выделенных из
A. brasilense Sp7 и SR75


К основным биологическим свойствам бактериофага, имеющим важное практическое и теоретическое значение, относится диапазон литической активности – спектр лизиса гомологичных бактериофагу бактерий по серологической группе. Определение спектра литической активности проводили методом нанесения капель бактериофага на газон изучаемой культуры, как описано (Адамс, 1961; Ганюшкин, 1988). Изучение спектра литической активности бактериофагов Ab-Sp7 и Ab-SR75 определяли по отношению к 18 штаммам бактерий рода Azospirillum: A. amazonense Am14,
A. brasilense штаммов Sp7, Cd, Sp107, Sp245, Jm6B2, Br14, KR77, S17, S27, SR55, SR65 SR75, A. halopraeferans Au4, A. irakense KBC1, KА3, A. lipoferum штаммов Sp59b и RG20a. Результат считали положительным, если на месте нанесения бактериофага на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов, и, соответственно, результат считали отрицательным при отсутствии лизиса. Результаты исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1 – Сравнение данных по определению спектра литической активности бактериофагов Ab-Sp7 и Ab-SR75 на газоне индикаторных культур бактерий рода Azospirillum и результатов, полученных с помощью метода электрооптического анализа микробных суспензий

Индикаторные штаммы

Действие бактериофага

Ab-Sp7

Ab-SR75

Метод «стекающая капля»

Метод ЭО анализа

Метод «стекающая капля»

Метод ЭО анализа

A. amazonense Am14

+

+

+

+

A. brasilense Sp7

+

+

-

-

A. brasilense Cd

+

+

-

-

A. brasilense Sp107

+

+

-

-

A. brasilense Sp245

-

-

-

-

A. brasilense Jm6B2

-

-

+

+

A. brasilense Br14

+

+

+

+

A. brasilense KR77

+

+

-

-

A. brasilense S17

-

-

-

-

A. brasilense S27

+

+

+

+

A. brasilense SR55

+

+

+

+

A. brasilense SR65

+

+

+

+

A. brasilense SR75

-

-

+

+

A. halopraeferans Au4

+

+

-

-

A. irakense KBC1

+

+

+

+

A. irakense KА3

+

+

+

+

A. lipoferum Sp59b

-

-

-

-

A. lipoferum RG20a

-

-

+

+

Примечание: «+» - наличие лизиса бактериальной культуры;

«-» - отсутствие лизиса бактериальной культуры.

Наряду с традиционными микробиологическими методами в последнее время активное внимание исследователей обращено на создание новых методов определения спектра литической активности бактериофагов, основанных на биосенсорных системах и регистрирующих взаимодействие инфекционных агентов с клетками-мишенями (Schmelcher, Loessner, 2008; Ripp, 2010). Была изучена возможность определения литической активности бактериофагов с помощью метода электрооптического (ЭО) анализа микробных суспензий на примере бактериофагов Ab-Sp7 и Ab-SR75. Методы ЭО анализа микробных суспензий основаны на регистрации изменения оптических свойств микробной суспензии под влиянием переменного электрического поля. При воздействии на бактериальные клетки антителами (Bunin et al., 2004a) и вирусами (Bunin et al., 2004b) происходит изменение ЭО параметров бактериальных суспензий. И наоборот, если вещество или частица присутствует в среде роста, но не взаимодействует с клетками, изменения величины ЭО параметров не происходит (Гулий, 2006; Гулий и др., 2008; Bunin et al., 2004a,b). Измеряя интенсивность рассеянного или прошедшего света, можно количественно охарактеризовать степень пространственной упорядоченности клеток и их электрофизические параметры (Ignatov, Guliy, Bunin, 2008). Спектр литического действия бактериофагов Ab-Sp7 и Ab-SR75 проверяли по отношению к 18 штаммам бактерий рода Azospirillum: A. amazonense Am14,
A. brasilense штаммов Sp7, Cd, Sp107, Sp245, Jm6B2, Br14, KR77, S17, S27, SR55, SR65, SR75, A. halopraeferans Au4, A. irakense KBC1, KA3, A. lipoferum штаммов Sp59b и RG20a. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Сравнительное исследование двух подходов определения спектра литического действия бактериофагов Ab-Sр7 и Ab-SR75 с помощью метода «стекающая капля» и метода ЭО анализа микробных суспензий показывает полное совпадение полученных результатов.

