WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ А.И. Рукавишников АЗБУКА РАКА Рекомендуется учебно-методическим объединением по ...»

-- [ Страница 3 ] --

П. Эрлих (1910) сформулировал тезисы, в которых подчеркнул задачи химиотерапии, и какой она должна быть. В том, архаичном стиле, они выгляде ли так: «Хемотерапия ставит себе задачу найти такие вещества, которые при большом влиянии на паразитов принесли бы возможно менее вреда организ му». И далее: «Средство в практику не выйдет, если взаимоотношение между ядовитостью и лечебной дозировкой неблагоприятно». Отсюда возникло пред ставление об идеальной по избирательности любого лекарственного средства – «магической пуле» П. Эрлиха.

Для каждого этапа метастазирования раковой клетки - изменения в гене или генах – это истинная причина, реализуемая через продукт гена. Ген с изме нениями – это ген-маркер, а изменения в его продукте – белок-маркер. По ним осуществляется диагностика этапов метастазирования раковой клетки. Они же, т.е. гены-маркеры и белки-маркеры, являются целями или мишенями для новых лекарств.

Лекарство новой, т.е. молекулярной или генной медицины, – это молеку лярная «пуля», бьющая точно в мишень или цель на том же молекулярном уро вне.

«Отлить» нужную «пулю» для любой болезни, даже для тех, которые се годня ещ неизлечимые или смертельные, например, рак, – вполне разрешимая задача. Но «только при одном условии: если четко определена мишень».

Итак, открытие генов и белков – причин инвазии раковой клетки, дают возможность:

- предсказывать потенции раковой клетки к инвазии и метастазированию по генам-маркерам свойства инвазии;

- обнаруживать микрометастазы раковой клетки в организме пациента путем выявления в крови и в других выделениях его генов-маркеров и белков маркеров свойства инвазии;

- уничтожать уже имеющиеся метастазы раковой клетки в организме па циента, используя эти маркеры как цели или мишени для создания на их основе избирательно действующих средств и лекарств от их носителей – раковых кле ток.

Как определить потенции к инвазии раковой клетки?

Пример 1.

Условия. В раковой клетке из ткани или из крови от пациента обна ружено, что ген белка nm23 отсутствует или неактивный. Значит, в раковой клетке отсутствует или дефектен продукт этого гена – белок nm23.

Вывод. Такая раковая клетка и ее потомки имеют высокую потенцию к инвазии, а значит, и к метастазированию.

Как подавить свойство инвазии этих раковых клеток?

В раковые клетки необходимо ввести: нормальный ген белка nm23, в крайнем случае иРНК этого гена с помощью, например, вируса Т4 или других векторов.

Пример 2.

Условия. В раковой клетке из ткани или из крови от пациента обнар ужено, что ген фермента GSK-3? отсутствует или слабо экспрессируется. Зн ачит, в раковой клетке и е потомках нет или мало фермента GSK-3?. B таком случае фактор транскрипции – белок «снейл» «выключит» полностью или час тично синтез белка Е-кадхерина в раковой клетке.

Вывод. Такая раковая клетка и е потомки имеют выраженную потенцию к инвазии, а значит, и к метастазированию.

Как подавить свойство инвазии таких раковых клеток?

В раковые клетки необходимо: 1) ввести ген фермента GSK-3?;

2) к этому можно добавить введение какого-либо ингибитора к иРНК гена белка «снейл», лучшим из них является РНКи.

Как уничтожить уже имеющиеся метастазы раковой клетки?

Это способна сделать только новая медицина – молекулярная или генная медицина.

Для лечения рака любой локализации пациенту вначале будет сделана операция на первичном очаге с иссечением путей лимфооттока – это первый этап. Второй этап – действия генной медицины и препараты из эмбриональных тканей.

Для второго этапа несколько путей: 1) избирательные лекарства, создан ные на основе генов-маркеров и белков-маркеров раковой клетки и маркеров свойства инвазии раковой клетки;

2) вакцины против раковой клетки и ее свой ства к инвазии: ДНК-вакцины, вакцины на основе дендритных клеток;

3) вак цинация пациента эмбриональными стволовыми клетками, вакцины из экстрак тов эмбриональных тканей и плаценты, на что особенно возлагаются большие надежды.

Инвазия раковой клетки в окружающие здоровые ткани и метастазирова ние без границ и без конца – ещ пример того, что раковая клетка – это одно клеточный организм или клетка-организм.

Свойство инвазии раковой клетки и е потомков создало нетипичную бо лезнь – рак. Найти в организме пациента каждую раковую клетку и уничтожить ее, не затрагивая нормальные клетки, означает излечить пациента от рака. Од нако достичь этого чрезвычайно трудно: вплоть до недавнего времени не было найдено абсолютных отличий раковой клетки от нормальной клетки того же типа.

Инвазия раковых клеток в окружающие нормальные ткани – разрушает эти ткани, а распространение через кровь и лимфу в различные органы – раз рушает ткани этих органов. Оба эти процесса продолжаются: без конца – из-за бессмертия раковой клетки, и без границ – из-за свойства инвазии раковой клетки, пока не приведут пациента к смерти.

Итак, если бы раковая клетка, не была одноклеточным организмом и не имела бы свойства к инвазии, не было бы этой самой опасной болезни – рака, и всех проблем, создаваемых именно раковой клеткой в этой болезни.

6.5. Ангиогенез и лимфангиогенез и их ингибирование для подавле ния пролиферации раковых клеток первичного рака и метастазов Из раковой стволовой клетки за счт деления вначале в ткани, образуется скопление клеток-потомков виде узелка размером 1-2 мм.

Дж. Фолкмэн (D. Folkman, 1970) из США учл тот факт, что когда идт рост рака из узелка, клетки в его середине начинают отмирать, а те, что снару жи, интенсивно делятся. У него возникла идея, что для роста рака должна зано во, т.е. de novo, создаваться сеть кровеносных капилляров, которая питает рако вые клетки.

В 1993 г. он и его группа в экспериментах доказали, что кровеносные ка пилляры создаются в узелке из раковых клеток, который едва достигает разме ра 2 мм в диаметре, – из крови раковые клетки получают кислород и питатель ные вещества.

Они пришли к выводу, что рак никогда не достигнет размера более 2 мм, если ингибировать развитие в нем новой сети не только кровеносных, но и лимфатических капилляров.

Теперь изучены молекулярные причины ангиогенеза и лимфангиогенеза в узелке из раковых клеток. Это начинается после того, как в раковой клетке включатся гены, отвечающие за синтез белков-лигандов: белок VEGF-1 – фак тор роста эндотелия сосудов и FGFb – фактор роста фибробластов. Они секре тируются раковыми клетками и диффундируют к эндотелию мелких вен ткани.

На поверхности клеток эндотелия они соединяются со своими молекулами рецепторами и так передают им сигнал к делению. Клетки эндотелия отделяют ся и мигрируют в толщу узелка из раковых клеток. В нм они делятся и обра зуют сеть не только из кровеносных, но и из лимфатических капилляров.

Главным из этих белков является VEGF-1. Он был выявлен как первый избирательный ангиогенный фактор для эндотелиальных клеток. Однако, еще важнее белок VEGF-C, так как участвует в регуляции контроля деления лимфа тического эндотелия, стимулирует лимфангиогенез и метастазирование рако вых клеток с лимфой. В результате создатся кровоснабжение и лимфообраще ние в узелке рака диаметром в 2 мм, который уже не имеет ограничения для размножения его клеток (Г.П. Георгиев, 2000).

Другие учные из США обнаружили, что в процессе ангиогенеза в узелке образуются «мозаичные» кровеносные капилляры, т.е. в их стенки среди клеток эндотелия встроены раковые клетки.

С помощью маркеров они определили долю эндотелиальных и раковых клеток в стенках кровеносных капилляров рака толстой кишки, имплантиро ванного мышам. Оказалось, что «примерно 15% капилляров» в опухоли явля ются мозаичными, а площадь сосудистой стенки, образованной раковыми клет ками, достигает 4% от общей площади стенок сосудов в ней.

Из расчта учных, до 50% раковых клеток стенок сосудов ежедневно выходят в кровоток. То есть, формирование мозаичных сосудов может являться одним из путей метастазирования раковых клеток. Если такое явление подтвер дится у больных раком, то анализ на наличие раковых клеток в крови пациента позволит выявлять самое «начало» рака, т.е. узелок из раковых клеток разме ром 1-2 мм в диаметре в ткани органа.

Что агрессивность раковых клеток и их метастазирование прямо зависит от образования новых капилляров, было доказано Д. Фолкмэн в ряде экспери ментов на животных.

1. Фрагменты агрессивной эпителиомы подсаживали в хрусталик глаза крыс, в хрусталике нет кровеносных сосудов. В течение 30 дней фрагменты ра ка оставались в толще хрусталика «в подвешенном состоянии, не увеличива лись при этом в размерах». После пересадки любого из этих фрагментов в об ласть лимбуса, где много капилляров, клетки рака начинали размножаться и проявляли бурный рост рака (Folkman and Gimbrone, 1976).

2. Раковые клетки способны синтезировать и секретировать белок ангио статин, который ингибирует пролиферацию раковых клеток. При раке Льюиса этот белок ингибировал образование капилляров de novo и этим задерживал рост метастазов. Эти эксперименты подтверждают важную роль ангиогенеза для роста солидного рака.

Ангиостатин подавляет рост рака у мышей. При лечении этим белком размеры рака уменьшались до микроскопических величин и оставались такими вс время, пока вводили этот препарат. Из этого следовал вывод: действие ан гиостатина обратимо, в этом недостаток препарата.

Другое вещество – эндостатин, в экспериментах оказался ещ более эф фективным, а при введении того и этого препарата, рак у мышей практически исчезал.

В настоящее время разрешены клинические испытания этих препаратов.

Но на выходе новый препарат – васкулостатин. Он в 14 раз сильнее угнетает пролиферацию эндотелицитов кровеносных капилляров, чем ангиостатин и в раза эффективнее эндостатина. Ген этого белка ещ не выделен и испытания на животных не проводились.

Ингибиторы и стимуляторы ангиогенеза В процессе роста рака в организме уровень секретируемого VEGF-1 белка повышается, а уровень секреции тромбосподина падает за счт утраты негатив ного регулятора ангиогенеза – тромбоспондина (TSP).

Тромбоспондин – гликопротеин внеклеточного матрикса. Его синтезиру ют эндотелиальные и другие клетки различного типа, и некоторые раковые. Он является главным ингибитором ангиогенеза, так как влияет на адгезию и про лиферацию эндотелиальных клеток.

Контроль синтеза тромбоспондина осуществляется геном wt53 через его белок – р53. При мутации этого гена в раковой клетке нарушается синтез этого белка. Содержание белка VEGF-1 значительно ниже в раковых клетках, в кото рых ген wt53 нормальный, и с низкой степенью ангиогенеза. Против действия этого белка и направлены разрабатываемые лекарственные препараты.

Роль ангиогенеза и лимфангиогенеза в метастазировании раковых клеток Метастазы – главная причина смерти пациентов, страдающих от рака, и прямо связаны со степенью васкуляризации рака. Метастазирование раковых клеток происходит за счет свойства раковой клетки к инвазии, т.е. проникнове нию раковых клеток в окружающие здоровые ткани и в сосуды через их стенку.

Это активный процесс: в раковой клетке включаются гены протеиназ для разрушения внеклеточного матрикса ткани и стенки сосудов, а также гены ин вазии: ген mts 1, репрессия гена белка nm23 и др.

Метастазы образуются в тканях различных органов путм переноса рако вых клеток с кровью и лимфой. Теперь эти знания существенно дополнены – инвазия и метастазирование происходит по сигналу от раковой стволовой клет ки с участием гемопоэтических клеток костного мозга, воспринимающими сиг нал. Этот процесс миграции раковых клеток без конца и границ, что и является основной причиной смерти пациента от рака.

Удаление первичного рака стимулирует рост микрометастазов раковых клеток В 1994 г. Д.Фолкмэн и его группа на основе экспериментов на животных дали два объяснения этому явлению.

1. Клетки первичного рака синтезируют и секретируют ингибитор ангио генеза – ангиостатин. Этот белок имеет большое время полужизни и действует системно, подавляя пролиферацию эндотелицитов. Иссечение первичного рака приводит к истощению ангиостатина в сыворотке крови, и это вызывает быст рый рост микрометастазов.

2. При наличии ингибитора ангиогенеза микрометастазы находятся в дремлющем состоянии, так как размножение раковых клеток равно скорости отмирания их за счт апоптоза. После иссечения первичного рака, а значит и удаления ингибитора, микрометастазы быстро растут из-за уменьшения числа апоптотических клеток при той же скорости деления раковых клеток.

ID-гены в регуляции ангиогенеза раковых клеток Проф. Р. Бенезра и его группа (1999) из ракового центра Нью-Йорка вы делили два гена в раковой клетке, обеспечивающие ангиогенез. Это гены: ID- и ID-3, в норме они имеются в геноме мыши и человека.

ID-гены отвечают за развитие и рост кровеносной системы плода, а у взрослого человека они не «включены», т.е. «молчат».

Однако в раковых клетках они вновь включаются, что вызывает ангиоге нез, поддерживая их жизнь и пролиферацию. Это явление учные подтвердили многочисленными опытами на мышах. Они провели такой опыт:

- вывели мышей с ослабленными ID-генами;

- привили этим мышам клетки рака из раковой опухоли.

Результат опыта: ни у одной из мышей возникновения рака не было обна ружено. Э. Янг – участник этого опыта, впервые обнаружила и оценила резуль тат опыта так: «мы не могли такого предвидеть».

Наоборот, проф. Р. Бенезра – руководитель этой группы учных считает, что ничего неожиданного в этом нет: «При блокировании поступления крови к раковым клеткам, ни один из видов рака не может развиваться. Это вполне ес тественно».

Теперь учные заняты тем, что «выводят мышей, у которых рак развива ется так же, как и у человека». На клетках рака от человека в лабораторных ис следованиях они уже подтвердили сво открытие.

По мнению авторов, необходимо ещ немало исследований в этом на правлении. В случае закрепления успеха, они планируют непосредственное воздействие на ID-гены, разработав лекарства, которые бы подавляли экспрес сию этих генов у больных раком;

когда питание раковых клеток прекращается, то они быстро погибают.

«В будущем, через много лет, мы сможем непосредственно воздейство вать на эти опасные гены человека. Избавиться от самого гена, вместо того чтобы бороться с продуктами его работы, означает по-настоящему сделать че ловечество неуязвимым для рака», – заявляют авторы открытия.

Дерепрессия ID-генов в раковой клетке, которые « работали» в клетке в эмбриогенезе, еще один признак того, что раковая клетка – это эмбриональная стволовая клетка.

Учным во главе проф. Р. Бенезра, кроме этого, удалось вывести породу мышей, которые стали устойчивыми к любым типам раковой клетки. Это все ляет надежду победы над раком, воздействуя на такие гены в раковой клетке у человека.

Оценка уровня ангиогенеза в раковой опухоли Так как ангиогенез необходим с момента формирования узелка из рако вых клеток с размера его 2 мм в диаметре, очень важно разработать маркеры для оценки его, начиная с этого уровня. Причина в том, что с началом ангиоге неза и лимфангиогенеза раковые клетки начинают распространяться по всему организму пациента, т.е. рак становится болезнью всего организма.

В настоящее время в качестве маркеров ангиогенеза рака используются:

количество микрокапилляров в раковой опухоли и число пролиферирующих эндотелиальных клеток. Эти маркеры определяются на материале раковой опу холи и е метастазов. Ясно, что оценка уровня ангиогенеза по таким маркерам – это знания «post factum».

Для клинической практики необходимы такие маркеры, которыми можно было бы оценить уровень ангиогенеза не на материале уже симптомов рака от пациента, а при раке размером с 2 мм в диаметре.

