WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |
-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ А.И. Рукавишников АЗБУКА РАКА Рекомендуется учебно-методическим объединением по

медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для студентов, обучающихся по специальности 040400 – Стоматология.

Издательство Волгоградского государственного медицинского университета 2007 1 А.И. Рукавишников Азбука рака. – Волгоград: Изд-во Волг. гос. мед. ун-та. – 2007. – 360 с.:

ил.

Учебное пособие посвящено диагностике и лечению солидного рака на основе его причины – раковой клетки.

В главах рассматриваются современные знания о канцерогенезе и его источниках, свойства раковой клетки и их молекулярные причины в сравнении с нормальной клеткой то го же типа.

На этой основе излагаются современные методы ранней диагностики раковых клеток и их ликвидации – методы уничтожения и реверсии раковых клеток.

Учебное пособие предназначено для студентов стоматологического факультета меди цинских вузов и университетов. Оно может быть полезно для врачей-онкологов.

Рецензенты:

А.В. Лепилин – заведующий кафедрой хирургической стоматологии и челюстно лицевой хирургии Саратовского государственного медицинского университета, д.м.н., про фессор.

М.П. Водолацкий – заведующий кафедрой челюстно-лицевой хирургии и стоматоло гии детского возраста Ставропольской государственной медицинской академии, д.м.н., про фессор.

Печатается по решению ЦМС Волгоградского государственного медицинского уни верситета.

УДК 616 – 006.6 (075) ББК 55.6 я А.И. Рукавишников Волгоградский государственный медицинский университет, Введение Согласно концепции Р. Вирхова (1821–1902), любая болезнь начинается с патологии клетки или клеток.

Что есть «патология» клетки, оставалось неясным до 1953 г. ХХ века, ко гда была раскрыта структура молекулы ДНК. Тогда на примере одного свойст ва клетки – деления е на две дочерние клетки, было впервые обнаружено, что это свойство создается репликацией молекулы ДНК. Иными словами, реплика ция ДНК – это молекулярная причина, а деление клетки – следствие этой при чины. Этим был открыт путь к молекулярной медицине.

Но переход медицины на молекулярный уровень начался с расшифровки генома человека – с открытия структуры генов, их количества и места в хромо сомах клетки, а также с началом протеомики – науки о белках, их строении и функциях.

Уже в 2000 г. акад. А.И. Арчаков впервые разделил все болезни на две группы на основе того факта, что все болезни возникают «от генов». Первая группа – наследственные, – от дефекта гена или генов в клетке, а вторая – нена следственные болезни, – от изменения экспрессии гена или генов.

Однако, ген – это только «схема», по которой синтезируются его продук ты – иРНК и белки. Но именно белки создают все свойства или функции клетки каждого типа. Позднее в некодирующих белок участках ДНК были открыты ге ны и их продукт – малые РНК или интерферирующие РНК (РНКи). Они осуще ствляют контроль экспрессии обычных генов в клетке: РНКи связывается с ко пией гена, т.е. иРНК, и затем фермент ее разрушает, – так выключается ген.

Познание всего этого и совершило революцию в медицине – она начала переход на молекулярный уровень: клетка – это место болезни, а причина бо лезни внутри клетки – на уровне молекул, т.е. генов и их продуктов. То есть «патология» клетки Р. Вирхова теперь раскрыта – это изменения в обычном ге не или генах и их продуктах – иРНК и их белках, а также в генах и их продукте – малые РНК в клетке.

Теперь учные стремятся скорее выяснить гены-причины и белки причины в соответствующей клетке, вызывающие конкретную болезнь челове ка. На этой основе они готовятся «радикально изменить средства и методы ран ней диагностики и лечения каждой болезни, в том числе, рака».

До сих пор многие болезни и рак начинают лечить после того, как бо лезнь проявляется симптомами. При этом объектом воздействий лечебных средств и лекарств оказываются не причины болезней, а их симптомы.

Но термин «рак» не выражает ни причины и ни сущности этой, самой древней и опасной для жизни человека болезни. В учебном пособии рассматри вается солидный рак;

часто такой рак представляют как одно целое.

Поэтому в раке важно различать, что является его причиной, а что – е следствием. Причиной является раковая клетка, а следствием – это колония из нее клеток-потомков, т.е. рак. При этом каждая раковая клетка от включения в ней гена теломеразы – бессмертная и является самостоятельным одноклеточ ным организмом, т.е. клетка-организм.

Но солидный рак – не одно целое: часть его клеток образует скопления в виде первичной опухоли и метастазов – это симптомы рака;

часть клеток миг рирует в окружающие ткани, разрушают их, и занимает их места, а часть через кровь и лимфу расселяется по организму, где из них в различных органах обра зуются метастазы.

Клетки солидного рака расселяются по всему организму через кровь и лимфу очень рано – при узелке из раковых клеток в тканях размером 2 мм. Это означает, что с этого момента рак уже становится болезнью всего организма, т.е. системным.

Расселение раковых клеток по организму во многом сходно с распростра нением бактерий при инфекциях, которое также регулируется генами. Но бак терия – прокариот и извне. Раковая клетка – это тоже организм, но эукариот и из клетки своего организма-хозяина.

При инфекциях первым этапом является диагностика возбудителя и его типа в организме пациента. Вторым этапом является лечение, которое сводится к уничтожению каждой клетки-возбудителя. То есть, действуя на причину – бактерию, ликвидируется само собой и ее следствие – инфекция.

Из того, что рак – не одно целое, а каждая его клетка – это клетка организм, то для пациента опасен вовсе не рак, а его раковые клетки.

Акад. Н.Н. Петров (1947) – основатель отечественной онкологии, выра жал это так: «рак целиком заключается в раковых клетках;

удалить или сжечь их без остатка, значит вылечить больного».

Акад. В.А. Кордюм (1998) писал: «убрать бы все раковые клетки из орга низма, все до единой, и болезнь бы ушла».

Проф. А.С. Соболев (2002) также говорит: «убить бы все раковые клетки до единой и ни одной не оставить для потомства».

Отсюда следует, что объектом для методов диагностики и лечения долж ны быть не симптомы рака, а его раковые клетки. То есть принципы диагности ки и лечения рака должны быть такими же, что и при бактериальной инфекции.

Не зря третьей мишенью химиотерапии после бактерий и вирусов, стали рако вые клетки. Так как рак не одно целое, а расселяющиеся по всему организму без конца и границ потомки раковой клетки, то лечение от рака также должно сводиться к ликвидации каждой раковой клетки и тогда рак ликвидируется сам собой.

Так как причина и сущность рака, все трудности диагностики и излечения от рака «заключаются» не в раке, а в его раковых клетках, то это и явилось для нас основанием назвать учебное пособие – «Азбука рака».

В истории познание рака шло в направлении – от рака к его причине, т.е.

к раковой клетке. Это же привело к созданию существующих до сих пор мето дов диагностики и лечения – симптомов солидного рака, а не его причины – ра ковой клетки и е потомков.

Отставание науки об отличиях раковой клетки от нормальной клетки того же типа до последнего десятилетия ХХ века, не позволяло разрабатывать мето ды ранней диагностики раковых клеток и методы их избирательной ликвида ции.

Основными методами лечения солидного рака во многих странах и в на шей стране являются: хирургический метод, лучевое лечение и химиотерапия.

Объектом лечения первых двух методов являются симптомы рака – пер вичный рак, метастазы и рецидив рака, но не раковые клетки, распространяю щиеся за пределами границ операционного поля или лучевого воздействия и те, которые расселяются без конца и границ по всему организму пациента.

Если хирургическим методом часто сразу можно удалить из организма пациента множество раковых клеток иссечением первичного рака и его мета стазов, то лучевое лечение, если убивает, то лишь часть раковых клеток.

Объектом стандартной химиотерапии являются раковые клетки, т.е. то, что и нужно уничтожать. Но она бессильная, так как стандартные лекарства са ми по себе не отличают раковую клетку от нормальной клетки. Незнание моле кулярных причин свойств раковой клетки препятствовало созданию лекарств и разработке других средств, избирательно уничтожающих раковые клетки, не затрагивая здоровых клеток.

По этим причинам во всех странах смертность от рака, несмотря на лече ние стандартными методами, большая и пока нет е снижения.

В странах мира:

проф. Д. Фелшер (D. Felsher, 2002) пишет: «рак поражает каждого третье го человека, а умирает каждый пятый от этой болезни»;

проф. У. Гиббс (2003) отмечает:

- «девять из десяти раковых больных погибают»;

- «к несчастью, когда у больного диагностируют рак, метастазы уже при сутствуют;

прогноз для таких больных неутешителен»;

проф. Л. Леб (L.A. Loeb, 2003) подчркивает, что «в любой опухоли, на считывающей 100 млн. клеток, всегда найдется одна, в которой произошла му тация, защищающая эту клетку от любого препарата. Можно рассчитывать только на то, что удастся сдержать рост опухоли. Вылечивать больных от рака мы пока не умеем».

Что удалось достичь к настоящему времени в странах при объекте – рак и стандартных методах его диагностики и лечения? Ответ дан в работе А.В. Лих тенштейн, Г.И. Потаповой (2005) из НИИ канцерогенеза, Российского онколо гического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва. В ней авторы на основе своих исследований и исследований зарубежных ученых характеризуют сложившуюся к настоящему времени ситуацию в онкологии так:

- имеется «разительный контраст между впечатляющим прогрессом в фундаментальных исследованиях, и практическим отсутствием достижений в клинической онкологии: смертность от основных форм рака сегодня примерно та же, что и 30-50 лет назад»;

- М.В. Sporn, N. Suh (2002), C. Leaf (2004) объясняют это следствием стратегического просчета: «клиницисты и тогда, и сегодня считают заслужи вающей врачебного вмешательства только уже сформировавшийся рак. Но та кая практика «устранения последствий» столь же мало эффективна, как и лече ние, например, уже случившегося инфаркта миокарда или инсульта»;

- «в основе такого просчета лежит представление о раке как о сугубо ло кальном процессе». В ткани из возникшей раковой клетки вначале возникает клон всего лишь из нескольких клеток. Такой очаг рака обычно считают «исче зающе малой мишенью, что лишает, казалось бы, смысла на этой стадии про цесса любые терапевтические и диагностические мероприятия». Однако авторы статьи считают, «что представленная картина не соответствует действительно сти и что на самом деле задолго до наступления клинической фазы рака суще ствует реальная мишень для превентивных мер»;

- «устоявшаяся к настоящему моменту времени практика сводится к тому, что основные диагностические и терапевтические усилия направлены соответ ственно на выявление и уничтожение уже существующего опухолевого очага.

Иными словами, борьба со злокачественной опухолью начинается в момент, когда битва уже в значительной степени проиграна».

- исходя из этого, авторы считают, что «более благодарной мишенью для терапевтических воздействий является предшествующий раку массив мутант ных клеток, не обладающих еще всеми свойствами злокачественности»;

«му тантные клетки», не обладающие свойствами раковой клетки, – это предрако вые клетки, – Прим. – А.Р.

- вс более актуальным «является необходимость концентрации противо раковых усилий на превентивных мерах, способных либо обратить вспять про цесс канцерогенеза, либо затормозить его настолько, чтобы отодвинуть момент появления рака за пределы естественных жизненных сроков» (M.B. Sporn, N.

Suh, 2002).

Из следствий «просчта» вытекает необходимость смены объекта для ме тодов диагностики и лечения рака. Вместо рака, т.е. следствия, объектом для обеих целей должна быть его причина, т.е. раковая клетка и е потомки.

Достижения молекулярной, т.е. генной медицины уже сейчас позволяют начать диагностику и лечение многих болезней задолго до их симптомов. Цель этой медицины – не ликвидация симптомов болезни, а устранение е причины.

Для рака это означает два уровня: «до начала» – это предраковые клетки, кото рые имеет опухолевый генотип, но нормальный фенотип, и «начало» – раковая клетка и е первые потомки.

Для уничтожения причины, т.е. раковой клетки, необходимо знать абсо лютные отличия между ней и нормальной клеткой того же типа.

Но таких отличий до сих пор не было найдено, на их поиски учными по трачены все истекшие века. Все проблемы только в том, что раковая клетка – это не пришелец извне, а клетка, возникающая из нормальной клетки своего ор ганизма в результате дерепрессии в ней ряда генов фетальных белков. Хотя она имеет эти изменения в геноме, но этот геном организма-хозяина, он же кодиру ет протеом этой клетки.

Так как дерепрессия генов – это не мутация генов, то е белки-маркеры не являются белками-антигенами или они очень слабые для клеток иммунной сис темы, и поэтому для них раковая клетка не является чужеродной клеткой, а значит, нет и иммунного ответа. Кроме этого, имеют значение и другие причи ны – нарушения функции дендритных клеток и др.

Долгое время считалось, что раковая клетка возникает из любой клетки ткани, и все клетки рака обладают одинаковыми потенциями к делению. По этому методы лечения рака имели целью уничтожение всех раковых клеток в организме пациента.

Недавно доказано, что раковая клетка возникает из стволовой клетки или из любой клетки ткани, если она способна вернуться в «стволовое» состояние (J.E. Trosko, 2005). При этом большая часть клеток рака – нераковые клетки и с коротким сроком жизни, и лишь меньшая их часть – это раковые стволовые долгоживущие клетки. То есть потенции к делению клеток в составе рака раз ные (M. Clarke, 2003).

До сих пор считалось, что место метастаза определяется тем, в какой ор ган с потоком крови попадает раковая клетка из первичного очага рака.

Теперь доказано, что метастазирование раковых клеток не хаотический, а управляемый самой раковой клеткой процесс с участием гемопоэтических кле ток костного мозга.

Миграция раковых стволовых клеток начинается с секреции ими фактора роста, а к нему на поверхности гемопоэтических клеток имеется белок – рецеп тор. Получив этот сигнал, гемопоэтические клетки из костного мозга мигриру ют «в разные места» организма, где оседают и размножаются, образуя премета стазные ниши. В эти ниши позднее прибудут раковые клетки из первичного очага рака, так образуются метастазы. Этим открыты новые мишени для пре дотвращения и подавления метастазирования раковых стволовых клеток.

Эти открытия учных существенно дополняют прежние знания и дают принципиально новые возможности для решения основных проблем рака:

- в клетках рака необходимо диагностировать только раковые стволовые клетки;

- для излечения от рака, надо «выборочно целиться именно по раковым стволовым клеткам», и только их уничтожать;

- если после лечения рака в организме пациента останется даже одна ра ковая стволовая клетка, то рецидива рака «не избежать»;

- теперь стало возможным определять степень риска образования мета стазов у каждого пациента, предупреждать и подавлять метастазы раковых кле ток (R.N. Kaplan et al, 2005).

Дерепрессия генов свойств раковой клетки – это не изменение в структу ре этих генов, а лишь изменения в выражении генов, а это – обратимый про цесс. Поэтому раковую стволовую клетку можно не только уничтожать, но и возвращать в нормальное состояние. Затем она станет дифференцированной клеткой и погибнет через апоптоз. Это явление обозначается термином – ревер сия.

То, что раковая клетка – это стволовая клетка, позволило ученым уже от крыть некоторые отличия между раковой и нормальной стволовыми клетками на уровне генома. Это дат надежду на такое лечение рака, при котором будут уничтожаться только раковые стволовые клетки, тогда как нормальные стволо вые клетки не будут повреждаться.