Таким образом, впервые показана возможность использования метода ЭО анализа микробных суспензий для определения литической активности бактериофагов. Полученные результаты в последующем могут быть использованы для развития нового метода определения специфичности действия бактериофагов в отношении микробных клеток.

Специфичность бактериофагов, выделенных из A. brasilense Sp7 и SR75

Необходимым условием для применения бактериофагов в микробиологических целях является отсутствие литического действия в отношении гетерологичных бактерий (специфичность). В качестве гетерологичных культур использовали бактерии родов Escherichia, Pseudomonas, Acinetobacter. Установлено, что изучаемые бактериофаги не вызывали лизис ни одной из испытуемых культур других видов бактерий. На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что бактериофаги Ab-Sp7 и Ab-SR75 не активны в отношении бактерий гетерологичных родов.

Температурная устойчивость бактериофагов, выделенных из
A. brasilense штаммов Sp7 и SR75

Для изучения температурной устойчивости бактериофагов Ab-Sp7 и Ab-SR75 подвергались воздействию высокой температуры от +50 до +90°С с шаговым интервалом в 10°С, при этом время воздействия составляло 30 мин (Адамс, 1961; Васильев и др., 2011). Устойчивость бактериофагов определяли посредством высева бактериальной культуры штаммов Sp7 и SR75, смешанной с суспензией соответствующего бактериофага Ab-Sp7 или Ab-SR75, методом двухслойного агара. В результате было показано, что прогревание бактериофагов Ab-Sp7 и Ab-SR75 до +60°С не оказало существенного влияния на активность бактериофагов (табл. 2). Дальнейшее повышение температуры приводило к незначительной потере активности бактериофагов.

Таблица 2 – Температурная устойчивость бактериофагов Ab-Sp7 и Ab-SR75

Температурный

режим, °С

Активность бактериофага после температурной обработки, количество активных корпускул в 1 мл

Ab-Sp7

Ab-SR75

50

0,6109

0,3107

60

7,3108

8,7107

70

5,9107

1,4107

80

6,6106

7,6106

90

3,2105

6,1106

Контроль активности бактериофага

1,7109

1,1108

Таким образом, можно сделать вывод, что изучаемые бактериофаги
Ab-Sp7 и Ab-SR75 являются термостабильными.


Устойчивость бактериофагов, выделенных из A. brasilense Sp7 и SR75,
к воздействию хлороформа


На следующем этапе изучали влияние хлороформа на активность бактериофагов Ab-Sp7 и Ab-SR75. Для этого бактериофаги обрабатывали хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном перемешивании. При этом время воздействия хлороформа составляло 10, 20, 30 и 40 мин. После чего определяли активность фаголизата исследуемых бактериофагов методом агаровых слоев.

Изучаемые бактериофаги проявили высокую устойчивость к воздействию хлороформа, таким образом, возможно использование хлороформа для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий.

Устойчивость бактериофагов, выделенных из клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75, к воздействию разных значений рН


Для изучения влияния разных значений рН буферного раствора на активность бактериофагов Ab-Sp7 и Ab-SR75 использовали ТЕ буферный раствор (10мМ TrisHCl, 1мМ ЭДТА) со значениями рН: 5,5; 6,5; 8,5; 9,5, при этом время воздействия буферного раствора составляло 18-20 ч. Далее определяли активность исследуемого бактериофага методом Грациа.

Показано, что щелочная и кислая среда буферного раствора незначительно влияли на снижение активности изучаемых бактериофагов. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что бактериофаги Ab-Sp7 и
Ab-SR75 обладают высокой устойчивостью к щелочной и кислой среде буферного раствора.

