WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Попова Анастасия Владимировна

БАКТЕРИОФАГ AP22, ЛИЗИРУЮЩИЙ КЛИНИЧЕСКИЕ ШТАММЫ ACINETOBACTER BAUMANNII: ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

03.02.03 микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оболенск – 2012

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант: кандидат биологических наук Воложанцев Николай Валентинович

Официальные оппоненты:

Павлов Виталий Михайлович, доктор биологических наук, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», заведующий лабораторией микробиологии туляремии Сыкилинда Нина Николаевна – кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биоинженерии

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «21» декабря 2012 года в 11 ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан « » ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Фурсова Надежда Константиновна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Проблема нозокомиальных инфекций (НИ) является одной из важнейших для современного здравоохранения и с каждым годом приобретает всё большую медицинскую и социальную значимость. Во многих странах наблюдается рост инфекционной заболеваемости в стационарах лечебных учреждений, что существенным образом связано с распространением штаммов микроорганизмов, устойчивых к различным антибактериальным препаратам.

Одним из возбудителей НИ является представитель группы неферментирующих грамотрицательных аэробных бактерий – Acinetobacter baumannii, играющий важную роль в инфекционной патологии у пациентов, находящихся на стационарном лечении. В отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), а также в ожоговых отделениях A. baumannii часто становится причиной развития госпитальных пневмоний, раневых инфекций (в том числе у больных с термическими поражениями), менингитов (при нейрохирургических вмешательствах и травмах спинного мозга), эндокардитов, перитонитов, абсцессов мозга и лёгких, урологических катетерных инфекций, постхирургических осложнений, бактериемий и септицемий (Metan et al., 2007; Rizos et al., 2007; Peleg et al., 2008; Towner, 2009).

Клиническая значимость A. baumannii существенно выросла за последние 20 лет. В первую очередь это связано с тем, что для данного микроорганизма характерны механизмы резистентности, обеспечивающие устойчивость к подавляющему большинству антимикробных препаратов (Van Looveren et al., 2004; Peleg et al., 2008; Zavascki et al., 2010). Другими клинически значимыми особенностями A. baumannii являются: устойчивость к дезинфицирующим средствам, высушиванию, ультрафиолетовому облучению, толерантность к детергентам (Wendt et al., 1997; Webster et al., 1998; Towner, 2009). Высокая выживаемость на объектах внешней среды и способность персистировать в течение продолжительного периода в условиях больничного окружения увеличивает риск передачи этого микроба через медицинский персонал или предметы обихода (Catalano et al., 1999; de Oliveira & Damasceno, 2010).

На основании вышесказанного весьма актуальным является своевременное выявление A. baumannii, быстрая идентификация данного микроорганизма и, что особенно важно, поиск новых антибактериальных средств против инфекций, вызванных A. baumannii. Одним из возможных путей решения последней проблемы может быть применение литических фагов. К настоящему времени накоплено множество данных об эффективном использовании бактериофагов для лечения бактериальных инфекций, в том числе госпитальных, вызванных, например, P. aeruginosa или S. aureus (Merabishvili et al., 2009; Kutter et al., 2010). Однако ни в нашей стране, ни за рубежом нет препаратов бактериофагов для контроля внутрибольничных A. baumannii-инфекций.

Это связано, в первую очередь, с отсутствием коллекций перспективных фагов, которые могли бы быть использованы для разработки лечебных препаратов, а также с узким спектром антибактериальной активности известных литических фагов, инфицирующих A. baumannii.

Цель исследования – выделение, молекулярно-генетическая характеристика и изучение биологических свойств вирулентного бактериофага, специфически инфицирующего и лизирующего широкий спектр клинических штаммов A. baumannii.

Задачи исследования:

1. Создание коллекции и молекулярно-генетическая характеристика клинических штаммов A. baumannii.

2. Поиск бактериофагов, лизирующих бактерии рода Acinetobacter, в образцах клинического материала и пробах из окружающей среды.

3. Определение таксономического положения и изучение биологических свойств бактериофага, обладающего широким спектром литического действия по отношению к клиническим штаммам A. baumannii.

4. Визуализация специфического взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой и характеристика различных стадий инфекционного процесса с помощью атомно-силовой микроскопии.

5. Изучение генома бактериофага с широким спектром литического действия.

Научная новизна.

Впервые выделен литический бактериофаг AP22 семейства Myoviridae, инфицирующий широкий круг клинических штаммов A. baumannii (приоритет защищен патентом РФ № 2439151). Бактериофаг обладает выраженной видоспецифичностью, высокой скоростью адсорбции при взаимодействии с бактериальной клеткой и высокой урожайностью.

Впервые для бактериофагов, лизирующих A. baumannii, проведена визуализация специфического взаимодействия в системе «литический бактериофаг - бактериальная клетка» и изучены различные стадии инфекционного процесса методом атомно-силовой микроскопии.

Впервые определена полная нуклеотидная последовательность ДНК и получены данные о структуре генома бактериофага семейства Myoviridae, лизирующего бактерии A. baumannii.

Практическая ценность работы.

Создана коллекция, включающая 130 идентифицированных и генетически типированных антибиотикоустойчивых штаммов A. baumannii, выделенных от больных крупных стационаров Европейской части России и Южного Урала в 2005-2010 гг.

Депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ-Оболенск») ФБУН ГНЦ ПМБ под номерами B-7125 – B-7134 десять штаммов A. baumannii – представителей разных генетических групп (Федеральный уровень внедрения).

Депонирован в «ГКПМ-Оболенск» под номером Ph42 охраноспособный бактериофаг AP22 (Федеральный уровень внедрения). Результаты изучения литических свойств и геномного анализа бактериофага AP22 позволяют рекомендовать его для разработки лечебных препаратов против A. baumannii-инфекций, а также использовать для идентификации A. baumannii при бактериологическом анализе клинического материала.

