WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Рахимова Файзигул Амонкуловна

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ  НЕКОТОРЫХ ДИКОРАСТУЩИХ

РАСТЕНИЙ ТАДЖИКИСТАНА

03.01.04 биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Душанбе  2012 г.

Работа выполнена на кафедре химии Технологического университета Таджикистана

Научный руководитель:  -  кандидат  химических наук, доцент

  Мирзорахимов Курбонали  Каримович.

Официальные оппоненты: -

  доктор химических наук, профессор

  кафедры органической химии ТНУ

  Халиков Ширинбек Халикович

доктор биологических наук, доцент,

зав.лаб.  Института  ботаники, физиологии и генетики растений АН РТ

  Джумаев Бахшулло Бокиевич

Ведущая организация: -  Институт химии им.В.И.Никитина Академии наук Республики  Таджикистан

  Защита состоится «  22 »  мая  2012 г. в  14.00  часов  на заседании диссертационного совета  Д.737.004.05  по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук  при Таджикском национальном университете 734025, г. Душанбе, пр. Рудаки,17.

  С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Таджикском национальном университете.

Автореферат разослан «12 » апреля  2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета 

кандидат биологических наук,  Хамрабаева З.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность работы. Фенольные соединения - широко распространенная в растительном мире группа соединений, которая в своей основе содержит бензольное кольцо, несущее одну или несколько гидроксидных групп. Фенольные вещества играют важную роль в обмене веществ растений. Они  участвуют в дыхании, фотосинтезе; отвечают за стимуляцию или ингибирование роста и развития (растительные гормоны), защиту клеток и метаболитов растения от окисления, повреждения бактериями и грибками и т.п. Предполагают, что они играют роль в образовании иммунитета. 

  Чрезвычайно широк спектр  их биологического воздействия. Они обладают антисептическим, антиоксидантным, кардиотоническим, кардиотропным, спазмолитическим, гипотензивным, седативным, гепатопротекторным, кровоостанавливающим, желчегонным  действием. Эти свойства, а также растворимость в воде, возможность получения водорастворимых форм в виде отваров, настоев  обуславливает широкое применение фенольных соединений в медицине и биологии. Этим не исчерпывается значение фенольных соединений растений. Они имеют важное практическое применение в некоторых отраслях промышленности,  в том числе пищевой. Современная пищевая промышленность широко применяет растительные экстракты в качестве пищевых и технологических добавок – пищевых красителей, антиоксидантов, консервантов. Красящими веществами в этих экстрактах являются в основном фенольные соединения, которые издавна использовались  в качестве красителей.

При технологической обработке сырья или при хранении цвет готовых изделий может меняться или ослабевать. Поэтому с  целью повышения качества  большинство продукции кондитерской, мясомолочной, масложировой, консервной, ликероводочной промышленности подкрашивается. В качестве пищевых красителей используются как синтетические, так и натуральные, то есть выделенные из природных объектов, вещества.

В настоящее время в различных странах используются свыше 160 синтетических красителей. Не все они безопасны для человека. Поэтому многие распространенные в прошлом  синтетические пищевые красители ныне запрещены к использованию.

       В современной пищевой промышленности наметилась стойкая тенденция к использованию пищевых натуральных красителей.

       В связи с этим научные исследования, направленные на выявление новых источников сырья, разработку способов выделения, условий хранения и применения экстрактов фенольных соединений в пищевой промышленности,  важны и актуальны. Эта проблема особенно важна для Таджикистана, имеющего богатейшую и уникальную флору. Известно более 120 красильных растений, произрастающих на территории Таджикистана. Анализ литературных данных показывает, что красящие вещества, выделяемые из них, применяются в основном для крашения текстильных волокон и тканей. О применении их для окрашивания продуктов питания нет сведений.

Целью работы является изучение биохимических свойств природных фенольных соединений,  выделенных из некоторых дикорастущих растений, из корней и корневищ ревеня (Rheum turkestanicum Janisch. семейство гречишные), щавеля конского (Rumex confertus Willd, семейство гречишные), солодки (Glycyrrhiza glabra,  семейство бобовые) и кизильника (Cotoneaster melanocarpus Fisch. Семейство розоцветных) произрастающих в Таджикистане, определение оптимальных условий их выделения, хранения и применения их  в качестве биологических  пищевых добавок.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

-  изучить процесс экстракции красящих фенольных веществ из растительного

сырья и  влияние на нее различных факторов;

- определить и  научно обосновать оптимальные условия извлечения  фенольных веществ из  растительного сырья;

- изучить биохимические  свойства  выделенных фенольных соединений;

- изучить превращения фенольных соединений при их выделении и хранении;

- изучить токсичность  выделенных фенольных соединений;

- изучить возможность применения  экстрактов фенольных соединений  для окрашивания различных групп пищевых продуктов;

Научная новизна.  В результате проведенных исследований выделены  и применены для окрашивания пищевых продуктов красящие фенольные  вещества из растений, произрастающих на территории Таджикистана –  корней и корневищ ревеня, щавеля конского, солодки и кизильника.

       Исследован процесс экстракции  красящих веществ из указанного  растительного сырья. Изучена зависимость извлечения фенольных соединений от различных факторов: экстрагента,  соотношения с сырья и растворителя, температуры, времени нагревания, способа экстракции. На основании полученных результатов разработан способ получения красящих экстрактов фенольных соединений из растительного сырья.        

         Изучены биохимические свойства экстрактов фенольных веществ, выделенных из корней и корневищ ревеня (Rheum turkestanicum Janisch. семейство гречишные), щавеля конского (Rumex confertus Willd, семейство гречишные), солодки (Glycyrrhiza glabra,  семейство бобовые) и кизильника (Cotoneaster melanocarpus Fisch. Семейство розоцветных),  имеющие технологическое значение – растворимость в воде и органических растворителях, содержание сухих веществ, содержание красящих веществ, плотность, кислотно-основные свойства.        

         Изучены превращения фенольных соединений при выделении и хранении и определена их устойчивость к воздействию света, температуры и времени нагревания, рН среды. Выявлена нетоксичность выделенных красящих экстрактов.