Теперь это возможно на основе открытия ID-генов, вызывающих ангио генез с узелка из раковых клеток в 1-2 мм в диаметре в ткани. Это можно сде лать двумя способами: 1) по степени экспрессии I–D1 и I–D3-генов по анализу образца плазмы крови от конкретного пациента и 2) по содержанию продуктов этих генов, т.е. белков в образце сыворотки крови от этого пациента.

Важно также исследовать степень активности в клетках генов VEGF-1 и FGFb и содержание их белков. Эти анализы в настоящее время можно выпол нять на ДНК-чипе и белковом чипе.

Такие критерии оценки уровня ангиогенеза можно использовать для ран ней диагностики раковых клеток и слежения за эффектом лечения рака с помо щью ингибиторов ангиогенеза.

Ингибиторы ангиогенеза Такое воздействие в литературе называется антиангиогенным лечением рака (Е.В. Степанова, А.Ю. Барышников, М.Р. Личиницер, 2000;

Е.В. Степано ва, 2002). В настоящее время для этой цели имеется ряд препаратов, которые уже проходят клинические испытания. По механизму действия их делят на две группы: 1) ингибиторы передачи сигнала к делению эндотелиальных клеток и 2) ингибиторы пролиферации эндотелиальных клеток.

Г.П. Георгиев, С.Л. Киселев, Н.В. Гнучев (2003) для лечения рака особен но перспективным считают использование сочетания антиангиогенного средст ва и генной вакцинотерапии. Это они объясняют тем, что такое сочетание дей ствует на независимые мишени – на раковую клетку и на эндотелий форми рующихся микрокапилляров. Кроме этого, «оба метода не зависят от того, ка кие гены вызвали превращение нормальной клетки в раковую клетку».

1. Блокада VEGF-C для ингибирования пролиферации раковых клеток и метастазов.

VEGF-C – это цитокин, самый главный фактор стимуляции образования новых капилляров для пролиферации клеток рака и их микрометастазов в тка нях. Именно он индуцирует из узелка раковых клеток в 2 мм в диаметре рост первичного рака и микрометастазов его в организме пациента.

Отличительная черта этого цитокина: он в равной степени индуцирует в узелке из раковых клеток размером 2 мм в диаметре образование не только кровеносных, но и лимфатических капилляров.

Проф. Х. Кубо и его группа (H. Kubo, 2004) из университета Киото созда ли антитела, блокирующие фактор роста эндотелия сосудов (VEGF-C). Это прекращает передачу сигнала из-за отсутствия этого белка к рецептору на эндо телицитах мелких вен.

В результате: эндотелициты не делятся и не мигрируют в узелок из рако вых клеток при размере, едва достигшего 2 мм, первичного рака и микромета стазов. Этим блокируется ангиогенез и лимфангиогенез в среде раковых клеток, и они в отсутствие питания через кровь, быстро погибают.

Учные считают, что сделанное ими открытие позволит подавлять свой ство раковых клеток индуцировать образование новых кровеносных и лимфа тических капилляров в узелке из раковых клеток, начиная с размера его в 2 мм.

Это предотвратит метастазирование раковых клеток, что «значительно увели чит шансы на успех в лечении рака».

2. Раковую клетку можно заставить синтезировать лекарство против себя самой.

Такой метод уничтожения раковых клеток разработали учные из Йель ского университета США (2001). Метод позволяет уменьшать кровоснабжение раковых клеток за счт уничтожения кровеносных сосудов в опухоли. Это но вое и быстро развивающееся направление. В отличие от прежних методов, этот метод разрушает сосуды в раковой опухоли, а не препятствует образованию но вых.

Учные обнаружили, что на поверхности клеток, выстилающих сосуды внутри опухоли, в отличие от сосудов в нормальной ткани, имеется молекула рецептор, названная TF. С ней плотно связывается молекула fV11, которая цир кулирует в крови. Выяснено, что если к этой молекуле добавить антитело, то получившийся комплекс будет разрушать стенку сосудов.

Молекула, разрушающая кровеносные сосуды, вводится внутрь опухоли с помощью безвредного вируса. После инфицирования раковые клетки начинают производить в большом количестве вещество, оно и вызывает разрушение со судов и гибель раковых клеток.

Метод испытан в экспериментах на лабораторных животных, которым были привиты клетки меланомы и рака простаты от человека. Животные оста вались живы до конца эксперимента – почти двести дней, в то время как жи вотные контрольной группы, не получавшие такое лечение, прожили не более 63-х дней.

Учные заявили о готовности испытать этот метод на добровольцах, страдающих от меланомы кожи.

3. В США успешно испытана новая вакцина против рака различного типа клетки.

Новая вакцина против рака разработана группой американских учных во главе с иммунологом Ральф Рейсфельдом. Они отмечают, что «вакцина дейст вует против ангиогенеза, к которому приводит рак, едва достигнув 2 мм в диа метре». Раковые клетки нуждаются в «сверхпитании», которое и получают, «провоцируя создание новых кровеносных сосудов».

В опытах на мышах «вакцина блокировала приток крови к опухоли и препятствовала е росту. Кроме того, у мышей ещ на 10 месяцев появлялась защита от повторного роста опухоли».

Ральф Рейсфельд использовал вакцину, содержащую FLK-1 против белка, вызывающего рост кровеносных сосудов вокруг опухоли. Мышам с тремя раз личными типами рака прививалась вакцина, содержащая генетически изменн ные, непатогенные бактерии, способные производить большое количество FLK 1.

Результаты: «появлялась довольно продолжительная и устойчивая им мунная реакция, способная блокировать кровеносные сосуды вокруг раковых опухолей. Эти сосуды ослаблялись и, в конечном счте, исчезали вовсе». «По мимо этого, почти не наблюдалось побочных эффектов. Эта вакцина, привитая человеку, будет еще более эффективной в сочетании с другими методами лече ния, способствующими гибели раковых клеток, и окажется полезной для пре дотвращения рецидивов».

Е.В. Степанова (2002) считает, что особенность антиангиогенной терапии в том, что она оказывает «цитостатический эффект» при воздействии на рако вые клетки.

Автор делит ингибиторы ангиогенеза на два класса и объясняет механизм их действия.

1. Прямые ингибиторы ангиогенеза действуют на эндотелиальные клетки, что блокирует их пролиферацию, миграцию и активацию апоптоза в этих клет ках.

2. Непрямые ингибиторы ангиогенеза подавляют синтез ангиогенных белков раковыми клетками: VEGF-1, FGFb и др.

Познания молекулярных причин ангиогенеза и лимфангиогенеза на этапе рака в 1-2 мм в ткани, открытие ID-генов и других причин, вызывающих эти процессы, позволят врачам-онкологам управлять этими процессами.

Это важно для раннего обнаружения первых раковых клеток первичного рака и микрометастазов, подавления их пролиферации и уничтожения.

6.6. Участие гемопоэтических клеток костного мозга в процессе мета стазирования: новые мишени диагностики метастазов раковых клеток и их уничтожения Причины, по которым раковые клетки могут покидать первичный очаг рака и мигрировать в другие части тела, до конца не изучены. Многие жизни можно будет спасти, если удастся останавливать этот процесс.

До сих пор считалось, что место образования метастаза определяется тем, в какой орган или органы с потоком крови попадает раковая клетка или клетки из первичного очага рака. Из не за счт деления в ткани органа образуется микрометастаз – узелок из потомков раковой клетки размером 1-2 мм.

Размер узелка из раковых клеток до 1-2 мм в диметре в ткани органа мо жет быть не только микрометастазом, но также и первичным очагом рака в тка ни.

Уже с размера 2 мм этого первичного очага рака или микрометастаза ра ковые клетки могут отделяться от них и таким же путем переноситься в другие органы и оседать в их тканях, образуя там новые очаги метастазов.

К настоящему времени открыт ряд генов и их продукты – белки в рако вых клетках, которые вызывают образование метастазов в организме.

Теперь выяснилось, что образование метастазов из раковых клеток – это «вовсе не хаотический, а полностью управляемый процесс». Им управляет ра ковая клетка: сама подготавливает путь для метастаза и сама регулирует его образование в тканях органа или органов.

Проф. Д. Лайден (David Liden, 2005) и его группа из Университета Кор нелла (США), а также другие исследователи выявили ранее неизвестные моле кулярные причины процесса образования метастаза из раковой клетки и сооб щили об этом в журнале «Nature» в конце 2005 г. Ниже мы излагаем некоторые данные из краткой статьи группы учных – R.N. Kaplan, R.D.Riba, S. Zacharoulis et al. (2005) и др.

Миграция клеток в организме вызывается биохимическими сигналами, т.е. сигнальными молекулами. В культуре раковых клеток обнаружено, что эти клетки экспрессируют и секретируют ряд таких молекул: VEGF-1 – фактор рос та эндотелия сосудов 1 типа, IGF-1 – инсулиноподобный фактор роста 1, CXCR4 – рецептор фактора SDF-1 (stromal-derived factor), VLA-4 и др.

Метастаз образуется из раковой клетки за счт е размножения. До этого она должна найти себе место в ткани и «встроиться» в не. Но как выяснили учные, для этого раковой клетке требуется помощь костного мозга.

Ещ до того, как раковые клетки отделятся от первичного очага рака, для них «в разных точках» организма готовятся специальные «ниши» – в них впо следствии и появляются раковые клетки. Эти ниши образуются гемопоэтиче скими клетками из костного мозга.

Начало образования метастаза с секреции раковой клеткой молекул сиг нала – VEGF-1. Они поступают в костный мозг и вступают в контакт с гемопо этическими клетками, так как на их мембране имеется рецептор к молекуле сигналу – VEGFR-1.

В обычном состоянии эти клетки длительное время не делятся, т.е.

«спят». Но, получив биохимический сигнал, гемопоэтические клетки покидают костный мозг и мигрируют «в разные места» организма, где оседают и размно жаются, готовя преметастазные ниши. В эти ниши позднее прибудут раковые клетки из первичного очага рака (D. Lyden et al., 2001).

Для проверки гипотезы образования такой ниши, учные провели серии опытов на мышах. Вначале с помощью облучения у мышей были убиты клетки костного мозга. Взамен этим же мышам был трансплантирован костный мозг.

Клетки его были помечены зеленым флуоресцентным протеином трансфекцией гена этого протеина в клетки – GFP. Это облегчало визуализацию движения этих клеток под микроскопом.

Через 4 недели, когда новые клетки костного мозга прижились, мышам ввели внутрикожно раковые клетки: одним мышам – клетки от легочного рака Льюиса, а другим мышам – клетки меланомы В16. Для клеток рака Льюиса по сле введения мышам характерны метастазы в лгкие, печень, а для клеток ме ланомы – печень, селезнка, почки.

Через 2 недели после введения раковых клеток Льюиса, в лгких были обнаружены скопления меченых гемопоэтических клеток, но не метастазы.

На 9-й день после этого в лгких были обнаружены метастазы в тех же местах, куда до этого мигрировали гемопоэтические клетки костного мозга.

При этом более 95% раковых клеток метастазов в легких было связано с гемо поэтическими клетками, имеющими метку GFP.

Исходя из этого, учные сделали вывод: гемопоэтические клетки, мигри ровавшие из костного мозга, образуют в лгких преметастазные ниши.

Схема этапов процесса метастазирования включает:

- секреция раковой клеткой VEGF-1, CXCR-4, PIGF, что вызывает экс прессию факторов хемотаксиса – фибронектин, SDF-1 в органе-мишени;

- миграция VEGFR-1 гемопоэтических клеток костного мозга по хемотак сическим осям в ткани органа-мишени, их адгезия к клеткам ткани с помощью молекул адгезии VLA-4, Id3 и образование преметастазных ниш;

- миграция VEGFR-2 клеток, вызывающих ангиогенез и заканчивающих формирование ниш;

- лишь после этого миграция раковых клеток из первичного очага рака в нишу или ниши и образование из них путм размножения зрелого метастаза или метастазов. Не исключается, что при этом происходит слияние раковых клеток со стволовыми клетками костного мозга.

Оказалось, что место формирования преметастазных ниш определяется типом раковой клетки и молекулами-сигналами, указывающими путь метаста зирования: для рака Льюиса – в лгкие и пчень, а для меланомы В16 – печень, селезнка и почки. Это было доказано в опытах на мышах.

Опыт: мышам вводили микросреду от культуры клеток меланомы В16.

Это вызывало выход в кровоток гемопоэтических клеток и образование из них преметастазных ниш в печени, селезнке и почках. Через некоторый срок этим же мышам внутривенно вводили клетки меланомы В16.

Результат: клетки меланомы мигрировали в преметастазные ниши и сформировали в них метастазы меланомы. Такой же результат был получен в опытах на мышах соответственно с клетками рака Льюиса.

Итак, места миграции гемопоэтических клеток совпадают с типичными или «природными» местами метастазирования у двух изучавшихся типов рака в опытах на мышах. В других органах мышей скоплений гемопоэтических клеток и метастазов не было обнаружено.

Для формирования метастаза в нише большую роль играет синтез и вы деление клетками костного мозга фибронектина – вязкого вещества, закреп ляющего раковые клетки на поверхности ниш органа-мишени.

SDF-1 экспрессируется стромальными клетками ниши, а к нему на рако вых клетках имеется его рецептор – CXCR-4. Это вызывает хемотаксис рако вых клеток в преметастазные ниши.

Главную роль в формировании преметастазных ниш в ткани играет VEGFR-1. Это подтверждено введением моноклональных антител к этому ре цептору после имплантации раковых клеток животным – полное предотвраще ние метастазирования раковых клеток обоих типов.

Введение моноклональных антител к VEGFR-2 уменьшало метастазиро вание раковых клеток, а введение тех и других антител «блокировало образова ние метастазов и даже самих ниш перед началом миграции раковых клеток» (Рис. 1).

Проф. Д. Лайден подчеркивает, что «до сих пор все боролись с первич ным очагом рака и относительно мало внимания обращали на процесс образо вания метастазов, а ведь именно они и являются главной причиной гибели больных».

Группа учных в серии опытов на мышах смогла наблюдать весь процесс метастазирования раковых клеток – «от отправки сигнала до появления мета стазов».

«Пока другие лаборатории год за годом исследовали непосредственно клетки, образующие метастазы, мы решили подойти с другой стороны и начали изучать окружающую среду – где именно они образуются, почему именно в этом месте, а не в другом», – объясняет секрет успеха проф. S. Rafii – один из соавторов исследований Дэвида Лайдена.

По мнению учных, число ниш для метастазов определяется геномом па циента, а их место – «в разных местах» или «по всему организму».

Рис. 1. Схема эксперимента Rosandra N. Kaplan et al. (2005).

Из исследований авторов не ясно:

1) образуются ли ниши для метастазов раковых клеток только «в разных местах» или вс же «по всему организму»;

2) что заставляет гемопоэтические клетки мигрировать в здоровую ткань органа для формирования ниш, если в такой ткани до этого нет раковой клетки или поврежденной клетки.

В экспериментах авторов мышам взамен убитых клеток костного мозга был трансплантирован костный мозг. Среди клеток костного мозга по гипотезе M. Kucia и его группы (2004) есть популяция тканеспецифичных стволовых клеток (ТССК). Эти клетки способны давать специализированные клетки опре делнной ткани и/или активно участвовать в е регенерации. Некоторые учные мечтают селективно изолировать эти клетки из костного мозга и использовать в лечении повреждений конкретной ткани или органа.

Раковая стволовая клетка – это тоже поврежднная клетка, так как на вы деляемый ею сигнал, – фактор роста, стволовые клетки костного мозга мигри руют к ней. Возможно, что гипотеза M. Kucia может дать ответ на эти два во проса.

Может быть, получив сигнал от раковой клетки, клетки костного мозга мигрируют к раковой стволовой клетке и в те здоровые органы и их ткани, ре генерацию клеток которых они обеспечивают. Тогда это и определяет место и число ниш в органе.

Выше мы отмечали, что начало образования метастазов в тканях органа мишени происходит на клеточном уровне: из потомков клетки образуется узе лок в 1-2 мм в диаметре. Однако, нет ни одного прибора, которым бы можно было выявить в ткани какого-либо органа микрометастаз или первичный очаг рака такого размера.

