WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

ФОМИН АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ

АПОПТОЗ РАКОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, ИНДУЦИРУЕМЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫМ АНАЛОГОМ ЛАКТАПТИНА

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный консультант:

к.б.н. Рихтер Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

Сергиев Пётр Владимирович, д.х.н., Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, химический факультет, доцент Зенкова Марина Аркадьевна, д.б.н., профессор, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, зав. лабораторией

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита состоится « 26 » декабря 2012 г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр-кт ак. Лаврентьева,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан « ___ » ______________ 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в большинстве развитых стран онкологические заболевания занимают второе место среди причин смертности взрослого населения. Поэтому, усовершенствование методов лечения и разработка новых средств терапии онкологических заболеваний является приоритетной задачей биохимии, молекулярной биологии и медицины.

Апоптоз или программируемая клеточная гибель – процесс, необходимый для поддержания численности и функциональности клеток организма в норме, а также для удаления дефектных клеток. Одним из наиболее продуктивных подходов к созданию современных онкотерапевтических средств является разработка новых индукторов и модуляторов апоптоза раковых клеток.

Понимание механизма действия препарата на клеточном уровне позволяет подробно исследовать возможные молекулярные мишени его действия и проводить направленное конструирование молекул с улучшенными свойствами. Кроме того, такие комплексные исследования позволяют прогнозировать чувствительность различных опухолей к определенным лекарственным средствам.

Известно, что молоко человека содержит белки и пептиды, вызывающие апоптоз раковых клеток. Ранее в нашей лаборатории из молока человека был выделен и идентифицирован один из таких пептидов. Было показано, что этот пептид имеет молекулярную массу 8 кДа и является протеолитическим фрагментом -казеина человека. Выделенный из молока человека пептид получил название лактаптин.

Целью настоящей работы являлось получение рекомбинантных аналогов лактаптина и исследование механизма их действия на клетки человека в культуре.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:

- Сконструировать и охарактеризовать рекомбинантные аналоги лактаптина.

- Разработать методы выделения и очистки рекомбинантных аналогов лактаптина.

- Исследовать цитотоксическую активность рекомбинантных аналогов лактаптина по отношению к опухолевым и немалигнизированным клеткам человека в культуре.

- Провести анализ основных биохимических маркеров гибели клеток, индуцируемой рекомбинантными аналогами лактаптина.

- Провести поиск и идентификацию белков, взаимодействующих с рекомбинантными аналогами лактаптина в клетках человека.

- Провести анализ изменения транскриптома клеток человека под действием рекомбинантных аналогов лактаптина методом гибридизации РНК на полнотранскриптомных чипах Illumina.

- На основании полученных экспериментальных данных разработать модель цитотоксического действия рекомбинантных аналогов лактаптина на клетки человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. Созданы генно-инженерные конструкции, с использованием которых получены рекомбинантные аналоги лактаптина. Установлено, что генно-инженерный аналог лактаптина RL2 вызывает гибель раковых клеток человека различного тканевого происхождения в культуре, в том числе клеток аденокарциномы молочной железы человека с ER-положительным и ER-отрицательным статусом, и не оказывает цитотоксического действия на немалигнизированные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани человека. Впервые разработаны методы выделения и очистки рекомбинантного аналога лактаптина RL2, позволяющие получать препараты RL2 для инъекционного применения при проведении доклинических испытаний. Впервые охарактеризован механизм цитотоксического действия рекомбинантного аналога лактаптина RL2 на раковые клетки человека. Показано, что RL2 проникает в клетки, взаимодействует с белками цитоскелета и индуцирует апоптотическую гибель раковых клеток по рецепторному и митохондриальному путям.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы представлены на конференциях: “The EMBO meeting 2010: advancing the life sciences” (Барселона, 2010); “IInd International conference physico-chemical biology” (Новосибирск, 2011); VI Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2011); V Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2012); “Postgenomic Technology for Biomedicine” (Новосибирск, 2012); “Programmed cell death in biology and medicine” (Москва, 2012); 37th FEBS “From Single molecules to Systems Biology” (Севилья, 2012), 20th Euroconference on Apoptosis “From Death to Eternity” (Рим, 2012).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы.

Работа изложена на 133 страницах, содержит 33 рисунка и 8 таблиц.

Библиография содержит 232 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Получение рекомбинантных аналогов лактаптина. Для конструирования рекомбинантных аналогов был проведен анализ аминокислотных последовательностей лактаптина и -казеина человека, и подобраны последовательности фрагментов -казеина RL1 и RL2 (Рис. 1). В структуру выбранных фрагментов были введены дополнительные последовательности, содержащие 6 а.о. гистидина, позволяющие эффективно выделять данные фрагменты из лизатов клеток-продуцентов аффинной продуцентов аффинной хроматографией на металл-хелатирующих сорбентах.

Рис. 1. Схема структур генно-инженерных аналогов лактаптина. Серым инженерных аналогов лактаптина. Серым прямоугольником обозначена последовательность -казеина человека (1казеина человека (1аминокислотных остатка), выделением указаны фрагменты, соответствующие аминокислотных остатка), выделением указаны фрагменты, соответствующие лактаптину и его генно-инженерным аналогам RL1 и RL2. LP– последовательность последовательность лидерного пептида -казеина.

Для конструирования фрагментов ДНК, кодирующих Для конструирования фрагментов ДНК, кодирующих последовательности RL1 и RL2, был проведен анализ нуклеотидной 2, был проведен анализ нуклеотидной последовательности гена -казеина человека с использованием базы данных казеина человека с использованием базы данных GenBank. Нуклеотидная последовательность, соответствующая фрагменту. Нуклеотидная последовательность, соответствующая фрагменту RL1, находится в 3-ем экзоне, а последовательность, соответствующая ем экзоне, а последовательность, соответств фрагменту RL2 во 2-ом и 3-ем экзонах гена -казеина. С учетом того, что казеина. С учетом того, что нуклеотидов последовательности RL2 находятся во 2-ом экзоне гена ом экзоне гена казеина, был выбран олигонуклеотидный праймер, включающий данную был выбран олигонуклеотидный праймер, включающий данную нуклеотидную последовательность на 3’-конце. Получение фрагментов ДНК,. Получение фрагментов ДНК, кодирующих рекомбинантные аналоги лактаптина RL1 и RL2, проводили 1 и методом ПЦР геномной ДНК плаценты человека. Конструирование методом ПЦР геномной ДНК плаценты человека. Конструирование плазмидных ДНК, обеспечивающих экспрессию рекомбинантных аналогов плазмидных ДНК, обеспечивающих экспрессию рекомбинантных аналогов лактаптина, проводили рестриктазно-лигазным методом на основе векторной игазным методом на основе векторной плазмиды pGSDI под промотором РНК-полимеразы фага Т7. Встройку полимеразы фага Т7. Встройку фрагментов ДНК, кодирующих RL1 и RL2, в плазмиду pGSDI GSDI проводили по сайтам эндонуклеаз рестрикции SalI и BglII. Клонирование векторных II. Клонирование векторных плазмид проводили в клетках E.coli XL-Blue. Правильность встройки. Правильность встройки фрагментов ДНК, кодирующих RL1 и RL2, в рекомбинантные конструкции 2, в рекомбинантные конструкци подтверждали секвенированием ДНК методом Сэнгера. По результатам подтверждали секвенированием ДНК методом Сэнгера. По результатам секвенирования были выбраны плазмидные рекомбинантные ДНК, секвенирования были выбраны плазмидные рекомбинантные ДНК, содержащие правильную структуру фрагментов RL1 и RL2 гена белка RL казеина человека. Штаммы-продуценты рекомбинантных аналогов продуценты рекомбинантных аналогов лактаптина создавали на основе клеток E.coli BL21(DE3) методом CaCl23) методом зависимой трансформации компетентных клеток.

