WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

МАЧУЛИН АНДРЕЙ ВАЛЕРИЕВИЧ

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ: ОТ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ДО НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ

03.01.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте белка Российской академии наук.

Научные руководители:

доктор физико-математических наук, профессор Сердюк Игорь Николаевич доктор физико-математических наук Хечинашвили Николай Николаевич

Официальные оппоненты:

Буданцев Аркадий Юстианович – доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, заведующий лабораторией функциональной гистохимии Васильев Виктор Дмитриевич – доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН, г.н.с.

персональной группы В. Д. Васильева

Ведущая организация:

НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова».

Защита диссертации состоится «20» декабря 2012 г. в 14.00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу:

142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «19» ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Смолихина Татьяна Ивановна

Общая характеристика работы

Диссертационная работа посвящена применению и развитию метода атомно-силовой микроскопии (АСМ) для исследования морфологических свойств бактериальных клеток и макромолекулярных структур.

В настоящей работе проведено подробное исследование морфологии поверхности фототрофных пурпурных бактериальных клеток Rhodobacter sphaeroides, трансформированных растительным геном ipt. Полученные данные позволили существенно расширить представление о влиянии данной трансформации на клеточную подвижность, капсульные структуры вокруг клеток, а также на состав клеточной стенки данного вида бактерий.

Метод АСМ был также апробирован в исследовании отдельных белков, молекул ДНК, а также белок-белковых и ДНК-белковых комплексов.

В данной работе на примере природного амилоидогенного белка YB-показаны возможности совместного использования методов аналитического ультрацентрифугирования (АУ) и АСМ для исследования полиморфизма и кинетики образования сформированных белковых структур.

Метод АСМ был применен для визуализации сайт-специфического связывания молекул ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I. Данная нуклеаза является уникальным по своим функциям ферментом, уже нашедшим широкое применение в ряде биотехнологических методов. Подобраны условия и соотношение ДНК/белок, которые позволили с высоким разрешением визуализировать образовавшийся ДНК-белковый комплекс.

Проведенная экспериментальная работа охватывает широкий круг научных проблем. Полученные результаты расширяют современные представления о влиянии генетических мутаций на морфологию фототрофных бактериальных клеток, а также о структурной организации макромолекулярных комплексов: образование фибрилл амилоидогенным белком YB-1 и образование комплекса ДНК-никаза. Разработанные в диссертационной работе подходы могут быть использованы в качестве методической основы для исследования одиночных биологических объектов разного уровня организации методом АСМ.

Актуальность работы Благодаря высокому пространственному разрешению на сегодняшний день основным инструментом для изучения рельефа поверхности в нанометровом масштабе является АСМ. Развитие этого метода открыло принципиально новые возможности в исследовании структуры и локальных биофизических свойств биологических объектов различного уровня организации.

АСМ предоставляет уникальную возможность по визуализации одиночных макромолекул, находящихся в атмосферных условиях или физиологических буферных растворах, в режиме реального времени. С помощью данного метода можно исследовать отдельные белки и молекулы ДНК, а также белок-белковые и ДНК-белковые комплексы, особенности их образования и специфического взаимодействия. Большим преимуществом данного метода является небольшое количество используемого при работе образца. Другими словами, исследования могут проводиться на одиночных молекулах. Кроме того, получаемые изображения макромолекулярных частиц могут быть полезны для оценки однородности образца, а также для выявления реального расположения составляющих компонентов наблюдаемых частиц.

Однако, при всех достоинствах этого метода существует и ряд недостатков, главным из которых является отсутствие одновременной информации о всей поверхности, поскольку в каждый момент времени мы имеем информацию только от участка препарата, непосредственно регистрируемого АСМ-зондом. Кроме того, при взаимодействии сканирующего зонда с поверхностью, часто происходит ее деформация, а ряд внешних факторов, таких как акустические шумы и механические колебания, могут внести искажения в получаемые изображения.

Стоит отметить, что если методология получения изображения клеточных объектов с помощью АСМ на сегодняшний день отработана и дает хорошие результаты, то для более мелких биообъектов, таких как белки и нуклеиновые кислоты приходится подбирать индивидуальные условия приготовления образца. Например, основной проблемой при исследовании ДНК-белковых комплексов является тот факт, что для непосредственной визуализации необходимо подбирать условия одновременного взаимодействия молекулы ДНК с белком и с поверхностью подложки.

Таким образом, поскольку не существует универсального подхода к исследованию биологических объектов методом АСМ, развитие методов препарирования и анализа биообъектов разных уровней организации является актуальной задачей. Полученные в работе результаты имеют важное значение для развития представлений об особенностях поверхности микроорганизмов (влияние мутаций на морфологию поверхности фототрофных клеток) и структурной организации биополимеров (образование фибрилл амилоидогенным белком YB-1, образование комплекса ДНК-никаза), а методики, используемые в данной работе могут быть использованы для детального анализа клеточных и белковых систем.

