WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

ДЕМИДЮК ИЛЬЯ ВАЛЕРЬЕВИЧ

CТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной генетики Российской академии наук

Научный консультант:

член-корреспондент РАН, Костров Сергей Викторович доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических Кочетков Сергей Николаевич наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярных основ действия физиологически активных соединений Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, профессор кафедры химии природных соединений Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова доктор химических наук, профессор, Ротанова Татьяна Васильевна ведущий научный сотрудник лаборатории химии протеолитических ферментов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН доктор биологических наук, профессор, Машко Сергей Владимирович директор по научной работе ЗАО «Научноисследовательский институт АджиномотоГенетика»

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 29 октября 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на Интернет-сайте ВАК РФ:

http://vak.ed.gov.ru Автореферат разослан «____» ___________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Белки выполняют огромное количество различных функций в каждом живом организме. Вопрос о структурных основах такого функционального многообразия вот уже несколько десятилетий является одним из центральных пунктов науки о белке. Однако, несмотря на достигнутые успехи, мы еще очень далеки от настоящего понимания структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В то же время изучение молекулярных механизмов функционирования имеет не только фундаментальное значение. Белки все шире используются человеком не просто как необходимый компонент рациона, но как способные направленно действовать агенты, прежде всего как промышленные катализаторы и лекарственные средства. В этом контексте знания о структурных основах функционирования – ключ к созданию белковых молекул, обладающих оптимальными для решения прикладных задач свойствами. Кроме того, все более широкое развитие получает направленное конструирование лекарств, для которого информация о структурных детерминантах в молекулах белков-мишеней имеет принципиальное значение.

Среди всего многообразия белков особое место занимают ферменты – белки-катализаторы. С одной стороны, они обеспечивают протекание ключевых биохимических реакций, а, с другой стороны, использование ферментов является одним из основных направлений современной биотехнологии. По имеющимся прогнозам мировой рынок промышленных ферментов достигнет к 2015 году объема в 3,74 миллиарда долларов США.

Основными отраслями, в которых используются ферменты, сегодня являются пищевая и текстильная промышленность, индустрия моющих средств, а также медицина и производство косметических средств. В последние годы наметилось заметное увеличение выпуска ферментов в связи с бурным ростом производства биоэтанола. Промышленное использование ферментов расширяется, в значительной степени, за счет применения инноваций, которые основаны на исследованиях структурно-функциональных взаимосвязей в молекулах белков. Такие исследования дают возможность модифицировать свойства индустриальных ферментов, добиваясь повышения их активности и удешевления целевых продуктов, а также позволяют получать новые рекомбинантные ферменты с заданными свойствами.

Протеазы – белки, катализирующие гидролиз пептидной связи, наряду с большим прикладным значением (они составляют самый крупный сегмент мирового рынка ферментов), играют важную роль в живых системах. Протеазы не просто являются ферментами деградации, вовлеченными в катаболизм белков, но и осуществляют высокоспецифичное расщепление пептидных связей – протеолитический процессинг. Последний определяет активацию или инактивацию различных ферментов, цитокинов, ростовых факторов и гормонов, а также внутри- или внеклеточную локализацию многих белков.

Таким образом, в той или иной степени под управлением протеаз находятся едва ли не все биологические процессы, включая, среди прочих, клеточную пролиферацию и дифференцировку, миграцию клеток, апоптоз и ангиогенез. Неудивительно поэтому, что протеазы вызывают неослабевающий интерес.

Сочетание высокой практической значимости и важной биологической роли протеолитических ферментов стало одним из основных факторов, определивших выбор протеаз в качестве объекта исследования в данной работе, направленной на выяснение новых механизмов функционирования белков.

Цель и задачи работы. Целью работы является изучение молекулярных механизмов, определяющих функционирование протеолитических ферментов.

В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

- построение экспериментальных моделей для исследования молекулярных механизмов функционирования белков на основе химотрипсинподобных и термолизинподобных протеаз (ТПП);

- разработка подходов к экспрессии протеаз, синтезируемых клеткой в виде предшественников;

- исследование роли в распознавании субстрата глутамилэндопептидазой Bacillus intermedius консервативных остатков субстратсвязывающего центра;

- исследование функций пропептида и механизма созревания предшественника глутамилэндопептидазы B. intermedius;

- разработка прототипа ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья;

- биоинформатический анализ структуры предшественников ТПП;

- изучение функций и механизмов действия пропептидов ТПП;

- определение пространственной структуры предшественника ТПП;

- исследование биологических функций протеализина.

Научная новизна. В рамках данной работы получены оригинальные данные о механизмах функционирования химотрипсинподобных и термолизинподобных протеаз.

Все результаты исследования являются новыми. В том числе:

- охарактеризованы новые протеолитические ферменты;

- впервые изучена функциональная роль консервативных остатков субстратсвязывающего центра глутамилэндопептидазы B. intermedius;

- впервые идентифицирована новая группа термолизинподобных протеаз с короткими N-концевыми пропептидами;

- впервые изучены функции коротких N-концевых пропептидов термолизинподобных протеаз и механизм их удаления;

- впервые для металлопротеаз продемонстрирован эффект «белковой памяти»;

- установлена пространственная структура предшественника протеализина – первая структура предшественника ТПП и первая структура протеазы с коротким N-концевым пропептидом;

- впервые продемонстрировано, что ТПП с короткими N-концевыми пропептидами могут определять инвазию клеток эукариот бактериями.

Практическая значимость.

Полученная в ходе работы информация о молекулярных механизмах функционирования протеаз может быть использована для конструирования ферментов с направленно измененными свойствами.

Практическую ценность имеют также реализованные в работе методы получения протеолитических ферментов в гетерологичных экспрессионных системах на основе клеток E. coli и B. subtilis. В частности, оригинальный подход для получения синтезируемых в виде предшественников протеаз с узкой субстратной специфичностью, который основан на создании автопроцессирующихся ферментов путем направленной модификации сайтов их процессинга.

Значительный практический интерес представляют охарактеризованные в работе новые протеолитические ферменты и их штаммы-продуценты. Так, глутамилэндопептидаза B. intermedius может быть использована для ограниченного протеолиза полипептидов при определении первичной структуры, доменной организации и идентификации белков, а также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов. Способность протеализина разрушать соединительную ткань животных при низкой положительной температуре позволяет, в перспективе, использовать этот фермент в различных приложениях, например, при получении культур клеток и тканей животных.

Потенциал протеализина в качестве промышленного катализатора демонстрирует созданный в ходе работы на основе рекомбинантного протеализина прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности.

Разработанный препарат протестирован в условиях опытного производства. Показано, что его использование способствуют формированию более высоких качественных показателей готовых продуктов мясопереработки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На основе охарактеризованных в работе новых термолизинподобных и химотрипсинподобных ферментов, их клонированных генов и экспрессионных систем создана экспериментальная модель для исследования молекулярных механизмов функционирования протеаз.

2. Консервативный элемент субстратсвязывающего центра гутамилэндопептидаз – остаток His213 не является основным элементом распознавания заряда субстрата ферментами группы и, по-видимому, для каждой эволюционной ветви Glu-специфичных протеаз характерна своя система компенсации заряда.

3. Идентифицирована новая группа термолизинподобных протеаз с короткими N-концевыми пропептидами. Изучена структурная организация представителей группы. Установлена пространственная структура предшественника протеализина – первая структура предшественника пептидазы семейства M4 и первая структура протеазы с коротким пропептидом. Показано, что протеазы группы протеализина могут определять инвазию клеток эукариот бактериями.

4. Разработан прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах работ по исследованию глутамилэндопептидаз и на большинстве этапов исследования пептидаз семейства M4 – от постановки задачи и планирования экспериментов, до анализа, обобщения и представления полученных результатов. Экспериментальный материал преимущественно получен при непосредственном участии автора и под его научным руководством. При разработке ферментного препарата эксперименты по исследованию его действия на мясное сырье осуществлены сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии.

Рентгеновские данные с кристаллов протеализина собраны в Курчатовском центре синхротронного излучения и нанотехнологий, а их обработка осуществлена сотрудниками Института кристаллографии РАН. Эксперименты по изучению вовлеченности протеализина в бактериальную инвазию и действия протеализина на актин проведены сотрудниками Института цитологии РАН.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 37 конгрессе IUPAC (Берлин, 1999), международной конференции «Biocatalysis 2000: Fundamentals & Application» (Москва, 2000), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), научно-практической конференции «Современное состояние российской биотехнологии» (Пущино, 2003), международном конгрессе «Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development» (Москва, 2003), конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 2004), XIII Международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), II российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 30 конгрессе FEBS (Будапешт, 2005), IV, V и VI симпозиумах «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 1997, 2002 и 2007), международной конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» (Минск, 2007), I международной научно-практической конференции «Микробная биотехнология – новые подходы и решения» (Казань, 2007), всероссийской научной конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России» (Санкт-Петербург, 2008), международном симпозиуме «Biological Motility: Achievements and Perspectives» (Пущино, 2008), VI и VII национальных конференциях «Рентгеновское, синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии» (Москва, 2007 и 2009), III, IV и V российских симпозиумах «Белки и пептиды» (Пущино, 2007; Казань, 2009; Петрозаводск, 2011).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 254 страницах, содержит 84 рисунка и 15 таблиц. Работа построена по традиционной схеме и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (544 источника).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 оригинальных научных статей, 5 обзоров, а также свыше 70 тезисов научных докладов. По результатам работы получен патент Российской Федерации.

Работа выполнена при участии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова, Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Казанского (Приволжского) федерального университета, Государственного научно-исследовательского институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва), Института кристаллографии РАН (Москва), Института цитологии РАН (Санкт-Петербург), Института биоорганической химии им.

академиков M.M. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва), Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва), Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино), Филиала института химических проблем химической физики (Черноголовка), Всероссийского научно-исследовательского института мясной промышленности им. В.М. Горбатова (Москва), Курчатовского центра синхротронного излучения и нанотехнологий (Москва).

Работа проводилась при поддержке РФФИ (гранты 97-04-50162-а, 00-04-48280-а, 00-04-48281-а, 00-04-48320-а, 01-04-06083-мас, 03-04-48754-а, 03-04-48755-а, 06-0408123-офи, 06-04-48678-а, 09-04-00734-а, 12-04-00961) и программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Структурные детерминанты строгой субстратной специфичности глутамилэндопептидаз 1.1. Создание модели исследований Наиболее эффективным подходом к исследованию молекулярных механизмов функционирования белков является сегодня использование методов белковой инженерии. Применение этой стратегии для изучения механизмов, лежащих в основе строгой субстратной специфичности глутамилэндопептидаз (ГЭПаз), диктует свойства необходимой экспериментальной модели. Такой моделью может стать охарактеризованный с биохимической точки зрения белок, ген которого клонирован, секвенирован и экспрессирован в удобной для генно-инженерных манипуляций гетерологичной системе. Поскольку анализ литературных данных показал, что наиболее перспективными объектами исследований являются глутамилэндопептидазы грамположительных бактерий, нами были осуществлены работы по характеристике и клонированию генов ГЭПаз из этой группы микроорганизмов.

В качестве модельного объекта для исследований молекулярных механизмов функционирования ГЭПаз нами была выбрана ранее охарактеризованная сотрудниками Московского и Казанского государственных университетов глутамилэндопептидаза из B. intermedius 3-19 (BIGEP). Совместно с сотрудниками МГУ и Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов нами были осуществлены работы по клонированию, секвенированию и экспрессии гена BIGEP, а также разработана схема очистки рекомбинантного белка.

Ген глутамилэндопептидазы был клонирован из геномной библиотеки B. intermedius 3-19 и секвенирован (номер доступа в базе данных GenBank – Y15136).

Анализ выведенной из нуклеотидной последовательности первичной структуры BIGEP показал, что ген кодирует предшественник фермента содержащий, кроме участка соответствующего каталитическому домену, сигнальную последовательность и пропептид. Последовательность зрелой BIGEP оказалась наиболее близкой к первичным структурам бациллярных ферментов, сходство с белками стафилококков, стрептомицетов и вирусов было значительно ниже. На основе сравнения первичных структур ГЭПаз были идентифицированы остатки активного центра BIGEP и высказано предположение, что BIGEP и другие бациллярные ГЭПазы имеют сходную организацию S1 участка и механизм компенсации отрицательного заряда субстрата.

Нами была осуществлена гетерологическая экспрессия гена BIGEP в клетках B. subtilis, а также разработана схема очистки белка из культуральной жидкости рекомбинантного продуцента и получен электрофоретически гомогенный препарат фермента.

Аминоконцевая последовательность рекомбинантного белка была идентична определенной ранее для природной BIGEP, установленная методом электрофореза молекулярная масса (23,5 кДа) хорошо совпадала с расчетной, а удельная активность протеазы соответствовала установленной ранее для природного фермента.

Таким образом, нами был клонирован, секвенирован и экспрессирован в клетках B. subtilis ген BIGEP. Разработана схема очистки рекомбинантного белка и продемонстрировано, что по своей структуре и свойствам он соответствует природному белку.

Полученные результаты были использованы при решении простанственной структуры белка, а также позволили применить BIGEP в качестве модельного объекта для исследования молекулярных механизмов функционирования ГЭПаз.

1.2. Модификация субстратсвязывающего сайта глутамилэндопептидазы B. intermedius Наиболее интересным аспектом функционирования ГЭПаз является их строгая специфичность к гидролизу пептидных связей, образованных -карбоксильными группами отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Кажется очевидным, что для узнавания заряда в молекуле субстрата S1 участок фермента (обозначение по Шехтеру и Бергеру) должен нести компенсаторный заряд, как показано для целого ряда случаев.

Однако у ГЭПаз обнаружить консервативный сильноосновный остаток в S1 кармане не удается.

Таблица 1. Значения KM и k при гидролизе Z-AALE-pNa нативной и cat модифицированной глутамилэндопептидазой B. intermedius* KM, мM kcat, с-1 kcat/ KM, с-1M-Нативная BIGEP 0,67 16,6 247Модифицированная BIGEP-T213 3,3 0,027 8,* Стандартное отклонение представленных значений KM и k не превышает 10 %.

cat В то же время рентгеновские структуры, молекулярное моделирование активных центров этих ферментов, а также эксперименты по их направленной модификации демонстрируют, что His213 (нумерация по химотрипсину) – остаток, существенный для функционирования ГЭПаз. Этот остаток, являющийся общей структурной особенностью всех ферментов данной группы, способен нести положительный заряд, и поэтому His2приписывалась роль наиболее вероятного ключевого элемента в распознавании субстрата ГЭПазами.

Гипотеза требовала экспериментальной проверки, однако получить ГЭПазу с заменой в положении 213 другим исследователям не удавалось. Данные, полученные до начала наших работ, демонстрировали чрезвычайную чувствительность ГЭПаз к природе аминокислотного остатка в положении 213. В связи с этим мы подошли к выбору аминокислотной замены с особым вниманием. Анализ первичных и пространственных структур химотрипсинподобных протеаз (ХПП) показывает структурное сходство регионов 208-214, вовлеченных в формирование S1 участка ГЭПаз, у всех ферментов группы.

Причем среднеквадратичное отклонение C атомов остатка 213 не превышает 0,564 в 13 пространственных структурах ХПП млекопитающих, бактерий и вирусов. Среди этих 13 ферментов, не проявляющих Glu-специфичной активности, шесть имеют Val, пять – Thr и по одному – Leu и Met в 213 положении. Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что Thr и Val являются наиболее многообещающими нативоподобными заменами для His213. Из этих двух вариантов нами был выбран Thr, поскольку введение мутации, соответствующей замене His213Val, в ген ГЭПазы Streptomyces griseus не позволило получить мутантный белок в экспрессионной системе, аналогичной примененной нами.

Нами был сконструирован и экспрессирован в клетках лабораторного штамма B. subtilis AJ73 ген BIGEP с двумя нуклеотидными заменами, соответствующими модификации Нis213Тhr. Активный мутантный белок накапливался во внеклеточной среде. Электрофоретически гомогенный мутантный фермент (BIGEP-T213) был выделен из культуральной жидкости. Молекулярная масса BIGEP-T213 (23 кДа) и N-концевая последовательность (VVIGD) были идентичны установленным ранее для нативного белка.

Мутантный фермент гидролизовал азоказеин с удельной активностью 0,6 Ед./мг (для фермента дикого типа 36,8 Ед./мг) и специфический субстрат ГЭПаз Z-AALE-pNA (удельная активность 0,16 Ед./мг), но не специфические субстраты химотрипсина (GlpAAL-pNA) и трипсина (Bz-R-pNA). BIGEP-T213 полностью сохранял активность при инкубации в течение 150 мин при 50C. Потери активности не наблюдалось также при хранении модифицированного фермента при 4C в течение 10 месяцев. Таким образом, нами впервые была получена ГЭПаза с заменой в положении 213 и показано, что модифицированный фермент проявляет каталитическую активность и высокую стабильность.

Субстратная специфичность BIGEP-T213 была оценена по гидролизу окисленной B-цепи инсулина. С помощью масс-спектрометрии и N-концевого секвенирования показано, что в результате действия фермента на субстрат образуется только два фрагмента, соответсвующих гидролизу связи Glu13-Ala14. Каталитические свойства нативной и мутантной BIGEP были изучены по гидролизу Z-AALE-pNa (табл. 1).

Полученные данные демонстрируют, что введение замены His213Thr в молекулу BIGEP не приводит к изменению субстратных предпочтений фермента, что позволяет сделать вывод о том, что His213 не определяет специфичность действия протеазы. В то же время модификация существенно влияет на эффективность катализа. При этом введенная замена относительно мало сказывается на константе Михаэлиса (увеличение KM в 4,9 раза), но сильно влияет на каталитическую константу (уменьшение k в 615 раз).

cat Интересно, что примерно такой же эффект наблюдается в случае гидролиза нативными ГЭПазами субстратов, содержащих остаток Asp в положении P1: KM растет примерно в раз, а падение k имеет тот же порядок (~150 раз).

cat Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют заключить, что консервативный остаток His213 не является ключевым элементом, определяющим распознавание отрицательного заряда боковой цепи остатка в положения P1 субстрата ГЭПзами, но, по-видимому, существенен для точного позиционирования расщепляемой связи относительно нуклеофила – кислорода гидроксильной группы серина каталитического центра. Этот вывод предполагает, что для обеспечения субстратной специфичности ГЭПаз, кроме His213, необходим дополнительный структурный элемент. Анализ пространственных структур ферментов группы показывает, что таким элементом в случае BIGEP и протеазы V8, по-видимому, является -аминогруппа N-концевого остатка фермента, формирующаяся лишь после удаления пропептида.

Для выяснения роли N-концевой аминогруппы в функционировании ГЭПаз может быть предложено два подхода. Первый заключается в получении вариантов зрелых ферментов с модифицированными N-концами. Поскольку удалить N-концевую аминогруппу белка не представляется возможным, то она либо может быть модифицирована химически, либо N-конец фермента может быть удлинен/укорочен на несколько аминокислотных остатков. Второй подход состоит в подробном исследовании механизма созревания ГЭПаз и поиске ответа на вопрос о субстратной специфичности предшественника.

