WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

Ван Вэньчжу РОЛЬ

ЦИТОСКЕЛЕТА В УПОРЯДОЧЕННОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ И РАСПРЕДЕЛЕНИИ ОРГАНЕЛЛ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена на кафедре клеточной биологии и гистологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный консультант:

Доктор биологических наук Смирнова Елена Александровна Профессор кафедры клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Глушанкова Наталия Александровна Ведущий научный сотрудник лаборатории механизмов канцерогенеза Федерального бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.

Блохина» РАМН, Москва Кандидат биологических наук Бураков Антон Владимирович Научный сотрудник лаборатории структуры и функций цитоскелета отдела функциональной биохимии биополимеров НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва

Ведущая организация:

Институт Биологии Развития имни Н.К. Кольцова РАН, Москва

Защита состоится 22 мая 2012 года в 15 часов 30 минут на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В.

Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, Биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » апреля 2012г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Цитоплазма клеток эукариот представляет собой сложно организованную систему функционирующих комплексов, от взаимного расположения которых зависят многие внутиклеточные процессы, влияющие на рост, морфогенез и дифференцировку тканей многоклеточных организмов. Общеизвестно, что цитоплазма подразделяется на специализированные структурно-функциональные домены или компартменты (Cheung and Wu, 2007; van Zutphen and van der Klei, 2011), и расположение органелл в тех или иных компартментах зависит от функциональной нагрузки, характера роста клеток, стадий их дифференцировки и поступающих в клетку сигналов. Изменение этих параметров вызывает реорганизацию цитоплазмы, которая осуществляется путем перемещения органелл в ходе внутриклеточного транспорта, при участии элементов цитоскелета - микротрубочек и актиновых филаментов, и связанных с ними моторных белков (кинезинов, динеина и миозинов) (Vale, 2003). Транспорт сопровождается изменением расположения и перераспределением органелл, и ведет к перестройке структурно-функциональных компартментов/доменов. Однако, возникает вопрос, какие механизмы обеспечивают удерживание и заякоривание органелл в тех или иных доменах цитоплазмы. Изучение механизмов, которые обеспечивают и поддерживают упорядоченную локализацию органелл в цитоплазме, а также регулируют реорганизацию цитоплазматических компартментов/доменов в ответ на внутренние или внешние сигналы, в ходе роста и дифференцировки клеток является важной научной задачей.

Цитоскелет играет важную роль в процессах роста, развития и дифференцировки клеток, тканей и органов растений, но его структура и организация имеет ряд существенных отличий и особенностей. Так, например, в клетках высших растений отсутствуют промежуточные филаменты, микротрубочки формируют несколько систем, которые последовательно сменяют друг друга в ходе клеточного цикла, причем центросома и иные типы дискретных ЦОМТ отсутствуют (Smirnova and Bajer, 1992; Mineyuki, 2007). Система актиновых филаментов в клетках растений также меняется в ходе клеточного цикла, но, в отличие от микротрубочек, ее организация зависит от типа ткани и стадии дифференцировки клеток в составе ткани/органа (Blancaflor et al., 2006). Также как и в клетках животных, в клетках растений транспорт органелл осуществляется по фибриллам цитоскелета при участии моторных белков. Однако у растений перемещение органелл на длинные расстояния происходит по актиновым филаментам, в то время как роль микротрубочек состоит в обеспечении транспорта на короткие расстояния (Boevinek et al., 1998; VanGestel et al., 2002;

Kim et al., 2005). Еще одной особенностью клеток растений является то, что у них ярко выражена компартментализация цитоплазмы. Характерная локализация клеточных структур и проявление их функциональной активности лежит в основе процессов поляризованного роста клеток растений, одним из ярких примеров которой является растущая пыльцевая трубка представителей покрытосемянных растений. Таким образом, в растительных клетках идет постоянное чередование процессов перемещения, то есть изменения локализации, с необходимостью поддерживания упорядоченной организации цитоплазмы, которая необходима для обеспечения поляризованного роста и дифференцировки. Однако до сих пор нет ясности в вопросе о том, что происходит после доставки органелл «по адресу», каким образом органеллы удерживаются в том месте, где им «предназначено» находиться, участвует ли цитоскелет клеток растений в поддерживании упорядоченной локализации органелл в составе структурно-функциональных доменов. Исходя из этого, были сформулированы и поставлены следующие цели и задачи исследования.

Цель исследования. Изучить роль цитоскелета в упорядоченной локализации и распределении органелл клеток высших растений.

Задачи исследования. Используя в качестве объекта исследования клетки корешков проростков пшеницы Triticum aestivum L. :

1) Исследовать расположение и распределение аппарата Гольджи и ЭПР относительно системы микротрубочек и актиновых филаментов в клеточном цикле.

2) Проанализировать локализацию и распределение аппарата Гольджи и ЭПР после разрушения и при подавлении сборки микротрубочек колхицином.