Практическое значение.

       Разработан способ экстракции фенольных соединений  из растительного сырья, содержащего комплекс красящих веществ, определены оптимальные условия для их выделения. Показана возможность их применения в качестве пищевых добавок  в пищевой промышленности.

Апробация работы.

       Результаты диссертационной работы доложены на Международной конференции «Наука, образование», Санкт-Петербург, 27-28 октября  2009г.;  Ш Международной конференции «Актуальные вопросы современной техники и технологии». РФ,  Липецк, 29 января 2011г.; IV  Международной конференции «Актуальные вопросы современной техники и технологии». РФ,  Липецк, 23 апреля  2011г.; V  Международной конференции «Актуальные вопросы современной техники и технологии». РФ,  Липецк, 23 июля 2011г.; Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные проблемы естественных наук». Новосибирск, 26 октября 2011г.; УШ Международной научной конференции «Наука и современность», Новосибирск, 15 ноября 2011г.

Публикации.

       По материалам диссертации опубликованы  2 статьи в журнале, рекомендованном ВАК РФ, 15 статей в  сборниках Международных научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 страницах компьютерного набора, состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Содержит  41 рисунков, 35 таблиц, список литературы, включающий 167 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

         Во введении обоснована актуальность темы, цели и задачи исследования, раскрыто основное содержание диссертации.

         В обзоре литературы приведены данные о фенольных соединениях растительного происхождения, их классификация, биохимические свойства, биосинтез и физиологическая роль, а также способы получения их экстрактов.

2. Экспериментальная часть

       Экспериментальная часть содержит характеристику растений, выбранных в качестве источника фенольных соединений, методики их выделения из сырья, исследования биохимических свойств, рецептуру пищевых продуктов, выбранных для испытания полученных экстрактов фенольных соединений и методики применения исследованных экстрактов для окрашивания пищевого продукта.

         В качестве объектов исследования при получении экстрактов фенольных соединений выбраны корни и корневища ревеня (Rheum turkestanicum Janisch. семейство гречишные), щавеля конского (Rumex confertus Willd, семейство гречишные), солодки (Glycyrrhiza glabra,  семейство бобовые) и кизильника (Cotoneaster melanocarpus Fisch. Семейство розоцветных) Все выбранные  растения могут быть  источником красящих пигментов, а  также  других биологически активных веществ. Известно, что полифенолы растений обладают антисептическими свойствами,  следовательно, они  могут проявлять помимо красящего и некоторое консервирующее действие.

       Выделение фенольных красящих веществ из растительного сырья  проводилось методом экстракции. Красящие вещества были получены в виде концентрированных растворов и сухих порошков.

Биохимические  и физико-химические свойства выделенных фенольных красящих веществ изучались по известным методикам, приведенным в литературе

Выделенные экстракты фенольных соединений были испытаны для окрашивания некоторых видов пищевых продуктов – выпечных кондитерских изделий, конфетных помад, мясных и молочных продуктов.

3. Обсуждение результатов

В главе «Обсуждение результатов» рассматриваются процесс выделения  фенольных соединений, их биохимические и физико-химические  свойства, превращения при экстракции и хранении и влияние на них различных факторов, а также применение экстрактов фенольных соединений в производстве пищевых продуктов.

3.1. Экстракция фенольных соединений из растительного сырья

Экстракция фенольных веществ из объектов исследования была произведена дистиллированной водой, 1% и 10%-ным растворами соляной, лимонной кислот и гидрокарбоната натрия, водно-спиртовыми растворами и 96%-ным этиловым спиртом.

Из корней и корневищ ревеня, щавеля конского, солодки  и кизильника  экстракция проводилась при кипячении водой, спиртом, водно-спиртовыми растворами, а также слабыми растворами кислот и  гидрокарбоната натрия. Водные вытяжки из  корней кизильника, ревеня и щавеля конского  имеют темно-красный цвет. Установлено, что при использовании в качестве экстрагента 1-2% раствора гидрокарбоната натрия, создающего щелочную среду,  получаются более интенсивно окрашенные растворы и сокращается время экстракции. Водные, спиртовые и водно спиртовые  экстракты из корней и корневищ солодки окрашены в желтый цвет. При экстракции растворами кислот  получены экстракты светлого коричневато-желтого цвета. Это вполне согласуется с литературными данными, согласно которым в корнях и корневищах и  древесине лиственных деревьев красящие вещества представлены флавоноидами и  дубильными веществами – производными галловой кислоты и катехинов, причем содержание растворимых экстрактивных  веществ достаточно велико – 18-20%, а у некоторых видов растений  до 40%. Гидролизующиеся дубильные вещества хорошо растворимы в воде и плохо - в спирте. При нагревании производные  катехинов переходят в производные галловой кислоты, которые  в кислой среде гидролизуются с образованием бесцветной галловой кислоты, возможно также образование эллаговой кислоты, имеющей желтоватый цвет. В присутствии щелочей катехины и производные галловой кислоты окисляются кислородом воздуха подобно пирогаллолу, переходя в хиноидную форму, окрашенную в красный  цвет.

При экстракции красящих веществ из корней ревеня и щавеля конского водными растворами получаются экстракты красного цвета. Экстракция же 96%-ным этанолом дает экстракты ярко-желтого цвета. Известно, что красящими веществами корней ревеня являются в основном хризофановая кислота и эмодин, которые относятся к производным антрахинона. Очевидно, их растворимость в спирте и воде различна, чем и объясняется различный цвет экстрактов.

В кислой среде могут экстрагироваться антоцианы, имеющие красный цвет в данной среде. Однако полученные экстракты в присутствии кислот практически не окрашены. По-видимому, антоцианы в исследуемом растительном сырье отсутствуют или же в кислой среде переходят в бесцветные лейкоантоцианы. На возможность этого указывается в литературе.

Было изучено влияние на степень извлечения фенольных соединений таких факторов, как соотношение сырья и экстрагента, температуры и времени ее воздействия.

На рисунках 3.1. 1-2. представлены результаты изучения зависимости экстракции от соотношения сырья и экстрагента при извлечении фенольных соединений из корней ревеня водой, спиртом  и водно-спиртовым раствором,  и из корней кизильника водой и раствором соды.

