WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 10 | 11 || 13 |

«РУКОВОДСТВО ПО СУДЕБНОЙ МЕДИЦИНЕ Под редакцией профессора В.В. Томилина профессора Г.А. Пашиняна Ав т о р с к и й к о л л е к т и в : ...»

-- [ Страница 12 ] --

единичных нуклеотидных заменах. Теоретически можно предполагать, что высокая локальная генетическая вариабельность обусловлена не столько точковыми мутациями или микроделециями (инсерциями), но и другими механизмами, приводящими к более существенной реорганизации геном ных последовательностей: транспозициями, неравными (или незаконными) рекомбинациями, проскальзыванием репликативного комплекса и т.п.

Оказалось, что такие локусы достаточно распространены в геноме чело века.

Наиболее примечательны из них «минисателлитные» ДНК, впервые описанные А.Джеффрисом. Это относительно короткие (10—60 п.н.), рас сеянные по геному повторяющиеся нуклеотидные последовательности, имеющие тандемную организацию и демонстрирующие разную степень внутригрупповой гомологии. Число тандемных повторов в минисателлит ных блоках (и следовательно, длина самих блоков) варьирует в широких пределах — от 3—4 до нескольких тысяч;

многие из таких блоков представ ляют разные аллельные варианты гомологичных мультиаллельных гене тических локусов. В 1987 г. Y.Nakamura предложил такого рода генетич еские элементы называть локусами с варьирующим числом тандемных по второв или просто тандемными повторами с переменным числом звеньев (общепринятая аббревиатура VNTR — от Variable Number Tandem Repeat) (рис. 125).

Вариации числа повторяющихся элементов в VNTR-блоках как раз и обусловливают структурный полиморфизм этих локусов, проявляющийся в форме ПДРФ. Это объясняется тем, что длина соответствующих рестрик тазных фрагментов при отсутствии участков расщепления внутри самих по второв (из-за их необычного нуклеотидного состава) зависит от числа по вторяющихся единиц.

Общая методика геномной дактилоскопии с использованием ПДРФ-ана лиза. Для реализации потенциала мультиаллельных ПД РФ-маркеров разра ботан комплекс гибридизационных методик с использованием ДНК-зон дов, позволяющий эффективно выявлять индивидуально-специфичные на боры аллельных вариантов гипервариабельных локусов в геноме человека.

32 - Рис. 125. Последовательности ДНК с варьиЯ ющим числом тандемных повторов (VNTR). Ва рианты таких локусов имеют разную длину из-я неодинакового числа повторяющихся звеньев (на пример, варианты А, Б, В и Г различаются на одга повторяющийся сег мент). Сайты рестрикции отмечены стрелка ми. Отличающиеся по длине рестрик-тазные фрагменты ДНК будут различаться и Б электрофоретической подвижности. Внизу — схематическая картина 'блотт-гибридизации некоторых гетерозиготных по данному локу су ДНК с молекулярным зондом, гомологич ным тандемному повтору-!' На ранних этапах технология ПДРФ анализа хромосомной ДНК предполагала регистрацию индивидуального структур!

ного полиморфизма ДНК при помощи мо лекулярной гибридизации с радиоак- ] тив но меченным зондом и включала несколько последовательных стадий. Геномную ДНК обрабатывают рестриктаза-3 ми. Получен ный гидролизат фракциони— руют с помо щью электрофореза в геле] агарозы, и фрагменты ДНК иммобилизуя ют на мем бранном фильтре (нитроцеллкн лозном или полиамидном). Далее фильтИ с рестриктазными фрагментами анализе руе мой ДНК гибридизуют — инкубируют в растворе, содержащем молекуЯ лы зонда — минисателлитную ДНК, меченную [32Р]. Фрагменты, имеющие] комплементарные зонду участки, связываются с радиоактивным зондом'и затем выявляются с помощью радиоавтографии. В результате на радиочув- ствительной пленке формируется распознаваемый графический образ - набор чередующихся полос разной степени почернения, которые образукии поперечно исчерченную дорожку. Графическая индивидуальность этого ге номного «отпечатка» выражается в числе полос, их расположении на до рожке и в интенсивности каждой полосы (рис. 126).

В настоящее время идентификация гибридизационных полос можеИ быть проведена и без использования радионуклидного метода детекции (например, с помощью биотинилированных зондов или дигоксигениновыхи флюоресцентных или хемилюминесцентных меток).

Поскольку для каждого человека характерен свой, присущий только ему} набор вариантов гипервариабельных локусов, вся картина обнаруживает чрезвычайно высокую индивидуальную специфичность, которая определяй ется числом детектируемых полос, их расположением на дорожке и относм тельной интенсивностью каждой полосы. Это и есть геномный «отпечаток»,] или генетический «паспорт» — индивидуализирующая геномная характет ристика личности человека, которому принадлежит анализируемая ДНК.

Технически рестрикционно-гибридизационный ПДРФ-анализ достя точно сложен. Для получения достоверных результатов необходимо тщан тельно оптимизировать очень многие параметры экспериментальных про цедур, такие, например, как специфичность рестриктаз и условия исчерти вающего гидролиза ДНК, условия электрофоретического фракционирова ния рестриктазных фрагментов и способы их переноса на мембранный Рис. 127. Гибридизационные картины для 3 неродственных индивидуум» X, Y и Z, по лученные с помощью ми-нисателлитного зонда, который узна ет в геноме два гомологичных мультн а' _ аллельных локуса: а (а, а', а"...) i b (b, b', b"...).

а' b" — 1—6 — варианты ПДРФ, детектируемые данной группе. Структурные особенносга аллель — b' ных вариантов локусов а и Ь, я словливающие наблюдаемый ПДРФ. R Л сайты рестрикции;

зачернено — облает» внутригрупповой гомологии (кор) и гомологии с зондом. Ь' — сайт ре стрикции смещен за счет удлинения блока повторов а,Ь' — сайт рестрикции утрачен;

а" — b а имеется добавочный сайт рестрикции.

" скопия»). В настоящее время под этим термином понимается именно мультилокус ный идентификационный анализ, который, таким образом, можно считать истори чески первой моделью геномной дактилоскопии.

Этот вид анализа позволяет детектировать одновременно большое число родственных вариабельных локусов, которые находятся в разных участках хромосом. ПримсЗ нение гибридиза ционных зондов на основе минисателлитной ДНК для анализа рестриктазных гид ролизатов суммарной геномной ДНК позволяетi выявлять на одной гибридизацион ной картине сразу все минисателлитьн данного семейства, гомологичного исполь зуемому зонду. При этом для;

каждого индивидуума характерен свой, присущий толь ко ему вариант набогЩ ра таких отличающихся по длине минисателлитных фрагмен тов. Гибриди-1 зационная картина, создаваемая всей суммой таких локусов, состав ляющий одно мультилокусное семейство, оказывается чрезвычайно полиморфной Б популяции, поскольку она является по существу комбинацией множества независимых полиморфных элементов (их может быть несколько десяи ков). Это обусловливает ее очень высокую индивидуальную специфичность!

(рис. 127).

В настоящее время неизвестно общее число семейств гипервариабельных локусов в геноме человека, но, по-видимому, оно достаточно великоЯ Каждое из них потенциально представляет собой мультилокусную гипервариабельную систему с очень высоким индивидуализирующим потенция лом. К началу 90-х годов были охарактеризованы и апробированы в су деб-: но-медицинской экспертной практике несколько таких систем. Это в nep-j вую очередь мультилокусные зонды Джеффриса «33.6», «33.15» и их произя водные, а также разработанная в 1987 г. в Институте молекулярной биологии АН СССР и независимо учеными в Бельгии система «М13», родствен-* ная ей немецкая система «MZ 1.3», японская система «Муо», зонды на оса нове так называемых простых последовательностей типа (CAC)s> (TCC)5, (GACA)4 и (CT)s, разрабо танные J.Epplen и др. Применение всех этих зондов для блотт-гибридизационного анализа ДНК неродственных индиви ду- Рис. 128. Геномные профили 4 неродственных индивидуумов (1—4).

Индивидуальные препараты геномной ДНК гидролизовали ре-стриктазой BSPRI, фракционировали электрофоретически в геле агарозы, иммобилизовали на нитроцеллюлозном фильтре, гибри-дизовали с радиоактивно меченным зондом (ДНК М13) и автора-диографировали.

умов демонстрирует чрезвычайно высокий уровень полиморфизма.

Наиболее информативные картины гибридизации получаются при использовании ре-стриктаз НаеШ, BspRI, Mval, Alul, НптЯ, Mbol. В за висимости от специфичности рестриктаз в индивидуальных ДНК обычно обнаруживается 20—30 полос гибридизации. Среди них 30—40 % полос по своему положению могут совпадать у разных людей. Остальные 60—70 % полос варьируют значительно, обеспечивая высокую индивидуальную специфичность картины гибридизации. Некоторые полосы имеют, кроме того, «морфологические» различия (например, по интенсивности, ширине и др.). Общий объем информации гибридизационных картин, определяемый числом вариабельных фрагментов, сходен для всех перечисленных мультилокусных систем.

На рис. 128 приведены геномные «отпечатки» нескольких индивидуумов, полученные автором с использованием зонда М13 в качестве гибридизацион-ной пробы для рестриктазного анализа суммарной геномной ДНК человека. Эта технология с г. с успехом применялась в Бюро главной судебно-медицинской экспертизы МЗ РФ, однако начиная с 1992 г. она постепенно была вытеснена более прогрессивными методами, основанными на использовании полимеразной цепной реакции. В мировой практике к настоящему времени интерес к мультилокусным системам также несколько снизился и их применяют в относительно небольшом числе лабораторий.

Это произошло по нескольким объективным причинам. Во-первых, чувствительность подобных систем относительно невысока: даже самые современные хемилюминесцентные зонды требуют для анализа не менее 0,5 мкг ДНК, а во многих случаях такое количество ДНК получить невозможно. Во вторых, очень высоки требования как к химической чистоте исследуемого препарата, так и физическому состоянию содер жащихся в нем молекул ДНК (нельзя работать с сильно деградированной ДНК). Это достаточно трудоемкий метод, он трудно поддается автоматизациии и стандартизации, требует больших затрат ручного труда.

Поэтому сфера применения мультилокусных систем ограничена главным образом экспертизами спорного происхож дения детей и установления родства: в этих случаях обычно не возникает трудностей с получением высококачественных препаратов ДНК, и тогда трудоемкость процедуры окупается очень выигрышными высокими дискриминирующими свой ствами мультилокусных зондов.

Монолокусный ПДРФ-анализ гипервариабельных локусов с варьирующим числом тандемных повторов. Монолокус ные зонды позволяют выявлять в ДНК человека так называемые уникальные гипервариабельные локу- сы, т.е. такие локусы, которые присутствуют в геноме человека в единственном числе на конкретной паре гомологич ных хромосом. Каждый индивидуум имеет только 1 или 2 аллельных варианта каждого такого полиморфного локуса, которые и выступают в роли индивидуализирующих личЯ ность признаков.

Таким образом, индивидуализирующий потенциал монолокусной гипервариабельной системы определяется числом аллельных вариантов соответствующего единичного полиморфного локуса. В принципе, этот потен циал существенно ниже, чем у мультилокусных систем, поскольку количеЯ ство операционных дифференцирующих признаков-полос в ге номном «отпечатке» (профиле) примерно на порядок меньше — всего их может быть только 1 или 2. Однако к достоин ствам монолокусной модели геномной дактилоскопии следует отнести ее относительно высокую чувствительности (осо бенно важно при исследовании биологических следов), а также и то. что интерпретация гибридизационной картины и практическая количеств венная оценка доказательственного значения идентификации в случае использования моноло кусных зондов проще и потому легче поддаются стаД дартизации, чем при применении мультилокусных систем.

В мировой судебно-медицинской практике в настоящее время широко используются несколько десятков моноло кусных систем геномной дактдд лоскопии. Основными разработчиками таких систем являются американЛ ские фирмы «Lifecodes», «Promega», «Collaborative Research», а также англоя американская корпорация «Cellmark». В России моно локусные рестрикци-онно-гибридизационные системы не находят широкого применения, суще! ственно уступая по популярности амплификационным системам.

44.3.2. Анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов ДНК Полимеразная цепная реакция. В конце 80-х годов технология моноло- 1 кусной геномной дактилоскопии обогати лась и дополнилась новым мето^ дическим приемом. Принципиальная особенность предложенного нового подхода за ключалась в том, что на смену анализу полиморфизма длины ре-1 стриктазных фрагментов (ПДРФ) ДНК пришел ана лиз* полиморфизма 1 длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК. Подобный анализЛ не требующий при менения рестрикционных ферментов и отличающийся чрезвычайно высокой чувствительностью, стал возможным в ре зультате 1 внедрения в практику метода так называемой энзиматической амплифика- ] ции гипервариабельных генети ческих локусов с помощью полимеразнойЯ цепной реакции (ПЦР).

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР, англ. PCR — Polimerase Chain Reaction) был разработан корпорацией «Cetus» (США) в 1985—1986 гг. В основу метода легли идеи и первые эксперименты K.Mullis в области энзиматической амплификации ДНК, суть которой заключается в экспоненциальном наращивании числа копий строго определенных фрагментов] молекулы ДНК in vitro. В 1993 г. К.Мюллис за эти работы был удостоен;

Нобелевской премии по химии;

сам же полимеразный цепной процесс был запатентован фирмой «Hoffman-La Roche», и его коммерческое использо вание регламентируется лицензионными соглашениями с корпорациями «Roche Molecular Systems» и «Perkin-Elmer» (США).

Области применения ПЦР как в сфере фундаментальной науки, так и биотехнологии столь разнообразны и много численны, что их трудно пере- числить. Главный же смысл этого открытия в том, что удалось преодолеть все потенциальные ограничения молекулярно генетических методов исследования, которые были связаны с недостаточным для анализа количеством ДНК.