1.3. Получение глутамилэндопептидазы B. intermedius с удаленными N-концевыми остатками Аминоконцевой остаток Val1 в молекуле BIGEP расположен непосредственно в субстратсвязывающем участке, следовательно, введение дополнительных аминокислотных остатков на N-конец молекулы наиболее вероятно приведет к нарушению/перестройке Sсайта и потере ферментом активности. Действительно, все известные в настоящее время варианты протеазы V8 с удлиненным N-концом, получающиеся в результате расщепления предшественника (у этого фермента Val1 также является элементом S1 участка), не обладают протеолитической активностью. Принимая во внимание высказанные соображения, можно полагать, что и химическая модификация аминогруппы Val1 приведет к аналогичным результатам, поскольку вводимые на N-конец фермента заместители будут также локализованы непосредственно в S1 регионе. В то же время, вероятно, оценить влияние аминогруппы Val1 на каталитические свойства белка можно, удалив один или несколько N-концевых остатков, как бы отодвинув аминогруппу от субстратсвязывающего участка.

Для реализации данного подхода нами была использована очищенная рекомбинантная BIGEP, продуцируемая клетками B. subtilis. С целью удаления N-концевых аминокислотных остатков ГЭПаза была обработана аминопептидазами, проявляющими предпочтение к гидрофобным остаткам: лейцин-аминопептидазами из Str. griseus и почек свиньи, а также аминопептидазой Aeromonas proteolytica. После обработки аминопептидазой A. proteolytica BIGEP демонстрировала практически полную потерю протеолитической активности. В то время как при обработке двумя другими аминопептидазами подобного эффекта не наблюдалось. При этом по результатам электрофоретического анализа количество ГЭПазы и ее молекулярная масса оставались неизменными во всех препаратах. Полученные препараты были очищены от аминопептидаз и продуктов гидролиза методом гельпроникающей хроматографии, а затем изучены их структура и ферментативные свойства. Структуру всех полученных вариантов BIGEP анализировали методом MALDI-масс-спектрометрии трипсиновых гидролизатов белков. Было установлено, что под действием ферментов из Str. griseus и почек свиньи структура ГЭПазы не меняется. В то же время, после обработки аминопептидазой A. proteolytica формировался белок (BIGEP-AP), N-концевым остатком которого был Gly4. Детектировать активность очищенной BIGEP-AP по гидролизу азоказеина и специфического субстрата Z-Glu-pNA не удавалось.

Для анализа специфичности BIGEP-AP был использован набор гептапептидных субстратов с внутримолекулярным гашением флуоресценции. Данные пептиды имели общее строение (E(Edans)-AAXAA-K(Dabcyl)-NH2), включая при этом различные аминокислотные остатки в положении 4 (X): Glu, Gln, Leu, Thr, Lys, Val, Ser и Ala. Однако ни в одном случае детектировать активность BIGEP-AP не удалось.

Потеря активности BIGEP при удалении первых трех аминокислот подтверждает важность N-концевых остатков для функционирования фермента. Вероятно, эффект связан с нарушением структуры субстратсвязывающего участка. В то же время, возможно, что модификация аминоконцевой области влияет на пространственное расположение остатков, формирующих каталитический центр. Полученные данные, однако, не дают ответа на вопрос о роли -аминогруппы Val1 в распознавании заряда субстрата, что вызывает необходимость использования другого экспериментального подхода – исследования механизма созревания предшественника.

1.4. Изучение механизма формирования активной глутамилэндопептидазы B. intermedius 1.4.1. Влияние модификации остатка в положении (-1) глутамилэндопептидазы на продукцию активного фермента клетками B. subtilis Все ГЭПазы синтезируются в виде предшественников, созревание которых происходит по разным механизмам. Предшественники эпидермолитических токсинов стафилококков содержат, кроме каталитического домена, только секреторные лидеры, удаляемые сигнальной пептидазой. Вирусные ГЭПазы синтезируются как часть протяженного полибелка, процессинг которого является основной функцией этих ферментов.

Предшественники ГЭПаз стрептомицетов, в дополнение к соответствующей зрелому ферменту области и секреторному лидеру, содержат пропептид, удаляемый автокаталитически. Автокаталитическое удаление пропептида в целом характерно для бактериальных протеаз. Однако автокатализ требует соответствия структуры сайта процессинга специфичности фермента, что в случае ГЭПаз накладывает жесткое ограничение: в положении (-1) в молекуле предшественника должен находиться остаток Glu. Такой остаток характерен для предшественников ГЭПаз вирусов и стрептомицетов, но не консервативен у других бактериальных ферментов. Напротив, у них в позиции (-1) наблюдаются самые разные аминокислотные остатки: Ser, Asn, His, Lys и Arg. Это разнообразие наводит на мысль о непринципиальности свойств остатка в (-1) положении для процессинга ГЭПаз, что может быть объяснено различиями специфичности зрелого фермента и предшественника. Такая трактовка согласуется с гипотезой о ключевой роли остатка 1 зрелоРис. 1. Продукция активной протеазы А Б клетками B. subtilis, несущими интактный и мутантные гены глутамилэндопептидазы B. intermedius в составе соответствующих плазмид. Контроль – клетки B. subtilis BG2036 (рСВ22), не имеющие гена BIGEP. A. 5 мкл ночной культуры нанесено на индикаторную среду «молочный агар» и выдержано 12 ч при 37°C, а затем 24 ч при 22°C. Б. Специфическая активность в культуральной среде (через 24 ч) по Z-Glu-pNA. D600 – оптическая плотность культуры при 600 нм.

го белка в определении специфичности фермента и предполагает, что предшественник обладает чрезвычайно широкой специфичностью. Однако существует и другое объяснение – гетероактивация, которая может осуществляться различными протеазами у разных микроорганизмов. В пользу этого варианта на момент начала нашего исследования свидетельствовали только данные, полученные еще в 1978 году для протеазы V8, однако механизм активации бактериальных ГЭПаз в целом оставался невыясненным. Поэтому с использованием модели на основе BIGEP мы предприняли работу по изучению влияния остатка (-1) на формирование зрелого фермента.

Было получено четыре мутантных варианта гена BIGEP, кодирующих ферменты с аминокислотными заменами Lys(-1)Ala/Ser/Asn/Glu (векторы рА-1/рS-1/pN-1/pE-1, соответственно). Кроме того, сконструирован аналогичный вектор (pK-1) с геном, соответствующим BIGEP, не несущей мутаций и сохраняющей Lys(-1). Все гены были экспрессированы в клетках лабораторного штамма B. subtilis. Уровень продукции активной протеазы клетками оценивали по размеру зон гидролиза казеина при культивировании на индикаторной среде «молочный агар» и по специфической активности в культуральной жидкости (рис. 1). Все клетки, несущие векторы с геном BIGEP, оказались способны, в отличие от контрольного штамма, к гидролизу казеина (рис. 1А). Уровень продукции активной BIGEP клетками был оценен количественно по гидролизу специфического субстрата Z-Glu-pNA. Накопление фермента в культуральной жидкости существенно различалось в зависимости от природы остатка в (-1) положении BIGEP (рис. 1Б). Полученные значения хорошо коррелировали с результатами теста на «молочном агаре».

Таким образом, можно констатировать, что ни одна из введенных в положение (-1) мутаций не приводит к полному прекращению продукции активного фермента клетками.

В то же время наши результаты показывают, что природа остатка в данной позиции сайта процессинга BIGEP существенно влияет на уровень продукции активного фермента.

Наиболее вероятным представляется, что изменение уровня продукции активной BIGEP при модификациях в положении (-1) связано с профилем субстратного предпочтения процессирующего фермента или ферментов. В настоящее время опубликованы данные, что в клетках B. subtilis процессинг собственной глутамилэндопептидазы осуществляется субтилизинподобной секреторной протеазой – бациллопептидазой F (bpF).

Можно предположить, что в нашем случае процессинг BIGEP осуществляется тем же ферментом. При этом показано, что bpF гидролизует связи после Ser, Arg и Lys, но, повидимому, не способна расщеплять связи с Ala, Asn и Glu в положении Р1. Следовательно, при введении этих остатков в позицию (-1) BIGEP существует вероятность гидролиза в другом месте полипептидной цепи, что может вызывать наблюдаемый эффект. Однако более правдоподобной представляется активация BIGEP с этими остатками в сайте процессинга другими ферментами, поскольку для ГЭПаз показана возможность процессинга протеазами различных семейств. Так ГЭПаза B. licheniformis in vitro процессировалась при действии субтилизина и трипсина. В случае протеазы V8 из S. aureus и родственных ей ГЭПаз других стафилококков процессинг осуществляется термолизинподобными протеазами: ауреолизином in vivo и термолизином in vitro. Таким образом, весьма вероятно, что, в зависимости от структуры сайта процессинга, ГЭПаза в одном микроорганизме активируется при участии нескольких разных ферментов. В случае B. subtilis, например, на эту роль могут претендовать, кроме bpF, еще семь секреторных протеаз различной специфичности. Кроме того, существует возможность автопроцессинга в случае замены Lys(-1) на Glu, что было показано для ГЭПаз из Str. griseus и B. subtilis, а также нами для самой BIGEP.

Интересно, что, несмотря на введение в положение (-1) BIGEP остатка Ser, находящегося в сайте процессинга ГЭПазы B. subtilis, максимальный уровень протеолитической активности в культуральной среде демонстрируют клетки с геном BIGEP, кодирующим характерный для B. intermedius вариант фермента с Lys(-1). Таким образом, наличие Lys(-1) является предпочтительным для достижения более высокого уровня продукции активного белка. Можно предположить, что модификация остатка (-1) ГЭПаз служит механизмом эволюционной адаптации уровня продукции фермента. В таком случае объяснимо разнообразие свойств остатков в этом положении сайта процессинга очень близких в остальном белков.

Таким образом, полученные нами и опубликованные другими авторами данные позволяют утверждать, что природа остатка в положении (-1) предшественника значительно влияет на созревание ГЭПаз, хотя и не является критической для активации ферментов, поскольку последняя может осуществляться различными путями. Эти результаты должны быть учтены при конструировании эффективных продуцентов не только самой BIGEP, но и других протеаз с узкой субстратной специфичностью.

Исследования влияния остатка (-1) на продукцию BIGEP продемонстрировали, что использованная нами на этом этапе работы экспрессионная система на основе клеток B. subtilis не дает возможности получить предшественник фермента и детально изучить процесс его созревания. Это, в свою очередь, не позволяет сделать вывод о субстратной специфичности ГЭПазы до возникновения свободной аминогруппы N-концевого остатка зрелого белка. Для решения этой задачи нами была создана экспрессионная система на основе клеток E. coli.

1.4.2. Созревание глутамилэндопептидазы B. intermedius in vitro Гетерологическая экспрессия является в настоящее время наиболее эффективным подходом к получению белков, как для исследований, так и в прикладных целях. В то же время, при использовании такого подхода возникает проблема корректного сворачивания. Для белков, синтезируемых в виде предшественников, во многих случаях показано, что фолдинг определяется пропептидами. Однако это не решает проблему полностью, поскольку для формирования активной формы белков пропоследовательности должны быть корректно удалены. Если отщепление пропептида может происходить автокаталитически, то экспрессированная в гетерологической системе протеаза после ренатурации, как правило, созревает самопроизвольно. Но если фермент не способен к автокаталитическому удалению прорегиона, что характерно для многих протеаз с узкой субстратной специфичностью, то необходимо использование другого протеолитического фермента.

Глутамилэндопептидаза B. intermedius синтезируется в виде предшественника, однако, к моменту начала наших работ было не известно, выполняет ли пропептид фермента функцию фолдинг-ассистента. В то же время имеющиеся данные позволяли предполаА Б Рис. 2. Полученные варианты глутамилэндопептидазы B. intermedius и их процессинг. А – частичные последовательности кодируемых генами белков и сайты процессинга. Б – схема получения активной BIGEP. SPM – полноразмерный предшественник; PM и PEM – предшественники без сигнального пептида и без сигнального пептида с мутацией Lys(-1)Glu; M – зрелая часть; IntF – промежуточная форма. Черной стрелкой отмечен сайт процессинга сигнальной пептидазой, белыми стрелками – сайты отщепления пропептидов, серыми – сайты формирования промежуточной формы. Установленные N-концевые последовательности подчеркнуты. Знак «*» соответствует положению (-1).

гать, что удаление пропептида BIGEP осуществляется другой протеазой. Действительно, удаление пропептида ГЭПаз может осуществляться автокаталитически лишь при наличии связи Glu–Xaa в сайте процессинга, в противном случае, для активации необходимо участие дополнительного фермента. При созревании BIGEP гидролизуется связь Lys–Val, таким образом, in vivo этот фермент, по-видимому, активируется гетерокаталитически.

Следовательно, при экспрессии BIGEP в клетках E. coli, вероятно, понадобится (как в случае ГЭПаз B. licheniformis и S. aureus) активация другой протеазой с соответствующей специфичностью. Этот факт может оказаться благоприятным для получения полноразмерного предшественника BIGEP. Однако использование для процессинга дополнительного фермента нежелательно, если целью исследования является изучение субстратной специфичности, и абсолютно недопустимо с точки зрения получения высокоспецифичной протеазы, которую предполагается применять для ограниченного протеолиза.

Поскольку в описанной ситуации не представлялось возможным выбрать одно оптимальное решение, то нами был сконструирован набор векторов, позволяющих экспрессировать в клетках E. coli разные варианты гена BIGEP (рис. 2). Вектор pM нес ген индивидуальной зрелой части BIGEP (M), предназначенной для проверки фолдазной способности пропептида. Плазмида pSPM кодировала полноразмерный предшественник BIGEP (SPM), содержащий сигнальный пептид, поскольку в ряде случаев при гетерологической экспрессии белков-предшественников в E. coli секреция приводит к их корректному созреванию. Вектора pPM и pPEM, определяющие синтез предшественников без сигнального пептида (PM) и без сигнального пептида с заменой Lys(-1)Glu (PEM), были необходимы для получения негидролизованного предшественника и автоактивирующегося фермента, соответственно.

При экспрессии вариантов генов BIGEP в клетках E. coli BL21 (DE3) все белки (SPM, PM, PEM и M) накапливались в нерастворимой форме. В то же время методом электронной микроскопии было показано, что тела включения имеют различную клеточную локализацию (рис. 3). Полноразмерный предшественник BIGEP (SPM) обнаруживался в периплазматическом пространстве, тогда как остальные белки были локализованы в цитоплазме. Данный факт демонстрирует, что в клетках E. coli наличие собственного сигнального пептида приводит к секреции BIGEP.

Рекомбинантные белки (SPM, PM, PEM и M) были очищены в присутствии 8 М мочевины с использованием катионообменной и гельпроникающей хроматографии до электрофоретически гомогенного состояния.

Для получения данных о первичной структуре SPM, PM, PEM и M были обработаны трипсином и подвергнуты анализу методом MALDI-масс-спектрометрии, котрый показал, что набор фрагментов в случае PM, PEM и M полностью соответствует последовательностям белков, кодируемых модифицированными Рис. 3. Электронные микрофотографии клегенами (рис. 2). В случае SPM фрагмент, соотток E. coli BL21 (DE3), несущих плазмиды pPET23b(+), pSPM, pPM и pM. Стрел- ветствующий кодируемому геном N-концевому ки указывает на положение тел включения.

участку белка, обнаружен не был. N-концевое секвенирование SPM показало, что пять первых аминокислотных остатков этого белка: TSDSV. Эти результаты свидетельствуют об удалении 26 стартовых аминокислотных остатков SPM, соответствующих теоретически предсказанному сигнальному пептиду.

Таким образом, SPM отличался от PM по первичной структуре лишь отсутствием стартового метионина (рис. 2А).

Ренатурацию очищенных SPM, PM, PEM и M проводили в присутствии 25% глицерина и 0,15 M NaCl, снижая концентрацию мочевины в растворе до 0,53 М однократным разбавлением. (Схема созревания представлена на рис. 2Б.) В случае SPM и PM, после 12 ч инкубации при 4C от 50 до 70% белка переходило в промежуточную форму (IntF) (рис. 4А, данные приведены для SPM). Молекулярная масса IntF, по результатам электрофореза, составляла около 26 кДа, что больше массы зрелого белка (22,8 кДа) и меньше массы предшественника (29,5 кДа). По результатам N-концевого секвенирования первые пять остатков IntF – KVKPL (это соответствует участку (-15)-(-11) в последовательности предшественника). Таким образом, промежуточная форма образуется при гидролизе связи Glu(-16)–Lys в пропептиде BIGEP и имеет расчетную молекулярную массу 24,7 кДа.

IntF была стабильна в растворе при 4C, по крайней мере, в течение 90 суток. Добавление PMSF, ингибитора сериновых протеаз, и о-фенантролина, ингибитора металлопротеаз, не влияло на образование промежуточной формы. Детектировать протеолитическую или специфическую активность IntF не удавалось. При добавлении трипсина или субтилизина, но не термолизина или BIGEP, полученной в клетках B. subtilis (BIGEP-Bs), IntF переходила в активную форму, имеющую, по данным электрофореза, молекулярную массу, совпадающую с массой BIGEP-Bs (около 23 кДа).

В случае PEM детектировать промежуточную форму не удавалось, 50-70% данного белка при инкубации (12 ч, 4C) переходило в активную форму с молекулярной массой около 23 кДа (рис. 4Б). Присутствие в растворе PMSF и о-фенантролина не влияло на этот процесс. Соответствие первичных структур активных форм, полученных из SPM, PM и PEM, структуре зрелой BIGEP дикого типа подтверждено масс-спектрометрическим анализом их трипсиновых гидролизатов.

Определенная по гидролизу Z-Glu-pNA специфическая активность всех полученных вариантов зрелой BIGEP, составляла 1,6±0,1 Ед./мг, что соответствует значениям, установленным для нативной BIGEP. Протеолитическая активность полученных из SPM, PM и PEM ферментов, определенная по гидролизу азоказеина, также была близка к таковой для природной BIGEP и составляла 31±3 Ед./мг.

А Б Рис. 4. Электрофоретический анализ препаратов SPM (A) и PEM (Б), полученных в ходе ренатурации. SPM – полноразмерный предшественник BIGEP; IntF – промежуточная форма;

mSPMT и mSPMS – зрелая BIGEP после обработки IntF трипсином и субтилизином, соответственно; M – индивидуальная зрелая часть; PEM – предшественник с мутацией Lys(-1)Glu;

mPEM – зрелая BIGEP, полученная при автокаталитическом созревании PEM; BIGEP-Bs – зрелая BIGEP, выделенная из клеток B. subtilis. MW – маркеры молекулярной массы.

Полученная в клетках E. coli индивидуальная зрелая часть BIGEP (M), очищенная и обработанная аналогично SPM, PM и PEM, при понижении концентрации денатурирующего агента агрегировала с образованием осадка. Детектировать протеолитическую или специфическую активность в осадке или супернатанте не удавалось. Таким образом, отсутствие пропептида в составе рекомбинантной BIGEP приводит к невозможности формирования активного фермента в условиях эксперимента.