Размещена в Европейской базе данных EMBL под номером HE806280 и базе данных GenBank под номером NC_017984 полная нуклеотидная последовательность ДНК бактериофага AP22 (международный уровень внедрения).

Результаты диссертационной работы использованы в лаборатории молекулярной биоинженерии ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН для клонирования, экспрессии и изучения пространственной структуры белка фибрилл и белка выростов хвостового отростка фага.

Положения, выносимые на защиту 1. На протяжении нескольких лет (с 2005 по 2010 гг.) в стационарах крупных городов России (Москва, Санкт-Петербург, Нижний Новгород, Челябинск) циркулируют две доминирующие генетически однородные группы бактерий A. baumannii, объединяющие 82 % клинических штаммов.

2. Бактериофаг AP22 принадлежит к семейству Myoviridae, является видоспецифическим, обладает широким спектром литической активности по отношению к клиническим штаммам A. baumannii, высокой скоростью адсорбции при взаимодействии с бактериальной клеткой и высокой урожайностью.

3. Геном бактериофага AP22 представлен двунитевой ДНК размером 46387 п.н., содержит 89 потенциальных генов, среди которых идентифицированы гены, кодирующие структурные протеины, ферменты, ответственные за лизис бактериальной клетки-хозяина и компоненты системы репликации ДНК.

4. Атомно-силовая микроскопия является эффективным методом визуализации специфического взаимодействия литического фага AP22 с бактериальной клеткой, а также изучения особенностей структуры данного бактериофага, бактериальных клеток A. baumannii и формируемых ими клеточных агрегатов.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генноинженерных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (на 2011-2015 гг.); Гос. регистрационный № 01201172662 (тема № 0«Разработка и исследование новых дезинфектантов, антимикробных и инсектицидных препаратов»).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах получены в сотрудничестве с к.б.н. Воложанцевым Н. В., к.б.н. Жиленковым Е. Л., Мякининой В. П., к.б.н. Красильниковой В. М., к.б.н. Богуном А. Г., к.ф-м.н. Дубровиным Е. В., к.б.н. Платоновым М. Е., д.б.н. Игнатовым С. Г. и д.в.н. проф. Светочем Э. А.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на восьми российских и международных конференциях: школе-конференции молодых учёных и специалистов научноисследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Биобезопасность в современном мире», Оболенск, 2009 г. (III место на конкурсе устных докладов); the 12th SAC Seminar «Combating Global Infections», Иркутск, 2009 г.; XII Международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии, Москва, 2010 г. (I место на конкурсе постерных докладов); «Microbial Viruses: Genomics, Evolution and Applications in Ecology, Biotechnology and Medicine», Белфаст, Великобритания, 2011 г. (I место на конкурсе постерных докладов); E-MRS 2011 Spring Meeting, Ницца, Франция, 2011 г.; 19th Biennial Evergreen International Phage Biology Meeting, Олимпия, США, 2011 г. (II место на конкурсе постерных докладов); II Международном Конгрессе по внутрибольничным инфекциям, Москва, 2011 г.;

the EMBO conference «Viruses of Microbes», Брюссель, Бельгия, 2012 г.

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ от 29 января 2009 г. (протокол № 1) с изменениями, утверждёнными на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ от 1 ноября 2012 г.

(протокол № 9). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 25 от 26 октября 2012 г.).

Публикации. Основное содержание работы

отражено в 12 научных публикациях, в том числе в 3 статьях в рецензируемых журналах из перечня ВАК и в одном патенте РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, две главы результатов исследований, обсуждение результатов, выводы и указатель литературы, включающий 26 работ отечественных и 260 – зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 8 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования В работе использовали 130 штаммов A. baumannii, выделенных из клинического материала от госпитализированных больных (раневое отделяемое, тканевые биоптаты, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, плевральная жидкость, моча, желчь, кровь, содержимое дренажей, внутривенных катетеров) в стационарах различного профиля городов Челябинска (n = 89), Нижнего Новгорода (n = 20), Москвы (n = 12), Санкт-Петербурга (n = 9) в 2005-2010 гг., а также бактерии других геномовидов Acinetobacter: A. pittii (n = 2), A. genomospecies (n = 2), A. johnsonii (n = 1), A. shindleri (n = 1), A. lwoffii (n = 6), A. anitratus (n = 4), A. calcoaceticus (n = 2) и бактерии других родов и семейств: Pseudomonas aeruginosa (n = 5), Escherichia coli (n = 3), Yersinia pseudotuberсulosis (n = 3), Yersinia enterocolitica (n = 3), Klebsiella pneumoniae (n = 3), Klebsiella oxytoca (n = 3), Enterobacter cloacae (n = 3), Pasteurella multocida (n = 3) и Salmonella Enteritidis (n = 3), полученные из коллекции НИИ антимикробной химиотерапии СГМА г. Смоленска и «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.

Бактериальные культуры выращивали на жидких или плотных питательных средах Luria-Bertani (LB) и Nutrient Agar (Himedia Laboratories Pvt. Limited, Индия) при температуре 37 °С в течение 18-24 ч. Чувствительность к антибактериальным препаратам определяли дискодиффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

Идентификацию штаммов A. baumannii проводили методом оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов амплификации гена 16S рРНК A. baumannii с использованием праймеров SP2-16S (5-gat cat ggc tca gat tga acg c-3) и ASP2 -16S (5-gct acc ttg tta cga ctt cac cc-3) и эндонуклеазы рестрикции AluI, а также методом ПЦР с праймерами на видоспецифические для А. baumannii последовательности blaOXA-51-подобных генов (Woodford et al., 2006).

Генетическое типирование штаммов А. baumannii проводили методом ПЦР с произвольными праймерами (RAPD): Wil2 (5-tac cga tgc a-3) (Williams et al., 1993) и 1247 (5-aag agc ccg t-3) (Akopyanz et al., 1992). Кластерный анализ для построения дендрограммы выполняли с помощью программного обеспечения Bionumerics 5.1 (Applied Math NV, Бельгия) с использованием метода Ward и коэффициента Cosine.