Применительно к судебно-экспертной практике значение ПЦР заключается в том} что реакция позволяет выделить и размножить любую необходимую для анализа последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в десятки и даже сотни миллионов раз. Такая высокая степень направленного обогащения теоретически позволяет работать с единич ными молекулами ДНК, а это означает, что открывается возможность проведения молекулярно-генетического типирования даже в случае исчезающе малых количеств доступного для экспертизы биологического материала. Действительно, еще в 1986 г. А.Джеффрис экспериментально доказал, что с помощью ПЦР становится реальной задача геномной дактилоско пии на уровне нескольких или даже одной клетки. Кроме того, ПЦР оказывается весьма эффективной при анализе сильно разрушенных ДНК, подвергшихся высокой степени деградации. Хорошей иллюстрацией может служить успешное выпол нение в 1992—1995 гг. уникального российско-британско-американского проекта по молекулярно-генетической иден тификации скелетиро-ванных останков Николая II и членов его семьи, которые пролежали в земле более 75 лет. (Эта ра бота проводилась под руководством и при непосредственном участии автора данной главы.) Научные принципы и общая методика ПЦР описаны во многих учебниках по молекулярной биологии и в монографи ях, поэтому мы лишь кратко напомним основные положения.

При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотид-ных праймера (затравки), которые располага ются по флангам интересующего эксперта участка ДНК. Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, молекулярной ассоциации («отжиг») праймеров с комплементарными им последова тельностями на ДНК-матрице и в последующей матричной достройке полинуклео-тидных цепей (начиная от этих прай меров) особым ферментом — термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой), выделенной из бактерии Thermus aquaticus. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы осуществляет ся только между ними, удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК (рис. 129).

В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента — приблизительно как 2", где п — число прошедших циклов амплификации. Таким образом, за 20 циклов амплификации количество синтези рованных молекулярных копий исходного фрагмента составит 220, или примерно 1 млн. Поскольку праймеры включаются как составная часть в концы новосинтезируемых молекул, они физически ограничивают конечный продукт реакции — фрагмент ДНК, который получается равным по длине расстоянию между концами комплементарных прайме-рам участков на исследуемой молекуле ДНК.

Для проведения ПЦР, кроме исходного препарата ДНК, праймеров, Taq-полимеразы, нужны еще так называемые предшественники ДНК — дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дезоксинуклеотиды) и солевой буферный раствор. Эти компоненты смешивают в пробирке и помещают в специальный прибор —программируемый термоцикл ер (амплифика тор), который обеспечивает необходимый температурный профиль реакции. Весь процесс длится несколько часов.

Рис. 129. Полимеразная цепная реакция (показаны два первых цикла). Для амплификации известного участка молекулы ДНК синтезируют полинуклеотидные последовательности — праймеры, представляющие собой отрезки однонитевой ДНК длиной 20— 30 нуклеотидов и комплементарные каждой из нитей ДНК-матрицы. Участок гена, заключенный между праймерами, многократно копируется с помощью Taq-полимеразы, результатом чего является многократное (во много тысяч раз) увеличение его количества. Фрагменты ДНК, образовавшиеся в результате амплификации, становятся доступ ными для обычного визуального анализа методом электрофореза в геле агарозы или полиакриламидном геле. Каждый этап удвоения ДНК в процессе амплификации состоит из 3 последовательных ступеней: 1 — денатурация ДНК;

2 — компле ментарное связывание праймерной последовательности с соответствующей последовательностью в ДНК-матрице («от жиг»);

3 — матричный синтез ДНК с помощью Taq-полимеразы (достройка праймера). Длинные фрагменты, синтезируе мые на исходной цепи, накапливаются в арифметической прогрессии. Специфические короткие фрагменты, ограниченные на концах праймерами (они появляются только в конце 3-го цикла), накапливаются в геометрической прогрессии и поэто му доминируют среди конечных продуктов амплификации.

Амплификациоиные молекулярно-генетические индивидуализирующие системы иа основе гипервариабельных локусов с варьирующим числом тан-демных повторов. Описанный выше метод эн зиматической амплификации ДНК положен в основу высокоспецифичных диагностических и индивидуализирующих тест-систем. Все они разрабатывались по единому принципу, который заключается в подборе праймеров на основе из вестной последовательности нуклеотидов ДНК (как правило, это олигонуклеотиды длиной 20—25 звеньев) и оптимиза ции условий энзиматической амплификации нужного генетического локуса. Существование же в геноме человека опи- ность их сохранения в деградированной ДНК, На практике это означаем ощутимый «выигрыш» в чувствительности ана лиза. Кроме того, вероятя ность ложной гомозиготности, обусловленной предпочтительной амплифи-i кацией низкомоле кулярных аллелей, крайне низка для микросателлитньщ локусов вследствие узости спектра длины аллелей.

Впервые систематическая работа по обнаружению и детальной характер ристике гипервариабельных локусов, пригод ных для целей геномно-«даю| тилоскопического» анализа с использованием ПЦР, была начата в конца 80-х годов в лабо ратории Р.Уайта (США). К настоящему времени для целее экспертно-криминалистической практики в США, Великобри тании и ряде стран Западной Европы разработано несколько десятков молекулярно-ге^ нетических ПДАФ-систем на ос нове мини- и микросателлитных полия морфных локусов.

Основы технологии геномной индивидуализации с использованием! ПДАФ-анализа. В общем случае технология ПДАФ анализа включает несколько последовательных стадий. Геномную ДНК вводят в реакционную смесь, содержащую все не обходимые компоненты для работы термостабильной ДНК-полимеразы. В такой системе хромосомная ДНК будет слу жить субстратом — матрицей для амплификации нужного локуса. Спещн фическим компонентом реакции и амплифика ционной индивидуализирующей системы в целом являются олигонуклеотидные праймеры, именно они определяют, какой генетический локус будет избирательно нарабатываться в ходе реакции. Реакционную смесь в течение нескольких часов инкубируют в термоциклере (ДНК-амплификаторе), где она подвергается-25—35 циклам нагревания — охлаждения в интервале температур от 50 до 95 °С. (Температурный профиль полимеразной реакции зависит от структур ры используе мых праймеров и потому индивидуален для каждой конкретной системы.) За время процесса интересующие исследователя последовательности ДНК, присутствующие в исходной геномной матрице, многократно (миля лионократно!) копируются Taq-полимеразой. Эти молекулярные копии накапливаются в ре акционной смеси, вследствие чего могут определяться уже количественно. Для этого полученные амплификационные про дукты фракционируют с помощью электрофореза в геле агарозы или полиакриламида (в последнем случае применяют как обычный электрофорез, так и электрофорез в денатурирующих условиях), фрагменты ДНК, амплифицированные в ходе реакции, выявляют с помощью различных методов детекции. Чаще всего полосы на электрофореграмме визуализируют флюоресцентным красителем этидиумбромидом и затем регистрируют фотографически в УФ-свете или путем окрашива ния нитратом серебра (в акриламидных гелях) с последующей фиксацией геля. В последнее время, однако, все более ак тивно внедряется регистрация амшшфицированных фрагментов ДНК с использованием более чувствительных методов детекции, например с помощью флюоресцентных меток, возбуждаемых лазерным излучением. Эти методы требуют специ ального аппаратного обеспечения и относительно дороги, однако позволяют анализировать картину электрофоретического разделения с очень высокой точностью и в режиме реального времени.

Гели агарозы традиционно считаются наиболее удобными и технологичными системами для электрофоретического анализа ДНК в молекуляр-но-генетических криминалистических исследованиях. Они не требуют многих подготови тельных процедур, необходимых для приготовления ПААГ, с ними легко манипулировать и они не обладают присущим ПААГ нейротоксическим действием. Однако разрешающая способность агароз- ных гелей в отношении фрагментов ДНК малого размера существенно ниже, чем у ПААГ. Это заставило фирмы производители работать над улучшением разделяющих свойств агарозных гелей и над созданием на их основе новых элек трофоретических сред, которые могли бы сочетать технологичность классической агарозной среды и высокие аналитиче ские свойства ПААГ.

Такие агарозные среды хорошо известны. Это, например, специальные модифицированные агарозы семейства NuSieveR фирмы «FMC Bio Products» (США). Они полностью отвечают тем высоким требованиям, которые предъявля ются к гелевым средам разделения при анализе продуктов амплификации локусов с вариабельным числом тандемных по второв. Еще более высокие параметры разрешения имеют гели агарозы Metaphor™, также выпускаемой указанной фир мой.

Идентификационный ПДАФ-анализ хромосомной ДНК в целом аналогичен монолокусному ПДРФ-анализу и предпо лагает регистрацию индивидуализирующих признаков ДНК в виде индивидуально-специфичного набора из двух поли морфных фрагментов (полос на электрофореграмме), характеризующихся определенным расположением на дорожке геля.

Этот так называемый амплификационный профиль ДНК и является в данном случае индивидуализирующей геномной ха рактеристикой личности человека, которому принадлежит анализируемая ДНК. Различия между ПДРФ- и ПДАФ системами обусловлены главным образом тем, что первые характеризуются непрерывным, а последние — дискретным распределением аллелей (это определяет некоторые различия в методах интерпретации данных, см. ниже).

Использование ПДАФ-анализа для установления генетического пола хромосомной ДНК. Важным элементом судебно биологического экспертного исследования вещественных доказательств является определение половой принадлежности следов и биологических объектов, изъятых с места преступления. Традиционные методы установления генетического пола основаны на анализе микроструктуры ядер интерфазных клеток и выявлении гранул полового хроматина. Однако эти ци тологические методы имеют существенные ограничения, которые очень часто не дают возможности однозначно опреде лить генетический пол объекта исследования. Эти ограничения обусловлены, с одной стороны, несовершенством морфо логических критериев определения специфических признаков пола на уровне исследования хроматина (в частности, их статистическим характером), а с другой стороны, как факультативным присутствием истинных Х- и Y-хромоцент-ров в ядрах нормальных клеток мужского и женского организма, так и существованием в хроматине сходных структур, которые не коррелируют с полом.

Появление в арсенале судебно-биологической экспертизы технологии геномной «дактилоскопии» придало этой про блеме особую остроту. Точное определение пола чрезвычайно важно при производстве генно-идентифи-кационной экс пертизы смешанных следов, поскольку с экспертной точки зрения нельзя однозначно интерпретировать генотипы ДНК с неустановленной половой принадлежностью (представление генетического «паспорта» ДНК с неустановленной половой принадлежностью может привести к серьезным следственным ошибкам).

Экспертное исследование биологических объектов на молекулярном уровне существенно повышает объективность и доказательность анализа их половой принадлежности. Молекулярно-генетические методы исследования на уровне ДНК половых хромосом позволяют предельно конкретизи- 12 3 4 Рис. 130, Анализ половой приладь лежности ДНК.

УФ-визуализация электрофоретиче<И кого фракционирования продуктов амплификации гетероморфного сегмента гена амелогснина на матрице мужской (2) и женской (3) ДНК. 1 — негативный контроль;

4 — маркерная «лестница» BRL 123bp.

ровать экспертный вывод, по-4 скольку выявляют половый признаки, имеющие абсолютную специфичность.

Для установления половой принадлежности ДНК предложен достаточно широкий спектр методических подходов. Так, на ранних этапах внедрения мультилокусной геномной «дактилоскопии» использовали гибридизационный анализ по Саузерну в пятнах («дот-блотт»-анализ) или in situ с применением Y специ-фичных молекулярных зондов. Позже автором этой главы был разработан рестриктазный анализ с прямой УФ-визуализацией специфических для пола фрагментов ДНК человека в рамках разработанной им концепции параллельного или сопряженного анализа половой принадлежности ДНК (сопряженный анализ играл роль «встроенного контроля» при выполнении генетического идентификационного исследования). Тогда же появились методы определения пола, основанные на использовании ПЦР и, в частности, ПДАФ-анализа.

В 1993 г. в лаборатории П.Гилла с участием автора этой главы был разработан новый ультрачувствительный метод определения пола на основе энзиматической амплификации фрагментов X/Y-гетероморфного гена аме-логенина.

Последовательности ДНК гена амелогенина, кодирующего один из белковых компонентов зубной эмали человека, представлены гомологичными копиями на Х- и Y-хромосомах, причем в Х-хромосоме в гене имеется делеция в 6 нуклеотидах. Для амплификации используются прай-меры, позволяющие амплифицировать очень короткие участки гена, которые содержат этот X/Y-гетероморфный сайт и потому являются высокоспецифическими половыми маркерами ДНК. В результате Х- и Y-специфичес-кие продук ты амплификации имеют разную длину —соответственно 106 и 112 п.н.;

их и необходимо дискриминировать для того, чтобы отличить дублет 106/112 нуклеотидов — «XY» (мужской пол) от полосы 106 нуклеотидов, представляющей на самом деле дублет 106/106 нуклеотидов — «XX» (женский пол). Для этого продукты реакции фракционируют электрофорети чески: 1) в гелях агарозы NuSieve или Metaphor («FMC BioProducts», США) и анализируют в УФ-свете после окрашива ния этидиумбромидом или 2) в ПААГ с последующим окрашиванием серебром (рис. 130).

Этот тест по праву считается одним из лучших. По чувствительности он превосходит все известные на сегодняшний день амплификационные ин- дивидуализирующие системы, оперирующие на уровне хромосомной ДНК человека, позволяя диагностировать генетический пол препаратов с единичными молекулами ДНК. Кроме того, амелогениновый тест очень надежен. В частности, амплификация Х- и Y-специфичных фрагментов осуществляется одновременно в одной реакции с использованием одних и тех же праймеров, а близкий размер совместно амплифицируемых (в слу чае генотипа XY) фрагментов гарантированно обеспечивает эквивалент ную продукцию обеих гетероформ даже при анализе сильно деградиро ванной ДНК. Указанные свойства амелогенинового теста явились предпо сылкой для разработки на его основе более сложных комбинированных индивидуализирующих систем, которые позволяют определять половую принадлежность исследуемого генетического материала параллельно с установлением его генотипа по ряду гипервариабельных локусов.

44.3.3. Анализ сайт-полиморфизма нуклеотидных после довательностей ДНК Молекулярно-генетические индивидуализирующие системы на основе полиморфных локусов с аллельнымн различиями в последовательности иук-леотидов. С точки зрения судебной медицины, главный смысл ис пользования ПНР заключается в том, чтобы наработать необходимую для анализа ДНК в количестве, достаточном для последующего идентифика ционного исследования теми или иными молекулярно-генетическими ме тодами. Иными словами, если в распоряжении эксперта уже имеется ам плифици-рованный продукт, полученный на матрице интересующего его генетического локуса, он имеет возможность применить разные методи ческие подходы для анализа генетической вариабельности в этом локусе и выявления соответствующих индивидуализирующих признаков.

Амплификация участков ДНК, содержащих делеции или инсерции, как это имеет место в случае тандемно организованных гипервариабельных локусов, приводит к формированию продуктов (аллельных фрагментов), различающихся по длине;

их дифференцируют путем электрофоретиче ского фракционирования. Этот принцип лежит в основе индивидуализи рующих систем ПДАФ-типа, о которых говорилось в предыдущих разде лах.