Активность бактериофагов, выделенных из клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75, при хранении


Изучаемые бактериофаги хранили в ТЕ-буферном растворе (рН 7,5) при температуре -4°С и проверяли способность лизировать индикаторную культуру бактерий штаммов Sp7 и SR75 методом Грациа 1 раз в месяц на протяжении 11 месяцев. В результате проведенных исследований было показано, что бактериофаги Ab-Sр7 и Ab-SR75 сохраняют активность в течение 10 месяцев, при этом титр бактериофага Ab-Sр7 за этот период снижался от 5,2108 до 6,5106 фаговых частиц/мл, а бактериофаг Ab-SR75 – от 2,4108 до 7,3106 фаговых частиц/мл.

Морфология фаговых частиц бактериофагов, выделенных из клеток
A. brasilense Sp7 и SR75, изученная с помощью электронной микроскопии


Для определения систематического положения выделенного бактериофага проводилось его электронно-микроскопическое исследование. Контрастирование осуществляли 1% уранилацетатом в течение 5 мин. Исследования проводили на просвечивающем электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss, Германия).

В результате проведенных исследований было установлено, что вирусные частицы бактериофага Ab-Sр7 имеют изометрическую головку размером около 27 нм и хвостовой отросток размером около 16 нм. Вирусные частицы бактериофага Ab-SR75 состоят из изометрической головки размером около 23 нм и хвостового отростка размером около 17 нм.

В соответствии с морфологическими параметрами, бактериофаги Ab-Sр7 и Ab-SR75, согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Podoviridae (Ackermann, 2007), а по классификации А.С. Тихоненко – ко II морфологической группе: «Фаги с аналогом отростка» (Тихоненко, 1968).

Использование бактериофагов для детекции микробных клеток Azospirillum brasilense с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий

Изучалась возможность использования выделенных бактериофагов для детекции клеток азоспирилл с помощью метода ЭО анализа клеточных суспензий.

Первоначально проводилась оптимизация условий измерения ЭО параметров суспензии клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75, которая включала в себя напряженность электрического поля 17 В/см при времени приложения электрического поля 16 сек и проведение измерений на частотах 740, 1000, 1450, 2000 и 2800 кГц. Электропроводность воды во всех случаях составляла 1,6 µS/m. В предварительных экспериментах было показано, что изменение величины ЭО сигнала происходит при внесении бактериофага из расчета 20 бактериофагов на 1 бактерию, поэтому мы использовали те же условия.

Далее изучали динамику изменений величины ЭО сигнала суспензии клеток A. brasilense Sp7 и A. brasilense SR75 при их инфицировании бактериофагами Ab-Sр7 и Ab-SR75. Для этого в суспензию клеток
A. brasilense Sp7 и A. brasilense SR75 (108 клеток/мл) вносили соответствующий бактериофаг, затем проводили инкубацию при температуре 37°С в течение 1, 5, 10, 20 и 30 минут. При инфицировании клеток A. brasilense штаммов Sp7 (рис. 1 (А)) и SR75 (рис. 1 (Б)) соответствующими бактериофагами наблюдалось изменение величины ЭО сигнала уже через 1 мин от начала инфекции, что, вероятно, связано с адсорбцией бактериофага на поверхности клетки. Следует отметить, что изменения величины ЭО сигнала суспензий клеток
A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 после 5, 10, 20 и 30 мин от начала инфекции клеток бактериофагом фиксировались в пределах 5%.

Рис. 1. Динамика изменений ОС суспензии клеток A. brasilense Sp7 (А) при добавлении бактериофага Ab-Sр7 и суспензии клеток A. brasilense SR75 (Б) при добавлении бактериофага Ab-SR75 из расчета 20 бактериофагов на 1 бактерию: (1) – контроль – суспензия клеток без добавления бактериофагов; время от начала инфекции: (2) –1 мин; (3) – 5 мин; (4) –10 мин; (5) –20 мин; (6) – 30 мин

Одним из важных параметров при развитии нового метода детекции клеток является определение минимального количества детектируемых клеток. Поэтому проводили измерения при количестве клеток в ячейке 106, 104 и 102 клеток/мл. Установлено, что предел детекции микробных клеток
A. brasilense штаммов Sp7 (рис. 2 (А)) и SR75 (рис. 2 (Б)) при их инфекции бактериофагами Ab-Sр7 и Ab-SR75 с помощью метода электрооптического анализа микробных суспензий составляет 104 клеток/мл.