Цель и задачи работы Целью данной работы было применение метода атомно-силовой микроскопии для исследования бактериальных клеток и макромолекул.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать морфологические особенности бактериальных клеток и влияние на них генной трансформации.

Для этого необходимо:

подобрать условия для визуализации фототрофных бактерий Rhodobacter sphaeroides идентифицировать влияние ipt-трансформации на морфологию поверхности клеток бактерий Rhodobacter sphaeroides 2. Исследовать процесс фибриллообразования белком YB-1, в том числе:

определить объем отдельных белковых молекул белка YB-1 путем анализа экспериментально измеренных параметров на АСМизображениях и сравнить его с гидродинамическим объемом исследовать структуры, образуемые белком YB-1 в различных ионных условиях методами АСМ и АУ 3. Исследовать сайт-специфическое связывание ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I:

подобрать оптимальные условия для получения изображения ДНКбелкового комплекса высокого разрешения выявить особенности механизма взаимодействия ДНК с никующей эндонуклеазой 4. Предложить методики препарирования микроорганизмов и макромолекулярных комплексов разного уровня организации для АСМ.

Научная новизна диссертации При исследовании пурпурных бактерий Rhodobacter sphaeroides:

показано, что ipt-трансформация приводит к практически полной утрате жгутиков клетками установлено, что ipt-трансформация приводит к изменению наружного слоя внешней мембраны, что обусловлено изменением структуры и состава липополисахаридов При исследовании белка YB-1 с помощью методов АСМ и АУ:

показано, что свежеприготовленный белок YB-1 находится в глобулярной мономерной форме и ионные условия не влияют на его конформацию в растворе установлено, что в растворе свежеприготовленного белка его неструктурированные N- и C- домены располагаются компактно вокруг домена холодового шока показано, что структурной единицей инициирующей возникновение протофибрилл и последующее развитие процесса образования протяженных фибрилл является димерная форма белка YB- показано, что белок YB-1 в условиях высокой ионной силы (2M LiCl) может формировать морфологически различные протяженные структуры При исследовании механизма комплексообразования между ДНК и белком:

установлено, что через пять минут после инкубации раствора ДНК с никазой Nt.BspD6I происходит их взаимодействие и образуется ДНКбелковый комплекс; взаимодействие ДНК с белком происходит в ожидаемом месте связывания показано, что высота молекулы ДНК рядом с местом связывания белка соответствует высоте одноцепочечной молекулы ДНК, что согласуется с особенностью ферментативной активности никазы обнаружено, что через 90 минут инкубации раствора ДНК с белком происходит расщепление ДНК в месте связывания белка на два сегмента (1/3 и 2/3 длины) Научно-практическая значимость 1. На основе полученных данных разработаны рекомендации, позволяющие исследовать морфологию клеточных бактериальных поверхностей.

2. Данные, полученные при исследовании морфологических особенностей фототрофной пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides, существенно расширяют представления об изменениях, происходящих при iptтрансформации данных клеток.

3. На основе данных, полученных при исследовании белка YB-1 методами АСМ и АУ установлено, что в растворе свежеприготовленный белок находится в компактной форме; структурной единицей инициирующей процесс фибриллообразования является димерная форма белка YB.

4. В ходе исследования сайт-специфического связывания между ДНК и ферментом никазой были подобраны ионные условия, а также соотношение концентраций ДНК к белку в конечном растворе, что позволило с высоким разрешением визуализировать образовавшийся ДНК-белковый комплекс.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Ipt-трансформация фототрофной пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides приводит к практически полной утрате жгутиков в трансформированных клетках, а также к изменению наружного слоя внешней мембраны.

2. Белок YB-1 формирует различные структуры в условиях высокой ионной силы (2M LiCl), что свидетельствует о характерном для амилоидогенных фибрилл полиморфизме.

3. Свежеприготовленный белок YB-1 находится в глобулярной мономерной форме и ионные условия не влияют на его конформацию в растворе.

4. В растворе свежеприготовленного белка его неструктурированные N- и C- домены располагаются компактно вокруг домена холодового шока 5. Структурной единицей инициирующей возникновение протофибрилл и последующее развитие процесса образования протяженных фибрилл является димерная форма белка YB-1.

6. Инкубация раствора ДНК c никующей эндонуклеазой приводит к связыванию ДНК с белком, который детектируется в ожидаемом месте связывания.

7. Никаза при специфическом связывании с молекулой ДНК вносит в нее одноцепочечный разрыв, который является характерной особенностью ферментативной активности этого белка.