Но проф. Д. Лайден считает, что «в любом случае все-таки можно зафик сировать, а значит, либо предотвратить развитие рака, либо остановить процесс, который уже начался». Для этого необходимо использовать новые мишени:

сигнал от раковой клетки к клеткам костного мозга, а также фибронектин.

Способы использования этих и других мишеней для предупреждения или прекращения метастазов раковой клетки:

- моноклональными антителами блокировать сигнал VEGF-1 от раковых клеток первичного очага рака, тогда стволовые гемопоэтические клетки «не по кинут костный мозг и не будут строить ниши для образования метастазов»;

- моноклональными антителами блокировать рецептор VEGFR-1, что предотвратит миграцию гемопоэтических клеток костного мозга для формиро вания преметастазных ниш и миграцию раковых клеток в их места;

- введение моноклональных антител против VEGFR-2, что предотвратит миграцию эндотелиальных клеток стромы костного мозга в места формирова ния преметастазных ниш, а значит, не будет ангиогенеза в них, и остановится формирование ниш.

- предотвратить секрецию в нише гемопоэтическими клетками костного мозга вязкого фибронектина, что будет мешать раковой клетке «встраиваться» в ткань органа-мишени.

«Так в корне может измениться лечение рака – пока оно направлено на уничтожение раковых клеток в организме. Но теперь расширяются возможно сти определять степень риска образования метастазов у каждого пациента и проводить профилактическое лечение», – говорит проф. Д. Лайден.

Исследования были выполнены только на мышах, но учные считают, что подобные молекулярные причины существуют у людей. Они планируют начать клинические испытания на людях в течение следующего года.

Открытие проф. Д. Лайдена и его группы, а также других учных сущест венно дополняют молекулярные причины процесса метастазирования раковых клеток.

Это открыло белки-сигналы и белки-рецепторы метастазирования рако вых клеток, и возможность предсказания «угрозы образования» метастазов, их ранней диагностики и избирательного уничтожения.

Однако, что заставляет раковые клетки мигрировать в окружающие ткани и метастазировать, – ответов нет. Теперь, когда мы знаем, что раковая клетка, – это стволовая клетка, можно дать и ответ: причиной инвазии и метастазирова ния является хоуминг раковой стволовой клетки – миграция е в «нужное ме сто», в свою стволовую нишу.

Стволовые клетки имеют естественную способность создавать себе «дом», т.е. нишу, чтобы находиться в благоприятной среде и самообновляться.

«Нам всем нужен дом, и стволовые клетки с их сильным инстинктом к выжива нию являются активными строителями жилья», – сказала проф. Руохола-Бейкер (2006) из США.

Глава 7. Методы для ранней диагностики раковых клеток 7.1. ПЦР-ММК – метод ранней диагностики раковых клеток Из первой раковой клетки за счт е деления вначале в ткани образуется узелок в 1-2 мм в диаметре. Но уже с этого размера раковые клетки индуциру ют внутри узелка ангиогенез и лимфангиогенез. С началом оттока крови и лимфы из узелка раковые клетки отделяются от него и с кровью и лимфой раз носятся по организму пациента – рак становится болезнью всего организма па циента.

Из этого следует, что диагностика рака, любого размера, видимого глазом и с помощью приборов – это поздняя диагностика. Пока в практике врача онколога диагностика рака тогда, когда рак проявляет себя симптомами.

Учные разных стран и нашей страны разными методами стремятся пе рейти к диагностике рака задолго до его симптомов. Именно на таком этапе бо лезни, можно надеяться на излечение от рака.

Нормальная клетка превращается в раковую после воздействия на не ка кого-либо канцерогена. Это вызывает в ней изменения экспрессии генов, соз дающих ее свойства. Вторая причина – изменения экспрессии генов супрессоров в этой клетке метилированием их промотора, а также мутации. Эти изменения происходят в генах, регулирующих процесс деления клетки, в генах, ингибирующих деление клетки при нарушениях в е геноме, а также в генах, вызывающих апоптоз в таких клетках.

Каждый дефект в геноме раковой клетки является маркером такой клетки.

Термин маркер (от англ. mark – метка). Диагностика первой раковой клетки и е близких потомков по генам-маркерам – это ранняя диагностика рака у паци ента.

Но как найти в организме пациента раковую клетку и е потомки от пер вых делений среди 5 1013-14 клеток организма взрослого человека.

Как и любая клетка, раковая клетка микроскопического размера, возник нув в ткани, ничем не беспокоит пациента. За счт свойства к инвазии е по томки распространяются в окружающие здоровые ткани и по всему организму, где, оседая, дают новые очаги рака – метастазы.

Задача диагностики разрозненных раковых клеток в тканях различных органов сопоставима даже не с поиском иголки в стоге сена, а с поиском кон кретного пучка сена в этом стоге. Поэтому не нужно быть слишком большим пессимистом, чтобы предположить всю «тупиковость» такой ситуации в прак тике врача-онколога.

Но все изменил метод ПЦР, т.е. полимеразная цепная реакция, а в сочета нии с ММК – методом молекулярных колоний, разработанным нашими учны ми – чл.-корр. А.Б. Четвериным и Е.В. Четвериной (2002), стал для ранней ди агностики весьма точным.

При любой локализации рака в кровь пациента попадают: а) сами рако вые клетки – из стенок мозаичных капилляров узелка из раковых клеток в 1- мм в диаметре и б) гены-маркеры из погибших раковых клеток еще задолго до проявления как первичного очага рака, так и его метастазов. Это и позволяет выявлять рак у пациента с самого начала, т.е. с размера узелка в 1-2 мм в диа метре.

Ещ в 60-70-х гг. XX в. Ф. Анкер (Ph. Anker) из Швейцарии сделал пер вые попытки доказать возможность обнаружения дефектных генов из раковых клеток в крови от пациента.

Наш учный, проф. А.С. Белохвостов еще в 1960 г. XX в. обнаружил де фектные гены из раковых клеток яичника и желудка в асцитной жидкости. Он же с коллегами в 1978 г. XX в. доказал выход дефектных генов из раковых кле ток в кровоток из опухолей в эксперименте на животных.

Теперь дефектные гены из раковых клеток обнаруживают с помощью ПЦР, а также ПЦР-ММК не только в крови, но и в других выделениях от паци ента – слюна, слзная жидкость, слизь, мокрота, моча и др., в зависимости от типа раковой клетки.

Раковые клетки разрушаются в тканях за счт апоптоза как клетки с де фектами в геноме, а также при уничтожении Т-клетками. ДНК из них попадает в межклеточную жидкость, а из не в кровь. В кровь попадают раковые клетки из первичного очага рака и метастазов. В крови они разрушаются, в том числе Т-клетками.

Молекулы ДНК и иРНК не могут быть вне клетки, в частности, раковой клетки, а раковая клетка не может быть без ДНК и иРНК. Поэтому выявление этих молекул является эквивалентом обнаружения их носителя – раковой клет ки.

Точно также по молекулам ДНК, РНК диагностируют бактерии и вирусы – возбудителей различных инфекций у пациентов.

Выявление генов-маркеров раковых клеток в их ДНК является идеальным методом для ранней диагностики раковых клеток, контроля лечения и излече ния, а также предсказания и диагностики рецидива и метастаза рака у пациен тов.

ПЦР-диагностика раковых клеток по плазме крови Процесс, благодаря которому можно получать копии генов из ДНК в не ограниченном количестве, называют полимеразной цепной реакцией – ПЦР.

ПЦР открыл в 1983 г. американский ученый К. Мюллис (Kary B. Mullis), за что он был удостоен Нобелевской премии.

Мишенями ПЦР являются – фрагмент ДНК с находящимся в нм геном и иРНК – копия гена.

Цель ПЦР – размножить фрагмент ДНК из образца плазмы крови пациен та, т.е. получить его копии, а также размножить иРНК до уровня, детектиру емого стандартными методами. Чтобы размножить иРНК, е сначала нужно с помощью обратной транскриптазы перевести в комплементарную ей ДНК, т.е.

кДНК.

Таким методом можно обнаружить экспрессию гена или генов по уровню их мРНК, а также мутации в гене, что явилось причиной превращения нор мальной клетки в раковую.

Принцип ПЦР Для ПЦР-метода из клинического образца – плазмы крови выделяют смесь всех содержащихся там ДНК и РНК. Далее, чтобы понять принцип копи рования этих молекул, нам не обойтись без некоторых знаний об их природе.

Молекула ДНК состоит из двух цепей, построенных из нуклеотидов, ос новной частью которых являются азотистые основания: аденин – А, цитозин – Ц, гуанин – Г и тимин – Т. Азотистые основания несут в себе генетическую ин формацию о структуре белков, а через них – строение клетки и е функции, а также е воспроизведение, т.е. деление на две дочерние клетки.

В английском языке есть слово complement – дополнять, дополнение.

От него в молекулярной биологии появился термин – комплементарность.

Смысл его в том, что молекулы узнают друг друга участками, которые допол няют друг друга как «ключ и замок».

По этому принципу цепи нуклеотидов составляют комплементарную па ру: А одной цепи всегда против Т другой цепи, а Г против Ц. Когда А и Т в двух цепях ДНК расположены друг против друга, между ними образуются две водородные связи. То же происходит с Г и Ц, но между ними возникает три во дородные связи.

Из комплементарности пар оснований следует, что последовательность или порядок размещения азотистых оснований на одной цепи ДНК, определяет порядок азотистых оснований в е другой цепи. Концы цепей ДНК химически различны: у каждой цепи есть 3’-конец и 5’- конец (Рис. 1, 2, 3).

Рис 1. Фрагмент молекулы ДНК.

Цепь ДНК, которая служит матрицей для синтеза матричной РНК на зывается матричной цепью.

Рис. 2. Цепь мРНК – это копия матричной цепи ДНК, последовательность азотистых оснований в ней та же, что и в нематричной цепи ДНК, но с заменой Т на У.

Цепь мРНК с помощью ПЦР размножают, но сначала е с помощью об ратной транскриптазы переводят в комплементарную ей матричную цепь ДНК – кДНК.

Рис. 3. кДНК синтезирована на матрице мРНК – копии гена.

Образование водородных связей между парами оснований: А-Т и Г-Ц – это спонтанный процесс, т.е. без участия фермента. Эти связи слабые и легко рвутся при нагревании – цепи ДНК отделяются друг от друга, а при охлажде нии раствора – вновь спариваются в прежнее комплементарное состояние.

Спонтанный процесс образования пар оснований А-Т и Г-Ц называют гибриди зацией.

В основе ПЦР-анализа и лежит гибридизация пар оснований, как спон танный процесс.

Выделенные из образца плазмы крови ДНК и иРНК являются мишенями для ПЦР. Их смешивают с реакционным буфером и другими компонентами ПЦР в специальную пробирку и помещают в прибор – ДНК-амплификатор, дающий циклические изменения температуры реакции.

Цикл ПЦР для размножения молекул-мишеней – ДНК и иРНК состоит из трх стадий:

1) расплавление двухцепочечной ДНК путем повышения температуры ре акционной среды до 90° С;

2) зная порядок оснований на концах фрагмента ДНК, взятого для раз множения, т.е. амплификации, синтезируют химическим путм олигонуклеоти ды, комплементарные этим участкам – это праймеры;

3) присоединение праймеров к матрицам, т.е. к однотяжевым цепям ДНК, полученными в результате первой стадии. Температура реакционной среды – 50-60°С.

На этой стадии происходит удлинение, т.е. элонгация гибридизованных праймеров ДНК-полимеразой при температуре для работы фермента 70-75°С, что превращает каждую из цепей в двухцепочечную молекулу ДНК (Рис. 4).

Рис. 4. Схема ПЦР [рис. и цит. по: А.С. Белохвостов (1995) с изменения ми]. На схеме цикл удвоения молекулы ДНК из исследуемого образца:

а – цепи исходной молекулы ДНК изображены двумя прямыми линиями;

б – после разделения цепей ДНК, к их концам присоединены по одному комплементарному праймеру в виде прямоугольника;

в – идт синтез новых цепочек ДНК.

Примечание. Стрелками показано направление синтеза новых цепей в ПЦР.

По окончании одного первого цикла из одной молекулы двухцепочечной ДНК получены две, в следующем цикле каждая из двух молекул снова удваива ется и так далее, с нарастанием числа молекул (N) по формуле: N = 2n, где n – число циклов. Отсюда и название реакции – цепная.

Теоретически ПЦР позволяет размножить до легко детектируемых коли честв даже единственною молекулу-мишень ДНК, даже если она находится среди множества других молекул ДНК и РНК. Стандартная ПЦР постоянно со вершенствуется.

Продукты ПЦР – молекулы ДНК, а значит гены и иРНК подвергаются анализу рядом методов, например электрофорезом в геле с окраской молекулы ДНК бромидом этидия и др. Определяются ген(-ы) и мутации в них: замена – пара оснований меняется на другую;

вставка – в молекулу введена новая пара оснований;

делеция – отсутствие пары комплементарных оснований в гене. По количеству копий иРНК гена судят о степени его экспрессии в клетке.

Различают два варианта ПЦР-диагностики: 1) качественный тест и 2) ко личественный тест.

Для качественного теста требуется лишь дать ответ: «да» или «нет», т.е.

содержится ли в образце ДНК или иРНК. Для диагностики вирусной инфекции обычно достаточен факт обнаружения в образце вирусной ДНК или иРНК.

Для обнаружения раковой клетки в образце недостаточно, например, об наружить иРНК, так как она может быть продуктом и нормальной, и раковой клетки.

Количественный тест определяет титр, т.е. число копий молекул мишеней в определенном количестве образца, здесь крайне важны мишени – ДНК и иРНК.

Ведь для ранней диагностики рака крайне важно обнаружить его на са мом раннем этапе – на уровне первой раковой клетки и е первых потомков, а еще лучше на уровне предраковой клетки по генетическим маркерам в молеку лах-мишенях – ДНК и иРНК. На уровне одной из этих клеток титр мишени бу дет минимальным.

Титр мишеней – ДНК и иРНК и их генетические маркеры необходимы:

1) для исследования молекулярных причин превращения нормальной клетки в раковую клетку в конкретном случае;

2) для слежения за течением скрытого ещ рака на уровне первой раковой клетки и е первых потомков, но также и для рака с симптомами;

3) для оценки эффективности лечения рака, коррекции лечения рака в процессе его лечения по состоянию генетических маркеров раковых клеток.

Чувствительность стандартной ПЦР разные авторы оценивают по разному;

причиной этого может быть и степень чувствительности е в специфи ческом обнаружении молекул-мишеней, но и характер клинического образца – плазма крови, ткань опухоли, слюна, моча и другие различные выделения.

ПЦР-ММК-метод для ранней диагностики раковой клетки или клеток по плазме крови Стандартная ПЦР может давать сбои и ошибки, в результате чего: 1) мо лекулы-мишени не будут выявлены из-за потери их в процессе подготовки об разца;

2) молекулы-мишени могут быть не размножены в процессе ПЦР, тем бо лее что в обычной клинической практике молекулы-мишени представляют не значительную долю среди ненужных матриц в образце.

Чл.-корр. А.Б. Четверин и Е.В. Четверина – сотрудники Института белка РАН – открыли метод молекулярных колоний – ММК, для прямого определе ния титра молекулы-мишени и пространственное разделение размножения нужных молекул-мишеней от ненужных. Этот метод запатентован учными в РФ и в США (1995, 1998).

Принцип метода в том, что молекулы-мишени – ДНК и иРНК – размно жаются не в жидкости, а в геле. Это создает отдельные колонии, каждая из ко торых является потомством единственной молекулы, т.е. клон.

ММК может сочетаться с ПЦР для размножения молекул-мишеней. Сна чала гель полимеризуют, затем вымачивают в воде, чтобы удалить все раство римые вещества, затем автоклавируют и сушат.