Для ликвидации раковых клеток в организме пациента в пособии рас сматриваются основные современные методы лечения. Наибольшие перспекти вы в излечении пациента от рака следует ожидать от вакцин и методов ревер сии раковых стволовых клеток, в том числе экстракты и белки из эмбриональ ных тканей и плаценты, а также вакцина из эмбриональных стволовых клеток.

У нас достаточно книг и статей о раке, но не было учебного пособия, в котором бы автор подошел к диагностике и излечению от рака пациента на ос нове новых знаний о раковой клетке, е свойствах и их молекулярных причин.

Такие материалы для всякого желающего ознакомиться, часто разрозненны и не всегда доступны.

В учебной программе – «Основная образовательная программа подготов ки врача-стоматолога». Часть 2. – М., 2003 г., выделен раздел «Опухоли». Ис ходя из этого, мы стремились дать в учебном пособии ответы на основные во просы этого раздела на примере солидного рака.

К настоящему времени уже многое известно о свойствах раковой стволо вой клетки и их молекулярных причинах. На этой основе разработан ряд новых методов для ранней диагностики раковых клеток в организме пациента и их из бирательной ликвидации. Часть этих методов уже внедрена в клиническую практику, в том числе индукция реверсии и апоптоза раковых клеток экстрак том из фетальных тканей человека.

Часть их лишь начинает «выходить» из лабораторий или «на выходе» в клиническую практику, например, метод «глушения» экспрессии генов свойств раковой клетки интерферирующей РНК: введенная в раковую клетку короткая молекула РНК связывается с иРНК гена и тогда синтез белка прекращается, а значит, раковая клетка утрачивает соответствующее белку свойство.

Желание приблизить время широкого внедрения новых методов ранней диагностики раковых стволовых клеток и методов их ликвидации в клиниче скую практику, а также в целях учебного процесса со студентами, явились для нас главными причинами написать это учебное пособие.

Из большого материала о раковой клетке, е свойствах и их молекуляр ных причинах, мы сделали критический выбор того, что особенно необходимо для ранней диагностики раковых клеток и их ликвидации с целью излечения от рака.

В основу учебного пособия положены: 1) материалы литературы по мо лекулярной медицине и молекулярной онкологии;

2) наши лекции по онколо гии для студентов стоматологического факультета, отдельные лекции для сту дентов лечебного факультета, а также семинары по онкологии для студентов на элективном курсе;

3) наш опыт как хирурга-онколога с 1971 г. и по настоящее время в отделении «Опухоли головы и шеи» Волгоградского областного кли нического онкологического диспансера («ВОКОД» №1).

Без смены объекта для диагностики и лечения с уровня рака на уровень раковой стволовой клетки, без знаний молекулярных причин свойств раковой клетки, нам не удастся справиться с е следствием, т.е. раком.

В книге каждый раздел написан как самостоятельная единица, но связь между разделами есть и ясна. Мы выражаем благодарность авторам и издатель ствам за использование в книге иллюстраций, заимствованных из журналов, книг и публикаций и стремились привести эти источники в списке литературы.

Учебное пособие – «Азбука рака» идет навстречу нуждам студента, как в ранней диагностике рака, так и в излечении от него новыми методами. Оно мо жет быть полезным и для врачей-онкологов.

А.И. Рукавишников Глава 1. Геном нормальной соматической клетки 1.1. ДНК – молекула жизни. Открытие структуры и функции, значе ние открытия Из истории открытия структуры ДНК В 1910 г. стало ясно, что гены располагаются на хромосомах. Но не ясно было, из какого материала состоят гены – из белка или из нуклеиновой кисло ты.

В 1928 г. Ф. Гриффит начал изучать роль нуклеиновой кислоты в жизни клетки в опытах на пневмококках.

Имеется два типа пневмококков. У одного пара бактериальных клеток окружена капсулой. Второй тип клеток – без капсулы. Капсула защищает мик робы от фагоцитоза. Если ввести такие мышам, то они погибают. Пневмококк без капсулы не заражает мышей и не вызывает пневмонию.

Опыт. Мышей заразил смесью клеток живых пневмококков без капсул и мертвых пневмококков с капсулами.

Ожидалось, что мыши останутся здоровыми. Но они погибли от пневмо нии. Живые бактерии, выделенные из мышей, имели капсулы. Это явление трансформации клетки.

Опыт. Микробиологи предположили, что какое-то вещество мертвых пневмококков способно заставить живые клетки образовывать капсулы. Они показали это в опытах.

Пневмококки с капсулами убили, растерли их и приготовили раствор из разрушенных этих клеток, – это экстракт. В культуральную среду внесли экс тракт из мертвых клеток с капсулами, затем в эту среду внесли живые пневмо кокки без капсул.

Результат: некоторые из клеток без капсул трансформировались в клетки с капсулами;

их потомки также обладали капсулами и при введении их мышам вызывали пневмонию.

Оказалось, что клетки без капсул претерпели изменение - они стали обла дать капсулами и вызывали пневмонию. Важно, что и их потомки также обра зовывали капсулы и вызывали пневмонию.

Вывод: 1) признаки пневмококков изменились, 2) это вызвано скорее тем, что какой-то компонент экстракта или он стал частью пневмококка.

Опыты Ф. Гриффита продолжили американские учные – микробиолог О.Т. Эвери (1877-1955) и его сотрудники.

Они задались вопросом: какое вещество вызывает трансформацию одного штамма пневмококка в другой? Для этого они повторили опыты Ф. Гриффита, используя вместо микробов экстракт из них.

Экстракт в опытах с пневмококками сохранял свою трансформирующую активность при разрушении в нем белков и РНК, но терял ее при разрушении ДНК.

Вывод: трансформирующим веществом является ДНК. Отсюда гены по строены из ДНК.

Трансформация состоит в передаче генов от умерших пневмококков в живые и внедрении их в хромосому-хозяина, т.е. в бескапсульные пневмококки.

Эти данные об открытии учные опубликовали в 1944 г. Так впервые бы ло доказано, что признак от одной клетки передается другой веществом ДНК.

Но как?

Роль ДНК в клетке была дополнена из жизни вирусов, содержащих ДНК.

Они заражают клетки бактерий для того, чтобы осуществить в них цикл ра змножения.

При этом обнаружилась способность ДНК вируса синтезировать свои ко пии и белки.

Из всего следует, что ДНК контролирует жизнь содержащих ее клеток и способна синтезировать копии своих молекул. Этот процесс называется «само удвоением» или размножением. ДНК – единственная в природе молекула, спо собная копироваться.

Вклад акад. Н.К. Кольцова В 1927 г. наш ученый – акад. Н.К. Кольцов (1872-1940) писал, что «в од ной хромосоме укладывается одна невероятно длинная молекула, а вдоль не располагаются отдельные группировки атомов – гены».

Он также впервые сказал, что «при делении клеток такие молекулы не создаются заново из отдельных кусков, а сначала достраивают на себе точные копии, а затем исходная молекула и копия разойдутся вместе с дочерними хро мосомами в образующиеся заново клетки». Это матричный принцип реплика ции генов и затем хромосом перед делением клетки на две.

Как происходит удвоение ДНК перед делением клетки было тайной для биологов в течение многих десятилетий. Учные догадывались, что для по нимания этого необходимо знать: 1) строение ДНК и 2) способы расположения нуклеотидов в молекуле.

К 1950 г. было известно, что ДНК молекула, которая состоит из тысяч со единенных между собой в линию молекул четырех разных типов – ну клеотидов.

Э. Чаргафф (1950) показал, что в любой ДНК количество аденина равно количеству тимина (А=Т), а количество гуанина – количеству цитозина (Г=Ц).

Это указывало на то, что в молекуле ДНК они находятся парами: А-Т;

Г-Ц.

Р. Фраклин (1920-1958) в лаборатории М. Уилкинса методом рентгенов ской кристаллографии получила «знаменитое ныне изображение картины структуры ДНК».

Однако из этих знаний не ясно было: как работает эта молекула или как она выглядит? Никто не знал, как выстраиваются химические единицы – А, Т, Г, Ц, чтобы нести в себе информацию о плане строения и воспроизводства жи вого.

Модель молекулы ДНК Д. Уотсон и Ф. Крик занялись созданием модели молекулы ДНК, как Л.

Полинг – для изучения пространственной структуры белка. Она помогла бы по нять детали структуры и возможные функции ДНК.

Проведя расчты, они в течение 18 месяцев были заняты созданием мо дели и создали модель ДНК. Но они не были уверены в правильности этой мо дели.

Руководитель Р. Франклин – М. Уилкинс разрешил Д. Уотсону ознакоми ться с рентгеновским изображением молекулы ДНК, не сказав об этом ничего Р. Франклин. Когда Д. Уотсон увидел полученное Р. Франклин изображение, он понял: «они с Ф. Криком не ошиблись». На этом снимке они четко видели при знаки спирали и пошли сразу в лабораторию, чтобы проверить «вс на объем ной модели».

Из-за отсутствия пластин Д. Уотсон вырезал из картона четыре типа ма кетов нуклеотидов: аденина (А), Тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц) и стал раскладывать их на столе.

Он тут же обнаружил, что аденин соединяется с тимином, а гуанин с ци тозином по принципу «ключ-замок», образуя пары. Именно таким образом удерживаются между собой две цепи молекулы ДНК.

Последовательность этих пар в молекуле может бесконечно варьировать.

Это и служит шифром или кодом, при помощи которого зашифрована инфор мация, определяющая тип белка, синтезируемого данной клеткой (Рис. 1).

Рис. 1. Молекула ДНК и двух цепей. Основания соединены водородными связями.

Молекула ДНК имеет две функции: 1) передавать информацию потомст ву, т.е. дочерним клеткам и 2) реализовывать информацию внутри клетки.

Из структуры двойной спирали сразу видно прямое следствие – реплика цию, т.е. размножение ДНК. Способ: расхождение двух комплементарных це пей и построение по каждой из них новой – дополняющей цепи. Так из одной молекулы ДНК образуется две, что требуется для деления клетки на две.

Ошибки при репликации, т.е. мутации – причина превращения нормальной клетки в дефектную (Рис. 2 и 3).

Рис. 2. Расхождение цепей ДНК.

Pиc. 3. Достраивание по каждой из цепей новой, – дополняющей цепи.

Итак, был доказан матричный принцип репликации ДНК перед делением клетки, предсказанный великим учным, акад. Н.К. Кольцовым. Две части мо лекулы отделяются друг от друга, по каждой из них синтезируется новая поло вина молекулы. Порядок же оснований – в роли матрицы или образца для дост раивания молекул.

ДНК – хранилище генетической информации Информация о синтезе каждого типа белка заложена в ДНК в виде некой линейной последовательности оснований.

В 1961 г. Ф. Крик доказал, что каждая группа из трех оснований образует кодон. Один кодон кодирует одну аминокислоту из 20 главных аминокислот.

Для переноса информации о структуре белка из ядра клетки имеется иРНК. Она – копия с фрагмента кодирующей матричной цепи ДНК. В ней вме сто тимина содержится урацил.

По иРНК в рибосоме с помощью транспортной РНК будет синтезирован белок – конечное звено реализации генетической информации. Так как ДНК служит хранилищем генетической информации, ее называют молекулой жизни.

До начала работы Д. Уотсона и Ф. Крика над структурой ДНК, уже мно гое было известно.

Р. Франклин в 1951 г. впервые получила первую уникальную рентгено грамму молекулы ДНК, где видно, что эта молекула имеет форму двойной спи рали, очень похожую на винтовую лестницу. Е снимки сыграли решающую роль в открытии Д. Уотсона и Ф. Крика. В знак этого, Р. Франклин называют «пионером» молекулярной биологии.

За открытие структуры ДНК и е функций Д. Уотсон, Ф. Крик и М. Уил кинс в 1962 г. удостоены Нобелевской премии. Р. Франклин не дожила. Она скончалась от рака в 1958 г.

Революция в мире науки Открытие пространственной структуры ДНК – стало основанием для ряда новых открытий.

В 60-х гг. ХХ в. механизм репликации ДНК подтвердился, обнаружен фермент – ДНК-полимераза, катализирующий этот процесс.

Открыт генетический код, т.е. шифр, по которому в клетке синтезируются белки.

В 70-х гг. XX в. ещ два метода были созданы: секвенирование и получе ние рекомбинантной ДНК.

Секвенирование дает возможность «читать» последовательность нуклео тидов в ДНК. С помощью этого метода расшифровывался «геном человека».

Получение рекомбинантной ДНК или метод молекулярного клонирова ния. Суть этого метода – в молекулу ДНК встраивают фрагмент, содержащий определенный ген.

Например, вводят его в бактерию, и она синтезирует его продукт – белок, который необходим человеку.

В 80-х гг. XX в. разработана полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эта технология необходима для быстрого «размножения» нужного фрагмента ДНК.

С помощью ПЦР можно осуществлять раннюю диагностику бактериаль ных и вирусных инфекций, а также первые раковые клетки в организме пациен та по их генам-маркерам.

Например, в плазме крови пациента можно обнаружить фрагменты генов маркеров раковой клетки. Если фрагмент в малом количестве или единствен ный, с помощью ПЦР его размножают и после этого легко идентифицируют.

Открытие структуры ДНК дало возможность учным расшифровать ге ном человека и многих других организмов. Это открытие позволило перейти к генной терапии любой болезни, в том числе рака.

Раковая клетка «плохо распознается иммунной системой пациента, т.к.

она возникает из нормальной клетки организма-хозяина».

Поэтому для уничтожения раковых клеток с помощью генной терапии, надо прежде сделать раковые клетки «чужими» для иммунной системы.

Есть много способов, как это сделать. Можно из материала биопсии рака выделить раковые клетки, ввести в них «чужой» ген, а затем эти раковые клет ки ввести обратно в организм пациента. В таком случае иммунная система по белку этого гена будет распознавать раковые клетки как «чужие» и уничтожать их.

В опытах на животных такой метод воздействия на ДНК раковых клеток дал обнадеживающие положительные результаты. Но для лечения же пациен тов от рака, подобный метод находится пока на этапе клинических испытаний (Е.Д. Свердлов, 2003).

К эре «живых технологий» И совсем необычно – начало новой эры «живых технологий». Учные ря да стран заявляют, что они почти готовы к созданию «искусственной жизни», т.е. абиогенезу.

Пока нет единого определения живого, для него характерны три приз нака;

1) наличие контейнера, т.е. мембраны, вмещающего содержимое клетки;

2) метаболизм – способность преобразовывать базовые питательные вещества в рабочие механизмы клетки;

3) наличие генов – химических конструкций, нео бходимых для построения клетки, которые могут передаваться потомству и из меняться вместе с изменениями окружающей среды.

Каждый из этих трх элементов уже воспроизведн в лабораториях, уч ные готовы приступить к попыткам соединить вс это «в одну рабочую едини цу», т.е. клетку.

В случае успеха, это будет «мир сверхмалых живых машин: специальные клетки будут лечить организм человека и бороться с загрязняющими окру жающую среду веществами».

Ближайшей задачей науки учные считают создание «искусственной клетки», способной к самовоспроизводству и вырабатывающей уникальные химические вещества, в том числе лекарства, которые пока не удатся синтези ровать.

«Искусственное живое» будет находиться под полным контролем челове ка, например, «подпитывая» его элементами, не встречающимися в природе в чистом виде.

Синтез вирусов и начало синтеза клетки 1. Проф. Э. Уиммер (E. Wimmer) и его группа из Нью-Йорка в 2002 г.

впервые со времн зарождения «живого» на Земле, создали вирус полиомиели та из неживой материи.

Ученые спорят: вирусы – это живые существа или неживые объекты?