3) Проанализировать локализацию и распределение аппарата Гольджи и ЭПР после разрушения актиновых филаментов латрункулином В.

Научная новизна. В работе детально проанализировано расположение компонентов синтетической (ЭПР) и секреторной (диктиосомы аппарата Гольджи) системы относительно микротрубочек и актиновых филаментов в находящихся на разных стадиях клеточного цикла клетках корешков проростков пшеницы T. aestivum L. Были получены новые результаты, которые показывают, что микротрубочки обеспечивают разобщенное расположение диктиосом аппарата Гольджи в цитоплазме интерфазных клеток, и смещение диктиосом от из зоны веретена в митозе, а также поддерживают структурную целостность диктиосом.

Кроме этого, микротрубочки влияют на характер распределения цистерн сети ЭПР из околоядерной зоны в периферическую цитоплазму интерфазных клеток, а также обеспечивают смещение ЭПР из зоны веретена во время митоза. Впервые было показано, что актиновые филаменты участвуют в транспорте секреторных везикул от аппарата Гольджи в разные домены цитоплазмы, поддерживают упорядоченную околоядерную локализацию ЭПР во время интерфазы и доставку элементов ЭПР в область формирования фрагмопласта во время завершающих стадий митоза. В целом, в данной работе впервые было показано, что не только локалазация, но и распределение (диспергированное или компактное) диктиосом и ЭПР в составе цитоплазматических доменов зависит от элементов цитоскелета.

Теоретическая и практическая значимость. Данная работа была направлена на изучение клеточных механизмов, обеспечивающих и поддерживающих упорядоченную организацию цитоплазмы клеток высших растений, поэтому она имеет большое теоретическое значение. Полученные результаты расширяют представления о функциях цитоскелета как о динамичной системе полимеров, которая контролирует рост и морфогенез тканей растений, и быстро реагирует на изменение условий окружающей среды. Результаты работы вносят вклад в понимание процессов, связанных с реорганизацией цитоплазмы клеток в ответ на действие факторов, оказывающих влияние на цитоскелет. Практическая значимость результатов состоит в том, что они могут быть использованы при создании линий растений, устойчивых к дейтствию внешних фаткоров, при скринниге мутантных растений, в биотехнологии, агробиологии и фитопатологии.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2009 и Ломоносов-2010, Москва; Asian Congress on Biotechnology, May 11-15, 2011, Shanghai, China; Chinese society for cell biology, July 2011, Beijing, China; BIT’s 1st Annual World Congress of Molecular & Cell Biology, August 2011, Beijing, China; Всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет», октябрь 2011, Санкт Петербург. Основные результаты работы были представлены на заседании кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 1 статья в рецензирумом журнале, рекомендованном ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 65 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка цитируемой литературы.

Материал диссертации содержит 2 таблицы и 39 рисунков, из которых 35 находятся в приложении. В списке цитируемой литературы приведены 103 зарубежных источника.





СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Объектом исследования являлись проростки пшеницы Triticum aestivum L. сорта Московская 39 (2n = 42). Семена пшеницы проращивали при 250C на влажной фильтровальной бумаге, помещенной в чашки Петри. Для исследований использовались проростки, корешки которых достигали длины 1-1.5 см.

Инкубация с колхицином. Проростки помещали в водный раствор 0.2% колхицина (Sigma Aldrich) и инкубировали при 250C. Через 1, 6, 12 и 24 часа корешки отрезали и фиксировали для иммуноцитохимического или электронно-микроскопического анализа.

Инкубация с латрункулином В. Проростки помещали в водный раствор латрункулина В (Sigma Aldrich) в концентрации 10-5 М на 1 час и инкубировали при 250C. Затем корешки отрезали и фиксировали для иммуноцитохимического или электронно-микроскопического анализа.

Иммуноцитохимическое и цитохимическое выявление элементов цитоскелета и клеточных органелл. Корешки фиксировали в 4% растворе параформальдегида, растворенном в буферном растворе PHEM (pH 6.9) при комнатной температуре (18-22 °С) в течение 2 часов. Для разрушения клеточной стенки корешки инкубировали в растворе 1% целлюлазы (Sigma Aldrich), 0.4 М маннитола и 5 мМ ЭДТА. Затем корешки помещали на покровные стекла и под бинокулярной лупой мацерировали с помощью тонкой иглы.

Полученную клеточную суспензию оставляли для высыхания в холодильнике при 40C. После этого, покровные стекла с клетками покрывали 0.2% водным раствором желатины и снова высушивали. Высушенные препараты помещали на 30 минут в буферный раствор PHEM с добавлением 0.5% Triton-X100 и 5% DMSO, затем инкубировали в трех сменах PBS по минут в каждой смене.