Таким образом, были сконструированы рекомбинантные плазмиды, Таким образом, были сконструированы рекомбинантные плазмиды, содержащие последовательности ДНК фрагментов гена -казеина человека казеина человека RL1 и RL2, соответственно, и получены штаммы-продуценты геннопродуценты генно инженерных аналогов лактаптина.

Выделение и характеризация рекомбинантных аналогов лактаптина. Рекомбинантные аналоги лактаптина выделяли из лизатов клеток-продуцентов E.coli аффинной хроматографией на Ni-NTA-агарозе.

Для очистки аналогов от неспецифически сорбирующихся на Ni-NTAагарозу белков E.coli проводили предварительную элюцию буфером, содержащим 50 мМ имидазола (Рис. 2, a), что позволяло получить белковые препараты с содержанием рекомбинантных аналогов >95% (Рис. 2, б).

Рис. 2. а. Хроматограмма лизата клеток E. coli - продуцента RL2 на Ni-NTA агарозе. Хроматографические фракции: А – белки, не взаимодействующие с сорбентом; B – белки, элюируемые буфером, содержащим 50 мМ имидазола; C – белки, элюируемые буфером, содержащим 250 мМ имидазола; D – белки, элюируемые буфером, содержащим 6 М гуанидин-HCl. б. Электрофоретическое разделение белков хроматографических фракций (Рис. 2, а) в 12% SDS-ПААГ.

Дорожки: 1 - белки лизата клеток E.coli; 2 – белки фракции А; 3 - белки фракции В; – белки фракции С; 5 и 7 - белки, элюируемые буфером, содержащим 6 М гуанидинHCl (в присутствии 1% 2-меркаптоэтанола и в невосстанавливающих условиях, соответственно); 6 – рекомбинантный аналог лактаптина RL1; 8 – набор белков с известными молекулярными массами.

При подборе условий выделения аналогов из лизатов клетокпродуцентов было установлено, что при концентрации имидазола в элюенте 250 мМ происходит полная десорбция аналога RL1 с Ni-NTA-агарозы. После нанесения на Ni-NTA-агарозу лизата E.coli - продуцента аналога RL2, элюция буфером, содержащим 250 мМ имидазола, приводила к десорбции лишь 10 - 15% RL2 (Рис. 2, a). Количественной элюции аналога RLудавалось достичь только с использованием хаотропных агентов (6 М гуанидин-HCl). Принимая во внимание тот факт, что оба аналога содержат идентичные С-концевые 6-His-последовательности, обеспечивающие высокое сродство к Ni-хелатным сорбентам, можно предположить, что повышенное сродство RL2 к сорбенту по сравнению с RL1 обусловлено сочетанием низкой растворимости этого белка в буфере с физиологической ионной силой (при pH>6,5) и его способности образовывать олигомерные формы.

Анализ белковых препаратов рекомбинантных аналогов лактаптина SDS электрофорезом в ПААГ показал, что RL1 представлен одним полипептидом с молекулярной массой 8.9 кДа (Рис. 2, б, дорожка 6), что соответствует массе рассчитанной теоретически.

Препараты RL2 в отсутствие 2-меркаптоэтанола содержали две формы белка с массами 14 и 28 кДа в соотношении ~ 30:70%, соответственно (Рис.

2, б, дорожка 7). В восстанавливающих условиях (1% 2-меркаптоэтанола) происходила полная диссоциация формы с массой 28 кДа с образованием формы с массой 14 кДа (Рис. 2, б, дорожка 5). Эти данные показывают, что RL2 продуцируется клетками E.coli в форме ковалентного гомодимера, субъединицы которого образуют межмолекулярные дисульфидные связи.

В структуре генно-инженерных аналогов лактаптина RL1 и RLсодержится 8 (RL1) и 13 (RL2) потенциальных сайтов расщепления трипсином. При исчерпывающем трипсинолизе RL1 и RL2 может образовываться, соответственно, 9 и 14 пептидов, из которых 8 (RL1) и (RL2) пептидов имеют молекулярные массы более 500 Да и могут быть идентифицированы MALDI-TOF масс-спектрометрией. При проведении масс-спектрометрического анализа фрагментов трипсинолиза RL1 и RLбыло идентифицировано 6 и 8 пептидов, соответственно (Табл. 1). Из данных представленных в таблице 1 видно, что пептиды, полученные при исчерпывающем трипсинолизе RL1 и RL2, обеспечивают практически полное покрытие структур аналогов. Из этого следует, что первичные структуры полученных рекомбинантных аналогов лактаптина RL1 и RLсоответствуют клонированным нуклеотидным последовательностям казеина человека.

Таблица 1. Пептиды, идентифицированные MALDI-TOF массспектрометрией в составе рекомбинантных аналогов лактаптина RL1 и RL2.

масса аминокислотная последовательность Позиция Позиция пептида, Да пептида в в структуре структуре RL1 RL1860,8 QPACHENDERPFYQK 4 – 2919,4 TAPYVPMYYVPNSYPYYGTNLYQR 19 – 1479,8 RPAIAINNPYVPR 1 – 13 43 – 2080,1 TYYANPAVVRPHAQIPQR 14 – 31 56 – 1506,8 QYLPNSHPPTVVR 32 – 44 74 – 1585,9 RPNLHPSFIAIPPK 45 – 58 87 – 11714,0 RPNLHPSFIAIPPKK 45 – 59 87 – 11691,8 IIIPTIGGSHHHHHH 64 – 78 106 – 1Таким образом, масс-спектрометрический анализ фрагментов трипсинолиза рекомбинантных аналогов лактаптина RL1 и RL2 показал, что их первичная структура соответствует структуре генно-иженерных конструкций (Рис. 1).

Сравнительный анализ цитотоксического действия RL1 и RL2 на клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. Сравнение цитотоксического действия рекомбинантных аналогов лактаптина RL1 и RLпроводили на культуре клеток MCF-7, поскольку именно эти клетки проявляли чувствительность к цитотоксическому действию лактаптина из молока человека. Клетки инкубировали с RL1 и RL2 в различных концентрациях в течение 72 ч, и оценивали изменение их жизнеспособности относительно контрольных, не обработанных клеток с использованием MTTтеста. Было обнаружено, что короткий аналог лактаптина RL1 вызывал слабое подавление жизнеспособности клеток MCF-7 (7 – 10%), в то время как инкубация MCF-7 с RL2 в концентрациях 30 – 60 мкг/мл приводила к снижению жизнеспособности клеток на 62% (Рис. 3).