Перед началом ПЦР гель пропитывают реакционной смесью. Этим авто ры достигают полного сохранения активности ДНК-полимеразы и уничтожения молекул ДНК из окружающей среды, которые могли бы попасть в гель при его приготовлении. Синтез кДНК на молекуле иРНК может быть осуществлн от дельно или в геле. Для детекции мишеней используется универсальная реа кционная смесь с ДНК-полимеразой (Рис. 5).

Рис. 5. Схема проведения ПЦР-ММК (рис. и цит. по: А.Б. Четверин, Е.В.

Четверина, 2002).

1. а – лунка с высушенным полиакриламидным гелем;

2. б – пропитывание геля реакционным раствором, содержащим, в том числе, исследуемый образец и специфические праймеры;

3. в – инкубация геля в течение 30 мин при 55-65° С – условия обратной транскрипции, с последующими 40 циклами ПЦР;

4. г – промакивание геля нейлоновой мембраной – перенос колоний;

5. д – гибридизация мембраны с радиоактивно меченым зондом, специ фичным к искомой мишени;

получение радиоавтографа мембраны.

Как пишут авторы метода, «ММК позволяет преодолеть все проблемы стандартной ПЦР и впервые сделать ПЦР-диагностику действительно чувстви тельной, количественной и наджной» (2003).

Основные отличия ПЦР-ММК от стандартной ПЦР 1) Реакционную смесь для размножения мишеней – ДНК и РНК, вносят не в жидкость в специальной пробирке, а в лунку с пленкой высушенного поли акриламидного геля. В результате чего «потомство каждой молекулы образует колонию, а не распространяется по реакционному объму».

2) Каждая колония является клоном молекул, а число колоний прямо ука зывает «на число молекул ДНК или РНК, присутствующих в геле до начала ре акции».

3) ПЦР-ММК фактически дешевле стандартной ПЦР: а) «многократно» сокращает число проб для проведения анализа;

б) расход реактивов «почти та кой же»: объм геля – 65 мкл, в стандартной ПЦР объм реакционной смеси мкл.

Для выполнения ПЦР-метода, а тем более ПЦР-ММК пригодны любая ткань, биологическая жидкость и выделения человека. По генным маркерам эти методы позволяют выявлять минимальное число раковых клеток при раке кро ви и лимфатической системы, так и при солидном раке. Это крайне важно для ранней диагностики раковых клеток первичного очага рака или метастазов, а также для выявления остатков раковых клеток после лечения рецидива рака.

Плазма крови от пациента является универсальным источником генных маркеров из раковых клеток любого типа клетки, т.е. любой локализации рака у пациента.

Повышение содержания генов-маркеров из раковых клеток в плазме кро ви при раке установлено многими исследователями.

Проф. Д. Сидрански (1994) считает, что ПЦР позволила совершить «гене тическую революцию в ранней диагностике рака», подчркивая следующее:

- рак начинается из одной клетки, утратившей зависимость деления от за щитных механизмов организма;

- в такой клетке возникают изменения генов, что вызывает бесконтроль ное е деление с образованием из не клона клеток – рак;

- особенность лечения человека от рака в том, что эффект лечения возмо жен лишь до образования его метастазов;

- рак опасен из-за того, что отдельные его клетки отрываются от клона и, продолжая делиться, проникают в окружающие здоровые ткани, а другие обра зуют метастазы в отдалнных органах. Это причина гибели людей от рака;

- ПЦР позволяет в биологических жидкостях от больного выявлять самые начальные изменения в структуре ДНК клеток, а в сущности предрак;

- с помощью ПЦР удатся в жидкостях обнаружить даже одну дефектную или мутантную молекулу ДНК из раковых клеток среди многих других молекул в исследуемой жидкости;

чувствительность этого метода до 100%.

- ПЦР – это универсальный метод для ранней диагностики раковых кле ток любой локализации рака у пациента. Им можно выявить тех лиц, которых необходимо обследовать детально.

Проф. А.С. Белохвостов (2000) впервые в двух работах изложил основы ранней диагностике раковых клеток с помощью ПЦР-метода;

мы излагаем их кратко:

1) бессимптомный рост рака от одной клетки до очага в 2 мм в ткани про должается долгие годы или даже десятилетия;

2) такой очаг из раковых клеток до 2 мм в диаметре дремлет в тканях до тех пор, пока не произойдут изменения в генах его клеток, вызывающих ангио генез и лимфангиогенез. С этого момента начинается рост и распространение его клеток через кровь и лимфу по организму пациента – рак становится болез нью всего организма.

3) ещ недавно диагностировать рак размером 2 мм, особенно если он на ходился во внутренних органах, было почти не возможным. И только метод ПЦР позволил определять очень малое число дефектных генов, иногда даже одну молекулу дефектного гена из раковой клетки.

Раковые клетки содержат эпимутации основных свойств и мутации или эпимутации генов-супрессоров. Такие изменения являются генетической мет кой, т.е. маркером раковой клетки.

Ген-супрессор белка р53. В норме он сдерживает деление «генетически дефектных клеток и заставляет их запускать апоптоз».

Мутации в этом гене обнаруживаются в половине случаев раковой клетки разного типа;

эти поломки в гене «позволяют генетически дефектной клетке избежать апоптоза».

Ген-супрессор белка p16. Он в норме подавляет деление дефектной клет ки «в другой точке клеточного цикла», но инактивирован из-за метилирования его промотора почти у половины раковых клеток разного типа.

Ген k-ras – мутантная форма одного из ключевых нормальных генов сти муляторов деления клетки. Есть ещ ряд генов с высокой частотой дефектов в раковой клетке. Для ранней диагностики раковой клетки важна регистрация эпимутаций и мутаций в нескольких генах.

ДНК из раковых клеток попадает «в межклеточную жидкость и далее в кровоток» после разрушения раковых клеток в тканях.

В плазме крови у таких пациентов будут, пишет автор, находиться фра гменты ДНК из раковых клеток. Обнаружить их долго не удавалось, пока не появился ПЦР-метод.

По расчтам проф. А.С. Белохвостова и первый его опыт применения это го метода показал возможность диагностировать в любой ткани рак размером с 2-х мм в диаметре.

Автор подчркивает, что диагностика раковых клеток в организме паци ента по их генам-маркерам в плазме крови ПЦР-методом, позволяет осу ществлять слежение за эффектом лечения рака. Он рекомендует сроки взятия для этого плазмы крови: до операции, после операции иссечения рака и путей лимфооттока, а также спустя не ранее, чем через 2 недели после лечения, и по сле химиотерапии.

Если, маркер, например ген белка р53, выявлен в клетках и в плазме до операции и/или после окончания химиотерапии, это означает, что раковых кле ток «или совсем не осталось в организме или их незначительная часть находит ся в покоящемся состоянии». В любом случае, рецидив или метастазы в бли жайшие месяцы маловероятны.

«Если же мутантный ген или измененный в экспрессии ген продолжает выявляться в ДНК плазмы крови или его количество нарастает, это указывает на рецидив рака или метастазы. Это требует изменения схемы лечения – добав ления или замены химиопрепаратов, средств биотерапии и т.д.». Такие анализы учный рекомендует выполнить несколько дней, а «значение ответа – ценою в жизнь».

Мы видим, что учные сконцентрировали свое внимание на поиске в плазме и других биологических жидкостях генов-маркеров из ядер раковых клеток, а это нелегкая задача (В.П. Шелепов и соавт., 1997).

Оказалось, что мутации могут быть и в митохондриях – органеллах, рас положенных в цитоплазме клетки и обнаружить их в раковых клетках до статочно просто. Это открытие сделано проф. Д. Сидрански (2000).

Гены, превращающие нормальную клетку в раковую клетку, часто нахо дятся в ядре клетки в виде одной или многих копий. Но, оказалось, что дефекты и изменения могут возникать не только в них, но и в генах митохондрий рако вой клетки.

В каждой клетке, в том числе и раковой, имеется несколько сот митохон дрий. Митохондрии – это самореплицирующиеся органеллы.

В каждой из них есть своя ДНК, в ней несколько генов, обеспечивающих синтез белков митохондрий. Количество копий такой ДНК может быть от од ной до десяти на митохондрию.

Гены ДНК митохондрий в раковых клетках подвергаются «усиленному воздействию токсических продуктов кислорода». Это вызывает «накопление большого числа изменений в генах митохондрий, чем в генах ядра раковой клетки».

В результате мутации ряда генов митохондрий выявляются в более чем половине случаев раковой клетки разного типа.

Другой важной особенностью в раковой клетке является «вытеснение ми тохондрий с нормальными генами путм преимущественного размножения ми тохондрий с мутантной ДНК». Это приводит к тому, что «все митохондрии в раковой клетке становятся потомками митохондрий с мутантными генами е ДНК».

Отсюда: если «в гене, находящемся в ДНК ядра клетки может быть лишь одна или две копии мутантного гена, то в митохондриях одной раковой клетки может находиться от нескольких сотен до десяти тысяч копий мутантного гена митохондриальной ДНК».

Из этого, проф. А.С. Белохвостов (2000) делает вывод: «если раковые клетки обнаруживать по мутантным генам митохондрий в плазме крови и в других биологических средах пациента, чувствительность ПЦР-теста можно увеличивать ещ в сотни раз по сравнению с применяемым сейчас методом вы явления маркеров измененных генов из ДНК ядра раковой клетки».

Сейчас, пишет проф. А.С. Белохвостов, возможным пределом размера обнаруживаемого рака считается очаг в 2-3 мм в диаметре, то при применении ПЦР для поиска в плазме крови мутантных генов митохондриальной ДНК, из раковых клеток, по-видимому, можно будет определять очаг рака в ткани в мм в диаметре.

В случае успеха такого подхода к оценке генов-маркеров раковых клеток ядерного генеза будут добавлены гены-маркеры из ДНК митохондрий раковых клеток.

О повышении выявляемости раковых клеток автор дат пояснения. Он говорит, что «мутации какого-либо гена раковой клетки, взятого в качестве маркера, встречаются только у части пациентов».

Изменения в экспрессии генов свойств нормальной клетки – главная при чина канцерогенеза.

Метилирование CpG-островков в промоторе гена выключает ген, а деме тилирование – включает ген. При этом изменений структуры в последователь ности оснований гена не происходит. Это обозначают термином – эпимутация, о чм мы уже писали в разделе канцерогенеза.

Метилирование или деметилирование промотора генов – это маркеры ра ковой клетки. Для анализа статуса метилирования генов раковой клетки часто используют МС-ПЦР – метилспецифическая полимеразная цепная реакция.

Материалом для этого является ДНК раковых клеток в образцах плазмы крови и других биологических жидкостей, фрагменты из опухоли от пациента.

Диагностика раковых клеток по их эпигенетическим изменениям в срав нении с нормальной клеткой – это новое направление в ранней диагностике ра ковых клеток. Оно открывает новые пути для создания новых лекарственных средств и методов лечения от рака.

В целях изучения канцерогенеза и других проблем учные используя ме тоды – ПЦР-ММК, МС-ПЦР, микрочипы и др. занялись изучением профилей экспрессии «изолированных клеток и клеточных культур».

1. Фенотип стволовой клетки. Цель – знать типичный профиль экспрес сии генов в эмбриональных и региональных стволовых клетках. Оказалось, что в этих клетках набор экспрессируемых генов «ограничен». Это важно для по нимания явления «стволовости».

2. Сравнение экспрессии генов в эмбриональных стволовых и раковых клетках. Обнаружено, что многие раковые клетки экспрессируют белки маркеры эмбриональных стволовых клеток. Например, Oct-4, Nanog и hTERT, что указывает на сходство биологии эмбриональных стволовых «и, по крайней мере, части раковых клеток».

3. Сравнение профилей экспрессии региональных стволовых и раковых клеток. Профиль экспрессии некоторых типов раковой клетки сходен с профи лем экспрессии региональных стволовых клеток той ткани, из которой возника ет раковая клетка, это указывает на то, что «именно региональные стволовые клетки в этих тканях способны претерпевать злокачественное перерождение» (К.Н. Ярыгин, Е.Е. Егоров, И.Б. Чеглаков и соавт., 2006).

7.2. Биочип или микроматрица – устройство для ранней диагностики раковых клеток, слежения за лечением рака и контроля излечения Биочип – это организованное размещение молекул ДНК или белка на специальном носителе – «платформе».

Платформа представляет из себя пластинку площадью всего 1 см2 или чуть больше. Она сделана из стекла или пластика, либо из кремния. На ней в строго определнном порядке может быть размещено множество молекул ДНК или белка. Отсюда и присутствие в термине слова – «микро».

На биочипе можно проводить анализ молекул различных веществ. Для этого на нм закрепляют «узнающие» молекулы. Каждую из таких молекул обозначают термином – «молекула-зонд», а каждую из исследуемых молекул – «молекула-проба».

Молекула-зонд на биочипе определяется самим исследователем, т.е. он планирует, какую молекулу нужно искать среди молекул в исследуемом мате риале – в жидкости и т.д. Если на микрочипе исследуется ДНК – это ДНК-чип, если молекула белка – белковый чип.

Как фиксируются молекулы-зонды на биочипе?

Во многих странах молекулы-зонды прикрепляют прямо к стеклянной пластинке, т.е. к подложке при помощи лазеров. В нашей стране молекулы зонды размещаются в ячейки из геля, диаметром менее 100 микрон каждая, ячейки фиксированы к пластинке в процессе изготовления микрочипа. Коли чество ячеек на чипе достигает уже несколько тысяч.

В ячейках молекулы-зонды химически привязаны и находятся в функци онально активном состоянии.

Так как ячейки заполнены гелем трехмерной структуры, то они удержи вают большее количество молекул-зондов, нежели чипы, в которых молекулы зонды просто прикреплены к пластинке. Важно и то, что химическая реакция между молекулой-зондом и вносимой в ячейку из геля молекулы-пробы, проте кает как и в жидкостях, а значит, как и в живом организме.

Изучение генома и протеома каждого типа клетки в норме и при любой болезни позволит выяснить – какой ген или гены вызывают ту или иную бо лезнь.

На ДНК-чипе выясняется причина возникновения болезни: дефекты в структуре гена или генов, или изменения активности гена при нормальной его структуре.

На белковом чипе определяются последствия «поломок» в гене по из менениям его продукта – белков в клетке. Изменения в гене клетки или белке – это их метка или маркер (от англ. mark – знак, метка).

Отсюда: ген с меткой – это ген-маркер, а белок с меткой – это белок маркер. Эти маркеры позволяют обнаруживать у пациента дефектную или больную клетку, характерную для конкретной болезни, в том числе и раковую стволовую клетку. При диагностике болезни ген-маркер и белок-маркер для контроля сравнивают с нормальным геном клетки и его продуктом – белками.

Ясно, что на ДНК-чипе молекулой-зондом является ген-маркер, а для контроля в отдельной ячейке – нормальный ген, в белковом микрочипе в ка честве молекулы-зонда может быть или антитело, или антиген.

Способы изготовления биочипов 1. Молекулы ДНК или белка предварительно синтезируют, а затем раз мещают на матрице. Недостаток этого метода: невысокая плотность молекулы зонда на матрице – до 1000 молекул и трудомкий процесс их синтеза.

Копии гена-маркера можно получить ПЦР-ММК методом, такого метода для копий белка-маркера нет. Его копии можно создавать встраиванием иРНК гена белка-маркера в бактерию: E. coli или в клетки дрожжей.

2. Для ДНК-чипов синтез олигонуклеотидов производят непосредственно на матрице. Такие чипы обладают гораздо большей плотностью молекул-зон дов.

3. Нанесение олигонуклеотидов в строго определнное место матрицы струйным принтером.

В нашей стране биочипы – ДНК-чип и белковый чип готовят по первому способу.