Выделение бактериофагов, лизирующих бактерии рода Acinetobacter, из образцов клинического материала и проб из окружающей среды, а также наработку, очистку и концентрирование фаголизата проводили, как описано ранее (Popova et al., 2012).

Для изучения биологических свойств бактериофагов и параметров фаговой инфекции использовали методы, предложенные М. Adams (1959), с нашими модификациями (Popova et al., 2012; Dubrovin et al., 2012).

Электронно-микроскопическое исследование нативных фаговых частиц проводили методом негативного контрастирования фаговых препаратов (Brenner, 1959).

Приготовление образцов для визуализации специфического взаимодействия фага с бактериальной клеткой и их анализ методом атомно-силовой микроскопии осуществляли, как описано в работе E. Dubrovin et al. (2012).

Возможное наличие профага в геномной ДНК фагорезистентных клонов A. baumannii определяли с помощью мультиплексной ПЦР с двумя парами праймеров, специфичных к ДНК бактериофага AP22: AP22A-f (5agt tcg ttc tgc tgt ttg g-3) и AP22A-r (5-tcc tca aca tac caa atc g-3); AP22B-f (5gtg ttc att tcg ttc tct ca-3) и AP22B-r (5-cga cat ttc tca aca tca gc-3). В качестве контроля прохождения реакции ПЦР использовали праймеры SP2-16S и ASP216S на ген 16S рРНК A. baumannii.

Электрофоретическое разделение фаговых белков проводили в денатурирующих условиях в 12 % полиакриаламидном геле по стандартному протоколу (Laemmli, 1970). Молекулярную массу белков определяли по сканированному изображению электрофореграмм с помощью программы PhotoCaptMW.

ДНК бактериофагов выделяли методом депротеинизации очищенных в градиенте хлористого цезия фаговых частиц с использованием лизирующей смеси, содержащей 0,5 % SDS, 20 мМ ЭДТА и 50 мкг/мл протеиназы К. ДНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ (1:1) и переосаждали этиловым спиртом с ацетатом натрия. Гидролиз ДНК бактериофагов эндонуклеазами рестрикции проводили согласно инструкции производителя (Fermentas, Литва).

Секвенирование ДНК проводили по методу Сэнгера на приборах ABI PRISM 310 (Applied BioSystem, США) и MegaBace (Amersham Biosciences, США) с программным обеспечением Cimarron 3.12.

Для фрагментации фаговой ДНК использовали эндонуклеазы рестрикции HindIII, DraI и RsaI и обработку ультразвуком. Клонирование фрагментов фаговой ДНК в векторную плазмиду pUC19, приготовление компетентных клеток E. coli DH5 и их химическую трансформацию рекомбинантной ДНК проводили согласно руководству Т. Маниатис и др. (1984). Селекцию клонов с рекомбинантными плазмидами осуществляли посевом на среду MacConky, содержащую ампициллин (100 мкг/мл). Секвенирование клонированных фрагментов фаговой ДНК проводили с использованием праймеров M13 forward (-21): 5tgt aaa acg acg gcc agt-3 и M13 reverse (-26): 5-cag gaa aca gct atg ac-3. Расчет праймеров для секвенирования c матрицы нативной ДНК фага и секвенирования ампликонов проводили с использованием компьютерной программы Vector NTI (Carlsbad, CША).

Сборку, редактирование и анализ нуклеотидной последовательности фага AP22, а также сравнение нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета программ DNASTAR (Madison, США) и Vector NTI (Carlsbad, CША).

Открытые рамки считывания (ОРС), кодирующие возможные протеины, предсказывали с помощью биоинформационных программ GeneMark.hmm (http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark) (Lukashin & Borodovsky, 1998) и SoftBerry FGENE SB (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) (Mount Kisco, CША).

Функциональную аннотацию генома фага AP22 проводили с помощью сравнения транслированных ОРС с известными белковыми структурами, представленными в международных базах данных, с использованием биоинформационного ресурса BLASTP (Altschul et al., 2005) и программного обеспечения HHPred (Sding et al., 2005).

Количественные значения экспериментов были представлены после их обработки с помощью статистических программ Windows Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Молекулярно-генетическая характеристика антибиотикорезистентных штаммов A. baumannii Для реализации цели диссертационной работы первоочередной задачей являлось создание представительной коллекции клинических штаммов A. baumannii, выделенных в разное время на географически разных территориях, а также их генетическая идентификация и типирование.

В коллекцию были включены130 штаммов, выделенных от больных ОРИТ, ожогового, терапевтического и урологического отделений, отделений плановой и экстренной хирургии разнопрофильных стационаров Челябинска, Нижнего Новгорода, Москвы и Санкт-Петербурга в 2005-2010 гг. Основными источниками выделения штаммов являлись раневое отделяемое (45 %), мокрота (18 %), отделяемое дренажей (13 %), смывы с объектов госпитальной среды (5 %) и др.

Выделенные штаммы были идентифицированы как A. baumannii на основании исследования культурально-морфологических и биохимических признаков, проведённого в локальных лабораториях, и данных молекулярногенетического анализа.

Все генетически идентифицированные штаммы A. baumannii характеризовались устойчивостью к антибиотикам разных функциональных классов:

амоксициллин-клавуланату, ампициллин-сульбактаму, амикацину, цефтазидиму, цефепиму, ципрофлоксацину, левофлоксацину, за исключением цефоперазон-сульбактама, имипенема и меропенема.

Генетическую внутривидовую вариабельность исследуемых штаммов А. baumannii изучали методом ПЦР с произвольными праймерами (RAPD).

На основании кластерного анализа RAPD-профилей 130 штаммов A. baumannii была построена дендрограмма, отражающая степень генетического родства исследуемых штаммов (рис. 1).