Вместе с тем уже отмечалось, что существенная часть вариаций в по ли-нуклеотидных цепях геномной ДНК обусловлена так называемыми точко-выми нуклеотидными заменами: очень многие локусы, в том числе и высокополиморфные, имеют варианты (аллели), которые на молекуляр ном уровне одинаковы по длине, но в той или иной степени различаются по последовательности нуклеотидов, составляющих эти молекулы. Это так называемый сайт-полиморфизм (от англ. site — участок), который ус ловно можно обозначить сокращением ППАФ — полиморфизм нуклео тидной последовательности амплифицированных фрагментов ДНК. По нятно, что амплификация локусов ДНК, обладающих свойством сайт полиморфизма, приведет к образованию неразличимых по длине фраг ментов. Дифференцировать такие фрагменты с помощью обычных мето дов электрофореза невозможно, поэтому в индивидуализирующих систе мах ППАФ-типа используются иные принципы дифференциации аллель ных вариантов.

Наиболее радикальный, хотя и наиболее дорогой, трудоемкий и дол гий путь, это так называемое секвенирование (от англ. sequencing) ампли фицированных фрагментов ДНК, т.е. определение первичной структуры поли-нуклеотидной цепи. Теоретически это самый точный и доказатель ный метод из всех возможных методов анализа индивидуальных генетических вариаций, поскольку по своей сути секвенирование — это расшифровка генетического кода, который в принципе уникален для каждого организ ма. Существуют две основные технологии секвенирования ДНК, разрабо танные в конце 80-х годов и названные по именам их авторов — лауреа тов Нобелевской премии А.Максама, У.Гилберта и Ф.Сэнгера. Метод Сэнгера может быть полностью автоматизирован, что и реализовано ря дом западных фирм. Мировым лидером в производстве автоматических ДНК-секвен-серов является американская корпорация «Perkin-Elmer».

В настоящее время единственной молекулярно-генетической индиви дуализирующей системой, основанной на секвенировании сайт полиморфных амплифицированных фрагментов ДНК,является локус D петли мито-хондриальной ДНК (мтДНК). Эта система не относится к хромосомным индивидуализирующим системам;

она обладает совершен но особыми свойствами и здесь мы ее рассматривать не будем.

Другой относительно более простой путь дифференциации сайт-поли морфных последовательностей ДНК — это амплификационно-гибридиза ционный анализ с использованием аллельспецифичных зондов. Такой подход предполагает регистрацию индивидуального структурного поли морфизма ДНК при помощи молекулярной гибридизации с мечеными зондами. Последние в соответствующих условиях будут связываться только со «своими» последовательностями ДНК, т.е. с полностью им комплементарными, и не будут реагировать с другими фрагментами, ко торые имеют нуклеотид-ные замены.

Аллельспецифичные зонды представляют собой короткие (обычно 10— 30 звеньев) олигонуклеотиды, в которых последовательность состав ляющих их нуклеотидов полностью комплементарна последовательности нуклеоти-дов того или иного аллеля полиморфного локуса. Амплифика ционный продукт, полученный на матрице анализируемой ДНК, подвер гают термической диссоциации и затем гибридизуют в строго заданных условиях с молекулами зонда. Условия гибридизации подбирают так, что бы комплементарное связывание происходило только между точными мо лекулярными копиями;

изменения даже одной позиции в полинуклеотид ной цепи должно оказаться достаточным, чтобы связывание с зондом не произошло. Определение условий дифференциальной молекулярной гиб ридизации — ключевой момент в создании систем индивидуализации на основе анализа сайт-полиморфизма ДНК: чем выше степень оптимизации процесса, тем меньше опасность получить артефактные результаты, обу словленные кеспеци-фической перекрестной гибридизацией разных алле лей.

Классический вариант постановки олигонуклеотидной гибридизации?

называется дот-блотт-анализом (от англ. dot blotting — промакивание пят на). Денатурированные амплифицированные фрагменты анализируемой ДНК иммобилизуют в ограниченной зоне (пятне) на мембранном фильтре — китроцеллюлозном или полиамидном. Далее зону фильтра с ампли фицированными фрагментами инкубируют в растворе, который содержит молекулы зонда, меченные радионуклидом или иным способом (напри мер, с помощью флюоресцентных или хемилюминесцентных меток или биоти-нилирования). При такой постановке эксперимента каждая индиви дуальная гибридизация с аллельным зондом представляет собой самостоя тельный тест, который требует приготовления стольких ДНК-пятен на фильтре, сколько аллелей предполагается тестировать.

Чтобы преодолеть связанные с этим затруднения и сделать анализ бо лее технологичным американская фирма «Cetus» в 1989 г. разработала новый подход, названный реверс-дот-блотт-форматом (от англ. reverse dot-blot).

В этом варианте на одном фильтре в индивидуальных зонах иммобилизиру ют все возможные аллельные олигонуклеотидные зонды, и такой фильтр один раз гибридизуют с мечеными амплифицированными фрагментами ин тересующей эксперта ДНК. Визуализация гибридизационных зон и, таким образом, идентификация амплифицированных аллелей могут осущест вляться разными методами в зависимости от способа мечения ДНК.

ППАФ-анализ аллельных вариантов локуса HLA DQA1 и локусов сис темы PoIyMarkerR. Исторически первой и наиболее широко известной мо лекулярно-генетической индивидуализирующей системой ППАФ-типа стала разработанная в 1989 г. фирмой «Cetus» система типирования локу са HLA DQalpha, ныне называемого по номенклатуре ВОЗ локусом HLA DQA1.

Локус DQA1 расположен на 6-й хромосоме и представляет собой поли морфный ген, кодирующий альфа-субъединицу одного из белков — DQ класса II (HLA D) так называемого комплекса лейкоцитарных антигенов человека HLA (от англ. Human Leikocyte Antigen), относящегося к главному комплексу гистосовместимости. Белки, входящие в этот комплекс, играют ключевую роль в механизмах реализации иммунного ответа, и их высокая вариабельность обусловлена именно этими функциями.

Ген DQA1 имеет 8 аллельных состояний, различия между которыми обусловлены множественными точковыми заменами нуклеотидов на отно сительно коротком участке полинуклеотидной цепи. Четыре основных ал леля гена DQA1 обозначаются А1, А2, A3 и А4;

эти 4 аллеля отличаются друг от друга как минимум на 5 нуклеотидов в 30-нуклеотидном участке ги первариабельного сегмента. Кроме того, два из основных аллелей, А1 и А4, имеют подварианты, последовательности которых отличаются всего 1— нуклеотидами: А1.1, А1.2, А1.3, А4.1, А4.2 и А4.3.

Р.Сайки, Р.Хигучи и Г.Эрлих разработали амплификационные прайме ры, с помощью которых осуществлена высокоэффективная полимеразная реакция на матрице этого гипервариабельного генного сегмента. Размер амплифицированных аллельных фрагментов практически одинаков и со ставляет 242 п.н. для аллелей А1 и A3 и 239 п.н. — для А2 и А4.

Детекция аллельных вариантов локуса DQA1 основана на использова нии аллельспецифичных олигонуклеотидных зондов. Первоначальный ва риант системы включает 8 диагностических элементов-зондов, которые применяются по сложной комбинированной схеме и позволяют идентифи цировать 6 аллелей. Четыре индивидуальных зонда распознают 4 главных аллельных типа — А1, А2, A3 и А4;

эти зонды заметно отличаются друг от друга по нуклеотидной последовательности. Аллели Al.l, A1.2 и А1.3 иден тифицируют с помощью других 4 зондов. При этом один из них специфи чен в отношении только А1.1, другой — только А1.3, третий «узнает» А1.2, А1.3 и А4.1, а четвертый реагирует со всеми аллелями, кроме А1.3. Геноти пы, содержащие аллели А1.2 и А1.3, дискриминируют на основании комби наторного анализа гибридизационных картин, получаемых с двумя послед ними зондами Вся система реализована в реверс-дот-блотт-формате. В на стоящее время стандартные наборы реагентов под коммерческим названием «AmpliTypeR HLA DQA1 PCR Amplification and Typing Kit» выпускаются компанией «rerkin-Elmer» (США).

Эта система очень удобна, технологична и надежна. Она способна дис криминировать 21 генотип, прекрасно стандартизована, не требует дорого стоящего оборудования. Единственным ее недостатком можно считать вы сокую коммерческую стоимость самих наборов реагентов.

При типировании локуса HLA DQA1 ДНК, выделенную из биоматерш ла, применяют в качестве матрицы для амплификации в ПЦР. Постанови реакции осуществляется с использованием реагентов, поставляемых в на боре AmpliType. Эти реагенты находятся в виде специальной буферно смеси, которая включает биотинилированные олигонуклеотидные прайме ры, нуклеотиды-предшественники и Taq-полимеразу. К этой смеси добя ляют аликвоту анализируемой ДНК (2—200 нг) и по завершении 30—32J цикловой ПЦР полученный амплифицированный продукт гибридизуют полосками нейлонового мембранного фильтра, несущими иммобилизован ные аллельспецифичные зонды. После 20-минутной гибридизации и с мывки фильтров амплифицированные аллели гена DQA1 выявляют с пом<ь щью ферментативных методов. В качестве конечного детектора выступает] конъюгированная с молекулами стрептавидина пероксидаза хрена, которая в зонах гибридизации — in situ — переводит хромогенный субстрат тетрамен тилбензидин из растворимой бесцветной формы в малорастворимую и ок рашенную: голубое окрашивание тех или иных зон с иммобилизованными зондами указывает на присутствие соответствующих амплифицированных аллелей гена DQA1. Генотип образца определяют визуально на основе ком бинаторного анализа гибридизационной картины.

В 1995 г. появился усовершенствованный вариант данной системы, ко торый позволяет дополнительно дифференцировать редкие аллели А4.Я А4.2 и А4.3.

Основываясь на успешном опыте внедрения системы AmpliTypeR HLA DQA1, в 1994 г. в фирме «Roche Molecular Systems» (партнер корпорации «Perkin- Elmer») была разработана другая индивидуализирующая система ППАФ-типа — AmpliTypeR РМ PCR Amplification and Typing Kit, известная также под названием «PolyMarker». Эта система позволяет анализировать одновременно 5 генетических локусов при использовании тех же оборудаа вания и реагентов, что и система типирования аллелей локуса DQA1. Пять молекулярно-генетических маркеров системы Polymarker представлены сле дующими локусами: LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), GYPAl (Gly cophorin A), HBGG (Hemoglobin G Gammaglobin), D7S8 (обозначении no HGM) и GG (Group Specific Component).

Гены LDLR, GYPA и D7S8 являются диморфными, два других - HBGG и GC — трехаллельными. В состав реакционной смеси входгаи пар амплификационных праймеров, которые работают в одинаковых ус4 лови ях и обеспечивают одновременную амплификацию аллелей всех 5J маркер ных компонентов и одного контрольного локуса в одной постановке ПЦР.

В качестве контрольного локуса используют константную частя гена HLA DQA1. Типирование аллельных вариантов маркерных генов] осуществляют с помощью реверс-дот-блотт-гибридизации амплифицирон ванных фраг ментов с 14 аллельспецифичными зондами, иммобилизован! ными на ней лоновой мембране. Как и в системе AmpliType* HLA DQA1. зоны молеку лярной гибридизации визуализируют с помощью ферментан тивной кон версии бесцветного субстрата-хромогена в окрашенный прея ципитат.

В 1995 г. система PolyMarker была доработана таким образом, что вмес то константного сегмента гена HLA DQA1, выполнявшего только коэа трольные функции, в нее была введена вариабельная 8-аллельная последо- вательность этого гена, выступающая теперь в качестве 6-го маркерногш элемента. Фактически системы AmpliTypeR HLA DQA1 и AmpliTypeR PMj удалось объединить в единую индивидуализирующую систему с очень вьщ соким потенциалом дискриминации.

44.4. Интерпретация молекулярно-генетических экспертных дан ных 44.4.1. Общие принципы учета результатов Применительно к задачам и практике судебно-медицинской эксперти зы молекулярно-генетический анализ наиболее эффективен в двух случаях:

в идентификации личности и при установлении биологического родства (в наиболее распространенном варианте — экспертиза спорного отцовства).

Под идентификацией понимаются, во-первых, задача экспертизы по конкретному уголовному или гражданскому делу, во-вторых, собственно процесс и результат экспертного исследования, который заключается в ус тановлении тождества исследуемых объектов (а в случае отрицательного ре зультата исследования их различия). Предпосылкой для идентификации объекта служит его индивидуализация — процесс выявления и оценки при знаков объекта, обладающих максимальной значимостью с точки зрения его неповторимости, т.е отличия от любых иных объектов. В соответствии с этим судебно-экспертная молекулярно-генетическая идентификация лич ности предполагает установление тождества идентифицируемого лица с конкретным человеком (или их отличия друг от друга) по характеризующим их отличительным (индивидуализирующим) молекулярно-генетическим признакам. Отождествление или дифференциация осуществляется на осно вании сравнительного анализа совокупности индивидуализирующих при знаков ДНК, выявленных в ходе идентификационного исследования. В ка честве индивидуализирующих признаков выступают генотипические комби нации аллелей полиморфных генетических локусов. Эти аллели в зависи мости от используемого методического подхода визуализируются (реги стрируются) либо в виде полос, которые образуют полиморфные фрагмен ты ДНК на электрофореграмме, либо в виде аллельспецифичных дот-гиб ридизационных сигналов на мембранных фильтрах. Такие индивидуально специфичные наборы полос или дот-сигналов, представляющие собой ге нотипические аллельные комбинации индивида, можно назвать локальными геномными профилями.

Результаты сравнительного исследования (совпадение — несовпадение) геномных профилей идентифицирующих объектов (ими могут быть как биологические образцы, заведомо происходящие от идентифицируемого лица, так и объекты неизвестного происхождения, связанные с расследуе мым событием — вещественные доказательства, следы биологической при роды и т.п.) отражаются в выводах о вероятном тождестве этих индивиду ально определенных объектов экспертизы или их безусловном отличии.

Следует особо обратить внимание на то, что вероятностная оценка генети ческой идентичности объектов экспертизы строго обязательна. Это требо вание диктуется необходимостью принимать во внимание возможность случайного совпадения индивидуализирующих признаков разных индиви дуумов (подробнее см. в разделе 44.4.3).