Выявление микротрубочек и аппарата Гольджи:

1 этап – детекция микротрубочек: крысиные моноклональные антитела YOL1/34 к aтубулину (Abcam), ослиные IgG к иммуноглобулинам крысы, конъюгированные с Texas Red (Jackson Immunochemicals). 2 этап – детекция аппарата Гольджи: мышиные моноклональные антитела к белку аппарата Гольджи 58К/FTCD (Sigma Aldrich), ослиные IgG к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с Alexa 488 (Invitrogene).

Выявление микротрубочек и ЭПР:

1 этап – детекция микротрубочек: крысиные моноклональные антитела YOL1/34 к aтубулину (Abcam), ослиные IgG к иммуноглобулинам крысы, конъюгированные с Texas Red (Jackson Immunochemicals). 2 этап – детекция ЭПР: мышиные моноклональные антитела KDEL к ЭПР (Abcam), ослиные IgG к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с Alexa 488 (Invitrogene).

Выявление актиновых филаментов и аппарата Гольджи:

1 этап - детекция аппарата Гольджи: мышиные моноклональные антитела к белку аппарата Гольджи 58К/FTCD (Sigma Aldrich), ослиные IgG к иммуноглобулинам мыши конъюгированным с Alexa 488 (Invitrogene). 2 этап - детекция актиновых филаментов:

фаллоидин, конъюгированный с Техas Red (Invitrogene).

Выявление актиновых филаментов и ЭПР:

1 этап - детекция ЭПР: мышиные моноклональные антитела KDEL к ЭПР (Abcam), ослиные IgG к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с Alexa 488 (Invitrogene). 2 этап - детекция актиновых филаментов: фаллоидин, конъюгированный с Техas Red (Invitrogene).

Полученные препараты заключали в заливочную смесь Prolong Gold, содержащую DAPI (Invitrogene). Клетки анализировали и фотографировали на микроскопе Аxiovert 200М, используя стандартный набор фильтров и объектив Neofluar 100. Изображения записывали с помощью цифровой камеры AxioCam HRm и анализировали с помощью программы Adobe Photoshop 7.0 и Image J. Препараты также анализировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа TCS SP2, Leica Microsystems, (Germany).

Электронная микроскопия. Для просвечивающей электронной микроскопии корешки фиксировали 2.5% глутаровым альдегидом на 0.1 М Na-K фосфатном буфере (рН 7.2) с добавлением сахарозы (15 мг/мл). Образцы постфиксировали в 1% OsO4 и оставляли на ночь при 40C в 70% этаноле, содержащем 2% уранил ацетата. Затем проводили дегидратацию проб в серии спиртов и ацетона и заключали в эпон 812 по стандартной методике.

Ультратонкие срезы помещали на покрытые формваром бленды, окрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу и исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM-1011 (JEOL) с цифровой фотокамерой GATAN ES500W.

Результаты и обсуждение Локализация аппарата Гольджи относительно микротрубочек в контрольных клетках В интерфазных клетках диктиосомы аппарата Гольджи распределены во всей цитоплазме, но преимущественно скапливаются в ее околоядерной зоне (рис. 1а, б). При вступлении в митоз, диктиосомы перераспределяются от ядра на периферию профазного веретена, где они располагаются и во время прометафазы, причем во многих клетках они аккумулируются над полярными зонами веретена (рис. 1 ж). Локализация диктиосом вокруг веретена и аккумуляция над его полярными зонами поддерживается и в метафазе. Во время анафазы диктиосомы также располагаются вокруг веретена и над его полярными зонами, но в средней-поздней анафазе аппарат Гольджи начинает выявляться в интерзоне, между расходящимися хромосомами, а в телофазе обнаруживается в составе проксимальной зоны фрагмопласта (рис. 1 и). Во время завершающих стадий цитокинеза диктиосомы располагаются вблизи дистальной зоны фрагмопласта и вокруг ядер дочерних клеток. Кроме этого, антитела к аппарату Гольджи выявляют антиген в клеточной пластинке, разделяющей родительскую клетку на дочерние клетки (рис. 1 л).

Рисунок 1. Аппарат Гольджи (зеленый) в клетках корешков пшеницы. а,б – интерфаза, контроль; в,г – интерфаза, колхицин; д,е – интерфаза, латрункулин; а,в,д – околоядерная зона, б,г,е – кортикальная цитоплазма; ж – прометафаза, контроль; з – К-метафаза, колхицин (синие – хромосомы); и –телофаза, контроль; к – телофаза, латрункулин; л –поздняя телофаза контроль; м – поздняя телофаза, латрункулин. Масштаб – 10 мкм.

Локализация аппарата Гольджи после разрушения микротрубочек колхицином При кратковременном действии колхицина (1 час) происходит разрушение кортикальных микротрубочек в интерфазных клетках, которое не вызывает значительных изменений расположения аппарата Гольджи. Разрушение митотического веретена в делящихся клетках вызывает переход в К-митоз, во время которого диктиосомы располагаются вокруг К-митотических хромосом. Это отличается от распределения диктиосом в метафазных клетках контрольных образцов, в которых диктиосомы смещаются от хромосом на периферию митотического веретена.