1Рис. 3. Изменение RLжизнеспособности клеток MCF-7 при RLинкубации с RL1 и RL2 в различных концентрациях в течение 72 ч; за 100% принята жизнеспособность клеток, инкубированных в отсутствие аналогов.

0 7 30 Концентрация, мкг/мл Снижение жизнеспособности клеток MCF-7 под действием RLсопровождалось морфологическими изменениями, характерными для апоптоза: откреплением от пластиковой подложки и конденсацией цитоплазмы и ядер (первичные данные не приведены). Поскольку в состав RL2 входит фрагмент -казеина с 23 по 66 а.о., отсутствующий в RL1, можно заключить, что этот фрагмент, важный для формирования мультимерных форм белка, необходим также для проявления цитотоксического действия этого белка на клетки.

Так как рекомбинантный аналог RL1 не оказывал существенного влияния на жизнеспособность клеток MCF-7, в дальнейших экспериментах мы использовали только аналог RL2.

Цитотоксическое действие RL2 на клетки человека различного тканевого происхождения. Сравнительный анализ чувствительности опухолевых клеток к действию RL2 проводили на клетках аденокарциномы молочной железы MCF-7, карциномы легкого А549 и карциномы гортани Hep-2 человека с использованием MTT-теста. Установлено, что M T T и н декс, % жизнеспособность клеток А549 через 72 ч инкубации с RL2 снижалась на 45%, а клеток Hep-2 - на 30% (Рис. 4). Жизнеспособность мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека MSC при инкубации с RL2 не отличалась от жизнеспособности необработанных клеток.

1MCF-Рис. 4. Изменение жизнеспособности клеток MCF-7, A5A549, Hep-2 и MSC, инкубированных Hep-2 c RL2 в течение 72 ч; за 100% 20 принята жизнеспособность клеток, MSC инкубированных в отсутствие аналогов.

0 7 30 Концентрация RL2, мкг/мл Снижение жизнеспособности клеток А549 и Hep-2 не сопровождалось морфологическими изменениями, характерными для апоптоза, фрагментации ядерной ДНК этих клеток не происходило даже при длительной инкубации с RL2 (5 суток; первичные данные не приведены).

Таким образом, было установлено, что чувствительность клеток к цитотоксическому действию аналога лактаптина RL2 убывает в ряду MCF7A549>Hep-2>>MSC. При этом снижение жизнеспособности происходило только у раковых линий клеток, немалигнизированные стволовые клетки человека оказались практически не чувствительны к действию этого белка.

Полученные результаты позволяют рассматривать рекомбинантный аналог лактаптина RL2 в качестве основы для создания противоопухолевого препарата.

Очистка рекомбинантного аналога лактаптина RL2. Выделение рекомбинантных белков из лизатов клеток E.coli аффинной хроматографией на металл-хелатных сорбентах в ряде случаев позволяет получить субстанцию, обогащенную по целевому белку и содержащую менее 10% примесей белков клеток-продуцентов. При этом целевая субстанция может также содержать примеси не белковой природы, например, ДНК бактерий и компоненты их клеточной стенки, в том числе липополисахариды (ЛПС), определяемые LAL тестом. Дополнительные стадии очистки позволяют уменьшить содержание ЛПС в субстанции RL2.

Фракция RL2, полученная аффинной хроматографией на Ni-NTAагарозе (Рис. 2, а, фракция D) содержала ~ 300 ЕЭ на 1 мг RL2. Очистку RLот примесей ЛПС проводили с помощью 2-х хроматографических стадий, включающих анионообменную хроматографию на Q-сефарозе и катионообменную хроматографию на SP-сефарозе.

На стадии анионообменной хроматографии RL2 не связывался с M T T и н декс, % сорбентом и элюировался при нанесении. Часть примесей связывалась с Часть примесей связывалась с сорбентом и десорбировалась на этапе промывки буферным раствором, сорбентом и десорбировалась на этапе промывки буферным раствором, содержащим 0,5 М NaCl, в результате чего количество ЛПС в целевой, в результате чего количество ЛПС в целевой фракции с RL2 составило ~10 ЕЭ на мг белка.

В процессе дальнейшей очистки на SP-сефарозе RL2 полностью сефарозе связывался с сорбентом. Элюцию эндотоксинов проводили раствором А, связывался с сорбентом. Элюцию эндотоксинов проводили раствором А, содержащим 0,5 М NaCl при нейтральном pH, а элюцию RL2 – буферным RL раствором Б (pH 4.5), содержащим 0,5 М NaCl и 3 М мочевину. После и 3 М мочевину. После обессоливания диализом фракции RL2, элюируемой буфером Б, содержание 2, элюируемой буфером Б, содержание ЛПС в элюате составило ~1 ЕЭ/мг.

Рис. 5. а. ВЭЖХ RL2 на ВЭЖХ обращенно-фазовом сорбенте С-18, фазовом сорбенте С пик 2 соответствует пик 2 соответствует RL2; б.

Электрофоретический анализ Электрофоретический анализ RL2 в ПААГ с 0,1% SDS. Дорожки: 1 – SDS выявление RL2 методом Вестерн2 методом Вестерн блоттинга с моноклональными блоттинга с моноклональными антителами; 2 – окраска геля – раствором кумасси G-250, 3 – окраска G геля ионами серебра, геля ионами серебра, 4 – набор белков с известными молекулярными с известными молекулярными массами (окраска ионами серебра).

массами (окраска ионами серебра).

Анализ оптического профиля ВЭЖХ при длине волны 220 нм показал, при длине волны 220 нм показал, что фракция RL2 содержит два основных пика (Рис. 5, а). При этом относительная площадь пика 2, соответствующего RL2, составила не менее 2, составила не менее 97%. Из данных рисунка 5, б видно, что анализируемый препарат, б видно, что анализируемый препарат очищенного RL2 содержит примеси с большей электрофоретической 2 содержит примеси с большей электрофоретической подвижностью. Данные примеси являются продуктами деградац подвижностью. Данные примеси являются продуктами деградации молекулы RL2, т.к. содержат антигенную детерминанту и детектируются 2, т.к. содержат антигенную детерминанту и детектируются специфическими моноклональными антителами.

Таким образом, после 2-х стадий очистки ионообменной х стадий очистки ионообменной хроматографией получен препарат RL2 с чистотой не менее 97% и 2 с чистотой не менее 97% и содержанием ЛПС ~1 ЕЭ на 1 мг белка.