Итак, экспрессия нескольких вариантов гена BIGEP в клетках E. coli позволила нам выявить целый ряд фактов, проливающих свет на механизмы функционирования этого фермента. Так, было впервые продемонстрировано, что пропептид ГЭПазы B. intermedius необходим для формирования активного фермента, т.е. является фолдинг-ассистентом.

Нами показано, что для активации in vitro BIGEP нуждается в участии других протеаз, специфичность которых соответствует расщепляемой связи пропептид-зрелая часть (Lys–Val). Необходимость гетероактивации была также показана ранее для ГЭПаз из B. subtilis (in vivo) и из B. licheniformis (in vitro).

В то же время оказалось, что созревание BIGEP осуществляется ступенчато. На первой стадии происходит гидролиз пропептида по единственному остатку глутаминовой кислоты (Glu(-16)) с образованием промежуточной формы (IntF). Образование IntF не требует участия дополнительных протеолитических ферментов и не зависит от присутствия ингибиторов, что соответствует свойствам BIGEP. Эти факты позволяют сделать предположение об автокаталитическом механизме образования IntF. Вероятно, предшественник BIGEP обладает протеолитической активностью, причем природа гидролизуемой в пропептиде связи (Glu–Lys) говорит о специфичности, совпадающей с таковой у зрелой ГЭПазы. Тем не менее, обнаружить активность IntF не удавалось. Такое положение может быть связано с низким, не детектируемым используемыми методами, уровнем активности промежуточной формы. Другими объяснениями могут служить внутримолекулярный процессинг предшественника на первой стадии и/или ингибирование активности IntF оставшимися аминокислотами пропептида. Хотя, не исключено, что автопроцессинг BIGEP осуществляется межмолекулярно зрелым ферментом, а инициируется с низкой эффективностью другой, примесной протеазой.

Данные о ступенчатом механизме процессинга были недавно получены in vitro для другой ГЭПазы – фермента из B. licheniformis, а также in vivo и in vitro для протеазы V8. Интересно отметить, что процессинг протеазы V8 происходит in vivo при участии термолизинподобной металлопротеазы ауреолизина, а in vitro при участии термолизина.

Однако обработка промежуточной формы BIGEP термолизином не приводила к образованию зрелого фермента. Вероятно, это связано с различной природой гидролизуемой связи: Asn–Val у протеазы V8 и Lys–Val у BIGEP. Эти данные хорошо дополняют результаты, полученные нами при мутагенезе (-1) положения BIGEP, и являются еще одним аргументом в пользу сделанных выводов о том, что модификации (-1) остатка ГЭПаз in vivo служат механизмом эволюционной адаптации.

Приняв во внимание способность BIGEP к автокаталитическому гидролизу пропептида по остатку Glu(-16), а также данные об автокаталитическом процессинге in vivo родственных ферментов (глутамилэндопептидазы из B. subtilis и Str. griseus), мы сконструировали ген BIGEP с мутацией, модифицирующей сайт процессинга так, чтобы он соответствовал субстратной специфичности фермента. Полученный мутантный предшественник с заменой Lys(-1)Glu при ренатурации переходил в зрелую форму, не отличающуюся от BIGEP дикого типа по первичной структуре и удельной активности. Процесс созревания такого предшественника осуществлялся автокаталитически, то есть не требовал использования других ферментов.

Этот результат имеет важное прикладное значение. Протеолитические ферменты с узкой субстратной специфичностью, к которым относится BIGEP, позволяют проводить ограниченный гидролиз белков и пептидов, что делает эти протеазы незаменимой составляющей основанных на масс-спектрометрии протеомных исследований. Такие ферменты применяют для определения первичной структуры и доменной организации, а также идентификации белков. Они могут быть использованы также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов. В случае высокоспецифичного фермента, пригодного для ограниченного протеолиза, присутствие примесной активности абсолютно недопустимо. Таким образом, нами предложен новый подход к получению протеаз с узкой субстратной специфичностью в гетерологических экспрессионных системах, состоящий в создании автоактивирующегося варианта целевого фермента путем модификации сайта его процессинга.

1.5. Глутамилэндопептидазы: пропептиды и структурные детерминанты субстратной специфичности Подведем итог осуществленным в рамках данной работы исследованиям глутамилэндопептидаз. Ферменты этой группы относятся к структурному семейству химотрипсина и характеризуются способностью гидролизовать пептидные связи, образованные -карбоксильными группами остатка Glu и, в некоторых случаях, других отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Все ГЭПазы имеют в целом сходное строение S1 субстратсвязывающего участка, различаясь, однако, системой компенсации заряда субстрата. При этом различия в механизмах распознавания отрицательного заряда коррелируют с различиями в архитектурах и путях процессинга предшественников соответствующих ферментов. Изложенные факты, в сочетании с филогенетическим анализом, позволяют сделать предположение о том, что белки с такой специфичностью возникли на эволюционном древе ХПП, по крайней мере, дважды. Все это делает ГЭПазы привлекательными объектами исследований, которые, с одной стороны, позволяют получить информацию о механизмах распознавания заряженных субстратов, а, с другой стороны, могут служить основой для создания протеаз с измененной субстратной специфичностью.

Нами создана экспериментальная модель для исследования механизмов функционирования ГЭПаз на основе протеазы B. intermedius (BIGEP). В рамках этой модели проведен направленный мутагенез субстратсвязывающей области и впервые получена ГЭПаза с аминокислотной заменой по остатку His213 – ключевому элементу S1 участка. Анализ свойств модифицированного фермента показал, что консервативный у всех ГЭПаз His213 не определяет способность BIGEP расщеплять субстраты после остатка Glu, хотя важен для проявления ферментом высокой каталитической эффективности.

Полученный результат позволил сделать вывод, что His213 не является основным элементом распознавания заряда субстрата у ГЭПаз, и стал новым аргументом в пользу предположения, что для каждой эволюционной ветви ГЭПаз характерна своя система компенсации заряда.

Нами впервые изучен механизм созревания BIGEP и получены данные о влиянии модификаций пропептида на формирование активной протеазы. Показано, что пропептид BIGEP необходим для формирования активного фермента и, следовательно, выполняет функцию фолдинг-ассистента. Такие данные для ГЭПаз получены впервые.

Продемонстрировано, что удаление пропептида BIGEP происходит ступенчато. Первая стадия процессинга, по-видимому, происходит автокаталитичеки, приводя к образованию неактивного интермедиата, который переходит в активную форму после гетероактивации. При этом эффективность гетероактивации и процессирующий фермент определяются остатком в положении (-1) пропептида, а введение остатка Glu(-1) приводит к автоактивации. Таким образом, во-первых, может быть сделан вывод о том, что активация BIGEP in vivo контролируется другими протеазами. Причем изменение остатка (-1) в ходе эволюции, определяя процессирующий фермент, вероятно, дает возможность влиять как на эффективность процессинга, так и на выбор механизма регуляции активности ГЭПазы. Во-вторых, полученные данные позволяют думать, что, поскольку автоактивация предшественника BIGEP сопровождается расщеплением связей остатков Glu, -аминогруппа Val1, N-концевого остатка зрелого белка, также как и His213, не является единственной детерминантой субстратной специфичности фермента. Учитывая это, можно предположить, что каждый из рассмотренных элементов S1 участка (-аминогруппа N-концевого остатка и His213) является достаточным, но не является необходимым для обеспечения наблюдаемых субстратных предпочтений бациллярных и родственных им ГЭПаз. Совокупность же этих двух элементов обеспечивает высокую эффективность катализа. Однако для того, чтобы сделать такой вывод полностью обоснованным, необходимо получить доказательства, что запуск процессинга не осуществляется зрелым ферментом, образующимся в результате действия какой-либо примесной протеазы. Кроме того, нельзя исключить, что ключевую роль в распознавании заряда субстрата играет еще один, до настоящего времени не идентифицированный структурный элемент, ведь высокая эффективность катализа вирусными и стрептомицетными ГЭПазами обеспечивается и без -аминогруппы N-концевого остатка в S1 сайте. Эти предположения еще ждут экспериментальной проверки, которая, вероятно, может быть выполнена в рамках предложенной модели.

Важно отметить, что созданная нами в ходе работы экспериментальная система имеет прикладное значение. Полученные результаты о механизме созревания предшественника BIGEP позволили разработать подход к получению синтезируемых в виде предшественников протеаз с узкой субстратной специфичностью в гетерологичных экспрессионных системах. Этот подход использует концепцию «инженерии пропоследовательностей» и основан на создании автопроцессирующихся ферментов, что позволяет избежать введения чужеродных процессирующих протеаз в препарат целевого белка.

В рамках данной работы такой метод был успешно применен для создания продуцента ГЭПазы B. intermedius. Полученный с использованием сконструированного продуцента фермент в настоящее время применяется в нашей лаборатории и других лабораториях Института молекулярной генетики РАН для ограниченного протеолиза белков и пептидов. Не подлежит сомнению также, что созданная нами экспериментальная модель является хорошей основой для получения ферментов с измененной субстратной специфичностью, в том числе с применением инженерии пропептидов.

2. Термолизинподобные протеазы – модель для исследования модулирующей способности пропептидов 2.1. Характеристика белков семейства MРеализация потенциала семейства пептидаз M4, более известного как термолизинподобные протеазы (ТПП), в качестве модельной системы для изучения модулирующей способности пропептидов требует наличия в руках исследователя набора охарактеризованных ферментов этой группы. Поскольку, как уже обсуждалось выше, одним из наиболее эффективных подходов для выявления структурно-функциональных соотношений в белковых молекулах является белковая инженерия, необходимо также располагать клонированными генами целевых протеаз и удобными системами для их экспрессии. Для решения этой задачи сотрудниками лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН (ЛБИ ИМГ РАН) на протяжении многих лет проводился поиск бактериальных штаммов-продуцентов протеолитических ферментов и конструирование геномных библиотек таких микроорганизмов, что дало возможность подобрать модельные белки для использования в рамках данного исследования.

2.1.1. Новая нейтральная протеаза Thermoactinomyces species 27a Сотрудниками ЛБИ ИМГ РАН была создана геномная библиотека Thermo­ actinomyces sp. 27a, при анализе которой был клонирован ген металлопротеазы. Ген был экспрессирован в клетках лабораторного штамма Bacillus subtilis AJ73 под контролем собственных регуляторных элементов. В данной работе была установлена последовательность гена металлопротеазы (номер доступа в базе данных GenBank – AY280367), очищен и охарактеризован соответствующий фермент.

Сравнение выведенной из структуры гена аминокислотной последовательности металлопротеазы Thermoactinomyces sp. 27a (Mpr-Thr) с известными первичными структурами белков показало, что она наиболее близка к последовательностям термолизинподобных протеаз (ТПП). Биоинформатический анализ позволил сделать вывод, что белок синтезируется в клетке как предшественник, содержащий, кроме высокогомологичного зрелым пептидазам M4 участка, секреторный лидер, N-концевой пропептид, а также карбоксиконцевой домен, который не характерен для большинства ТПП.

Электрофоретически гомогенная металлопротеаза была выделена из культуральной жидкости рекомбинантного продуцента B. subtilis AJ73 (p31) с выходом 23% при очистке примерно в 40 раз. Молекулярная масса белка, установленная методом электрофореза, составляла 34 кДа, что совпадало со значением, полученным при масс-спектрометрическом анализе – (34190±70 Да). Нами была определена N-концевая аминокислотная последовательность фермента (AAATGTGTGV), положение которой в первичной структуре предшественника показало, что при созревании фермента удаляется N-концевой пропептид протяженностью 215 а.о. Кроме того, сопоставление N-концевой последовательности и молекурярной массы зрелого белка с выведенной первичной структурой предшественника дало возможность сделать вывод, что при созревании Mpr-Thr удаляется также С-концевое расширение. Причем процессинг происходит после 317 или 318 остатка. Это позволяет рассматривать С-концевое расширение фермента как пропептид. Следует отметить, что С-концевые пропептиды характерны для примерно 1/3 ТПП.

Сравнение последовательностей зрелой части Mpr-Thr и каталитических доменов бациллярных ТПП показало их существенное сходство. Наибольшая гомология наблюдается в функционально значимых регионах молекулы: активном центре и участках связывания ионов кальция. Таким образом, по первичной структуре каталитического домена Mpr-Thr является типичным представителем семейства пептидаз M4.

Нами были изучены свойства Mpr-Thr. Ингибиторный анализ подтвердил отнесение Mpr-Thr к каталитическому типу металлопротеаз. Подобно другим ТПП, фермент демонстрировал оптимум протеолитической активности при pH 7,0-7,5 и был стабилен при pH 6,5-9,0. Протеаза проявляла оптимум действия при температуре около 55C. Ионы кальция стабилизировали фермент. Фермент гидролизовал стандартный субстрат ТПП 3-(2-фурил)акрилоил-глицил-L-лейцинамид (ФАГЛА), при этом отношение k /KM, хаcat рактеризующее эффективность катализа, составило (2,8±0,1)103 M-1c-1. Для сравнения, в случае термолизина это значение – (2,0±0,1)104 M-1c-1.

Таким образом, нами впервые охарактеризована ТПП термоактиномицета. По своей структуре и свойствам зрелый фермент является типичным представителем семейства M4. В то же время предшественник белка содержит C-концевой пропептид, что характерно лишь для части протеаз группы. Это делает Mpr-Thr перспективной в качестве одного из элементов модели для исследования функций пропоследовательностей.

2.1.2. Протеализин – металлопротеаза Serratia proteamaculans 94, представляющая новую группу термолизинподобных ферментов Ранее сотрудниками ЛБИ ИМГ РАН и Лаборатории гигиены производства и микробиологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии (ВНИИМП) из испорченного мясного сырья был выделен психротолерантный штамм Ser. proteamaculans 94 – продуцент протеолитических ферментов. В рамках данной работы мы исследовали металлопротеазу из этого организма: клонировали, секвенировали и экспрессировали ее ген, охарактеризовали соответствующий белок. Этот фермент, получивший название «протеализин», был первой выделенной из Ser. proteamaculans протеазой и первой протеазой этого организма, для которой была установлена структура гена.

Ген протеализина (Pln) был клонирован из созданной нами геномной библиотеки Ser. proteamaculans 94 в составе фрагмента ДНК размером около 3,3 тпн и секвенирован (номер доступа в GenBank – AY280367). Сравнение полной выведенной из последовательности гена первичной структуры (341 а.о.), т.е. последовательности предшественника Pln, с первичными структурами известных ТПП показало, что наибольшая гомология наблюдается с внеклеточной протеазой Erwinia carotovora и минорной протеазой Serratia marcescens.

Последовательность, соответствующая зрелому Pln (291 а.о.), имеет выраженную гомологию с последовательностью термолизина (Tln) (37% идентичных и 54% сходных остатков) и других хорошо охарактеризованных белков семейства M4. Наибольшее количество совпадающих аминокислотных остатков наблюдается в функционально существенных участках молекулы. Это позволило идентифицировать остатки, формирующие активный центр фермента (His112, His116, Glu136, Asn135, Asp140, Glu113, His214, Tyr127) и S1' сайт (обозначение по Шехтеру и Бергеру) связывания субстрата (Phe130, Phe133, Val139 и Leu202). Сопоставление первичной структуры Pln с последовательностью Tln в областях, соответствующих сайтам связывания кальция, показало, что эти участки существенно различаются: в Pln изменено большинство остатков, взаимодействующих с Ca2+ боковыми группами.

Находящаяся на N-конце предшественника Pln последовательность (50 а.о.), которая удаляется при созревании белка, полученного нами в клетках E. coli, не имеет гомологии с препропоследовательностью Tln (232 а.о.) и большинства других ТПП, Рис. 5. LOGO-представление консенсусной пооднако обнаруживает заметное сходство c следовательности PPL-мотива.

N-концевыми областями предшественников целого ряда ферментов группы. В этих последовательностях нами обнаружен консервативный гидрофобный кластер, названный PPL-мотивом и включающий семь аминокислотных остатков, три из которых инвариантны: два следующих друг за другом Pro и Leu через два остатка за ними (рис. 5).

Нами сконструирован рекомбинантный продуцент Pln. При работе с продуцентом E. coli BL21 (DE3) (pSIT20) обнаружено, что свежий лизат клеток содержит Pln в виде предшественника с молекулярной массой около 37 кДа. При этом детектируемая протеолитическая активность в лизате была крайне низкой. Инкубация препарата при 4C приводила к созреванию фермента – образованию процессированой формы с массой примерно 32 кДа. Данный процесс сопровождался ростом протеолитической активности, которая достигала максимума через 24-72 часа после лизиса клеток.

Электрофоретически гомогенный активный Pln выделен из клеточного лизата E. coli в количестве 18,5 мг на литр культуральной суспензии с выходом по активности 12% при очистке в 5 раз. Установлена N-концевая аминокислотная последовательность зрелого белка (AKTSTGGEVI), что позволило идентифицировать точку процессинга предшественника и сделать вывод о том, что при созревании Pln, синтезированного в клетках E. coli, удаляется аминоконцевой регион, состоящий из 50 а.о., и формируется зрелый активный белок, протяженностью 291 а.о.

Молекулярная масса зрелого Pln составила: определенная посредством гельпроникающей хроматографии – около 31,5 кДа и электрофореза в ПААГ в присутствии SDS – около 32 кДа. Экспериментальные значения близки к величине, рассчитанной по последовательности – 31894 Да. Соответствие значений, полученных в денатурированной и активной форме, показывает, что функциональной формой белка является мономер.

Фермент проявляет оптимум активности при гидролизе азоказеина при pH около 7 и температуре 50C. По типу ингибирования Pln является типичной металлопротеазой.

Активность фермента угнетается о-фенантролином и ЭДТА, но не хлоридом ртути (II) и PMSF. Фермент гидролизует ФАГЛА, стандартный субстрат ТПП. При этом отношение k /KM составляет (2,52±0,02)102 М-1с-1. Таким образом, по своим энзиматическим свойcat ствам Pln является типичным представителем семейства пептидаз M4.

Протеализин стабилен при pH 5,5-9,5 и температуре до 40C. При более высоких температурах фермент заметно инактивируется и при температуре 60C практически полностью теряет активность за 15 мин. Термостабильность Pln зависит от концентрации ионов кальция. Остаточная активность фермента после 20 мин инкубации при 55C снижалась в 2,4 раза при увеличении концентрации Ca2+ до 40 мМ.

Полученные результаты демонстрируют, что Pln не является высокостабильным ферментом. Это может быть связано с неспособностью к акцепции ионов кальция молекулой белка. Известные представители семейства пептидаз M4 существенно отличаются по термостабильности. Причем атрибутом более лабильных белков является отсутствие сайтов связывания кальция Ca3 и Ca4. При этом стабильность большинства ТПП растет с увеличением концентрации ионов кальция в диапазоне 1-100 мМ. В случае Pln наблюдается обратный эффект. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этого явления, не ясны. Однако можно предположить, что оно, как и низкая стабильность, определяется упоминавшимися выше существенными изменениями в регионах молекулы Pln, соответствующих сайтам связывания кальция.