У.М. Стэнли – лауреат Нобелевской премии – считает, что «в клетке ви рус ведт себя как живое существо, а вне клетки он мертв, как камень».

Г. Надсон – наш микробиолог, говорит так: «Вирус – это то ли вещество, обладающее свойствами существа, то ли существо со свойствами вещества».

Акад. В.А. Энгельгардт – наш учный, писал: «Многие вирусы состоят всего лишь из белка и нуклеиновой кислоты. Они могут быть отнесены к хими ческим соединениям – нуклеопротеидам».

Геном вируса полиомиелита полностью расшифрован. На этом основании учные собрали точную последовательность нуклеотидов, соответствующую естественному образцу.

Этот генетический материал поместили в раствор, подобный цитоплазме.

В нм по информации, заложенной в ДНК, были синтезированы необходимые белки.

Они применили рецептуры, опубликованные в Интернете, и генетические последовательности, полученные по почтовому заказу.

Проф. Э. Уиммер сообщает, что как только в пробирку были помещены все генетические составляющие, вирус тут же «самособрался». Иными словами, «жизнь, или по крайней мере е подобие, завелась с пол-оборота».

Созданный вирус выглядел так же, как его природный образец. Для до казательства активности вируса ученые заразили им мышей. Животные по гибли при классических симптомах полиомиелита.

На сборку генома вируса полиомиелита проф. Э. Уиммеру потребовалось три года.

В той же лаборатории К. Вентер (J. Craig Venter) синтез вируса произвел за 14 дней.

2. Синтез искусственного вируса phi-Х174. Это бактериофаг, существует в природе, безопасный для человека и животных.

К. Вентер и его группа взяли несколько участков ДНК и соединили их, создав полный геном вируса, содержащий одиннадцать генов. Эта смесь была помещена в пробирку, где самостоятельно собралась в генетическую цепочку, идентичную геному phi-Х174. После этого собранный геном имплантировали в живую клетку, которая начала производить копии вируса.

3. Американские учные создадут неизвестную в природе форму живого.

Учные из лаборатории Роквилля объявили о намерении создать при по мощи генной инженерии новую форму жизни – 21.11.2002.

Цель проекта – исследования фундаментальных механизмов зарождения и развития органической жизни. Основные участники – генетик К. Вентер и Нобелевский лауреат Х. Смит.

Целью эксперимента является создание одной клетки, являющейся базо вой для формирования организма с минимальным набором генов для поддер жания жизни.

Если опыт удастся, то выращенная клетка будет расти и делиться, со здавая, таким образом, целую клеточную структуру, не существующую в при роде. Это будет «минималистский» организм.

В конце 1990-х гг.XX в. К. Вентер – в то время глава Института геномных исследований в Роквилле (США), – опубликовал перечень генов, необходимых для существования одноклеточного организма, – микоплазмы. По его подсч там этот обитатель половых путей человека может обходиться 300 генами из своих 517, которые в этом микробе образуют одну хромосому.

В основе проекта – на 3 года, лежит та же бактерия. Из е клетки учные намерены извлечь весь генетический материал, затем скомпонаватъ из его «ку сочков» искусственную цепочку генов, т.е. хромосому. В е состав войдут только те гены бактерии, которые «безусловно необходимы» для поддержания жизни нового организма. На завершающем этапе собранная цепочка генов бу дет инкорпорирована в лишенную генетического материала клетку.

Затем «должно случиться самое интересное, то, ради чего задуман эк сперимент» – оживление бактерии. Дальше пойдут наблюдения за таким полу природным организмом: как он живт и размножается.

«Нас интересует: можно ли придти к молекулярному определению жизни, и наша главная цель – фундаментальное понимание составляющих самой эле ментарной живой клетки».

Во избежание создания болезнетворного агента К. Вентер и Х. Смит ли шат новую «микоплазму» генов, ответственных за е прикрепление к клеткам в организме человека, потом тех генов, которые позволяют ей выживать в не благоприятных условиях. В результате получится «довольно хрупкое существо, абсолютно зависимое от своих создателей».

В задачу исследований также входит научиться искусственно создавать различные гены. «Это – воистину базовая наука, – говорит К. Вентер. – Даже при том, что мы обнаружили все гены в человеческом геноме, мы до сих пор не смогли постичь тайну самой простой клетки. Именно это мы и хотим сделать сейчас».

К. Вентер и Х. Смит и их группы в запасе имеют и другой вариант со здания живой клетки: искусственно в лаборатории синтезировать эти базовые гены, собрать их в цепочку, а затем ввести их в такую же бактерию, из которой е генетический материал весь будет предварительно удалн.

Что вкладывает К. Вентер в свою задачу – дать «молекулярное опреде ление жизни»?

Любая клетка построена из молекул, как и организм в целом. Их стру ктура и состав, а также взаимодействие заложены в генах. В процессе эволюции каждая молекула скроена в соответствия с функцией в клетке. Клетка – это не хаотическое скопление молекул, а «их упорядоченность», т.е. организация, так как е строят гены через продукты – белки. Разрушь е, то хотя и останутся в виде смеси эти молекулы клетки,– это уже будет мртвое, так как разрушена молекулярная организация клетки. А она создана в процессе эволюции «живо го».

Отсюда: К. Вентер стремится минимумом генов получить такую органи зацию неживых молекул, которая превратится в «живое». Это и будет абио генезом.

1.2. Раскрытие секрета жизни – значение для медицины и онкологии В биологии проблема сущности жизни и е происхождения всегда стояла под номером один.

Главным признаком жизни или живого на уровне клетки является е де ление, т.е. митоз.

Процесс митоза, видимый в микроскоп, при котором одна клетка делится на две, – «удивительное явление в биологии». Ещ удивительнее при этом представлялось возникновение двух хромосом там, где раньше была только од на.

Это являлось величайшим секретом биологии: «как удваивается это, имеющее первостепенное значение, тельце?» Хромосома состоит из трх веществ: ДНК, белка и РНК. Нуклеиновые кислоты и белки состоят из гигантских молекул, каждая из которых имеет ос новной скелет и боковые группы. В белках содержатся элементы двадцати ти пов, в нуклеиновых кислотах – четырх типов и при том иных.

28.II.1953 г.Ф. Крик вошл в кембриджский «Игл паб» и сказал: «Мы рас крыли секрет жизни». Они действительно обнаружили «нечто подобное». И это было то, за что позднее он и ещ двое сподвижников, в 1962 г. получили Нобе левскую премию.

Они создали модель пространственной структуры молекулы ДНК и этим совершили прорыв, который, в частности, позволил разгадать загадку: как уд ваиваются хромосомы перед делением клетки на две. Эта тайна или секрет де сятилетиями не давала покоя учным.

Модель молекулы – это е копия, но гораздо больше по размерам, чем существующая в клетках. Из-за слишком малого размера мы не видим реаль ную молекулу. Модель молекулы позволяет нам понять е строение вплоть до расположения в пространстве отдельных атомов, а то и е функции в клетке.

Оказалось, что хромосома удваивается за счт репликации, т.е. удвоения.

Молекула ДНК – это спираль из двух цепей. Каждая цепь состоит из нук леотидов: аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц). Две цепи соеди няются между собой парами этих оснований по принципу «ключ – замок»: А-Т;

Г-Ц.

Механизм репликации, т.е. удвоения молекулы ДНК: две цепи расходят ся. Каждая цепь из нуклеотидов служит матрицей или шаблоном для достраи вания к ней дополняющей е цепи из нуклеотидов. Когда этот процесс закон чится, у нас будет уже не одна, а две пары цепей, т.е. две молекулы ДНК.

Одна молекула – для одной хромосомы, другая – для другой, т.е. по одной для каждой из двух дочерних клеток. Для деления клетки на две дочерние, как раз и требуется удвоение хромосомы. Но только теперь становится ясно, что это происходит после удвоения молекулы ДНК. В этом и состоит раскрытие секрета жизни.

В 60-х гг. ХХ в. предположение Д. Уотсона и Ф. Крика о механизме реп ликации, т.е. удвоения ДНК, было подтверждено. Кроме того, было показано, что этот процесс осуществляется при участии специального фермента – ДНК полимеразы.

Примерно в то же время было сделано ещ одно открытие – открытие ге нетического кода. Гены содержат в себе информацию о плане строения клетки и е функционирования, что передается дочерним клеткам. Передатся инфор мация о линейной структуре каждого белка в клетке.

Белки, как и ДНК, представляют собой длинные цепочки из аминокислот.

Аминокислот – 20. Было не ясно, каким образом «язык» ДНК, состоящий из че тырхбуквенного алфавита: А, Т, Г, Ц переводится на «язык» белков, где ис пользуется 20 «букв», первая буква – название аминокислоты.

Было показано, что сочетание из трх нуклеотидов ДНК, каждое из кото рых, называется кодоном, чтко соответствует одной из 20 аминокислот. И, та ким образам, «текст» на ДНК однозначно переводится в белок.

Схема синтеза белка с копии гена, т.е. иРНК в рибосоме: ген – иРНК – белки.

Все свойства клетки в виде «инструкций» заложены в соответствующем гене или генах, а создаются через их продукт – белки. Изменения в гене: дефект его структуры или изменение его экспрессии дадут изменения в его белках – изменения в структуре белка, отсутствие белка, избыток нормального белка. А это вызовет изменения в свойствах клетки.

В чм польза раскрытия секрета жизни?

Между размножением клетки и репликацией ДНК имеется принципиаль ное различие.

Первый процесс – это деление клетки на две. Это клеточный уровень.

Второй процесс – это создание молекулой точной своей копии. Это молекуляр ный уровень. Деление клетки на две дочерние не произошло бы, если не было бы репликации молекулы ДНК.

Отсюда: репликация ДНК – это молекулярная причина, а деление клетки – е следствие.

Таким образам, до раскрытия секрета жизни каждое свойство клетки как живого только описывали, а теперь – объясняют, т.е. знают его молекулярную причину.

Клетка стала предметом изучения биологии, а молекулярные причины свойств клетки, – предметом молекулярной биологии. Она возникла с момента раскрытия секрета жизни.

Зная молекулярную причину каждого свойства клетки, можно на не воз действовать. Это дало возможность учным управлять живым;

управлять – это, значит, уметь изменять свойства живого.

Пример В отличие от нормальной клетки, раковая клетка – бессмертна за счт восстановления в ней после каждого деления длины теломер.

Причина этого свойства – молекулярная: в раковой клетке включн ген теломеразы, а она восстанавливает длину теломер.

Цель: лишить раковою клетку свойства бессмертия, т.е. сделать е смерт ной. Здесь ген и его фермент – теломераза будут целями или мишенями для воздействия.

Для прекращения функции гена можно в раковую клетку ввести анти смысловую РНК к иРНК, т.е. к копии гена. Она по принципу комплементарно сти пар оснований соединится с иРНК, и тогда синтеза теломеразы уже не бу дет.

Чтобы блокировать теломеразу, можно по е трехмерной структуре син тезировать молекулу лекарства, комплементарную к активным участкам фер мента теломеразы. Его ввести в раковую клетку, оно соединится с теломеразой по принципу – «ключ-замок», и теломераза будет блокирована. В результате в раковой клетке теломеры уже не будут достраиваться перед делением, и клетка погибнет через апоптоз.

Но эти средства блокирования гена теломеразы не всегда могут быть эф фективными. Недавно сделано открытие – «малые интерферирующие РНК», введение которых в организм специфично «выключает» конкретный ген путем разрушения его копии – иРНК (см. раздел 8.1.).

Вот это и означает – управлять живым, в данном случае, раковой клеткой, воздействуя на молекулярные причины ее свойств.

Открытие того, что каждое свойство клетки в норме, а значит, и при бо лезни, создатся молекулярной причиной, привело к открытию молекулярной медицины.

Теперь мы знаем, что гены и их белки каждого свойства раковой клетки – это метки или маркеры для е диагностики. Они же – цели или мишени для ле карств, избирательно уничтожающих раковые клетки.

Точно также находят гены-маркеры и белки-маркеры для свойств возбу дителей различных инфекций – бактерий, вирусов и др.

На примере со свойством бессмертия раковой клетки мы дали три спосо ба уничтожения носителя этого свойства, т.е. раковой клетки.

Во-первых, через связывание копий гена-маркера этого свойства – иРНК.

Во-вторых, с помощью лекарства, связывающего белок-маркер, т.е. тело меразу, которая создат свойства бессмертия раковой клетки.

В-третьих, «выключение» гена свойства бессмертия раковой клетки пу тем разрушения его копий иРНК с помощью интерферирующей РНК.

Создание лекарств по генам-маркерам и белкам-маркерам позволяет, дей ствуя только на них, избирательно уничтожать их носителей, не давая побоч ных эффектов. Это и есть молекулярная или генная медицина.

В ближайшие годы ХХI-го века эта медицина должна заменить сущест вующую, которую теперь уже называют, – «старой». Ведь при «старой» меди цине лекарство создают методом «проб и ошибок», поэтому они часто и вызы вают у пациентов тяжлые побочные эффекты. В этом смысле в трудном поло жении находится сегодня стандартная химиотерапия рака.

Основные причины этого: 1) раковая клетка – это эукариот среди нор мальных клеток организма человека, тоже – эукариотов;

2) отставание науки до последних лет об источниках канцерогенеза и его молекулярных причинах.

Лекарства стандартной химиотерапии сами по себе не могут различать раковую клетку среди нормальных клеток и направлены на уничтожение слиш ком быстро делящиеся клетки, к которым относили каждую клетку рака.

Недавно выяснено, что канцерогенез из двух источников: 1) из нормаль ной клетки ткани, ставшей прежде стволовой клеткой, или 2) из стволовой клетки ткани.

Оказалось также, что в составе клеток рака клетки неодинаковые:

- основную массу клеток составляют нераковые клетки: они быстро де лятся и после выполнения функций ткани сами погибают через апоптоз;

именно эти клетки – мишени для лекарств стандартной химиотерапии;

- значительно меньшую часть составляют раковые клетки: это раковые стволовые клетки, которые асимметричным делением копируют себя и генери руют нераковые клетки в составе клеток рака.

При этом, раковые стволовые клетки делятся редко и медленно. Это при чина того, что лекарства стандартной химиотерапии оказываются неэффектив ными против раковых стволовых клеток (J.E. Trosko et al., 2005).

До сих пор в клинической практике преобладают пациенты с симптомами рака и крайне редко встречаются пациенты, у которых рак – «ин ситу», т.е. на месте.

Начинать лечение рака при его симптомах – это уже очень поздно. Ведь раковые клетки начинают распространяться по организму при размере рака в ткани какого-либо органа всего лишь 2 мм в диаметре, т.е. с началом в узелке ангиогенеза и лимфангиогенеза.

Теперь же, когда наступила эра молекулярной медицины, пациента нач нут лечить ещ до того, как появятся первые симптомы болезни, в том числе и рака: в самом его начале – на уровне первой раковой клетки и е первых потом ков, и даже до его начала – на уровне предраковых клеток.

Определив ген-маркер болезни, можно определить, какой именно белок е вызывает, а значит, надо и создать лекарство против этого белка или его гена – вот и «волшебная пуля», о чм так мечтал П. Эрлих. На этом и будет строить ся фармакология будущего.

Новые лекарства и средства на основе генов-маркеров и белков-маркеров конкретной болезни станут прицельно атаковать только дефектные клетки, уничтожая их, и не повреждая при этом здоровые клетки. Отсюда – не будет побочных эффектов от лекарств у пациента.