Согласно требованиям государственной фармакопеи Согласно требованиям государственной фармакопеи XII (ГФ XII, ОФС 42-0062-07) при проведении доклинических испытаний не допуска доклинических испытаний не допускается использование инъекционных препаратов с чистотой менее 95% и чистотой менее 95% содержанием бактериальных эндотоксинов более 10 ЕЭ на содержанием бактериальных эндотоксинов более 10 ЕЭ на дозу. Методы выделения и очистки RL2, предложенные в данной работе, позволяют 2, предложенные в данной работе, позволяют получать субстанцию RL2 с чистотой, удовлетворяющей требованиям ГФ удовлетворяющей требованиям ГФ XII для инъекционных препаратов, и в количествах, достаточных для достаточных для проведения доклинических испытаний. Кроме того данная субстанция го данная субстанция стабильна при хранении в стерильной упаковке при температуре от +2 до стабильна при хранении в стерильной упаковке при температуре от +2 до +8оС не менее 5 мес.

Таким образом, разработаны методы выделения и очистки рекомбинантного аналога лактаптина RL2, позволяющие получать препараты RL2 для инъекционного применения при проведении доклинических испытаний.

Анализ цитотоксического действия инъекционого препарата RLна клетках MCF-7, MDA-MB-231 и MSC в культуре. Анализ цитотоксического действия инъекционного препарата RL2 проводили с использованием культур клеток аденокарцином молочной железы человека MCF-7, MDA-MB-231 и немалигнизированных стволовых клеток жировой ткани MSC. Культуры клеток MCF-7 и MDA-MB-231 характеризуются различным уровнем экспрессии рецептора эстрогенов (ER): клетки MCF-являются ER-положительными, а MDA-MB-231 ER-отрицательными.

Для анализа влияния инъекционного препарата на жизнеспособность клеток в культуре клетки MCF-7, MDA-MB-231 и MSC инкубировали с очищенным препаратом RL2 (0.1 - 0.4 мг/мл) в течение 2-х периодов удвоения клеточных популяций. Для клеток MCF-7 и MDA-MB-231 период удвоения популяции составляет ~24 ч, а для клеток MSC ~56 ч.

Жизнеспособность клеток, обработанных RL2, определяли относительно контрольных не обработанных клеток с использованием MTT-теста. Из данных, представленных на рисунке 6, видно, что повышение концентрации RL2 в культуральной среде клеток MCF-7 и MDA-MB-231 приводит к снижению их жизнеспособности. При этом жизнеспособность MCF-7 и MDA-MB-231, инкубированных с RL2, снижается на 50% при концентрации RL2 в среде менее 0,3 мг/мл. Жизнеспособность клеток MSC при инкубации с RL2 в течение 110 ч не снижается относительно жизнеспособности не обработанных RL2 контрольных клеток (Рис. 6).

11Рис. 6. Изменение жизнеспособности клеток MCF-7, MCF-MDA-MB-231 и MSC, MDA-MB 2инкубированных с различными MSC концентрациями RL2 в течение 48, и 112 ч, соответственно; за 100% принята жизнеспособность клеток, инкубированных в отсутствие 0 0.1 0.2 0.25 0.3 0.аналога.

Концентрация RL2, мг/мл ИК50 (ИК50 – концентрация препарата, вызывающая торможение роста клеток на 50%) RL2, рассчитанная по кривой зависимости роста культуры от концентрации RL2 в среде, для клеток MCF-7 составила 0,24 мг/мл, а для MTT индекс, % клеток MDA-MB-231 – 0,25 мг/мл. Из полученных данных следует, что 0,25 мг/мл. Из полученных данных следует, что клетки MCF-7 с ER-положительным статусом и клетки MDA-MB-231 с ERMDA отрицательным статусом проявляют практически одинаковую отрицательным статусом проявляют практически одинаковую чувствительность к цитотоксическому действию RL2.

Таким образом, полученные результаты позволяют рассматривать ьтаты позволяют рассматривать RLкак основу противоопухолевого лекарственного средства для терапии как как основу противоопухолевого лекарственного средства для терапии как ER-положительных, так и ER-отрицательных злокачественных отрицательных злокачественных новообразований молочной железы.

Анализ транслокации фосфатидилсерина на внешнюю транслокации фосфатидилсерина на внешнюю поверхность плазматической мембраны клеток MCF-7. Одним из лазматической мембраны клеток MCF наиболее характерных изменений плазматической мембраны клетки при наиболее характерных изменений плазматической мембраны клетки при апоптозе является экспозиция полярной части фосфатидилсерина (PS) с апоптозе является экспозиция полярной части фосфатидилсерина (PS) с внутренней стороны липидного бислоя на внешнюю сторону.

ного бислоя на внешнюю сторону.

В настоящее время наиболее доказательные методы выявления иболее доказательные методы выявления апоптотических клеток основаны на дифференциальном окрашивании апоптотических клеток основаны на дифференциальном окрашивании цитоплазматической мембраны флуоресцентно-меченым белком аннексином меченым белком аннексином V, который аффинно связывается с полярной частью PS. При этом, который аффинно связывается с полярной частью PS. При этом апоптотические клетки остаются непроницаемыми для йодида пропидия ( аются непроницаемыми для йодида пропидия (PI), окрашивающего клеточные нуклеиновые кислоты.

Рис. 7. Диаграммы распределения клеток MCF распределения клеток MCF-7 по интенсивности окраски FITC интенсивности окраски FITCмеченым аннексином V ( меченым аннексином V (FITC) и йодидом пропидия ( йодидом пропидия (PI); a – клетки MCF-7, инкубированные с RL2 в 7, инкубированные с RL2 в течение 24 ч, б – клетки MCF-7, не клетки обработанные RL2; Q1 и Q2 – 2;

популяции жизнеспособных и популяции жизнеспособных и апоптотических клеток, апоптотических клеток, соответственно.

Для того, чтобы оценить изменения плазматической мембраны клеток Для того, чтобы оценить изменения плазматической мембраны клето MCF-7 под действием RL2, клетки окрашивали индикаторами FITC2, клетки окрашивали индикаторами аннексин V/PI и анализировали проточной цитофлуориметрией. Изменение и анализировали проточной цитофлуориметрией. Изменение уровня транслокации PS на внешнюю поверхность плазматической на внешнюю поверхность плазматической мембраны в клетках, обработанных RL2, определяли относительно базового 2, определяли относительно базового уровня в не обработанных контрольных клетках. Из данных рисунка 7, а уровня в не обработанных контрольных клетках. Из данных рисунка 7, а видно, что при инкубации клеток MCF-7 в присутствии RL2 в течение 24 ч 2 в течение 24 ч доля апоптотических клеток составила ~83% (квадрант доля апоптотических клеток составила ~83% (квадрант Q2), а жизнеспособных ~16% (квадрант Q1). В то же время, в культуре 1). В то же время, в культуре контрольных клеток MCF-7 доля популяции Q2 составила ~25%, а Q1 - ~73% 2 составила ~25%, а (Рис. 7, б). Следовательно, инкубация клеток с RL2 ведет к увеличению доли 2 ведет к увеличению доли апоптотической популяции с 25 до 83%. При этом снижение апоптотической популяции с 25 до 83%. При этом снижение жизнеспособности клеток под действием RL2 сопровождалось ти клеток под действием RL2 сопровождалось морфологическими изменениями, характерными для апоптоза клеток в морфологическими изменениями, характерными для апоптоза клеток в культуре: откреплением от пластиковой подложки, конденсацией культуре: откреплением от пластиковой подложки, конденсацией цитоплазмы и ядер (первичные данные не представлены).