Наиболее интересной особенностью Pln является организация N-концевой области его предшественника. Все известные ТПП синтезируются в виде препробелков, содержащих на N-конце участок, который отсутствует в зрелом активном ферменте. В то же время для большинства белков семейства, в том числе для Tln, характерна иная структура аминоконцевого региона предшественника. Таким образом, внутри семейства M4 могут быть выделены два структурных подсемейства. Это позволяет, учитывая важность N-концевых пропептидов для функционирования пептидаз семейства, рассматривать ТПП как модель для исследования модулирующей способности пропептидов.

Использование данной модели требует более глубокого анализа структурной организации предшественников пептидаз семейства M4. Такой анализ был осуществлен нами в рамках данной работы и будет представлен ниже.

2.2. Создание прототипа ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья на основе протеализина Как упоминалось выше, штамм Ser. proteamaculans 94, природный продуцент протеализина, был обнаружен в ходе исследований, проведенных совместно сотрудниками ВНИИМП и ИМГ РАН. Эта работа была направлена на поиск микроорганизмов, продуцирующих коллагенолитические ферменты, активные при низкой положительной температуре. Было показано, что ферменты культуральной жидкости Ser. proteamaculans способны гидролизовать соединительную ткань животных при температуре 4-10C. На их основе был создан ферментный препарат для улучшения качества мясного сырья.

Однако из-за неэффективности продуцента препарат имеет высокую себестоимость и, вследствие этого, не рентабелен при промышленном применении. Описанное выше клонирование гена Pln и создание его рекомбинантного продуцента послужило базой для осуществления нового совместного проекта ВНИИМП и ИМГ РАН. Этот проект был направлен на создание ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья на основе рекомбинантных протеаз Ser. proteamaculans 94.

На первом этапе коллагенолитическая активность Pln при температурах 4 и 20C была оценена по гидролизу нативного коллагена I типа. Было установлено, что рекомбинантный фермент способен гидролизовать коллаген при обеих температурах, что позволило сделать вывод о целесообразности проведения исследований действия Pln на мясное сырье. Для осуществления этой работы нами была получена лабораторная партия препарата рекомбинантного фермента.

Сотрудниками ВНИИМП была проведена оценка действия препарата на мясное сырье. Для этого были изучены физико-химические и микроструктурные изменения ферментированной говядины. Основные физико-химические характеристики, такие как рН, содержание влаги и влагосвязывающая способность изучали при различных концентрациях препарата в сырье. Было показано, что при действии препарата рН мясного сырья меняется незначительно. При введении препарата в мясном сырье возрастала массовая доля растворимого белка с высокогидрофильными свойствами, что приводило к увеличению влагосвязывающей способности в 1,7-2,1 раза (в зависимости от использованной концентрации препарата). Влияние препарата на соединительную ткань определяли, сравнивая содержание оксипролина в сырых и вареных образцах без и после 48 ч инкубации с ферментным препаратом. Исследование показало, что содержание свободного оксипролина в опытных образцах на 24-30 мг% А Б выше по сравнению с контролем. Эти данные соответствуют увеличению развариваемости коллагена в ферментированном мясном сырье на 74-85%. Эффективное действие на соединительную ткань было подтвеждено микроструктурными исследованиями образцов, обработанных препаратом.

Важным условием применимости ферментного препарата в пищевой промышленности является его полная инактивация Рис. 6. Действие ферментного препарата на в готовом продукте. Поскольку технология основе рекомбинантного протеализина на соприготовления мясных изделий стандартно единительную ткань в составе мясного сырья.

Микрофотографии фарша контрольного образвключает температурную обработку, нами ца (А) и фарша, обработанного препаратом (Б).

была исследована термоинактивация Pln.

Оценка остаточной активности фермента в готовой продукции была проведена совместно с сотрудниками ВНИИМП. Для этого была выработана опытная партия колбасных изделий (сосисок) и изучена протеолитическая активность в изделиях, прошедших термическую обработку и полученных как с использованием ферментного препарата, так и без него. Установлено, что активность Pln не детектируется в готовой продукции, и, следовательно, ферментный препарат может быть использован в пищевой промышленности.

Таким образом, совокупность полученных данных позволила сделать вывод о перспективности использования препарата для обработки сырья с высоким содержанием соединительной ткани. Для проведения дальнейших исследований в опытно-промышленных масштабах были необходимы значительно большие количества ферментного препарата.

Совместно с сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина (ИБФМ РАН) был разработан технологический регламент получения препарата Pln на основе штамма-продуцента E. coli BL21 (DE3) (pSIT20) в ферментерах объемом 100 л. Была выпущена опытная партия сухого ферментного препарата, с использованием которого на ЗАО «Микояновский мясокомбинат» (совместно с сотрудниками ВНИИМП) была выработана опытная партия варено-копченой колбасы, а затем изучены микроструктурные характеристики ферментированного фарша и готового продукта.

Исследования показали, что ферментный препарат оказывает влияние, в первую очередь, на структуру соединительной ткани. При этом ее характеризует разрыхление компоновки коллагеновых волокон в пучках (рис. 6), что способствует более глубоким изменениям в структуре коллагена при термической обработке. Использование препарата не оказывает негативного влияния на микроструктурные показатели готовых колбасных изделий. Компоновка структурных элементов фарша в готовых изделиях более плотная по сравнению с контрольными образцами. Фрагменты соединительной ткани характеризуются глубокими деструктивными изменениями. Отмеченные морфологические изменения в структуре опытных образцов способствуют формированию более высоких качественных показателей готового продукта.

Таким образом, в результате совместного проекта сотрудниками ВНИИМП, ИБФМ РАН и ИМГ РАН на основе рекомбинантного Pln создан прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности.

Рис. 7. Дендрограмма аминокислотных последовательностей N-концевых областей предшественников пептидаз семейства M4.

2.3. Структурная организация предшественников термолизинподобных протеаз Термолизинподобные протеазы (ТПП) – группа цинксодержащих металлоэндопептидаз, обнаруженных у десятков видов грамположительных и грамотрицательных бактерий, а, кроме того, у микроскопических грибов и архей. ТПП, как и многие другие протеолитичекие ферменты, синтезируются в виде предшественников, которые включают дополнительные структурные элементы, отсутствующие в зрелых молекулах. Причем такие дополнительные последовательности могут быть локализованы как в N-, так и в C-концевой области предшественника.

Во многих случаях показано, что аминоконцевые регионы (АКР) предшественников содержат сигнальный пептид, обуславливающий секрецию ферментов из клетки, и пропоследовательность. Последняя, по крайней мере, у некоторых ферментов семейства, играет роль внутримолекулярного шаперона, который определяет сворачивание белка.

Кроме того, продемонстрировано, что прочасти ТПП способны ингибировать соответствующие зрелые белки, а также участвуют в их секреции. Карбоксиконцевые области предшественников ТПП, по-видимому, отвечают за связывание этих ферментов с различными нерастворимыми субстратами, хотя сведения на этот счет весьма ограничены.

Проведенные нами исследования, а также данные, опубликованные другими авторами, свидетельствуют, что пептидазы семейства M4 могут иметь несколько разных типов структурной организации предшественников. В данной работе впервые осуществлен систематический сравнительный анализ первичных структур полноразмерных предшественников ТПП.

2.3.1. Структура и функции N-концевых регионов предшественников Сравнение аминокислотных последовательностей показало, что по структуре АКР предшественников пептидазы семейства M4 делятся на две основные группы (рис. 7).

Первая группа включает 74 фермента, для которых характерны удаляемые в ходе созревания N-концевые регионы протяженностью 183-287 а.о. (далее длинные АКР). Все экспериментально охарактеризованные белки этой группы секретируются во внеклеточную среду и несут на N-конце предшественника типичные сигнальные пептиды, которые могут быть успешно идентифицированы существующими в настоящее время методами предсказания. За сигнальным пептидом у белков с длинными АКР расположена область, называемая пропоследовательностью, пропептидом или прочастью. Размер пропептидов составляет 162-264 а.о.

Для целого ряда термолизинподобных протеаз с длинными АКР показано, что пропоследовательности выступают в качестве так называемых внутримолекулярных шаперонов, без которых, как правило, невозможно формирование активного фермента. Кроме того, такие пропептиды действуют как ингибиторы зрелого белка. Причем, по-видимому, эта функция прочастей существенна in vivo для предотвращения преждевременного высвобождения активного фермента, которое может быть губительно для клетки. Наличие пропептидов, вероятно, также необходимо для секреции ТПП с длинными АКР. Важно отметить, что длинные пропептиды, как показано в ряде случаев, отщепляются автокаталитически и внутримолекулярно.

В структуре пропептидов ТПП с длинными АКР можно выделить две области, отличающиеся наибольшим консерватизмом. Первая область, которую мы обозначили как R-кластер, соответствует остаткам (-144)-(-106) в последовательности термолизина (Tln).

Вторая – D-кластер соответствует остаткам (-47)-(-16). Между R- и D-кластерами нами обнаружен консервативный остаток Ala(-83). Оба выявленных кластера соотносятся с консервативными областями, выделявшимися в пропоследовательностях протеаз семейства M4 ранее. R-кластер близок к FTP-мотиву (PFAM ID – PF07504). D-кластер является частью домена PepSY (PF03413). Необходимо подчеркнуть, что, хотя (по данным базы данных PFAM) FTP и PepSY обнаруживаются главным образом в пропептидах ТПП, эти домены идентифицированы также в структурах пептидаз, не относящихся к семейству M4, и, кроме того, во многих белках, не являющихся пептидазами.

Вторая группа ТПП, впервые выделенная нами по структуре АКР предшественников, включает 20 из проанализированных ферментов (рис. 7), N-концевые регионы которых имеют протяженность 50-60 а.о. (далее короткие АКР). Большинство белков этой группы гипотетические. Только три фермента с короткими АКР были выделены и охарактеризованы к моменту нашего анализа. Это – протеаза Pectobacterium carotovorum, минорная протеаза Ser. marcescens и Pln (Ser_pro на рис. 7). Данных о функциональной роли АКР предшественников этой группы не было.

Нам не удалось идентифицировать классические сигнальные пептиды в последовательностях коротких АКР с использованием существующих биоинформатических методов. В то же время в структуре коротких АКР нами обнаружен консервативный гидрофобный кластер в области, близкой к стартовому метионину (рис. 5). Этот кластер, PPL-мотив, содержит семь аминокислотных остатков, три из которых инвариантны: два следующих друг за другом Pro и Leu через два остатка за ними. В большинстве случаев за парой Pro следует ароматический остаток Tyr или His. Функциональная роль PPL-мотива в момент обнаружения была не ясна.

Ранее, при первичном анализе последовательности предшественника Pln, нами было высказано предположение, что ферменты с короткими АКР образуют отдельную группу внутри семейства M4. Исследование значительного набора последовательностей предшественников ТПП показало, что в семействе M4 действительно представлены два типа ферментов, отличающихся структурой АКР. При этом не удается обнаружить «промежуточных звеньев», которые показали бы эволюционный переход от одного типа АКР к другому. По-видимому, различия в организации АКР не могут быть объяснены видовыми особенностями клеток-хозяев, поскольку один и тот же организм может продуцировать ферменты как с короткими, так и с длинными АКР.

Заканчивая обсуждение структуры АКР предшественников пептидаз семейства M4, следует обратить внимание на два принципиальных, на наш взгляд, момента. Вопервых, пропоследовательности ТПП более толерантны к мутациям, чем зрелые части.

Так, нами не обнаружено ни одного аминокислотного остатка, который был бы сохранен во всех проанализированных АКР; доля идентичных аминокислотных остатков в АКР ниже, чем в соответствующих зрелых частях; большинство модификаций наиболее консервативных остатков пропоследовательностей ТПП (есть данные только для длинных АКР) не приводит к полному нарушению функционирования фермента; пропептиды ТПП могут быть «переставлены» от одного белка группы к другому, протяженные участки пропоследовательностей ТПП могут быть заменены чужеродными последовательностями без нарушения способности к фолдингу и процессингу. Во-вторых, анализ накопления мутаций в АКР и зрелых частях белков группы показывает, что оно происходит согласовано, т.е. АКР и каталитические части эволюционируют вместе и обмена этими доменами между разными ферментами не происходит.

Можно предположить, что в такой системе пропептиды, обладающие повышенной вариабельностью, служат специфическим модулем быстрой эволюции, изменения в котором влияют на функционирование зрелых белков in vivo. Мутации в пропоследовательности могут сказываться на накоплении и локализации фермента в клетке. Кроме того, экспериментально показана возможность прямого влияния изменений в пропептидах на каталитические свойства зрелых протеаз. В настоящее время опубликовано, по крайней мере, четыре таких примера. Для субтилизина и дрожжевой карбоксипептидазы Y показано, что к формированию отличающихся по свойствам от белка дикого типа конформеров приводят точечные мутации в пропептиде. У катепсина E такой эффект возникает при замене пропептида на пропоследовательность родственного белка катепсина D. И, наконец, недавно такой эффект обнаружен нами для ТПП: при сворачивании фермента из Thermoactinomyces sp. 27a с собственным пропептидом in cis и in trans формируются протеазы, отличающиеся первичной субстратной специфичностью.

2.3.2. Структура и функции С-концевых регионов предшественников Анализ последовательностей предшественников пептидаз семейства M4 показал, что 37 ферментов из нашей выборки имеют дополнительное, по отношению к каталитической части, расширение на С-конце. Среди этих белков 33 относятся к ТПП с длинными АКР, для 3 характерны короткие АКР и один не удается отнести ни к той, ни к другой группе.

Размер дополнительных карбоксиконцевых регионов (ККР) находится в диапазоне от 110 до 670 а.о. Различия в первичной структуре ККР разных ферментов еще более значительные, чем у АКР. В ряде случаев экспериментально показано, что ККР отсутствуют в зрелых активных белках и, таким образом, могут быть названы С-концевыми пропептидами. Напротив, некоторые протеазы семейства выделены из природных хозяев исключительно в форме (также каталитически активной), включающей ККР. Однако в тех случаях, когда исследования металлопротеаз, гены которых кодируют ККР, проводятся более детально, как правило, оказывается, что in vivo один и тот же белок присутствует в обоих вариантах: с ККР и без него. In vitro рекомбинантные протеазы также переходят из формы, включающей ККР, в укороченную, причем, по-видимому, этот процесс осуществляется автокаталитически. Суммируя опубликованные данные, можно полагать, что предшественники ТПП в большинстве случаев теряют ККР, однако время жизни форм с ККР существенно отличается для различных белков.

Наиболее заметной особенностью ККР предшественников ТПП является наличие в структуре значительной их части ранее идентифицированных консервативных белковых доменов. Эти домены обнаружены также в большом количестве бактериальных и архебактериальных белков, а также в белках млекопитающих и других позвоночных.

Широкая распространенность консервативных доменов, встречающихся в ККР, наводит на мысль о перестановке (шаффлинге) этих доменов между белками различных групп.

Экспериментальных данных о функциях ККР у ТПП в настоящее время мало.

Однако они позволяют предполагать, что ККР обеспечивают связывание ферментов с нерастворимыми белковыми и/или полисахаридными субстратами. Вывод о том, что ККР пептидаз семейства M4 являются субстратсвязывающими модулями, подтверждается полученными для ферментов других групп данными о свойствах встречающихся в них консервативных доменов. По-видимому, ККР у ТПП могут отвечать за клеточную локализацию, поскольку в ряде случаев включают консервативные домены, характерные для разнообразных белков клеточной поверхности бактерий.

Таким образом, данные о функциях ККР у ТПП и обнаруживаемых в их составе консервативных доменов позволяют предполагать, что большинство ККР являются модулями, связывающимися с высокомолекулярными нерастворимыми субстратами.

2.3.3. Термолизинподобные протеазы, кодируемые одним геномом Анализ доступных данных о структуре геномов показывает, что некоторые из них содержат несколько генов термолизинподобных протеаз. Во многих случаях гены одного организма кодируют ТПП, отличающиеся строением предшественников. Эти ферменты могут отличаться структурой как АКР, так и ККР. Анализ последовательностей таких белков показывает, что для них характерны те же, что и для семейства M4 в целом, тенденции. Так, АКР имеют меньший консерватизм по сравнению со зрелыми частями, в то же время накопление мутаций в АКР и зрелых частях происходит согласовано. Структура ККР указывает на перетасовку доменов: близкие каталитические домены сочетаются с разными доменами в ККР.

Описанная ситуация позволяет предполагать, что наличие нескольких ТПП дает организму определенные эволюционные преимущества. По-видимому, функции ферментов набора отличаются, что определяется N- и C-концевыми пропептидами. При этом многообразие протеаз с длинными АКР, вероятно, является, в первую очередь, следствием дупликации одного гена и перестановки доменов, но эволюция ферментов с длинными и коротким АКР идет независимо.

2.3.4. Основные итоги анализа первичной структуры предшественников термолизинподобных протеаз Подводя итоги анализа, мы хотели бы констатировать наиболее существенные факты, касающиеся организации предшественников пептидаз семейства M4:

- все предшественники ТПП, кроме каталитического модуля, содержат аминоконцевые регионы (АКР), которые удаляются при созревании;

- существуют АКР двух типов: короткие (около 50 а.о.) и длинные (около 200 а.о.);

- длинные АКР состоят из секреторного лидера и пропептида, который выполняет функции внутримолекулярного шаперона, способен ингибировать зрелый фермент, а также, по-видимому, принимает участие в секреции;

- длинные АКР не содержат ни одного остатка, консервативного во всех последовательностях пептидаз семейства M4;

- в коротких АКР не удается обнаружить классических сигнальных пептидов, в то же время короткие АКР содержат консервативный PPL-мотив вблизи стартового метионина;

- функции коротких АКР неизвестны;

- АКР менее консервативны, чем каталитические части ТПП, однако накопление мутаций в АКР коррелирует с накоплением мутаций в каталитических доменах;

- примерно треть предшественников ТПП имеет ККР (у предшественников с длинными АКР они обнаруживаются почти в половине случаев, у предшественников с короткими АКР – заметно реже);

- ККР содержат консервативные домены, которые встречаются во многих других белках различных организмов и, по-видимому, обеспечивают взаимодействие с высокомолекулярными субстратами.

Таким образом, в результате нашего анализа впервые установлено, что существуют две группы ТПП, отличающихся по структуре N-концевых пропептидов. Между двумя типами пропептидов не удается выявить эволюционной связи. При этом имеющаяся информация дает основания полагать, что ферменты с разными типами АКР выполняют в клетке разные функции. Нами также впервые систематически рассмотрена ситуация с С-концевыми расширениями ТПП и сделан вывод о том, что добавление ККР к каталитическому домену этих ферментов может расцениваться как стандартный способ изменения функций протеаз группы in vivo.

Анализ структуры предшественников ТПП демонстрирует важную роль пропептидов в функционировании белков семейства, что делает его представителей перспективными в качестве моделей для изучения механизмов действия пропоследовательностей.

Результаты анализа позволяют также выбрать основные направления дальнейших исследований: изучение механизмов влияния пропептидов на функциональные свойства зрелых частей, выяснение функций и механизмов действия коротких пропептидов, а также установление пространственных структур предшественников ТПП.