Раковая стволовая клетка возникает из нормальной клетки или стволовой клетки ткани из-за дерепрессии в ней генов фетальных белков и одновременно репрессии генов-супрессоров метилированием CpG-динуклеотидов промотора этих генов или мутаций в генах. При этом она становится более живучей, чем нормальная клетка этого же типа.

Раковая клетка нест в себе ряд уловок, делающих е неуязвимой и спо собной к самостоятельному существованию в организме пациента. Т.е. эта де фектная клетка не просто клетка, а целый одноклеточный организм.

«Один в поле не воин», – гласит пословица. Но раковая стволовая клетка организм – «одна в поле воин», так как легко обходит все защитные механизмы организма пациента.

Она в организме, но живт отдельно от него, паразитируя на нм. В орга низме пациента эта клетка-организм занята лишь одним делом – копированием себя и разрушением тканей и органов своего носителя вплоть до его смерти и погибает сама лишь после его смерти.

Из того, что причиной любой болезни являются гены и их продукты – белки в клетке, вытекают состояния пациента, знания которых важно для врача любого профиля.

1. Предболезнь.

Любая болезнь начинается с патологии клетки или клеток. Изменения в том или ином гене или генах клетки – не диагностика болезни, а лишь установ ление вероятной предрасположенности к ней.

При таких изменениях в половой клетке употребляют термин – предрас положенность к болезни, а в соматической клетке, чаще говорят – предболезнь.

При предболезни такой ген ещ не проявляет себя, так как в клетке ещ нет синтеза продукта гена – белков. При возникновении в нормальной клетке таких изменений в генах, – это предраковая клетка.

«Ремонт» такого гена или генов, или замена его в клетке на нормальный ген, «выключение» генов свойств раковой клетки ликвидируют предболезнь.

2. Болезнь.

Когда в клетке под контролем гена или генов уже есть синтез его продук та – белков, то это признак того, что ген уже начал разрушительную работу в клетке, ведущую к болезни.

Здесь изменения в гене или генах – первопричина болезни клетки, а из менения свойств клетки вызываются продуктом гена, т.е. его белками. Эти свойства формируют затем симптомы конкретной болезни.

Ген-причина в клетке – это ген-маркер, а его белок – белок-маркер. Инги бирование гена-причины и его продуктов – белков в клетке, может остановить болезнь.

3. Ранняя диагностика болезни.

До сих пор многие болезни и среди них тяжлые, в том числе – рак, диаг ностируются на этапе их симптомов. Лечение многих болезней на таком этапе крайне затруднительно в смысле излечения или даже невозможно.

Теперь диагностика любой болезни, в том числе, самой опасной болезни – рак, станет возможной в досимптомном периоде.

«До начала». Это будет осуществляться путм выявления в клетке или клетках у пациента гена-маркера конкретной болезни. В отношении рака – это будет диагностика предраковой клетки или клеток.

«С самого начала». Это будет осуществляться выявлением в клетке или клетках не только гена-маркера, но и белка-маркера для конкретной болезни. В отношении рака, это будет выявлением в организме пациента первой раковой клетки и е близких потомков.

Материалами для этих исследований могут быть: образцы ткани фоново го процесса соответствующего органа – биопсия, а также кровь и другие биоло гические жидкости от пациента.

При любой локализации рака у пациента в крови за счт мозаичности ка пилляров узелка рака могут быть обнаружены как сами раковые клетки, так и их маркеры: в плазме крови – гены-маркеры, а в сыворотке крови – белки маркеры из раковых стволовых клеток.

В плазме крови могут быть гены-маркеры из предраковых клеток, а также гены-маркеры – из раковых клеток, но различить их практически невозможно.

Теоретически найти эти различия можно с помощью МС-ПЦР и ПЦР ММК и белковых микрочипов.

Если в плазме крови от пациента будут обнаружены гены-маркеры, ха рактерные для раковой клетки, а в сыворотке этого же образца крови отсутст вуют соответствующие белки-маркеры, то это могло бы указывать на присутст вие предраковых клеток.

Обнаружение в плазме крови от пациента генов-маркеров из раковой клетки, можно было бы обозначать как I уровень ранней диагностики рака, так как нарушения в генах – это первопричина превращения нормальной клетки в раковую клетку. Тогда обнаружение белков-маркеров из раковых клеток в сы воротке крови от пациента – это II уровень ранней диагностики рака, так как белок-маркер – это продукт гена.

4. Лечение болезни.

Для этого в качестве мишеней для лекарств и средств будут использо ваться – гены-маркеры и белки-маркеры клеток при каждой болезни.

Это новые лекарства и средства, которые будут прицельно действовать только на дефектные клетки, а для рака – это раковые стволовые клетки, не за трагивая при этом нормальные стволовые клетки. То есть эти лекарства и сред ства будут избирательны и индивидуальны для конкретного пациента (А.И.

Арчаков, 2000).

5. Критерии излечения от болезни и контроль.

Гены-маркеры и белки-маркеры позволят обнаружить дефектные клетки при любой болезни тогда, когда никакими другими методами их еще нельзя об наружить в организме пациента.

Они позволят обнаружить рак у пациента при размере узелка из раковых клеток в ткани диаметром в 2 мм (А.С. Белохвостов, 2000).

Количество или титр генов-маркеров и белков-маркеров в крови из де фектных клеток конкретной болезни или из раковых стволовых клеток позво лит осуществлять слежение за процессом лечения болезни и результатом лече ния пациента.

Если титр маркеров в процессе лечения не уменьшается, тактику лечения нужно менять. Полное отсутствие маркеров через две-три недели после окон чания лечения – признак излечения пациента от болезни.

Очень удобно будет вести такой контроль с помощью биочипов: ДНК чипы для генов-маркеров, а белковые чипы – для белков-маркеров дефектных клеток конкретной болезни и раковых стволовых клеток рака.

1.3. Открытие строения генома человека – значение для медицины и онкологии Причина любой болезни внутри клетки или клеток, – на уровне молекул ДНК и белков. В будущем причины болезней будут обнаруживать на уровне атомов и их электронных оболочек.

В настоящее время нарушения в молекулах ДНК и белков клетки или клеток – истинная причина любой болезни. Для понимания болезни, е ранней диагностики и излечения, необходимо знать их молекулярные причины.

Но это прежде требует знаний структуры и функций молекул ДНК и бел ков в нормальной клетке каждого типа. На уровне ДНК – это гены.

Ген – это фрагмент ДНК, который нест информацию о структуре иРНК, других РНК и белков.

Геном – это совокупность генов и межгенных участков в молекулах ДНК.

Геном изучает наука – геномика.

В ядре любой соматической клетки человека имеется 23 пары хромосом.

Каждая хромосома содержит одну молекулу ДНК из двух цепочек. Каждая це почка построена из нуклеотидов, в каждом по одному из азотистых оснований.

Всего азотистых оснований четыре: аденин, тимин, гуанин, цитозин. Для крат кости их обозначают первыми буквами слов – А, Т, Г, Ц. Эти буквы – алфавит ДНК.

Каждая молекула ДНК представляет собой целый ряд генов. Так как ДНК построена из двух цепочек, то е длина измеряется числом пар оснований, а каждую пару обозначают словом «буква».

Две цепочки из нуклеотидов с помощью пар оснований соединяются вме сте и образуют целую молекулу ДНК. Пары оснований комплементарны друг другу и соединены между собой водородными связями только такими сочета ниями: А-Т или Т-А;

Г-Ц или Ц-Г. На протяжении всей длины молекулы ДНК можно видеть такие сочетания оснований. Но порядок размещения пар основа ний или их последовательность для каждого гена свой. Именно в последова тельности пар оснований или «букв» и заключена генетическая информация.

Это инструкция о том, как должна быть построена клетка каждого типа, и как она должна функционировать. Это относится и к организму в целом. То есть генетическая информация всех генов – это «рецепт» построения и функциони рования организма человека.

Из этого ясны цели открытия строения генома:

1) выявить последовательность пар оснований каждого гена вдоль длины молекулы ДНК;

2) определить место каждого гена и его границы по длине молекулы ДНК. Это необходимо было сделать в каждой хромосоме – с 1-й по 23-ю.

Весь процесс открытия строения генома человека состоял из этапов:

1) разделение молекул ДНК на большие фрагменты и секвенирование (от лат. sequi – следовать), т.е. определение последовательности пар оснований или «букв»;

2) картирование, т.е. идентификация генов и локализация места их распо ложения на хромосомах.

На первом этапе было обнаружено, что ДНК человека в 23-х хромосомах состоит из 3,2 млрд. пар оснований, т.е. химических «букв». Каждая пара осно ваний – это «кирпичик», из которых формируются гены.

На втором этапе учные расположили эти пары оснований в правильной последовательности, что позволило «прочитать» каждый ген и произвести ин вентаризацию генов и межгенных участков. Так была составлена карта топо графии генов на хромосомах. Но эти данные будут ещ уточняться и допол няться.

Прямая выгода от знания строения генов станет очевидна не сразу, пока не будут выяснены функции каждого гена в клетке, т.е. что он делает?

До открытия строения генома учные знали функции ряда генов. В целом учные знают о функциях не более одной трети генов, а о двух третях их – ни чего.

То есть учным ещ предстоит выполнить важнейший третий этап – вы яснить функции каждого гена в клетке каждого типа в норме. Важно узнать, ка кие гены в такой клетке работают, а какие «молчат». Затем учные то же сде лают в дефектной клетке того же типа, например, в раковой клетке. По разнице можно выявить ген-причину, но это лишь один из путей обнаружения раковой клетки.

Что пока дало открытие строения генома?

1. Оказалось, что в геноме человека всего 26-30 тысяч генов, а не больше, как предполагалось.

Очевидно, не зря в клетках человека обнаружено «расщепление» генов.

За счт этого с гена может копироваться не одна иРНК, а больше – в среднем до 10 таких молекул. Отсюда продукт гена – белок не один, а несколько – от 3 до 10 разных белков.

То есть в схему этапов реализации генетической информации от гена к его основному продукту, следует внести уточнение: ген – иРНК – белки, вместо – «белок» в прежней схеме.

Считают, что у человека «один ген отвечает за группу функций» или «за одну функцию отвечает сразу целая группа генов». Это будет изучено, так как есть методы определения функций генов.

2. Лишь 2% всех генов участвует в синтезе белков в клетке, остальные – 98% длины ДНК до недавнего времени считалось – не являются генами. Это длинные последовательности нуклеотидов, в которых часто повторяется – АГГ, АГГ… Функции этой части генома только начинают изучаться. Но уже ясно, что это не «мусор», как некоторые считали, а часть ДНК, которая регулирует экспрессию генов и их связей между собой.

3. Небольшое число генов в геноме человека имеет важное практическое значение – легче разобраться в роли генов, которые могут вызывать разные бо лезни, в частности, рак.

4. Оказалось, что около половины генов являются общими и для челове ка, и для червячка «C. elegans». Более того, в геноме человека только 300 генов, которых нет в геноме полевой мыши.

Для изучения функций генов широко используется клетки в культуре.

Принцип: с помощью введения в клетки антисмысловой РНК блокиро вать, а теперь можно малой молекулой РНКи разрушить в клетке иРНК, т.е. ко пию изучаемого гена. По изменению свойств такой клетки можно определить функции этого гена.

Открытие общих с человеком генов у червячка и мыши делает эти орга низмы новыми, очень нужными моделями для определения функций неизвест ных у человека генов, но одинаковых с ними. Ведь изучать функции генов на этих организмах проще и легче, чем на человеке. Их гены можно легко изме нять, т.е. вызывать мутации или выключать ген, следя за изменениями свойств клетки или свойств организма.

На мышах можно использовать и такой прим: в половых клетках удалять один, либо два, либо больше генов и изучать организм таких мышей-мутантов.

Это позволит понять какой ген или гены за что отвечают, изучать взаимодейст вие генов между собой.

5. Разница между генами мыши и человека не превышает 1%, а между разными людьми – 0,01%.

На выяснение функций всех генов в клетках каждого типа человека уйдт много лет. Когда это будет достигнуто, учные смогут на уровне нормальной клетки каждого типа установить стандарт или идеал нормы: а) последователь ности пар оснований для каждого гена и б) функций каждого гена в клетке.

Акад. А.И. Арчаков (2000) подчркивает, что «теперь стало совершенно очевидно, что все болезни от генов». На этой основе он впервые предложил классификацию всех болезней на «два больших класса»:

1. Наследственные болезни. Они составляют всего 2% от всех болезней.

Их причина – дефект гена или генов в половых клетках.

2. Ненаследственные или приобретнные болезни. Они составляют 98% от всех болезней. Их причина – нарушения экспрессии гена или генов в сома тической клетке или клетках.

Из причин болезней «сразу» вытекают и методы лечения пациентов: для пациентов первого класса – «перспективна генная терапия», а для пациентов второго класса – «создание новых лекарств».

В настоящее время для оценки функций генов и их изменений в клетках при различных болезнях, в частности, раке, разработан ряд новых методов. Но в клиническую практику они только начинают «входить». Они необходимы для ранней диагностики раковых клеток и для контроля излечения от рака.

1. ПЦР-ММК – это чувствительный и наджный метод получения фраг ментов генов или РНК в неограниченном количестве копий для последующего их анализа. Им можно выявлять любые фрагменты мутантных генов или избы ток иРНК генов из раковых клеток в образцах из плазмы крови и других биоло гических жидкостей, из клеток рака материала биопсий от пациента. А избыток иРНК и мутации в генах – это маркеры раковых клеток.

2. ДНК-чипы. На них можно определять, какие гены в нормальной клетке каждого типа активны, а какие – «молчат». Такие микрочипы позволяют оце нить состояние десятков тысяч генов в клетке и даже сразу всех, т.е. 26-30 ты сяч составляющих геном человека.

ДНК-чипы позволяют произвести раннюю диагностику рака, т.е. первую раковую клетку и е первые потомки по исследованию образца плазмы крови от пациента: в ней можно находить фрагменты генов фетальных белков, на пример, гена oct-4, гена белка «5Т4» и другие, а также фрагменты мутантного гена wt53 – «стража» генома из погибших раковых клеток.

Когда будут выяснены функции каждого гена в нормальной клетке каж дого типа и гены-причины, вызывающие ту или иную болезнь, медицина будет изменена в корне: она станет молекулярной.

Перед учными стоят задачи:

1) какие гены в нормальной клетке разного типа, став дефектными, пре вращают нормальную клетку в раковую клетку;

2) сколько всего дефектных генов вызывает образование из нормальной клетки раковую клетку;

3) влияние таких дефектных генов на организм человека. Для этого необ ходимо создать мышь-мутант с таким дефектом гена или генов. То есть, работы по идентификации генов теперь могут длиться дни, а не годы, как раньше. Но главная задача молекулярной медицины заключается теперь в том, чтобы выяс нить, какие гены и как изменены, что вызывают ту или иную болезнь, в частно сти, канцерогенез, «трансформировать в знание того, что с этим можно сде лать».

Для этого учным потребуется лучше понять, как, строя и поддерживая наш организм, взаимодействуют между собой белки – молекулы, построенные по генетическим «шаблонам» ДНК.

Наука геномика уже существует и активно развивается, но наука протео мика ещ только вначале своего пути. И здесь впереди ещ «долгий путь».

Диагностика болезней будет основана на выявлении дефекта гена или ге нов, или изменения экспрессии генов по иРНК. Такие изменения в генах – это маркеры для ранней диагностики болезни и гены – причины конкретной болез ни. Они же будут мишенями для воздействия лекарственных препаратов.