Биочип – новейшее устройство для медицины XXI века. По молекулам маркерам он позволяет:

1) диагностировать любую болезнь: до е начала или в самом е начале;

2) находить в организме тот или иной вирус, бактерии и раковые клетки;

3) белковым чипом можно находить лекарства среди низкомолекулярных соединений в целом ряде анализируемых материалов;

4) решение этих задач на биочипах можно сделать за считанные часы, а не дни и т.д.

Принцип действия биочипов и этапы анализа 1. ДНК-чип.

Мы знаем, что молекула ДНК состоит из двух комплементарных цепей.

Основа каждой цепи – это последовательность из четырх азотистых осно ваний: аденин (А), гуанин (Г), тимин (Г) и цитозин (Ц).

При этом последовательность оснований одной цепи определяет по следовательность оснований в другой: А-Т и Г-Ц. Когда между этими ком плементарными основаниями спонтанно образуются водородные связи, две це пи соединяются, т.е. гибридизуются в двойную спираль и удерживают цепи вместе. Именно на способности комплементарных оснований связываться друг с другом: А с Т, а Г с Ц основан принцип действия ДНК-чипа.

Этапы анализа с помощью ДНК-чипа 1. В ячейках чипа фиксированы копии известного гена-маркера в виде одной цепи этого гена, т.е. его «половинки» – кДНК.

2. Из плазмы крови от пациента выделяется копия гена-маркера, т.е.

иРНК.

3. На молекуле иРНК с помощью фермента обратной транскриптазы син тезируют другую цепь гена-маркера, т.е. вторую его «половинку» – кДНК.

ПЦР-ММК размножают эту кДНК – это молекулы-пробы, и их метят флуорес центным красителем.

4. Роботом помещают молекулы-пробы в определнные ячейки на чипе с копией генов-маркеров раковой стволовой клетки.

Если кДНК генов из образца плазмы комплементарна с кДНК в соответ ствующих ячейках, то между ними произойдт гибридизация, и такие ячейки начнут светиться. Чип сканируют лазером, следя за интенсивностью сигнала флуоресценции в каждой ячейке. То есть гены-маркеры в плазме есть, а значит, в организме пациента есть раковые стволовые клетки.

Если нет гибридизации между этими молекулами, значит, нет гена маркера раковой стволовой клетки в этом образце плазмы.

Когда имеется ген с мутацией, тогда будет гибридизация его кДНК на чи пе с кДНК молекулы-зонда, имеющей эту мутацию. Если это ген-супрессор wt 53, то это также может указывать на наличие в организме пациента раковой стволовой клетки или клеток.

Раковая клетка возникает из стволовой клетки ткани из-за включения в ней генов фетальных белков. Поэтому в молекулах-пробах плазмы пациента будут кДНК этих генов и отсутствие их в контроле.

Чем меньше в образце плазмы от пациента титр эпимутантных и мутант ных генов-маркеров, тем меньше раковых клеток в его организме.

Выявление раковых клеток в образце плазмы крови или других биологи ческих жидкостей от пациента – моча, слюна, слзная жидкость и др. по генам маркерам, дат возможность поставить диагноз рака, а по генам-маркерам свойства инвазии раковой клетки – микрометастазы рака. И это задолго до об наружения их стандартными методами – УЗИ, рентгенография, компьютерная томография и др.

Биочипом по генам-маркерам можно выявлять угрозу болезни. Так, если обнаружены гены-маркеры, но ещ нет их продуктов – белков в клетке, то это выявление предболезни. По отношению к раку – это предраковые клетки. Так как в этом случае биочип позволяет выявить только вероятность болезни, то та кой чип пока не подвергается сертификации.

Плазма крови пациента – это главный резервуар, куда проникают гены маркеры из погибающих дефектных или больных клеток при конкретной бо лезни из различных органов, в том числе из раковых клеток. Такие клетки в ор ганизме могут погибать за счет некроза и апоптоза, а их гены через межклеточ ную жидкость затем проникают в кровь.

Низкий титр генов-маркеров в плазме крови пациента по анализу на ДНК чипе и отсутствии их продукта – белков, может означать предболезнь, а при на личии их – болезнь. В таком же смысле это касается и рака. Это могло бы озна чать раннюю диагностику рака – II е уровень.

2. Белковый чип.

Строение чипа для анализа белков то же, что и у ДНК-чипов. Лишь те чипы, на которых проходит ферментативная реакция, имеют более редкое рас положение ячеек, а те, на которых идт ДНК-реакция, – более частое.

Белки-маркеры – это продукт «поломок» гена или генов, они превращают нормальную клетку в дефектную или больную клетку при конкретной болезни.

Эти белки появляются на поверхности клеток и являются белками-антигенами и для каждой болезни они свои.

На раковой стволовой клетке появляются фетальные белки и белки рецепторы, которых нет на нормальной стволовой клетке. Являются ли они белками-антигенами – вопрос не решн.

В белковом чипе в качестве молекулы-зонда, т.е. белка-маркера дефект ной или больной клетки может быть белок-антиген, тогда в сыворотке от паци ента определяют антитела к нему. Если молекулой-зондом берется антитело, то в сыворотке крови от пациента ищут белок-антиген.

В связи с расшифровкой генома человека требуется анализ функций ог ромного количества белков в клетках разного типа, в том числе ранее неизвест ных. Тысячи белков могут быть фиксированы в разных ячейках микрочипа и одновременно анализированы на способность: связывать известный лиганд, ка тализировать ту или иную ферментативную реакцию, взаимодействовать с ан тителами, низкомолекулярными соединениями и др.

В раковой клетке важно изучать кроме белков-маркеров, белков рецепторов и антител к ним, белки свойства инвазии, фактор роста эндотелия сосудов-1 и белок-рецептор к нему на поверхности гемопоэтической клетки и др.

Принцип действия белкового чипа Он также основан на комплементарности участвующих молекул, но бел ковых.

1. Антиген со своим антителом. Антиген – это любое вещество, в состав которого обычно входит какой-то белок, способный вызывать иммунную реак цию.

Антитело – это молекула белка, секретируемая одной из клеток иммун ной системы. Форма этой молекулы и распределение электрического заряда по е поверхности делают е способной связывать антиген, комплементарный ей по форме и распределению заряда.

Впервые ещ в 1942 г. нобелевский лауреат Л. Полинг и его коллеги вы двинули верный постулат, что трехмерная структура антигена и его антитела комплементарны и, таким образом, «несут ответственность» за образование комплекса – антиген–антитело.

2. Субстрат со своим ферментом. На основе гипотезы топохимического соответствия специфичность действия фермента связана с узнаванием той час ти субстрата, которая не изменяется при катализе. Между этой частью субстра та и субстратным центром фермента возникают точечные контакты и водород ные связи.

3. Белок с низкомолекулярным соединением. Для ингибирования белка необходима связь между ними – комплементарной поверхности соединения с активными участками молекулы белка, 4. Фермент с низкомолекулярным соединением. Ферменты и другие бел ки создают все свойства раковой клетки, поэтому они являются основными ми шенями для лекарств. Для блокады фермента низкомолекулярным соединением также необходима между ними комплементарность: поверхность молекулы со единения при этом должна быть копией поверхности участка субстрата, ко торая не изменяется при катализе.

Этапы анализа с помощью белкового чипа 1. В ячейках чипа фиксирован известный белок-антитело к белку, кото рый создает дефектную или больную клетку конкретной болезни. Искомый бе лок – это белок-маркер.

2. Из сыворотки крови от пациента бертся образец сыворотки для анали за. В образец добавляют флуоресцентный краситель – каждая молекула белка маркера получает это вещество.

3. С помощью робота капли сыворотки из образца помещают в опреде лнные ячейки чипа. Молекулы-зонды ищут комплементарные им молекулы среди молекул-проб. Если есть такая молекула, то она связывается с молеку лой-зондом в ячейке чипа;

между ними происходит химическая реакция, и она начинает светиться.

4. Ячейки, в которых появилось яркое свечение, укажут на присутствие искомого белка белка-маркера. Так как этот белок-маркер из дефектной или больной клетки при конкретной болезни, это укажет на начало у пациента этой болезни. Точно также выявляют присутствие в организме пациента раковой клетки(-ок) по их белкам-маркерам.

Если в ячейках чипа фиксирован белок-антиген, тогда в сыворотке крови пациента ищут антитела к белку-маркеру. Если в сыворотке окажутся антитела к белку-маркеру, это будет указывать на наличие в организме пациента раковых клеток, т.е. пациент болен. А по белкам-маркерам свойства инвазии раковой клетки, например, по наличию белка Mts1 и других, можно регистрировать где то в организме у пациента микрометастазы раковых клеток.

Мы уже знаем, что белки, которые образуются в раковых клетках, но от сутствуют в нормальных, это белки-маркеры или антигены. Наличие таких бе лков – признак того, что ген, вызывающий перерождение нормальной клетки в раковую, начал свою разрушительную работу. Выявление раковой клетки(-ок) по белкам-маркерам позволяет поставить диагноз рака или его микрометастазов задолго до выявления его симптомов у пациента. Титр белка-маркера в сыво ротке крови пациента определяет количество раковых клеток в его организме.

Низкий титр белков-маркеров из раковых клеток в сыворотке крови, а также в других жидкостях пациента – признак малого количества раковых клеток в ор ганизме пациента. Это могло бы стать ранней диагностикой рака – II е уро вень.

Итак, в XXI веке по мере выявления генов-маркеров и белков-маркеров, вызывающих конкретную болезнь, диагностика е, в том числе и рака, станет ранней, т.е. на двух уровнях: 1) «до начала» – по генам-маркерам и 2) «в самом начале» – по белкам-маркерам.

Гены-маркеры и белки-маркеры в дефектной или больной клетке – это цели или мишени для новых лекарств. На их основе будут создаваться ле карства и другие средства, в том числе – вакцины. За счт комплементарности к молекулам-мишеням, лекарства будут действовать избирательно, не повреждая нормальные клетки.

Врач, действуя на гены-маркеры болезни, сможет е предотвратить, а воздействиями на белки-маркеры клеток е можно будет излечить в самом «за родыше».

Этими двумя путями врач получит, так сказать, полную власть над любой болезнью на клеточном уровне.

Поиск генов-маркеров и белков-маркеров в различных средах организма пациента быстро и точно можно выполнять на биочипах, а гены-маркеры, кро ме этого, можно выявлять с помощью точнейших методов: ПЦР-ММК и МС ПЦР. Это будет означать революцию в медицине.

Учные выявят гены-маркеры и белки-маркеры, вызывающие конкрет ную болезнь, в том числе и возникновение раковой клетки. Тогда станет воз можным разработать для ранней диагностики любой болезни минимум набо ров: генов-маркеров и белков-маркеров. Они будут дополняться и уточняться по мере получения новых знаний. Это будет генный и белковый «профили» бо лезни, и которые будут перенесены на биочипы.

Тестирование человека на маркеры определенной болезни с помощью ДНК-чипа и белкового чипа имеет несколько преимуществ.

Отрицательный результат – принест человеку радость и может избавить его от обследования стандартными методами: ультразвуковое исследование, рентгенография и др.

Положительный результат – даст человеку возможность, а также время на то, чтобы принять меры для снижения риска возникновения болезни, или при е начале – начать соответствующее лечение.

Особое значение имеет ранняя диагностика рака. Это связано с тем, что, во-первых, причина рака – раковая клетка, а она из клетки своего организма- хозяина и, во-вторых, вплоть до недавнего времени не было известно абсолют ных отличий раковой клетки от нормальной клетки.

До сих пор считается, что для каждого типа раковой клетки характерны «свои» гены и белки. Но геном в клетке каждого типа – один и тот же. Если принять, что из каждого типа клетки раковая клетка – «своя», тогда почему свойства раковой клетки любого типа – одинаковые?

Тип клетки создается репрессией одних генов – из-за метилирования и экспрессией других генов – за счет деметилирования их промотора.

Теперь также доказано, что клетка любого типа становится раковой за счет дерепрессии в ней генов фетальных белков. То есть формирование типа клетки и возникновение раковой клетки из нормальной клетки – это независи мые друг от друга процессы. Из этих двух фактов можно допустить, что общие гены-маркеры и их продукт – белки для любого типа раковой стволовой клетки должны быть.

Общими генами и их продуктами – белками могут стать: ген и его фер мент – теломераза, ген и белок под кодовым обозначением «5Т4», ген oct-4 и белок Oct-4, ген Nanog и белок, ген mts 1 и белок Mts 1, ген остеопонтин и бе лок и др.

Если это подтвердится, то это станет настоящим прорывом в решении многих, если не всех, проблем рака:

- ранняя и точная диагностика раковой стволовой клетки любого типа на основе общего гена-маркера и его продукта – белка-маркера;

- универсальные лекарства и средства, в том числе вакцина, против рако вой стволовой клетки и е метастазов.

7.3. ДНК-чип для диагностики раковых клеток первичной опухоли и микрометастазов по плазме крови от пациента Так как диссеминация раковых клеток начинается с узелка из этих клеток в 1-2 мм в диаметре, то излечение рака возможно лишь на пути его ранней ди агностики.

В XXI в. станут известными основные гены-маркеры и белки-маркеры, превращающие нормальную клетку в раковую. По ним будет проводиться ран няя диагностика раковых клеток.

Ранняя диагностика рака – это диагностика его начала. Ещ важнее диаг ностика рака до его начала.

«До начала» – это клетка, в которой уже эпимутации генов свойств клет ки и мутации или эпимутации генов-супрессоров и генов репарации ДНК. Это предраковая клетка. Она морфологическими методами исследования не отлича ется от нормальной.

«Начало» – это первая раковая клетка, из которой затем образуется е по томство, т.е. рак.

Изменения в генах и эпимутации – это метки или маркеры раковых кле ток. По ним отличают раковые клетки от нормальных.

В тканях организма часть раковых клеток погибает от апоптоза или нек роза, а их мутантные и эпимутантные гены через лимфу попадают в кровь. За счт мозаичности капилляров опухоли, начиная с узелка раковых клеток в 1- мм в диаметре, часть раковых клеток из стенки сосуда легко попадает в кровь.

Какие-то из клеток остаются живыми в крови, а другие погибают, но оставляют свой след – фрагменты генов с мутациями и эпимутациями.

Так как ДНК вне клеток в нормальных условиях нет, то обнаружение в плазме крови или других жидкостях от пациента – моча, слюна, слзная жид кость и др. генов-маркеров, равнозначно обнаружению их носителя, т.е. рако вых клеток.

Кровь пациента – главный резервуар, куда попадает ДНК из раковых кле ток разных тканей организма.

В XXI в. ДНК-чип по генам-маркерам позволит обнаруживать дефектные клетки конкретной болезни, в том числе и рака. За короткое время – часы, а не дни, это устройство позволит найти любые и все изменения в генах раковой клетки или клеток задолго до симптомов рака.

В предыдущем разделе мы обсуждали биочипы, здесь мы выделим цели ДНК-чипа.

Ген – это фрагмент молекулы ДНК из двух цепей нуклеотидов;

основной частью нуклеотида является какое-то одно из четырех оснований: А, Т, Г, Ц.

Цепи нуклеотидов гена удерживаются вместе за счт комплементарности пар оснований: А с Т, Г с Ц. Их связывает друг с другом спонтанный процесс образования водородных связей между ними. Это явление – образования пар оснований, называется гибридизацией. На этом явлении основан принцип дей ствия ДНК-чипа.

Для этого молекулы-пробы выделяют из раковой клетки или из образца плазмы крови от пациента. Их метят флуоресцентным красителем и с помощью робота вносят в ячейки чипа.

Молекулы-зонды на чипе способны вылавливать из молекул-проб только комплементарную себе молекулу, т.е. вторую цепь нуклеотидов определнного гена.

Если среди молекул-проб такая молекула окажется, то она гибридизуется с молекулой-зондом. Это можно наблюдать: ячейка начинает светиться – тем сильнее, чем больше будет гибридизованных молекул. В этом суть принципа «работы» этого чипа.

Но для обнаружения присутствия в организме раковой клетки или клеток в молекулах-зондах на чипе должны содержаться все возможные эпимутации и мутации определенного гена в дополнение к нормальной копии этого гена на чипе.