Локализация аппарата Гольджи при подавлении сборки микротрубочек При длительном действии колхицина (6-24 часа) микротрубочки в клетках отсутствуют, так как произошла полная разборка старых, и ингибируется сборка новых микротрубочек. Кроме этого, в клетках собираются тубулиновые тяжи, располагающиеся в кортикальной, субкортикальной или околоядерной цитоплазме, в зависимости от стадии клеточного цикла (Lazareva et al., 2003). В этих условиях, как в интерфазных, так и в митотических клетках, меняется характер выявления аппарата Гольджи - окрашивание становится более диффузным или мелкодисперсным. В то же время, в интерфазных клетках диктиосомы агрегируют и образуют разные по размеру, форме и плотности скопления и кластеры (рис. 1в, г). Митотические клетки в присутствии колхицина проходят через Кмитоз, во время которого аппарат Гольджи располагается вокруг хромосом (рис. 1 з), и распределение диктиосом вокруг хромосом может быть как равномерным и диффузным, так и в виде зональных скоплений. Агрегация диктиосом вокруг К-метафазных хромосом дает основания полагать, что обеспечение и поддерживание удаленного от хромосом расположения аппарата Гольджи во время нормального митоза зависит от микротрубочек веретена.

Ультраструктура аппарата Гольджи Диктиосомы аппарата Гольджи клеток контрольных образцов (рис. 2 а) состоят, в среднем, из 6-8 уплощенных цистерн, каждая диктиосома имеет отчетливую структурную полярность, в транс-части находится разное число везикул, которые являются частью TGN компартмента диктиосом у растений (Staehelin and Kang, 2008). Согласно данным литературы, цис и транс части аппарата Гольджи отличаются по толщине цистерн и плотности их содержимого (Donohue et al., 2007). Основываясь на этих морфологических признаках, мы анализировали и сравнивали с контролем диктиосомы, которые присутствуют в клетках корешков после действия колхицина. Было обнаружено несколько типов диктиосом (таблица 1): 1) диктиосомы с такой же морфологией, как и в контроле (1 тип); 2) диктиосомы, состоящие из изогнутых или волнистых цистерн (2 тип); 3) диктиосомы, состоящие из фрагментированных или везикулярных цистерн, причем общее число цистерн было редуцировано до 3-5 (3 тип); 4) диктиосомы состоящие всего из 3-4 цистерн (4 тип) (рис. 2 б). Все типы диктиосом, кроме 4 типа, были выявлены как после кратковременного (час) так и продолжительного (6-24 часа) действия колхицина. Но, как показано в таблице 1, морфология диктиосом прогрессивно меняется по мере увеличения времени воздействия.

Рисунок 2. Электронно-микроскопический анализ аппарата Гольджи и ЭПР в клетках корешков пшеницы. а – диктиосомы в клетках контрольных образцов; б – диктиосома с уменьшенным числом цистерн, колхицин; в – длинная диктиосома в кортексе, колхицин; г,д – диктиосомы с гипертрофированным TGN компартментом, латрункулин; е – ЭПР в клетках контрольных образцов, ж – ЭПР после действия латрункулина; з – ЭПР после действия колхицина.

Можно предположить, что изменение морфологии цистерн (2 тип) и/или фрагментация цистерн (3 тип) являются начальными стадиями дегенеративных изменений, которые могут приводить к уменьшению числа цистерн в диктиосоме (4 тип). Поэтому, диффузный характер окрашивания, который мы наблюдали при иммуноцитохимическом выявлении аппарата Гольджи, можно объяснить, как постепенным разрушением диктиосом (уменьшением размера диктиосом за счет редукции числа цистерн), так и перераспределением диктиосом из околоядерной зоны в кортикальную цитоплазму. В свою очередь, диктиосомы имеют тенденцию к агрегации и формированию кластеров, возможно, путем сближения и группировки соседних диктиосом, или слияния, с последующим формированием более крупных диктиосом. Мы обнаружили в кортикальной цитоплазме гигантские диктиосомы (рис. 2 в), которые по длине в несколько раз превышают размеры диктиосом клеток контрольных образцов.

Таблица 1. Морфологические типы диктиосом в клетках корешков проростков, которые инкубировали с колхицином.

Число диктиосом Колхицин Колхицин Колхицин Колхицин Морфологический 1 час 6 час 12 час 24 час тип диктиосом Тип 1 16 15 13 (как в контроле) Тип 2 8 9 6 (волнистые цистерны) Тип 3 9 7 8 (фрагментированные цистерны) Тип 4 0 0 1 (уменьшенное колво цистерн) 33 31 28 Измерение длины диктиосом на случайных срезах показало значительное увеличение протяженности диктиосом (примерно на 37%) при длительном действии колхицина (таблица 2), как раз в то время, когда на светооптическом уровне с помощью антител к белку-маркеру аппарата Гольджи выявляются длинные тубулярные образования в кортикальной цитоплазме. Образование таких структур можно объяснить слиянием диктиосом или нарушением их разделения в процессе биогенеза.