Среди лекарственных препаратов могут быть: нормальный ген для заме ны дефектного гена в клетке, ингибиторы дефектных генов – введение РНКи в дефектные клетки, «ремонт» генов в клетке и др.

Действие лекарственных препаратов будет избирательным, т.е. без по вреждения здоровых клеток и направлено не на ликвидацию симптомов болез ни, а против гена-причины. Это особенно необходимо соблюдать при лечении рака.

Что даст в перспективе для медицины открытие строения генома?

1. Проведение генетических тестов. Для любой болезни будут определе ны гены-маркеры: а) «до е начала» – это диагностика предболезни и б) «е на чало» – это ранняя диагностика болезни – I уровень.

По одному небольшому образцу крови или плазмы от пациента достаточ но, чтобы определить степень риска возникновения болезни, в том числе появ ления первых раковых клеток в организме. Для этого наука быстрыми темпами разрабатывает детальные тесты, что позволит очень рано выявлять предболезнь или болезнь. В таких случаях применение избирательных лекарственных пре паратов может предотвратить возникновение болезни, в частности, рак.

2. Создание индивидуальных лекарственных препаратов. Лекарство будет создаваться для конкретного пациента. На уровне ДНК эти лекарства будут на правлены против дефектов генов и их иРНК. В отличие от существующих пре паратов, новые препараты будут давать максимальный эффект, а их избира тельное действие на клетки-мишени предупредит побочные эффекты у пациен та.

3. Проведение генной терапии. В настоящее время любой ген можно кло нировать или синтезировать. Сам по себе такой ген, введенный в организм лю бого вида, не отторгается этим организмом.

Для излечения рака генная терапия крайне необходима. Для этого уже разработано много методов, но в клиническую практику только начинают вне дряться.

Например: введение в раковые клетки нормального гена-супрессора wt белка р53 при мутациях его в раковой клетке, «гена-смерти» bах для индукции апоптоза в раковые клетках, подавление экспрессии генов oct-4, Nanog, hTERT, циклина D1, генов mts1 и остеопонтина и других генов инвазии раковых кле ток.

До сих пор считалось, что хранилищем генетической информации явля ются только гены, кодирующие белки. Но в некодирующих белки областях ДНК, которые долгое время относили к «хламу», оказалось множество генов, кодирующих только малые, т.е. короткой длины двухцепочечные молекулы РНК. Они то и осуществляют контроль обычных генов – избирательно подав ляя их экспрессию в клетке, путем разрушения копии, т.е. иРНК гена. Это ин терферирующие РНК (РНКи).

Фенотип клетки любого типа во многом определяется метильными груп пами – (-СН3). Они могут связываться с цитозином (С), когда в одной цепи нуклеотидов за ним следует гуанин (G) – это дуплет CpG. Такие дуплеты часто располагаются в промоторе генов.

При присоединении к CpG – островкам метильной группы метилтрансфе разой, – ген выключается, а когда удаляется метильная группа деметилазой, – ген включается. Важно то, что при этом последовательность нуклеотидов не за трагивается. Отсюда и название этого явления – эпигенетическое изменение ге на. «Эпи» в переводе с греческого, – это «над» генами.

Открытие строения генома человека, – «это только начало пути», подчер кивает У. Гиббс (2004). В настоящее время учные приступили к изучению эпи генома, конечная цель которого – составление карты «всех сайтов метилирова ния в ДНК».

В отличие от мутаций метилирование и деметилирование промотора ге нов – процесс обратимый. В каждой нормальной клетке разного типа «рису нок» метилирования свой. Кроме редких типов клетки, ошибки в метилирова нии – главная причина превращения нормальной клетки в раковую клетку.

Для раковой клетки характерны:

- снижение метилирования геномной ДНК в целом;

- деметилирование ряда фетальных генов, что приводит их к дерепрессии;

- метилирование генов-супрессоров, препятствующих в норме превраще нию нормальной клетки в раковую клетку;

- введение деметилирующих лекарств в эти гены возвращает гены в нор мальное состояние. Однако, в раковой клетке в отличие от нормальной клетки, такое изменение часто нестабильно. Учные заняты решением этой очень важ ной проблемой для онкологии.

Эпигенетическими изменениями занимается наука эпигенетика – е объ ект эпигеном человека.

4. Открывается подход к определению состояний живого существа.

«Живое существо» или «живое» начинается с уровня клетки, ниже этого уровня молекулы, ещ ниже – атомы и их электроны. Но это уже не живое.

Понятие «состояния» относится к живому существу, так как только живое существо, а не молекулы или атомы, могут реагировать на раздражители.

Состояния живого существа известны с глубокой древности – из работ нашего великого соотечественника – учного и врача ибн Сины (980-1037 г.).

Величайший труд ибн Сины «Канон врачебной науки» охватывает все разделы средневекового медицинского знания. Он включает анатомию и фи зиологию человека, патологию, лекарствоведение, клиническую диагностику и лечение болезней.

Этот труд по своей роли в истории медицины ученые сопоставляют толь ко с Гиппократовым сборником.

«Канон» был составлен в первые десятилетия XI в., впервые был отпеча тан на арабском языке в Риме в конце XVI в., затем был ряд переводов его на латинский язык.

Много веков подряд его штудировали в университетах и школах Запада и Востока как обязательное руководство для врачей. Да и сегодня каждый чита тель находит в нм много интересного и поучительного.

Ибн Сина определял медицину так: «медицина – наука, познающая со стояние тела человека, поскольку оно здорово или утратит здоровье, ради того, чтобы сохранить здоровье и вернуть его, если оно утрачено».

«Познание всякой вещи, если она возникает, достигается и бывает совер шенным через познание е причин, если они имеются». Поэтому ибн Сина го ворит: «в медицине следует знать причины здоровья и болезни. Причины эти бывают явные и скрытые».

«В истинных изъяснено, что познание вещи приобретается через позна ние е причин и начал. Материальные причины – это заложенные в теле осно вы».

Теперь нам можно перейти к определению состояний живого существа.

Среди состояний живого существа ибн Син различал: «здоровье» и «ут рата здоровья». В утрату здоровья он включал два состояния: «болезнь» и «не здоровье и не болезнь». Для сегодняшнего дня «не здоровье и не болезнь» – это предболезнь.

Познание состояний живого, писал ибн Син, требует знания их причин. И на это ушли века. Многие учные пытались дать определение «болезни», а оп ределения «здоровья» практически не касались. Но мы до сих пор не имеем правильного и понятного определения ни здоровья, ни болезни.

На наш взгляд, выделенные впервые ибн Син состояния живого, – основа для их определения.

Лишь недавно прогресс науки – расшифровка генома человека и начало изучения его эпигенома дают нам возможность решить эту проблему или за метно приблизиться к ней. Но для этого прежде надо дать ответ на вопрос: что является причиной этих состояний?

Ответ: причиной является эпигеном живого существа, так как: 1) именно эпигеном «контролирует и регулирует работу каждого гена» в клетке и 2) на рушения экспрессии гена или генов в нормальной клетке – причина болезни (А.И. Арчаков, 2000).

Анализ эпигенома позволит определить каждое из этих состояний, в том числе промежуточное состояние – предболезнь;

в схеме это можно было бы сделать так1:

а) на уровне соматической клетки 1. Идеальный эпигеном клетки - Здоровье клетки 2. Изменения в эпигеноме клетки без - Предболезнь клетки нарушений е функций 3. Изменения в эпигеноме клетки с - Болезнь клетки нарушениями е функций б) на уровне эпигенома человека по анализу клеток крови 1. Идеальный эпигеном человека - Здоровье человека 2. Изменения в эпигеноме без - Предрасположенность к болезни нарушений функций организма или предболезнь человека 3. Изменения в эпигеноме с - Болезнь человека нарушениями функций организма Примечания:

1. В пункте «а» тип исследуемой клетки должен быть одинаковым с ти пом клетки идеального эпигенома.

2. Регистрация отличий эпигенома исследуемого образца от идеального эпигенома.

3. Сравнение эпигеномов проще проводить на ДНК-чипах.

Идеальный эпигеном, т.е. стандарт здоровья.

Глава 2. Протеом нормальной соматической клетки 2.1. Протеом клетки – значение для медицины, ранней диагностики раковой клетки и излечения рака Скоро нынешняя медицина уйдт в прошлое. Давняя мечта П. Эрлиха – иметь лекарство без нанесения вреда пациенту – «волшебную пулю», станет реальностью.

Оно будет уничтожать: при инфекциях – возбудителей, при раке – рако вую стволовую клетку, не повреждая здоровых клеток, действуя на белок, вы зывающий болезнь. Для каждого пациента будут создаваться индивидуальные лекарства. Это началось после открытия структуры генома человека.

Что мешало этому раньше?

Причина – нынешний принцип создания лекарств. Их открывают слепым подбором веществ-«кандидатов» на лекарства (А.М. Егоров, 2002). Механизм их действия тот же: действие на те же мишени в возбудителях, в раковой клетке – на е ДНК, повреждая е в той же степени и в окружающих здоровых клетках.

Но раковые клетки – клетки-организмы, очень живучи и коварны. Многие из них остаются не пораженными намертво включением гена MDR1 P гликопротеина: лекарства активно выводятся в межклеточную среду и клетки продолжают размножаться. Даже адресная доставка лекарств в раковые клетки, рассеянные по организму, но без подавления этого гена или белка, бессильна против них.

Выход из этого один: отказ от слепого способа создания лекарств, поиск в раковой клетке белков-маркеров и синтез против этих мишеней лекарств.

Что такое белок?

Белок-маркер раковой клетки находится на е поверхности, на нормаль ной клетке того же типа его нет. Все болезни начинаются с уровня гена и его продукта – белков. Простые белки или протеины состоят лишь из остатков аминокислот.

Белки или протеины известны с начала XIX в. Химики выбрали термин «протеины» для этих веществ, от греч. proteios – «первый», так как в начале XX в. стало ясно, что белки – главные участники всех жизненных процессов в клетке. После открытия структуры генома оказалось, что знания о нм можно применить на практике лишь: 1) через белки и 2) именно белки создают все свойства клетки. Любой белок – это продукт гена. В схеме это выражается так:

ген — иРНК — белки При любой болезни в клетке, в частности, раковой, какой-то ген или гены изменены. Поэтому в е белках произойдут соответствующие изменения: 1) нет белка или его мало;

2) изменена первичная структура белка;

3) избыток нор мального белка в клетке;

4) нет деградации дефектного белка в клетке.

Что такое протеом?

Термин «протеом» образован от слова «протеин» и окончания слова «ге ном».

Протеом – это набор белков в данной клетке в определенный момент времени. Его изучает наука – протеомика.

Набор генов в каждом типе клетки один и тот же, а набор белков в клетке каждого типа свой. Причина в том, что в одном типе клетки активны одни гены, в другом – другие.

Сколько белков в нормальной клетке каждого типа – никто пока не знает.

По некоторым данным в одной клетке может быть до 1 миллиона белков.

Учные торопились открыть строение генома клетки для того, чтобы по нять, какие белки участвуют в выполнении функций в нормальной клетке каж дого типа и в дефектных клетках при различных болезнях.

Как образуются белки?

Для синтеза белка с его гена снимается копия – иРНК. Этот процесс на зывается транскрипцией. До последнего времени считалось, что с каждого гена снимается копия одного белка. Теперь оказалось, что с различных участков ге на снимается несколько копий – до 20, значит, синтезирован будет не один бе лок, а несколько.

Синтез белка происходит на рибосоме, иРНК, т.е. копия гена, является матрицей для синтеза белка. Этот процесс называется трансляцией. В нм уча ствуют и другие РНК.

Функции каждого белка зависят от: 1) порядка или последовательности аминокислот в белке и 2) его пространственной структуры, т.е. трхмерной формы.

Порядок, в котором выстраиваются аминокислоты и какие аминокислоты, диктуются копией гена, т.е. иРНК. Это фрагмент из нуклеотидов, каждый из которых содержит одно из азотистых оснований, которых четыре: аденин, ти мин, гуанин, цитозин.

Из трх нуклеотидов в ряд образуется кодон и порядок оснований в нм диктует, какая из аминокислот будет синтезироваться. Например, участку ко пии гена Т-Т-Т соответствует аминокислота лизин, а участок цепи гена А-Ц-А – цистеину и т.д.

На рибосоме по последовательности оснований синтезируются амино кислоты, а они в той же последовательности соединяются в цепь – первичную структуру белка. Как транскрипция, так и трансляция осуществляются специ альными ферментами, ген в этих процессах дает только программу синтеза.

После синтеза этот продукт должен претерпеть ряд химических измене ний и только после этого принимает пространственную структуру – трх мерную форму. Только в такой форме молекула белка в состоянии выполнять свои функции в клетке.

Пространственная структура молекулы белка – это «все эти выпуклости, бороздки и изгибы, позволяющие белку реагировать с другими молекулами в клетке» (А.И. Арчаков, 2001). Очень часто дефект именно в этой структуре ме шает белку выполнять свои функции в клетке. Информация о пространственной структуре каждого белка – своя, она постоянная и неизменная. Это опознава тельный знак или пароль для иммунной системы. Любой незнакомый организ му белок подлежит уничтожению.

На поверхности раковой клетки из-за эпигенетических изменений в ней имеются фетальные белки, которых нет на нормальной клетке этого же типа.

Они «свои» для клеток иммунной системы, но являются белками-маркерами для диагностики раковой клетки.

На раковой клетке могут быть белки от мутации некоторых генов супрессоров. Такие белки на клетке могут быть белками-антигенами, так как их синтез не закодирован в геноме организма-хозяина. Это метки или маркеры.

По метке иммунная система распознает раковую клетку, связывается с этим белком, уничтожает этот белок, а вместе с ним и его носителя – раковую клетку.

Считают, что отдельные раковые клетки иммунная система пациента спо собна уничтожать. Но против потомства раковых клеток, т.е. рака, обычно не эффективна. Это объясняют рядом причин.

В последнее время выяснено, что мутации генов в клетках иммунной сис темы способствуют «избеганию раковых клеток от клеток иммунной защиты».

Такие клетки иммунной системы не способны бороться с раковыми клетками.

Ключ к пониманию этого процесса может изменить подход лечения рака.

Функции белков в клетке Все функции клетки каждого типа выполняют белки. Учные это вы ражают так.

N.J. Anderson (1998) считает, что: «белки определяют активную жизнь клетки, а гены представляют собой только план этой активности».

Акад. А.И. Арчаков (2003) пишет, что информация в генах – «это знания того, что может быть», а знания о состоянии белков в клетке, – «это ко нкретное знание того, что есть».

А. Волков (2002): «гены – всего лишь инструкция или схема, по кото рой изготавливается подлинный продукт – протеины, т.е. белки».

В генах все определяет последовательность нуклеотидов, в белке – по следовательность аминокислот.

Функции белков в клетке каждого типа: белки – это строительный мате риал;

белки-переносчики различных сигналов;

белки-рецепторы для перенос чиков этих сигналов;

белки – это антитела в организме;

важнейшими среди всех белков в клетке являются белки-ферменты, катализирующие каждую химиче скую реакцию в клетке и др.

Методы определения пространственной структуры молекулы белка Белок устроен намного сложнее гена. Если ген составлен из четырх ви дов нуклеотидов и его строение может быть записано в виде текста из четырех букв – А, Т, Г и Ц, то для записи строения белка нужен уже двадцатибуквенный алфавит.