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были изложены в докладах на следующих конференциях:

XIX Пущинские чтения по фотосинтезу, Россия, Пущино, 15-19 июня 2009; 14я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых: Биология – наука XXI века, Россия, Пущино, 19-23 апреля 2010; I Международная научная конференция. Современное естествознание: вопросы и ответы. Россия, СанктПетербург, 30-31 августа 2011; XIX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», 9-13 апреля 2012 года;

16-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых:

Биология – наука XXI века, Россия, Пущино, 16-21 апреля 2012 года; IV Съезд биофизиков России, Россия, Нижний Новгород, 20-26 августа 2012 года Публикации По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в реферируемых журналах, входящих в список ВАК, и 6 тезисов докладов на конференциях Структура и объем диссертационной работы Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка литературы, включающего 211 наименований. Работа изложена на 160 страницах и содержит 60 рисунков и 1 таблицу.

Основное содержание работы

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулирована цель работы, обсуждается новизна и практическая значимость полученных результатов.

В главе 1 представлен обзор литературы по теме диссертационной работы. В обзоре описаны основные особенности атомно-силового микроскопа, связанные с его конструкцией и режимами работы, подготовка и проведение эксперимента. Большое внимание уделено основным методикам препарирования биологических образцов для АСМ. Кроме того, описаны возможности АСМ в исследованиях бактериальных клеток, молекул белков и нуклеиновых кислот, а также их комплексов. В данной главе также описаны особенности выбранных объектов исследования.

Глава 2 посвящена особенностям обработки и анализу АСМ-данных, поскольку при всем многообразии возможностей, которые дает метод АСМ, в процессе исследования поверхности различных материалов и при интерпретации полученных результатов возникает ряд сложностей. Часть из них вызвана артефактами (искажениями изображения исследуемого объекта, обусловленными конструктивными особенностями прибора и ограничениями режима работы), а часть – внесением в конечное изображение дополнительной картины, связанной с физическими особенностями как объекта исследования так и подложки.

На примере мономеров белка YB-1 частиц в данной работе проведено сравнение объема белковой молекулы, рассчитанной из экспериментально измеренных параметров на АСМ-изображениях с гидродинамическим объемом, полученным методом АУ.

В главе 3 описываются материалы и методы, используемые в работе для подготовки к исследованию выбранных объектов.

В главе 4 представлены экспериментальные данные, полученные при исследовании выбранных объектов.

Первая часть главы 4 посвящена АСМ-исследованию морфологических особенностей бактериальных клеток. Приведено исследование влияния генной трансформации на фототрофные клетки. В настоящее время метод АСМ активно применяется для исследования морфологии бактериальных клеток, локализации их поверхностных компонентов, изучения механических свойств клеточной стенки [Casuso et al., 2011], определения сил взаимодействия между отдельными молекулами. У фотосинтезирующих пурпурных бактерий этим методом подробно изучена структура фотосинтетического аппарата [Scheuring et al., 2009], структура и динамика отдельных белков фотосинтезирующих мембран [Liu et al., 2011].

Цитокинины – растительные гормоны, регулирующие процесс деления клеток, были обнаружены практически во всех живых организмах. Ключевым ферментом синтеза цитокининов является изопентенилтрансфераза, которая кодируется геном ipt. В ipt-трансгенных растениях табака нерегулируемая экспрессия гена биосинтеза цитокининов вызывает как изменение их морфологии, так и понижение содержания хлорофилла и фотосинтетической активности [Алексеева, 2000]. В геноме Rhodobacter sphaeroides ген изопентинилтрансферазы обнаружен не был. Для выяснения влияний ipt гена на физиологические процессы фототрофной пурпурной бактерии была проведена ее трансформация методом конъюгации.

Ранее, различными биохимическими методами и методом электронной микроскопии было показано, что ipt-трансформация фототрофной пурпурной бактерии Rhodopseudomonas palustris приводит к подавлению биосинтеза бактериохлорофилла, изменению соотношения фотосинтезирующих комплексов, корового и светособирающего, а также к изменениям в форме колоний и структуре клеточной стенки этой бактерии [Сердюк и др., 2007].

Аналогичные изменения наблюдали и в ipt-трансформанте Rhodobacter sphaeroides. В данной работе было проведено сравнение морфологии и поверхности трансформированных клеток и клеток дикого типа и Rhodobacter sphaeroides. У модифицированных бактерий выращенных анаэробно наблюдалось существенно меньшее или полное отсутствие жгутиков, что коррелирует с гораздо меньшей подвижностью клеток-трансформантов, наблюдаемой в световом микроскопе.

При исследовании модифицированных бактерий выращенных аэробно также наблюдалось существенно меньшее или полное отсутствие жгутиков.

Еще одним отличием трансформированных клеток от клеток дикого типа являлось присутствие вокруг клетки слизистой структуры. Судя по толщине этого образования (около 1 мкм), плотному прилеганию к клеточной стенке и четкому очертанию границ его можно отнести к капсульным структурам.