Таблица 2. Средняя длина диктиосом аппарата Гольджи, подсчитанная на случайных ультратонких срезах клеток корешков в контроле и после инкубации с колхицином.

Контроль Колхицин Колхицин Колхицин Колхицин 1 час 6 час 12 час 24 час Количество 48 59 51 80 1диктиосом Средняя 0.82±0.03 0.96±0.02 0.75±0.02 1.13±0.03 1.12±0.длина диктиосом (m) Локализация ЭПР относительно микротрубочек в контрольных клетках В клетках, находящихся на стадии интерфазы, ЭПР выявляется в цитоплазме в виде сети, которая образует более плотные скопления в околоядерной области (рис. 3 а, б), что соответствует данным литературы о структурной связи ЭПР с ядерной оболочкой (Matheson et al., 2006). При вступлении в митоз, скопления ЭПР выявляются над полюсами профазного веретена. Такое же расположение ЭПР характерно и для прометафазы, но наиболее четко «надполюсное» расположение ЭПР проявляется в метафазе (рис. 3 ж), когда ЭПР располагается выше дистальных участков кинетохорных фибрилл веретена. Во время анафазы ЭПР по-прежнему находится над полярными зонами веретена, но появляется и в интерзональной области, между расходящимися хромосомами, где формируется фрагмопласт. Во время телофазы прослеживается ярко выраженная локализация ЭПР в зоне фрагмопласта (рис. 3 к), а во во время завершающих стадий цитокинеза ЭПР уже аккумулируется в виде скоплений вокруг ядер дочерних клеток (рис. 3 л).

Рисунок 3. ЭПР (зеленый) в клетках корешков пшеницы. а,б – интерфаза, контроль; в,г – интерфаза, колхицин; д,е – интерфаза, латрункулин; а,в,д – околоядерная зона, б,г,е – кортикальная цитоплазма; ж – метафаза, контроль; з,и – К-метафазы, колхицин (синие - хромосомы); к,л – телофаза и поздняя телофаза, контроль; м,н – телофаза и поздняя телофаза, латрункулин. Масштаб – 10 мкм.

Локализация ЭПР после разрушения микротрубочек После разрушения микротрубочек расположение ЭПР в интерфазных клетках почти не отличается от того, что наблюдается в клетках контрольных образцов. Во время К-митоза скопления ЭПР окружают хромосомы, но в некоторых клетках эти скопления с хромосомами не контактируют, то есть, располагаются на некотором расстоянии от них.

Локализация ЭПР при подавлении сборки микротрубочек В интерфазных клетках после длительного действия колхицина ЭПР образует гипертрофированные агрегаты, которые окружают ядро и располагаются в его инвагинациях, а также распространяются в центральную, и даже кортикальную цитоплазму (рис. 3 в, г).

Агрегированный ЭПР имеет вид вытянутых и/или расширенных трубок, цистерн, везикул, цепочек из трубочек, и др. В К-митотических клетках ЭПР располагается вокруг хромосом в виде диффузных скоплений. Но, в отличие от аппарата Гольджи, который плотно окружает К-метафазные хромосомы, скопления ЭПР не обязательно контактируют с хромосомами (рис. 3 з, и).

Ультраструктура ЭПР В клетках контрольных образцов ЭПР представлен системой покрытых рибосомами цистерн, которые на срезах имеют вид ровных и протяженных трубочек (рис. 2 е). Трубочки более или менее равномерно распределены в цитоплазме, но их намного больше в околоядерной зоне. После разрушения микротрубочек колхицином (1 час), мы не обнаружили изменений структуры ЭПР. Однако при длительном действии колхицина ровные и плоские цистерны/трубочки ЭПР собираются и укладываются параллельно друг другу в стопки, которые могут быть как прямыми, так и неправильной формы (рис. 2 з). В стопках содержится до 10-12 цистерн (трубочек) ЭПР, и они располагаются в околоядерной зоне, в периферической и кортикальной цитоплазме. Таким образом, данные электронной микроскопии подтверждают результаты, полученные с помощью световой микроскопии, и показывающие, что ингибирование сборки микротрубочек вызывает изменения системы ЭПР, которые связаны не с набуханием или увеличением объема цистерн, а с формированием крупных локальных и упорядоченно уложенных скоплений ЭПР.

Локализация аппарата Гольджи и актиновых филаментов в контрольных клетках В клетках на стадии интерфазы актиновые филаменты формируют разнообразные пучки, которые располагаются в околоядерной и субкортикальной цитоплазме.