Если генов в каждой клетке человека тридцать тысяч, хотя скорее всего будет больше, то различных белков – около миллиона. Ген лишь кодирует на бор аминокислот – «молекулярных кирпичиков», из которых состоит молекула белка.

Линейная последовательность аминокислот в живой клетке сворачивается в молекулу белка со строго определенной для каждого белка пространственной структурой. Такой процесс самосборки называется фолдингом (от англ. to fold – сворачиваться). Этот фолдинг контролируется в клетке агрегатом из белков под названием «шаперон». По форме он напоминает «ведрко». Он проверяет про странственную структуру у каждой молекулы белка.

Из-за повреждения гена нарушается конфигурация его молекулы белка. В таком случае «шаперон» это распознат, втягивает белок в «ведрко», развора чивает молекулу в исходную цепь аминокислот и выбрасывает «на свободу», т.е. дат ей попытку ещ свернуться правильно.

Процесс фолдинга для медицины имеет огромный интерес. Правильная структура белка обеспечивает правильную функцию, а нарушение простран ственной структуры приводит к неспособности такого белка выполнять свою функцию, и как следствие, к возникновению патологии.

В настоящее время для определения пространственной структуры белка исследователи используют технологии, которые основаны на определении по ложения каждого атома в данном конкретном белке. В первую очередь это ме тод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), а также рентгеноструктурный ана лиз кристаллов белка.

В этом знании недавно сделан настоящий прорыв. В 2002 г. объявлены Нобелевскими лауреатами по химии специалисты в области масс спектрометрии американец Дж.Б. Фенн и японец К. Танака, а также швейцарец К. Вютрих – специалист по проблемам ядерно-магнитного резонанса.

Учные разработали методы, позволяющие быстро и надежно опреде лять: какие белки содержаться в пробах, а также воспроизводить трхмерное изображение молекул белков в растворе.

В заявлении при вручении премии было сказано, что награды «за успехи в понимании жизненных процессов», т.е. появляется возможность увидеть бел ковые молекулы и понять механизм их функционирования.

Учные поясняют, – за разработку мощных аналитических методов для исследования больших молекул – белков, что может привести к появлению но вых эффективных лекарств.

Считают, что именно эти учные дали жизнь протеомике – познанию структуры и функций белков, их роли в поддержании жизни.

Дж.Б. Фенн и К. Танака ранее разработали метод для определения состава и размера больших биомолекул. До них масс-спектрометрия использовалась только для малых молекул.

Тогда же К. Вютрих создал метод, основанный на ядерном магнитном ре зонансе и позволяющим определять структуру белка.

В результате работ этих учных стало возможным делать трхмерное изображение молекул белка, а из этого понимание, как работает в клетке тот или иной белок. В настоящее время с помощью ядерного магнитного резонанса по методу К. Вютриха получают 20% всех «снимков» молекул белка. За эти от крытия этих троих учных называют – «отцы-основатели протеомики».

Но, принимая во внимание громадное количество атомов даже в про стейшей молекуле белка, очевидно, что такие методы очень трудомки, дли тельны и дорогие, т.е. «не для нас» (А.И. Арчаков, 2000).

Поэтому учные заинтересовались, можно ли предсказывать трхмерную структуру белка, основываясь лишь на известной последовательности его ами нокислот или генетического кода, который определяет последовательность аминокислот. Предсказание, какая молекула белка получится из последова тельности азотистых оснований конкретного гена – одна из важнейших задач, встающих после определения генома человека.

Оказалось, что с помощью компьютерного моделирования становится во зможным правильно предсказывать пространственную структуру белка.

Зная свойства аминокислот притягиваться или отталкиваться друг от дру га и применив компьютерное моделирование, теоретически можно спрог нозировать и их расположение в пространстве. Число работ с использованием молекулярного моделирования растт год от года, и на пути предсказывания конформации молекул белка приближаются большие сдвиги. До сих пор неиз вестно, почему конкретные белки выглядят именно так, а не иначе.

Используя пространственную структуру белка с помощью передовых технологий, позволило полностью отказаться от «метода проб и ошибок» в по иске новых лекарств – лиганд. Для нас – это поиск лекарств от раковых клеток.

Раковая клетка или клетки возникают в любом организме, даже у здоро вого человека. Она имеет аномальное строение и нарушенные функции. Е по явление обусловлено каким-либо из канцерогенов: радиация, химические веще ства, токсические продукты кислорода, а также ошибками в репликации генов и другими причинами.

Возникновение раковой клетки в организме – это ещ не болезнь, но е начало. Если она не будет уничтожена апоптозом, то из не возникнет потомст во клеток, т.е. рак.

Все белки раковой клетки кодируются геномом организма-хозяина, по этому они не являются белками-антигенами. Исключение могут составлять белки, возникающие из-за мутации в гене-супрессоре раковой клетки.

Отсутствие белков-антигенов на поверхности раковой клетки или их мало и «слабые», – главные причины отсутствия ответа клеток иммунной системы на раковые клетки.

Если бы на раковой клетке были бы белки-антигены, то проблем излече ния пациента от рака вообще не существовало бы.

Никакая бактерия или вирус извне, никогда не создадут таких трудностей в диагностике их и излечении от них пациента, какие создает раковая клетка, так как она – «возбудитель» изнутри, т.е. из клетки своего организма.

Как уже было сказано выше, каждый белок, в том числе чужеродный, вы полняет определнную функцию в клетке. Наша задача заблокировать его дей ствие или в другом случае восполнить функцию поврежднного белка.

Как можно заблокировать фетальный белок в раковой клетке?

Любой белок взаимодействует с другими белками или менее сложными веществами посредством активных зон. Эти активные зоны – как специали зированные разъмы, к которым возможно присоединение других веществ. Для того чтобы заблокировать белок, надо присоединить к его активной зоне неко торое вещество, т.е. молекулу, которая полностью погасит активность этой зо ны, а также создаст прочную химическую связь с белком-мишенью, с тем, что бы эта связь была неразрывна. Такое вещество, т.е. молекула, и называется ли ганд.

Молекула-лиганд – это «слепок» с активных зон белка-мишени. Получив его – вот и «волшебная пуля» против раковой клетки. Однако это не совсем так:

для каждого белка поиск лиганда требует множество опытов, что на практике занимает ряд лет.

Поэтому учные и пришли к мысли – моделировать задачу химической реакции белка и лиганда на компьютере. Здесь компьютер в роли «электронной пробирки», в которой по заданным параметрам, проводится процесс отбора нужных лигандов. На компьютере получают некоторые лиганды, которые он «примеряет» к белку-мишени, вычисляя параметры реакции каждого лиганда с этим белком.

Сейчас учные приближаются к решению «обратной задачи» – не искать лиганд для известного белка, а определить белок-мишень по структуре из бирательно связываемого им лиганда.

Цели протеомики 1. Инвентаризация белков в нормальной клетке каждого типа;

белки маркеры данного типа клетки.

2. Пространственная структура всех белков нормальных клеток каждого типа и их функции;

белки-рецепторы и белки-лиганды клеток.

3. Потенциальная способность белков взаимодействовать с другими мо лекулами в организме, например, лекарственные средства.

4. Поиск алгоритма формирования пространственной структуры белков в нормальной клетке.

5. Поиск белков, причастных к возникновению разных болезней у чело века, в том числе белки, превращающие нормальную клетку в раковую. Эти белки – маркеры больной и дефектной клеток и мишени для воздействия на них лекарств.

6. Составление белковых тестов с помощью белковых микрочипов для ранней диагностики любой болезни, в том числе рака, в самом е начале и даже до е начала. Это есть II уровень ранней диагностики любой болезни, так как белок – это продукт гена.

На основе генов-мишеней и белков-мишеней лекарства и их дозы будут индивидуальными, т.е. для конкретного пациента. На основе белка-мишени можно будет создавать вакцины против любой болезни – для лечения и профи лактики.

По изменениям генома раковой клетки будет определн е протеом. В нм будут опознаны белки, специфичные для раковой стволовой клетки, и рас считана их пространственная структура. С помощью скрининга найдены лекар ства, избирательно связывающиеся с этими белками. Геномика найдт гены мишени в раковой клетке.

Прицельно действующие лекарства против генов-мишеней и белков-ми шеней при различных болезнях – это «волшебные пули». О них мечтал сто лет назад великий П.Эрлих.

Как пишет акад. А.И. Арчаков (2002), рано или поздно генная и белковая диагностика болезней и, прежде всего раковых клеток, «станут массовыми» и окажутся «привычным делом, как анализ крови». Лекарства будут попадать точно «в цель», т.е. в ген-маркер и белок-маркер в дефектных клетках, поэтому, не вызывая побочных эффектов.

Сравнивая генные и белковые картины нормальной клетки данного типа и раковой клетки того же типа, можно будет оценивать эффект лекарств. И, на конец, сама медицина повернтся лицом к пациенту, став персонифицирован ной.

2.2. Сигнальный пептид Г. Блобеля, управляющий транспортом бел ков и их локализацией внутри клетки,1 – значение для онкологии В клетке любого типа много отделов – органелл: ядро, митохондрии и др.

Они окружены мембранами, как и сама клетка. В каждой клетке около милли арда белковых молекул, т.е. белков разного типа.

ДНК клетки – это «чертж» построения клетки, а белки – «строители» клетки. Перед делением клетки в ней удваивается набор всех белков для дочер них клеток.

Для белков характерно разнообразие пространственной укладки цепи, что порождает адекватное разнообразие функций белков. Есть белки в роли строи тельных элементов, белки-переносчики различных сигналов и белки-рецепторы для этих переносчиков, белки-маркеры для данного типа клетки и белки «аг рессоры», которые атакуют клетки, несущие чужеродные маркеры. В конечном Сигнальный пептид или Zip-код – это продукт части гена данного белка.

счете, белки создают все свойства клетки и обеспечивают все е функция как части ткани.

В клетке постоянно происходит распад ненужных уже белков и замена их новыми путм их синтеза. После синтеза белки должны быть транспорти рованы из клетки или в ее различные органеллы, проникая соответственно че рез их мембраны.

Эволюция каждого типа клетки закрепила за каждым белком после его синтеза то место, где ему положено находиться. Если это нарушается, то клетка не выполнит свою функцию или функции.

Как вновь синтезированный белок находит сво место в клетке?

Этот вопрос был первым, на который ответил Г. Блобель – американский биолог.

Ещ в 1970-х годах он обнаружил, что каждый вновь синтезированный белок содержит в себе информацию о месте его в структуре клетки. Затем в те чение 20 лет он изучал – чем является эта информация? В результате он открыл сигнальный пептид в молекуле каждого синтезированного белка.

Оказалось, что при синтезе каждого белка в рибосоме в его структуру за кладывается сигнальный пептид или аминокислотный код, назвав его Zip кодом. Ясно, что он транспортируется вместе с этим белком.

Сигнальный пептид – это короткая цепочка из нескольких аминокисл отных остатков – от 10 до 30. Синтез белка в клетке начинается с сигнального пептида. Он прикреплен к белку на его конце – в виде «хвоста», либо внутри белка отдельными участками, а в глобулярном белке в виде единой части (Рис.

1).

Размер и структура сигнального пептида не для вида белка, а для опр еделения его места в клетке;

то есть для каждого белка он специфичен. Поэто му сигнальный пептид можно сравнить с «адресом» на почтовом отправлении или с «ярлычком» на багаже, где написано место, куда надо его доставить.

Рис. 1. Два варианта сигнального пептида: а – в виде «хвоста»;

б – в виде отдельных участков (рис. и цит. по: В. А.Ткачук, Л. П. Белянова, 2000).

Так что сигнальный белок определяет судьбу каждого белка: направить ли его в митохондрию, и он проникнет в не, в ядро клетки – для запуска экс прессии генов, или построить из него ионный канал или рецептор и встроить его в клеточную мембрану, или секретировать его в другие участки организма.

Но белок-носитель сигнального пептида, может быть по количеству ами нокислот в нм, – большим и малым. Количество аминокислот может достигать от 50 до нескольких тысяч.

Как белок проникает через мембрану органеллы, и клеточную мембрану?

Этот вопрос был вторым, на который своими исследованиями также от ветил Г. Блобель.

Оказалось, что сигнальный пептид служат пропуском для белка через мембраны. Это вторая функция сигнального пептида1.

На мембране органелл и клеточной мембране имеются специфические молекулы-рецепторы, проверяющие сигнальный пептид данного белка. Его ст руктура комплементарна рецептору той органеллы, для которой этот белок предназначен.

При контакте сигнального пептида с рецептором происходит молекуля рное узнавание: если их контакт подобен «застежке-молнии». В таком случае В литературе часто называют сигнальный пептид – «адресная метка».

мембрана пропускает в органеллу этот белок, признавая его «своим». По этому же принципу в органеллу не может проникнуть чуждая, т.е. «не своя» молекула белка, если при контакте не образуется подобия «застежке-молнии». Вот в чем причина удивительной избирательности белков, которая характерна для нор мальной, т.е. здоровой клетки.

То же характерно для процесса выхода белка из клетки. Рецептор на ружной мембраны клетки выясняет, каков сигнальный пептид у того белка, ко торый хочет выйти из клетки, и делает возможным выход только того белка, сигнальный пептид которого комплементарен рецептору.

Доставка белка в клеточное ядро отличается от доставки какого-либо белка в органеллу. Белки, а их множество, попадают из цитоплазмы в ядро не через липидные слои его мембраны, а через водные поры. Но и здесь требуется механизм молекулярного узнавания. Эти поры работают, подобно клапану, т.е.

способны открываться по сигналу от транспортируемого белка и закрываться, когда белок достигает ядерной плазмы.

Когда белок будет доставлен точно на сво место, сигнальный пептид от деляется от молекулы белка, так как уже не нужен. Его отщепляет специальный фермент – сигнальная пептидаза. В сигнальном пептиде кроме адреса доставки белка есть ещ фрагмент, который распознает пептидаза. Через него пептидаза отщепляет сигнальный пептид от белка. Это закрывает белку обратный путь.

Оказалось, что молекулярные механизмы транспорта белка в клетке уни версальны: они одинаковы у всех эукариот – растений, дрожжей и животных.

В чм значение открытия?

1. Открыт сигнальный пептид, который управляет транспортом белка и его локализацией в клетке.

2. Молекулярные механизмы этих процессов в клетке – это наиболее уяз вимые места для возникновения ряда болезней и не только наследственных. Г.

Блобель предполагает, что какие-то нарушения в этих механизмах окажутся причиной превращения нормальной клетки в раковую клетку.

Возможные применения 1. Ошибки в участке гена сигнального пептида ведут к изменению ло кализации белка в клетке. Это может стать причиной возникновения некоторых генетических болезней. Изменением структуры этого участка гена можно уст ранить болезнь.

2. С помощью сигнального пептида можно определить, какие белки в данном типе клетки должны быть встроены в е мембрану. Это даст возмо жность обнаружить изменения в белках мембраны раковой клетки этого же ти па.

3. К сигнальному пептиду и его белку можно присоединять молекулу ле карственного препарата для доставки его в нужное место клетки – в ми тохондрию, в е ядро и др. Это можно использовать для уничтожения раковой клетки. Однако прежде это лекарство требуется адресно доставить к раковой клетке, что намного труднее (А.С. Соболев, 2003).

4. Расширена возможность использования клетки как «фабрики белковых лекарств». Для этого ген необходимого белка можно соединить с участком гена сигнального пептида. Эту конструкцию затем клонировать, встроив в геном бактерии, – обычно кишечной палочки, для производства препарата (А.С. Со болев, 2003). Для этого больше годятся более сложные клетки – клетки дрож жей.