2.4. Участие пропептидов в формировании активной металлопротеазы Thermoactinomyces species В соответствии с результатами описанного выше биоинформатического анализа впервые обнаруженная нами металлопротеаза Thermoactinomyces sp. 27a (Mpr-Thr) имеет архитектуру предшественника, характерную для значительного числа представителей семейства пептидаз M4. Поэтому данный фермент был использован нами в качестве модели для исследования функциональной роли длинных N-концевых пропептидов и С-концевых расширений ТПП.

Первым этапом исследования стала попытка выяснить функции С-концевого пропептида Mpr-Thr, удаляемого в процессе созревания и содержащего консервативный PPC-домен. Как обсуждалось выше, функции ККР предшественников ТПП в целом не ясны, хотя имеющиеся данные позволяют предполагать, что эти участки являются связывающими высокомолекулярные субстраты модулями. В то же время, подобные С-концевые участки не являются уникальными для ТПП. Для ряда протеаз других групп показано участие ККР в секреции, что указывает на такую возможность и в случае Mpr-Thr. Кроме того, нельзя исключить, что, аналогично N-концевым пропептидам, ККР может быть существенным для формирования активной протеазы.

Для экспериментальной оценки участия ККР в формировании активной Mpr-Thr нами был сконструирован и экспрессирован в клетках B. subtilis ген, кодирующий фермент, в котором C-концевой пропептид замещен His6-последовательностью (SNMat на рис. 8). Культуры клеток B. subtilis, несущих вектор с геном SNMat и аналогичный вектор с геном, кодирующим полноразмерный предРис. 8. Схема первичных структур сконшественник, демонстрировали схожие кривые струированных вариантов металлопротеазы роста при периодическом культивировании и Thermoactinomyces sp. 27a. Обозначения соотдинамику накопления протеолитической акветствующих белков даны слева. S – сигнальный пептид, N – N-концевой пропептид, Mat – тивности в культуральной среде. Белковые зрелая часть, C – C-концевой пропептид.

продукты обоих генов (SNMat и SNMatC на рис. 8) не отличаются по термостабильности. Полученные данные позволяют заключить, что удаление С-концевого пропептида не влияет на продукцию внеклеточного фермента клетками бацилл и существенно не влияет на формирование функционально активной молекулы. Таким образом, роль ККР металлопротеазы in vivo, по-видимому, связана со взаимодействием предшественника с другими молекулами или надмолекулярными структурами.

В отличие от ситуации с ККР, для длинных N-концевых пропоследовательностей ТПП хорошо известна их функция фолдинг-ассистента. В то же время, предполагаемое использование Mpr-Thr в качестве модельного объекта при исследовании структурнофункциональной организации длинных пропептидов требует строгого доказательства участия АКР в формировании каталитически активного фермента. Для решения этой задачи на основе штамма E. coli BL21 (DE3) и плазмиды pET-23c нами были получены продуценты предшественника Mpr-Thr без сигнального пептида и ККР (NMat на рис. 8), зрелой части (Mat) и N-концевого пропептида фермента (N). На 3'-конец генов NMat и Mat была введена последовательность, кодирующая His6-якорь. В случае варианта N такой элемент был введен на 5'-конец гена. При экспрессии доля всех рекомбинантных белков составляла 30-40% от общего количества внутриклеточных белков E. coli. При этом NMat и Mat накапливались преимущественно в нерастворимой форме, а N был в равной степени представлен в растворимой и нерастворимой фракции бактериальных клеток.

Белки NMat и Mat переводили в раствор, используя 8 М мочевину, а их ренатурацию инициировали десятикратным снижением концентрации денатурирующего агента путем однократного разведения. За образованием функционального фермента следили, определяя протеолитическую активность в ренатурирующем растворе. В условиях эксперимента Mat был не способен формировать активный фермент. В то время как NMat сворачивался в каталитически активную форму. Функционально активная протеаза также формировалась при сворачивании Mat в присутствии N – ковалентно несвязанного N-концевого пропептида. Полученные данные демонстрируют, что для Mpr-Thr, как для других ТПП с длинными пропептидами, характерен пропептид-зависимый механизм сворачивания. При этом N-концевой пропептид способен выполнять функцию фолдингассистента вне зависимости от того, связан он ковалентно с каталитическим доменом или нет. В то же время, скорость формирования активного фермента существенно выше, если пропоследовательность и зрелая часть представляют собой одну молекулу.

Во всех изученных случаях сворачивание протеаз при участии пропептидов находится под кинетическим, а не термодинамическим контролем, а нативное состояние зрелых белков не является глобальным энергетическим минимумом. Следствием этого является эффект «белковой памяти» – формирование молекул фермента, соответствующих разным локальным энергетическим минимумам и отличающихся пространственной организацией, при участии разных или модифицированных пропоследовательностей. Этот Таблица 2. Удельная активность вариантов металлопротеазы Thermoactinomyces sp. 27a, полученных при сворачивании с пропептидом in cis и in trans Удельная активность, мкмольмг-1мин-Субстрат* in cis in trans DNP-Ala-Ala-Leu-Arg-NH2 3,3±0,1 3,3±0,DNP-Ala-Ala-Phe-Arg-NH2 3,2±0,2 1,4±0,DNP-Ala-Ala-Val-Arg-NH2 1,8±0,1 0,4±0,* Жирным шрифтом выделено положение P1’.

феномен был обнаружен при введении точечных замен в пропептид субтилизина и карбоксипептидазы Y, а также при перестановке прорегионов родственных аспартильных протеаз катепсинов E и D. Можно ожидать, что эффект «белковой памяти» характерен и для белков других групп, и что альтернативные конформации, соответствующие разным локальным энергетическим минимумам, будут возникать также при других изменениях процесса про-зависимого сворачивания, например, при фолдинге in trans.

Для подтверждения этой гипотезы мы охарактеризовали варианты активной металлопротеазы Thermoactinomyces sp. 27a, образовавшиеся при сворачивании in cis и in trans. Белки были очищены до электрофоретически гомогенного состояния с использованием аффинной хроматографии на бацитрацин-сефарозе и высокоэффективной гельпроникающей хроматографии. Аминоконцевая последовательность полученного in cis фермента (AAATGT) совпадала с установленной ранее для нативного белка, что свидетельствует о корректном процессинге.

Субстратная специфичность очищенных белков была изучена с использованием набора синтетических хромогенных пептидных субстратов, отличающихся остатком в положении P1'. Данные об удельной активности обоих вариантов Mpr-Thr по этим субстратам (табл. 2) показывают существенные различия в их первичной специфичности (по отношению к остатку в положении P1'). Таким образом, сворачивание in trans приводит к формированию фермента с более узкой субстратной специфичностью, что предполагает разную структуру субстратсвязывающей области двух исследованных белков.

Возможно, различия в структуре объясняются тем, что в случае NMat внутримолекулярное удаление пропептида требует локализации N-концевой области каталитической части в S' субсайте фермента, накладывая дополнительные, по сравнению с фолдингом in trans, ограничения при формировании субстратсвязывающей области.

Таким образом, в ходе исследований Mpr-Thr нами было показано, что С-концевой пропептид этого фермента не влияет на формирование активного белка и его секрецию.

Мы установили также, что образование активного фермента происходит только в присутствии N-концевого пропептида, но как in cis, так и in trans. На модели Mpr-Thr впервые для металлопротеаз был продемонстрирован эффект белковой памяти. При этом впервые обнаружено, что формирование конформеров может происходить в системе пропептидкаталитическая часть in trans, а не при изменении последовательности пропептида.

2.5. Процессинг предшественника протеализина Анализ первичной структуры предшественников пептидаз семейства М4 показал, что по структуре N-концевых пропептидов ТПП делятся на две группы. Пропептиды ферментов, относящихся к первой группе, сходны с пропоследовательностью термолизина (Tln), в то время как предшественники белков второй группы по структуре аминоконцевых регионов похожи на протеализин (Pln).

Пропептиды ТПП, сходные с пропоследовательностью Tln, играют важную роль в функционировании соответствующих ферментов. Они выполняют функцию внутримоРис. 9. Аминоконцевая последовательность предшественника протеализина. Подчеркнуты N-концевые последовательности охарактеризованных форм Pln. PPL-мотив приведен на сером фоне. Позиция 1 соответствует первому аминокислотному остатку зрелого фермента.

лекулярных шаперонов, способны ингибировать соответствующие им зрелые белки, а также участвуют в секреции. Такие пропоследовательности удаляются автокаталитически. При этом для Tln и металлопротеазы Listeria monocytogenes показано, что отщепление пропептида может происходить только внутримолекулярно.

Функции пропептидов протеализинового типа к началу нашей работы известны не были. Созревание протеализинподобных протеаз (ППП) систематически не изучалось.

Несмотря на то, что опубликованные данные указывали на автокаталитический процессинг таких ферментов, оставалось неясным, способны ли их пропептиды, подобно пропоследовательностям термолизинового типа, удаляться внутримолекулярно, а также может ли гидролиз предшественника осуществляться другой протеазой. Поэтому нами были изучены возможные пути созревания белков данной группы на модели Pln. Для исследования механизма процессинга предшественника Pln в данной работе использованы стандартные подходы: модификация каталитического центра и изучение созревания предшественника в иммобилизованном состоянии.

Для получения рекомбинантных предшественника Pln и зрелого Pln (proPlnHisи PlnHis6, соответственно), несущих His6-последовательность в С-концевой области, мы сконструировали экспрессионный вектор pProPlnHis6 на основе плазмиды pSIT20.

Конструкция pProPlnHis6 была использована для создания pProPlnHis6/А – вектора для экспрессии предшественника Pln, имеющего мутацию Glu113Ala в активном центре фермента (proPlnHis6/А). Остаток Glu113 (Glu143 в Tln) играет ключевую роль в катализе ТПП, и, как было показано ранее на других моделях, его замена приводит к образованию неактивного фермента.

Для экспрессии модифицированных генов Pln векторы pProPlnHis6 и pProPlnHis6/А были введены в клетки E. coli BL21 (DE3). Оба варианта накапливались внутри клеток.

При этом часть белка находилась в нерастворимом виде, однако значительное количество фермента обнаруживалось в растворе. Именно растворимая фракция была использована нами в дальнейшей работе.

После разрушения клеток E. coli BL21 (DE3) (pProPlnHis6), как и в случае белка дикого типа, предшественник Pln (proPlnHis6) переходил в зрелую форму (PlnHis6) при инкубации при 4C в течение 24-72 ч. Этот процесс сопровождался увеличением протеолитической активности клеточного лизата.

Зрелый Pln (PlnHis6) был очищен до электрофоретического гомогенного состояния с использованием металло-хелат аффинной и гельпроникающей хроматографии.

Аминоконцевая последовательность полученного белка (AKTST, рис. 9) совпадала с определенной ранее для немодифицированного зрелого Pln. Также как белок дикого типа, PlnHis6 проявлял оптимум активности при гидролизе азоказеина при рН около 7 и полностью ингибировался 1 мМ о-фенантролина.

Для предотвращения процессинга proPlnHis6 все манипуляции при очистке этого белка проводили при pH 11. В этих условиях Pln, подобно другим ТПП, не проявляет протеолитической активности и, следовательно, не способен автопроцессироваться.

Предшественник Pln был очищен до электрофоретически гомогенного состояния (рис. 10, proPlnHis6). Аминоконцевая последовательность этого белка – VIPPY, таким образом, proPlnHis6 не содержит восьми N-концевых остатков, кодируемых геном (рис. 9). Очищенный proPlnHis6 стабилен в растворе при pH 11 и 4C в течение 30 дней. При переводе в раствор с рН 7,3 белок полностью переходит в зрелую Рис. 10. Созревание предшественника протеформу. Этот процесс идет через образоваализина (proPlnHis6) в растворе. Положение ние интермедиата (intPlnHis6) с молекулярной предшественника (pro), промежуточной (int) массой около 34 кДа (рис. 10). Скорость про- и зрелой формы (mat) показано стрелками.

цессинга proPlnHis6 зависит от pH. Характер этой зависимости совпадает с характером зависимости от рН протеолитической активности зрелого Pln. Созревание proPlnHis6 полностью подавляется 2 мМ o-фенантролина, в то же время 2 мМ PMSF не оказывает влияния на этот процесс.

Рис. 11. Электрофоретический анализ образцов предшественника протеализина Для выяснения того, является ли про(proPlnHis6), иммобилизованного на Ni2+-НТК цессинг предшественника Pln внутримолеагарозе. S – раствор, в котором инкубировакулярным или межмолекулярным событием, лась Ni2+-НТК агароза с иммобилизованным proPlnHis6, Im – proPlnHis6 после инкубации была исследована способность proPlnHisна сорбенте. Обозначения как на рис. 10.

созревать в иммобилизованном состоянии.

Иммобилизацию проводили при рН 11 на Ni2+-НТК агарозе через His6-последовательность. Для осуществления процессинга иммобилизованный белок переводили в буфер с рН 8,4 и инкубировали при 37C. Как видно из рис. 11, через 4 ч после начала инкубации детектировать промежуточную и зрелую формы фермента не удавалось. Поскольку причиной неспособности предшественника формировать зрелую форму может быть потеря ферментом активности при иммобилизации, с использованием PlnHis6 нами было продемонстрировано отсутствие такого эффекта.

Мутантный предшественник Pln (proPlnHis6/A) был очищен до электрофоретически гомогенного состояния. Аминоконцевая последовательность (PTLTAR, рис. 9) и молекулярная масса proPlnHis6/A (38103 Да), определенная методом масс-спектрометрии, соответствуют белку без стартового Met, с заменой в активном центре Glu(113)Ala и шестью гистидинами в С-концевой области.

Очищенный proPlnHis6/А стабилен в растворе при рН 8,0 и 4C в течение 30 суток, а также при pH 7,3 и 37C в течение 24 ч. При действии активного протеализина proPlnHis6/А переходит в зрелую форму (PlnHis6/A). Этот процесс идет через образование интермедиата (intPlnHis6/A), который по молекулярной массе (около 34 кДа) совпадает с промежуточной формой, образующейся при созревании proPlnHis6. Аминоконцевая последовательность PlnHis6/A (AKTST) идентична N-концу PlnHis6. Аминоконцевая последовательность промежуточной формы – LLGNK, таким образом, интермедиат содержит 11 дополнительных N-концевых остатков по сравнению со зрелым белком (рис. 9).

Мутантный предшественник Pln способен переходить в зрелую форму при обработке субтилизином и Tln. Как и при действии активного протеализина, процессинг идет через промежуточную форму. По данным электрофоретического анализа зрелые и промежуточные формы, образующиеся при действии всех трех ферментов, близки по молекулярным массам.

Полученная нами совокупность экспериментальных данных позволяет сделать выводы о возможных механизмах процессинга протеализина и подобных ему ферментов.

Прекращение созревания предшественника Pln, после модификации ключевого остатка активного центра, Glu(113)Ala, свидетельствует об автокаталитическом процессинге.

Аналогичные результаты опубликованы для ряда ТПП, имеющих длинные пропептиды, а также для протеазы PrtS Ph. luminescens, относящейся к группе Pln. Таким образом, можно заключить, что, вне зависимости от структуры предшественника, удаление пропептидов ТПП может происходить автокаталитически.

При этом данные о поведении предшественника протеализина в иммобилизованном состоянии демонстрируют его неспособность к внутримолекулярному процессингу.

Это впервые показывает, что свойства предшественника Pln и, по-видимому, предшественников других ППП отличаются от свойств предшественников ферментов с длинными пропептидами. Так, для Tln и металлопротеазы L. monocytogenes показано, что отщепление пропептида происходит внутримолекулярно. На это указывает и установленная недавно структура гидролизованного комплекса относящегося к семейству пептидаз Mвибриолизина MCP-02 из Pseudoalteromonas sp. SM9913 с собственным пропептидом термолизинового типа.

В то же время, мутантный предшественник Pln может процессироваться межмолекулярно под действием зрелого Pln и других протеаз, например, Tln и субтилизина.

Похожие результаты были получены ранее для протеализинподобной протеазы PrtS Ph. luminescens, а также для некоторых ТПП с длинными пропептидами. Однако зрелые Tln и металлопротеаза L. monocytogenes не способны отщеплять собственные пропептиды межмолекулярно.

Сопоставляя данные о возможных вариантах удаления пропоследовательностей у ТПП с длинными и короткими пропептидами, можно сделать вывод о том, что созревание предшественников ферментов этих двух групп происходит по-разному. Неспособность Pln к внутримолекулярному процессингу позволяет предполагать, что, наиболее вероятно, созревание этого фермента in vivo происходит с участием другой протеазы, в то время как для ферментов с длинными пропептидами доминирующим механизмом, повидимому, является внутримолекулярный автопроцессинг.

Нами впервые изучен путь созревания предшественника ТПП с коротким пропептидом. Созревание предшественника Pln происходит ступенчато. Первая стадия процессинга сопровождается отщеплением восьми лидерных аминокислотных остатков, и, таким образом, не модифицированный предшественник Pln, выделенный из клеток E. coli, содержит на N-конце последовательность PPL-мотива (рис. 9). Однако эти восемь остатков не удаляются после модификации активного центра фермента. Таким образом, первый этап процессинга происходит автокаталитически и, по-видимому, внутримолекулярно. Следовательно, PPL-мотив взаимодействует с S' субстратсвязывающим субсайтом Pln. Возможно, именно с этим связан консерватизм данного мотива у ППП. На второй стадии происходит удаление большей части пропептида, что приводит к образованию промежуточной формы, которая в случае автопроцессинга содержит 11 дополнительных N-концевых остатков по сравнению со зрелым белком (рис. 9). Третья стадия процессинга приводит к образованию зрелого фермента. Необходимо отметить, что молекулярные массы промежуточных и зрелых форм, полученных при действии Pln, субтилизина и Tln, совпадают по результатам электрофореза. Этот факт позволяет думать, что место, в котором происходит гидролиз предшественника на второй и третьей стадии, определяется, в первую очередь, пространственной структурой процессируемого белка. В частности, доступностью для действия протеаз района Leu(-11)-Ala1 (рис. 9). Расщепление предшественника на второй и третьей стадии процессинга, по-видимому, может происходить только межмолекулярно, так как иммобилизованный предшественник Pln процессироваться не способен.

Таким образом, наши результаты впервые демонстрируют, что два типа пропоследовательностей ТПП заметно отличаются не только структурно, но и функционально.

Можно полагать, что такая ситуация определяется различной биологической ролью соответствующих ферментов.

2.6. Пространственная структура предшественника протеализина Совокупность полученных нами и опубликованных другими исследователями данных о структуре и свойствах ТПП позволяет думать, что биологические функции пептидаз семейства M4 во многих случаях могут определяться именно структурой их пропептидов, а не зрелыми частями ферментов. Однако для понимания особенностей функционирования этой системы пока недостаточно структурных и биохимических данных.

В частности к началу нашей работы отсутствовали данные о пространственной структуре предшественников ТПП и каталитических доменов протеализинподобных проотеаз.

Выяснение механизма процессинга Pln и создание его непроцессирующегося варианта позволило нам осуществить рентгеноструктурные исследования этого белка – первые исследования пространственной структуры предшественника ТПП. Кристаллизация и решение пространственной структуры предшественника Pln осуществлены совместно с сотрудниками Института кристаллографии РАН.