Рисунок 1 – Дендрограмма кластеризации штаммов A. baumannii. Для каждого генотипа (RAPD-группы) отмечены: RAPD-профиль штамма-представителя; 1 - буквенное обозначение генотипа; 2 - общее количество штаммов, входящих в генотип; 3 - место выделения штаммов: Ч – Челябинск, НН – Нижний Новгород, М – Москва, СП – Санкт-Петербург При анализе дендрограммы было выявлено, что изучаемые штаммы входят в состав двух кластеров, условно обозначенных A и B (при степени гомологии более 90 %), каждый из которых включает по одной из двух доминирующих RAPD-групп (A1 и B1), объединяющих в целом 82 % (107 из 130) клинических штаммов A. baumannii, циркулирующих на протяжении нескольких лет в условиях больничного окружения в стационарах разных городов РФ. Наличие уникальных штаммов – представителей минорных RAPD-групп, по-видимому, является следствием генетических процессов, приводящих к постоянному формированию новых вариантов, что проявляется в генетической неоднородности госпитальной популяции A. baumannii.

Изучение бактериофага AP22, лизирующего клинические штаммы A. baumannii С целью поиска бактериофагов, специфически инфицирующих бактерии рода Acinetobacter, проведён анализ более 1500 образцов клинического материала и смывов с различных объектов внутрибольничной среды и около 200 проб из окружающей среды (образцы воды и почвы). Кроме того, с использованием митомицина С (5 мкг/мкл) была проведена индукция профагов из разных клинических штаммов A. baumannii.

В результате было выделено девять фагов, взаимодействующих с представителями рода Acinetobacter, из которых только один бактериофаг, получивший авторское название AP22, обладал широким спектром антибактериального действия по отношению к госпитальным штаммам A. baumannii. Данный бактериофаг выделен из клинического материала, полученного в ожоговом центре Научно-исследовательского института скорой помощи им. Н.В. Склифосовского (г. Москва).

На культуре чувствительных бактериальных штаммов A. baumannii бактериофаг AP22 формирует круглые прозрачные негативные колонии с ровными краями диаметром около 2-3 мм, окружённые непрозрачными ореолами, которые увеличиваются в размере с течением времени (рис.2).

Рисунок 2 – Зоны лизиса бактериального «газона» штамма A. baumannii 1053, формируемые фагом AP22 на плотной питательной среде: A. Морфология негативных колоний фага с ореолами; Б. Пятно лизиса бактериофага, окружённое ореолом (наверху: через 18 ч инкубации при температуре 37 С, внизу – через 30 ч последующего хранения при температуре 4 С) С помощью электронной микроскопии препаратов фаговых частиц показано, что бактериофаг AP22 имеет головку икосаэдрической формы с расстоянием между противоположными апикальными вершинами, равным 63-65 нм, и сокращающийся хвостовой отросток длиной 85-90 нм. Аппарат адсорбции AP22 представлен базальной пластинкой диаметром 22-23 нм, и хвостовыми фибриллами, каждая из которых имеет длину 42-43 нм. Фибриллы хорошо заметны у частиц с сокращёнными хвостовыми отростками (рис. 3).

Рисунок 3 – Электронные микрофотографии фага AP22: А. Очищенный в градиенте CsCl препарат бактериофага AP22; Б. Интактная фаговая частица; В. Фаговая частица с сокращённым хвостовым отростком; Г. Фаговые частицы на поверхности бактериальной клетки A. baumannii 1053. Контрастирование 1 % уранилацетатом. Масштаб: 50 нм В соответствии с морфологическими параметрами согласно Международной классификации и таксономии вирусов бактериофаг AP22 отнесен к семейству Myoviridae, морфотипу А1.

В серии экспериментов по определению спектра антибактериального действия и специфичности фага установлено, что бактериофаг AP22 лизирует в общей сложности 68 % (89 из 130) клинических штаммов A. baumannii и не обладает литической активностью по отношению к представителям других геномовидов Acinetobacter, а также бактериям других родов и семейств. При этом исследуемый бактериофаг обладает более выраженной литической активностью по отношению к представителям доминантных RAPD-групп A. baumannii A1 и B1, распространённых в нескольких крупных стационарах России в течение длительного промежутка времени (2005-2010 гг.), лизируя 82 % (88 из 107) штаммов данных групп.

Необходимо отметить, что бактериофаг AP22 обладает наиболее широким спектром литического действия из всех ранее описанных фагов, инфицирующих A. baumannii.

К критическим параметрам, влияющим на литическую активность и стабильность бактериофагов при хранении, относится ряд физико-химических факторов, в том числе значение pH, а также наличие хлороформа, обычно используемого в качестве инактивирующего бактерии агента. В экспериментах по определению влияния физико-химических факторов на стабильность и литическую активность бактериофага AP22 установлено, что титр бактериофага не меняется в течение суток в случае инкубирования при значениях pH от 4 до 9. В то же время, экстремальные значения pH (pH 2 и pH 12) существенно влияют на стабильность фага, а, следовательно, и на его способность инфицировать бактериальную клетку.

При изучении устойчивости фага AP22 к воздействию хлороформа продемонстрировано, что обработка хлороформом от 30 мин до 24 ч не оказывает влияния на активность фага. При этом воздействие хлороформа на индикаторные бактериальные культуры A. baumannii в течение 15-30 мин вызывает инактивацию исследуемых штаммов, что позволяет использовать его для удаления из фаголизата жизнеспособных бактерий.

Параметры инфекционного процесса фага AP22 изучены в экспериментах по определению времени адсорбции и одиночного цикла размножения бактериофага. Показано, что исследуемый бактериофаг адсорбируется на клеткехозяине штамма A. baumannii 1053 очень быстро: более 99 % фаговых частиц адсорбируются в течение 5 мин (рис. 4 A) независимо от присутствия в среде двухвалентных катионов. Константа скорости адсорбции составляет 1,5310-7 мл/мин.