Рис. 2. Изменение величины ЭО сигнала суспензии клеток A. brasilense Sp7 (А) при их инфекции бактериофагом Ab-Sр7 и A. brasilense SR75 (Б) при их инфекции бактериофагом Ab-SR75. Количество клеток в ячейке – 104 клеток/мл. (1) – контроль – суспензия клеток без добавления бактериофагов;
(2) – суспензия клеток с добавлением бактериофагов

Важным этапов в развитии метода детекции клеток является получение аналитического сигнала при наличии мешающих факторов и, прежде всего, в присутствии посторонней микрофлоры. Поэтому нами проводились измерения ЭО параметров суспензии клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 при их инфекции бактериофагами Ab-Sр7 и Ab-SR75, соответственно, в присутствии клеток E. coli штаммов B-878 и XL-1.

Для этого к смешанной суспензии A. brasilense Sp7, E. coli B-878 и E. coli XL-1 и смешанной суспензии A. brasilense SR75, E. coli B-878 и E. coli XL-1 (количество клеток в измерительной ячейке 104 клеток/мл, взятых в равном соотношении (1:1:1), вносили определенный бактериофаг. В качестве контроля использовалась смешанная суспензия A. brasilense Sp7, E. coli B-878 и E. coli XL-1 без внесения бактериофага. В результате было показано, что при инфекции клеток A. brasilense штамма Sp7 бактериофагом Ab-Sр7 (рис. 3 (А)) и клеток штамма SR75 бактериофагом Ab-SR75 (рис. 3 (Б)) в присутствии клеток E. coli В-878 и E. coli XL-1, происходит значительное снижение величины ЭО сигнала.

Дополнительно проводились контрольные эксперименты по изучению неспецифического взаимодействия бактериофагов Ab-Sр7 и Ab-SR75 с клетками E. coli штаммов B-878 и XL-1, при этом было показано, что изучаемые бактериофаги не инфицируют клетки E. coli штаммов B-878 и XL-1.


Рис. 3. (А) Изменение величины ЭО сигнала смешанной суспензии клеток
E. coli B-878 + E. coli XL-1 + A. brasilense Sp7 при добавлении бактериофага Ab-Sр7; (Б) суспензий клеток E. coli B-878 + E. coli XL-1 + A. brasilense SR75, при добавлении бактериофага Ab-SR75. (1) – контроль – суспензия клеток без добавления бактериофагов; (2) – суспензия клеток с добавлением бактериофагов

Полученные результаты показывают возможность использования бактериофагов Ab-Sр7 и Ab-SR75 для детекции микробных клеток с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий в присутствии посторонней микрофлоры.

Использование бактериофагов для детекции микробных клеток Azospirillum brasilense с помощью метода электроакустического анализа микробных суспензий


Принцип действия акустических методов анализа основан на регистрации биологических взаимодействий непосредственно в жидкой суспензии, контактирующей с поверхностью пьезоэлектрика. При добавлении соответствующих реагентов происходит изменение вязкости и проводимости суспензии, что приводит к сдвигу резонансной частоты, которая фиксируется датчиком (Ballato et al., 1986; Smythe, Tiersten, 1988; Khan, Ballato, 2000; Hu et al., 2004; Pinkham et al., 2005; Wark et al., 2007).

Для детекции микробных клеток был использован резонатор с поперечным возбуждающим электрическим полем, с простейшей геометрией электродов, нанесенных на пластину ниобата лития X-среза, разработанный в лаборатории физической акустики Саратовского филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова (г. Саратов). Для подавления нежелательных колебаний использовалось нанесение поглощающего покрытия на определенную область резонатора (Зайцев и др., 2011).

Целью данного этапа исследований являлось использование бактериофагов, выделенных из клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75, для детекции микробных клеток азоспирилл с помощью электроакустического метода анализа микробных суспензий.

Первоначально проводилась оптимизация условий измерения электроакустических параметров. По результатам предварительных экспериментов были выбраны следующие частоты 6-7 МГц, при этом время анализа составляло ~10 мин.