Аллельные варианты каждого полиморфного локуса наследуются по ядерному типу, т.е. примерно 50 % всех маркерных элементов, составляю щих локальный геномный профиль человека, происходит от его отца, а другие 50 % — от матери. Это обусловлено аутосомной локализацией ги первариабельных локусов: каждый аллельный вариант наследуется как про стой менделевский кодоминантный признак. Высокий индивидуальный полиморфизм гипервариабельных локусов в сочетании с их соматической 33 - Рис. 131. Семейный анализ полиморфных вариантов гипер- вариабельных минисателлитов семейства М13.

Блотт-гибридизация Mval-гидролизатов индивидуаль ных ДНК^ представляющих семейное «трио» (1 — мать, 2 — ребенок, 3 —| отец), с радиоактивно мечен ным зондом MI3.

стабильностью и менделевским характером наследо-| ва ния позволяет использовать метод геномной иден-| тифи кации для определения биологического родствая Экспер тиза спорного отцовства по сути также является иденти фикационным тестом. Однако в отличие от прямой су дебно-медицинской идентификация личности отождеств ление в этом случае носит опосре*4 дованный характер:

признаки «образующего» объекта (здесь — признаки ро дительского индивидуума), используемые с целью иден тификации, отражаются в «воспринимающем» объекте — ребенке не непосред-1 ственно, как в биологических сле дах, а преломляются через призму сложных генетических закономерностей. Знание и правильная оценка этих зако номерностей необходимы для адекватной интерпретации результатов экспертного исследования. Учитывая это, проведение экспертизы спорного отцовства с исполь-;

зо ванием технологии геномной идентификации ха рактеризуется рядом принципиальных моментов, на ко торых следует остановиться в дополнение к сказанному выше.

Современная экспертиза спорного отцовства (ма теринства) должна ответить на два вопроса: а) исклю чается или не исключается отцовство (материнство) дан ного индивидуума в отношении данного ребенка (плода);

б) если отцовство (материнство) не исключается, то како ва вероятность того, что это не является результатом слу чайного совпадения индивидуализирующих признаков неродственных лиц.

Идентификационный тест, направленный на раз решение случаев оспариваемого отцовства, предполагает сравнительный анализ геномных профилей ребенка, матери и предпола гаемого отца. При этом сначала регистрируют те полосы в геномном отпе чатке ребенка, позиции которых совпадают с «материнскими» полосами, а оставшиеся полосы у ребенка сопоставляют с геномным профилем муж чины. Если исследуемое «трио» представляет истинную биологическую семью, все «нематеринские» полосы ребенка обнаружатся в геномном профиле отца. В противном же случае часть полос в локальных геномных профилях ребенка окажется «лишними», т.е. не «найдет» соответствия в геномных профилях заявленных родителей (рис. 131). Это стандартный алгоритм решения данной экспертной задачи, который базируется на за кономерностях наследования гипервариабельных локусов. В частности, опираясь на менделевский характер наследования, можно считать, что все полосы, составляющие геномный профиль ребенка, должны иметь либо отцовское, либо материнское происхождение. Поэтому присутствие у ре бенка посторонних фрагментов слу- жит основанием для исключения заявленного отцовства (при условии, что материнство рассматривается как бесспорное). В свою очередь полное комплементарное соответствие геномного профиля ребенка таковым заяв ленных родителей означает неисключение заявленного родства.

Суммируя сказанное, в контексте судебно-экспертной идентификации личности результаты молекулярно-генетического типирования должны ин терпретироваться в следующем логическом ключе.

А Сравнительный анализ: зафиксировано совпадение или несовпадение локальных генетических профилей либо (в случае экспертизы родст ва) индивидуальных аллелей, выявленных у идентифицирующего объекта и у идентифицируемого лица, или соответственно у ребенка и родителей.

Вероятностный анализ: в случае совпадения генетических профилей или аллелей — какова статистическая значимость этого события?

44.4.2. Сравнительный анализ геномных профилей Формальное сравнение. В принципе два геномных профиля можно счи тать одинаковыми (совпадающими), если они неразличимы по генотипу.

Для индивидуализирующих систем, основанных на использовании поли морфных локусов с дискретным распределением аллелей, это означает со впадение в сравниваемых геномных профилях всего набора составляющих аллелей. Чтобы это утверждать, надо, очевидно, уметь определить (иденти фицировать) сами аллели. В этом есть свои особенности.

Дело в том, что прямое (безусловное) генотипирование, т.е. прямое ус тановление локального генотипа, возможно только для систем, использую щих аллельспецифичные диагностикумы, например ППАФ-типа. RТак, при ППАФ-анализе локуса HLA DQA1 и локусов системы PolyMarker иденти фикация аллелей легко достигается за счет того, что регистрируемые дот сигналы являются аллельспецифичными и потому непосредственно указы вают, какой именно аллельный вариант выявлен. Регистрируемые таким образом генетические характеристики имеют абсолютное значение и пото му могут помещаться в банк данных для последующего сравнения с любы ми другими аналогичными данными.

В тех же случаях, когда прямое генотипирование невозможно, необхо димо соблюдать определенные условия, которые должны обеспечить кор ректность процедуры генотипирования. Например, для ПДАФ-систем на основе гипервариабельных локусов с варьирующим числом тандемных по второв, которые предполагают электрофоретическое фракционирование амплифицированных фрагментов ДНК, аллели определяют не прямым ме тодом, а опосредованно — на основании физического расположения (пози ционирования) фрагментов ДНК на дорожке геля. Но тогда для идентифи кации аллелей необходимы правила, которые определяли бы критерии по зиционного совпадения полос на геле. Важно понимать, что такие крите рии различаются в зависимости от свойств аналитической системы и спо соба сравнения (см. ниже). Поэтому регистрируемые генетические характе ристики имеют не абсолютное, а относительное значение. Иначе говоря, они могут быть пригодны для сравнения в рамках одного эксперимента и не могут использоваться для более широкого исследования. (Поэтому в банк данных они могут помещаться только тогда, когда установлено их со ответствие такому уровню точности, который обеспечивает возможность сравнения с любыми аналогичными данными.) 33" На практике совпадение геномных ПДАФ-профилей фиксируется в том) случае, когда картины распределения полос на сравниваемых дорож ках! геля однотипны и похожи, а позиции соответствующих фрагментов попадают в интервалы, удовлетворяющие установленным допускам.

Подобные принципы сравнительного позиционного анализа примени мы и для индивидуализирующих систем, которым свойственно непрерыв ное распределение аллелей, например, таких как минисателлитные моно-и мультилокусные ПДРФ-системы, поскольку для них определение генотипа еще более проблематично. В этом случае существуют проблемы как теоре тические, так и практические. Так, индивидуально-специфическая картина гибридизации, состоящая из множества характеристический полос и получающаяся при мультилокусной геномной дактилоскопии, представля ет собой своего рода «черный ящик», в котором остаются не^ выясненны ми ни генетическая природа, ни аллельные состояния локусов, соответст вующих этим полосам. Таким образом, поскольку для мультило-кусных систем критерии генетического тождества полос не определены, по сути сравнение осуществляется не по самому генотипу, а как бы п<я внешнему образу генотипа. В данном случае это оказывается возможным благодаря выраженной графической индивидуальности мультилокусного геномного профиля, который характеризуется сразу несколькими параметрами: чис лом полос, их расположением на дорожке и интенсивностью каждой поло сы.

При этом, однако, надо помнить, что оценочная специфичность муль-т тилокусного геномного «отпечатка» зависит от конкретных условий про ведения анализа, параметров и особенностей экспериментальных проце дур, количества и качества анализируемой ДНК. Это имеет принципиаль ное значение, поскольку отождествляемые препараты ДНК могут значи тельно различаться по своим «дактилоскопическим» свойствам, в частно сти вследствие процессов деградации нативных молекул ДНК. Таким об разом, при интерпретации результатов следует учитывать всю совокуп ность экспериментальных условий, действующих факторов и получаемых данных. Следует признать, что пока для мультилокусных систем эта задача в общем виде решена не полностью, хотя определенный прогресс наблю дается в решении] некоторых частных вопросов.

Интерпретация гибридизационной картины в случае использования мо-нолокусных зондов проще, чем для мультилокусных систем. Принци пиальное значение приобретает тот факт, что теоретически в геномных профилях сравниваемых объектов совпадающие полосы заведомо тожде ственны, поскольку они представляют один и тот же аллельный вариант конкретного генетического локуса, т.е. один и тот же индивидуализирую щий признак. Следует, однако, оговориться, что в свою очередь для моно локусных систем более проблематичным может оказаться решение вопро са собственно совпадения полос из-за сплошного характера их распреде ления и отсутствия внутренних маркеров геометрической однородности геля. (В мультилокусных системах роль таких маркеров играют достаточ но многочисленные мономорфные полосы.) Для решения этой проблемы предложены специальные методические и биостатистические подходы, в частности так называемый бининг (от англ. bin — интервал), когда аллели учитывают не индивидуально, а определенными группами.

В дальнейшем мы сосредоточим внимание на вопросах, связанных с интерпретацией только амплификационных геномных профилей локусов с варьирующим числом тандемных повторов, поскольку в нашей стране именно они имеют наибольшее практическое значение.

Позиционное сопоставление амплификационных геномных профилей. Во прос о том, одинаковы или неодинаковы геномные профили, которые по лучены при анализе препаратов ДНК, выделенных из объектов экспертизы (например, из биологических следов на вещественных доказательствах и из крови проходящих по делу лиц), является ключевым для молекулярно-ге нетической идентификации. Это ясно, поскольку от того, как будет интер претирован результат сравнения, зависит экспертный вывод: в одном слу чае это неисключение, а в другом —исключение причастности данного лица к происхождению исследованных следов. Между тем именно вопрос о похожести и непохожести геномных профилей может создать большую опасность неверного решения из-за множества причин. Некоторые из них мы рассмотрим в данном разделе.

Итак, как уже упоминалось, при анализе электрофореграммы можно выделить два аспекта:

• картины распределения полос на сравниваемых дорожках геля похо жи или непохожи;

• позиции соответствующих фрагментов совпадают или не совпадают.

Ложно е г енот ипир ова ние. Что касается общей похожести одного геномного профиля на другой, то в данном случае ложный результат может быть обусловлен двумя причинами.

Во-первых, присутствие в сравниваемых препаратах ДНК постороннего генетического материала (чаще всего в результате случайных загрязнений) может имитировать как совпадение, так и различие их геномных профилей.

Во-вторых, этот же эффект может проявиться как результат неправильного генотипирования, в частности в результате ложноопределеинои гомо- или гетерозиготности анализируемых объектов. Это связано с артефактами ПЦР, возникающими под влиянием неоптимальных условий ее проведе ния:

— избыточным или недостаточным исходным количеством матричной ДНК;

— плохим качеством препарата;

— неспецифичностью праймеров и(или) неадекватно подобранным для них рабочим режимом (например, отжиг при более низкой, чем сле дует, температуре);

— неоптимальной концентрацией Taq-полимеразы в реакционной сме си, в частности, ее избыточным количеством;

— присутствием в реакции неоптимальной концентрации Mg2+;

— профилем кривой нагрева реакционной смеси с неоптимальными значениями температурных переходов (это может быть вызвано не удачными техническими параметрами прибора, используемого для амплификации ДНК);

— неоптимальной продолжительностью процесса циклического нара щивания.

Наиболее распространенный артефакт, так называемый феномен пред почтительной амплификации аллелей, довольно часто приводит к ошибоч ному заключению о гомози готности. Вместе с тем наряду с опасностью ти пирования ложных гомозигот нередки и более сложные случаи искажения генотипа, характеризующиеся не только частичной утратой истинных алле лей, но и амплификацией неспецифических (неаллельных) фрагментов, что имитирует ложногетерозиготныи аллельныи профиль. Решить проблему ложноопределеинои гомо- или гетерозиготности в некоторых случаях сложно. Помочь в этом случае может только скрупулезный анализ устойчи вости амплификационных профилей, основанный на амплификационнои титровании сомнительных препаратов и многократной проверке воспроиз водимости результата.

Сд в и г полос. Физическое сопоставление полос на электрофоре грамме также требует учета многих факторов. Одна из сложностей — тая называемый сдвиг полос, когда в процессе электрофореза фрагменты ДНК в одной дорожке геля движутся быстрее или медленнее, чем идентичны!

фрагменты в соседней дорожке. Это явление имеет несколько причин:

— неодинаковое количество ДНК в разных дорожках геля;

— неодинаковые ионные характеристики препаратов, внесенных в раз- ные дорожки геля (присутствие в препаратах примесей, влияющих на электрофоретическую подвижность ДНК — солей, спирта, фенола, этидиумбромида и др.);

— избыточная напряженность электрического поля;

— перегрев и нарушение структуры геля (избыточный ток);

— истощение электрофорезного буфера;

— микрогетерогенность геля (в частности, недостаточно высокое каче ство среды разделения).

Большая часть перечисленных факторов поддается контролю, поэтому решением проблемы может быть оптимизация и текущий мониторинг соот ветствующих параметров.

В некоторых случаях сдвиг полос имеет не ступенчатый, а сглаженный характер (например, хорошо известный эффект «улыбки»). Тогда вознщ кающие геометрические искажения электрофоретической картины в принт ципе поддаются математическому анализу и могут быть скомпенсированы на стадии обработки изображения. Для этого рекомендуется, кроме флан кирующих дорожек, также и каждую 3—4-ю дорожку геля делать референт ной, т.е. вносить в нее маркеры молекулярных масс, по которым будет рас считываться фактор коррекции. Следует, однако, отметить, что надежная коррекция возможна не всегда и электрофорез по возможности надо повто рить.

Ра з ре ша юща я с пос об ност ь электрофорез а. Другой очень важный момент, о котором следует помнить при позиционном сопо ставлении полос на электрофореграмме, это разрешающая способность ис пользуемой электрофоретической системы. Оценка этого параметра имеет принципиальное значение для решения вопроса о самой возможности аде кватного сравнения амплификационных профилей. Для того чтобы иметь такую возможность, необходимо быть уверенным, что применяемая для фракционирования амплифицированных фрагментов ДНК система позво ляет надежно различать аллельные варианты, отличающиеся по длине как минимум на одно повторяющееся звено. Иначе можно ошибочно посчи тать идентичными те фрагменты, которые имеют близкую, но не одинако вую длину.