За открытие у белков сигнального пептида, управляющего их транспо ртом и локализацией в клетке, Г. Блобель в 1999 г. удостоен Нобелевской пре мии по физиологии и медицине.

2.3. «Убиквитин-опосредованное расщепление» «ненужных» белков в клетке – значение для онкологии Каждая клетка человека содержит множество разных белков. Общее их количество в клетке пока никто не знает. Цифры содержания белков в клетке называют разные: сто тысяч и более.

Белки в клетке каждого типа выполняют разные и очень важные функ ции: глобулины и другие белки – строят клетку, ферменты – регулируют хими ческие реакции, белки-рецепторы и белки-лиганды к ним важны для передачи сигналов между клетками разного типа и др. Так белки обеспечивают все функции каждого типа клетки в организме человека. При этом каждая клетка живт и выполняет свои функции, как часть ткани и организма в целом.

В каждом типе клетки геном один и тот же, но экспрессия генов в разном типе клетки разная. Экспрессия гена – это синтез его копии, т.е. иРНК, а по ней в рибосоме – синтез белка. Белки создают свойства клетки и е тип.

Многие десятилетия учных интересовали детали синтеза белков разного типа в рибосомах. Знали, что в клетке белки могут уничтожаться ферментами – протеазами, но не знали, что каждый белок после выполнения функций унич тожается как «ненужный». Оказалось, что в клетке любого типа происходит не только регулируемый синтез белков, но и регулируемый распад белков.

К процессу распада белков в каждой клетки лишь немногие ученые про являли интерес. Так, учные – А. Цихановер и А. Гершко из Израиля, а также И. Роуз из США «пошли наперекор этой тенденции». Они в начале 1980-х гг.

открыли важнейший процесс в клетке любого типа – регулируемый генами ра спад «ненужных» белков. Такой распад белков называют также – деградацией или расщеплением их.

Какой белок считается «ненужным»? Белок, выполнивший свои функции в клетке, относится к «ненужным», т.е. уже вредным. Клетка в этот момент должна от него избавиться. Это чтко звучит в работах о значении этого откры тия.

В любой клетке белки постоянно деградируют и вновь образуются из аминокислот – «кирпичиков» белков.

Вред для клетки ненужного белка М. Ермолаева объясняет двумя причи нами: 1) после выполнения функции этот белок уже не нужен и 2) нужно синте зировать новые белки, а «перегрузка клетки полипептидами может вызвать апоптоз». Деградации подвергаются как белки цитоплазмы клетки, так и е яд ра.

В определенный момент деградации в клетке подвергаются белки, регу лирующие клеточный цикл, белки передачи сигналов в клетке и между клет ками, белки репарации ДНК, белки для презентации антигена в комплексе с МНС-1, а также мутантные белки и белки дефектные после трансляции. Дегра дация или расщепление «ненужных» белков происходит в протеасомах.

Открытие учных состоит в том, что белки, подлежащие распаду в клет ке, помечаются специальной молекулой – убиквитином. Это полипептид – ве щество из экстракта ретикулоцитов. Оно обнаружено во всех клетках, разли чных организмов, кроме бактерий. Отсюда и название нового вещества – убик витин (ubiquitin – от лат. ubique – «везде»).

В клетке каждого типа убиквитин выполняет роль надсмотрщика: поме чает из всего множества белков такие, которые подлежат немедленному и без условному уничтожению, как «ненужные» клетке белки.

На молекуле уничтожаемого белка крепится цепочка из четырех убикв нитинов – мини-белков, состоящих из 76 аминокислот. То есть убиквитин – это метка или маркер на «ненужном» клетке белке. Белок с такой меткой через ряд этапов поглощается специальной органеллой в клетке – протеасомой, и в ней он разрушается на полипептиды длиной 5-24 аминокислот, которые вы свобождаются из протеасомы, и в цитоплазме могут разрушаться до аминокис лот протеазами.

Протеасоама – это частица с протеолитической функцией. Протеасомой названы две частицы: 20S – расщепляет только короткие полипептиды, а 26S – до полипептидов.

Протеасома представляет собой полый цилиндр с каналом внутри. Из ка нала образуются три камеры: центральная – большая и две меньшие, – по кра ям. В центральной камере имеются каталитические центры, и там осуществля ется расщепление белков.

Процесс распада белка очень избирательный и может быть обратим с мо мента прикрепления к белку маркера. Белок без маркера не уничтожается в клетке.

Если на белке будет в качестве маркера всего одна молекула убиквитина, то такой белок не подлежит деградации и регуляторы протеасомы не откроют отверстие протеасомы, ведущее в центральный канал.

Метка в виде цепочки молекул убиквитина для белка становится роковой – этот белок будет уничтожен. Для такого случая учные, открывшие убикви тин, образно назвали его «поцелуем смерти». Наш учный – проф. В.Л. Карпов (2004) употребляет другое название – «метка смерти».

Процесс присоединения убиквитина к «ненужному» белку происходит в несколько этапов. Он регулируется тремя ферментами – E1, Е2 и Е3. Типичная клетка человека содержит только один вариант фермента Е1, несколько десят ков видов фермента Е2 и несколько сот видов – Е3.

Белок-убиквитин не сам по себе определяет белок-мишень, который под лежит расщеплению. Оказалось, что такой белок-мишень «уже нест признаки смерти: специфические сигналы», которые включают процесс расщеплении или деградации.

Сигналами являются специфические участки в молекуле этого белка:

внутри молекулы белка или на е N-конце. Как пишут Е.Б. Абрамова, В.Л. Кар пов (2004) при определенных условиях эти участки становятся доступными для узнавания ферментом. Это делает фермент из семейства лигаз, т.е. «сшиваю щих» ферментов Е3. Он их узнат и крепит на них цепочку молекул убиквити на.

1. Фермент Е1 соединяется с убиквитином, что активирует комплекс. Это выражается в том, что одно звено на конце убиквитина выдвигается в поисках нужного белка. Для этого требуется энергия – АТФ.

2. Комплекс убиквитин-Е1 взаимодействует с Е2 и молекула убиквитина передатся ферменту Е2. Этот этап повторяется до тех пор, пока не создастся цепочка из нескольких убиквитинов, – не менее четырх молекул убиквитина.

3. Е3 распознат белок-мишень, который должен быть уничтожен. Он принимает убиквитин от Е2, соединяется с белком-мишенью и «пришивает» к нему цепочку убиквитина (Рис. 1).

Рис. 1. Этапы образования цепочки белка-убиквитина и присоединения к нему белка-мишени (цит. и рис. из работы Е.Б. Абрамова, В.Л. Карпов, 2003).

4. Цепочку убиквитина узнат субъединица специального регулятора и связывается с ней, а значит с белком-мишенью. Этот процесс также требует АТФ.

Линейная молекула белка-мишени протягивается через регулятор, иг рающего роль «молекулярных ворот» протеасомы и через отверстие проникает в центральную камеру.

Белок-мишень расщепляется на полипептиды короткой длины, они вы свобождаются из протеасомы и в цитоплазме разрушаются протеазами до ами нокислот. Цепочка молекул убиквитина перед входом в протеасому отделяется и разрушается протеазами на мономеры (Рис. 2).

Рис. 2. Расщепление белка-мишени в протеасоме до пептидов и молекул убиквитина (цит. и рис. из работы Е.Б. Абрамова, В.Л. Карпов, 2003).

Так учным впервые удалось открыть молекулярные причины регули руемого генами распада или деградация «ненужных» белков, а значит, вредных для ряда процессов жизни в нормальной клетке.

Белок-убиквитин регулирует в клетке время функционирования всех бел ков, удаляет из не чужеродные и дефектные белки, создат в результате раз ложения белков полипептиды в качестве антигенов в комплексе с МНС I клас са. По ним NK-клетки и Т-клетки иммунного контроля определяют в одних случаях, – здоровье клетки, в других – болезнь клетки.

Белок-убиквитин путм разложения «ненужных» белков в клетке упра вляет делением клеток, репарацией ДНК клеток, проверкой качества только что синтезированных белков в клетке, синтезом белков, участвующих в апоптозе клеток, а также в синтезе важных белков для иммунного ответа организма.

Сбои в работе убиквитина ведут к нарушениям в этих процессах, следст вием чего является возникновение ряда тяжелых болезней, в частности, воз никновения раковой клетки.

Теперь возможно понять на молекулярном уровне, как в клетке проте кают важнейшие процессы путем избирательного действия белка убиквитина – разрушает «ненужные» белки, не трогая нормальные.

За открытие «убиквитин-опосредованного расщепления белков» в клетке, названные трое учных, в 2004 г. были награждены Нобелевской премией.

Зная роль убиквитина в том или ином процессе в нормальной клетке, можно понять молекулярные причины возникновения определенных болезней.

Влиянием на этот процесс при болезни, можно достигать е излечения, а также осуществлять профилактику болезни. Основным условием разработки методов лечения и создания лекарств является, конечно, понимание того, какой белок или белки являются причиной данной болезни.

В информации о вручении Нобелевской премии учным, а также после этого ряд учных сделали акценты на возможные пути применения в медицине этого открытия.

1. При вручении премии учным было отмечено, что понимание убикви тина приведт к созданию новых видов лекарств. Учные будут изменять про цесс, предотвращая выход из строя белков, либо заставляя клетку уничтожать те из них, которые приводят к болезням.

2. Р. Айкеда: «Открытие учных имеет очень важное применение. Оно особенно важно, поскольку показало, что разрушение составных частей клетки поддатся контролю. Каждый из элементов клетки должен оставаться в ней оп ределнный отрезок времени, а потом выведен вовне подконтрольно, иначе он может стать канцерогеном».

3. Открытие, сделанное этими учными, привело к созданию средства от рака в США под названием Velcade.

Как подчркивают учные, этот препарат «бьт прицельно по больным клеткам. Ранее при лечении рака клетки убивались неизбирательно, что зачас тую приводило к тяжлым осложнениям и летальным исходам».

4. В. Грибанов: «Открытие лауреатов позволило понять на молекулярном уровне механизм регуляции ремонта ДНК, транскрипцию гена и управление качеством синтезируемых клеткой белков. Они также пролили свет на возник новение дефектов иммунной системы, которые приводят к ряду тяжлых бо лезней, включая рак».

5. Наши учные Е.Б. Абрамова, В.Л. Карпов (2003). «Сбои в деградации белков протеасомой нарушают равновесие между пролиферацией и апоптозом и этим служат причиной разных болезней». Они делят болезни на две группы:

болезни, «обусловленные тем, что деградационная система не работает, и бо лезни, которые возникают из-за усиления е функции. Первые – это результат стабилизации субстратов», т.е. белков-мишеней, быстро разрушаемых в норме, «вторые, наоборот, аномально быстрого распада белков-мишеней».

a) Регуляция клеточного цикла. Клеточный цикл состоит из нескольких фаз, их смена регулируется белками-циклинами. Так как каждую фазу регули рует свой регулятор, – белок-циклин, жизнь его должна быть короткой. Это де лает 26S протеасома.

Белки-циклины в качестве метки для узнавания ферментом Е3 содержат разные участки в молекуле белка-циклина. Узнанный «по той или иной метке» регуляторный белок, т.е. циклин «сшивается» своим ферментом из семейства Е3 с убиквитиновой цепочкой и разрушается 26S протеасомой. Исходя из этого, учные подчеркивают, что «сбой в е работе вызовет остановку клеточного цикла в той или иной фазе».

б) Перерождение нормальной клетки в раковую клетку. В нормальной клетке белки скорости транскрипции, определяют во многих случаях судьбу этой клетки: станет ли делиться как нормальная клетка, пойдт ли по пути бес контрольного деления, как раковая клетка, или будет разрушена, как опасная клетка.

Поэтому регуляторные белки могут быть или белками, вызывающими не контролируемое деление клетки, или, наоборот, белками-онкосупрессорами.

Пример. Белок р53. Его уровнем в нормальной клетке удерживается рав новесие между делением и апоптозом. Но ситуация может меняться, например, при заражении человека вирусом папилломы. Его белок Еб находит белок р53 и подат сигнал ферменту Е3 присоединить к р53 цепочку убиквитинов. Фермент выполняет свою функцию, и р53 становится белком-мишенью для деградации протеасомой. В результате его быстрого разрушения нормальная клетка пере рождается в раковую.

в) Иммунная система. 26S протеасома участвует в иммунном ответе клет ки. Она расщепляет аномальные или чужеродные белки до полипептидов, неко торые из них – короткой длины аминокислот, выставляет в качестве антигенов.

Такие полипептиды в цитозоле клетки соединяются с белком-транспортром и переносятся в эндоплазматический ретикулум. Там они взаимодействуют с белками МНС1 и переносятся на поверхность клетки. Как незакодированные в геноме этой клетки белки-антигены, их обнаруживают Т-клетки иммунной сис темы и разрушают эти клетки, так как в них синтезируются необычные для них белки.

6. Исследования учных из разных стран показали, что от того, как функ ционирует в клетке белок-убиквитин, которого некоторые учные называют клеточный «дворник», зависит продолжительность фаз деления клеток, т.е. кле точный цикл, репликация ДНК перед делением клетки, структура хромосом. И когда в работе «дворника» случаются неполадки, возникают тяжлые болезни.

Так, сбой в деградации белка, отвечающего за разделение хромосом в процессе деления клетки, приводит к неправильному числу хромосом в дочер них клетках. Это может быть причиной превращения нормальной клетки в ра ковую клетку, а также вызывать другие болезни.

Понимание молекулярного механизма разрушения «ненужных» белков может быть полезно для лечения рака и ряда других болезней путм уничто жения определенного белка введением протеасомных стимуляторов. В других случаях, уменьшать или увеличивать содержание того или иного белка в де фектной или больной клетке.

Итак, процесс распада молекул белка в клетке интересовал учных в те чение многих десятилетий значительно меньше, чем синтез белка.

Теперь оказалось, напрасно: нарушения в молекулярных механизмах расщепления белков в клетке, а значит, в организме человека, могут привести к последствиям не менее тяжлым, чем сбои в синтезе новых молекул белка.

Учные открыли такой молекулярный механизм, который может ликви дировать угрозу любой болезни в зародыше, уничтожая опасные белки.

По этой причине Шведская академия наук заявила, что это открытие в будущем «даст возможность побороть рак: знания химических механизмов по могут создать нужные лекарства».

Глава 3. Нормальная соматическая клетка 3.1. Смертность нормальной соматической клетки: молекулярные причины В 1891 г. известный биолог А. Вейсманн (A. Wesmann) впервые предпо ложил, что соматические клетки животных и человека «должны иметь ограни ченный потенциал деления», т.е. они смертны. Но учный не дал подтвержде ний этому предположению.

Знания о том, что соматическая клетка того или иного типа у человека смертна или бессмертна очень важно для понимания раковой клетки.

Для решения вопроса – смертна или бессмертна сама по себе нормальная клетка, имеются два метода:

1) нормальную клетку после выделения из ткани организма можно пе ренести на питательную среду, т.е. в культуру и проследить е способность к размножению;

2) нормальную клетку из ткани организма можно пассировать на изоген ных лабораторных животных, пометив е специфическим маркером для от личия от нормальных клеток хозяина.

По наличию размножения клетки можно сделать вывод – смертна или бессмертна нормальная клетка.

В начале XX в. А. Каррель – известный специалист по культуре клеток, – изучал этот вопрос в культуре фибробластов, взятых из сердца цыпленка.