Далее изучали динамику взаимодействия бактериофагов Ab-Sр7 и
Ab-SR75 с клетками A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий. Для этого к суспензии клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 (108 клеток/мл) добавляли изучаемые бактериофаги, инкубацию проводили при температуре 37°С в течении 1, 5, 10, 20 и 30 минут. В результате было установлено, что минимальное время, необходимое для взаимодействия бактериофагов Ab-Sр7 и Ab-SR75 с бактериальными клетками A. brasilense для обоих штаммов составляет ~1 мин.

На следующем этапе исследований определяли минимальное количество детектируемых клеток с использованием бактериофагов Ab-Sр7 и Ab-SR75 при помощи электроакустического датчика. Были проведены измерения при количестве клеток в ячейке 106, 104, и 103 клеток/мл. Для суспензий клеток
A. brasilense штамма Sp7 предел детекции составляет 104 клеток/мл (рис. 4 (А)) и для суспензии клеток штамма SR75 – 103 клеток/мл (рис. 4 (Б)). Показано, что датчик позволяет четко разграничивать ситуации, когда происходит взаимодействие бактериальных клеток со специфическими бактериофагами от контрольных экспериментов, когда такое взаимодействие отсутствует.

Рис. 4. Зависимость значений электрического импеданса суспензии клеток
A. brasilense Sp7 (А) при инфекции бактериофагом Ab-Sр7, количество клеток в ячейке – 104 клеток/мл и суспензии клеток A. brasilense SR75 (Б) при инфекции бактериофагом Ab-SR75, количество клеток в ячейке – 103 клеток/мл. (1) – контроль – суспензия клеток без добавления бактериофагов;
(2) – суспензия клеток с добавлением бактериофагов

Важным моментом в развитии нового метода детекции клеток является получение аналитического сигнала в присутствии посторонней микрофлоры. Проводили измерения частотных зависимостей импеданса для клеточных суспензий A. brasilense Sp7 и A. brasilense SR75 при взаимодействии с бактериофагами Ab-Sр7 и Ab-SR75 в присутствии клеток E. coli XL-1. Для этого к смешанной суспензии клеток A. brasilense Sp7 и E. coli XL-1 и, соответственно, A. brasilense SR75 и E. coli XL-1 (в соотношении 1:1 в обоих случаях) добавляли исследуемый бактериофаг и регистрировали изменения частотных зависимостей импенданса.

В качестве контроля использовалась смешанная суспензия клеток
A. brasilense Sp7 и E. coli XL-1 и A. brasilense SR75 и E. coli XL-1 без добавления бактериофагов. Как видно из полученных данных, при инфекции клеток A. brasilense Sp7 (рис. 5 (А)) и A. brasilense SR75 (рис. 5 (Б)) бактериофагами Ab-Sр7 и Ab-SR75 в присутствии посторонней микрофлоры (клеток E. coli XL-1), происходит изменение значений электрического импеданса.

Дополнительно проводили эксперименты по регистрации изменений значений электрического импеданса клеток E. coli XL-1 при добавлении бактериофагов, выделенных из клеток A. brasilense Sp7 и A. brasilense SR75. При этом было показано, что изменения электрического импеданса в обоих случаях не происходит. Следовательно, бактериофаги Ab-Sр7 и Ab-SR75 не инфицируют бактерии E. coli XL-1.

Рис. 5. (А) Изменение значений электрического импеданса смешанной суспензии клеток A. brasilense Sp7 + E. coli XL-1 при взаимодействии с бактериофагом Ab-Sр7; (Б) смешанной суспензии клеток A. brasilense SR75 + E. coli XL-1 при взаимодействии с бактериофагом Ab-SR75. (1) – контроль – суспензия клеток без добавления бактериофагов; (2) – суспензия клеток с добавлением бактериофагов

Таким образом, впервые показана возможность использования бактериофагов Ab-Sр7 и Ab-SR75 для детекции микробных клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий.

Использование фаговых миниантител к поверхностным антигенам
A. brasilense Sp245 для детекции клеток с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий


Антитела, полученные с помощью технологии фагового дисплея, успешно используются для идентификации бактерий (Williams, Benedek, Turnbough, 2003; Paoli, Chen, Brewster, 2004; Nanduri et al., 2007). Изучалась возможность использования рекомбинаторных фаговых миниантител на антигены клеточной стенки типового штамма A. brasilense Sp245 для детекции клеток с помощью методов электрооптического и акустического анализа клеточных суспензий.