Впервые в практике явление гибридизации пар оснований применил Эд.

Саузерн в 1975 г. Он использовал меченую молекулу-пробу для определения комплементарной цепи нуклеотидов гена среди молекул-зондов, фиксиро ванных на чипе. Это был прототип ДНК-чипа. В конце 1980-х гг. наш учный – акад. А.Д. Мирзабеков идею гибридизации молекул реализовал в нашей стране в создании ДНК-чипа.

Для каких основных целей можно использовать ДНК-чип?

1. Для определения, какие гены в нормальной клетке каждого типа ак тивны, а какие «молчат».

2. Для сравнения активности генов в нормальной клетке данного типа с активностью генов в раковой клетке этого типа. Это даст возможность выявить гены-причины раковой клетки.

3. Выяснять, зависят ли изменения генов раковой клетки – дефекты их или изменения их экспрессии, от типа клетка.

4. Определить, изменения каких генов и в чм встречаются в раковой клетке чаще других.

5. Контроль лечения рака и его излечения по исчезновению в плазме кро ви от пациента генов-маркеров раковой клетки.

Виды мутаций 1. Замена – это замена одной пары оснований в молекуле гена на другую.

Пример: А-Т на Г-Ц.

2. Вставка – это дополнительная пара оснований или даже несколько их в ген. Пример: новая пара оснований А-Т в ген.

3. Делеция – выпадение одной или нескольких пар оснований в гене.

Пример: Г-Ц в последовательности оснований где-то отсутствует.

Мутация в гене выразится в его продукте, т.е. в его белках – изменена по следовательность аминокислот в белке. Если этот ген в норме регулирует деле ние клетки, то в случае мутации в этом гене такая клетка может стать раковой.

Раковая клетка может возникать из нормальной клетки не только от эпи мутаций и мутаций в ряде генов, но и в результате чрезмерной активности гена.

Это приводит к избытку в клетке числа копий этого гена, т.е. иРНК, а значит, нормального по строению, но избытка этого белка.

Пример: ген c-myc во многих типах клетки активирует РНК-полимеразу III типа в 12-15 раз по сравнению с обычной, и этим ведт к превращению нор мальной клетки в раковую.

В каждом случае рака у пациента необходимо определять «молекулярные причины» свойств его раковых клеток: изменения экспрессии в них генов, в том числе генов инвазии, мутации и эпимутации в генах-супрессорах и репара ции ДНК.

Как найти мутацию гена с помощью ДНК-чипа?

Для выявления в гене какого-либо вида мутации, в молекулы-зонды надо внести все виды мутаций этого гена во время синтеза молекул. После этого их размещают в ячейках ДНК-чипа.

Из клеток или здесь образца плазмы крови пациента готовится смесь ДНК-пробы. Каждую из них молекулу метят флуоресцентным красителем и ро ботом вносят в ячейки известного гена.

Если в ячейке произойдт гибридизация молекулы-зонда с молекулой пробой, то лунка начнт светиться. Из этого будет вывод: в гене из образца плазмы есть эпимутация или мутация. А это означает, что в организме пациента есть раковая клетка или клетки.

Зная, какой ген в этой ячейке и какая в нм мутация или эпимутация, а также сравнив его с нормальной копией гена в контрольной ячейке на чипе, мы узнаем какой измененный ген в плазме крови пациента.

Измерение степени свечения в гелевой лунке укажет нам на титр мутант ного или с эпимутацией гена в образце плазмы крови: чем меньше титр, тем меньше раковых клеток в организме пациента.

Как определить экспрессию гена с помощью ДНК-чипа?

Геном человека расшифрован и главная задача учных – как можно ско рее выяснить функции каждого гена в клетке каждого типа и для организма в целом.

Для определения активности гена в клетке, в лунках чипа фиксируются одноцепочные молекулы ДНК, т.е. «половинки» генов. На чипе размером 1 см можно расположить до 10 тысяч генов.

Как работает чип, мы уже знаем. При гибридизации со второй цепью дан ного гена, т.е. со второй его «половинкой», образуется двухцепочная ДНК.

Она отличается от одноцепочных участков тем, что способна «цеплять» половинки молекулы гена с флуоресцентным красителем, светящимся в специ фичной для него области спектра. Так происходит высвечивание активных ге нов в клетке.

Откуда бертся вторая цепь гена? Е можно получить из исследуемой клетки, которая в разные промежутки своей жизни и функций включает и ра зные «наборы» генов в свом геноме. Для нашей цели е получают из плазмы крови от пациента, куда попадают фрагменты генов из погибших раковых кле ток.

Известно, что активные гены синтезируют на своей матрице молекулы информационной РНК, т.е. иРНК. Затем эти молекулы используют для синтеза белков.

С помощью фермента «обратной транскриптазы» из вирусов рака, с иРНК получают копию в виде одноцепочной ДНК, т.е. вторую «половинку» гена – кДНК.

Роботом в ячейки чипа переносят молекулы-пробы, т.е. кДНК. Если моле кула-зонд комплементарна кДНК, то между ними происходит гибридизация с образованием двухцепочного гена. Такая ячейка или ячейки на чипе начнут светиться. Чем больше степень свечения в гелевой ячейке, тем больше титр этого гена в плазме от пациента, а значит, больше раковых клеток.

Обнаружение раковой клетки или клеток в образце плазмы крови от па циента по маркерам: эпимутации и мутации генов или амплификация генов, да т возможность выявлять рак у пациента в самом его начале и даже до его на чала, т.е. задолго до появления его симптомов. Низкий титр генов-маркеров в плазме крови пациента при анализе на ДНК-чипе должен означать ми нимальное количество предраковых и/или раковых клеток в его организме.

ДНК-чипы позволяют получить «профили» экспрессии генов в каждом типе нормальной или дефектной клетках. С их помощью уже удалось выяснить, что для нормальных и раковых клеток эти профили различны.

Превращение нормальной клетки любого типа в раковую после действия на не какого-либо канцерогена. Но когда, и на какую клетку и где в организме человека подействовал канцероген или продукты окисления кислорода, что, может быть, чаще всего, нам всегда неизвестно.

Но при этом раковые клетки обладают одинаковыми зловещими свойст вами вне зависимости от типа клетки и от класса канцерогена, вызвавшего е образование. Это и заставляет думать, что раковая клетка любого типа может возникать от одних и тех же изменений в генах.

Если это подтвердится, тогда легче создать минимальный набор генов маркеров, вызывающих превращение нормальной клетки любого типа в рако вую клетку. Гены-маркеры разместят в качестве молекул-зондов в ячейках ДНК-чипа и фиксируют в них. В будущем каждый человек может носить на ру ке такой чип того же крохотного размера. Чип будет дополнен микросхемой для анализа его информации.

Постоянные, но не редкие в течение года анализы плазмы его крови и других биологических жидкостей на эпимутации и другие изменения генов это го набора, позволили бы выявлять самое «преддверие» рака, т.е. его «начало», а ещ надежнее – «до начала» его.

При выявлении такого «преддверия» рака, на наш взгляд, следовало бы начать профилактическое лечение такого пациента для уничтожения этих пер вых предраковых и/или раковых клеток в организме пациента. Ряд методов для этой цели уже разработан, но в клиническую практику они лишь начинают «входить».

Выбор препаратов и средств должен определяться молекулярными при чинами образования раковой клетки у конкретного пациента. Эти причины бу дут мишенями для лекарств и средств. Среди них, могли бы быть: монокло нальные антитела, нормальные копии генов-супрессоров и генов апоптоза с помощью модифицированного вируса, в будущем – мТКР с лекарственным ве ществом, малые интерферирующие РНК для разрушения иРНК генов-причин и другие. Это важно, так как место образования таких клеток в организме паци ента на этапах – «начало» и тем более – «до начала», нельзя найти никакими методами, кроме методов на основе генов-маркеров и белков-маркеров раковых клеток.

7.4. Белковый чип для диагностики раковых клеток первичной опу холи и микрометастазов по сыворотке крови пациента Второй путь ранней диагностики раковых клеток по белкам на поверхно сти раковых клеток.

Раковая клетка отличается от нормальной клетки того же типа по составу синтезируемых ею белков. Эти белки – продукт «поломок» в генетическом ма териале нормальной клетки, превратившие е в раковую. Наличие их – признак того, что ген или гены, вызывающий перерождение нормальной клетки, начал свою разрушительную работу. Так как эти белки из раковых клеток, то это бел ки-маркеры. По наличию их в сыворотке крови от пациента обнаруживают у него рак.

На поверхности нормальной клетки любого типа имеются белки: 1) бел ки-рецепторы и 2) белки-маркеры. Наши знания о них очень скудные, так как протеомика лишь делает начало.

Нам важно знать какие это белки, чем отличаются в каждом типе норма льной клетки, какова пространственная структура молекул этих белков. Это же надо знать и в раковой клетке разного типа и в чм разница между нормальной клеткой и раковой того же типа.

В многоклеточном организме нормальные клетки идентифицируют друг друга и передают сообщения с помощью белков-рецепторов. Эти рецепторы действуют как химические «флаги» для связи с другими клетками или как хи мические «ворота», контролирующие поступление в клетку молекул извне.

Внутренняя часть молекулы-рецептора часто представлена ферментом – тирозинкиназой. От не сигнал извне через белки цитоплазмы в конечном счте достигает ядра клетки и она дат ответ – деление, секреция белка и т.д. Другой путь передачи сигнала от белка-рецептора в ядро клетки – через универсальный G-белок.

Дефекты в белке-рецепторе или в G-белке из-за мутаций в их генах ведут к многочисленным болезням, в том числе, к превращению нормальной клетки в раковую. Поэтому важно знать пространственную структуру белков рецепторов или G-белков в нормальной клетке каждого типа, а также при лю бой болезни.

На клетке каждого типа – свои белки-маркеры. Они, как и белки рецепторы, – продукт генов этой клетки.

Для каждой болезни на поверхности е клеток – характерные этой болез ни, белки-маркеры.

В настоящее время каждый вновь открытый ген и белок проверяется на способность быть маркером. Критерий оценки общий, и его дал акад. Г.И. Абе лев (2003): «Если в нормальной клетке нового гена или белка нет, а в дефект ной, в частности, раковой присутствует, то он уже явный претендент, чтобы стать маркером».

При любой болезни гены-маркеры и белки-маркеры – всегда строго спе цифичны. Отсюда: диагноз болезни по обнаружению у пациента таких марке ров – точный.

В отношении рака ситуация трудная: здесь гены-маркеры – строго спе цифичны, а известные белки-маркеры, т.е. антигены на раковых клетках не все гда строго специфичны.

Специфичным белком-маркером раковой клетки может быть лишь тот белок, который синтезируется в раковой клетке, но не синтезируется в норма льной клетке того же типа.

Дело в том, что раковая клетка – это как бы возврат по степени е диффе ренцировки к эмбриональному периоду. Поэтому раковая клетка снова начина ет секретировать эмбриональные антигены;

их в нормальной клетке нет, или их содержание меньше.

Пока специфичные антигены в раковых клетках учным выделить не уда лось, и таких антигенов скорее всего нет. А в этом кроются все проблемы соз дания вакцины от рака: лечебной и, тем более, профилактической.

На вопрос корреспондента акад. Г.И. Абелев ответил: «Нет, такого мар кера пока не существует. Думаю, что он вряд ли и появится». Он далее сказал о другом направлении поиска маркеров раковых клеток – по анализу состава ин формационной РНК, т.е. копий генов в этих клетках.

«Нет врага в чистом виде», – так кто-то сказал об известных уже, но не специфичных белках-маркерах раковой клетки. Всего таких маркеров около – для рака простаты, молочной железы, печени и др.

Их используют на основе того, что синтез такого белка-маркера в нор мальной клетке гораздо меньше, чем в раковой клетке этой ткани, из-за слабой экспрессии гена этого белка.

Такие маркеры важны для: 1) установления предварительного диагноза рака по повышению количества данного вещества в крови пациента в несколь ко десятков раз по сравнению с нормой;

в таком случае необходима прицельная проверка того или иного органа несколькими разными анализами, и выяснить, сколько из них изменено, включая при необходимости биопсию из ткани;

2) для выявления раннего рецидива рака и степени адекватности методов лечения рака у конкретного пациента.

Но теперь для такой диагностики раковых клеток у пациента учные вы явили целый ряд новых белков-маркеров в раковых клетках любого типа. От крытие таких маркеров в мире совершается очень быстрыми темпами. Такие белки-маркеры очень ценны, так как они практически в «чистом» виде.

Вся ценность их, в отличие от названных, в том, что гены этих белков маркеров «включаются» во взрослом организме, но только в раковых клетках, а в нормальных клетках эти гены – «молчат». То есть, в нормальных клетках этот белок не синтезируется. Причина «включения» генов – деметилирование CpG островков в промоторах этих генов ферментом – деметилазой.

1. Фермент ДНК-метилтрансфераза 1.

Этот фермент химически модифицирует гены – присоединяет метильные группы к цитозину (C), за которым расположен гуанин (G) в промоторе гена.

Это подавляет экспрессию гена. Если это будет ген-супрессор, то это способст вует превращению нормальной клетки в раковую.

Резкое повышение экспрессии этого фермента в клетке – признак предра ковой и раковой клетки. Такое повышение содержания фермента в сыворотке крови от пациента в сравнении с нормой, можно использовать для диагностики с помощью белкового чипа раковых клеток.

Блокада ДНК-метилтрансферазы 1 в клетке предупреждает или снимает репрессию генов-супрессоров, что препятствует превращению нормальной клетки в раковую.

2. Метил-ДНК-связывающие белки.

После присоединения метильных групп к CpG-островкам промотора ге нов вступают в действие метил-ДНК-связывающие белки. Они связываются с участком метилирования промотора гена и подавляют экспрессию гена.

А.В. Прохорчук (2005) и американские коллеги заняты исследованием одного из таких белков – белок Каизо. Учные измерили уровень экспрессии гена белка Каизо в клетках рака разного типа от человека. Он оказался «в де сятки раз выше», чем в нормальных клетках того же типа. По мнению учных, это можно использовать для ранней диагностики раковых клеток, а ген белка может стать «геном-маркером и указать на характеристики рака».

Для уничтожения раковых клеток ученые планируют создать химерный Каизо белок, который бы не подавлял, а усиливал экспрессию генов супрессоров раковой клетки. А.В. Прохорчук – руководитель проекта – отмеча ет, что на этом пути «кроятся подводные камни. Нужно заставить химерный Каизо работать только во благо, т.е. активировать только гены-супрессоры ра ковой клетки, но не остальные метилированные гены. Над этим мы сейчас и ра ботаем».

Конечная цель исследований этих ученых – «изучить возможность ис пользования белка Каизо как мишени для направленной противораковой тера пии».

3. Белок Mts 1 – продукт гена mts 1.

Он открыт акад. Г.П. Георгиевым и его группой (1999). Он создат свой ство инвазии раковой клетки разного типа. Белок синтезируется в раковых клетках, а в большинстве нормальных клеток синтеза его нет, так как его ген mts 1 «молчит» из-за метилирования его промотора. Обнаружение повышенной экспрессии этого белка в сыворотке крови указывает на наличие метастазов ра ковых клеток в организме пациента.

Связывание этого белка в раковых клетках подавляет метастатический фенотип раковых клеток.

4. Белки JD-1 и JD-3 и их гены.

Они открыты проф. Р. Бенезра (1999) и его группой. Эти белки вызывают ангиогенез и лимфангиогенез в узелке из раковых клеток с размера его в 1-2 мм в диаметре в ткани различных органов, что препятствует отмиранию раковых клеток. В нормальных клетках взрослого организма гены этих белков – «мол чат», так как также их промоторы метилированы. Блокада белков этих генов подавляет микрометастазы в тканях.

5. Фермент теломераза. Он делает раковую клетку бессмертной путм восстановления длины теломер раковой клетки перед каждым е делением. В нормальной клетке у взрослого человека ген этого белка «молчит», – нет и те ломеразы.