  Рис. 3.1. 1. Зависимость экстракции фенольных соединений от соотношения сырья и экстрагента (при температуре  200С, 400С, 600С 800С,1000С)





  1. Водный экстракт корней кизильника
  2. Экстракт из корней кизильника раствором соды
  3. Спиртовой экстракт из корней ревеня
  4. Водный экстракт из корней ревеня
  5. Водно-сипртовой экстракт из корней ревеня

Рис. 3.1. 2.  Зависимость экстракции фенольных соединений от соотношения сырья и экстрагента(при температуре  200С, 400С, 600С 800С,1000С)

  1. Водный экстракт из корней солодки 
  2. Водный экстракт из корней щавеля 
  3. Экстракт из корней щавеля раствором соды

Как видно из рисунков,  увеличение  соотношения сырья и растворителя ведет к увеличению  экстракции, но начиная с определенного соотношения, она остается практически постоянной 

С целью исследования влияния температуры на экстракцию была выполнена серия опытов по извлечению окрашенных фенольных веществ  в интервале температур 20-1000С. Сырьё и экстрагент, взятые в соотношении, при котором экстракция максимальна (1:3), выдерживались в течение 1 часа при температуре 200С, 400С, 600С 800С и при кипячении. Затем определялась оптическая плотность, как показатель степени экстракции. Полученные результаты приведены на рис. 3.1. 3,4,5,6.

Рис. 3.1. 3. Зависимость экстракции фенольных соединений от температуры

  1. Водно-спиртовой экстракт из корней ревеня
  2. Спиртовой экстракт из корней ревеня
  3. Водный экстракт из корней ревеня
  4. Водный экстракт из корней солодки

Рис. 3.1. 4. Зависимость экстракции фенольных соединений от температуры

  1. Спиртовой раствор из корней кизильника
  2. Водный раствор из корней кизильника
  3. Водный раствор из корней щавеля
  4. Спиртовой раствор из корней щавеля

Рис. 3.1. 5. Зависимость экстракции фенольных соединений от времени

действия температуры

  1. Водно-спиртовой экстракт из корней ревеня
  2. Спиртовой экстракт из корней ревеня
  3. Водный экстракт из корней ревеня
  4. Водный экстракт из корней солодки

       Рис. 3.1. 6. Зависимость экстракции фенольных соединений от времени действия температуры

  1. Водный экстракт из корней щавеля
  2. Спиртовой экстракт из корней кизильника
  3. Водный экстракт из корней кизильника
  4. Экстракт из корней кизильника раствором соды

       Как показывают полученные результаты, с увеличением температуры увеличивается степень извлечения окрашенных фенольных  веществ. Эти вещества извлекаются больше всего при  кипячении. Для определения оптимального времени кипячения была изучена зависимость степени экстракции от времени кипячения. Для этого сырье и экстрагент в соотношении 1:3 кипятили в колбе с обратным холодильников в течение определенного времени и измеряли оптическую  плотность экстракта. Полученные результаты показали, что оптимальное время кипячения составляет от 40 до 60 минут.

3.2. Определение кинетических параметров процесса экстракции красящих веществ

Проведенные эксперименты позволили рассчитать  некоторые кинетические параметры  процесса экстракции фенольных соединений из выбранных растений.

Были рассчитаны средние скорости экстракции полифенольных соединений водой из корней и корневищ солодки, ревеня, щавеля конского и кизильника при кипячении сырья и экстрагентов, взятых в оптимальных соотношениях. Средние скорости были рассчитаны при различных промежутках времени кипячения  в интервале от 10 минут до достижения постоянства концентрации экстрагированных веществ. Полученные результаты приведены в таблице 3.2. 1.

Таблица 3.2. 1

Скорость экстракции красящих веществ при кипячении

Экстракт из корней

Время, мин

Средняя скорость

экстракции, г/л·мин

Солодки

10

5,091

20

0,535

30

0,446

40

0,357

50

0,357

Ревеня

10

4,532

20

0,895

30

0,268

40

0,215

50

0,161

60

0,161

Щавеля конского

10

5,093

20

0,597

30

0,161

40

0,107

50

0,075

Кизильника

10

6,410

20

0,537

30

0,536

40

0,536

  Как видно из данных таблицы, скорость экстракции полифенольных соединений из исследуемых растений водой, которая имеет определенное значение после 10 минут кипячения,  с увеличением времени кипячения уменьшается.

       Графические зависимости степени  экстракции от времени и от температуры показывают, что  процесс экстракции красящих веществ можно описать кинетическим уравнением для реакций первого порядка:

ln с  = - kt  +  B (1)

Согласно уравнению (1) логарифм концентрации находится в линейной зависимости от  времени. Если опытные данные укладываются на прямую линию в координатах lgC  -  t, то это является доказательством того, что рассматриваемый процесс описывается кинетическим уравнением для реакций первого порядка. Подобные графические зависимости построены нами для экстракции окрашенных фенольных  веществ из всех исследованных растений различными экстрагентами. На рис. 3.2.1. представлены графики для процесса экстракции красящих веществ водой из корней ревеня,  корней щавеля конского, корней солодки и кизильника.

Как видно из представленного ниже графика, зависимость lgC  от времени при  экстракции красящих веществ имеет линейных характер и процесс экстракции действительно описывается кинетическим уравнением для реакций первого порядка.

 

Рис. 3.2.1. Зависимость lgC от времени для процесса экстракции фенольных соединений из корней исследуемых растений

1. Экстракт из корней кизильника  2. Экстракт из корней солодки

3. Экстракт из корней ревеня  4. Экстракт из корней щавеля

По формуле:        

  где  х – концентрация образовавшегося к моменту t вещества,

  а - первоначальная концентрация вещества.

нами были рассчитаны константы скорости экстракции красящих веществ  в интервале температур от 200С до 1000С.  Значения констант скорости экстракции, рассчитанные при 1000С приведены в таблице 3.2. 2.