Капсулы образуются в определенных условиях выращивания бактерий, иногда неблагоприятных. Они защищают клетки бактерий от механических повреждений, высыхания, создают дополнительный осмотический барьер, могут выполнять функцию запасных питательных веществ, препятствуют адсорбции бактериофагов на клетках [Stukalov et al. 2008]. По-видимому, в нашей работе неблагоприятным фактором, вызывающим образование капсул у генетически модифицированных бактерий являлась сама ipt-трансформация бактериальной клетки. Изменения в метаболизме клетки, вызванные трансформацией, обусловили необходимость адаптации бактерий к их обычной среде выращивания (рис.1).

Рис. 1. АСМ-изображения одиночных клеток Rhodobacter sphaeroides (аэробное выращивание). (А) клетки дикого типа, (Б) ipt-трансформированные клетки. Режим боковой подсветки.

АСМ-изображения поверхности клеток двух типов Rhodobacter sphaeroides представлены на рисунке 2. Из рисунка видно, что внешний слой клеток дикого типа представлен протяженными, волнистыми структурами.

Похожие структуры наблюдаются и у трансформирмантов Rhodobacter sphaeroides (рис. 2 Б), но они более короткие, свернуты в кольца или полукольца, и имеют более плотную упаковку. Такие изменения в структуре наружного слоя внешней мембраны клеток трансформантов являются следствием изменений в структуре и составе липополисахаридов.

Рис. 2. АСМ-изображения поверхности клеток Rhodobacter sphaeroides. (А) клетки дикого типа, (Б) ipt-трансформированные клетки.

Также, в данной части приведены результаты исследования сложноорганизованного фотосинтетического аппарата фототрофных бактерий.

Отработанные методики работы с трансформированными клетками и их хроматофорами в дальнейшем позволят визуализировать с высоким разрешением взаимное расположение светособирающих комплексов фотосинтетического аппарата ipt-трансгенных фототрофных бактерий с целью построения структурной модели хроматофора трансформированного типа.

Вторая часть Главы 4 посвящена исследованию с помощью АСМ и АУ амилоидогенных белков, а именно особенностям их самоорганизации и влияния на этот процесс внешних условий. В качестве объекта исследования был использован амилоидогенный белок YB-1 (молекулярная масса 36 кДа) – ДНК и РНК-связывающий белок, участвующий в различных внутриклеточных процессах [Елисеева и др., 2011]. Этот белок состоит из трех основных доменов: N-домена (1-52 а.о.), центрального эволюционно консервативного домена холодого шока CSD (53-129 а.о.) и протяженного С-домена (131-3а.о.), состоящего из чередующихся положительно и отрицательно заряженных кластеров (по 25-30 а.о. каждый). Этот белок входит в группу природнонеструктурированных белков, которые либо полностью не структурированы, либо содержат большие неструктурированные области. К этой же группе относятся прионные белки, а также развернутый -амилоидный полипептид, отвечающий за болезнь Альцгеймера, и -синуклеин, отвечающий за болезнь Паркинсона и другие болезни старческого слабоумия. Все эти конформационные изменения обусловлены появлением аномальных свойств белков вследствие изменения их пространственной структуры.

Однако для того, чтобы приблизиться к пониманию процесса фибриллогенеза белка YB-1, необходимо выявить параметры протофибрилл, определяющих их функциональное состояние и упаковку в протяженные фибриллы. Кроме того, определение влияния внешних условий на процесс фибриллогенеза даст возможность получать фибриллы с регулируемыми свойствами.

Для исследования кинетики образования фибрилл белка YB-1 в данной работе были использованы методы АСМ и АУ.

Рис. 3. (А) седиментационный профиль белка YB-1 в условиях высокой ионной силы (2 M LiCl). Основной график иллюстрирует распределение седиментационной постоянной, а вложенный график иллюстрирует распределение молекулярной массы. (Б) АСМ изображение мономеров белка YB-1 в условиях высокой ионной силы (2M LiCl). (В) седиментационный профиль белка YB-1 в условиях умеренной ионной силы (150мМ КCl).

Основной график – распределение седиментационной постоянной, а вложенный график – распределение молекулярной массы. (Г) АСМ изображение мономеров белка YB-1 в условиях умеренной ионной силы (150мМ КCl).

Седиментационный анализ свежеприготовленного белка YB-1 в условиях высокой ионной силы 2М LiCl приведен на рисунке 3А. Как видно из рисунка, распределение по константе седиментации и по молекулярной массе унимодально. Вычисляемая величина константы седиментации s составляет, s20w = 2.72 S. Вычисляемая молекулярная масса М составляет 35.3 кДа, что всего лишь на 2% меньше теоретической величины, рассчитанной из первичной последовательности (36 кДа). Константа седиментации равная 2.72 S соответствует глобулярному белку в растворе. Седиментационный анализ белка YB-1 в условиях умеренной ионной силы 150мМ KCl (свежеприготовленный) дает константу седиментации равную 2.80 S, что также соответствует глобулярному белку в растворе (рис. 3 В). Вычисляемая молекулярная масса М при этом равна 36.2 кДа.