2.6.1. Кристаллизация предшественника протеализина Для кристаллизации нами был использован электрофоретически гомогенный препарат не способного к автопроцессингу предшественника Pln с мутацией ключевого остатка каталитического центра (proPlnHis6/A). Было получено два типа кристаллов, различающихся по морфологии: одни – в виде плоских четырехугольных пластин со средними размерами 0,30,30,03 мм, другие – в виде треугольных клиньев со средними размерами 0,50,30,05 мм.

Две кристаллические формы оказались различными по рентгенографическим характеристикам. Выяснилось, что четырехугольные кристаллические пластины относятся к моноклинной сингонии и имеют следующие параметры элементарной ячейки:

a = 64,13 ; b = 77,29 ; c = 69,85 , угол моноклинности = 105,88. Более изометричные клиновидные кристаллы относятся к ромбоэдрической сингонии и имеют размеры элементарной ячейки a = 59,28 ; b = 70,76 ; c = 78,65 , углы = = = 90.

Дифракционные рефлексы от моноклинных кристаллов достигали разрешения 2,2 , а от ромбоэдрических – 1,8 , поэтому обе формы были пригодны для дальнейшего рентгеноструктурного исследования. Однако ромбоэдрические кристаллы рассеивали до более высокого разрешения, были более изометричны и содержали только одну молекулу в независимой части элементарной ячейки. Поэтому именно они были использованы при решении пространственной структуры предшественника Pln (proPln). Набор дифракционных данных от кристаллов был собран с разрешением 1,8 при длине волны 0,99 и 100 K с применением источника синхротронного излучения в Курчатовском центре синхротронного излучения и нанотехнологий. Координаты атомов и структурные данные депонированы в банк данных PDB (www.rcsb.org) под номером доступа 2VQX.

2.6.2. Общая характеристика структуры Пропептид формирует в молекуле proPln отдельный домен (рис. 12), который взаимодействует с каталитической частью в области активного центра. При этом N-концевая часть пропептида занимает непосредственно субстратсвязывающий участок фермента. Важно отметить, что на картах электронной плотности нам не удалось идентифицировать некоторые участки молекулы proPln:

2-5, 38-51 и 342-347. В то же время установленная нами при помощи масс-спектрометрии молекулярная масса (38103 Да) и N-концевая последовательность (PTLTAR) очищенного белка, который использовался для кристаллизации, соответствуРис. 12. Общий вид структуры предшеют полноразмерному предшественнику без старственника протеализина. Зрелая часть и тового метионина, с заменой Glu163 на Ala и His6пропептид показаны коричневым и синим цветом, соответственно. Каталитиче- последовательностью на C-конце. Сопоставление ский Zn2+ представлен как зеленая сфера.

вышеперечисленных фактов свидетельствует о высокой подвижности указанных регионов, что в случае участков 2-5 и 342-347, представляющего собой His6-якорь, может быть связано с их положением на N- и С-конце молекулы, соответственно. Подвижность же региона 38-51, по-видимому, имеет функциональное значение. Этот участок, включающий 13 C-концевых остатков пропептида и первый остаток зрелой части, содержит сайты протеолиза при автокаталитическом удалении пропептида, здесь же, судя по всему, происходит и гетерокаталитический процессинг proPln. Таким образом, доступная широкому спектру эндопептидаз подвижная петля 38-51, вероятно, обеспечивает возможность эффективного удаления пропептида Pln.

2.6.3. Структура каталитического домена Пространственная структура зрелой части Pln в целом демонстрирует высокое сходство со структурой термолизина (Tln) и других ТПП, однако имеет несколько очень существенных локальных отличий.

В структуре Pln нам не удалось обнаружить ионов кальция, хотя все ТПП, для которых ранее установлены пространственные структуры, связывают от 1 до 4 ионов этого металла. Причем во всех исследованных ранее случаях была продемонстрирована важность ионов кальция для стабилизации молекул белков семейства, следствием чего является повышение термостабильности при увеличении концентрации Ca2+. Анализ структуры Pln в областях, соответствующих сайтам связывания ионов кальция Tln и других ТПП, показывает, что в Pln все эти участки заметно отличаются. Сопоставление аминокислотных последовательностей ферментов с короткими пропептидами демонстрирует высокий консерватизм обсуждаемых участков у протеализинподобных протеаз (ППП).

Этот факт позволяет заключить, что такая структура является общей особенностью белков этой группы. Таким образом, нами впервые показано, что молекула ТПП может не содержать ионов кальция.

Структура зрелой части Pln отличается от известных пространственных структур других ТПП не только отсутствием ионов кальция. Наиболее значимыми являются различия в структуре активного центра. Все установленные ранее пространственные структуры ТПП принадлежат ферментам с длинными пропептидами. Активные центры этих белков содержат каталитический ион цинка и локализованы в щели между N- и C-концевыми доменами. В случае Pln желоб активного центра перекрыт со Рис. 13. Консенсусная последовательность AYDD-шпильки (подчеркнута) и стороны S' субсайта (обозначение по Шехтеру и смежных регионов. Нумерация по proPln.

Бергеру), что обеспечивает дополнительные контакты N- и C-концевых доменов. «Перегородка» щели активного центра сформирована участком 235-244, обозначенным нами как AYDD-шпилька. Анализ репрезентативного набора последовательностей ТПП показал, что этот структурный элемент не встречается в известных пептидазах семейства M4 с длинными пропептидами, но обнаруживается во всех ферментах с короткими пропоследовательностями и имеет высококонсервативную последовательность (рис. 13). Таким образом, наличие AYDD-шпильки является характерной особенностью ППП, наряду с коротким пропептидом. При этом пропептид и AYDD-шпилька в молекуле Pln непосредственно взаимодействуют, что позволяет рассматривать AYDD-шпильку как структурный элемент, обеспечивающий комплементарность зрелой части и пропептида. Кроме того, возможно, именно наличие AYDD-шпильки, приводящее к изменению геометрии активного центра в районе S' субсайта, определяет сужение субстратной специфичности Pln: недавно нами показано, что Pln, высокоспецифично, в отличие от Tln, действует на актин.

Обратим внимание на еще один существенный факт. Tln и эластаза P. aeruginosa (PAE) могут быть получены в двух кристаллических формах в зависимости от того, связаны они с лигандом или нет. Причем ферменты в комплексе с лигандом демонстрируют «закрытую» конформацию субстратсвязывающей щели, а свободные ферменты более «открытую» конформацию. Эти данные позволили сделать вывод о том, что у ТПП во время каталитического цикла происходит изменение положения С- и N-концевых доменов относительно друг друга. Предшественник Pln, который можно рассматривать как зрелый фермент в комплексе с лигандом, имеет более открытую конформацию субстратсвязывающей щели, чем «открытая» форма Tln, и почти также открыт, как «открытая» форма PAE. Вероятно, такая ситуация является результатом взаимодействия зрелой части с пропептидом (см. ниже). Однако нельзя исключить, что наличие AYDD-шпильки препятствует сближению доменов, вследствие чего для Pln не характерно их движение в ходе каталитического цикла и фермент всегда имеет «открытую» конформацию.

Таким образом, зрелая часть Pln обладает характерными особенностями: не содержит ионов кальция и имеет значительные изменения в области активного центра.

Наш анализ показывает, что эти отличия не являются индивидуальными для Pln, а, повидимому, свойственны для всех ТПП c короткими пропептидами. Таким образом, группа Pln может быть выделена в отдельное подсемейство не только по первичной структуре предшественников, но и по пространственной структуре зрелых частей.

2.6.4. Структура и взаимодействия пропептида Пропептид Pln, как уже отмечалось выше, представляет собой отдельный домен (рис. 12), соединенный со зрелой частью гибким спейсером (остатки 38-51). В детектируемой части пропептида (остатки 6-37) можно выделить два структурных элемента:

шпильку, состоящую из двух -спиралей (1 – 11-22 и 2 – 23-36), и N-концевой сегмент (6-10). Пропептид взаимодействует со зрелой частью в области активного центра (рис. 14). При этом 2 контактирует с поверхностью N-концевого домена каталитической части, С-концевая часть 1 – с AYDDшпилькой (которую можно рассматривать как элемент С-концевого домена), а N-концевая часть 1 и N-концевой сегмент опущены во впадину активного центра.

Между спиралями 1 и 2 реализованы гидрофобные контакты, в которые вовлечены боковые группы остатков Leu15 и Ile19 со стороны 1 и Arg27, Ala30, Leu31 и Leu34 со стороны 2. С каталитическим доменом 1 и 2 взаимодействуют по-разному. Для спирали Рис. 14. Взаимодействие пропептида и зрелой части протеализина. N-концевой до2 основными, по-видимому, являются водомен зрелой части показан бежевым цверодные связи Gln26.N2–Glu148.O1, Thr33.

том; С-концевой домен – желтым; AYDDO1–Gln131.N, а также Сys29.S–Glu129.O1.

шпилька – зеленым; каталитический ион Взаимодействия 1 более сложны и разноцинка представлен оранжевой сферой; пропептид окрашен синим, кроме PPL-мотива, образны. В C-концевой части 1 реализовано который показан сиреневым.

гидрофобное взаимодействие бокового радикала Ile18 c боковыми цепями остатков Ile149, Phe150, Leu240 и Leu241, а также алифатической части боковой цепи Arg17 с Leu241. Существенно, что остатки 149 и 1относятся к N-концевому домену зрелой части Pln, а остатки 240 и 241 принадлежат AYDD-шпильке, которая является частью С-концевого домена. Таким образом, в молекуле proPln, благодаря взаимодействию с пропептидом, N- и С-концевые домены зрелой части оказываются зафиксированными в положении, соответствующем открытой конформации субстратсвязывающей щели.

Ранее в структуре коротких пропептидов ТПП нами был обнаружен консервативный элемент – PPL-мотив (рис. 5). Как показывают полученные нами рентгеноструктурные данные, в молекуле proPln этот мотив соответствует N-концевой части спирали (остатки 11-15) и двум остаткам (9 и 10) N-концевого сегмента пропептида (рис. 14).

Шесть из семи остатков PPL-мотива непосредственно взаимодействует с S' субстратсвязывающими субсайтами активного центра. Седьмой, Leu15, находясь между 1, и N-концевым доменом зрелой части, по-видимому, является одним из главных связующих элементов, обеспечивающих стабильность комплекса пропептид-зрелая часть.

Основными партнерами Leu15 выступают остатки Phe150, со стороны зрелой части, и Leu34, со стороны 2.

Аминоконцевая часть пропептида (с 7 по 14 остаток) оккупирует субстратсвязывающую область Pln. При этом связь Ser8–Val9 расположена так, что карбонильная группа Ser8 находится на расстоянии водородной связи от молекулы воды, взаимодействующей с каталитическим цинком (рис. 15А), т.е. соответствует связи, расщепляемой активным ферментом. Остатки пропептида, взаимодействующие с субстратсвязывающим сайтом, могут быть обозначены по Шехтеру и Бергеру следующим образом: Arg7 – P2, Ser8 – P1, Val9 – P1', Ile10 – P2', Pro11 – P3', Pro12 – P4', Tyr13 – P5' и Met14 – P6' (рис. 15А).

(Отметим, что позиции P1–P6' соответствуют остаткам PPL-мотива.) Таким образом, по сравнению со всеми другими ТПП с известными пространственными структурами S' регион в молекуле proPln существенно расширен и формально включает, вместо двух, шесть субсайтов. Причем дополнительные субсайты формируются за счет наличия AYDD-шпильки, которая консервативна для ППП.

Кристаллическая структура Pln впервые для ТПП включает полипептидный лиганд перекрывающий всю S область субстратсвязывающего центра. Ранее взаимодействия А Рис. 15. Субстратсвязывающий сайт протеализина. A – общий вид (стереоизображение). Разностная карта электронной плотности в области, соответствующей пропептиду, показана голубым. Изолинии проведены на уровне 3. Б – окружение каталитической воды. В – S1’ и S2’ субсайты. На Б Б В и В карты электронной плотности показаны светло-серым. Изолинии проведены на уровне 1,5. Зрелая часть показана желто-оранжевым. Фрагменты пропептида выделены светло-зеленым. Ион цинка представлен как зеленая сфера, кислород воды HOH-2277 – как красная сфера. Расстояния между атомами приведены в Ангстремах.

пептидов с S субсайтами, кроме S1, рассматривались только теоретически. Полученные данные показывают, что остаток Ala6 не взаимодействует с каталитическим доменом, а экспонирован в растворитель (рис. 14, рис. 15А). Остатки пропептида 2-5, которые, как упоминалось выше, детектировать не удалось, по-видимому, также экспонированы в растворитель и не связываются со зрелой частью. Это, вероятно, и объясняет высокую подвижность данного участка. Таким образом, для связывания с ферментом существенны только P1 и P2 положения пептидного лиганда. Взаимодействие пропептида Pln с каталитическим доменом в участках S2 и S1 в целом аналогично взаимодействию лигандов с субстратсвязывающим сайтом Tln. Остатки Arg7 (P2) и Ser8 (P1) образуют антипараллельный -лист с участком 133-135 каталитического домена. При этом боковые группы остатков 7 и 8 направлены из желоба активного центра в растворитель (рис. 14, рис. 15А) и, по-видимому, их природа не имеет принципиального значения для связывания. Кристаллическая структура proPln – первая пространственная структура ТПП, в которой в P1 положении лиганда находится немодифицированный аминокислотный остаток, соединенный с остатком в положении P1' обычной пептидной связью. Таким образом, мы, по-видимому, впервые можем наблюдать аналог взаимодействия субстрата с ферментом непосредственно перед началом каталитического акта. Как упоминалось выше, карбонильный кислород Ser8 находится на расстоянии водородной связи от каталитической молекулы воды (HOH-2277) – четвертого лиганда иона цинка (рис. 15Б).

Фенольная группа Tyr177 (157TLN) и N2 атом азота имидазольного кольца His264 (231TLN) – остатков, стабилизирующих переходное состояние субстрата подобно «оксианионной впадине» сериновых протеаз, – ориентированы в направлении HOH-2277. При этом расстояния Tyr177.OH–HOH-2277.O и His264.N2–HOH-2277.O в полученной нами структуре proPln превышают длину сильной водородной связи. Не исключено, однако, что в связанной с субстратом зрелой молекуле, имеющей «закрытую» конформацию, такие связи могут образовываться. В то же время в структуре proPln, вероятно, формируется водородная связь Tyr177.OH–His264.N2.

Взаимодействие пропептида Pln с каталитическим доменом в участках S1' и S2' подобно взаимодействию лигандов с аналогичными сайтами Tln и PAE. Основная цепь пропептида на участке Val9 (P1')–Ile10 (P2') формирует три водородные связи с регионом Asn132–Ala133 зрелой части: Val9.N–Ala133.O, Ile10.N–Asn132.O1 и Ile10.O–Asn-132.

N2 (рис. 15В). При этом расстояния Val9.O–Arg227.NH1 и Val9.O–Arg227.NH2 значительно превышают длину водородной связи, в то время как при взаимодействии лигандов с Tln и PAE водородные связи между карбонильным кислородом остатка в положении P1' и соответствующими группами остатка Arg203TLN (198PAE) образуются. Эта ситуация, также как и в случае упоминавшегося выше взаимодействия Tyr177 и His264 с HOH-2277, вероятно, является следствием «открытой» конформации субстратсвязываюшего сайта proPln. Можно полагать, что при связывании лиганда со зрелым ферментом водородные связи между Val9 и Arg227 формироваться будут.

Сайт S1' является главной детерминантой субстратной специфичности ТПП. У Pln, как и у других пептидаз семейства M4, участок связывания боковой группы остатка в положении P1' представляет собой гидрофобный карман, который, однако, заметно отличается от S1' кармана Tln. Основной вклад в формирование этого участка у Pln вносят остатки Phe153, Val159, Leu216 и Leu226, которые соответствуют остаткам Leu133TLN, Val139TLN, Val192TLN и Leu202TLN, формирующим S1' карман Tln. При этом наличие более объемных остатков (Phe153 вместо Leu133TLN и Leu216 вместо Val192TLN) приводит к тому, что S1' карман протеализина мельче, чем у Tln. Вероятно, Pln должен более эффективно, по сравнению с Tln и другими ТПП со сходным строением S1' кармана, гидролизовать связи образованные -аминогруппами небольших гидрофобных остатков, таких как Ala или Val. Важной особенностью организации молекулы proPln является наличие выраженного S2' кармана, который образуется благодаря смещению остатка Phe150 (Phe130TLN) и, как бы, удлинению S1' кармана по сравнению с термолизином. Таким образом, эффективность связывания субстрата Pln, по-видимому, должна в большей степени, чем в случае Tln, зависеть от аминокислотного остатка в положении P2' субстрата.

Как отмечалось выше, в молекуле Tln и других ТПП с установленными ранее пространственными структурами область S' содержит только два субсайта, а в каталитической части молекулы proPln обнаружены дополнительные S' субсайты, взаимодействующие с остатками 11-14 пропептида. Поскольку этот регион наиболее консервативен в коротких пропептидах, можно полагать, что его контакты очень существенны для реализации функций пропоследовательности. Абсолютно консервативные для всех коротких пропептидов остатки Pro11 и Pro12, соответствующие положениям P3' и P4' лиганда, по-видимому, обеспечивают точное стерическое соответствие между пропептидом и каталитическим доменом: тандем пролинов позволяет опустить полипептидную цепь на N-конце спирали 1 почти вертикально вниз. Боковым цепям остатков Tyr13 (P5') и Met14 (P6') в структуре зрелой части соответствуют четко очерченные связывающие карманы. Следует отметить, что поскольку в формировании S5' и S6' субсайтов ключевыми являются консервативные остатки AYDD-шпильки (рис. 13) и S1', S2' кармана, наблюдаемая нами структура, вероятно, не является уникальной для обсуждаемой молекулы, а характерна для всех белков подсемейства Pln.

Рассмотрение всей совокупности взаимодействий пропоследовательности с каталитической частью позволяет предполагать, что пропептид Pln является внутримолекулярным ингибитором. Ингибиторное действие пропоследовательности реализуется, по-видимому, через блокирование S' субстратсвязывающей области фермента участком пропептида, соответствующим PPL-мотиву, и фиксацию неблагоприятной для осуществления катализа «открытой» конформации активного центра белка.

2.6.5. Основные итоги анализа пространственной структуры предшественника протеализина Анализ пространственной структуры proPln, первой структуры предшественника пептидазы семейства M4, демонстрирует, что протеализинподобные протеазы могут рассматриваться как отдельное подсемейство термолизинподобных протеаз не только по структуре предшественников, но и по структуре зрелой части.

Характерными особенностя- Рис. 16. Схемы конструкций, использованных для экспрессии различных форм протеализина. Pro – участок ми каталитического домена Pln и, погена Pln, соответствующий пропоследовательности;

видимому, других ТПП с короткими mat – участок гена, соответствующий зрелому ферпропептидами являются: отсутствие менту; PT7 – промотор фага T7. TT7 – терминатор фага сайтов связывания кальция, изменен- T7; * – мутация в активном центре Pln, соответствующая замене GluAla.