Таким образом, было установлено, что рекомбинантный аналог Таким образом, было установлено, что рекомбинантный аналог лактаптина RL2 вызывает транслокацию PS на поверхность плазматической на поверхность плазматической мембраны MCF-7, что является одним из признаков индукции 7, что является одним из признаков индукции апоптотической гибели клетки.

Анализ изменения трансмембранного потенциала митохондрий иала митохондрий клеток MCF-7 под действием RL2. Для анализа изменения m Для анализа изменения митохондрий клеток MCF-7, происходящего под действием RL2, были 7, происходящего под действием RL2, были использованы флуорофоры DiOC6 и JC-1. Эти флуорофоры проникают в 1. Эти флуорофоры проникают в жизнеспособные клетки и накапливаются в активных мит жизнеспособные клетки и накапливаются в активных митохондриях. При этом DiOC6 флуоресцирует в зеленой области спектра, а JC-1 способен а флуоресцировать в двух областях спектра в зависимости от его локальной зависимости от его локальной концентрации: при концентрациях JC-1, достигаемых в активных 1, достигаемых в активных митохондриях, его молекулы агрегируют, образуя олигомерные структуры, митохондриях, его молекулы агрегируют, образуя олигомерные структуры, флуоресцирующие в красной области спектра (590 нм). При низкой флуоресцирующие в красной области спектра (590 нм). При низкой локальной концентрации JC-1 происходит разрушение агрегатов красителя, 1 происходит разрушение агрегатов красителя, что приводит к сдвигу максимума спектра флуоресценции в зеленую область симума спектра флуоресценции в зеленую область (525 нм).

Из данных, представленных на рисунке 8, а, видно, что после Из данных, представленных на рисунке 8, а, видно, что после инкубации клеток с RL2 происходит смещение максимума распределения 2 происходит смещение максимума распределения клеток по интенсивности флуоресценции красителя DiOC6 в сторону DiOC меньших интенсивностей (Рис. 8, а, кривая 2). В клетках, окрашенных JC-1,, а, кривая 2). В клетках, окрашенных происходит накопление популяции клеток с пониженной флуоресценцией в происходит накопление популяции клеток с пониженной флуоресценцией в красной области спектра (Рис. 8, б, кривая 2).

Риc. 8. Распределение клеток MCF-7, Распределение клеток не обработанных RL2 (пик 1), и после 2 ( ч инкубации с RL2 (пик 2) по RL интенсивности флуоресценции интенсивности флуоресценции митохондриальных красителей митохондриальных красителей DiOC6 (a) и JC-1 (б).

Следовательно, оба флуорохромных индикатора дают возможность флуорохромных индикатора дают возможность наблюдать уменьшение числа клеток с активными митохондриями в митохондриями в образцах, инкубированных с RL2. Эти данные позволяют сделать вывод, что 2. Эти данные позволяют сделать вывод, что апоптоз MCF-7, индуцируемый RL2, сопровождается диссипацией 2, сопровождается диссипацией трансмембранного потенциала митохондрий. Известно, что диссипация митохондрий. Известно, что диссипация трансмембранного потенциала митохондрий может являться индикатором нного потенциала митохондрий может являться индикатором нарушения проницаемости внутренней ММ. Поэтому представленные нарушения проницаемости внутренней ММ. Поэтому представленные данные позволяют предположить, что действие RL2 на клетки MCF-2 на клетки приводит к нарушению проницаемости внутренней ММ и активации приводит к нарушению проницаемости внутренней ММ и активации апоптотического каскада по митохондриальному пути.

Анализ активации инициаторных каспаз в клетках MCF Анализ активации инициаторных каспаз в клетках MCF-7 под действием RL2. Для оценки вклада инициаторных каспаз в процесс гибели Для оценки вклада инициаторных каспаз в процесс клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 под действием 7 под действием RL2 был проведен анализ накопления активных форм каспаз-8 и -9 методом 2 был проведен анализ накопления активных форм каспаз Вестерн-блоттинга с антителами к этим каспазам (Рис. 9).

Рис. 9. Изменение уровня Изменение уровня инициаторных каспаз в клетках инициаторных каспаз в клетках MCF7, инкубированных с RL2 12, 24, 48 и 7, инкубированных с RL2 12, 24, 48 и 72 часа. Вестерн 72 часа. Вестерн-блот: а – прокаспазы-8 и -9 в клетках, 8 и инкубированных с RL2 (образцы 12 – инкубированных с RL2 (образцы 72), и в контрольных клетках (К);

72), и в контрольных клетках (К); б – активные формы каспаз активные формы каспаз-8 и -9 в клетках, инкубированных с RLклетках, инкубированных с RL(образцы 12 – 72), и в контрольных 72), и в контрольных клетках (К); в – относительные – интенсивности иммуноокраски интенсивности иммуноокраски белковых полос Вестерн белковых полос Вестерн-блота, соответствующих активным формам соответствующих активным формам каспаз -8 и -9, определенные с 9, определенные с помощью программы GelPro 5.0.

ью программы GelPro 5.0.

Из данных рисунка 9 видно, что уже через 12 ч после добавления RLвидно, что уже через 12 ч после добавления RL(0,1 мг/мл) к клеткам MCF-7 происходит заметное накопление активных 7 происходит заметное накопление активных форм как каспазы-8, так и каспазы-9. Количество активных форм 9. Количество активных форм инициаторных каспаз-8 и -9 синхронно возрастает с увеличением времени 9 синхронно возрастает с увеличением времени инкубации клеток с аналогом. Синхронность изменения уровня активации инкубации клеток с аналогом. Синхронность изменения уровня активации каспаз-8 и -9 (Рис. 9) указывает на эквивалентность вкладов апоптотических ) указывает на эквивалентность вкладов апоптотических путей, опосредованных этими каспазами, в процесс гибели клеток MCF-бели клеток под действием RL2.

Так как RL2 вызывает апоптотические изменения клеток, в которые в Так как RL2 вызывает апоптотические изменения клеток, в которые в равной степени вовлечены каспаза-8 и каспаза-9, можно также заключить, 9, можно также заключить, что в апоптозе клеток MCF-7 участвуют активаторные элементы как 7 участвуют активаторные элементы как рецептор-опосредованного сигнального каскада, так и митохондриальные так и митохондриальные факторы.

Анализ активации эффекторных каспаз, ДНКазы DFF40 и Анализ активации эффекторных каспаз, ДНКазы DFF40 и олигонуклеосомной фрагментации ДНК клеток MCF-7 под действием 7 под действием RL2. Известно, что в клетках MCF-7 существует делеция 50-ти п.н. в III-м 7 существует делеция экзоне гена каспазы-3. В результате делеции в клетках MCF-7 отсутствует MCF ключевой фермент апоптотического каскада - каспаза-3. Однако известно, 3. Однако известно, что в этих клетках функции каспазы-3 выполняет капаза-7.