Кривая одиночного цикла размножения (кривая репродукции) фага APпредставлена на рис. 4 B. Длительность латентного периода (времени между инфицированием бактериальной клетки и выходом фагового потомства) для AP22 составляет 40 мин. Средний выход фаговых частиц (среднее число фагов в расчёте на одну инфицированную клетку) составляет около 240 частиц на одну бактериальную клетку, что свидетельствует о высокой урожайности фага AP22.

Рисунок 4 – Анализ инфекционного процесса бактериофага AP22: A. Скорость адсорбции фага на клетках штамма A. baumannii 1053; B. Кривая одиночного цикла размножения фага на клетках штамма A. baumannii 1053: L – латентный период; BS – выход фаговых частиц В процессе изучения динамики инфекционного процесса путем спектрофотометрической детекции изменений, происходящих в ходе взаимодействия бактериофага AP22 с бактериальной клеткой, показано, что при значениях множественности инфицирования (MOI) 50 и 5 фаговых частиц на одну бактериальную клетку бактериофаг полностью лизирует жидкую культуру штамма-хозяина через 60 мин после начала фаговой инфекции, в то время как при MOI=0,5 лизис происходит через 2 ч (рис. 5) Рисунок 5 – Кривые изменения оптической плотности для неинфицированной фагом бактериальной культуры A. baumannii 1053 и бактериальных клеток, инфицированных фагом при MOI=50, 5 и 0,Для визуализации специфического взаимодействия фага AP22 и бактериальных клеток штамма-хозяина A. baumannii 1053 использовали метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), основанный на принципе механического сканирования образцов без применения предварительного напыления металлов и облучения фотонами и электронами.

При анализе АСМ-изображений контрольных образцов фаговых частиц, помещенных на поверхность слюды, установлено, что среднее значение диаметра головки бактериофага, оценивается как 62±1 нм, а длина хвостового отростка – 88±9 нм (рис. 6), что соответствует данным электронномикроскопического исследования.

Рисунок 6 – АСМ-анализ бактериофага AP22: A. АСМ-изображение фага, нанесённого на слюду (режим прерывистого контакта, канал «высота»); B. Гистограмма распределения высот головок бактериофага, нанесённого на слюду С помощью АСМ контрольных образцов бактериальных клеток A. baumannii 1053, выращенных в стационарных условиях при температуре 37 C, установлено, что бактерии располагаются на поверхности слюды в виде агрегатов, состоящих из нескольких десятков клеток (типичные наблюдаемые агрегаты представлены на рис. 7 A, B).

Рисунок 7 – АСМ-анализ клеток A. baumannii: A. АСМ-изображение нанесённых на слюду клеток A. baumannii, записанное по каналу «высота»; B. АСМ-изображение нанесённых на слюду клеток A. baumannii, записанное по каналу «отклонение», со вставкой, демонстрирующей увеличенный участок вокруг бактериальных агрегатов с экзополисахаридами и пилями; С. Профиль сечения вдоль линии с АСМ-изображения A; D. Увеличенный участок поверхности A. baumannii. Представленные АСМизображения получены при контактном режиме сканирования.

Наличие вокруг клеток относительно тонкого слоя предположительно внеклеточного матрикса (секретируемых экзополисахаридов) и густой сети окружающих клетки пилей (увеличенный фрагмент на рис. 7 B) дают основания предположить, что наблюдаемые агрегаты являются начальной стадией формирования биопленки или «протобиопленкой». В среднем, длина бактериальных клеток в составе агрегатов составляет 1-2 мкм, ширина – 0,75-1 мкм и высота – 0,4-0,5 мкм.

В серии экспериментов по исследованию различных стадий литического цикла бактериофага AP22 и изучению морфологии бактериальных клеток A. baumannii, инкубированных с фагом AP22 при температуре 37 C, установлено, что адсорбция фагов на поверхности бактериальных клеток A. baumannii наблюдается уже с первой минуты их совместной инкубации (рис. 8 A,B), что хорошо согласуется с данными эксперимента по определению времени адсорбции. Следует отметить, что с первых минут взаимодействия фага с бактериальными клетками происходит быстрое рассеивание протобиопленок. Это свидетельствует о том, что бактериофаг AP22 является эффективным дезагрегирующим фактором. Известно, что в большинстве случаев рассеивание биопленки опосредовано действием экзополисахарид-деградирующих ферментов, которые несут фаги (Sutherland et al., 2004). Очень быстрое рассеивание клеточных агрегатов A. baumannii при взаимодействии с бактериофагом AP22, наблюдаемое в наших экспериментах, также предполагает наличие фаговой экзополисахариддеполимеразы, что подтверждается образованием ореолов вокруг негативных колоний бактериофага (см. рис. 2). Количество адсорбированных на бактериальную поверхность фагов существенно увеличивается в течение последующих 10 мин (рис. 8 C-F). В отличие от фагов, помещенных на поверхности слюды, большинство бактериофагов, адсорбированных на поверхности бактерий, имеют пустую головку. Это указывает на то, что высвобождение ДНК происходит достаточно быстро или немедленно после фаговой адсорбции на клеткехозяине.

Рисунок 8 – АСМ-изображения клеток A. baumannii, инкубированных с фагом в течение одной (A), трёх (C) и шести (E) мин (контактный режим сканирования, канал «отклонение»); В, D, F - увеличенные трёхмерные изображения соответствующих бактериальных поверхностей Взаимодействие фага AP22 с клетками A. baumannii в течение 15, 30 и 60 мин представлено на рис. 9. Через 15 мин после начала фаговой инфекции можно наблюдать высокую плотность адсорбированных на поверхности бактерий фаговых частиц, что указывает на наличие большого количества соответствующих рецепторов, и, начиная с 30 мин инкубации, существенные изменения формы клеток A. baumannii. Бактериальные клетки становятся неоднородными по своей длине, их высота варьирует от 70 до 200 нм (рис. 9 D-I), что в 25 раз ниже, чем высота клеток, определённая на АСМ-изображениях контрольных клеточных образцов (рис. 7 A-C). Через 60 мин инкубации наблюдается разрушение бактериальных клеток, о чём можно судить по потере клетками нормальной формы и по выходу из инфицированных клеток новых фаговых частиц (рис. 9 G-I).