Использование фаговых миниантител к поверхностным антигенам
A. brasilense Sp245 для детекции клеток с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий

Проводили измерения ЭО параметров суспензии клеток A. brasilense Sp245 при взаимодействии с разным количеством фаговых миниантител, специфичных к ЛПС и к флагеллину. Было показано, что при взаимодействии клеток A. brasilense Sp245 с миниАт, специфичными к ЛПС, а также при взаимодействии с миниАт, специфичными к флагеллину, происходят значительные изменения величины ЭО сигнала клеточной суспензии, при этом при увеличении количества внесенных миниАт величина ЭО сигнала значительно не изменялась (рис. 6).

Взаимодействие клеток A. brasilense Sp245 с миниАт, специфичными к ЛПС и к флагеллину клеток A. brasilense Sp245 были подтверждены с помощью электронной микроскопии.

Рис. 6. Зависимость величины ЭО-сигнала суспензии клеток A. brasilense Sp245 от количества анти-ЛПС (А) и антифлагеллиновых миниАт (Б): (1) – контроль – клетки без добавления миниАт, клетки A. brasilense Sp245 с добавлением разного количества миниАт: (2) – 2103, (3) – 4103, (4) – 6103 фаговых частиц/клетку

Таким образом, в результате исследований получены анти-ЛПС миниАт и антифлагеллиновые миниАт, специфичные к клетками A. brasilense Sp245. Установлено, что анти-ЛПС миниАт обладают большей чувствительностью по сравнению с антифлагеллиновыми миниАт в отношении клеток A. brasilense Sp245. Впервые показана возможность использования миниАт для детекции микробных клеток с помощью метода ЭО анализа клеточных суспензий.


Использование миниантител к поверхностным антигенам
A. brasilense Sp245 для детекции клеток с помощью метода электроакустического анализа микробных суспензий


На данном этапе работы проводили исследование возможности регистрации биологических взаимодействий «бактериальные клетки – специфические миниантитела» с помощью электроакустического метода анализа.

Поскольку ранее нами было показано, что анти-ЛПС миниАт обладают большей чувствительностью по сравнению с миниАт на флагеллин, в данной серии экспериментов использовались анти-ЛПС миниАт. Проводили исследования по изучению возможности определения микробных клеток
A. brasilense Sp245 с помощью измерения резонансной частоты при более низких концентрациях клеток в ячейке. Для этого измерения проводились при количестве клеток в ячейке 106; 104; 103, 102 клеток/мл. При этом в качестве контроля использовали дистиллированную воду. Показано, что для суспензий клеток в ячейке 106, 104, 103 клеток/мл внесение соответствующих анти-ЛПС миниАт также существенно меняет значения резонансной частоты и электрического импеданса.

Таким образом, впервые показана возможность использования электроакустического метода анализа клеточных суспензий для детекции микробных клеток при взаимодействии с миниАт. Представленные результаты показывают возможность создания биологического акустического датчика для количественного анализа микробных клеток с пределом детекции ~103 клеток/мл.

Результаты проведенных исследований подтвердили актуальность, большую значимость и дальнейшую перспективность разрабатываемых подходов для применения в микробиологической и биотехнологической промышленности.