Таблица  3.2.2

  Констант скорости экстракции при 1000С

Экстракция

К1,мин

К2,мин

К3,мин

Кср,мин

Из корней солодки

0,0231

0,0232

0,0231

0,0231

Из корней ревеня

0,1005

0,0899

0,0887

0,0930

Из корней щавеля конского

0,3486

0,3915

0,3506

0,3478

Из корней кизильника

0,2449

0,2553

0,2478

0,2497

  Таким образом, полученные результаты показали, что процесс экстракции полифенольных соединений описывается кинетическим уравнением для реакций первого порядка. Полифенольные вещества из корней солодки, ревеня, щавеля конского и кизильника  хорошо растворяются в воде,  и их основная часть экстрагируется в течение первых 10-20 минут кипячении.

Зависимость константы скорости реакции от температуры описывается уравнением Аррениуса. 

  ,

где А и В – постоянные для данной реакции.

В случае, когда известны значения констант скорости реакции k1 и k2 при двух температурах Т1 и Т2,  получаем:

  А (- )

Величина А связана с энергией активации соотношением Е = -АR. Данные уравнения были использованы нами для определения энергии активации процесса  экстракции красящих веществ из исследуемых растений. Результаты расчета энергии активации представлены в таблице 3.2. 3.

  Таблица 3.2.3

Значения энергии активации процесса экстракции красящих веществ

Экстракция

Энергия активации, Дж/моль

Из корней и корневищ ревеня водой

2021,503

Из корней и корневищ ревеня водно-спиртовым раствором

1651,324

Из корней и корневищ ревеня спиртом

35382,601

Из корней и корневищ щавеля конского спиртом

2324,495

Из корней солодки водой

5560,306

Из корней солодки спиртом

1634,891

Из корней кизильника водой

2463,542

Из корней кизильника раствором спиртом

967,513

Как показывают полученные расчетные данные, процесс экстракции имеет небольшую энергию активации, то есть экстракция красящих  веществ незначительно зависит от температуры.

Этот вывод подтверждается и вычислением температурного  коэффициента.

Таким образом, результаты опытов показали, что для выделения фенольных соединений  из корней ревеня, щавеля конского, солодки и кизильника  оптимальным  является экстракция водно-спиртовыми растворами и этанолом при кипячении  в аппарате Сокслета в течение 40-60 минут при соотношении сырья и растворителя 1:3.

3.3. Состав выделенных экстрактов

Содержание фенольных соединений в составе выделенных экстрактов определено качественными реакциями и подтверждено данными ИК и УФ- спектров.

  Для качественного определения всех групп фенольных соединений были использованы реакция образования осадка при действии ацетата свинца и  реакция с ванилином в сильно-кислой среде, при которой образуется ярко-красное окрашивание. Указанными реакциями установлено содержание флавоноидов в исследуемых экстрактах.  Индивидуальные группы флавоноидов качественными реакциями  не определялись. Однако,  изменения цвета экстрактов в кислой, нейтральной и щелочной среде, а также данные ИК-и УФ-спектров  позволяют предположить, что в выделенных экстрактах  преобладают флавоноиды (флаванолы, флаваноны, катехины, халконы),  изофлавоноиды, в экстрактах из корней ревеня и щавеля содержатся также  антрагликозиды. Антоцианы содержатся в незначительных количествах или отсутствуют.

ИК-спектры исследованных экстрактов, таблетированных с бромидом калия, снятые на спектрометре SPECORD  в диапазоне длин волн от 500 до 4000 см-, подтверждают наличие фенольных соединений в исследуемых экстрактах.

В спектрах всех исследованных экстрактов присутствует широкая интенсивная полоса в области  2900-3600 см-, характерная для валентных колебаний О-Н связи  спиртовых групп. О наличии в экстрактах ароматических связей свидетельствуют интенсивные полосы при  1600, 1400 см- и полоса средней интенсивности  при 1490 см-, относящиеся к колебаниям  С-С связей бензольного кольца. Интенсивная полоса поглощения при  1000 см- относится к неплоским  деформационным колебаниям С-Н связей ароматических соединений, полосы поглощения при 1290 см – средней интенсивности  и слабые полосы при 1390 и 1440 см- и полосу средней интенсивности при 780 см-  - к колебаниям С-С связей гетероциклического кольца. Полоса поглощения карбонильной группы, сопряженной с бензольным кольцом, смещается в область 1750-1720 см-. Эта  полоса в виде выступа присутствует только в спектрах экстрактов из корней ревеня и щавеля конского.        Это позволяет нам утверждать, что в экстрактах из корней солодки и кизильника преобладают флавоноиды – производные флавана и изофлавана, а в экстрактах из корней ревеня и щавеля содержатся в основном производные антрахинона.

          Состав полученных экстрактов из корней ревеня, щавеля конского, солодки и кизильника  был исследован также метом УФ-спектроскопии.

В спектрах присутствуют интенсивная полоса поглощения  при 280 нм, полосы поглощения средней интенсивности при 210, 240, 320 нм, а также слабые полосы поглощения при 420 и  540 нм. В соответствии с литературными данными  наличие этих полос свидетельствует о присутствии фенольных веществ различных групп. Интенсивная полоса поглощения с максимумом при 280 нм и минимумом при 260 нм свидетельствует о наличии производных антрахинона, коими являются антрагликозиды. Полосы поглощения при 320 нм и 240 нм можно также отнести к флавонам. Возможно присутствие в экстракте халконов, которым соответствует резкая полоса поглощения при 390 нм и антоцианов, имеющие полосу поглощения  в области 450 нм.

В  УФ-спектре  экстракта из корней щавеля обнаруживаются полосы поглощения  при 220, 300, 400, 440 и 600 нм. Наиболее интенсивная полоса поглощения наблюдается при  440 нм,  также имеется резкий максимум при 400 нм и меньший максимум при 300 нм. Согласно литературным данным такое расположение и интенсивность полос поглощения обусловлено присутствием антрахиноновых производных и халконов.

         УФ-спектр экстракта корней солодки характерен для изофлавонов. Именно к этим соединениям относятся  очень интенсивные полосы поглощения с максимумом при 380 нм и полосу поглощения с несколько меньшей интесивностью при 220 нм.