ная структура N-концевой области, а также наличие высококонсервативной AYDD-шпильки, модифицирующей структуру субстратсвязывающего участка.

Пропептид Pln образует отдельный домен в структуре белка и, по-видимому, выполняет функции внутримолекулярного ингибитора, блокируя субстратсвязывающую область и фиксируя активный центр фермента в неблагоприятной для осуществления катализа «открытой» конформации. Ключевыми элементами интерфейса пропептид-зрелая часть в молекуле proPln являются: со стороны каталитического домена – AYDD-шпилька, а со стороны пропептида –высококонсервативный PPL-мотив.

2.7. Анализ функциональной роли пропептида протеализина Анализ имеющихся в настоящее время данных демонстрирует, что функциональная роль пропептидов протеолитических ферментов очень разнообразна. Установлено, в частности, что длинные пропептиды ТПП могут выполнять функцию фолдинг-ассистентов, действуют как ингибиторы зрелых ферментов и, вероятно, принимают участие в секреции соответствующих белков. Впервые полученные в рамках нашего исследования данные о свойствах и структуре коротких пропептидов ТПП указывают на способность таких пропоследовательностей поддерживать соответствующий фермент в неактивном состоянии. Однако остается неясным, важны ли короткие пропептиды для формирования пространственной структуры и вовлечены ли они в транспорт ППП.

2.7.1. Пропептид протеализина необходим для формирования активного фермента Влияние пропептида на сворачивание Pln было изучено нами с применением классического подхода, который заключается в сравнении эффективности формирования активного фермента при гетерологической экспрессии интактного гена, соответствующего полноразмерному предшественнику, и гена, кодирующего только зрелую часть, а также при совместной экспрессии генов, отвечающих за синтез отдельно пропептида и зрелой части. Для экспрессии полноразмерного предшественника Pln (proPln) нами была использована полученная ранее плазмида pProPlnHis6. Кроме того, дополнительно сконструированы еще три вектора. Два из них, pPlnHis6 и pPlnHis6/A, отвечают за синтез индивидуальных зрелой части протеализина (Pln) и зрелой части Pln с мутацией в каталитическом центре GluAla (Pln/A), соответственно. Третий, pPro+PlnHis6, предназначен для коэкспрессии не связанных ковалентно зрелой части и пропептида (pro) (рис. 16).

При введении описанных векторов в E. coli все белки накапливались в клетках приблизительно в одинаковых количествах. Однако доли белка, находящегося в растворимом виде, существенно отличались. Зона, соответствующая зрелому белку, отчетливо детектировалась при электрофоретическом анализе растворимого содержимого клеток, экспрессирующих интактный ген Pln, в то время как во всех остальных случаях обнаружить растворимый фермент удавалось только методом иммуноблоттинга. По приблизительной оценке, сделанной на основе этих данных, при экспрессии интактного гена в клетках E. coli содержалось в 10-30 раз больше растворимого Pln. В то же время накопление растворимого белка при экспрессии без пропоследовательности или с пропептидом in trans варьировало не значительно. Таким образом, белок, не связанный с пропептидом ковалентно, по-видимому, более склонен к агрегации.

Результаты иммуноблоттинга также показали, что Рис. 17. Динамика накопления активно- в отсутствие пропептида в клетках образуются сти в растворимой фракции лизата кленизкомолекулярные фрагменты Pln, которые, вероток E. coli. Обозначения proPln, pro+Pln ятно, являются продуктами его деградации. Этот и Pln соответствуют лизатам клеток факт может быть интерпретирован как свидетельE. coli BL21 (DE3), несущих вектор pProPlnHis6, pPro+PlnHis6 или pPlnHis6.

ство того, что белок не формирует плотноупакованной высокостабильной пространственной структуры, иными словами, не способен сворачиваться без пропоследовательности.

Прямым доказательством формирования ферментом корректной пространственной структуры служит его способность осуществлять катализ. При экспрессии гена полноразмерного предшественника, в полном соответствии с полученными нами ранее данными, после лизиса клеток E. coli протеолитическая активность фермента в полученном растворе постепенно возрастала в результате процессинга, достигая максимума через 24 ч инкубации при +4C (рис. 17). При коэкспрессии генов пропептида и зрелой части Pln мы также обнаружили в клеточном лизате протеолитическую активность, уровень которой был в 10-15 раз ниже, чем в случае интактного гена, коррелируя с количеством растворимого Pln. Причем, как и для полноразмерного предшественника, активность постепенно возрастала и через 24 ч достигала максимального значения, что, вероятно, также связано с деградацией пропептида. Напротив, при экспрессии генов, кодирующих Pln без просегмента, нам не удалось обнаружить активность в клеточных лизатах даже через 50 ч после лизиса. При этом результаты не отличались для вариантов с мутацией в каталитическом центре и без нее.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что без пропептида Pln не способен эффективно формировать каталитически активную структуру. При этом прочасть способна направлять сворачивание фермента, не зависимо от того, связана она ковалентно со зрелой частью или нет. Таким образом, пропептид Pln является фолдинг-ассистентом. Для коротких пропептидов ТПП данная функция выявлена впервые.

На первый взгляд способность пропептида Pln направлять сворачивание не выглядит удивительной. Такая функция прорегионов обычна для протеаз. Более того, ранее она была продемонстрирована для ряда ТПП. Однако все эти пептидазы семейства Mотносятся к подгруппе Tln и имеют длинные пропептиды. Таким образом, несмотря на отсутствие структурного сходства, пропоследовательности протеализинового и термолизинового типа могут выполнять одну и ту же функцию.

Модель катализируемого пропептидами фолдинга белков, которая была предложена на основе детальных исследований, проведенных для субтилизина (Sbt) и -литической протеазы (-LP), предполагает, что продомены ускоряют сворачивание путем стабилизации одной из возникающих на пути фолдинга локальных структур. Эта субструктура, редко образующаяся в отсутствие связывания с пропептидом, выступает в роли ядра Рис. 18. Суперпозиция структур (стереоизображение) предшественника протеализина (из 2VQX) и процессированного комплекса протеазы MCP-(из 3NQY). Зрелая часть протеализина выделена голубым цветом, пропептид – синим. Зрелая часть MCP-02 – розовым, пропептид – красным. Зелеными сферами представлены ионы цинка.

сворачивания, вслед за формированием которого, начинается фолдинг других регионов молекулы. Поскольку в переходном состоянии белковой молекулы пропептид, повидимому, стабилизирует участки, подобные существующим в свернувшемся белке, сделать предположения о природе этой субструктуры можно, основываясь на информации о пространственной структуре фолдированных комплексов пропептид-каталитический домен. В настоящее время опубликованы данные о таких комплексах для Pln и вибриолизина MCP-02 из Pseudoalteromonas sp. SM9913, типичной ТПП с длинным пропептидом.

При сравнении фолдированных комплексов бросается в глаза, что длинный и короткий пропептиды взаимодействуют с очень похожими каталитическими доменами абсолютно по-разному (рис. 18). Продомены контактируют с поверхностью зрелых протеаз с разных сторон, так что при наложении каталитических доменов пропептиды практически не перекрываются. Лишь в области активного центра взаимодействие пропептида с протеазой в обоих случаях подобно взаимодействию субстрата. Однако пропептид Pln заходит в щель активного центра N-концом, а пропоследовательность MCP-02 – С-концом. Вероятно, как для Sbt и -LP, стабилизация активного центра за счет контактов пропептид-каталитический домен в субстратсвязывающей области является необходимым условием катализируемого прорегионом фолдинга. Однако для Sbt и -LP такое взаимодействие не является достаточным для сворачивания. Таким образом, по аналогии можно полагать, что важные для инициации фолдинга ТПП контакты локализованы в других местах. Если считать такими участками основные зоны взаимодействия, то в случае MCP-02 это будут контакты между соответствующей FTP-мотиву N-концевой частью пропептида и С-концевым доменом каталитической части. А для Pln – связывание одновременно с N- и С-концевым доменом вблизи активного центра. (В это взаимодействие вовлечена AYDD-шпилька.) Принимая во внимание все вышесказанное, следует заключить, что опосредованное прочастями сворачивание ТПП с разными типами пропептидов идет по разным путям.

Результаты, полученные в данной работе и опубликованные ранее нами и другими исследователями, демонстрируют, что оба типа пропоследовательностей ТПП способны выполнять две наиболее часто обнаруживаемые у пропептидов протеаз функции – направлять сворачивание и поддерживать фермент в неактивной форме. В то же время, молекулярные механизмы, обеспечивающие эти свойства прорегионов, по-видимому, принципиально отличаются. Не подлежит сомнению, что необходимость использования разных пропептидов для «одинаковых» молекул продиктована функциями, которые эти молекулы выполняют в клетке. К сожалению, сегодня мы не можем оценить такое конструкторское решение, поскольку роль ТПП в жизни микроорганизмов исследована слабо. Традиционно ТПП приписывается роль ферментов, переваривающих внеклеточные белки и пептиды для питания бактерий. Хотя, есть убедительные доказательства того, что ТПП с длинными пропептидами могут выполнять и более тонкие функции, например, процессировать белки-предшественники. Функции протеализинподобных ферментов практически не изучены. Однако полученные нами данные позволяют рассматривать эти белки как специфические факторы бактериальной инвазии (см. п. 2.8). Не исключено, что короткие пропептиды являются ключевыми детерминантами такой функциональности.

2.7.2. Локализация протеализина в клетке Как упоминалось выше, для длинных пропептидов ТПП предполагается участие в секреции соответствующих белков. В случае коротких пропептидов таких данных сегодня нет. Более того, остается нерешенным вопрос о том, секретируются ли протеализинподобные протеазы бактериями.

В рамках данной работы нами было оценено накопление Pln в клетках и культуральной среде Ser. proteamaculans 94 при периодическом культивировании. Для детекции фермента был применен метод иммуноблоттинга (рис. 19). Используя антитела к proPln, было установлено, что протеализин обнаруживается в клетках уже через 3 ч после инокуляции. При продолжении культивирования количество Pln в клетке возрастает вплоть до достижения культурой стационарной фазы роста, после чего меняется незначительно. Независимо от времени культивирования, в клетках Pln обнаруживается в виде предшественника. Детектировать зрелую форму не удается, однако выявляются иммуноположительные зоны, соответствующие белкам с молекулярной массой ниже, чем у предшественника, но выше, чем у зрелой формы Pln. По-видимому, эти белки являются продуктами деградации предшественника. В культуральной среде использованная техника позволяет обнаружить proPln через 7 ч после начала культивирования. Концентрация фермента вне клеток, как и в случае внутриклеточного белка, растет в ходе культивирования. По мере увеличения количества Pln в образцах выявляются две иммуноположительные зоны с молекулярной массой ниже, чем у предшественника. Одна из этих зон имеет электрофоретическую подвижность, совпадающую с подвижностью зрелого фермента.

Вторая, более тяжелая, по-видимому, соответствует промежуточной форме, наблюдаемой при созревании Pln (см. п. 2.5). При этом доля процессированного фермента в культуральной жидкости увеличивается во времени.

Проведенная нами по данным иммуноблоттинга приблизительная оценка относительных количеств Pln в образцах показала, что не зависимо от фазы роста отношение внутриклеточный/внеклеточный фермент сохраняется и примерно равно 100/1.

Таким образом, наши данные позволяют предположить, что Pln не секретируется из клеток Ser. proteamaculans конститутивно, чем Рис. 19. Анализ накопления протеализина принципиально отличается от ТПП с длинныв клетках и культуральной среде Ser. proteamaculans 94 при периодическом культивиро- ми пропептидами – внеклеточных ферментов, вании. На врезке приведены данные иммуносекреция которых зависит от классическоблоттинга. Образцы, подвергнутые электрого сигнального пептида и идет по основному форетическому анализу, были приготовлены пути. В то же время, имеющиеся факты не поиз 170 мкг клеток или 1 мл культуральной зволяют сделать вывод ни о том, что Pln не явжидкости (КЖ).

ляется секреторным белком, ни о том, что пропептид Pln не участвует в его транспорте.

Накопление около 1% синтезируемого Pln во внеклеточном пространстве может быть отражением базального уровня секреции фермента по неустановленному индуцибельному механизму. Такая гипотеза представляется вполне оправданной. Поскольку активация предшественника Pln происходит только после выхода белка из клеток, представляется вероятным, что фермент выполняет свои биологические функции вне бактериальной клетки. Учитывая приведенные ниже данные об участии Pln в бактериальной инвазии (см. п. 2.8), можно допустить, что секреция протеазы происходит не во внеклеточное пространство, а в цитоплазму эукариотической клетки, например, через систему секреции третьего или шестого типа.

2.8. Биологические функции протеализинподобных протеаз Различия в структуре пропептидов и зрелых ТПП, а также в их клеточной локализации, позволяют думать, что протеазы групп Tln и Pln имеют разные биологические функции. К настоящему времени опубликовано достаточно много данных о роли ферментов с длинными пропептидами у различных организмов. Имеющаяся информация дает возможность утверждать, что эта роль не сводятся лишь к функции «пищеварительных» ферментов, неспецифически расщепляющих внеклеточные белки. Напротив, пептидазы подсемейства Tln часто имеют специфические мишени, которые могут быть как белками, продуцируемыми одним с ними организмом, так и экзогенными полипептидами. Направленное действие, в частности, во многих случаях является принципиальным для функционирования ТПП в качестве факторов патогенности.

Биологические функции ТПП с короткими пропептидами практически не изучены. В то же время большинство охарактеризованных протеализинподобных ферментов синтезируются патогенными микроорганизмами. В целом остается не ясным, являются ли ППП факторами патогенности соответствующих бактерий. Однако имеющиеся данные подкрепляют такое предположение. Недавно в Институте цитологии РАН проведены исследования, доказывающие вовлеченность ECP32/гримелизина в процесс бактериальной инвазии, а также, при нашем участии, получены аналогичные данные для Pln.

(Исследование роли Pln в бактериальной инвазии было представлено в выполненной под руководством С.Ю. Хайтлиной диссертации О.А. Цаплиной на соискание ученой степени кандидата биологических наук.) Методом конфокальной микроскопии нами было установлено, что после 3 часов инкубации природного продуцента Pln, Ser. proteamaculans 94, с клетками карциномы гортани человека Hep-2 в культуре наблюдается нарушение монослоя, изменение формы клеток Hep-2, появление на их поверхности многочисленных выростов, содержащих актин. При этом бактерии обнаруживаются в цитоплазме примерно 10% эукариотических клеток. Локализация Ser. proteamaculans 94 в цитоплазме Hep-2 была подтверждена методом электронной микроскопии. Таким образом, нами было продемонстрировано, что бактерии Ser. proteamaculans 94, также как продуцент ЕСР32/гримелизина, способны проникать в клетки эукариот.

Введение гена Pln в составе вектора pProPlnHis6 сообщало клеткам E. coli способность к инвазии. Как и в случае природного продуцента, методами конфокальной и электронной микроскопии было показано, что, после 3 ч совместной инкубации с культурой клеток Hep-2, бактерии E. coli BL21 (DE3) (pProPlnHis6), в отличие от контрольного штамма, детектируются внутри эукариотических клеток (рис. 20). При этом большинство бактерий локализуется в вакуолях, но также были обнаружены бактерии, находящиеся в цитоплазме в свободном виде.

Полученные результаты впервые демонстрируют, что ТПП с короткими пропептидами являются элементом механизма проникновения бактерий в клетки животных. В сочетании с обсуждавшимися выше данными о синтезе таких белков болезнетворными микроорганизмами это, по-видимому, свидетельствует, что ППП являются факторами патогенности соответствующих бактерий.

В ходе наших исследований также получены результаты, указывающие на вероятную роль Pln в процессе бактериальной инвазии.

Было показано, что Pln действует на глобулярный актин (G-актин) подобно ECP32/гримелизину. Pln полностью расщепляет актин c Рис. 20. Инвазия клеток Hep-2 рекомбинантобразованием фрагмента с массой 36 кДа уже ными штаммами E. coli. А, Б – результаты через 30 мин инкубации. При массовом соотконфокальной микроскопии. Изображения ношении Pln/актин равном 1/50 дальнейший сделаны в фокальной плоскости, проходящей протеолиз не наблюдается даже после 4 ч инчерез середину клетки. Стрелки указывают на участки с зеленой флуоресценцией, сооткубации. При увеличении концентрации Pln ветствующие меченым флуоресцеином бак(Pln/актин выше 1/10) детектируется расщетериям. Черта соответствует 10 мкм. В, Г – пление 36 кДа фрагмента с образованием проданные электронной микроскопии. Бактерия дукта с массой около 33 кДа. N-концевая амивнутри эукариотических клеток помечена белой стрелкой, вне клеток – черной. А, В – нокислотная последовательность фрагмента клетки Hep-2, инфицированные E. coli BL36 кДа (VMVGMQ) соответствует гидролизу (DE3) (pET23b), не несущими ген Pln. Б, Г – актина между Gly42 и Val43. В препарате, соклетки Hep-2, инфицированные E. coli BLдержащем фрагмент 33 кДа, выявлено при(DE3) (pProPlnHis6), несущими ген Pln.

сутствие двух полипептидов с N-концевыми последовательностями LKYPIE и ILTLKY, что соответствует гидролизу связей Thr66– Leu67 и Gly63–Ile64. Интересно, что Tln, прототип семейства пептидаз М4, как и Pln, первоначально расщепляет актин с образованием 36 и 33 кДа фрагментов. Однако даже при массовом отношении Tln/актин равном 1/50 эти фрагменты подвергаются интенсивному дальнейшему протеолизу. Таким образом, Pln ограниченно расщепляет актин в петле, связывающей ДНКазу I (Gly42–Val43), и при более высоких соотношениях субстрат/ фермент в так называемой нуклеотидной щели (Thr66–Leu67 и Gly63–Ile64).

Поскольку установленные нами сайты расщепления G-актина (Gly42–Val43 и Gly63–Ile64) в актиновом полимере расположены в участках, вовлеченных во взаимодействие мономеров, можно предположить, что фибриллярный актин (F-актин) будет более устойчив к действию фермента. Действительно, при инкубации F-актина с Pln образуется только фрагмент 36 кДа, что указывает на недоступность для действия протеазы участков нуклеотидной щели. По сравнению с G-актином снижена и эффективность гидролиза в сайте Gly42–Val43, находящемся в ДНКазной петле. Однако от 20 до 40% (при разных соотношениях актин/протеаза) F-актина расщепляется протеализином за 3 ч – время, совпадающее со временем инкубации в обсуждавшихся выше инвазионных экспериментах. Таким образом, впервые была продемонстрирована способность протеазы группы Pln гидролизовать F-актин, являющийся основным видом актина в клетке.

Нами были изучены свойства F-актина, обработанного Pln. Расщепление F-актина сопровождается снижением интенсивности светорассеяния и флуоресценции (для меченного пиренилом актина) его раствора примерно на 30%. Это свидетельствует о сдвиге равновесия мономер-полимер в сторону коротких филаментов и/или мономеров, что должно влиять на динамику F-актина – обмен субъединиц филаментов с молекулами пула мономеров. Поскольку включение мономеров в полимер сопровождается гидролизом содержащегося в них АТФ, динамика F-актина может быть оценена путем измерения АТФазной активности F-актина, находящегося в равновесном состоянии в растворе.