Уровень активации каспазы-7 в клетках MCF-7, инкубированных с 7, инкубированных с RL2, определяли методом Вестерн-блот анализа с использованием специфических моноклональных антител. Из данных рисунка 10, а видно, что после 48 ч инкубации клеток MCF-7 с RL2 (0,1 мг/мл) происходит специфический гидролиз прокаспазы-7 с образованием неактивной формы p20-p11 и ее последующее расщепление, приводящее к появлению большой субъединицы p20.

а б в Рис. 10. а – Анализ активации прокаспазы-7 в клетках MCF-7, инкубированных с RL2, методом Вестерн-блоттинга. Дорожки: 1 – набор белков с известными молекулярными массами, 2 – клетки MCF-7, не обработанные RL2, 3 – клетки MCF-7, инкубированные с RL2 (0,1 мг/мл) в течение 48 ч; б – Анализ протеолитического расщепления нуклеазы DFF45 в клетках MCF-7, инкубированных с RL2, методом Вестерн-блоттинга. Дорожки: 1 – набор белков с известными молекулярными массами, 2 – клетки MCF-7, не обработанные RL2, 3 – клетки MCF-7, инкубированные с RL2 в течение 48 ч; в – Электрофоретический анализ продуктов олигонуклеосомной фрагментации ДНК клеток MCF-7 в 1,5% агарозном геле.

Дорожки: 1 – набор фрагментов ДНК с известными молекулярными массами, 2 и 4 – геномная ДНК клеток MCF-7, не обработанных RL2, 3 и 5 - геномная ДНК клеток MCF-7, инкубированных с RL2 48 и 120 ч, соответственно.

Для определения уровня активации ДНКазы DFF40 был проведен Вестерн-блот анализ фрагментов протеолитической деградации ее ингибитора DFF45 с использованием специфических моноклональных антител. Из данных рисунка 10, б видно, что инкубация клеток MCF-7 с RLв течение 48 ч не приводит к специфичному протеолизу DFF45, и, следовательно, к активации DFF40.

Анализ олигонуклеосомной фрагментации ДНК клеток MCF-7 под действием RL2 проводили методом электрофоретического разделения геномной ДНК в агарозном геле (Рис. 10, в). Появление олигонуклеосомных фрагментов ДНК наблюдалось лишь через 120 ч инкубации клеток MCF-7 с RL2 (0,1 мг/мл).

Из полученных данных следует, что при действии рекомбинантного аналога лактаптина RL2 на клетки MCF-7 происходит индукция апоптотической гибели клеток, сопровождающаяся активацией инициаторных каспаз-8 и -9 и эффекторной каспазы-7. При этом олигонуклеосомная фрагментация ДНК наблюдается лишь на поздних стадиях апоптоза клеток MCF-7.

Анализ проникновения и локализации RL2 в клетках человека.

Проникновение и локализацию RL2 в клетках исследовали методом флуоресцентной микроскопии на культурах клеток MCF-7 и MSC. Для этого было синтезировано производное RL2 c ковалентно присоединенным красителем 5(6)- карбокситетраметилродамином (RL2-Rh). Клетки, растущие в лунках 96-луночного планшета, обрабатывали конъюгатом RL2-Rh (0,мг/мл) и анализировали распределение конъюгата в клетках на приборе IN CELL (GE Healthcare). Ядра клеток окрашивали DAPI.

Рис. 11. Распределение конъюгата RL2-Rh в клетках MCF-7 и MSC.

Фотография флуоресцентных препаратов клеток MCF-7 и MSC, обработанных конъюгатом RL2-Rh;

стрелками отмечены области локализации родаминового конъюгата RL2 в клетках. Окраска ядер - DAPI.

Из данных рисунка 11 видно, что конъюгат RL2 с карбокситетраметилродамином проникает и накапливается в цитоплазме как раковых клеток MCF-7, так и немалигнизированных клеток MSC. При этом флуоресценция клеток, окрашенных RL2-Rh, характеризуется максимальной интенсивностью на границе цитоплазмы и плазматической мембраны (Рис.

11). Распределение интенсивности флуоресценции в клетках MSC, окрашенных RL2-Rh, сходно с распределением интенсивности флуоресценции стресс-фибриллярных структур (Рис. 11, MSC). Похожее распределение интенсивности флуоресценции наблюдают при анализе актинового цитоскелета различных клеток, например, остеобластов.

Таким образом, RL2 проникает как в раковые клетки MCF-7, так и в немалигнизированные клетки MSC и распределяется в обоих типах клеток сходным образом, что указывает на то, что противоопухолевая активность RL2 не связана со способностью избирательно проникать в раковые клетки.

При этом механизм проникновения RL2 в клетки остается не выясненным.

Выделение и идентификация белков, взаимодействующих с RL2.

Определение белков-партнеров рекомбинантного аналога лактаптина RLпроводили методом аффинной хроматографии лизатов клеток MCF-7 с последующим масс-спектрометрическим анализом трипсинолизатов белков.

Для выявления белков, взаимодействующих с RL2, хроматографию проводили на сорбенте с иммобилизованным RL2. Для исключения белков, не специфически взаимодействующих с сорбентом, проводили хроматографию лизата клеток MCF-7 на сорбенте, не модифицированном RL2.

Для сохранения нативной укладки белков клетки MCF-7 лизировали в MCF буферном растворе с физиологической ионной силой и pH. Известно, что pH электростатические белок-белковые взаимодействия ослабевают при белковые взаимодействия ослабевают при повышении ионной силы раствора. Поэтому, элюцию белков, связавшихся с повышении ионной силы раствора. Поэтому, элюцию белков, связавшихся с сорбентом, проводили в изократическом режиме в буферных растворах с сорбентом, проводили в изократическом режиме в буферных растворах с возрастающей ионной силой (Рис. 12).

Рис. 12. Хроматографическое Хроматографическое разделение белков лизата клеток разделение белков лизата клеток MCF-7 аффинной хроматографией;

7 аффинной хроматографией;

кривая 1 – хроматограмма белков хроматограмма белков лизата клеток MCF-7 на CH-сефарозе с ковалентно иммобилизованным с ковалентно иммобилизованным RL2; кривая 2 – хроматограмма – белков лизата клеток белков лизата клеток MCF-7 на CHсефарозе; Фракции:

сефарозе; Фракции: A – белки, не связавшиеся с сорбентом;

связавшиеся с сорбентом; B – белки, элюируемые буфером, содержащим буфером, содержащим 300 мМ NaCl; C – белки, элюируемые белки, элюируемые буфером, содержащим 1 М NaCl; D – буфером, содержащим белки, элюируемые 6М гуани белки, элюируемые 6М гуанидинHCl.