Для разделения аллелей применяемых на практике локусов с варьирую щим числом тандемных повторов, таких как STR-локусов (длина повторя ющейся последовательности 2—4 п.н.) и VNTR-локусов с коротким шагом (в частности, минисателлитного локуса D1S80, длина повторяющейся пос ледовательности которого составляет 16 п.н.), необходимо иметь возмож ность различать фрагменты ДНК, которые отличаются по длине на 1—2 % (и даже меньше в случае коротких тандемных повторов). Кстати, это спра ведливо и в случае электрофоретического фракционирования половых ге- тероформ амелогенинового гена, при котором надежность разделения дуб лета XY имеет принципиальное значение для использования данного теста.

Обеспечить такое разрешение способна далеко не любая электрофоре тическая система. В первую очередь этим обусловлены высокие требова ния, предъявляемые к электрофоретическим средам разделения.

Электрофорез в геле — стандартный метод, широко используемый для разделения и характеристики (идентификации) фрагментов ДНК в лабора торной практике. В основе его лежит эффект «молекулярного сита», прису щий многим гелевым средам (например, агарозным, крахмальным, агаро вым, ПААГ). Этот феномен обеспечивает возможность функционирования молекул ДНК в электрическом поле как по величине электрического заря да, т.е. по размеру, так и другим параметрам (например, пространственная конфигурация молекул), что в целом характеризует электрофорез в геле как сложный аналитический метод, в котором определяющую роль играет именно среда разделения. В современном анализе ДНК применяют агароз ные и полиакриламидные гели.

Агарозные гели, безусловно, являются наиболее удобными и техноло гичными системами для электрофоретического анализа ДНК: с ними легко манипулировать, они не обладают присущим акриламиду нейротоксичес ким действием. Кроме того, стандартные нативные агарозные гели в гораз до меньшей степени, чем ПААГ, чувствительны к случайным флюктуациям в макроструктуре молекул ДНК. Поэтому они менее «склонны» к опреде ленным, связанным с этим артефактам, которые могут приводить к пози ционным искажениям в анализируемом геномном профиле и как следствие к ошибкам при идентификации аллелей. Однако следует помнить, что раз деляющая способность обычных агарозных гелей в отношении фрагментов ДНК малого размера намного ниже, чем у ПААГ. Поэтому в молекулярно генетических экспертных исследованиях предпочтительнее использовать специальные агарозные среды, такие как модифицированные агарозы се мейств NuSieveR и MetaPhorR фирмы «FMC Bio Products» (США) или ана логичные им продукты других фирм.

Могут применяться как нативные, так и денатурирующие акриламид ные гели. Эти системы имеют ряд особенностей, которые должны быть предметом отдельного рассмотрения. Из принципиальных моментов отме тим лишь то, что интерпретация электрофореграмм, полученных в денату рирующих условиях, может осложняться эффектом «разделения цепей», когда индивидуальные фрагменты ДНК в геле оказываются представлен ными двумя полосами. Что касается нативных ПААГ, то в целом это систе мы с нехарактерными для агарозы электрофоретическими свойствами: они гораздо более чувствительны к пространственно-конформационным пара метрам молекул ДНК. Поэтому в этих гелях электрофоретическое поведе ние фрагментов ДНК значительно зависит от их нуклеотидного состава.

Это может проявляться в так называемом эффекте аномальной электрофо ретической подвижности и вызывать определенные геометрические иска жения амплификационного профиля, в частности позиционные несоответ ствия, касающиеся наблюдаемых и реальных размеров фрагментов.

На практике разрешение электрофореза можно контролировать визу ально с помощью наборов локусспецифичных аллельных маркеров (аллель ных «лестниц») или компьютерных программных средств, используя внут ренние или внешние маркеры молекулярных масс.

Из ме р е н ие э ле к т р офор е т ич е с к ой под вижнос т и фр а г ме н т о в ДНК;

физ ич е с к а я п ог р е шн о с т ь анали т ическ ой системы. Из сказанного выше очевидно, что позицион- ное совпадение или несовпадение амплифицированных фрагментов ДНК в сравниваемых геномных профилях (по сути вопрос их тождественности или отличия) не всегда может быть адекватно определено «на глазок». И прежде всего потому, что при таком способе оценки трудно учесть все действую щие факторы в их совокупности, а именно это влияет на результат. Так, на пример, мы знаем, что при невысоком электрофоретическом разрешении можно ошибочно отождествить заведомо разные фрагменты, поскольку их позиции совпадут на электрофореграмме. Однако в более сложных случаях в сочетании с выраженным эффектом сдвига полос недостаточное разреше ние электрофореза может привести к тому, что, наоборот, заведомо одина ковые фрагменты будут иметь разные позиции на геле и восприниматься как разные аллели (рис. 132).

Поэтому, строго говоря, вопрос позиционного совпадения или несовпа дения фрагментов ДНК должен решаться аналитическим путем на том ос новании, что позиции сравниваемых фрагментов попадают или же не попа дают в интервалы, удовлетворяющие установленным допускам. Очевидно, что такой подход в первую очередь требует физических измерений на электрофореграмме и учета их неизбежных неточностей.

Существует множество методов, позволяющих проводить измерение электрофоретической подвижности фрагментов ДНК на геле. При этом вполне определенные ограничения на применение того или иного метода накладывают погрешности измерений. Так, наиболее простой, но и наиме нее точный способ — измерение обычной линейкой. Он оказывается не приемлемым для относительно коротких агарозных гелей, когда цена деле ния мерной шкалы легко «вмещает» разницу в подвижности двух соседних аллелей. Наивысшие надежность и точность измерений обеспечивают авто матические компьютеризованные сканирующие или линейные регистри рующие системы, которые используются в наиболее совершенных прибо рах. Более или менее универсальный вариант — это так называемый диги тайзер (от англ. digitizer), представляющий собой электронный модуль, ко торый состоит из курсора-измерителя и цифрового координатного устрой ства. Такой модуль можно использовать как самостоятельно, так и в каче стве составной части компьютерных систем обработки изображения.

Разработано много моделей подобных устройств. В качестве примера можно привести первую в нашей стране компьютеризованную систему TVID-DATAPHOR, созданную в 1994 г. в Бюро главной судебно-медицин ской экспертизы МЗ РФ. При помощи видеокамеры данная система позво ляет получать и хранить в памяти компьютера «оцифрованное» изображе ние геля. На экране монитора изображение воспроизводится с общим гео метрическим разрешением 280 х 460 точек и монохромным тоновым разре шением в 256 градаций. Программные средства позволяют эксперту осу ществлять контроль электрофоретического разрешения, проводить анализ распределения материала в полосе на электрофореграмме и двумерное из мерение пробега в геле, определять размеры фрагментов ДНК с использо ванием нескольких алгоритмов. Предусмотрена также возможность коррек ции электрофоретической неоднородности геля. Программа-дигитайзер имеет координатную систему с ценой деления в 1 пиксел, что в зависимости от аппаратной оптики может обеспечить точность измерений в реальном масштабе в пределах ±0,1 мм.

Погрешности измерений — составная часть общей ошибки измерений (физическая погрешность), которая в конечном итоге определяет разре шающую способность всей используемой аналитической системы. Кроме погрешности метода измерения, свой вклад в общую физическую ошибку Б В А I-S +S т Рис. 132. Решение вопроса о позиционном совпадении или несовпадении амплифи-цированных фрагментов ДНК в сравниваемых геномных профи лях.

Этот вопрос не всегда может быть правильно решен «на глазок». Например, при невысоком электрофоретическом разрешении в сочетании с эффектом сдвига полос можно ошибочно отождествить заведомо разные фрагменты, поскольку их позиции совпадут на электрофоре-грамме (как аллели 6 и 7 в дорожках Б и В), или наоборот, заведомо одинаковые фрагменты будут иметь разные позиции на геле и восприниматься как различные аллели (как фрагмент 5 в дорожках Б и В). Показана схематическая картина электрофо ретического фракционирования в 3 дорожках на геле аллельной «лестницы» одного и того же полиморфного локуса с дискретным распределением алле лей, имеющего более 8 аллельных вариантов: А — условно нормальное рас пределение фрагментов на геле;

Б — случайный сдвиг полос на величину -S (замедление);

В — случайный сдвиг полос на величину +S (ускорение). В разных зонах геля в зависимости от достигнутой величины электрофоретиче ского разрешения величина случайного сдвига (физическая погрешность системы, S) по-разному соотносится с величиной аллельно-го шага. Если это х соотношение меньше /г, то позиционное совпадение или несовпадение фрагментов интерпретировать невозможно, поскольку это могут быть как одинаковые, так и разные аллели (зона а). Если это соотношение находится в интервале между 1Л и 1А (зона б), то можно однозначно интерпретировать только две ситуации: когда полосы полностью совпадают — в этом случае можно быть уверенным, что это идентичные аллели;

когда позиции полос различаются больше чем на 2S — тогда это по определению разные аллели.

Любое же несовпадение на величину, меньшую чем 2S, однозначно интер претировать нельзя — это могут быть как одинаковые, так и разные аллели (ср., например, фрагменты 4 и 5 или 5 и 6 в дорожках Б и В). Если величина сдвига полос (S) меньше УА длины аллельного шага (зона в), то при любом взаимном расположении полос на геле имеется возможность решить вопрос об аллельной идентичности фрагментов.

системы вносят такие факторы, как разрешение электрофореза, характере степень геометрических искажений в геле, форма, ширина и интенсивности самих полос и др.

Чтобы на практике оценить общую физическую погрешность исполы зуемой аналитической системы, необходимо определить так называемое окно для фрагмента, т.е. границы пространства на геле, в котором он стад тистически может оказаться. Эта величина зависит главным образом от свойств электрофоретической системы: статистического сдвига полос (т.е.

величины случайных вариаций подвижности идентичных фрагментов), стен пени диффузии и разрешения электрофореза, точности измерительной сиш темы.

Отметим, что физическую погрешность можно выразить в виде доли (з процентах) от длины анализируемого фрагмента ДНК, но тогда эта величи на будет зависеть от длины фрагмента. Например, по данным автора этой главы, на агарозных электрофоретических средах MetaPhorR в сочетаниям описанной выше системой TVID-DATAPHOR, на стандартном 12 см геле позиция фрагмента ДНК длиной 800 п.н. определяется с погрешностью!

соответствующей 0,6 % длины этого фрагмента. Это означает, что такой фрагмент на разных дорожках геля попадает в «окно», аналитический разл мер которого не превышает 2 минимальных единиц измерения при достизи нутом разрешении 5 н.п. на 1 ед. измерения.

В плане решения ключевого вопроса — позиционного совпадения или несовпадения фрагментов ДНК — оценка величины физической погреш ности используемой экспертом аналитической системы позволяет устано- вить для данной системы соответствующие объективные правила и количе- \ ственные критерии позиционного сопоставления геномных профилей.

По з и ц и о н н ы е к р ит е р и и с о п о с т а в л е н и я геномных профиле й. Теоретически обобщенные требования для аналитической системы просты — позиции на геле разных аллельных фрагментов] не должны совпадать. Действительно, если бы физическая погрешность! сис темы равнялась нулю, то полное совпадение позиций на геле двух фраг-J ментов ДНК в противоположность любому позиционному несовпадение могло бы рассматриваться как критерий их аллельной идентичности^ Любое же несовпадение должно было бы означать разные аллели. Единст- \ венной оговоркой в этом случае будет разрешение электрофореза, которое, очевидно, должно быть способно продемонстрировать имеющуюся разницу в электрофоретической подвижности фрагментов как детектируемую (из меряемую) геометрическую величину. Отсюда ясен физический смысл ве- <личины электрофоретического разрешения, который заключается в том, что эта величина определяет минимальную абсолютную разницу в длине] анализируемых фрагментов ДНК, которую может «показать» используемая система. Важно подчеркнуть, что эта величина зависит от длины самих iфрагментов.

Учитывая сказанное, можно было бы предложить следующие критерии.

• Два фрагмента ДНК тождественны друг другу, если их позиции на геле неразличимы при условии, что разрешение электрофореза в этой точке достаточно, чтобы зафиксировать разницу в длине между сосед ними аллелями.

• Два фрагмента ДНК нетождественны, если при том же условии их по зиции на геле не совпадают.

Однако не следует забывать, что физическая погрешность используемых на практике аналитических систем — реальная величина и потому позиции идентичных фрагментов на геле вполне могут различаться — в пределах со ответствующего «окна». Следовательно, в реальной системе два фрагмента ДНК можно считать тождественными друг другу в том случае, если, во-пер вых, их позиции на геле не выходят за пределы границ соответствующего «окна», и, во-вторых, если заведомо разные фрагменты не могут попасть в эти границы. (Надо четко понимать, что если последнее условие не опреде лено, то задача отождествления фрагментов на основании их позиции на геле в принципе невыполнима.) Поскольку пространство «окна» ограничено удвоенной величиной фи зической погрешности, то на первый взгляд можно было бы сказать так:

для того чтобы иметь возможность в любом случае решить вопрос об ал лельной идентичности фрагментов, разрешение электрофореза должно быть достаточным, чтобы величина физической погрешности не достигала Vi длины аллельного шага на минимально измеряемую величину. Однако на самом деле это справедливо только в том случае, если известны границы «окна» каждого фрагмента на геле. Поскольку эти границы априори неиз вестны, при таком разрешении геля можно однозначно интерпретировать только две ситуации: 1) когда полосы полностью совпадают, — в этом слу чае можно быть уверенным, что это идентичные аллели, 2) когда позиции полос различаются больше, чем на удвоенную величину физической по грешности, — тогда это разные аллели. Любое же несовпадение на величи ну, равную или меньшую, чем удвоенная физическая погрешность, одно значно интерпретировать невозможно — ведь это могут быть как одинако вые, так и разные аллели. Отметим, что это правило остается верным и в случае примененения локусспецифичных аллельных маркеров (так назы ваемой аллельной лестницы).

Чтобы избежать подобной неопределенности и действительно при лю бом взаимном расположении полос на геле иметь возможность решить во прос об аллельной идентичности фрагментов, разрешение электрофореза должно быть таким, чтобы величина физической погрешности системы оказалась меньше А длины аллельного шага на минимально измеряемую величину.

Таким образом, мы сформулировали универсальные критерии.

А Два фрагмента ДНК тождественны друг другу, если их позиции на геле не отличаются более чем на удвоенную величину физической по грешности системы при условии, что разрешение электрофореза в этой точке достаточно, чтобы величина физической погрешности была меньше У\ длины аллельного шага на минимально измеряемую величину;

Два фрагмента ДНК нетождественны, если при том же условии их по зиции на геле отличаются более чем на удвоенную величину физичес кой погрешности.