Действительно, определенная нами АТФазная активность F-актина, расщепленного Pln на 30%, составляет 1,2 (моль Pi)/(моль актина) в час, что значительно превышает значение для немодифицированного F-актина в сходных условиях – 0,02-0,04 (моль)/(мольч).

Полученные результаты важны для понимания механизмов бактериальной инвазии, происходящей с участием ППП. Проникновение бактерий в эукариотические клетки, как правило, включает «разборку» актиновых структур в месте контакта бактерии с клеточной стенкой, что приводит к полимеризации актина в прилегающих участках и образованию на поверхности клетки выступов, которые охватывают бактерию и обеспечивают ее поглощение в ходе процесса подобного макропиноцитозу. Ограниченное расщепление F-актина Pln существенно усиливает динамику актиновых филаментов и способствует их деполимеризации. Этот эффект может приводить к разборке актинового цитоскелета в месте контакта, в результате чего будет расти концентрация мономеров, необходимых для сборки актиновых филаментов в выростах клеточной поверхности.

Таким образом, специфическая способность Pln и других ферментов группы расщеплять актин может быть использована бактерией для изменения функциональных свойств актина, вызывая перестройки цитоскелета и обеспечивая проникновение микроорганизма в эукариотическую клетку.

2.9. Термолизинподобные протеазы – модель для исследования функций пропептидов Подведем итог осуществленным в рамках данной работы исследованиям ТПП.

Семейство пептидаз M4 объединяет около пятиста белков, обнаруженных у многочисленных бактерий и, кроме того, у микроскопических грибов и архей. В настоящее время охарактеризовано около 30 представителей семейства и установлено несколько пространственных структур протеаз этой группы. Наличие данных о структуре и свойствах близкородственных, но отличающихся функционально ферментов делает ТПП привлекательной моделью для изучения структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В рамках данной работы ТПП были использованы как модель для исследования механизмов функционирования пропептидов.

Нами впервые проведен систематический анализ первичных структур предшественников ТПП и показано, что по организации N-концевых регионов предшественников семейство может быть разделено на две группы. Представители первой имеют хорошо изученные длинные пропептиды, сходные с пропоследовательностью Tln. Для белков второй группы характерны ранее не описанные короткие прорегионы, подобные пропептиду протеализина. Таким образом, нами идентифицирована новая группа пептидаз семейства M4, представители которой обозначены нами как протеализинподобные ферменты (ППП).

Для исследования методами белковой инженерии механизмов функционирования двух типов пропептидов ТПП создана экспериментальная модель на основе двух новых детально охарактеризованных в ходе данной работы ферментов: металлопротеазы Thermoactinomyces sp. (Mpr-Thr) и протеализина Ser. proteamaculans (Pln). Важно подчеркнуть, что Mpr-Thr и Pln имеют разные типы пропептидов. Модель включает охарактеризованные гены ферментов, системы для их экспрессии, а также схемы получения высокоочищенных рекомбинантных белков.

С использованием одного из модельных белков, Mpr-Thr, впервые для металлопротеаз был продемонстрирован эффект белковой памяти. При этом впервые обнаружено, что формирование конформеров может происходить в системе пропептид-каталитическая часть in trans, а не при изменении аминокислотной последовательности пропептида.

Другой модельный белок, Pln, стал основой для изучения структуры, функций и механизмов действия коротких пропептидов.

Нами была установлена (совместно с сотрудниками ИК РАН) пространственная структура предшественника Pln – первая структура предшественника пептидазы семейства M4 и первая структура ППП. Анализ этой структуры позволил выявить характерные особенности каталитического домена ТПП с короткими пропептидами и показал, что ППП могут рассматриваться как отдельное подсемейство ТПП не только по структуре предшественников, но и по структуре зрелой части. Было установлено, что пропептид Pln образует отдельный домен в структуре белка и выполняет функции внутримолекулярного ингибитора, блокируя субстратсвязывающую область и, вероятно, фиксируя активный центр фермента в неблагоприятной для осуществления катализа «открытой» конформации.

Анализ функциональной роли пропептида Pln впервые показал, что короткие пропептиды ТПП выступают в качестве фолдинг-ассистентов, определяя сворачивание соответствующих белков. Было установлено, что удаление таких пропептидов может происходить автокаталитически, но, в отличие от длинных пропропоследовательностей, по межмолекулярному механизму. Также впервые было обнаружено, что Pln и, вероятно, другие ППП не секретируются бактериальной клеткой конститутивно, хотя активируются только при попадании во внеклеточную среду. Совместно с сотрудниками Института цитологии РАН мы впервые продемонстрировали, что ТПП с короткими пропептидами являются элементом механизма проникновения бактерий в клетки эукариот. Было также показано, что ферменты группы Pln специфически расщепляют актин, что, вероятно, является основной функцией этих ферментов при инвазии.

Таким образом, структурные и функциональные свойства протеализинподобных ферментов и пептидаз семейства M4, сходных с термолизином, существенно отличаются. Совокупность полученных данных позволяет предполагать, что эти различия в значительной степени определяются пропептидами.

В ходе наших исследований также получены результаты, имеющие прикладное значение. Уникальные свойства Pln позволили создать (совместно с сотрудниками ВНИИМП и ИБФМ РАН) на его основе прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности. Эффективность разработанного препарата подтверждена в условиях опытного производства.

Следует подчеркнуть, что потенциал использованной в данной работе модельной системы далеко не исчерпан. Не подлежит сомнению, что продолжение исследований свойств пропептидов ТПП даст новую информацию о механизмах модуляции функциональной активности белков пропоследовательностями. Наиболее перспективным, повидимому, является изучение биологических функций пептидаз семейства M4 и влияния на них соответствующих прочастей. Существенный интерес представляет также вопрос о приводящих к функциональному разнообразию белков путях эволюции пропептидов.

Кроме того, в рамках описанной модели могут решаться и задачи, не связанные с исследованием пропоследовательностей.

ВЫВОДЫ 1. Клонирован ген глутамилэндопептидазы B. intermedius (BIGEP), осуществлена его гетерологичная экспрессия в клетках B. subtilis и E. coli, разработаны методы получения высокоочищенного рекомбинантного белка, что позволяет использовать BIGEP в качестве экспериментальной модели для исследования механизмов функционирования Gluспецифичных протеаз.

2. Впервые получена, на модели BIGEP, глутамилэндопептидаза с аминокислотной заменой по остатку His213 – консервативному у всех Glu-специфичных протеаз элементу Sучастка. Анализ свойств модифицированного фермента показал, что His213 не определяет способность BIGEP расщеплять субстраты после остатка глутаминовой кислоты, хотя важен для проявления ферментом высокой каталитической эффективности. Таким образом, His213 не является основным элементом распознавания заряда субстрата глутамилэндопептидазами и, по-видимому, для каждой эволюционной ветви Glu-специфичных протеаз характерна своя система компенсации заряда.

3. Впервые для глутамилэндопептидаз на модели BIGEP показано, что пропептид необходим для формирования активного фермента и, следовательно, выполняет функцию фолдинг-ассистента.

4. Установлено, что удаление пропептида BIGEP in vitro происходит ступенчато. Первая стадия процессинга происходит автокаталитически, приводя к образованию неактивного интермедиата, который переходит в активную форму только после гетероактивации.

Таким образом, активация BIGEP in vivo контролируется другими протеазами.

5. Эффективность гетероактивации in vivo и процессирующий фермент определяются остатком в положении (-1) пропептида BIGEP. Введение остатка Glu в позицию (-1) делает фермент автоактивирующимся. Таким образом, модификация остатка (-1) позволяет в ходе эволюции изменять механизмы регуляции активности глутамилэндопептидаз.

6. Разработан подход для получения синтезируемых в виде предшественников протеаз с узкой субстратной специфичностью в гетерологичных экспрессионных системах.

Подход основан на создании автопроцессирующихся ферментов путем направленной модификации сайтов их процессинга.

7. Идентифицирована новая группа термолизинподобных протеаз, представители которой отличаются от классических членов семейства структурой N-концевого пропептида.

8. Создана экспериментальная модель для исследования механизмов функционирования пропептидов пептидаз семейства M4 на основе двух новых детально охарактеризованных в ходе данной работы и имеющих разные типы пропоследовательностей ферментов: металлопротеазы Thermoactinomyces sp. и протеализина Ser. proteamaculans. Модель включает охарактеризованные гены ферментов, системы для их гетерологической экспрессии и методы получения высокоочищенных рекомбинантных белков.

9. На основе рекомбинантного протеализина разработан прототип ферментного препарата для улучшения качества мясного сырья в пищевой промышленности. Эффективность препарата подтверждена в условиях опытного производства.

10. На примере фермента Thermoactinomyces sp. впервые для металлопротеаз продемонстрирован эффект белковой памяти. Впервые обнаружено, что формирование конформеров может происходить в системе пропептид-каталитическая часть in trans, а не при изменении аминокислотной последовательности пропептида.

11. Впервые продемонстрировано, что короткие пропептиды термолизинподобных протеаз выступают в качестве фолдинг-ассистентов, определяя сворачивание соответствующих белков.

12. Впервые установлено, что удаление коротких пропептидов термолизинподобных протеаз может происходить автокаталитически, но, в отличие от длинных пропоследовательностей, по межмолекулярному механизму.

13. Впервые продемонстрировано, что термолизинподобные протеазы с короткими пропептидами могут определять инвазию клеток эукариот бактериями, что, вероятно, связано со способностью ферментов группы протеализина специфически расщеплять актин.

14. Методом рентгеноструктурного анализа определена пространственная структура предшественника протеализина – первая структура предшественника пептидазы семейства M4 и первая структура протеализинподобной протеазы. Показано, что ферменты с короткими пропептидами могут рассматриваться как отдельное подсемейство термолизинподобных протеаз не только по структуре предшественников, но и по структуре каталитического домена. Установлено, что пропептид протеализина образует отдельный домен в структуре белка и выполняет функции внутримолекулярного ингибитора, блокируя субстратсвязывающую область и фиксируя активный центр фермента в неблагоприятной для осуществления катализа «открытой» конформации.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Статьи 1. Демидюк И.В., Звонкова Е.Н., Носовская Е.А., Швец В.И. Вариант очистки генноинженерной металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens. // Биотехнология. 1994. № 11-12.

С. 13-15.

2. Демидюк И.В., Носовская Е.А., Цаплина И.А., Каравайко Г.И., Костров С.В. Выделение и характеристика сериновой протеиназы из Thermoactinomyces species, относящейся к группе Glu,Аsp-специфичных ферментов. // Биохимия. 1997. Т. 62. № 2. С. 202-207.

3. Rebrikov D.V., Akimkina T.V., Shevelev A.B., Demidyuk I.V., Bushueva A.M., Kostrov S.V., Chestukhina G.G., Stepanov V.M. B. intermedius glutamyl endopeptidase. Molecular cloning and nucleotide sequence of the structural gene. // J. Protein Chem. 1999. V. 18. № 1. P. 21-7.

4. Zabolotskaya M.V., Demidyuk I.V., Akimkina T.V., Kostrov S.V. A novel neutral protease from Thermoactinomyces sp. 27a: sequencing of the gene, purification, and characterization of the enzyme. // Protein J. 2004. V. 23. № 7. P. 483-492.

5. Титов Е.И., Митасева Л.Ф., Машенцева Н.Г., Костров С.В., Демидюк И.В. Изменение аминокислотного состава мясного сырья. // Пищевая пром. 2004. № 11. С. 82-83.

6. Demidyuk I.V., Kalashnikov A.E., Gromova T.Yu., Gasanov E.V., Safina D.R., Zabolotskaya M.V., Rudenskaya G.N., Kostrov S.V. Cloning, sequencing, expression, and characterization of protealysin, a novel neutral proteinase from Ser. proteamaculans representing a new group of thermolysin-like proteases with short N-terminal region of precursor. // Protein Expr.

Purif. 2006. V. 47. № 2. P. 551-561.

7. Михайлова А.Г., Лихарева В.В., Хайруллин Р.Ф., Лубенец Н.Л., Румш Л.Д., Демидюк И.В., Костров С.В. Новая психрофильная трипсиноподобная протеиназа из Ser. proteamaculans. // Биохимия. 2006. Т. 71. № 5. С. 697–706.

8. Sharipova M.R., Shagimardanova E.I., Chastukhina I.B., Shamsutdinov T.R., Balaban N.P., Mardanova A.M., Rudenskaya G.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V. The expression of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase gene in Bacillus subtilis recombinant strains. // Mol. Biol.

Rep. 2007. V. 34. № 2. P. 79-87.

9. Гасанов Е.В., Романова Д.В., Громова Т.Ю., Демидюк И.В. Эффект делеции 3'-некодирующей области гена глутамилэндопептидазы B. intermedius на продукцию активного белка клетками B. subtilis. // Мол. ген. микробиол. вирусол. 2007. № 2. С. 31-32.

10. Sharipova M., Balaban N., Kayumov A., Kirillova Y., Mardanova A., Gabdrakhmanova L., Leshchinskaya I., Rudenskaya G., Akimkina T., Safina D., Demidyuk I., Kostrov S. The expression of the serine proteinase gene of Bacillus intermedius in Bacillus subtilis. // Microbiol.

Res. 2008. V. 163. № 1. Р. 39-50.

11. Можина Н.В., Бурмистрова О.А., Пупов Д.В., Руденская Г.Н., Дунаевский Я.Е., Демидюк И.В., Костров С.В. Выделение и свойства цистеиновой протеиназы Ser. pro­ teamaculans 94. // Биоорг. химия. 2008. Т. 34. № 3. С. 303-309.

12. Demidyuk I.V., Gasanov E.V., Safina D.R., Kostrov S.V. Structural organization of precursors of thermolysin-like proteinases. // Protein J. 2008. V. 27. № 6. P. 343-354.

13. Громова Т.Ю., Демидюк И.В., Костров С.В., Сосфенов Н.И., Мелик-Адамян В.Р., Куранова И.П. Кpисталлизация и предварительные рентгеновские исследования кристаллов предшественника пептидазы семейства M4 – протеализина. // Кристаллография.

2008. Т. 53. № 5. С. 840-842.

14. Велишаева Н.С., Гасанов Е.В., Громова Т.Ю., Демидюк И.В. Влияние модификации сайта процессинга глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius на продукцию активного фермента клетками Bacillus subtilis. // Биоорг. химия. 2008. Т. 34, № 6. С. 786-791.

15. Gasanov E.V., Demidyuk I.V., Shubin A.V., Kozlovskiy V.I., Leonova O.G., Kostrov S.V.

Hetero- and auto-activation of recombinant glutamyl endopeptidase from B. intermedius. // Protein Eng. Des. Sel. 2008. V. 21. № 11. P. 653-658.

16. Gromova T.Yu., Demidyuk I.V., Kozlovskiy V.I., Kuranova I.P., Kostrov S.V. Processing of protealysin precursor. // Biochimie. 2009. V. 91. № 5. P. 639-645.

17. Цаплина О.А., Ефремова Т.Н., Кевер Л.В., Комиссарчик Я.Ю., Демидюк И.В., Костров С.В., Хайтлина С.Ю. Выявление актиназной активности протеализина. // Биохимия. 2009.

Т. 74. № 6. С. 797–804.

18. Хайруллин Р.Ф., Михайлова А.Г., Себякина Т.Ю., Лубенец Н.Л., Зиганшин Р.Х., Демидюк И.В., Громова Т.Ю., Костров С.В., Румш Л.Д. Олигопептидаза B из Ser. proteomaculans. I. Определение первичной структуры, выделение и очистка природного и рекомбинантного фермента. // Биохимия. 2009. Т. 74. № 10. С. 1427–1437.

19. Demidyuk I.V., Gromova T.Yu., Polyakov K.M., Melik-Adamyan W.R., Kuranova I.P., Kostrov S.V. Crystal structure of protealysin precursor: insights into propeptide function. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. № 3. P. 2003-2013.

20. Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from B. intermedius. // FEBS Lett. 2010. V. 584. № 21. P. 4419-4425.

21. Михайлова А.Г., Хайруллин Р.Ф., Демидюк И.В., Громова Т.Ю., Костров С.В., Румш Л.Д.

Олигопептидаза B из Ser. proteamaculans. II. Энзиматическая характеристика – субстратный анализ, влияние ионов кальция, рH- и температурная зависимость. // Биохимия. 2011. Т. 76. № 4. С. 590-602.

22. Bozhokina E.S., Tsaplina O.A., Efremova T.N., Kever L.V., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Adam T., Komissarchik Ya.Yu., Khaitlina S.Yu. Bacterial invasion of eukaryotic cells can be mediated by actin-hydrolyzing metalloproteases grimelysin and protealysin. // Cell Biol. Int.

2011. V. 35. № 2. P. 111-118.

23. Safina D., Rafieva L., Demidyuk I., Gasanov E., Chestukhina G., Kostrov S. Involvement of propeptides in formation of catalytically active metalloproteinase from Thermoactinomyces sp.

// Protein Pept. Lett. 2011. V. 18. № 11. P. 1119-1125.

24. Klykov S.P., Kurakov V.V., Vilkov V.B., Demidyuk I.V., Gromova T.Yu., Skladnev D.A. A cell population structuring model to estimate recombinant strain growth in a closed system for subsequent search of the mode to increase protein accumulation during protealysin producer cultivation. // Biofabrication. 2011. V. 3. № 4. P. 045006.

25. Tsaplina O., Efremova T., Demidyuk I., Khaitlina S. F-actin is a substrate for protealysin, a metalloprotease of invasive Ser. proteamaculans. // FEBS J. 2012. V. 279. № 2. P. 264-274.

Обзоры 26. Демидюк И.В., Костров С.В. Особенности функциональной организации глутамилэндопептидаз. // Мол. биология. 1999. Т. 33. № 1. С. 100-105.

27. Демидюк И.В., Заболотская М.В., Велишаева Н.С., Сафина Д.Р., Костров С.В.

Прозависимый фолдинг микробных протеолитических ферментов. // Мол. ген. микробиол. вирусол. 2003. № 4. С. 11-15.

28. Демидюк И.В., Сафина Д.Р., Заболотская М.В., Костров С.В. Молекулярные механизмы стабилизации протеолитических ферментов. Модель термолизинподобных микробных металлопротеиназ. // Биоорг. химия. 2003. Т. 29. № 5. С. 418-426.

29. Демидюк И.В., Костров С.В. Организация и функционирование белковых молекул.

Модель протеолитических ферментов. / В книге: Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 2. Отв. редактор Е.Д. Свердлов. // M.: Наука, 2004. С. 125-163.

30. Demidyuk I.V., Shubin A.V., Gasanov E.V., Kostrov S.V. Propeptides as modulators of functional activity of proteases. // Biomolecular Concepts. 2010. V. 1. № 3-4. P. 305-322.

Патент 31. Костров С.В., Демидюк И.В. Способ хроматографического выделения и очистки белка.

Патент РФ № 2322505, приоритет от 30.06.2006.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.