По его данным, фибробласты в культуре имели неограниченную способ ность к размножению, т.е. они бессмертны. Это было признано открытием. Но оно просуществовало до 1961 г., когда было доказано, что это не так.

В 1961 г. Л. Хейфлик и П. Мурхед (Hayflick L. and Moorhead P.S.) на нор мальных фибробластах от человека показали ограниченную способность фиб робластов в культуре к делению, т.е., что они смертны. Перед началом своих опытов они исключили все артефакты и неадекватные условия культуры для изучаемых клеток.

В этих опытах учные обнаружили, что фибробласты от эмбриона чело века были живыми, т.е. удваивались в числе, в среднем до 50±10 раз. Чем стар ше донор, тем меньше удвоений делали взятые от него клетки. Фибробласты от человека 20 лет, уже делились только 30±10 раз. К концу среднего срока ни од на клетка уже не делилась, и клетки гибли. Этим было доказано, что нормаль ные клетки человека имеют ограниченную продолжительность жизни.

Предел числа деления нормальной клетки – 50±10, в литературе стали обозначать словами – «лимит Хейфлика».

В другом опыте учные хранили часть клеток в жидком азоте при темпе ратуре –190° ниже нуля. В таких условиях клетки могут храниться сколько угодно. Но как только фибробласты оттаивали и помещали в питательную сре ду, они снова начинали делиться. При этом оказалось, что клетки «считают», сколько удвоений у них было до того, как их поместили в холодильную камеру, так как доводят число удвоений до положенного значения – 50±10. Например, клетки, помещнные на хранение после 30 делений, удваивались ещ, но только 20 раз. Это означает, что причина ограниченного числа делений нормальной клетки, а затем е смерть, является «внутренним свойством» самой клетки. Но какая причина делает клетки неспособными к делению и затем приводит их к смерти, учные не смогли установить.

На основе анализа процесса репликации ДНК, проф. А.М. Оловников – предположил, что с каждым делением клетки «как-то меняется длина е ДНК».

Если это так, то причина «лимита Хейфлика» должна быть в процессе, который происходит в области концов каждой из цепей ДНК во время е удвоения перед делением клетки. Так он в 1971 г. впервые в мире предсказал причину ограни ченного числа деления нормальной клетки, предложив гипотезу – «маргиното мии». От лат. слова margo – край и греч. tome – отсечение, то есть усечение копии ДНК с крав.

Цепи ДНК расходятся, и на каждой из цепей достраивается е копия с помощью фермента ДНК-полимеразы. Ясно, что цепь исходной ДНК – это ма трица, по ней строится дочерняя цепь путм комплементарного связывания азо тистых оснований. В результате перед делением клетки удваивается ДНК, а с этим и хромосома.

В своей гипотезе учный исходил из того, что фермент ДНК-полимераза – это не «точка», а объмная молекула. Е каталитический центр достраивает дочернюю цепь ДНК, но занимает «лишь ничтожную часть молекулы». Ос тальные участки фермента каталитически неактивны. С их помощью фермент узнат матрицу и движется по ней, но в копировании цепи ДНК эти участки «не заняты».

По причине неактивных участков фермент синтезирует копию цепи: «ли бо не с самого начала матрицы (Рис. 1), либо не до самого е конца» (Рис. 2). В результате дочерняя цепь получается короче, чем матрица. Поэтому после каж дого деления дочерние клетки получают «в наследство» вс более короткие мо лекулы ДНК. В этом и заключается «усечение копии ДНК с краев».

Еще в 1932 г. Нобелевский лауреат Г. Мюллер задолго до открытия ст руктуры ДНК, понял, что концевые участки хромосом содержат материал, за щищающий проксимально расположенные гены от разрушения. Он назвал эти концевые структуры теломерами (от греч. – telos – конец, meros – часть, доля).

Рис. 1. Схема проксимальной маргинотомии ДНК. а1 – молекула ДНК полимеразы с «правокраевым» расположением каталитического центра (рис. и цит. по: А.М. Оловников, 1971).

Рис. 2. Схема дистальной маргинотомии ДНК. а2 – молекула ДНК полимеразы с «левокраевым» расположением каталитического центра (рис. и цит. по: А.М. Оловников, 1971).

По мнению A.M. Оловникова, усечение копии ДНК не дойдт до «исчер пания всей длины ДНК, а значит хромосомы», клетка перестанет делиться и по гибнет раньше. Он допускал, что на концах ДНК находятся «буферные» гены, которые не кодируют белки, а лишь «страхуют клетку». Концевые гены назы вали телогенами. На каждом конце хромосомы находится по одному телогену.

Гены, кодирующие белки, расположены ближе к середине хромосомы;

если усечение не затрагивает их, клетка будет функционировать нормально.

«Буферный» ген состоит примерно из 50 сегментов. В процессе маргино томии сегменты телогена утрачиваются. A.M. Оловников даже предположил, как это происходит. В процессе каждой репликации не воспроизводится край ний сегмент телогена, и так к 50-му делению клетки все сегменты телогена рас ходуются. Вместе с этим клетка утрачивает способность удваиваться, затем по гибает.

Итак, маргинотомия ДНК в процессе деления нормальной клетки,– это и есть молекулярная причина и «счтчик» ограниченного числа деления, старе ния и смерти нормальной клетки.

Маргинотомия или укорочение теломер молекулы ДНК является повре ждением ДНК клетки. Поэтому считают, что гибель клетки после «лимита Хейфлика» происходит через апоптоз. Это имеет биологический смысл: клетки всех тканей должны обновляться, иначе живое не может существовать. Так что природа живого предусмотрела ограничение числа делений нормальной клетки и е гибель с этой целью.

При репликации дочерней молекулы ДНК в качестве матрицы использу ется одна из ее цепей: нематричная – для одной дочерней молекулы ДНК, мат ричная – «стяжками Оказаки назад» – для другой. Предположение нашего уч ного – проф. А.М. Оловникова о том, что репликация ДНК с помощью ДНК полимеразы всегда происходит с укорочением концов дочерней молекулы, а значит и хромосомы, многие учные называют открытием «на кончике пера» (А.Г. Голубев, 1996). Это предположение было подтверждено в 1972 г. Д. Уот соном (J.D. Watson, 1972). Он учл другую особенность фермента при реплика ции ДНК, но с теми же последствиями, что предсказал A.M. Оловников.

Оказалось, что ДНК-полимераза не может синтезировать копию из нук леотидов ни нематричной, ни матричной цепи, а может только достраивать уже существующую короткую цепочку нуклеотидов и только с 3’-конца растущей цепи ДНК. Что из себя представляет эта короткая цепочка нуклеотидов, и кто е синтезирует?

Это короткая цепь из 10 до 20 нуклеотидов, комплементарных матери нской цепи, т.е. матрице, и называется затравкой. Она образует начальный 5’ концевой участок дочерней цепи. Е синтезирует другой фермент – РНК полимераза, называемая праймазой (от англ. primer – затравка). ДНК полимераза присоединяется к 3’-концу затравки и удлиняет дочернюю цепь комплементарными нуклеотидами в направлении от 5’ к 3’, но с 3’-конца затра вки (Рис. 3).

Рис. 3. Репликация нематричной цепи ДНК: I-II – достраивание нуклео тидами 3’-концов праймерами на нематричной цепи материнской ДНК;

II-III – выщипление рибонуклеотидов праймерной РНК;

III-IV – заполнение брешей от праймерной РНК, начиная от 3’-концов фрагментов Оказаки;

V – дочерняя ДНК с укороченной нематричной цепью (рис. и цит. по: А.Г. Голубев, 1996).

После репликации дочерней цепи молекулы ДНК, крайняя затравка уда ляется, т.е. выщипляется специальным ферментом. В матричной цепи также удаляется затравка из фрагментов Оказаки.

Удаление самой крайней затравки приводит к тому, что дочерняя цепь как нематричной, так и матричной цепи оказывается короче на длину затравки, т.е. на 10-20 нуклеотидов. В результате 3’-конец нематричной цепи ма теринской ДНК остается недореплицированным, а 5’-конец матричной цепи дочерней молекулы ДНК оказывается укороченным на длину затравки.

В результате этой особенности репликации, ведущей к укорочению 5’ конца дочерней цепи, 3’-конец нематричной цепи в дочерней молекуле ДНК получается ни с чем не спаренным и образует выступающий 3’-конец матери нской цепи, его называют 3’-оверхенг. В нормальной клетке этот одноцепочеч ный конец уничтожается каким-либо ферментом, в результате дочерняя моле кула укоротится с конца, а значит, укоротится перед делением клетки и хромо сома.

Ясно, что с каждой последующей репликацией перед делением нормаль ной клетки, концы цепей дочерней молекулы ДНК – 3’- и 5’-конец – укорачи ваются на величину затравки (Рис. 4).

Рис. 4. Уничтожение выступающего 3’-конца нематричной цепи в дочер ней молекуле ДНК. В результате: укорочение 3’- и 5’-го конца цепей в дочер ней молекуле ДНК на одинаковую длину.

Итак, то, что считалось сегментом телогена, теперь это – РНК-праймер, а телоген – это теломера, или теломерная ДНК.

Г. Мюллер (1932) раньше всех понял, что теломеры на концах хромосомы предохраняют хромосому от разрушения. Но многие годы о теломерах больше ничего не было известно, в частности, из чего они состоят.

Лишь в конце 1970-х – начале 1980-х годов американские генетики Е.

Блэкберн и Дж. Голл открыли строение теломеры.

Оказалось, что теломера в хромосоме человека – это гексануклеотид с тимином на 5’-конце и целиком из гуанина – на 3’-конце, т.е. – ТТАГГГ. Эта последовательность создат концы молекулы ДНК, а в комплексе с белками, – концы хромосомы.

ТТАГГГ создат фрагмент Г-цепи, а комплементарные ему основания – фрагмент Ц-цепи. Такой двухцепочечный фрагмент многократно повторяется и создат концы молекулы ДНК, а в комплексе с белками – концы хромосомы. В литературе употребляются равнозначные термины – теломера или теломерная ДНК.

Именно теломера укорачивается на длину РНК-праймера при каждой ре пликации цепи перед делением клетки. Но укорачивается теломера, а гены при этом обычно не страдают.

Укорочение теломеры на величину праймера каждый раз перед делением клетки – это метка, указывающая сколько ещ клетке осталось делиться, то есть жить.

Нормальная клетка прекращает делиться, когда е теломеры становятся слишком короткими, чтобы защитить концы хромосом от склеивания или их неправильного распределения – анеуплоидии и пр. На этом этапе в клетке во зникает сигнал на самоуничтожение, т.е. апоптоз, а не тогда, когда теломеры полностью «расходуются».

Потери теломеры на 10-20 нуклеотидов при каждом делении нормальной соматической клетки, позволяют ей делиться, т.е. жить не более «лимита Хейф лика»: 50±10 раз.

Итак, предположение немецкого биолога А. Вейсманн (1891) о том, что способность нормальной клетки к делению «не вечна, но ограничена», впервые нашло подтверждение в 1961 г. в работе Л. Хейфлик с П. Мурхедом в опытах с нормальными клетками в культуре. Однако, выяснить причины этого явления им не удалось.

В 1953 г. была открыта структура молекулы ДНК и, исходя из не, был объяснен механизм ее репликации, которая необходима любой клетке перед е делением.

Однако, в 1971 г. наш учный, ныне сотрудник Института биохимической физики РАН, проф. А.М. Оловников, впервые обратил внимание на то, что ДНК-полимераза «не в состоянии» полностью копировать концы цепочек нук леотидов молекулы ДНК. Следствием этого должно быть укорочение, т.е. не дорепликация ДНК перед каждым делением нормальной клетки. Это и оказа лось молекулярной причиной ограниченного числа деления нормальной клетки любого типа – лимит Хейфлика.

Проф. А.М. Оловников предсказал и способ, которым клетка могла бы решать эту проблему: «наращивание некодирующей белок последовательности нуклеотидов, которую не жалко было бы потерять при репликации» (акад. В.П.

Скулачв, 1997).

По его мнению, для наращивания нуклеотидов необходим особый фер мент. В 1985 г. его открыли другие учные, – это фермент теломераза.

Понимание механизма работы и регуляции этого фермента позволит уч ным глубже проникнуть в сущность процессов старения и бессмертия раковой клетки.

Акад. В.П. Скулачв (1997) писал так: «Работа А.М. Оловникова – один из немногих примеров, когда блестящая мысль отечественного учного не ос талась забытой, но, к сожалению, получила развитие, не у нас в стране, а за ру бежом, причем приоритет автора общепризнан и нигде не подвергается сомне нию».

3.2. Передача сигнала извне для деления нормальной клетки Организм взрослого человека из 5.1013-14 клеток (В.Н. Сойфер, 1998 и др.).

По признакам структуры и функции эти клетки разделены на типы, – их более 200.

Функции любого типа клетки в многоклеточном организме определяются генами через их продукты – белки. В разных клетках имеет место экспрессия разных генов, остальные гены «молчат». Клетка в организме – его часть;

свои ми функциями она вносит свой вклад для нужд организма как целого. Так что в жизни клетки каждого типа определено: «что ей позволено, а что – нет» (Е.Д.

Свердлов, 1999).

Деление клетки, т.е. размножение, – признак того, что она живая. Этим свойством старые и дефектные клетки ткани заменяются новыми, а, значит, об новляется организм. Без этого многоклеточный организм не может жить.

В организме нормальная клетка может делиться лишь после получения сигнала к делению. Без сигнала ей это «запрещено» генами.

Любое свойство клетки определяется микросредой, окружающей клетку.

В состав этой среды входят: 1) соседние клетки, с которыми она связана моле кулами;

2) внеклеточный матрикс – продукт самих клеток;

с ним клетка также связана молекулами;

3) жидкая среда – тканевая жидкость, кровь и лимфа (Ю.М. Васильев, 1997).

Для деления клетка получает сигнал из микросреды – из тканевой жидко сти, от клеток-соседей и от внеклеточного матрикса.

Чем является сигнал для клетки в организме? Это сигнальная молекула, иначе – молекула-лиганд. Для размножения клетки ей нужны молекулы лиганды. Среди них – это молекулы фактора роста и цитокины. С химической точки зрения, это белки. Через молекулы-лиганды клетки разного типа осуще ствляют связи между собой, обмениваются информацией и этим создают мно гоклеточный организм как единое целое.

Откуда берутся молекулы-лиганды для нормальной клетки? Они не син тезируются в самой этой клетке. Они синтезируются в других клетках, выделя ются из них и мигрируют к другим клеткам, в том числе и к ней.

Это важно для отличия нормальной клетки от раковой клетки.

Что нужно, чтобы молекула-лиганд подействовала на клетку? Для этого нужна молекула-рецептор на клетке, на которую будет действовать молекула лиганд.

В клетке разного типа синтезированный белок обычно своей частью вы ставляется на поверхность клетки. Это продукт генов данного типа клетки.

Белки данного типа клетки своего рода антенны – это и есть молекулы рецепторы. Они определяют набор молекул-лиганд, с которыми может реаги ровать клетка данного типа. Реагирование клетки означает, что е молекула рецептор будет узнавать в межклеточной среде свою молекулу-лиганд и соеди няться с ней. Молекула-лиганд своей поверхностью комплементарна поверхно сти молекулы-рецептора, т.е. подходит, как субстрат к своему ферменту. Если клетка не имеет специфического рецептора, она «слепа» в отношении этого сигнала. Клетку, способную воспринимать свой сигнал, называют клеткой мишенью.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.