         В УФ-спектре экстракта из корней кизильника, присутствуют интенсивные полосы поглощения при 300 нм, 360 нм, 460 нм, полосы средней интенсивности при 220 нм, полосы при 420 и 560-580 в виде выступа (или «плеча»). На основании этого мы предполагаем, что в составе водного экстракта из корней кизильника содержатся в основном флаванолы, ауроны. В небольшим количестве гликозиды антоцианинов.

Сопоставляя данные УФ- и ИК спектров, можно говорить также о том, что в исследованных экстрактах наряду с указанными фенольными соединениями присутствуют  также их сложнее эфиры с фенолкарбоновыми кислотами и гликозиды.

Количественное содержание фенольных соединений определялось как сумма красящих веществ фотоколориметрическим методом со стандартным раствором сульфата кобальта.

3.4. Физико-химические свойства выделенных фенольных веществ

               Все полученные порошкообразные сухие экстракты фенольных веществ растворимы в воде, спирте и спиртовых растворах и не растворимы в органических растворителях.  Содержание красящих веществ в выделенных веществах составляет от 27 до 79 г/л

Определение общей и титруемой кислотности показало, что  экстракты фенольных  красящих веществ обладают низкими значениями общей (титруемой) кислотности, а активная кислотность, выражаемая значением рН растворов красителей равна 5-7.

Результаты определения общей и титруемой кислотности полученных экстрактов  являются косвенным доказательством наличия в них фенольных соединений, так как фенольные соединения в растворах проявляют свойства слабых кислот.  Эти результаты также показывают, что спектр их применения в качестве пищевых красителей может быть достаточно широк, так как они не будут способствовать появлению в пищевом продукте сильно-кислой или щелочной среды.

3.5. Биохимические превращения  фенольных соединений при  экстракции и хранении

Фенольные соединения подвержены многим превращениям, которые могут проходить с участием ферментов и без них.  На  скорость прохождения этих реакций оказывают влияние температура, время, рН растворов, присутствие  минеральных веществ.  Для определения технологических параметров применения фенольных соединений в производстве пищевых продуктов  представляет интерес изучение превращений фенольных соединений в процессе экстракции и при хранении сухого экстракта и их растворов.

  О превращениях фенольных соединений судили по устойчивости их цвета на основе  изменения оптической плотности растворов. Так как оптическая плотность растворов прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества, то по изменению оптической плотности можно судить об изменении концентрации, и, следовательно, о разрушении окрашенных фенольных соединений. На основании  полученных  нами результатов можно судить о тех превращениях, которые претерпевают фенольные соединения  в процессе экстракции и в растворе при дальнейшем хранении под  воздействием света, температуры  и времени ее воздействия.

Образование  окрашенных  в красный цвет экстрактов  при экстракции водой  происходит в результате  превращения полифенольных соединений в окрашенные в красный цвет  хиноны, которые затем полимеризуются. По литературным данным, это превращение может происходить под влиянием ферментов  фенолоксидаз и пероксидаз. Мы предполагаем, что в данной реакции имеют большее значение пероксидазы, так как они  по сравнению с фенолоксидазами более стабильны и  в растениях они локализуются в местах, где происходит образование лигнина, а именно такие части растений выбраны нами в качестве сырья. При повышении температуры вследствие инактивации ферментов процесс полимеризации фенольных соединений, конечным результатом  которого является образование темноокрашенных, нерастворимых веществ, не идет до конца, а останавливается на стадии образования димеров и олигомеров, которые окрашены  в красный цвет и хорошо растворимы в воде. Кроме того, образовавшиеся димерные и олигомерные формы фенольных соединений сами являются ингибиторами фенолоксидаз и других ферментов, вызывающих полимеризацию. Результаты наших опытов показывают, что подобные формы полимеров фенольных соединений  устойчивы и могут существовать достаточно долго. Они также устойчивы к воздействию температуры в интервале от 20 до 1000С. 

В технологии пищевых продуктов не менее важным технологическим фактором является воздействие рН среды.  Цвет исследуемых красителей меняется в зависимости от среды. При значения рН 2 и 1 цвет растворов исследуемых красителей становится желтым. Устойчивый красный цвет появляется при рН 4 и сохраняется до значений рН 12.  Как показывают полученные результаты, при увеличении  значения рН от 1 до  3-4, оптическая плотность, измеренная при  длине волны 480 нм,  несколько уменьшается, затем выравнивается и остается постоянной до достижения значения рН от7-11. На основании этих результатов можно предположить, что в сильнокислых средах проходит гидролиз  производных катехинов с фенолкарбоновыми кислотами с образованием  бесцветной галловой кислоты или эллаговой кислоты, имеющей светло-желтый цвет, а также происходит образование светлоокрашенных полимерных форм фенольных соединений. Характер изменения цвета при  изменении рН среды косвенно подтверждает, что в составе выделенных экстрактов имеется незначительное количество антоцианов, для которых характерно изменение цвета при значениях 4,8-5,3 (исчезает оранжево-красная окраска, при 5,3 и выше нарастает фиолетово-синяя окраска, что связано с их структурными изменениями).

  Согласно литературным данным, в сильно щелочной среде фенольные соединения подвергаются окислительным реакциям, при которых происходит присоединение кислорода к фенольным соединениям. При  этом происходит разрыв бензольного кольца с образованием малорастворимых соединений типа меланинов или гуминовых кислот с темно-коричневой, почти черной  окраской.  Однако полученные нами результаты показывают, что  данные реакции не идут до конца, возможно вследствие  инактивации ферментов.

3.6. Исследование токсического действия  выделенных фенольных соединений

В связи с тем, что исследуемые фенольные соединения  из корней ревеня, щавеля конского, солодки и кизильника предполагается использовать в производстве пищевых продуктов, представляет интерес изучение их токсического  воздействия. Многочисленные литературные источники  сообщают о нетоксичности флавоноидов. Фенольные соединения с конденсированными бензольными кольцами, производные нафтохинона и антрахинона, широко используются в медицине и пищевой промышленности  в качестве перспективных консервантов. Однако некоторые источники сообщают о том, что продолжительное применение антрагликозидов может быть причиной ряда заболеваний.