Белки хроматографических фракций (A, B, C, D) анализировали ) анализировали электрофорезом в 12% ПААГ в денатурирующих условиях с последующей электрофорезом в 12% ПААГ в денатурирующих условиях с последующей окраской геля раствором кумасси. Локализацию в геле белков, в геле белков, взаимодействующих с RL2, определяли, сравнивая электрофореграммы сравнивая электрофореграммы белков из опытных (Рис. 13, дорожки 1b, 2b, 3b, 4b) и контрольных фракций и контрольных фракций (Рис. 13, дорожки 1a, 2a, 3a, 4a). Всего было обнаружено и проанализировано Всего было обнаружено и проанализировано 3 белковых образца, специфично связывающиеся с RL2-сефарозой: образец сефарозой: образец – белки с электрофоретической подвижностью в диапазоне 45 – 66 кДа, белки с электрофоретической подвижностью в диапазоне образец 2 – белки с электрофоретической подвижностью 66 – 116 кДа и белки с электрофоретической подвижностью образец 3 – белки с электрофоретической подвижностью 35 – 45 кДа (Рис.

белки с электрофоретической подвижностью 13, дорожка 2b). Эти белки гидролизовали трипсином в геле и анализировали в геле и анализировали методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Анализ масс-спектров проводили спектров проводили в программе FlexAnalysis 2.4.

Рис. 13. Электрофоретическое Электрофоретическое разделение белков фракций, разделение белков фракций, полученных аффинной полученных аффинной хроматографией лизата клеток MCF-лизата клеток на CH-сефарозе (дорожки отмечены сефарозе (дорожки индексом a) и на CH-сефарозе с ) и на иммобилизованным иммобилизованным RL2 (дорожки отмечены индексом отмечены индексом b); Дорожки: 1 – белки фракции A, 2 – белки фракции, B, 3 – белки фракции C, 4 – белки белки фракции фракции D, 5 – набор белков с известными молекулярными массами;

ми молекулярными массами;

звездочкой отмечены белки, звездочкой отмечены белки, вырезанные из геля для проведения вырезанные из геля для проведения масс-спектрометрического анализа.

спектрометрического анализа.

При проведении масс-спектрометрического анализа фрагментов спектрометрического анализа фрагментов трипсинолиза белков, содержащихся в образце 1 и трипсинолиза белков, содержащихся в образце 1 и 2, были идентифицированы 14 пептидов и цепей тубулина человека и 5 пептидов цепей тубулина человека –актинина-1. Все идентифицированные белки являются белками Все идентифицированные белки являются белками цитоскелета. В связи с низким качеством масс-спектра образца 3 его анализ образц не привел к интерпретируемым результатам.

Таким образом, в результате поиска белков клеток MCF-7, способных MCF взаимодействовать с RL2, были выделены и идентифицированы белки 2, были выделены и идентифицированы белки цитоскелета: белки семейства тубулинов ( и цепи тубулина) и цепи тубулина) и -актинин1. Полученные результаты позволяют предположить, что при инкубации 1. Полученные результаты позволяют предположить, что при инкубации клеток MCF-7 с рекомбинантным аналогом лактаптина RL2, RL2 способен 2, проникать в цитоплазму клеток и взаимодействовать с белками цитоск проникать в цитоплазму клеток и взаимодействовать с белками цитоскелета и/или тубулином и -актинином-1, что подтверждается данными что подтверждается данными флуоресцентной микроскопии о локализации родаминового конъюгата флуоресцентной микроскопии о локализации родаминового конъюгата RL2 в клетках MCF-7 и MSC.

Анализ изменений транскриптома клеток MCF-7 под действием 7 под действием RL2 методом гибридизации РНК на чипах Illumina. Для обнаружения Для обнаружения генов, экспрессия которых изменяется под действием RL2, было проведено 2, было проведено полногеномное исследование изменений транскриптома раковых клеток полногеномное исследование изменений транскриптома раковых клеток человека, обработанных рекомбинантным аналогом лактаптина RL2. Клетки человека, обработанных рекомбинантным аналогом лактаптина RL2. Клетки MCF-7 инкубировали с RL2 (0,4 мг/мл) в течение 8, 18 и 28 ч, и сравнивали ) в течение 8, 18 и 28 ч, и сравнивали изменение концентраций мРНК клеток, обработанных RL2, и контрольных 2, и контрольных не обработанных клеток.

Результаты гибридизации суммарной мРНК клеток Результаты гибридизации суммарной мРНК клеток MCF-7 были представлены в виде матрицы Nx6, где N = 48000 – число представленных на представленных на микрочипе транскриптов. Каждая строка матрицы представляет профиль микрочипе транскриптов. Каждая строка матрицы представляет профиль интенсивностей сигнала i-ого транскрипта, распределенного по 6 образцам: ого транскрипта, распределенного по 6 образцам: образца – клетки MCF-7, инкубированные с RL2 в течение 8, 18 и 28 ч., и 2 в течение 8, контрольных образца – клетки MCF-7, культивированные без RL2 те же промежутки времени. Значения интенсивностей были нормализованы с использованием метода "постоянных рангов". Для каждого значения интенсивности сигнала транскрипта был рассчитан минимальный уровень статистической значимости p-Value. Для дальнейшего анализа экспрессии генов были отобраны 8660 сигналов, для которых значение p-Value<0.05.

Анализ изменения экспрессии генов в клетках MCF-7 после инкубации с RL2 характеризуется изменениями представленности следующих наиболее значимых транскриптов: циклинов A, B, E и D, белка p53, белков, контролирующих функционирование веретена деления при митозе (Bub1, Bub3 и Mad2), а также и субъединиц белков, формирующих коровую часть протеасом.

Инкубация клеток MCF-7 с RL2 в течение 8 и 18 ч характеризуется достоверным повышением относительной концентрации мРНК изоформ циклина B - B1 и B2 по сравнению с контрольными клетками. Эти данные могут свидетельствовать о задержке клеточного цикла при переходе клеток из G2 в M фазу под действием RL2. При этом в препаратах клеток, инкубированных с RL2 28 ч, относительная концентрация мРНК этих циклинов уже мало отличается от контроля. В клетках, инкубированных с RL2, концентрация мРНК циклина А2 повышена во всех точках измерения.

Это может быть связано с увеличением популяции клеток, синхронизированных в S или G2 фазах клеточного цикла.

Концентрация мРНК циклина D1 понижена в клетках, инкубированных с RL2 в течение 8 и 18 ч, и достоверно увеличивается к ч. Различия в концентрациях мРНК циклина E1 во всех парах опыт/контроль незначительны.

Полученные результаты, в совокупности с данными литературы, позволяют предположить, что в клетках, инкубированных с RL2, происходит синхронизация (остановка) клеточного цикла в G2/M фазе (8, 18 ч) и, возможно, в S/G2 - фазе (28 ч).

Анализ изменения концентрации мРНК гена p53 в клетках MCF-показал, что относительная концентрация мРНК белка p53 увеличивается с увеличением времени инкубации клеток с RL2, и через 28 ч превышает концентрацию мРНК p53 в контрольных клетках на 5 единиц. Необходимо отметить, что, в отличие от ряда других линий клеток рака молочной железы (T47D и MDA-MB-468), ген белка p53 клеток MCF-7 не содержит мутаций, вызывающих его инактивацию. Следовательно, повышение концентрации мРНК p53 в клетках MCF-7 можно рассматривать как один из маркеров апоптоза, индуцируемого RL2.