Околоядерные пучки тянутся параллельно друг другу или образуют конусовидные конфигурации, их длина и ориентация в цитоплазме варьирует. Диктиосомы аппарата Гольджи, располагающиеся в кортикальной и околоядерной цитоплазме, колокализуется с некоторыми пучками актиновых филаментов. При вступлении в митоз пучки актиновых филаментов разрушаются, аппарат Гольджи перераспределяется, и сначала формирует околоядерные скопления, а затем смещается на периферию профазного веретена. Во время прометафазы-метафазы сеть актиновых филаментов выявляется в цитоплазме в виде диффузного свечения, более интенсивного в полярных зонах веретена. Аппарат Гольджи концентрируется в полярных зонах, в области скопления актина и, в меньшей степени, на периферии экваториальной части веретена. На стадии анафазы сеть актиновых филаментов присутствует в полярных зонах и в интерзоне, между расходящимися хромосомами, где она входит в состав фрагмопласта, и в этих же зонах располагается аппарат Гольджи. Во время ранней телофазы между хромосомами выявляется актиновый компонент фрагмопласта, который «имитирует» расположение его микротрубочек. Аппарат Гольджи располагается в этой же зоне, и «актиновый» фрагмопласт находится внутри интерзонального скопления диктиосом. Во время средней и поздней телофазы актиновые филаменты присутствуют в составе фрагмопласта, и по мере его роста от центра к периферии, распространяются вместе с ним. В это время аппарат Гольджи выявляется внутри «актинового» фрагмопласта и в составе клеточной пластинки, а также аккумулируется вокруг ядер дочерних клеток.

Локализация аппарата Гольджи после разрушения актиновых филаментов После действия латрункулина В, локализация и распределение диктиосом в интерфазных клетках почти не меняется, хотя небольшие скопления диктиосом видны в кортикальной цитоплазме (рис. 1 д, е). По мере формирования веретена в профазе, диктиосомы смещаются на его периферию. На стадии прометафазы-метафазы скопления аппарата Гольджи располагаются как в полярных зонах веретена, так и в цитоплазме над ними, а также между кинетохорными фибриллами. В этих же зонах диктиосомы выявляются и во время анафазы, но в этот период появляются и между расходящимися хромосомами, где они колокализуются с интерзональными микротрубочками, участвующими в формировании фрагмопласта. В телофазе расположение аппарата Гольджи зависит от стадии формирования фрагмопласта. На начальных стадиях, во время роста фрагмопласта от центра к периферии клетки, аппарат Гольджи заполняет зону, где располагаются микротрубочки (рис. 1 к). После того, как фрагмопласт контактирует с клеточной стенкой родительской клетки, диктиосомы выявляются в дистальной части фрагмопласта, а поздней телофазе и ранней G1 фазе они диффузно распределены в цитоплазме, хотя уже прослеживается их околоядерная локализация (рис. 1м). Таким образом, после разрушения актиновых филаментов, прослеживается тенденция к появлению локальных скоплений диктиосом аппарата Гольджи в кортексе интерфазных клеток. Значительных изменений в локализации аппарата Гольджи митотических клеток не выявлено.

Ультраструктура аппарата Гольджи Несмотря на то, что значительных изменений в локализации и распределении аппарата Гольджи после разрушения актиновых филаментов выявлено не было, анализ с помощью электронной микроскопии показал, что ультраструктура диктиосом значительно меняется по сравнению с тем, что было обнаружено в клетках контрольных образцов. Это выражается в том, что как в интерфазных, так и в митотических клетках, вокруг диктиосом присутствует множество пузырьков и везикул разного размера и формы (рис. 2 г, д). Как правило, везикулы, располагаются в транс-части, но иногда окружают всю диктиосому.

Согласно данным литературы, составной частью диктиосом аппарата Гольджи растительных клеток является хорошо выраженный TGN компармент, который представлен везикулярными элементами, отходящими или ассоциированными с транс-частью диктиосом (Matheson et al., 2006; Staehelin and Kang, 2008). Следовательно, разрушение актиновых филаментов, скорее всего, вызывает гипертрофические изменения именно этого структурного компартмента диктиосом. Накопление везикул в TGN компартменте диктиосом может быть связано с усилением секреции, но в связи с тем, что это состояние наблюдается при отсутствии в клетках актиновых филаментов, можно предположить, что происходит подавление транспорта продуктов секреции от аппарата Гольджи.

Локализация ЭПР относительно актиновых филаментов в контрольных клетках В интерфазных клетках элементы ЭПР колокализуется с пучками актиновых филаментов, что подтверждает данные литературы о пространственной связи актина и ЭПР в клетках растений (Ueda et al., 2010). При вступлении в митоз, сеть ЭПР формирует полярные шапочки в профазе, а затем смещается в полярные зоны веретена, где колокализуется с актином в течение прометафазы, метафазы и анафазы. Во время анафазы происходит постепенное перераспределение ЭПР в интерзону, где формируется фрагмопласт. В телофазе ЭПР выявляется в составе актинового компонента фрагмопласта, но он отсутствует в его более «старых», то есть, расположенных ближе центру, зонах.