        Была изучена токсичность экстрактов из  корней ревеня, щавеля конского, солодки и кизильника.

При скармливании белым лабораторным мышам выделенных экстрактов фенольных соединений  в течение всего периода наблюдения животные были спокойны, заторможенности не наблюдалось, все животные живы. Результаты биохимического и морфологического исследования крови приведены в таблицах 3.6.1- 8.

  Таблица 3.6.1

Биохимические показатели крови мышей принимавших экстракт из корней кизильника

Показатели

Результат

Норма

(экстракты фенольных соединений -  день исследования)

7

14

21

Контрольный

Общий белок, г/л

97,1

102

102

82,30

98-108

Общий билирубин, мкмоль/л

1,2

1,3

1,3

1,54

0,00-1,67

Щел. Фосфатаза, Е/л

1029,0

1230,0

1779,2

1280,1

1066,0-1220,0

Мочевина, ммоль/л

7,08

7,2

7,8

9,10

8,0-14,0

Аланина АТ (АлАТ), Е/л

115,20

123,0

125,0

130,0

110,0-140,0

Аспарагин (АсАТ), Е/л

80,50

82,0

80,10

79,00

72,0-196,0

Глюкоза, моль/л

9,2

9,5

9,8

8,9

8,8-16,3

 

                                          Таблица 3.6.2

Показатели периферической крови подопытных мышей

Эозинофилы, 2.0 (0-4.0%)

Нейтрофилы

Лимфоциты,

68.0(60.0-77.0%)

  Моноциты,

3.0 (2.0-4.0%)

Палочкоядерные,

  3.0 (1.0-4.0%)

  Сегменты,

23.0 (18.0-30.0%)

Промежуток времени  исследования (дни)

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

0,0

0,0

0,0

0,0

1,0

1,0

2,0

2,0

69,0

56,0

37,0

35,0

27,0

40,0

52,0

60,0

3,0

3,0

9,0

2,0

 

  Таблица 3.6.3

  Биохимические показатели крови мышей принимавших экстракт

из корней щавеля

Показатели

Результат

Норма

(экстракты фенольных соединений -  день исследования)

14

21

Контрольный

Общий белок, г/л

74,10

110,10

114,0

82,30

98-108

Общий билирубин, мкмоль/л

1,58

1,62

1,70

1,54

0,00-1,67

Щел. Фосфатаза, Е/л.

1087,0

1098,0

1112,0

1280,1

  1066,0-1220,0

Мочевина, ммоль/л

6,24

6,12

6,10

9,10

8,0-14,0

Аланина АТ (АлАТ), Е/л

122,74

124,2

125,76

130,0

110,0-140,0

Аспарагин (АсАТ), Е/л

68,2

68,54

68,25

79,00

72,0-196,0

Глюкоза, ммоль/л

9,01

9,5

10,04

8,9

8,8-16,3

Таблица 3.6.4

Показатели периферической крови подопытных мышей

Эозинофилы, 2.0 (0-4.0%)

Нейтрофилы

Лимфоциты,

68.0(60.0-77.0%)

Моноциты,

3.0 (2.0-4.0%)

  Палочкоядерные,

  3.0 (1.0-4.0%)

Сегменты,

23.0 (18.0-30.0%)

Промежуток времени  исследования (дни)

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

2,0

0,0

2,0

38,0

47,0

58,0

35,0

55,0

48,0

37,0

60.0

7,0

3,0

5,0

2,0

Таблица 3.6.5

Биохимические показатели крови мышей принимавших экстракт из корней  ревеня

Показатели

Результат

Норма

(экстракты фенольных соединений -  день исследования)

14

21

Контрольный

Общий белок, г/л

86,4

90,80

92,5

82,30

98-108

Общий билирубин, мкмоль/л

0,95

0,94

8,50

1,54

0,00-1,67

Щел. Фосфатаза, Е/л.

1075,20

1160,0

1287,0

1280,1

1066,0-1220,0

Мочевина, ммоль/л

9,8

10,06

10,82

9,10

8,0-14,0

Аланина АТ (АлАТ), Е/л

130,40

160,80

170,40

130,0

110,0-140,0

Аспарагин (АсАТ), Е/л

73,40

79,00

82,30

79,00

72,0-196,0

Глюкоза, ммоль/л

9,8

10,2

10,20

8,9

8,8-16,3

Таблица 3.6.6

Показатели периферической крови подопытных мышей

Эозинофилы, 2.0 (0-4.0%)

Нейтрофилы

Лимфоциты,

68.0(60.0-77.0%)

Моноциты,

3.0 (2.0-4.0%)

Палочкоядерные, 3.0 (1.0-4.0%)

Сегменты,

23.0 (18.0-30.0%)

Промежуток времени  исследования (дни)

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

1,0

4,0

2,0

56,0

59,0

52,0

35,0

40,0

36,0

33,0

60,0

4,0

4,0

11,0

2,0

  Таблица 3.6.7

Биохимические показатели крови мышей принимавших экстракт из корней солодки

Показатели

Результат

Норма

(экстракты фенольных соединений -  день исследования)

14

21

Контрольный

Общий белок, г/л

59,70

82,3

72,00

82,30

98-108

Общий билирубин, мкмоль/л

0,85

0,90

0,95

1,54

0,00-1,67

Щел. Фосфатаза, Е/л.

1095,0

1110,0

1112,0

1280,1

1066,0-1220,0

Мочевина, ммоль/л

9,99

6,66

8,33

9,10

8,0-14,0

Аланина АТ (АлАТ), Е/л

144

120,8

124,2

130,0

110,0-140,0

Аспарагин (АсАТ), Е/л

82,2

84,20

85,0

79,00

72,0-196,0

Глюкоза, моль/л

8,7

9,0

9,2

8,9

8,8-16,3

 

Таблица 3.6.8

Показатели периферической крови подопытных мышей

Эозинофилы, 2.0 (0-4.0%)

Нейтрофилы

Лимфоциты,

68.0(60.0-77.0%)

Моноциты,

3.0 (2.0-4.0%)

Палочкоядерные,

  3.0 (1.0-4.0%)

Сегменты,

23.0 (18.0-30.0%)

Промежуток времени  исследования (дни)

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

7

14

21

К.