При проведении функционального анализа изменения экспрессии генов клеток MCF-7 под действием RL2 были сформированы подмножества генов (инкубация клеток с RL2 8 ч, 18 ч и 28 ч), уровень транскрипции которых достоверно был выше, чем в контрольных клетках.

Анализ проводили с использованием базы данных GO при помощи расширения ClueGO программы Cytoscape.

Рассмотрение результатов анализа позволило выделить наиболее многочисленные функциональные группы генов. После 8 ч инкубации клеток MCF-7 с RL2 происходит увеличение количества мРНК следующих групп генов: генов конденсации хромосом, генов центромерных регионов хромосом, а также группы генов, участвующих в задержке клеточного цикла.

После 18 ч инкубации происходит увеличение экспрессии в группах генов организации цитоскелета микротрубочек, генов кинетохоров конденсированных хромосом и регуляции митотического цикла. После 28 ч инкубации происходит увеличение экспрессии в группах генов организации актинового цитоскелета и регуляции митотического цикла, а также увеличение концентрации мРНК р53 и группы генов ответа клетки на поврежденния ДНК.

Модель механизма апоптотической гибели клеток MCF-7, индуцируемой RL2. На основании полученных экспериментальных данных, в совокупности с данными литературы, предложена модель механизма апоптотической гибели клеток MCF-7, индуцируемой RL2 (Рис. 14).

Данная модель включает проникновение RL2 в цитоплазму клетки и взаимодействие его с белками цитоскелета , -цепями тубулина и актинином-1. Известно, что -актинин выполняет адаптерную функцию при формировании комплексов фокальных адгезий, связывая цитоплазматический домен -интегрина с актиновыми филаментами.

Предполагается, что RL2 приводит к дестабилизации и диссоциации адгезивных комплексов. Диссоциация адгезивных комплексов в раковых клетках может способствовать активации белка p53. Накопление активной формы белка p53 приводит к индукции апоптоза клетки по рецепторному и митохондриальному путям, что сопровождается активацией инициаторных каспаз-8 и -9. Взаимодействие RL2 с - и -цепями тубулина в составе микротрубочек может приводить к высвобождению митохондриального проапоптотического фактора Bim в цитоплазму клетки. Накопление данного фактора в цитоплазме приводит к формированию митохондриальных пор и вносит вклад в активацию апоптоза по митохондриальному пути. Далее инициаторные каспазы-8 и -9 активируют эффекторную каспазу-7, что приводит к апоптотической гибели клетки.

Рис. 14. Модель механизма апоптотической гибели клеток MCF-7, индуцируемой MCF RL2.

ВЫВОДЫ 1. Методами генной-инженерии сконструированы аналоги лактаптина инженерии сконструированы аналоги лактаптина RL1 и RL2. Разработаны методы выделения и очистки рекомбинантного 2. Разработаны методы выделения и очистки рекомбинантного аналога лактаптина RL2 с использованием аффинной и ионообменной 2 с использованием аффинной и ионообменной хроматографии, позволяющие получать RL2 с чистотой не менее 97%.

2 с чистотой не менее 97%.

2. Показано, что RL2 эффективно тормозит пролиферацию клеток 2 эффективно тормозит пролиферацию клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, вызывает снижение 7, вызывает снижение жизнеспособности клеток аденокарциномы легкого человека жизнеспособности клеток аденокарциномы легкого человека A549 и карциномы гортани человека Hep-2 и не подавляет жизнеспособность 2 и не подавляет жизнеспособность немалигнизированных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани немалигнизированных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека MSC.

3. Установлено, что гибель клеток MCF-7, индуцируемая действием 7, индуцируемая действием RL2, проходит по механизму апоптоза. При этом наблюдается транслокация 2, проходит по механизму апоптоза. При этом наблюдается транслокация фосфатидилсерина на внешнюю поверхность цитоплазматической фосфатидилсерина на внешнюю поверхность цитоплазматической мембраны, диссипация трансмембранного потенциала митохондрий клеток и митохондрий клеток и активация инициаторных каспаз-8 и -9 и эффекторной каспазы 9 и эффекторной каспазы-7.

4. Показано, что RL2 проникает в цитоплазму клеток MCF-7 и MSC и 2 проникает в цитоплазму клеток взаимодействует с белками цитоскелета , -тубулином и -актинином актинином-1.

5. При исследовании изменений транскриптома MCF-7 под действием рекомбинантного аналога лактаптина RL2 методом гибридизации РНК на 2 методом гибридизации РНК на полнотранскриптомных чипах Illumina было показано, что происходит увеличение уровня экспрессии гена TP53 и группы генов, участвующих в pзависимом ответе клетки на повреждение ДНК.

6. На основании полученных экспериментальных данных, в совокупности с данными литературы, предложена модель механизма апоптотической гибели клеток MCF-7, индуцируемой рекомбинантным аналогом лактаптина RL2, включающая взаимодействие RL2 с белками цитоскелета и активацию белка p53, что приводит к индукции рецепторного и митохондриального путей апоптоза и последующей гибели клетки.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Фомин А.С., Семенов Д.В., Кулигина Е.В., Коваль О.А., Бабкина И.Н., Тикунова Н.В., Матвеева В.А., Матвеев Л.Э., Рихтер В.А. Генноинженерные аналоги потенциального противоопухолевого пептида лактаптина // Вестник НГУ. –2010. –Т. 8. –С. 17 – 25.

2. Semenov D.V., Fomin A.S., Kuligina E.V., Koval O.A., Matveeva V.A., Babkina I.N., Tikunova N.V., Richter V.A. Recombinant analogues of novel milk pro-apoptotic peptide lactaptin and their effect on cultured human cells // The Protein J. –2010. –V. 29. –P. 174 – 180.

3. Фомин А.С., Коваль О.А., Семенов Д.В., Потапенко М.О., Кулигина Е.В., Кит Ю.Я., Рихтер В.А. Анализ биохимических маркеров апоптоза клеток MCF-7, индуцируемого рекомбинантным аналогом противоопухолевого пептида лактаптина // Биоорган. химия, –2012. –Т. 38. –С. 92-4. Тикунова Н.В., Семенов Д.В., Бабкина И.Н., Кулигина Е.В., Коваль О.А., Фомин А.С., Матвеева В.А., Матвеев А.Л., Матвеев Л.Э., Рихтер В.А.

Рекомбинантная плазмидная днк pFK2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида, являющегося аналогом каппа-казеина человека, и рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам // Патент РФ № 2401307 (дата приоритета: 15 мая 20г.) 5. Матвеев Л.Э., Матвеев А.Л., Семенов Д.В., Фомин А.С., Кулигина Е.В., Матвеева В.А., Тикунова Н.В., Бабкина И.Н., Рихтер В.А. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus, продуцирующий моноклональные антитела, специфичные к пептиду, обладающему апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека // Патент РФ № 2402605 (дата приоритета: 17 сентября 2009 г.)




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.