Сра в не ние г е н о мн ых профилей, пол уч е нных на р а з н ых гелях. По существу сопоставление геномных профилей, по лученных на разных гелях, означает, что сравнению подвергаются результа ты разных экспериментов. Этот факт имеет принципиальное значение:

если при сравнении позиций фрагментов ДНК на одной электрофореграм ме их позиционное совпадение или несовпадение устанавливают путем прямого (непосредственного) сопоставления друг с другом, то при анализе разных электрофореграмм этого сделать нельзя, поскольку профили элек трофоретического разделения в каждом эксперименте оказываются не одинаковыми. На разных гелях амплификационные профили идентичных объектов могут быть весьма похожими, но они необязательно будут геомет-' рически тождественны. Поэтому сравнение можно делать только опосредо ванно — путем независимого сопоставления параметров сравниваемых полос с некой третьей величиной. Далее известно, если две величины по рознь равны третьей, они равны между собой и т.д.

Совершенно очевидно, что таким согласующим параметром является аллельная принадлежность фрагментов в сравниваемых геномных профи лях. Сопоставление аллелей (генотипов) в отличие от позиционного срав нения амплификационных профилей имеет уже не относительный, а аб солютный характер, поэтому генотипированные аллельные профили в принципе можно сравнивать независимо от того, получены они в одном или в разных экспериментах. Это означает, что генотипические характе ристики исследованных объектов могут быть организованы в информаци онную базу данных и использоваться как элементы банка генетических данных.

Для индивидуализирующих систем, основанных на использовании по лиморфных локусов с дискретным распределением аллелей, применение локусспецифичных аллельных маркеров (аллельных «лестниц») позволяет относительно просто осуществлять генотипирование локальных аллельных профилей и при условии, что в каждом эксперименте были соблюдены не обходимые позиционные критерии сопоставления полос (см. выше), пере ходить от позиционного анализа в рамках одного эксперимента к безотно сительному сравнению генотипов объектов.

В том случае, если используются другие (неаллельные) маркеры молеку лярных масс, первичной согласующей величиной для сравнения на разных гелях амплифицированных фрагментов ДНК является длина этих фрагмен тов. Однако в этом случае понадобятся дополнительные условия, которые обсуждаются в следующем разделе.

Определение ра з мера фраг мент ов и г енотипиро в а ни е г е н о м н ых пр офиле й. Физические измерения пробега фрагментов ДНК на электрофореграмме дают возможность вычислять их условный молекулярный размер, например длину в парах нуклеотидов.

Между этими двумя параметрами существует вполне определенная взаимо связь: молекулярная масса (а следовательно, и размер) обратно пропорцио нальна величине электрофоретической подвижности. Надо подчеркнуть, что эта зависимость имеет сложный характер, она не является линейной и ее конкретные характеристики могут существенно различаться на разных гелях. Последнее объсняется тем, что электрофоретическая подвижность молекул нуклеиновых кислот в геле, в частности ДНК, определяется целым рядом параметров, таких как молекулярная масса, линейный размер моле кул, а также молекулярные структурные особенности высших порядков.

Вклад каждого из факторов и, следовательно, форма кривой, характеризую щей эту многопараметрическую зависимость, могут быть разными: все за висит от аналитических свойств конкретной гель-электрофорезной сис темы Таким образом, чтобы определить размеры амплифицированных фраг ментов ДНК по их расположению на геле, нужно проанализировать про филь электрофоретического разделения для данного конкретного геля и для него определить точный характер зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров. Это можно сделать, используя стандарты молекулярных масс, т.е. фрагменты ДНК заранее известного размера, которые фракционируют на том же геле, что и анализируемые ам плифицированные фрагменты.

По характеру применения электрофоретические стандарты молекуляр ных масс бывают внешними и внутренними. Внешние стандарты наносят на гель так, что они образуют самостоятельные контрольные или маркер ные дорожки. Для минимизации возможных пространственных искажений, как реальных, так и кажущихся (параллаксных), влияющих на точность со поставления характеристик стандартной и анализируемой дорожек, мар керные дорожки следует располагать на геле как можно ближе к дорожкам, по которым движутся анализируемые фрагменты ДНК. Такой проблемы не возникает в том случае, если стандарты молекулярных масс вносят непо средственно в ту же дорожку, где фракционируют интересующие эксперта амплифицированные фрагменты (внутрений стандарт). Однако в обычной практике использовать внутренние стандарты можно лишь для решения ог раниченного круга задач;

универсализация же этого подхода требует специ альной приборной базы (например, многоцветной флюоресцентной детек ции).

Анализ данных электрофоретического разделения стандартных (маркер ных) фрагментов позволяет определить параметры кривой зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров для данного конкретного геля и затем, используя эти параметры, рассчитать длину ана лизируемого фрагмента на основании величины его электрофоретической подвижности. Для этого существуют специальные расчетные алгоритмы.

Эти алгоритмы характеризуются разной степенью точности.

Важно понимать, что погрешность расчетов при определении размера фрагментов является еще одной составляющей (вместе с физической по грешностью) общей ошибки генотипирования, присущей данной аналити ческой системе в целом. Поэтому, если вернуться к сопоставлению элек трофоретических данных, полученных на разных гелях, то в том случае, когда не используются аллельные маркеры, а сравниваются длины фраг ментов, определенные с помощью стандартов молекулярных масс, следует учитывать и ошибку расчетов.

Наиболее заметный вклад в методическую разработку вопросов повыше ния точности расчета длин фрагментов ДНК внесли работы Э.Сазерна и А.Элдера (начало 80-х годов). Предложенные этими авторами алгоритмы расчетов в принципе позволяют определять размер фрагментов ДНК с по грешностью, не превышающей 0,1 %. Однако принципиальное значение имеет то, что такой результат возможен только при условии, что стандарты (маркерные фрагменты) и анализируемые фрагменты гомологичны, т.е.

представлены одинаковыми полинуклеотидными последовательностями.

Если же это условие не соблюдено, т.е. нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой и контрольной ДНК различны, то ошибка в оп ределении размера фрагментов может достигать нескольких процентов.

(Это связано с минорными различиями в физико-химических и как след ствие электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с разным нуклеотидным составом.) Определяемый размер фрагментов служит «ключом» к генотипирова нию, т.е. к идентификации аллелей. Однако следует помнить, что из-за по грешности расчета определение размеров амплифицированных фрагментов ДНК не всегда может гарантированно обеспечить правильную идентифика цию аллелей, которым эти фрагменты соответствуют.

Речь идет о том, что позиционное «окно» фрагмента, которое задается физическими параметрами системы и «пространство» которого в норме распределено симметрично относительно истинного аллельного размера, при перерасчете в «окно» допустимых длин оказывается асимметричным — смещенным от среднего положения на величину алгоритмической погреш ности. Если эта погрешность относительно велика, скажем, сравнима с ве личиной аллельного шага, то «окно» длин фрагмента может и вовсе пере двинуться на место, соответствующее соседнему аллелю. Если этот эффект не учитывать, может сложиться положение, когда, например, идентичные фрагменты, аллельную принадлежность которых в разных экспериментах определяли с помощью разных стандартов молекулярных масс, могут быть ошибочно отнесены к разным аллелям.

Представим себе такую ситуацию. Величина физической погрешности системы составляет 4 п.н., и мы имеем право, например, анализировать ал лель N22 локуса D1S80 (494 п.н.), поскольку удовлетворяется критерий по зиционного сопоставления фрагментов на геле (аллельный шаг в этой зоне составляет 3,2 % от длины фрагмента, а погрешность — 0,8 %). В этих усло виях аллель N22 может попасть в 1,6 % позиционный интервал («окно»).

Если бы погрешность расчета размера фрагмента по его подвижности была равной нулю, то это соответствовало бы значениям 21,75—22,25;

соседний же аллель N23 (510 п.н.) определялся бы в интервале 22,75—23,25. Однако погрешность расчета для гетерологичного стандарта молекулярных масс может составить 3 %. Для анализируемого локуса это 0,95 аллельного шага.

Тогда интервал для аллеля N22 сместится, примет значения 22,7—23,2 и пе рекроет формальное «окно», предназначенное для аллеля N23. Иными сло вами, фрагмент уже не будет определяться как аллель N22, а будет опре деляться как N23. В другом случае, при использовании иного стандарта, по грешность расчета может оказаться совсем другой, например 0,5 % (0, аллельного шага), и аллель N22, вероятнее всего, будет определен именно как N22.

Все это означает, что генотипические характеристики, полученные рас четным путем на основании величины электрофоретической подвижности гетерологичных стандартов молекулярных масс, являются условными и по тому не всегда могут быть напрямую использованы для сопоставления как элементы банка данных. Чтобы получить такую возможность, необходимо использовать как минимум одинаковые маркеры или же провести норми рование ошибки и осуществить коррекцию всех данных по эталону, напри мер по гомологичному аллельному маркеру. Последний вариант предпо чтителен, поскольку позволяет оперировать не условными, а истинными генотипами, что необходимо для корректной статистической обработки данных.

44.4.3. Вероятностная оценка генетической идентичности объ ектов при совпадении их геномных профилей Обоснование вопроса и постановка задачи. Вероятностная оценка гене тической идентичности объектов экспертизы строго обязательна. Это тре бование диктуется необходимостью принимать во внимание возможность случайного совпадения индивидуализирующих признаков разных индиви дуумов.

Совпадение амплификационных профилей (генотипов) в препаратах ДНК, полученных из биологических следов с места преступления, и в ДНК подозреваемого еще не означает, что у этих двух ДНК общее происхожде ние. Иначе говоря, сам по себе факт генотипического совпадения необяза тельно влечет за собой вывод о том, что следы произошли именно от этого человека;

они могли произойти и от другого индивидуума, который неотли- чим по исследованным генетическим признакам от первого. Точно так же в экспертизе спорного отцовства факт совпадения отцовских аллелей в гено типе ребенка с аллелями, присутствующими в геноме предполагаемого отца, еще не означает доказанного отцовства. Это объясняется тем, что как бы ни высока была индивидуализирующая значимость анализируемых при знаков, а именно аллельных вариантов гиперполиморфных генов, она не абсолютна. Практически все эти признаки группоспецифические, т.е. в той или иной степени каждый из них распространен в популяции. Поэтому после того как в ходе экспертизы установлен факт совпадения ДНК-про филей, характеризующих объекты экспертизы, и выполнено их генотипи рование, перед экспертом встает последний и самый важный вопрос:

• если генотипические аллельные комбинации двух препаратов ДНК совпадают, то какова вероятность того, что они произошли от одного человека.

Или в случае экспертизы спорного происхождения детей:

• если все аллели ребенка находят соответствие в генотипах матери и предполагаемого отца, то какова вероятность того, что предполагае мый отец является биологическим отцом этого ребенка?

Для того чтобы ответить на этот ключевой вопрос и тем самым оконча тельно решить экспертную задачу, понадобится прояснить два момента. Во первых, необходимо оценить индивидуализирующее значение выявленного комплекса признаков, т.е. количественно определить, насколько по лученные в ходе исследования генетические признаки позволяют отграни чить исследованный объект экспертизы от любого другого, ему подобного.

Во-вторых, нужно правильно выбрать алгоритм расчета интересующей нас вероятности для оценки идентификационной значимости результатов экс пертизы.

Количественная оценка индивидуализирующего значения геиоттшчсских характеристик. Для того чтобы оценить индивидуализирующее значение выявленного геномного профиля, нужно определить, какая часть популя ции может быть донором данного типа ДНК. Заметим, что определение в популяции доли потенциальных «двойников», т.е. индивидуумов, которые не различаются по тому или иному исследуемому признаку, является стан дартным предметом популяционнои генетики и соответственно решается стандартными методами этой науки. Поэтому мы не будем касаться тонко стей методологии популяционных расчетов, что подробно описано в спе циальной литературе, а сосредоточим внимание лишь на тех понятиях и той логике, которые имеют принципиальное значение для вопросов, по ставленных перед судебной экспертизой.

Итак, по существу перед экспертом стоит задача определить частоту идентификационного признака в популяции. В качестве индивидуализирую щих и в конечном счете идентификационных признаков в судебно-экс пертном молекулярно-генетическом анализе выступают конкретные аллели полиморфных локусов ДНК. Они могут анализироваться либо самостоя тельно (например, в случае решения вопросов о родстве), либо в составе ге нотипических аллельных комбинаций (при идентификации личности).

Исходным параметром популяционных выкладок, касающихся оценки распространенности признака, служит величина, называемая вероятностью признака. В нашем случае это вероятность аллеля, которая обозначается символом (р). По определению эта величина равна отношению числа алле лей данного типа к общему числу аллелей исследуемого локуса в наблюдае- мой выборке. Величину (р) называют также аллельной частотой. Ее опреде ляют эмпирически, на основании результатов популяционных исследова-J ний.

Помимо вероятности аллеля, другой важной характеристикой является частота встречаемости аллеля в популяции — так называемая статистичесЛ кая частота аллеля. Она обозначается символом (q). Обращаем внимание на то, что этот параметр, хотя и «созвучен» аллельной частоте, отличается от нее как по величине, так и по смыслу. Для популяций, находящихся в условиях равновесия Харди—Вайнберга, величина (q) связана с величиной (р) соотношением q = 2р—р2. Она также может быть определена на основа нии данных популяционных исследований: статистическая частота аллеля — это отношение числа генотипов, в которых присутствует данный аллель, к общему числу всех возможных генотипов в популяционной выборке.

Из этого определения следует, что, например, в экспертизе спорного отцовства именно статистическая частота аллеля (q) должна фигурировать как мера распространенности в популяции индивидуализирующего призна ка, присущего сравниваемым субъектам (ребенку и предполагаемому отцу) и используемого в целях идентификации биологического отца ребенка.

Иными словами, это и есть мера индивидуализирующего значения призна ка, в данном случае аллеля: величина (q) служит тем параметром, который определяет шансы любого (случайного) мужчины, имеющего данный ал лель в генотипе, считаться биологическим отцом любого ребенка, у которо го этот конкретный аллель был идентифицирован как отцовский.