Рисунок 9 – Записанные по каналу «отклонение» (A, D) и «высота» (G) АСМизображения клеток A. baumannii, инкубированных с фагом в течение 15 мин (A), 30 мин (D) и 60 мин (G) (контактный режим сканирования); B, E, H - профили сечения вдоль пунктирных линий с соответствующих АСМ-изображений; C,F, I - увеличенные трёхмерные изображения соответствующих бактериальных поверхностей.

Таким образом, использование АСМ является эффективным подходом для визуализации инфекционного процесса и характеристики литического цикла бактериофага AP22.

Для того чтобы экспериментально продемонстрировать литическую природу фага проведен анализ фагорезистентных клонов A. baumannii. Частота образования устойчивых к данному фагу клонов, образующихся в зоне фаголизиса газона A. baumannii, составляет 10-6 на одну бактериальную клетку. Для того чтобы проверить, являются ли такие клоны фагорезистентными мутантами (например, адсорбционно-устойчивыми) или лизогенными вариантами со встроенным профагом, 50 очищенных трёхкратным пересевом фагоустойчивых клонов проверяли на способность подвергаться спонтанной или направленной индукции в присутствии различных концентраций митомицина С. Во всех случаях индукции бактериофагов не отмечено. Для более строгого доказательства отсутствия ДНК фага AP22 в составе суммарной ДНК фагорезистеных клонов была проведена мультиплексная ПЦР с двумя парами праймеров, специфичных к фаговой ДНК. В качестве контроля прохождения реакции использовали праймеры на ген 16S рРНК A. baumannii (рис. 10). В ходе проведенных экспериментов фаговой ДНК в составе геномной ДНК 50 фагоустойчивых клонов A. baumannii не выявлено.

Рисунок 10 – Определение возможного наличия профага в геномной ДНК фагорезистентных клонов с помощью мультиплексной ПЦР: A. Устойчивые к бактериофагу AP22 клоны в зоне фаголизиса A. baumannii 1053; B. Электрофореграмма продуктов ПЦР c тремя парами праймеров (AP22A-f –AP22A-r и AP22B-f – AP22Br22, специфичных к фаговой ДНК, и SP2-16S – ASP2-16S на ген 16S рРНК A. baumannii), проводимой для определения возможного присутствия профага в геноме фагорезистентных клонов: Ph –бактериофаг AP22, 1, 2, 3 – фагорезистентные клоны, Ab – штамм A. baumannii 1053, L – маркер молекулярных масс 100bp Ladder (Fermentas, Литва) При анализе белкового состава очищенного препарата бактериофага AP22 методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле выявлено четыре основных и три минорных структурных белка с молекулярными массами: 84,8;

67,2; 46,3; 31,3; 27,7; 23,1; 17,4 кДа, определёнными с помощью программы PhotoCaptMW (рис. 11).

Рисунок 11 – Электрофоретическое разделение белков бактериофага AP22 в 12 % SDS-полиакриламидном геле, окраска Кумасси G-250; M – маркер молекулярной массы Можно предположить, что мажорный белок с молекулярным весом около 31 кДа является основным структурным элементом головки бактериофага, а мажорные белки с молекулярными весами 46 и 17 кДа – основными компонентами хвостового отростка.

Рестрикционный анализ ДНК бактериофага AP22, проведённый с использованием 28 эндонуклеаз рестрикции, показал, что ДНК фага расщепляется ферментами HindIII, DraI, VspI, SspI, TaqI, AluI, RsaI, HinfI, MspI, CfrI, EcoRI, частично гидролизуется EcoRV, PstI, SalI, XmiI, SmiI, ClaI, BamHI, PvuII, BglII, EcoR91I, NcoI, NheI и не гидролизуется ферментами SmaI, ApaI, NotI, DraII, Eco52I. Для определения размера генома фага AP22 проводили двойной и тройной гидролиз фаговой ДНК эндонуклеазами рестрикции NheI и PstI, SmiI и PstI, SmiI и EcoRV, NheI, EcoRV и PstI (рис. 12).

Рисунок 12 – Электрофореграммы продуктов гидролиза ДНК фага AP22 рестрикционными эндонуклеазами VspI (1), SspI (2), HindIII (3), DraI (4), NheI (5), SmiI (6), PstI (7), EcoRV (8), NheI и PstI (9), SmiI и PstI (10), SmiI и EcoRV (11), NheI, EcoRV и PstI (12, рестрикционные фрагменты отмечены треугольниками); L – гидролиз ДНК фага эндонуклеазой HindIII; М – маркер молекулярных масс 1-kb DNA Ladder (Fermentas, Литва). Сумма размеров рестрикционных фрагментов (для 9-12) указана в kb Размер генома фага AP22, определённый на основании обработки рестрикционных профилей фаговой ДНК с помощью программного обеспечения Quantity One (Bio-Rad), составил 46,4 т.п.н.

Для определения полной нуклеотидной последовательности генома бактериофага AP22 проводили секвенировнание геномных библиотек (shotgun sequencing), полученных при клонировании в векторную плазмиду pUCфрагментов фаговой ДНК, образованных при ферментативном расщеплении ДНК эндонуклеазами рестрикции HindIII, DraI и RsaI, а также при обработке фаговой ДНК ультразвуком. В результате клонирования было отобрано в общей сложности 224 клона, содержащих рекомбинантную ДНК со вставками ДНК бактериофага AP22 размером от 170 до 3800 п.н.