ВЫВОДЫ

  1. Из микробных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с использованием индуцирующего фактора – низкой температуры выделены бактериофаги Ab-Sp7 и Ab-SR75. Литическая активность бактериофагов Ab-Sp7 и Ab-SR75 по методу Грациа составила 5,0108 и 3,3108, соответственно. Бактериофаги Ab-Sp7 и Ab-SR75 обладают высокой температурной устойчивостью до +80оС и устойчивостью к воздействию хлороформом в течение 40 минут, сохраняют высокую активность при значении рН буферного раствора в пределах от 6,5 до 8,5 и сохраняют активность при хранении при температуре -4°С в течение 10 месяцев.
  2. Установлено, что выделенные бактериофаги Ab-Sp7 и Ab-SR75 в соответствии с морфологическими параметрами согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Podoviridae, а по классификации А.С. Тихоненко к II морфологической группе: «Фаги с аналогом отростка».
  3. Впервые показана возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для определения литической активности бактериофагов. Показана возможность детекции микробных клеток азоспирилл при их инфекции специфическим бактериофагом с помощью метода электрооптического анализа микробных суспензий. Определен минимальный предел детекции клеток, который составляет 104 клеток/мл.
  4. Впервые исследована возможность использования бактериофагов, выделенных из A. brasilense Sp7 и A. brasilense SR75, для детекции микробных клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий. Показана возможность создания биологического акустического датчика для количественного анализа микробных клеток при их инфекции специфическими бактериофагами с пределом детекции ~103 клеток.
  5. Установлена возможность использования методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий для детекции клеток азоспирилл при их взаимодействии со специфическими бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры.
  6. Впервые определена возможность использования миниантител для детекции микробных клеток с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа клеточных суспензий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. Результаты диссертационных исследований по детекции микроорганизмов с помощью бактериофагов предлагается использовать в учебной работе аспирантов и студентов при изучении дисциплин микробиология, вирусология и биотехнология в ВУЗах и научно-исследовательских институтах РФ.
  2. Определение литической активности бактериофагов рекомендуем проводить согласно «Методическим рекомендациям по определению литической активности бактериофагов с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий» для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии, рекомендованные ученым советом ИБФРМ РАН (протокол №9 от 25.09.2012 г.).
  3. При проведении научных исследований детекцию бактерий рода Azospirillum рекомендуем проводить с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий с использованием выделенных бактериофагов Sp7 и SR75, в том числе в присутствии посторонней микрофлоры.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Электрофизические свойства Azospirillum brasilense после пассажа в растении-хозяине / О.И. Гулий, О.В. Игнатов, О.А. Караваева [и др.] // Экология. Природные ресурсы. Рациональное природопользование. Охрана окружающей среды. Бюллетень Московского общества испытателей природы. 2009. Т. 114, Вып. 3. С. 233-235.
  2. Изменение электрофизических свойств клеток Azospirillum brasilense Sp7 при их связывании с агглютинином зародыша пшеницы / О.И. Гулий, О.А. Караваева, Л.П. Антонюк [и др.] // Биология – наука XXI века: тезисы 13-ой Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых 28 сентября - 2 октября 2009 г. Пущино, 2009. С. 197-198.
  3. Гулий О.И., Караваева О.А., Игнатов О.В. Определение фагочувствительности микробных клеток E. сoli с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий // Биология – наука XXI века: тезисы 14-ой Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых19 - 23 апреля 2010 г. Пущино, 2010. С. 240.
  4. Караваева О.А., Гулий О.И., Игнатов О.В. Определение устойчивости микробных клеток по отношению к бактериофагам с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: материалы V Всероссийской конф. молодых ученых 28 сентября - 1 октября 2010 г. Саратов, 2010. С. 164.
  5. Гулий О.И., Караваева О.А., Игнатов О.В. Использование метода электрооптического анализа клеточных суспензий для определения фагочувствительности бактерий // Актуальные аспекты современной микробиологии: тезисы VI Молодежной школы-конф. с междунар. участием 25-27 октября 2010 г. М.: МАКС Пресс, 2010. С. 176-177.