То, что свежеприготовленный белок находится в глобулярном состоянии подтверждается полученными АСМ изображениями мономеров белка на подложке (рис. 3 Б, Г). Таким образом, можно утверждать, что на начальном этапе ионные условия не влияют на конформацию белка в растворе. Кроме того, из этого следует, что в растворе неструктурированные N- и C- домены белка располагаются компактно вокруг домена холодового шока.

Рис. 4. (А) седиментационный профиль белка YB-1 после суток инкубации в растворе в условиях высокой ионной силы (2M LiCl). Основной график – распределение седиментационной постоянной, вложенный график – распределение молекулярной массы.

(Б) седиментационный профиль белка YB-1 после трех суток инкубации в растворе в условиях высокой ионной силы (2M LiCl). Основной график – распределение седиментационной постоянной, вложенный график – распределение молекулярной массы.

(В) АСМ изображение фибрилл белка YB-1 после трех суток инкубации в растворе в условиях высокой ионной силы (2M LiCl).

После инкубации белка YB-1 в условиях высокой ионной силы 2 М LiCl в течение суток наблюдалось изменение седиментационного профиля (рис. 4 А).

На рисунке видно второй меньший пик, константа седиментации которого соответствует димеру белка. Через трое суток точное определение константы седиментации становится невозможным, а молекулярная масса отдельных образованных в растворе структур становится 7106 Да, что говорит о прошедшей в растворе процессе полимеризации вещества (рис. 4 Б). При этом структуры, наблюдаемые на АСМ-изображениях, представляют собой протяженные фибриллы, что коррелирует с полученными гидродинамическими данными (рис. 4 В), а также с полученными раннее данными других работ [Селиванова О. М. и др. 2010, Guryanov S. G. et al. 2012].

В условиях умеренной ионной силы в процессе инкубации белок YB-коэффициент седиментации не изменялся, что свидетельствует об отсутствии процесса полимеризации.

Кроме того, во второй части главы 4 приводятся результаты исследования явления полиморфизма (внутриобразцовые варианты) амиллоидогенных белков. Так как полиморфизм в случае амилоидогенных фибрилл является одной из основных причин их устойчивости к разным внешним воздействиям, то в настоящее время этому явлению уделяется особое внимание [Petkova et al., 2005].

Характерный для амилоидогенных фибрилл полиморфизм зависит от способа получения препарата, источника (природный, рекомбинантный, синтетический), от условий приготовления и других параметров, вплоть до получения разных результатов в одних условиях с одним и тем же препаратом в разных лабораториях (или даже в одной лаборатории), что отмечается, например, при исследованиях A-пептида [Fandrich et al., 2011].

Структурные исследования белков, способных к фибриллообразованию, подтверждают, что полиморфизм отражает существование нескольких независимых и конкурирующих путей сборки, приводящих к агрегации. Кроме того, рядом авторов доказано, что полиморфизм также является отражением реальных структурных различий в молекулярной упаковке полипептидных цепей, что ведет к возможности существования нескольких видов протофибрилл и, как следствие, разнообразию сформированных фибрилл.

В данной работе методом АСМ было показано, что инкубация полноразмерного белка YB-1 в 20 мМ Hepes-KOH, pH 7.6, 2 M LiCl приводит к образованию морфологически отличающихся друг от друга фибрилл в одинаковых условиях инкубации.

Для полноразмерного белка YB-1 в условиях высокой ионной силы можно было наблюдать две различные картины. На первой наблюдались длинные тяжи средней длины 6 мкм и высоты 3.6 нм (рис. 5 А). Они имеют тенденцию собираться в пучки. На второй наблюдались тяжи двух типов:

короткие тяжи средней длины 250 нм и высоты 3.5 нм, и короткие тяжи длиной менее 200 нм и средней высоты 7 нм (рис. 5 Б).

Рис. 5. АСМ-изображения фибрилл белка YB-1 в условиях высокой ионной силы 2 M LiCl.

Концентрация белка 3µM.

Процесс олигомеризации и фибриллообразования происходит за счет электростатических, водородных и гидрофобных взаимодействий между молекулами белка с образованием димеров – начальных строительных блоков.