В случае же идентификации личности в качестве индивидуализирующе го признака, имеющего идентификационное значение, выступает уже не отдельный аллель, а целиком локальный генотип. Напомним, что для каж дого отдельного локуса это комбинация двух аллелей, которые могут быть разными (aj;

аг — гетерозиготное состояние), а могут оказаться и одинако выми (ai;

ai — гомозиготное состояние). Поэтому в этом случае для количе ственной оценки индивидуализирующего значения признака используют статистическую частоту генотипа, а именно, частоту встречаемости кон кретного профиля ДНК в популяции. Эту величину иногда обозначают символом Q;

ее определяют эмпирически на основании данных популяци онных исследований или же рассчитывают, исходя из величины вероятности каждого аллеля (ра, и р-а) на основании закономерностей менделевского на следования. Для гетеро- и гомозиготного генотипов расчетные величины Q соответственно равны: Q = 2 • ра, • р02 и Q = ра,2. Важно, однако, подчеркнуть, что в современной мировой практике для расчета статистической частоты гомозиготных профилей вместо выражения Q = ра,2 обычно применяют ис кусственную, но более консервативную оценку Q = 2р для компенсации эффекта ложной гомозиготности. (Приведенные формулы справедливы только для популяций, находящихся в условиях равновесия Харди— Вайн берга.) Таким образом, в случае идентификационного исследования величина Q служит параметром, который определяет шансы любого (случайного) че ловека, имеющего данный генотип, считаться именно тем лицом, от кото рого произошла любая ДНК с этим генотипом.

Если индивидуализация объекта экспертизы осуществляется по не скольким независимым признакам, то для совокупной оценки индивидуа лизирующего значения выявленного комплекса признаков их статистичес кие частоты могут быть перемножены. Для геномных локусов критерием независимости является отсутствие между ними генетического сцепления (так называемое состояние равновесия по сцеплению). Следовательно, ко личественная оценка индивидуализирующего значения нескольких геном ных профилей, полученных для панели несцепленных полиморфных локу сов, будет определяться как произведение статистических частот всех ге нотипов в идентификационной экспертизе или всех отцовских аллелей ре бенка в экспертизе спорного отцовства.

Принципы расчета вероятности для оценки идентификационной зна чимости совпадения генотипов. Как и в предыдущем разделе, обратимся к вопросам, относящимся к предмету и методу самостоятельной отрасли науки, а именно — теории вероятностей. Вопрос судебно-генетической экспертной идентификации, касающийся вероятностной оценки того, что данный конкретный биологический след на вещественном доказательстве произошел от данного конкретного человека или же именно этот человек является биологическим отцом конкретного ребенка, в принципе решается штатными методами математической статистики с использованием хоро шо известных специалистам теорем и формул.

Но проблема заключается в том, что, так сказать, «вводная» часть зада чи оказывается достаточно сложной. Во-первых, она сложна в той мере, в какой сложны те биологические и, в частности, молекулярно-генетические закономерности, которые лежат в основе формирования исследуемых ге но-типических характеристик и процесов их наследственной передачи в ряду поколений (вспомним, например, процессы генетической рекомби нации и мутагенеза). Во-вторых, она может быть сложной ситуационно (например, когда в совершении преступления участвовали несколько че ловек). Кроме того, в самой математической статистике существуют раз ные научные направления и школы, которые при формулировании одной и той же задачи могут опираться на различные логические построения, а для решения задачи применять неодинаковый математический аппарат.

Неудивительно, что среди математиков существуют разные мнения по по воду целесообразности и даже правомочности применения того или иного подхода.

Эта тема вполне может стать предметом специального обсуждения и мы не будем ее касаться. Наша задача — прояснить основные принципы вероятностных расчетов, используемых в мировой практике для опреде ления идентификационной значимости результатов экспертизы. Для крат кости нам придется максимально упростить рассуждения и ограничиться «общим случаем», не обсуждая конкретные экспертные ситуации, кото рые в свою очередь могут быть рассмотрены отдельно.

Выч и с л е н и е и нк р ими нир ующе г о з на ч е ния гено типа и и н д е к с а от цов ст ва. Стандартные в зарубежной судебно экспертной практике величины «инкриминирующее значение» (англ. In criminating Value, IV) и «индекс отцовства» (англ. Paternity Index, PI), ма тематически — суть отношения правдоподобия.

При идентификации личности инкриминирующее значение (IV) выяв ленного генотипического совпадения геномных профилей выражает соот ношение шансов двух версий, а именно:

Вероятность совпадения геномных профилей, если они получены на одной и той же ДНК Гу =--------------------------------------------------------------------------- Вероятность совпадения геномных профилей, если они по лучены ' на разных по происхождению ДНК Очевидно, что амплификационные профили ДНК, полученные из сле дов на вещественных доказательствах и из крови подозреваемого лица, за- 34- ведомо совпадут, если следы произошли именно от этого человека. Иными словами, вероятность совпадения в этом случае равна 1, и следовательно, числитель приведенного выше выражения равен 1.

Если же анализируемые ДНК произошли от заведомо разных людей, то вероятность того, что их амплификационные профили окажутся одинако выми, будет численно равна индивидуализирующему значению признака, т.е. частоте встречаемости конкретного профиля ДНК в популяции. Следо вательно, в знаменателе мы имеем статистическую частоту выявленного ге нотипа (Q). Таким образом, IV = VQ. Или для анализа, проведенного по не скольким несцепленным локусам, IV = V(QaQbQe...Qn), где Qn — статисти ческая частота n-го локального генотипа. (Следует оговориться, что подоб ный расчет приемлем только в том случае, если происхождение генетичес кого материала от подозреваемого не исключается другими методами и следы оставил один человек.) При вероятностной оценке результатов экспертизы спорного отцовства, когда не получено исключения ложноуказанного отца, используется анало гичная по смыслу величина — индекс отцовства (PI).

Этот параметр был введен в практику серологического типирования в 1956 г. Х.Гюртлером, который предложил следующее правило: считать тес тируемого мужчину отцом, если PI > 19. Позже, в 70—80-х годах К.Хюм мель обосновал более жесткие вероятностные критерии отцовства. В част ности, нижний порог величины PI, который бы недвусмысленно свиде тельствовал об «отцовстве», теперь превысил 400. И хотя в целом вопрос о стандартах доказательности позитивного установления отцовства выходит за рамки нашего обсуждения, можно сказать, что этот критерий еще не вполне устарел.

В молекулярно-генетической интерпретации величина PI выражает со отношение шансов двух версий, а именно:

Вероятность совпадения отцовского аллеля в геномном профиле ребенка с одним из аллелей мужчины, если этот мужчина — его биологический отец Вероятность совпадения отцовского аллеля в геномном профиле ребенка с одним из аллелей мужчины, если этот мужчина не является его биологи ческим отцом Если не учитывать возможных (но все-таки достаточно редких) мута ций, то амплификационные профили ДНК ребенка и его истинного отца заведомо совпадут по тому аллелю, который ребенок унаследовал от отца, т.е. вероятность такого совпадения равна 1 и, следовательно, в числителе ставим 1. Если же неисключенный предполагаемый отец на самом деле не является биологическим отцом ребенка, то вероятность случайного совпа дения какого-нибудь из его аллелей с отцовским аллелем в геномном про филе ребенка будет численно равна частоте встречаемости этого конкрет ного аллеля в популяции. Следовательно, в знаменателе мы имеем статис тическую частоту аллеля (q). Таким образом, PI = Vq. Или для анализа, про веденного по нескольким несцепленным локусам, PI =,/(qaqbqc...qn), где q — статистическая частота идентифицирующего аллеля для каждого из ис следованных локусов. (Здесь следует оговориться, что подобный расчет приемлем только в том случае, если точно известно, какой именно аллель ребенок унаследовал от отца.) Выч и с л е н и е в е р оя т н о с т и г е не т ич е с к о й иден т и ч н о с т и об ъе кт ов э к с пе р т из ы и в е р оя т н о с т и от цовства. Наряду с вычислением отношений правдоподобия для получе- ния количественных оценок достоверности экспертного вывода широкое распространение в мировой судебно-экспертной практике получил так на зываемый байесов метод математической статистики. Суть заключается в следующем.

Рассмотренные выше отношения правдоподобия (IV и PI) должны отве тить на вопрос, во сколько раз более вероятно, что выявленные в ходе ана лиза индивидуализирующие признаки совпадают закономерно (например, когда исследуемые образцы ДНК произошли от одного человека), а не слу чайно (т.е., когда они принадлежат двум разным членам популяции). Но строго говоря, это не есть ответ на главный вопрос, «призванный» количе ственно охарактеризовать доказательственное значение экспертизы: если совпадение признаков установлено, то какова вероятность, что это совпа дение закономерно, а не произошло случайно? Ответить на этот вопрос можно, используя формулу вычисления условной вероятности, выведенную еще в XVIII в. математиком Байесом:

Р(А\В)Р(В) Р(В\А) = Р(А|В) Р(В) + Р(А| not В) P(notB) Смысл этой формулы в том, что, зная так называемую априорную (без условную) вероятность интересующего нас некоего события В — Р(В), объ единяем ее с вероятностью (условной) другого имеющего отношение к В события А при условии, что В уже произошло — Р(А|В), и в результате оп ределяем величину так называемой постериорной (условной) вероятности события В при условии, что событие А имело место — Р(В|А).

Представим, что событие А, которое имело место в проведенной нами экспертизе идентификации личности, это наблюдаемое совпадение геном ных профилей двух ДНК. Интересующее нас в этом контексте событие В — это, например, то, что оба образца ДНК генетически идентичны, т.е. про изошли от одного человека. Априорную («до опыта») вероятность такого события Р(В) принято считать равной 0,5. Это означает, что с равной веро ятностью генетический материал, обнаруженный на идентифицирующем объекте, и образец ДНК идентифицируемого лица могут иметь и разное происхождение: P(not В) — Р(В). Далее, вероятность того, что геномные профили совпадут при том условии, что они принадлежат одному человеку Р(А|В), нам известна (равна 1), равно как и вероятность P(A|not В) того, что они совпадут при обратном условии (это частота генотипа Q). Подставляя эти значения в формулу Байеса, определяем конечную постериорную («после опыта») вероятность Р(В|А) того, что при наблюдаемом совпадении геномных профилей исследованные образцы ДНК идентичны:

= Р(В|А)= Р(А|В) Р(А|В) + P(A|not В) 1 + Q ' (Следует обратить внимание на то, что приведенное равенство верно только при 50 % значении априорной вероятности.) Эта байесова вероятность генетической идентичности геномных профи лей иногда называется инкриминирующей вероятностью (англ. Incriminat ing Probability, IP). Заметим, что:

1Р=---------.

1 + Vlv 34* Аналогично в случае неисключающеи экспертизы спорного отцовства байесова постериорная вероятность Р(В|А) того, что при наблюдаемом со впадении отцовского аллеля в геномном профиле ребенка с одним из алле лей предполагаемого отца этот мужчина является его биологическим от цом, называется вероятностью отцовства (РР, от англ. — Probability of Pa ternity) и выражается формулой:

1 РР= 1 + q = 1 + '/PI ' Обе эти вероятности часто выражают в процентах.

Концепция количественной оценки вероятности отцовства в судебно экспертной практике была разработана более 60 лет назад Э.Эссен-Мелле ром. На основании собственных исследований он впервые предложил фор мулу расчета позитивной вероятности, которая позволяла выражать наблю даемое в экспертизе сходство признаков у ребенка и родителей не эмоцио нально и субъективно, а объективно и количественно, т.е. как величину, которую можно измерить (вычислить). В 1961 г. П.Им показал, что форму ла Эссен-Меллера может быть выведена из теоремы Байеса. В настоящее время эссен-меллеровская версия оценки вероятности отцовства является концептуальной основой применения вероятностных расчетов в молеку лярно-генетической экспертизе по делам о спорном отцовстве, материнст ве и происхождении детей.

раздел Судебно-медицинская экспертиза при чрезвычайных ситуациях Стихийные бедствия и современные крупномасштабные технологичес кие катастрофы создают неожиданную, внезапную ситуацию, которая приводит к серьезной угрозе для здоровья и жизни отдельных групп или больших контингентов населения, к изменению привычного уклада жиз ни, экологическим нарушениям и рассматривается как острейшая форма социальной патологии вообще и медико-социальной проблемы в частно сти.

Каждая катастрофа имеет свои отличительные черты по виду, масшта бу и действию поражающего фактора, которые определяют количество человеческих жертв и характер повреждений, а следовательно, объем су дебно-медицинской экспертизы и необходимые для этого силы и средства.

На современном этапе такие социальные процессы, как урбанизация и концентрация населения и связанное с этим увеличение площади городов, сопровождаются скоплением на большой территории газо- и нефтепрово дов, электростанций, емкостей со сжиженным газом, мощных производст венных комплексов, содержащих запасы сильнодействующих ядовитых, легковоспламеняющихся горюче-смазочных, взрывчатых веществ, могут приводить к нарастанию силы катастроф и резкому увеличению числа жертв.

Согласно ВОЗ, катастрофы делятся на 4 основные группы: 1) метеоро логические — бури (ураганы, циклоны, смерчи, бураны), морозы, необыч ная жара, засуха и т. п.;

2) теллурические и тектонические — землетрясе ния, извержения вулканов;

3) топологические — наводнения, снежные и горные обвалы, оползни, сели и др.;

4) техносферные — выход из строя технических сооружений (плотин, туннелей, зданий, шахт), пожары, ко раблекрушения, аварии на железнодорожном и другом транспорте, отрав ление воды в системе водоснабжения ядовитыми и сильнодействующими веществами, взрывы и выбросы на атомных электростанциях и токсиче ских веществ на производственных установках и химических предприяти ях.

Для практических целей в нашей стране применяется временная квали фикация чрезвычайных ситуаций, которая строится по типам и видам экс тремальных событий.

Поскольку масштаб бедствия определяет уровень управления ликвида ции последствий чрезвычайной ситуации и привлечения дополнительных сил и средств, катастрофы делятся на: а) местные (объектовые);

б) терри ториальные (район, город, область);

в) региональные (межрегиональные), республиканские, глобальные.

Для организации медицинских мероприятий по ликвидации последст вий бедствия важна квалификация видов очагов массового поражения в мирное время вне зависимости от причин их возникновения.