Ген этого фермента «включн» деметилированием его промотора в рако вой клетке. В норме он экспрессируется также в половых клетках. По резкому повышению количества фермента в сыворотке крови в сравнении с нормой, его можно использовать для самой ранней диагностики раковой клетки любого ти па в организме пациента.

Теперь учные из США на основе этого фермента создали вакцину от ра ка любого типа клетки.

6. Белок под кодовым названием «5Т4».

Он открыт проф. П. Стерн с коллегами в Британии. Оказалось, что имен но этот белок «маскирует» белки-антигены на поверхности раковой клетки лю бого типа от Т-клеток иммунной системы организма человека.

Этот белок синтезируется в стволовых клетках эмбриона человека и не обходим для его развития.

Очень ценно то, что во взрослом организме этот белок синтезируется только в раковых клетках любого типа клетки и имеется на их поверхности. Ген этого белка в нормальных клетках также «молчит». Этот белок позволяет рако вым клеткам «ускользать» от воздействия иммунной системы пациента и рас пространяться этим клеткам по всему организму без конца и границ.

На основе белка «5Т4» учные разработали вакцину – «Волшебная Пуля», и уже ведутся е испытания на добровольцах, страдающих от рака.

7. Циклин и циклин-зависимая киназа.

В раковой клетке любого типа избыточная экспрессия этих молекул белков-регуляторов клеточного цикла. По анализу содержания этих белков в сыворотке крови от пациента можно обнаружить эти белки, а, значит, и их но сителей – раковые клетки.

Протеомика – наука о белках, способна за ряд лет открыть протеом нор мальной клетки каждого типа, а также раковых клеток у человека. Будут из вестны белки-рецепторы и белки-маркеры раковых клеток разного типа.

Тогда с помощью белкового чипа или микроматрицы будет возможно проводить раннюю диагностику раковых клеток по этим белкам в сыворотке крови от пациента.

Будут диагностироваться: 1) раковая клетка и е близкие потомки пе рвичного очага рака;

2) микрометастазы раковых клеток по белкам свойства инвазии этих клеток.

Мы уже знаем, что структура белкового микрочипа принципиально не от личается от ДНК-чипа: пластинка площадью в 1 см2 или чуть больше из стекла или пластика. На ней в строгом порядке фиксированы трехмерные ячейки из геля, каждая ячейка – диаметром не более 100 микрон.

В каждую ячейку помещается известная исследователю молекула-зонд. В качестве молекул-проб будет исследуемая жидкость – сыворотка крови от па циента. Молекула-зонд способна избирательно связываться с молекулой пробой, содержащейся в исследуемой сыворотке, если она комплементарна по структуре молекуле-зонду.

В зависимости от вида молекулы-зонда может быть несколько вариантов белкового чипа для диагностики раковых клеток по образцу сыворотки крови от пациента:

1. Моноклональное антитело (мКА) на чипе – поиск белка-маркера рако вой клетки в сыворотке крови.

2. Моноклональный Т-клеточный рецептор (мТКР) на чипе – поиск белка маркера раковой клетки в сыворотке крови.

4. мКА на чипе – поиск белка-рецептора раковой клетки в сыворотке кро ви.

5. мТКР на чипе – поиск фермента раковой клетки в сыворотке крови.

6. Белок-рецептор раковой клетки на чипе – поиск антител к нему в сыво ротке крови.

7. Белок-маркер раковой клетки на чипе – поиск антител к нему в сыво ротке крови.

Мы привели схему поиска раковых клеток в организме пациента по бел кам, изложенным в пунктах 1-7 этого раздела, с помощью белкового чипа. Ка ждый из этих белков являются маркером для ранней диагностики раковых кле ток по сыворотке крови от пациента, а также мишенью для лекарств и средств с целью уничтожения раковых клеток.

Глава 8. Методы уничтожения раковых клеток 8.1. «Малые интерферирующие РНК» – «выключатели» гена и сред ство для ингибирования пролиферации раковых клеток В клетке каждого типа организма одинаковый набор генов. Но только часть из них работает. Причем в одном типе – одни, а в другом типе клетки – другие гены. Мы ещ не знаем, какие гены в клетке разного типа включены, а какие нет.

Включение или экспрессия гена – это синтез копии его кодирующей це почки – иРНК, а по ней как на матрице синтез белка в рибосоме клетки.

Этот процесс происходит в клетке так:

- две цепи ДНК в нужном месте разделяются, открывая ген, т.е. участок кодирующей цепи;

- к нуклеотидам его по принципу комплементарности оснований присое диняются нуклеотиды, образуя одноцепочечную информационную РНК (иРНК). В ней, в отличие от ДНК, основание Т (тимин) заменяется основанием – У (урацил).

Этот процесс переноса информации с гена на РНК с образованием иРНК называется транскрипцией гена. По такому принципу на разных генах в клетке образуется также транспортная (тРНК) и рибосомная РНК (риб-РНК).

иРНК несет в себе всю информацию гена, кроме той, что в интронах гена, – она удаляется при созревании иРНК. иРНК передает информацию на риб РНК в рибосоме клетки. тРНК доставляет к рибосоме части для белков – ами нокислоты в соответствии с той инструкцией, что в иРНК. Так на рибосоме строится полипептидная цепь, но обычно цепи, образующие молекулы белков.

Понимание молекулярных причин «включения» и «выключения» генов позволит управлять этим процессом и держать его под контролем, чтобы, на пример, предупредить возникновение из нормальной клетки раковой клетки.

В клетке гены, кодирующие белки, составляют 2%, а вне-генная, т.е. не кодирующая белки остальная часть ДНК, составляет 98% генома клетки. По этому ее назвали – «junk» ДНК, что означает «хлам, утиль». Но «не кодирует» – не значит, что «не используется».

Оказалось, что во «вне-генной» части имеется множество генов, которые «разбросаны» внутри обычных генов и между генами. Но их продуктом являет ся не белок, а «малые» РНК. В класс «малых» молекул РНК включают молеку лы, содержащие короткой длины цепочки нуклеотидов.

Отличия «малых» РНК от трх клеточных РНК:

- они из двух цепей нуклеотидов, которые спариваются друг с другом по принципу комплементарности, что и в ДНК хромосом;

- по 3 концам каждой из цепочек всегда остатся два неспаренных нук леотида.

В клетке «малые» РНК заняты другим делом: регулируют работу обыч ных генов. Они включают их экспрессию или выключают их из экспрессии, ко гда это нужно в клетке.

История «малых РНК» клетки началась в начале 90-х годов ХХ в. с экс периментов учных на цветке «петуний», а затем на черве C.elegans. На обоих живых существах учные пытались усилить выражение опредленного призна ка. Для этого они вводили в их клетки копии гена, т.е. иРНК этого признака. Но вместо усиления выражения, т.е. экспрессии гена, происходило его «замолка ние». В биологии это обозначают термином – «сайленсинг» от англ. «silencing» – молчание, немота. Причиной этого явления оказалась малая интерферирую щая РНК (siRNA), которую открыли в 1998 г. ученые из США Эндрю Файр (Andrew Z. Fire) и Крэйг Меллоу (Craig C. Mello). Эти РНК обладают способно стью «выключать» гены путем разрушения их иРНК. Эффект «гашения» экс прессии гена «малыми РНК» назван РНК-интерференцией, а короткие молеку лы, вызывающие его, назвали siРНК (short interfering RNAs, малые интерфери рующие РНК). Это самые короткие молекулы, состоящие у млекопитающих всего из 21-23 нуклеотида.

Вначале было непонятно, как siРНК появляется в клетке после введения в не копии гена. Авторы открытия выяснили, что в клетке есть молекулярный механизм для синтеза этой молекулы и накопления е. Механизм РНК интерференции в клетке запускается двухцепочечной РНК (дцРНК) и осущест вляется в несколько этапов.

1-й этап. Белок Дайсер нарезает дцРНК на фрагменты, содержащие ко роткие в 21 нуклеотид фрагменты РНК. Это уже siРНК.

2-й этап. Такие фрагменты захватывается комплексом белков – RISC (RNA induced silencing complex).

3-й этап. В комплексе дуплекс коротких РНК расплетается, и только одна цепь siРНК остатся в нм. Это фрагмент антисмысловой цепочки гена.

4-й этап. Комплекс RISC с помощью антисмысловой цепи siРНК скани рует молекулы РНК клетки. siРНК-наводчик находит комплементарную ей по следовательность нуклеотидов в соответствующей смысловой иРНК, т.е. копии гена и разрезает е. Теперь в клетке уже нет иРНК, а, значит, нет и синтеза бел ка гена.

Ни один из блокаторов гена, известных до сих пор, не обладает такой специфичностью к своему гену-мишени. Основная функция siРНК – защита ге нома клетки. Эти молекулы предохраняют геном от мутаций, генов извне – от вирусов, а также от транспозонов.

Итак, учные доказали, что siРНК в клетке блокирует тот ген, матричная цепь которого комплементарна антисмысловой цепи внутри siРНК. Мишенью для молекулы является не сам ген, а его иРНК. То есть ген «выключается» пу тм разрушения его копии – иРНК, после выхода е из ядра в цитоплазму клет ки. Каждая siРНК распознает и разрушает только свою специфическую иРНК и не вызывает никаких побочных эффектов. Замена даже одного нуклеотида внутри siРНК резко снижает эффект интерференции.

Открытие siРНК в 2002 г. признано важнейшим открытием года в списке десяти открытий. Введение в клетку siРНК – это новый метод «выключения» гена (Рис. 1).

Рис.1. Этапы «РНК-интерференции» в клетке (рис. и цит. по: Т. Бархато ва, 2005).

В отличие от антисмысловых РНК, siРНК – «инструмент многоразового использования». Они связываются вс с новыми и новыми молекулами специ фической иРНК, выводя каждый раз их из строя.

Раскрытие генома человека в 2000 г. – это открытие нуклеотидной карты ДНК человека. Однако, эта карта описывает только последовательность нук леотидов в каждом гене, но не функции гена. Чл.-корр. Л. Киселв (2006) счи тает, что теперь стало возможным перейти к созданию карты функций генов.

Эта работа, по мнению Л. Киселева, может быть закончена уже через один-два года.

Метод «выключения» гена очень необходим не только для выяснения функций каждого гена в клетке, но и для «выключения» гена-причины, вызы вающего ту или иную болезнь, в том числе возникновение раковой клетки из нормальной клетки ткани. Выяснив гены-причины раковой клетки, можно «за глушить» гены, – значит, предупредить и возникновение рака.

Для выявления функций гена необходимо иметь клетки в культуре, и, ис пользуя метод Файера и Меллоу, можно по очереди выключать ген за геном и смотреть, какие функции клетки при этом пропадают или появляются. Так лю ди будут впервые знать, какую функцию или функции выполняет каждый ген в клетке (Л. Киселв, 2006).

За открытие «РНК-интерференци» – подавления генов двухцепочечной РНК, американским учным Эндрю Файер и Крейг Меллоу присуждена Нобе левская премия в области медицины и физиологии за 2006 г.

Успех применения препарата siРНК зависит от доставки его в клетки мишени и защиты его от воздействия ферментов клетки. siРНК должны нахо диться в клетке достаточно долго, чтобы выполнить свою роль – найти специ фические иРНК и связаться с ними. Препарат представляет собой синтезиро ванные in vitro двухцепочечные РНК длиной в 21 нуклеотидную пару. Чтобы молекула-препарат легче проникала в клетку и не разрушалась, к молекуле присоединяют липофильную группу (Г. Стикс, 2005). Предполагается, что со временем короткие двухцепочечные РНК можно будет вводить в кровоток па циента и лечить системные болезни. Рак с размера узелка 2 мм в диаметре тоже становится системной болезнью.

Джон Марганоре (J.M. Marfganore, 2006) из США пишет, что у животного единичная доза siРНК сохраняет активность в организме в течение 22 суток.

«Если то, что проделано с клетками млекопитающих в культуре, удастся повто рить на уровне целого организма, мы получим уникальный метод создания ле карственных препаратов. Осуществится заветная мечта, можно будет прицель но выводить из строя нужные гены».

С открытием «РНК-интерференции» появилась возможность подавлять избыточный или недостаточный синтез определнных белков в нормальной клетке, что может превратить е в раковую клетку. Учные предполагают, что этот метод должен быть лишен побочных эффектов, которыми сопровождаются другие методы лечения рака. Однако надо прежде провести соответствующие исследования на животных, а затем и на пациентах.

8.2. Апоптоз и пути его применения для уничтожения раковых кле ток Это необычное явление впервые заметил древний врач К. Гален (131- гг. н.э.). Он наблюдал листопад с деревьев осенью: листья опадают с живой ветки, а если е сломать, то листопад прекратится.

Из этого К. Гален сделал выводы: 1) листопад – это преднамеренное са моубийство;

2) листья убивают сами себя, так как при наличии их зимой, снег сломает ветки. Это явление он обозначил термином апоптоз.

Термин «апоптоз» происходит от греч. apo – отделение, ptosis – опадание.

Для К. Галена осталось неясным, – что это за причина в листьях, ведущая их к самоубийству.

Оказалось, что способность к самоубийству присуща любой клетке, как у растений, так и у животных. То есть в каждой клетке имеется программа на апоптоз. В нормальной клетке эта программа выключена.

Для поддержания жизни многоклеточного организма требуется, как заме на клеток новыми путм деления, так и присутствие смерти уже ненужных кле ток – апоптоз их.

Отмирание клеток в многоклеточном организме первыми обнаружили биологи. Так, у эмбриона человека между пальцами рук и ног имеются пере понки, есть жабры и хвост. Но они к рождению человека исчезают через апоп тоз их клеток.

После открытия апоптоза в течение десятилетий учные были заняты описанием морфологии апоптоза клеток и стадиями или этапами этого процес са. Позднее была изучена морфология другого типа смерти клетки – некроза.

В. Флемминг (W. Flemming, 1843-1905) в 1895 г. дал подробное морфоло гическое описание апоптоза клетки. В такой клетке в первую очередь ядро рас падается на отдельные фрагменты, которые затем как бы «рассасываются». Па раллельно сама клетка распадается на частицы, в последствии названные «апоптозными тельцами».

Дж. Керр (J.R. Kerr, 1972) и соавторы отметили, что апоптоз имеет не меньшее значение, чем митоз. Любая живая клетка снабжена программой апоп тоза, регулируемой рядом генов.

До 1960-х гг. XX века причина апоптоза оставалась невыясненной. Пред полагалось, что такая ликвидация клетки происходит посредством фагоцитоза или каким-то другим, ещ неизвестным способом.

В 1963 г. двое британцев – С. Бреннер (S. Brenner) и Дж. Салстон (J. Suls ton) и американец Р. Горвиц (R. Horvitz) занялись изучением развития много клеточного организма от одной клетки до взрослого организма.

Для этого С. Бреннер впервые предложил удачный объект – червь нема тоду (C. elegans). Длина его тела меньше 1 мм, а тело прозрачно, что делает удобным изучение размножения клеток просто под микроскопом. При изуче нии развития этого простого многоклеточного организма Дж. Салстон открыл апоптоз.

Он заметил, что в процессе развития тканей и органов червя клетки не только делились, но и умирали. Удивляло то, что смерть их не была вызвана какими-либо внешними повреждениями. Ему стало ясно, что смерть клеток – чтко отрегулированный процесс при развитии червя.

Дж. Салстон мог точно отметить те клетки, которым суждено погибнуть, – это и есть регулируемый процесс смерти клетки – апоптоз. Учный обнару жил, что апоптоз регулируется генами – выявил мутацию одного из генов – nuc 1, продукт его оказался необходимым для деградации ДНК погибающей клет ки.

В 1970-е гг. Р. Горвиц поставил задачу – обнаружить эти «внутренние причины» гибели клетки, т.е. апоптоза. Он открыл несколько генов, мутации в которых приводят к нарушению апоптоза в эмбриогенезе червя.