Как было показано выше образование тяжей белком YB-1 происходит через эту стадию (образование димеров). Дальше димеры олигомеризуются в тетрамеры, октамеры и т. д. с образованием протофибрилл шириной 2-3 нм и длиной до 200 нм. Эти образования накапливаются в лаг-фазе, характерной для кинетики фибриллообразования. Окончание лаг-фазы связано с образованием протофибриллами фибрилл диаметром 7-8 нм. Длина фибрилл и особенности их морфологии при этом напрямую зависят от числа структурных протофиламентов. Такой тип реакции существенно отличается от типичных реакций сворачивания глобулярных белков, для которых один «набор» взаимодействий между аминокислотными остатками приводит к существованию одной упорядоченной конечной конформации.

В случае белка YB-1 явление полиморфизма является прямым следствием того факта, что это белок с большой долей неупорядоченности. Известно, что природно-неструктурированные белки не имеют определенной трехмерной структуры при физиологических условиях, а приобретают ее лишь после взаимодействия с различными лигандами [Сердюк, 2007]. Кроме того, «приобретенная» структура часто зависит от вида лиганда, и при этом может сильно меняться. Т.е. можно говорить о своеобразном полиморфизме структур таких белков. Такое структурное разнообразие и своеобразная гибкость определяет многофункциональность таких белков, как и в случае белка YB-1.

Белок YB-1 в условиях высокой ионной силы, и что важно, с длинными неструктурированными областями на концах, образует как длинные, так и короткие тяжи. Отметим, что до сих пор не одним методом не было определено, как происходит взаимодействие мономеров белка. Возможны несколько вариантов, а именно последовательное взаимодействие N- домен к N-домену и C-домен к C-домену или поочередное взаимодействие N-домена с C-доменом. Кроме того возможен вариант при котором формирование димеров и далее тяжей происходит по средствам взаимодействия доменов холодового шока, при этом возможно “оборачивание” неструктурированных участков вокруг образованных структур.

Высокая ионная сила также может являться определяющим фактором для образованных полиморфных структур, поскольку электростатические взаимодействия приводят к значительным отклонениям в поведении системы от идеального, при этом активность белка начинает зависеть как от природы ионов, так и от общего состава раствора. Кроме того, C-концевой домен белковой молекулы представляет собой чередующиеся положительно и отрицательно заряженные кластеры (по 25-30 а.о. каждый).

Таким образом, различие в морфологии фибриллярных структур белка YB-1 обусловлено в значительной мере неупорядоченными областями, а также электростатическими взаимодействия буферного раствора с “заряженной” частью белковой молекулы.

В третьей части главы 4 приведены результаты исследования с помощью АСМ сайт-специфического связывания ДНК с никующей эндонуклеазой (никазой) Nt.BspD6I на уровне одиночных молекул.

Никазы, являющиеся уникальными по своим функциям ферментами, уже нашли применение в ряде биотехнологических методов, таких как изотермическая реакция для амплификации олигонуклеотидов и геномной ДНК. Никаза Nt.BspD6I, имеющая молекулярную массу 70,8 кДа (604 а.о.), была выделена из штамма бактерий Bacillus species D6 [Железная и др., 2001].

Этот белок узнает в двухцепочечной ДНК последовательность 5’-GAGTC/5’GACTC и расщепляет одну цепь, содержащую последовательность GAGTC на расстоянии 4-х нуклеотидов от сайта в сторону 3’-конца [Железная и др., 2009].

Внесение разрыва только в одну цепочку ДНК (никование) играет ключевую роль в таких важных биологических процессах как инициация репликации, рекомбинация и репарация. Пространственная структура никазы Nt.BspD6I была получена с высоким разрешением (1.8 ) [Kachalova et al., 2005].

Молекула представляет собой компактную глобулу с размерами 506080 .

Структура состоит из трех доменов: N-концевого (состоящего из двух субдоменов), линкерного и С-концевого. На основании высокой степени структурного сходства субдоменов никазы с аналогичными доменами эндонуклеазы рестрикции FokI, структура которой определена в комплексе с ДНК, был сделан вывод о том, что именно N-концевой домен никазы является узнающим доменом [Wah et al., 1997]. Ферментативная активность никазы проявляется в присутствии ионов Mg2+ или Ni2+. При замене Mg2+ или Ni2+ на другие катионы никаза сохраняет способность связываться с узнаваемым сайтом, но утрачивает способность расщеплять одну цепь ДНК. Этот факт позволяет использовать никазу в качестве «удобного» объекта для изучения процесса образования ДНК-белкового комплекса, а также его характерных черт, таких как сайт-специфическое узнавание и связывание. Специфическая никующуя активность никазы была хорошо изучена и описана [Юнусова и др., 2006]. Тем не менее не были проведены структурные исследования сайтспецифического связывания никазы Nt.BspD6I с ДНК. С помощью АСМ нами были получены изображения молекул ДНК гена никазы длиной 920 н.п., наработаных с помощью ПЦР и содержащих сайт узнавания никазы, расположенный на расстоянии 600 н.п. от 5' конца ДНК (в 2 мМ NiCl2).