Локализация ЭПР после разрушения актиновых филаментов В интерфазных клетках ЭПР равномерно распределен во всей цитоплазме, но, в отличие от контрольных клеток, не скапливается в околоядерной зоне (рис. 3 д, е). В Gфазе, ЭПР образует рыхлые и крупные агрегаты, которые располагаются как в центральной зоне цитоплазмы, так и в кортексе. Это отличается от расположения ЭПР в контрольных клетках, у которых ЭПР образует около ядра компактные скопления. Однако, на стадии прометафазы и метафазы, ЭПР располагается так же, как и в контрольных клетках, то есть, над полюсами митотического веретена. Во время анафазы-телофазы ЭПР выявляется во всей цитоплазме, но все же прослеживается его аккумуляция в полярных зонах веретена, и в интерзоне, где формируется фрагмопласт. Однако, сеть ЭПР в интерзоне более разреженная (рис. 3 м), чем в клетках контрольных образцов (рис. 3 к). Кроме этого, не наблюдается агрегации сети ЭПР вокруг ядер дочерних клеток в поздней телофазе (рис. 3 н). Таким образом, разрушение актиновых филаментов приводит к дезорганизации и разреживанию околоядерной сети ЭПР в интерфазных клетках, а в митотических клетках вызывает нарушение аккумуляции ЭПР в зоне формирования фрагмопласта.

Ультраструктура ЭПР После разрушения актиновых филаментов, цистерны/трубочки ЭПР становятся волнистыми, неровными, на них появляются локальные вздутия, прослеживается разрозненный характер распределения ЭПР в цитоплазме (рис. 2 ж). Таким образом, данные электронной микроскопии не только подтверждают наблюдения, сделанные с помощью световой микроскопии, но и показывают, что дезорганизация ЭПР сопровождается разобщением единой сети и ее структурными изменениями. Можно предположить, что эти изменения являются следствием разрушения актиновых филаментов.

Заключение Сравнение расположения аппарата Гольджи и ЭПР в клетках с интактными микротрубочками и после их разрушения/подавления сборки выявило следующие закономерности:

Отсутствие микротрубочек в интерфазных клетках вызывает перераспределение аппарата Гольджи из околоядерной зоны в периферическиую цитоплазму и изменение характера выявления диктиосом антителами к белку-маркеру аппарата Гольджи с гранулярного, как в клетках контрольных образцов, на мелкодисперсный. В то же время, диктиосомы агрегируют и образуют скопления и кластеры в кортикальной цитоплазме.

Электронно-микроскопические исследования ультраструктуры аппарата Гольджи показали, что с одной стороны, диктиосомы содержат меньше цистерн, а с другой стороны, длина диктиосом увеличивается, и в кортикальной цитоплазме присутствуют длинные диктиосомы, которые не встречаются в клетках контрольных образцов. В митотических клетках отсутствие веретена деления вызывает вступление клеток в К-митоз, во время которого диктиосомы аппарата Гольджи агрегирует вокруг К-митотических хромосом.

Что касается ЭПР, то отсутствие микротрубочек в интерфазных клетках вызывает гипертрофическую агрегацию ЭПР, наиболее выраженную в околоядерной зоне цитоплазмы.

Электронно-микроскопические исследования показали, что это связано с формированием крупных локальных скоплений цистерн ЭПР, упорядоченно уложенных в виде стопок. В митотических клетках скопления ЭПР аккумулируется вокруг К-митотических хромосом, но не всегда с ними контактируют. Удаленное от хромосом расположение ЭПР может быть связано с начальными стадиями процесса распада ядерной оболочки, с которой ЭПР непосредственно связан и является ее продолжением.

Таким образом, можно сделать заключение, что микротрубочки обеспечивают: 1) независимое (разобщенное) расположение диктиосом в цитоплазме интерфазных клеток и смещение диктиосом от хромосом и из зоны веретена в митозе; кроме этого, микротрубочки поддерживают структурную целостность диктиосом; 2) распространение и распределение цистерн сети ЭПР из околоядерной зоны в периферическую цитоплазму интерфазных клеток, а также смещение ЭПР из зоны веретена во время митоза.

Сравнение расположения аппарата Гольджи и ЭПР в клетках с интактными актиновыми филаментами и после их разрушения выявило следующие закономерности:

Отсутствие актиновых филаментов не вызывает значительных изменений в расположении аппарата Гольджи во время клеточного цикла, однако электронномикроскопический анализ показал, что происходит увеличение числа и размеров ассоциированных с диктиосомами везикулярных элементов TGN компартмента. Это может быть связано с нарушением транспорта секреторных везикул от диктиосом. В отличие от аппарата Гольджи, локализация ЭПР на некоторых стадиях клеточного цикла после разрушения актиновых филаментов меняется. Во время интерфазы ЭПР равномерно распределен по всей цитоплазме и не образует компактных скоплений в околоядерной зоне.