0,0

0,0

0,0

0,0

  2,0

5,0

4,0

2,0

57,0

46,0

45,0

35,0

38,0

53,0

47,0

60,0

3,0

1,0

2,0

2,0

Как показывают результаты определения биохимических показателей крови, при скармливании мышам экстракта из корней кизильника в течение 7 дней содержание общего белка и мочевины остается в пределах нормы, возрастает содержащие щелочной фосфатазы. После 21 дня скармливания экстракта из корней кизильника возрастает содержание общего белка, а щелочная фосфатаза значительно возрастает. Показатель (АлАТ) несколько увеличивается, хотя и в пределах нормы, а (АсАТ) остается практически неизменным.

Картина вскрытия мышей. Все животные были забиты с соблюдением принципов эвтаназии. По истечении каждых 7 дней проводилось вскрытие подопытных животных. После забоя оценивался внешний вид органов, кровенаполнение.

За весь период исследования у подопытных животных не было отмечено макроскопических изменений со стороны внутренних органов. Патологии со стороны легких и сердца нет. Легкие бледно-розовые, без изменений. Печень без видимых изменений. Желчный пузырь не растянут, содержимое желчного пузыря желтого цвета. Слизистая оболочка желудка без изъязвлений и гиперемии.

В  результате проведенной работы по изучению токсического действия экстрактов из корней ревеня, щавеля конского,  солодки и кизильника  было установлено, что исследованные экстракты не обладают острой токсичностью для мышей.

Животные контрольных групп в течение всего периода наблюдений оставались живы, здоровы.

Рассматривая воздействие исследуемых экстрактов на живые организмы и сравнивая эти результаты с результатами биохимического и морфологического анализа  крови мышей контрольной группы, можно отметить отклонения от нормы в значении некоторых показателей крови мышей как опытных, так и контрольной групп. Так, у всех животных повышаются показатели общего белка, щелочной фосфатазы, тогда как содержание мочевины, глюкозы,  общего билирубина соответствует норме.  Отклонения от нормы в показателях общего белка, щелочной фосфатазы крови как опытной, так и контрольной группы от нормы показывает, что они  не связаны с приемом экстракта и, наш взгляд, объясняются характером питания. Повышенное потребляемое количество углеводистой пищи может вызывать дегидратацию  организма, результатом которой является повышение уровня белка в сыворотке крови. Причиной повышения уровня фосфатазы также является пища, обедненная белком.  Показатели морфологического анализа крови  животных опытных и контрольных групп в целом соответствуют норме, но некоторые показатели  изменяются  значительно. Так, у мышей, которых кормили экстрактом кизильника и щавеля конского,  наблюдается  увеличение количества моноцитов в два раза по сравнению с нормой, увеличивается содержание сегментовидных нейтрофилов в крови животных, принимавших экстракт из корней щавеля. Уменьшается показатель лимфоцитов под воздействием экстракта из корней солодки, щавеля и корней ревеня.  Наибольшие отклонения от нормы наблюдаются в крови животных, принимавших экстракт из корней ревеня.

Сопоставляя результаты исследования биохимических и морфологических показателей крови с картиной вскрытия животных и с наблюдениями их поведения во время опыта, можно сделать вывод о том, что исследуемые экстракты из корней кизильника, солодки, щавеля конского до в дозировке до 5 г/кг ж.в. нетоксичны. Наблюдаемые изменения в крови и органах связаны не с токсичностью вводимых образцов, а с большой дозой их введения и  однообразным рационом кормления, что подтверждается и литературными источниками.

Экстракт из корней ревеня вызывает не только достаточно большие изменения биохимических и морфологических показателей крови, но и анизоцитоз и пойкилоцитоз. Состояние внутренних органов после вскрытия также свидетельствует о токсичности данного экстракта в дозе 5 г/кг ж.в.  При вскрытии животных, которых кормили экстрактом из корней щавеля, наблюдались небольшие изменения печени и желчного пузыря. Подобное воздействие экстрактов из корней ревеня можно объяснить содержанием антрагликозидов, производных антрахинона, которые согласно  литературным источникам, обладают токсическим действием и при длительном применении в больших дозах вызывают поражения печени и т.д.

3.7. Окрашивание пищевых продуктов экстрактами фенольных соединений

  Полученные красящие экстракты фенольных веществ были испытаны в качестве пищевых красителей. 

Лабораторными опытами показано, что полученные красители могут применяться при  окрашивании  некоторых видов кондитерских изделий и молочных продуктов. Изученные свойства указанных красителей позволяют предположить, что их можно использовать также в производстве безалкогольных напитков, варенья, компотов. Их можно вводить в порошки для сухих концентратов, например для киселей и желе.

ВЫВОДЫ

1. Изучен процесс экстракции фенольных соединений  из корней ревеня туркестанского (Rheum turkestanicum Janisch. семейство гречишные), щавеля конского (Rumex confertus Willd, семейство гречишные), солодки голой (Glycyrrhiza glabra,  семейство бобовые) и кизильника (Cotoneaster melanocarpus Fisch. Семейство розоцветных),  и  влияние не нее различных факторов – вида растворителя, соотношения сырья и растворителя, времени и температуры экстракции. На основе  проведенных исследований  разработан метод получения красящих фенольных веществ из растительного сырья, определены оптимальные режимы экстракции и экстрагенты.

2. Рассчитаны некоторые кинетические параметры процесса экстракции красящих веществ – средние скорости экстракции,  константы скорости и энергия активации.

3.  Изучены физико-химические свойства выделенных фенольных соединений, имеющие значение в технологии пищевых продуктов – плотность, содержание сухих веществ, содержание красящих веществ, общая и титруемая кислотность. Установлено, что совокупность указанных физико-химических и органолептических свойств полученных экстрактов фенольных соединений  соответствует значениям, известным из литературы, а содержание красящих веществ в полученных красителях составляет  до 72г/кг, что выше, чем в известных натуральных пищевых красителях.