Высота молекул ДНК составила 0.80±0.15 нм. Данная величина отличается от величины диаметра ДНК (около 2 нм). Занижение высоты происходит в результате взаимодействия между наконечником зонда и молекулой, а также между молекулой и поверхностью слюды, что неоднократно отмечено в литературе [Klinov et al., 2003]. Величина средней высоты белка, определенная из построенной гистограммы распределения высот, составила 0.47±0.01 нм. Гистограмма распределения контурных длин цепей ДНК позволила определить среднее значение контурной длины, которая оказалась равной 280±2 нм. Эта величина на 10% меньше значения теоретически рассчитанной для молекулы ДНК длиной 920 н.п. (310 нм). Это может быть объяснено тем, что на типичном поле сканирования одному пикселу соответствует примерно 3 нм длины молекулы ДНК. По этой причине молекула ДНК имеет изгибы, которые не могут быть разрешены на поле сканирования равном 1.51.5 мкм. Кроме того, удалось получить изображения отдельных молекул белка никазы.

При совместной инкубации (5 минут) ДНК с белком происходит их специфическое взаимодействие и образуется ДНК-белковый комплекс. На АСМ-изображениях можно наблюдать цепочки ДНК со связанным белком (рис.

6 А). Однако, несмотря на то, что соотношение между ДНК и белком в данном эксперименте 1:8 (белок в избытке), белок наблюдается не на всех нитях ДНК.

Некоторое количество комплексов, видимо, диссоциируют в результате взаимодействия с поверхностью подложки, и на слюду адсорбировались отдельно молекулы ДНК и белка [Sorel et al., 2006]. Из АСМ-изображений видно, что белок «разделяет» цепь ДНК на два сегмента равных, примерно, 1/и 2/3 длины, что соответствует ожидаемому месту связывания (рис. 6 Б).

Анализ профиля сечения непосредственно по месту связывания дает высоту 1.нм, что соответствует суммарной высоте отдельных молекул двуцепочечной ДНК и белка. Кроме того, высота молекул ДНК рядом с местом связывания соответствует высоте одноцепочечной молекулы ДНК, что согласуется с внесением одноцепочечного разрыва никазой при комлексообразовании (рис. В-Г).

Рис. 6. (А) АСМ-изображение комплекса ДНК с никазой при соотношении 1:8. Стрелками помечены образованные комплексы. Поле сканирования 1.5 1.5 мкм. (Б) увеличенные изображения молекул комплекса. Стрелками отмечено положение белка. Поле сканирования 0.30.3 мкм. (В) Трехмерная проекция молекулы ДНК с белком. Стрелками показаны места сечения. (Г) профиль сечения поперек молекулы с рисунка В. Цифрам соответствуют профили на графике.

Таким образом, подобранные ионные условия, а также соотношение ДНК/белок позволили с высоким разрешением визуализировать образовавшийся после взаимодействия ДНК-белковый комплекс. Проведенное исследование подтвердило тот факт, что никаза специфически связывается с сайтом узнавания на молекуле ДНК и вносит в нее одноцепочечный разрыв, который является характерной особенностью ферментативной активности этого белка. Поскольку до сих пор не удалось получить пригодные для рентгеноструктурного анализа кристаллы комплекса ДНК с никазой, полученные в данной работе результаты являются первым наглядным подтверждением описанного ранее механизма взаимодействия ДНК с никующей эндонуклеазой.

При совместной инкубации (90 минут) ДНК с белком в соотношении 1:в 2 mМ NiCl2 происходит расщепление ДНК на два фрагмента (короткий и длинный). На полученных АСМ-изображениях на концах фрагментов ДНК наблюдались молекулы связанного белка. Построенная гистограмма распределения контурных длин фрагментов ДНК дала длину коротких фрагментов около 100 нм и длину длинных фрагментов около 200 нм.

Суммарная длина средних значений наблюдаемых фрагментов дают общую длину равную 300 нм, что соответствует контурной длине нерасщепленной цепи ДНК (рис. 7).

Рис. 7. (А) АСМ-изображение ДНК-белкового комплекса через 90 минут инкубации при комнатной температуре. Поле сканирования 3.53.5 мкм. Произошло расщепление ДНК на два фрагмента: длинный и короткий. (Б) гистограмма распределения контурных длин цепей ДНК. Средняя контурная длина коротких фрагментов ~ 100 нм, а длинных ~ 200 нм. Над пиками гистограммы показаны АСМ изображения соответствующих нитей ДНК Последующие эксперименты показали, что уже после 30 минут инкубации ДНК-белкового комплекса происходит расщепление ДНК на те же фрагменты. Однако такое разрезание не наблюдается в растворе. Причины такого расхождения пока не ясны и требуют дальнейшего изучения.