  6. Электрофизические свойства микробных клеток при индукции бактериофага / О.А. Караваева, О.И. Гулий, С.А. Павлий [и др.] // Вестник Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина. Серия: биология. 2010. № 920, Вып. 12. С. 118-123.
  7. Караваева О.А. Выделение бактериофага из Azospirillum brasilense Sp7 // Исследование молодых ученых в биологии и экологии: сб. науч. тр. 18-21 апреля 2011 г. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2011. Вып. 9. С. 48-51.
  8. Павлий С.А., Караваева О.А., Володин Д.Ю. Использование метода электрооптического анализа клеточных суспензий для определения фагоустойчивости микробных клеток // Исследование молодых ученых в биологии и экологии: сб. науч. тр. 18-21 апреля 2011 г. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2011. Вып. 9. С. 82-85.
  9. Изучение взаимодействия бактериофага с клеточной поверхностью Azospirillum brasilense Sp7 / О.А. Караваева, О.И. Гулий, С.А. Павлий [и др.] // Симбиоз Россия 2011: материалы IV Всероссийского с междунар. участием конгресса студентов и аспирантов-биологов 23-27 мая 2011 г. Воронеж: Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2011. Т. 1. С. 69-70.
  10. Использование метода электрооптического анализа микробных суспензий для определения специфичности бактериофага / О.А. Караваева, О.И. Гулий, С.А. Павлий [и др.] // Известия Саратовского университета. Серия: химия, биология, экология. 2011. Т. 11, Вып. 2. С. 94-98.
  11. Изучение бактериофага Azospirillum brasilense Sp7 / О.А. Караваева, О.И. Гулий, С.А. Павлий [и др.] // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по микробиологии и биотехнологии. 2011. №4/1(38). С. 32.
  12. Preparation of miniantibodies to Azospirillum brasilense Sp245 surface antigens and their use for bacterial detection / L.A. Dykman, S.A. Staroverov, O.I. Guliy, O.V. Ignatov, A.C. Fomin, I.V. Vidyasheva, O.A. Karavaeva [et al.] // Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 2012. Vol. 33 N2. P. 115-127.
  13. Получение фаговых мини-антител и их использование для детекции микробных клеток с помощью электроакустического датчика / О.И. Гулий, Б.Д. Зайцев, И.Е. Кузнецова, А.М. Шихабудинов, О.А. Караваева [и др.] // Биофизика. 2012. Т. 57, Вып. 3. С. 460-467.
  14. Phage mini-antibodies and their use for detection of microbial cells by using electro-acoustic sensor / O. Guliy, B. Zaitsev, I. Kuznetsova, A. Shikhabudinov, O. Karavaeva [et al.] // European Congress of clinical microbiology and infectious disease 31 march-3 april 2012. London, 2012. P. 1393.
  15. Исследование взаимодействия микробных клеток с антителами при помощи резонатора с поперечным электрическим полем / О.И. Гулий, Б.Д. Зайцев, И.Е. Кузнецова, А.М. Шихабудинов, Л.Ю. Матора, С.С. Макарихина, О.А. Караваева [и др.] // Биология – наука XXI века: тезисы 16-ой Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых 16-21 апреля 2012 г. Пущино, 2012. С. 223.
  16. Использование фаговых миниантител для детекции микробных клеток Azospirillum brasilense Sp245 с помощью электроакустического датчика / О.И. Гулий, Б.Д. Зайцев, И.Е. Кузнецова, А.М. Шихабудинов, О.А. Караваева [и др.] // Биология – наука XXI века: материалы Междунар. конф. 24 мая 2012 г. Москва, 2012. С. 207.
  17. Использование электроакутического датчика для детекции микробных клеток при их взаимодействии с миниантителами / О.И. Гулий, Б.Д. Зайцев, И.Е. Кузнецова, А.М. Шихабудинов, О.А. Караваева [и др.] // Новые тенденции и методы в биофизике: материалы докладов IV Съезда биофизиков России. Симпозиум IV 20-26 августа 2012 г. Нижний Новгород, 2012. С. 84.
  18. Выделение бактериофагов из Azospirillum brasilense Sp7 и их применение для детекции азоспирилл / О.А. Караваева, О.И. Гулий, С.С. Макарихина [и др.] // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: материалы VI Всероссийской конф. молодых ученых 24-28 сентября 2012 г. Саратов, 2012. С. 160.
  19. Исследование бактериофага почвенных бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b / С.С. Макарихина, О.И. Гулий, О.А. Караваева [и др.] // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: материалы VI Всероссийской конф. молодых ученых 24-28 сентября 2012 г. Саратов, 2012. С. 37.
  20. Получение мини-антител к поверхностным антигенам Azospirillum brasilense и их использование для детекции микробных клеток / О.И. Гулий, О.А. Караваева, С.С. Макарихина [и др.] // Актуальные аспекты современной микробиологии: тезисы VIII Молодежной школы-конф. 22 - 24 октября 2012 г. Москва, 2012. С.120.
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.