Несколько циклов секвенирования клонированных фрагментов ДНК фага позволили получить перекрывающиеся фрагменты, объединённые затем в более крупные контиги. Для объединения контигов в единую последовательность проводили прямое секвенирование генома фага, используя олигонуклеотидные праймеры, комплементарные 5- и 3-концевым последовательностям ранее секвенированных фрагментов и контигов фага, а также секвенирование отдельных ампликонов, наработанных в ПЦР с использованием тех же праймеров. В результате каждый нуклеотид в составе фаговой ДНК был прочитан как минимум три раза.

Проведённые эксперименты показали, что геном бактериофага представлен двухцепочечной кольцевой ДНК размером 46387 п.н. с Г-Ц составом 37,74 %.

С помощью биоинформационных программ GeneMark.hmm и SoftBerry FGENE в геноме фага AP22 было выявлено 89 открытых рамок считывания (ОРС), кодирующих предполагаемые пептиды размером не менее 35 а.о., из которых 77 ОРС располагаются на прямой, 12 – на обратной цепях ДНК. ОРС организованы как минимум в 17 транскрипционных единиц, определённых с помощью биоинформационной программы GeneMark.hmm.

Установлено, что геном бактериофага AP22 имеет модульную организацию и включает гены, кодирующие структурные протеины (белок капсида, белки хвостового отростка, базальной пластинки, хвостовых фибрилл и выростов), ферменты, ответственные за лизис бактериальной клетки-хозяина (фаговый лизоцим – эндолизин и потенциальный холин) и компоненты системы репликации ДНК (рис. 13).

При сравнении аминокислотных последовательностей потенциальных белков фага AP22 с известными протеинами, определены возможные функции 25 % (22 из 89) из них; 60 % (54 из 89) ОРС кодируют гипотетические белки с неизвестными функциями, представленные в базах данных; а предполагаемые продукты 15 % ОРС (13 из 89) не имеют сходства с какими-либо фаговыми или бактериальными протеинами.

Показано, что 18 % (16 из 89) ОРС AP22 кодируют полипептиды, обладающие гомологией с протеинами Acinetobacter spp. с неизвестной функцией, 57 % (51 из 89) ОРС гомологичны фаговым протеинам.

Сравнительный геномный анализ выявил существенную гомологию между бактериофагом AP22 и фагом AB1 (Yang et al., 2010), также инфицирующим A. baumannii: гомология определена для 53 из 89 предполагаемых генов. Кроме того, по одному из предсказанных протеинов AP22 обладают гомологией с белками следующих бактериофагов: фага Staphylococcus 52A (ORF032), фага Salmonella E1 и фага Burkholderia BcepC6B (gp36).

Следует отметить, что в геноме фага AP22 не идентифицировано ни одного гена, кодирующего токсины или какие-либо известные факторы вирулентности. Кроме того, не выявлены гены, определяющие умеренный (лизогенный) путь развития бактериофага (в составе профага).

Таким образом, в результате проведённых экспериментов впервые определена полная нуклеотидная последовательность ДНК бактериофага семейства Myoviridae, лизирующего бактерии A. baumannii. Аннотированная последовательность генома фага AP22 депонирована в Европейской базе данных EMBL под номером HE806280 и базе данных GenBank под номером NC_017984.

Рисунок 13 – Геномная карта бактериофага AP22 с указанием функций предсказанных белковых продуктов В заключение стоит подчеркнуть, что к важнейшим характеристикам, необходимым для отбора литических фагов как оптимальных терапевтических агентов, можно отнести широту спектра литического действия, относительную простоту получения фага в высоком титре, быстрое размножение фага (минимальный латентный период, высокий урожай, отсутствие задержки лизиса), устойчивость к процедурам очистки от бактерий и некоторые другие признаки.

В ходе проведенных исследований было установлено, что бактериофаг APобладает всеми вышеперечисленными свойствами.

Таким образом, на основании данных микробиологического, геномного и биоинформационного анализов бактериофаг AP22 можно рассматривать в качестве потенциального компонента препарата для лечения инфекций, вызванных A. baumannii, и использовать для идентификации бактерий данного вида при бактериологическом анализе клинического материала.

ВЫВОДЫ 1. Создана коллекция, включающая 130 штаммов A. baumannii, выделенных в период с 2005 по 2010 гг. в крупных стационарах Европейской части России и Южного Урала.

2. Среди изученных штаммов выявлено 10 генетических групп, из которых две доминирующие группы объединяют 82 % (107 из 130) клинических штаммов A. baumannii.

3. Выделено девять бактериофагов, инфицирующих бактерии рода Acinetobacter. Бактериофаг AP22 семейства Myoviridae с широким спектром антибактериального действия выделен из клинического материала, полученного в ожоговом центре.

5. Бактериофаг AP22 специфически инфицирует и лизирует 68 % (89 из 130) штаммов A. baumannii, обладает высокой скоростью адсорбции к бактериям (более 99 % фаговых частиц адсорбируются в течение 5 мин) и высокой урожайностью – 240 фаговых частиц на одну инфицированную бактериальную клетку.

6. Методом атомно-силовой микроскопии изучена морфология фага APи проведена визуализация его литического цикла. Установлено, что с первой минуты совместной инкубации данного фага и протобиопленок, формируемых A. baumannii в стационарных условиях роста, наблюдается рассеивание клеточных агрегатов и адсорбция фаговых частиц.

7. Определена полная нуклеотидная последовательность генома бактериофага AP22, представленного двунитевой ДНК размером 46387 п.н. с Г-Ц составом 37,74 %. В геноме выявлены 89 открытых рамок считывания и определены вероятные функции 22 из них.

8. В геноме фага AP22 не идентифицировано ни одного гена, кодирующего пептиды, подобные токсинам или каким-либо известным факторам вирулентности, представленным в международных базах данных, а также гены, определяющие умеренный путь развития фага.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК 1. Popova, A. V. Isolation and characterization of wide host range lytic bacteriophage AP22 infecting Acinetobacter baumannii / A. V. Popova, E. L. Zhilenkov, V. P. Myakinina, V. M. Krasilnikova, N. V. Volozhantsev // FEMS Microbiol. Lett. – 2012. – Vol. 332. – N 1. – P. 40-46.