В главе 5 формулируются основные методические положения, разработанные в диссертационной работе, для исследования бактериальных клеток и макромолекул методом АСМ. Предлагаются методики приготовления биологических образцов, с помощью которых можно получать равномерно нанесенный слой бактериальных клеток заданной плотности на подложке, а также вытянутые в одном направлении длинные молекулы на подложке, такие как ДНК и амилоидные фибриллы.

Выводы 1. Исследование особенностей ipt-трансформированных бактериальных клеток показало, что:

ipt-трансформация приводит к изменению морфологии поверхности клеток бактерий Rhodobacter sphaeroides т.е. к изменению наружного слоя внешней мембраны, а также практически полной утрате жгутиков у таких клеток.

изменение наружного слоя внешней мембраны, обусловлено изменением структуры и состава ее липополисахаридов 2. При исследовании особенностей белка YB-1 показано, что:

в растворе с высокой ионной силой белок YB-1 образует фибриллы, морфологически отличаются друг от друга свежеприготовленный белок YB-1 находится в глобулярной мономерной форме и ионные условия не влияют на его конформацию в растворе неструктурированные N- и C- домены белка YB-1 располагаются компактно вокруг домена холодового шока структурной единицей инициирующей возникновение протофибрилл является димерная форма белка YB-3. При исследовании сайт-специфического связывания ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I установлено, что:

инкубация раствора ДНК с никазой приводит к связыванию молекулы ДНК с белком, который располагается в ожидаемом месте связывания и «разделяет» цепь ДНК на два фрагмента (равных, примерно, 1/3 и 2/3 длины) высота молекулы ДНК рядом с местом связывания соответствует высоте одноцепочечной молекулы ДНК, что согласуется с особенностью ферментативной активности никазы через 90 минут инкубации раствора ДНК-никазы с белком происходит расщепление ДНК в месте связывания на два фрагмента. Однако, такое разрезание не наблюдается в биохимических экспериментах Список публикаций по теме диссертации 1. Мачулин А.В., Смолыгина Л.Д., Сузина Н.Е., Сердюк О.П. Исследование морфологии клеток дикого типа и ipt-трансформанта фототрофной пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides методами атомно-силовой и электронной микроскопии. Биофизика, 2012. Т57(1):88-92.

2. Мачулин А.В., Дерюшева Е.И., Юнусова А.К., Железная Л.А., Сердюк И.Н.

Исследование сайт-специфического связывания ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I на уровне одиночных молекул методом атомносиловой микроскопии. Биофизика, 2012. Т57(3):432-436.

3. Мачулин А.В., Хечинашвили Н.Н. Исследование кинетики образования фибрилл белка YB-1 с помощью методов атомно-силовой микроскопии и аналитического ультрацентрифугирования. Современные проблемы науки и образования, 2012. № 5, стр. 1-7; URL: www.science-education.ru/105-7164 (дата обращения: 16.10.2012).

4. Сердюк О.П., Смолыгина Л.Д., Мачулин А.В. Атомно-силовая микроскопия в исследованиях морфологии ipt-трансгенных клеток фототрофной пурпурной бактерии Rps. palustris. Сборник тезисов XIX Пущинских чтений по фотосинтезу. (Пущино, 15-19 июня 2009), стр. 5. Мачулин А.В., Сердюк О.П., Смолыгина Л.Д., Сердюк И.Н. Исследование влияния трансформации агробактериальным вектором, несущим ген биосинтеза цитокининов, на фототрофные пурпурные бактерии Rhodobacter sphaeroides.

Сборник тезисов 14-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». (Пущино, 19-23 апреля 2010), стр. 211.

6. Мачулин А.В. Исследование особенностей строения фотосинтетического аппарата Rhodobacter sphaeroides методами сканирующей зондовой и электронной микроскопии. Сборник тезисов I Международной конференции «Современное естествознание: вопросы и ответы». (Санкт-Петербург, 30-августа 2011), стр. 33-38.

7. Мачулин А.В., Дерюшева Е.И., Юнусова А.К. Исследование сайтспецифического связывания ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I методом атомно-силовой микроскопии. Сборник тезисов XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов».

(Москва, 9-13 апреля 2012), стр. 43.

8. Мачулин А.В., Дерюшева Е.И., Юнусова А.К. Визуализация комклекса ДНК с никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I методом атомно-силовой микроскопии.

Сборник тезисов 16-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». (Пущино, 16-21 апреля 2012), стр. 130-131.

9. Сердюк О.П., Санникова Е.П., Смолыгина Л.Д., Иванова Е.П., Мачулин А.В.

Исследование ЛПС и морфологии клеток дикого типа и ipt-трансформанта фототрофной пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides методом атомносиловой микроскопии. Сборник тезисов IV Съезда биофизиков России.

(Нижний Новгород, 20-26 августа 2012 года), стр. 267.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.