В 1986 г. он сделал сообщение о первых двух генах, вызывающих апоп тоз: «гены смерти» – ced-3 и ced-4 ( название ced – от англ. cell death – смерть клетки). Показал, что наличие этих двух генов необходимо, чтобы произошла смерть клетки.

Позднее Р. Горвиц доказал, что другой ген – ced-9, взаимодействуя с ге нами ced-3 и ced-4, предотвращает гибель клетки. То есть ген ced-9 – это «ген жизни». Он обнаружил множество генов, направляющих элиминацию погиб шей клетки. Он показал, что в геноме человека присутствует ген, подобный ге ну ced-3 нематоды: ген ced-3 кодирует фермент каспазу;

ген ced-4 –аналог гена у человека для фактора – Apat-1;

аналог гена ced-9, предупреждающего апоп тоз, у человека – ген bcl-2.

В 2002 г. этим трм учным – «за открытие регуляции развития органов и программированной клеточной смерти генами» присуждена Нобелевская пре мия.

Апоптоз и некроз клетки – разные типы смерти клеток Показатель Апоптоз Некроз Характер процесса Физиологический или Только патологический патологический Регуляция Генами через их белки Нерегулируемый Причина Сигнальная молекула Токсичные и мембра для мембранного ре- нотропные агенты, не цептора, или отсутствие адекватные внешние сигнальной молекулы условия Скорость развития 1-12 ч. В пределах 1 ч.

Локализация перви- В ядре В клеточной мембране чного повреждения Плазматическая мем- Интактна до последней Разрушается в началь брана стадии ной стадии Распространнность Отдельные клетки Много клеток Причина гибели кле- Деградация ДНК, на- Нарушение целостно тки. рушение работы генов сти клеточной мем браны Размер клетки Уменьшение (сморщи- Увеличение (набуха вание) ние) Изменения ядра Конгломераты хрома- Набухание тина, фрагментация Изменение клеточной Образование апоптоз- Нарушение целостно мембраны ных телец, фагоцитоз сти, разрушение и де их зинтеграция клетки Состояние ДНК Разрывы с образовани- Неупорядоченная де ем крупных, затем мел- градация ких фрагментов Исход для ткани Без воспаления и рубца С воспалением и руб цом Методы выявления:

- морфологические Сморщивание клетки Набухание клетки - электрофоретические Формирование «лесен- Размазанное пятно при ки» при электрофорезе электрофорезе ДНК ДНК Апоптоз клеток сопровождает человека на протяжении всей его жизни, начиная с оплодотворенной яйцеклетки. Из не берут начало все типы клеток, их более 200 типов, а организм взрослого человека состоит из 51013-14 клеток.

Взаимодействия между разными типами клеток объединяет функции организма в единое целое. Клетка каждого типа является частью той или иной ткани и ор ганизма в целом. В организме человека каждый день рождается за счт деления более тысячи миллиардов клеток и столько же отмирает через апоптоз, и мы не ощущаем этого.

Причины апоптоза клеток В физиологических условиях для:

- сохранения генетически заданной численности клеток в каждой ткани, стабилизации границ ткани;

- ликвидации клеток, случайно оказавшихся вне своей ткани: каждая клетка на поверхности имеет рецепторы, с которыми связывается антиапоптоз ный белок, специфический для каждой ткани. Эти белки непрерывно посылают клетке сигнал: «живи дальше» (В.П. Скулачв, 2001). При выходе же клетки из своей ткани, клетка лишается этого белка, сигнал исчезает, и клетка кончает с собой;

- ликвидации клеток, к которым не поступает сигнал к делению от сосед них клеток, например, при отсутствии молекулы фактора роста;

- уничтожения нормальных клеток после 50±10 делений – лимит Хейфли ка;

из-за предельного укорочения теломер на концах ДНК геном такой клетки включает апоптоз;

В патологических условиях для:

- уничтожения клетки с повреждениями ДНК – эпимутации в генах свойств клетки, чтобы она не превратилась в раковую клетку;

- уничтожения клетки с повреждениями ДНК – раковая клетка, чтобы не дала потомства с такими дефектами ДНК, т.е. рак;

- ликвидации клетки с нерегулируемой стимуляцией пролиферации за счт повышенной экспрессии гена c-myc и/или транскрипционного фактора E2F;

- ликвидации клетки с нарушениями клеточного цикла;

- отмирания клетки, инфицированной вирусом, в том числе опухолерод ным вирусом;

в первом случае для предупреждения распространения инфекции на соседние клетки, а во втором – для предупреждения образования из нее ра ковой клетки.

Клетка, подвергающаяся апоптозу, в литературе обозначается определн ным термином:

- «ненужная» – это клетка как часть своей ткани и организма в целом, от мирает после выполнения своих функций;

- «теряющая свой дом» – это опухолевая клетка, которая утратила ко нтакты с соседними клетками своей ткани и с межклеточным матриксом в ре зультате генетических нарушений в ней;

- «чужая» или «несвоя» – это клетка с нарушениями в генах, т.е. предра ковая, а также раковая клетка. На поверхности таких клеток из-за генетических в них перестроек появляются новые белки. А то, что не закодировано в геноме клетки в норме в процессе эволюции, для иммунной системы является «чужим» или «несвоим», другими словами, – «чужеродным». В организме человека еже дневно образуется множество таких клеток, но иммунная система их распозна т и уничтожает.

Как включается программа апоптоза в клетке?

Апоптоз вызывают как внутриклеточные сигналы, так и внешние. Внеш ние сигналы действуют через молекулу-рецептор, пронизывающую насквозь мембрану клетки-мишени. В молекуле-рецепторе три части – наружная, т.е. вне клетки, внутренняя – в толще цитоплазматической мембраны и внутренняя, вы ступающая в цитоплазму клетки. Сигнальная молекула находится либо во вне клеточной жидкости, либо на поверхности других клеток или в межклеточном матриксе.

Стадии апоптоза В апоптозе выделяют три стадии, но пока они ещ мало охара ктеризованы: 1 стадия – инициации, т.е. воспринятие сигнала. 2 стадия – пере дача сигнала и 3 стадия – эффекторная стадия (Рис. 1).

Повреждение Удаление ростовых Связывание специфи ДНК факторов ческих рецепторов р Торможение апоптоза Активация апоптоза Bad Bcl- | Bax Bcl-XL Bcl-XS Апоптоз-специфические протеазы (каспазы) Эндонуклеазы Апоптоз Рис. 1. Общая схема стадий апоптоза (рис. и цит. по: М.А. Пальцев и со авт., 1998).

1. Стадия инициации. Сигнал к клетке-мишени о смерти изнутри клетки поступает от повреждений ДНК, от дефицита или отсутствия фактора роста.

Сигнал к клетке-мишени извне вылавливает молекула-рецептор.

2. Стадия передачи сигнала. После связывания рецептора сигнальной мо лекулы в молекуле-рецепторе из-за изменения положения атомов наступают изменения е конформации. Внутренняя часть молекулы-рецептора обычно яв ляется ферментом киназой. Она активирует цепочку белков, последний из ко торых находится в ядре клетки-мишени. Здесь происходит активация генов, включающих апоптоз в клетке, т.е. «гены смерти» и/или репрессии генов, пре пятствующих апоптозу клетки, т.е. «генов жизни». Через иРНК генов на рибо сомах происходит синтез их белков, в том числе прокаспазы и другие белки ферменты, участвующие в апоптозе.

3. Эффекторная стадия. Она осуществляется белками – продуктом «генов смерти» во взаимодействии с белками – продуктом «генов жизни». Обе группы генов принадлежат к одному семейству генов – bcl-2.

К «генам смерти» относятся: bax – его белок Bax, bak – Bak, bad – Bad, bid – Bid, bik – Bik.

К «генам жизни» относятся: bcl-2 – его белок Bcl-2, bcl-XL и его белок – Bcl-XL.

Судьба клетки-мишени при поступлении сигнала к апоптозу – войдет ли она в апоптоз или сохранит жизнь себе, зависит от количества белка.

Так, если преобладает белок Bax над белком Bcl-2, клетка-мишень всту пит в апоптоз. Если образуется комплекс из двух молекул Bax, т.е. Bax/Bax, то и в этом случае начнтся апоптоз. При наличии достаточного количества моле кул белка Bcl-2 происходит образование комплекса Bax/Bcl-2, в этом комплексе Bax теряет свою апоптотическую активность.

Митоптоз в реализации апоптоза Доказано, что многие виды апоптоза реализуются через образование в мембране митохондрий пор белками «генов смерти». Это приводит к митопто зу, т.е. смерти митохондрии клетки-мишени, а неминуемое следствие этого – смерть клетки (В.П. Скулачв, 1996).

У провинившихся японских самураев тоже был один способ уйти из жиз ни – при отсутствии палачей: «делали себе харакири». В.П. Скулачв (1996) считает, что в биологии действует «самурайский закон», – «лучше умереть, чем ошибиться», начиная с уровня митохондрии и кончая человеком. Так как апоп тоз реализуется одним механизмом, – через митоптоз, учный применяет ино гда термин «харакири» вместо слова «апоптоз».

Bcl-2 – главный ингибитор апоптоза и локализуется на наружной мем бране митохондрий (Рис. 2). Белок Bax до получения сигнала к апоптозу нахо дится в цитоплазме, а после сигнала мигрирует в мембраны митохондрий.

Рис. 2. Митоптоз в реализации апоптоза: f – «белок самоубийства» – AIF, вызывающий апоптические изменения в ядре клетки [цит. и рис. по: В.П. Ску лачв (1996) с изменениями].

Этот белок связывается с внутренней мембраной митохондрии и откры вает в ней поры, вызывая набухание матрикса митохондрии и разрыв е внеш ней мембраны. В результате из межмембранного пространства митохондрий выходит в цитозоль ряд белков: цитохром с, фактор, индуцирующий апоптоз или белок самоубийства – второй фактор, активирующий апоптоз, и прокаспаза 9. Именно эти белки осуществляют эффекторную стадию апоптоза – деграда цию ДНК, изменения мембран и фрагментацию клетки в апоптозные тельца.

Белок AIF в своей структуре имеет адресную метку в ядро клетки мишени. Он сразу из цитоплазмы проникает в ядро клетки, активирует нуклеа зы, которые расщепляют ДНК, это приводит клетку-мишень к апоптозу.

Цитохром с вызывает апоптоз иначе. В цитоплазме этот белок связывает ся с белком Apaf-1 и молекулами прокаспазы 9 – это фермент протеаза;

путм расщепления образуется каспаза 9. Она расщепляет прокаспазу 3 и образуется каспаза 3 – активный фермент, разрушает в клетке-мишени белки, ДНК, и клет ка гибнет.

Оба пути апоптоза – через белок Apaf-1 и цитохром c схематично выгля дят так: сигнал самоубийства митоптоз апоптоз (В.П. Скулачв, 2001).

В отличие от любой клетки многоклеточного организма раковая клетка – не часть ткани, а одноклеточный организм-паразит. Для клеток иммунной сис темы она «своя», так как е протеом кодируется геномом организма-хозяина.

Так как раковая клетка – организм, к ней должен применяться термин – феноп тоз, а не апоптоз.

В инициации программы апоптоза важная роль принадлежит гену супрессору wt53.

Белок этого гена – p53 локализован в ядре клетки и является регулятором транскрипции других генов – ген белка p21 и других, которые могут задержи вать клетку в G-фазе клеточного цикла.

В норме ген wt53 в клетке молчит. При повреждениях ДНК происходит активация этого гена – много белка его. Он блокирует клеточный цикл в фазах G1 и G2 до репликации ДНК и митоза, делая возможной репарацию ДНК, и этим предотвращает появление клеток с эпимутациями и мутациями. Если ре парация не произошла, то индуцируется апоптоз для защиты организма от при сутствия дефектных по геному, т.е. предраковых клеток, способных превра щаться в раковые клетки.

В половине случаев раковых клеток разного типа ген-супрессор wt имеет мутации. Это ведт к превращению предраковой клетки в раковую клет ку и возникновению из не рака. То есть раковая клетка в отличие от любой другой клетки не подвергается апоптозу, если в ней дефекты в е генах супрессорах.

Знания о «генах смерти» и «генах жизни» и их белках позволит управлять феноптозом раковых клеток.

Генетические изменения в раковых клетках, ведущие к подавлению обоих путей индукции апоптоза В них закономерно обнаруживаются:

- потеря экспрессии на поверхности раковой клетки рецептора смерти Fas;

при наличии бы рецептора Fas взаимодействие его с FAS-L или с монокло нальными антителами приводило бы раковую клетку к феноптозу;

- нарушения проведения апоптогенного сигнала к митохондриям. Напри мер, при мутации в «страже» генома гене wt53 и мутации или эпимутации в ге не-супрессоре PTEN;

- ингибирование пор во внутренней мембране митохондрии для цитохро ма c и AIF, вследствие экспрессии «генов жизни» через их белки – Bcl-2. Эти белки не дают открыть поры во внутренней мембране митохондрии;

- блокирование активации эффекторных каспаз. Например, при потере экспрессии белка Apaf-1 в результате метилирования его гена и др.

Пути использования индукции апоптоза в раковой клетке Главная задача сегодня – как можно быстрее найти способы воздействия на молекулярные причины апоптоза, чтобы вызвать апоптоз раковых клеток.

Над этим сейчас работают учные во многих странах мира, в том числе и уч ные нашей страны.

- индукция апоптоза раковых клеток путм введения в составе генетиче ской конструкции свободных копий «гена смерти» bax;

средством доставки яв ляется ретровирус, способный проникать именно в раковые клетки;

перед этим вирус должен быть лишн способности к размножении. Это открыло значи тельные перспективы в генной терапии раковых клеток разного типа;

- замена мутированного «стража» генома – гена wt53 на нормальный с целью восстановления способности раковых клеток к феноптозу;

средство дос тавки гена wt53 – ретровирус или лентовидный вирус;

- малые интерферирующие РНК, для выключения «гена жизни» – bcl-2 в раковой клетке;

мишенью их служит его иРНК, которую они разрушают;

- доставка в раковую клетку «гена смерти», например, ген bax, что вы зовет в ней феноптоз;

- подавление в раковой клетке генов с эпимутациями, создающими ее свойства, и замена генов-супрессоров с мутациями нормальными генами.

Очень многие патологические процессы в организме заканчиваются апоптозом.

Ключевым фактором в изучении апоптоза клетки оказался правильный выбор объекта для экспериментов учных. На одноклеточных организмах – бактерии и др. апоптоз изучать невозможно. Млекопитающие очень сложны для исследования, так как состоят из большого числа клеток. Идеальное реше ние предложил в начале 60-х гг. С. Бреннер: выбор пал на нематоду.

В процессе апоптоза клетки разрушаются е структуры, например, мито хондрии, но при этом мембрана клетки остатся целой.

Так клетка разрушает сама себя изнутри без каких-либо негативных по следствий для организма. Клетка заканчивает свою жизнь самоубийством, ко гда получает сигнал на уничтожение. А отдают его специфические ферменты и белки, которые вырабатываются в клетке в нужном количестве и в нужный мо мент.

Эта программа строго контролируется многими генами, которые были открыты учными. Одни охраняют полноценные клетки, другие дают сигнал на уничтожение исчерпавших свой срок или подвергшихся эпимутациям и мута циям. И лишь одни клетки не подвергаются апоптозу, очень часто – раковые.

Причина: изменения в генах, регулирующих апоптоз в клетке.

Акад. В.П. Скулачв (2001) задат вопросы и отвечает на них сам так:

«Почему же должны умирать клетки человеческого организма? Да в том-то и дело, что они, как правило, не умирают от старости. Они кончают самоубий ством. Как ни парадоксально это звучит, но есть все основания полагать, что смерть клетки запрограммирована. Так же, как запрограммировано отмирание органов: у растений это осенний листопад, у головастика – исчезновение хво ста, у эмбриона человека – рассасывание хвоста и жабер».

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.