2. Dubrovin, E. V. Atomic force microscopy analysis of the Acinetobacter baumannii bacteriophage AP22 lytic cycle / E. V. Dubrovin, A. V. Popova, S. V. Kraevskiy, S. G. Ignatov, T. E. Ignatyuk, I. V. Yaminsky, N. V. Volozhantsev // PLoS ONE. – 2012. – Vol. 7. – N 10. – e47348.

3. Попова, А. В. Молекулярно-генетическая характеристика антибиотикоустойчивых штаммов Acinetobacter baumannii и оценка их чувствительности к бактериофагу AP22 / А. В. Попова, В. П. Мякинина, М. Е. Платонов, Н. В. Воложанцев // Мол. генетика, микpобиол., виpусол. – 2012. – № 4. – С. 18-22.

б) патенты 4. Пат. № 2439151 C1 РФ, МПК C12N7/00, C12R1/19. Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii АР22 для идентификации бактерий Acinetobacter baumannii при бактериологическом анализе клинического материала и для получения препарата против внутрибольничных A. baumannii-инфекций / А. В.

Попова, Н. В. Воложанцев, Е. Л. Жиленков, В. П. Мякинина, М. А. Попова, Т. Г. Спиридонова, Э. А. Светоч – заявлено 24.06.2010; опуб. 10.01.2012.

в) тезисы научных конференций 5. Попова, А. В. Изучение эффективности применения бактериофагов в комплексном лечении ожоговых больных / А. В. Попова, М. А. Попова, И. А.

Худяков // Материалы школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Биобезопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009 г.). – Оболенск, 2009. – С. 249-251.

6. Kuzhelnaya, E. N. Multidrug Resistant Acinetobacter Nosocomial Strains Collected from Russian Hospitals in 2003-2008: Phenotypes of the resistance / E. N.

Kuzhelnaya, А. V. Popova, N. K. Fursova, А. N. Kruglov, S. V. Sidorenko, E. А.

Svetoch // Abstracts of the 12th SAC Seminar «Combating Global Infections» (Irkutsk, 21-25 September 2009). – P. 38.

7. Попова, А. В. Молекулярно-генетическое типирование и изучение устойчивости к антибактериальным препаратам нозокомиальных штаммов Аcinetobacter baumannii / А. В. Попова, Е. Н. Кужельная, М. А. Попова, Н. В. Воложанцев, Н. К. Фурсова // Тезисы XII Международного конгресса МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 18-20 мая 2010 г.).

Клин. микробиол. и антимикроб. химиотерапия. – 2010. – T. 12. – № 2, прилож.

1. – C. 42-43.

8. Popova, A. V. Isolation and characterization of Myoviridae bacteriophage lytic for Acinetobacter baumannii / A. V. Popova, V. P. Myakinina, E. L. Zhilenkov, V. M. Krasilnikova, N. V. Volozhantsev // Abstracts of «Microbial Viruses: Genomics, Evolution and Applications in Ecology, Biotechnology and Medicine» (Belfast, 19-20 April 2011). – P. 53.

9. Dubrovin, E. V. Use of atomic force microscopy for investigation of bacteriophage infection cycle / E. V. Dubrovin, A. V. Popova, S. V. Kraevsky, T. E. Ignatyuk, S. G. Ignatov, I. V. Yaminsky, N. V. Volozhantsev // Abstracts of «E-MRS 20Spring Meeting» (Nice, France, 9-13 May 2011). – P. 13.

10. Popova, A. V. Characterization of Acinetobacter baumannii bacteriophage AP22 isolated from Russian hospital / A. V. Popova, E. V. Dubrovin, V. P. Myakinina, E. L. Zhilenkov, S. V. Kraevsky, T. E. Ignatyuk, N. V. Volozhantsev // Program and abstracts of the 19th Biennial Evergreen International Phage Biology Meeting (Olympia, 7-12 August 2011). – P. 84.

11. Гончаров, А. Е. Эпидемические клоны Acinetobacter baumannii в российских стационарах / А. Е. Гончаров, Л. П. Зуева, Н. В. Воложанцев, А. В. Попова, Т. Н. Суборова, А. П. Соломенный, Н. Р. Сагиева // Материалы II Международного Конгресса по внутрибольничным инфекциям (Москва, 23-24 ноября 2011 г.). Инфекционные болезни. – 2011. – T. 9, прилож. 3. – C. 24-25.

12. Popova, A. V. Genomic organization of lytic Acinetobacter baumannii bacteriophage AP22 / A. V. Popova, A. G. Bogun, N. V. Volozhantsev // Program and abstracts of the EMBO conference «Viruses of Microbes» (Brussels, 16-20 July 2012). – P. 57.

Благодарности Глубоко признательна научному руководителю моей кандидатской диссертации к.б.н. Воложанцеву Николаю Валентиновичу, а также моим соавторам и коллегам, принимавшим участие в планировании, проведении экспериментов и обсуждении их результатов.

Считаю своим долгом выразить искреннюю благодарность Поповой М. А.

(Городская клиническая больница №6, Челябинск), Спиридоновой Т. Г. (НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского, Москва), Гординской Н. А. (Нижегородский НИИ травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития России, Нижний Новгород), Гончарову А. Е. (Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И. И. Мечникова, Санкт-Петербург), Фурсовой Н. К. (ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск) и Эдельштейну М. В. (НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленск) за предоставление бактериальных штаммов, клинических изолятов и образцов для проведения исследований.

Выражаю искреннюю признательность ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, заданные вопросы и сделанные поправки, которые, по возможности, были учтены.

Приношу особую благодарность моей маме – врачу Поповой Маргарите Александровне и врачу Худякову Илье Александровичу, профессионализм, ответственность и энтузиазм которых побудили меня к выбору направления моей исследовательской деятельности.

Диссертация посвящена памяти Настоящего Ученого – Юрия Николаевича Ковалева.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.