Дезорганизация системы ЭПР прослеживается и на ультрастуктурном уровне, что выражается в изменении форма цистерн ЭПР и их расположения относительно друг друга.

Во время митоза, локализация ЭПР меняется на стадии анафазы-телофазы, когда, в отличие от контрольных клеток, не происходит аккумуляции ЭПР в зоне формирования фрагмопласта.

На основании полученных данных можно предположить, что актиновые филаменты поддерживают транспорт секреторных продуктов от аппарата Гольджи в разные «пункты назначения» в цитоплазме, компактную околоядерную локализацию ЭПР во время интерфазы и доставку элементов ЭПР в область формирования фрагмопласта во время завершающих стадий митоза.

Обобщая полученные данные, можно предположить, что микротрубочки обеспечивают «диспергированное» распределение диктиосом аппарата Гольджи и ЭПР, а актиновые филаменты, наоборот, поддерживаюют компактное состояние ЭПР, и кроме этого, обеспечивают транспорт секреторных везикул от диктиосом.

ВЫВОДЫ 1. Микротрубочки и актиновые филаменты в клетках корешков проростков пшеницы T.

aestivum L. образуют упорядоченные системы, которые последовательно сменяют друг друга во время клеточного цикла. Локализация и распределение аппарата Гольджи и ЭПР также меняется в ходе клеточного цикла, и их расположение относительно элементов цитоскелета носит неслучайный характер.

2. Разрушение/подавление сборки микротрубочек в интерфазных клетках вызывает перераспределение диктиосом аппарата Гольджи из околоядерной зоны и их агрегацию с образованием скоплений и кластеров, в кортикальной цитоплазме. Отсутствие митотического веретена вызывает вступление клеток в К-митоз, во время которого диктиосомы аппарата Гольджи аккумулируются вокруг К-митотических хромосом.

3. При подавлении сборки микротрубочек нарушается не только распределение, но и структурная целостность диктиосом.

4. Разрушение/подавление сборки микротрубочек в интерфазных клетках вызывает гипертрофическую агрегацию ЭПР (наиболее выраженную в околоядерной зоне), которая связана с формированием крупных локальных скоплений упорядоченно уложенных цистерн.

В К-митотических клетках скопления ЭПР располагаются вокруг хромосом.

5. Разборка актиновых филаментов значительно не влияет на расположение и распределение аппарата Гольджи в ходе клеточного цикла. Однако, наблюдается увеличение числа и размеров ассоциированных с диктиосомами везикулярных элементов TGN компартмента.

6. Разборка актиновых филаментов нарушает компактное расположение ЭПР в околоядерной зоне интерфазных клеток, и подавляет перераспределение ЭПР в зону формирования фрагмопласта во время анафазы-телофазы.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Ван Вэньчжу. 2009. Исследование локализации аппарата Гольджи относительно системы актиновых филаментов в клетках меристемы корня пшеницы Triticum aestivum.

Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2009.

Тезисы докладов конференции Ломоносов-2009, стр. 294-295.

2. Ван Вэньчжу. 2010. Роль микротрубочек в упорядоченном распределении эндоплазматического ретикулума в клетках меристемы корня пшеницы Triticum aestivum L.

XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010», секция «Биология», стр. 295.

3. Wang Wenzhu, E. Lazareva, I. Kyreev, E. Smirnova. 2011. The role of microtubules in retention of ER and Golgi in specific cytoplasmic domains during mitosis in plant cells. Asian Congress on Biotechnology, May 11-15 2011, Shanghai, Book of Abstracts, p. 213-214.

4. Wang Wenzhu, E. Lazareva, I. Kyreev, E. Smirnova. 2011. The role of microtubules in maintenance and distribution of Golgi apparatus in plant cells. Chinese society for cell biology, p.

281-282.

5. Wang Wenzhu, E. Lazareva, E. Smirnova. 2011. The role of microtubules in Gogi distribution in root meristem cells of Triticum aestivum L. BIT’s 1st annual world congress of molecular & cell biology, p.181.

6. Ван Вэньчжу, Е.М. Лазарева, Е.А. Смирнова. 2011. Роль микротрубочек в упорядоченном распределении аппарата Гольджи в клетках корня пшеницы Triticum aestivum L. I Всероссийская конференция «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет».

Цитология, стр.695.

7. Wang Wenzhu, Lazareva E., Kyreev I., Smirnova E. 2012. The role of microtubules in the maintenance of regular localization and arrangement of Golgi apparatus in root cells of Triticum aestivum L. Process Biochem, doi:10.1016/j.procbio.2012.01.001.

Соискатель Ван Вэньчжу






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.