4. Изучены биохимические превращения фенольных соединений при экстракции и хранении. Установлено, что процесс окислительной полимеризации, которая приводит к образованию нерастворимых полимерных соединений, не идет в условиях экстракции до конца, а заканчивается на стадии образования окрашенных олигомерных хинонных форм, устойчивых к воздействию света в течение достаточного времени. Установлено также, что  в сильнокислых средах происходит образование светлоокрашенных полимерных форм фенольных соединений, а также гидролиз  производных катехинов с фенолкарбоновыми кислотами с образованием  бесцветной галловой кислоты или эллаговой кислоты,  а окислительные реакции, идущие в щелочной среде с разрывом бензольного кольца, не идут до конца.

  5. Исследована микробиологическая чистота и токсичность выделенных красящих веществ. Показано, что они не обладают токсичностью.

  6.  Лабораторными опытами показана возможность окрашивания полученными красителями некоторых видов кондитерских изделий,  колбасных изделий, кисломолочных продуктов.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

  1. Рахимова Ф.А., Икрами М.Б., Мирзорахимов К.К., Тураева Г.Н.,  Гулбекова Н.Б. Превращения фенольных соединений  в процессе экстракции некаторых растений таджикистана // Известия АН РТ Серия. -2012 №1(178),-С.
  2. Рахимова Ф.А., Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б.,  Тураева Г.Н.,  Гулбекова Н.Б. Воздействие фенольных соединений на живые организмы. // Известия АН РТ Серия. -2012 №4(177),-С.
  1. Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б.,Шарипова М.Б., Рахимова Ф.А. Получение пищевого красителя из корней ревеня. // Труды ТУТ. Вып.ХIV. 2008. – С. 74-77.
  2. Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б., Шарипова М.Б., Рахимова Ф.А., Тураева Г.Н. Применение пищевого красителя в выпечных кондитерских изделиях. //  Материалы Международной конференции «Высокие технологии, фундаментальные исследования, образование, промышленность» Россия, Санкт-Петербург, 27-28 10.2009.- С. 220-221.
  3. Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б., Рахимова Ф.А., Тураева Г.Н. Исследование токсичности растительных экстрактов. // Материалы Международной конференции «Новое в технологии и технике пищевых производств». Воронеж 30 июня-2 июля 2010. - С. 66-68.
  4. Икрами М.Б., Мирзорахимов К.К., Рахимова Ф.А., Шарипова М.Б., Тураева Г.Н. Исследование экстракции полифенольных соединений из некоторых растений. // Материалы Ш Международной конференции «Актуальные вопросы современной техники и технологии». РФ,  Липецк, 29 января 2011. - С. 127-129.
  5. Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б., Рахимова Ф.А., Тураева Г.Н. Полифенольные соединения, выделенные из корня ревеня и их применение. // Материалы Ш Международной конференции «Актуальные вопросы современной техники и технологии». РФ,  Липецк, 29 января 2011. - С. 131-132.
  6. Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б., Рахимова Ф.А., Тураева Г.Н., Гулбекова Н.Б. Некоторые кинетические параметры  процесса экстракции полифенольных соединений из растений. // Материалы VШ Международной научной конференции «Наука и современность» (Новосибирск),1 февраля 2011.Ч.1. - С. 34-38.
  7. Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б., Рахимова Ф.А., Тураева Г.Н. ИК-спектроскопическое исследование  растительных экстрактов. // Материалы IV  Международной конференции «Актуальные вопросы современной техники и технологии». РФ,  Липецк, 23 апреля  2011. - С. 128-129.
  8. Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б., Рахимова Ф.А., ТураеваГ.Н.  Биологические свойства растительных экстрактов. // Материалы IV  Международной конференции «Актуальные вопросы современной техники и технологии». РФ,  Липецк, 23 апреля  2011. - С. 140-141.
  9. Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б., Рахимова Ф.А., Тураева Г.Н. Гулбекова Н.Б. Влияние растворителя на экстракцию полифенольных соединений из некоторых растений. // Материалы V Международной конференции «Актуальные вопросы современной техники и технологии». РФ,  Липецк, 23 июля  2011.- С. 117-119.
  10. Икрами М.Б., Мирзорахимов К.К., Рахимова Ф.А., Тураева Г.Н., Гулбекова Н.Б. УФ - спектры растительных экстрактов. // Материалы Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные проблемы естественных наук». Новосибирск, 26 октября 2011. - С. 20-24.
  11. Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б., Рахимова Ф.А., Тураева Г.Н., Гулбекова Н.Б. Биологические свойства экстрактов солодки и кизильника. // Материалы Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные проблемы естественных наук». Новосибирск, 26 октября 2011. - С. 24-28.
  12. Икрами М.Б., Мирзорахимов К.К., Рахимова Ф.А., Гулбекова Н.Б. К вопросу о токсичности  природных  производных  антрахинона. // Материалы V Международной научной  конференции «Актуальные вопросы современной техники и технологии». РФ,г. Липецк 29 октября 2011. - С. 171-173.
  13. Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б., Рахимова Ф.А., Тураева Г.Н. Влияние растворителя на экстракцию полифенольных соединений из некоторых растений. // Материалы V Международной научной  конференции «Актуальные вопросы современной техники и технологии». РФ, г. Липецк 29 октября 2011. - С. 174-176.
  14. Икрами М.Б., Мирзорахимов К.К., Рахимова Ф.А., Тураева Г., Гулбекова Н.Б. Кислотно-основные свойства фенольных соединений в растительных экстрактах. // Сборник материалов XIII международной научной практической конференции «Наука и современность» – 2011. Новосибирск, 15 ноября  2011.Ч.1. - С. 32-34.
  15. Мирзорахимов К.К., Икрами М.Б., Рахимова Ф.А., Тураева Г.Н., Гулбекова Н.Б. Влияние  времени температуры на устойчивость цвета  растительных экстрактов. // Сборник материалов XIII Международной научной практической конференции «Наука и современность» – 2011. Новосибирск, 15 ноября 2011. Ч.1. - С. 34-38.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.