Виды очагов массового поражения Подвиды очагов массового пораже ния Травматический С преобладанием механической травмы С преобладанием термической травмы С преобладанием поврежде ний огнестрельным и холодным оружием Химический Радиационный Инфекционный (эпидемический) Смешанный Каждый очаг бедствия по своему масштабу, медико-тактическим ха рактеристикам, механизму возникновения поражающего фактора имеет свои особенности, которые определяют потребность в различных силах и средст- КЛАССИФИКАЦИЯ ЧРЕЗВЫЧАЙНЫХ СИТУАЦИЙ ПО СФЕРЕ ВОЗНИКНОВЕНИЯ Авиа- и космические Бури Железнодорожные Морозы А вто до р ож н ы е Засухи На речном и морском флоте Необычная жара Пожары и взрывы Пожары Извержения вул- С выбросом с СДЯВ (хими ческие) канов С выбросом РВ (радиаци Землетрясения онные) Наводнения С выбросом биологических Сели веществ (БОВ) Оползни Снежные обвалы Прорывы плотин Природ- Техноген ные ные ЧРЕЗВЫЧАЙНЫЕ СИТУАЦИИ Экологиче- Социаль ские ные Наличие в почве вредных ве- Эпидемии ществ, Войны превышающих ПДК Голод Интенсивная деградация почв Терроризм (эрозия, Общественные бес засоление, заболачивание) порядки Резкое изменение климата Превышение ПДК вредных примесей в атмосфере Острый кислородный голод в городе Превышение предельно допус тимого уровня шума Разрушение озонового слоя Резкая нехватка воды Исчезновение вида фауны, флоры вах для оказания экстренной и специализированной, в том числе судебно медицинской, помощи пострадавшим.

Эффективность деятельности судебно-медицинских формирований в экст ремальных ситуациях находится в прямой зависимости от степени готовнос ти экстренной службы и своевременности выполнения ею задач, на основе соблюдения следующих принципов:

• компетентность и профессионализм врачей-специалистов в области судебной медицины, их способность высококвалифицированно и своевременно проводить в максимально доступном объеме эксперт ные исследования, исходя из имеющихся сил и возможностей, средств и конкретных условий обстановки;

• приближенность производства всех видов судебно-медицинской экс пертизы к очагу поражения в результате аварии, катастрофы, стихий ного бедствия;

• неотложность мероприятий по организации производства судебно медицинской экспертизы для решения стоящих перед ней задач в максимально короткие сроки с момента возникновения чрезвычай ной ситуации;

• преемственность в работе, предусматривающая соблюдение единого подхода в организации производства экспертизы трупов, идентифика- ции личности погибших, освидетельствования пострадавших, находя щихся на излечении в лечебно-профилактических учреждениях;

• этапность — соблюдение принципов работы судебно-медицинских формирований в соответствии с целями и задачами;

• простота и общедоступность выполнения мероприятий в организаци онном и экспертном плане, максимально приближенных к населе нию;

• надежность — формирование у личного состава судебно-медицинских бригад постоянной готовности, уверенности в правильном и опера тивном проведении мероприятий и экспертных исследований с уче том степени достоверности и информативности используемых мето дов или признаков;

• индивидуальность подхода к проведению судебно-медицинской экс пертизы трупов, опознания личности погибших, судебно-медицин ских освидетельствований.

Основные периоды и исходные задачи судебно-медицинской службы при чрезвычайных ситуациях следующие.

Период П Необходимые задачи одготовител ьный Разработка плана мероприятий в чрезвычайных ситуациях Проверка выполнения утвержденного плана не реже 1 раза в год и при необходимости его корректировка Обучение медперсонала бюро судебно-медицинской экспертизы к работе в обстановке возникшей экстремальной ситуации Чрезвычайная Судебно-медицинская разведка Организация работы в ситуация очаге поражения Формирование организационных струк тур и бригад Организация взаимодействия с другими служ бами Организация производства экспертиз трупов и постра давшим Организация мероприятий по идентификации личности пострадавших и трупов Мероприятия по соблюдению санитарно-противоэпидемиче ских режимов Свертывание деятельности судебно-медицинских формиро После ваний чрезвычайной Анализ и обобщение результатов работы организационных ситуации структур службы Проведение медико-психологической реабилитации и лечеб но-оздоровительных мероприятий личному составу форми рований В связи с тем что при ликвидации медицинских последствий стихийных бедствий значительно возрастает объем работы, для оперативного выполне ния которой привлекаются дополнительные силы и средства и одновремен но изменяется содержание организационно-методической деятельности экспертных учреждений, постоянная готовность к работе может быть до стигнута только заблаговременной отработкой в повседневных условиях всего комплекса мероприятий, план которых должен предусматривать все имеющиеся и требуемые в различной обстановке ресурсы: финансовые, ма териально-технические, кадровые.

Ре- сурсь Материаль Людские Финансо- но вые технические —Специалисты в области судебной — Бюджет- — Медицин медицины, антропологии и ное обеспе- ское имуще криминалистики ство чение — расходное "Средний медицинский персонал — инвентар — Младший медицинский персонал ное —Санитарно —Прочий немедицинский персонал хозяйствен ное имуще ство —Формирования постоянной — готовности других ведомств и служб Специальное —Средства связи В подготовительном периоде большое значение имеет информационное обеспечение, чтобы располагать сведениями о структуре повреждений, воз никновение которых может быть обусловлено не только поражающими факторами аварии, но и другими условиями (состоянием объектов про мышленного и социально-бытового назначения, климатогеографически ми факторами, санитарно-эпидемическими и экологическими режимами и др.).

Необходимо помнить, что наибольшую опасность в плане массовой гибели людей представляют технологические катастрофы и аварии, в ос нове которых лежат взрывы на промышленных предприятиях и транспор те. В то же время при таких крупномасштабных стихийных бедствиях, как наводнения, цунами, тайфуны, наносится материальный ущерб, но мас совой гибели людей обычно не бывает благодаря своевременной, надеж ной системе оповещения населения о надвигающемся бедствии и прове дению профилактических мероприятий. На основе имеющейся информа ции начальник бюро судебной медицины разрабатывает и согласовывает с другими ведомствами план мероприятий судебно-медицинской службы в чрезвычайных условиях и систему раннего оповещения и приведения экс пертных формирований к повышенной готовности к работе в случаях уг розы бедствия.

Информационное обеспечение включает: 1) оценку степени риска катас трофы с учетом местных и региональных условий (наличие химических производств, подземных взрывоопасных трубопроводов, электростанций, транспортных узлов, а также геологических опасностей);

2) прогнозирова ние структуры повреждений, травм, ранений и осложнений в зависимости от вида и масштаба катастрофы;

3) коммуникационную связь района бедст вия с другими регионами.

Основу плана составляют решения начальника бюро судебно-медицин ской экспертизы о создании необходимых организационных структур и формирований и о проведении важнейших мероприятий по обучению лич ного состава работе в районе бедствия. В своем решении он также указыва ет силы и средства для решения возникающих задач, мероприятия и поря док их выполнения при ликвидации последствий аварий, организацию связи и взаимодействие с другими ведомственными службами. Указанный план после разработки утверждается в органах здравоохранения. Его кор- ректировка должна производиться не реже 1 раза в год, а также в тех случа ях, когда изменились условия и исходные данные, положенные в основу разработки плана. Проверка и корректировка плана также должны осу ществляться по итогам штабных тренировок или же по результатам участия судебно-медицинских экспертов в работе по ликвидации последствий ката строф.

Предварительное планирование состоит из двух этапов: 1) определение материально-технического обеспечения и инвентаризация имеющихся и требуемых ресурсов;

2) технологические аспекты и предполагаемая разра ботка программы работы экспертных формирований непосредственно в об становке чрезвычайной ситуации.

Исходными данными для планирования материально-технического и медицинского снабжения являются характеристика кадрового состава бю ро судебно-медицинской экспертизы, укомплектованность штатного рас писания и возможность медицинского персонала работать в экстре мальной обстановке на базе бюро или приспособленном помещении либо в полевых условиях с использованием в этом случае многоместных пала ток или пневмокаркасных модулей, имеющихся в распоряжении регио нальных центров службы экстренной медицинской помощи. Особое вни мание следует уделить комплектации чемоданов-укладок с необходимым набором средств, рассчитанных на исследование определенного количест ва трупов.

Решая вопросы бюджетного обеспечения, необходимо заблаговременно предусмотреть дополнительные расходы, отражающие действительные по требности. При этом исходят из структуры санитарных потерь и процента планируемых показателей смертности, характерных для данной катастро фы, из вида экспертиз и стоимости каждого метода исследования, целе сообразность и рациональность применения которого должна быть обо снована, из затрат, связанных с возможным проведением лабораторных исследований в других учреждениях. Эти данные могут использоваться в качестве основы для запросов об оказании помощи или компенсации рас ходов.

Людские резервы формируются из специалистов в области судебной ме дицины, антропологии, криминалистики и технического персонала, недо статок которого может быть восполнен студентами, военнослужащими и добровольцами. Количественный и качественный состав судебно-медицин ских формирований должен определяться показателями числа погибших и видом катастроф, сложившейся обстановкой. Важна способность медицин ского персонала к работе в чрезвычайных ситуациях, поскольку под дейст вием стресса в сочетании с физиологическим и физическим перенапряже нием, связанного с одновременным выполнением нескольких видов дея тельности, быстрым и точным восприятием информации, дефицитом вре мени, для выполнения большого объема работы в экстремальной обстанов ке у членов бригады могут развиться психические и психосоматические ре акции.

В подготовительном периоде в каждом бюро судебно-медицинской экс пертизы также должны быть созданы бригады быстрого реагирования из 4—5 врачей — судебно-медицинских экспертов, постоянно готовых к рабо те и оснащенных необходимым имуществом. Эти бригады в функциональ ном отношении являются мобильными формированиями и предназначены для выезда в районы бедствия не только обслуживаемой территории, но и другого региона.

При формировании персонального состава бригад постоянной готовнос- ти следует учитывать некоторые специфические особенности стихийных бедствий и поведение человека в экстремальных условиях. Так, при круп ных авариях поражения и санитарные потери могут быть не только среди населения, но и личного состава экспертных формирований, в частности, в результате неоправданного участия их в действиях по ликвидации послед ствий («героическая фаза»). Поскольку в зоне бедствия может возникать несколько очагов поражения, следует предусмотреть возможность создания необходимого количества подвижных экспертных бригад быстрого реаги рования, способных работать в автономном режиме. При этом нужно по мнить, что врачи, включенные в состав бригад постоянной готовности, должны быть хорошо ориентированы в вопросах организации и проведения сортировки, исследования трупов, выполнения экспертизы идентификаци онных признаков, знать общие меры предосторожности при химических и радиационных поражениях, соответствующие степени загрязнения окру жающей среды.

Персональный список специалистов, входящих в бригады постоянной готовности, составляет начальник бюро судебно-медицинской экспертизы по соответствующей форме и направляет его в территориальный центр экс тренной медицинской помощи по чрезвычайным ситуациям.

ОСНОВНЫЕ ФОРМИРОВАНИЯ СУДЕБНО МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ ПРИ ЧРЕЗВЫЧАЙНЫХ СИТУАЦИЯХ ШТАБ г~ ] Группа организации технологи Группа организации ческого процесса управления экспертизы трупов, живых лиц с сектором технического обслужи вания |_ _J Оперативно Группа быстрого реагирования информационный центр Экспертно-следственные брига Справочная служба ды Эксперт-стоматолог Сектор материаль но-технического Эксперты судебно снабжения медицинской лаборатории Транспортный отдел Бригады скорой медицин ской и психотерапевтиче Служба питания ской помощи Группа охраны общест Сектор связи венного порядка Группа коммунально- бытового В составе формирований судебно-медицинской службы необходимо выде лить: 1) группу по организации управления и обработки оперативных дан ных;

2) группу по организации судебно-медицинской экспертизы трупов и живых пострадавших с сектором технического обслуживания.

Общее руководство группами осуществляет во главе с начальником бюро (ведущий эксперт) штаб, при котором создается оперативно-инфор мационный центр. Начальник штаба (ведущий судебно-медицинский экс перт) обеспечивает общее руководство деятельностью судебно-медицин ских формирований и оперативно-информационного центра. Он выполняет распорядительные функции, используя принципы единоначалия. Для чет кого и оперативного взаимодействия с другими службами штаб располагает списком телефонов ответственных лиц, а также планом мероприятий и опо вещения на случай обнаружения при исследовании трупов острых ка рантинных заболеваний или подозрения на них.

Штаб обеспечивает регистрацию трупов, учет и контроль за ведением и оформлением судебно-медицинской документации, постоянную связь с другими подразделениями службы и группами и учет личного состава су дебно-медицинских формирований, анализ деятельности экспертизы с обобщением и предоставлением результатов руководству. Штаб организу ет сменность в работе судебно-медицинских формирований и контроли рует ее продолжительность. Необходимо установить такое количество смен и бригад с учетом имеющихся сил, чтобы обеспечить соблюдение ус ловий для производительной работы и достаточного отдыха персонала, так как физическое перенапряжение при высокой интенсивности труда, нервно-психические нагрузки, нарушение режима труда и отдыха неиз бежно приводят к ухудшению самочувствия, развитию усталости, возник новению нервно-психических расстройств, обострению соматических за болеваний и как следствие к снижению работоспособности. К ведущим факторам риска ухудшения состояния здоровья и снижения работоспо собности личного состава следует отнести неполноценное питание. Поэ тому органы управления организуют контроль по обеспечению сотрудни ков формирований полноценным питанием, адекватным имеющимся на грузкам.

Для нормального функционирования указанный центр укомплектовы вается 4 врачами — судебно-медицинскими экспертами, 4 лаборантами и 1—2 водителями с легковыми автомобилями.

При работе службы в экстремальных условиях с массовой гибелью людей должны создаваться надлежащие организационные структуры, кото рыми являются приемно-сортировочное отделение, отделения по исследо ванию и идентификации трупов, опознания личности погибших, выдачи трупов для погребения.

Среди комплекса мероприятий, проводимых в подготовительном пе риоде, важное место должно занимать обучение медицинского персонала бюро судебно-медицинской экспертизы выполнению своих функциональ ных обязанностей в экстремальной обстановке. Обучение может прово диться в различных формах (учения, тренировки, практические занятия, групповые упражнения, лекции, семинары), организуемых гражданской обороной, службой медицины катастроф территориальных органов здраво охранения. Программа занятий должна включать изучение системного под хода к принципам судебно-медицинского обеспечения в чрезвычайных си туациях с использованием алгоритмизации экспертного мышления, игро вого моделирования и профессиональной деятельности специалистов при катастрофах.

Таким образом, основными направлениями в подготовительном перио де являются совершенствование управления, создание территориальных бригад быстрого реагирования и других судебно-медицинских формиро ваний, обучение персонала.

В чрезвычайной ситуации деятельность судебно-медицинской службы осуществляется в двух направлениях: проведение разведки на месте про исшествия и организация непосредственного технологического процесса экспертизы трупов и живых пострадавших.

В ближайший период после аварии в очаг бедствия выезжает началь ник бюро судебно-медицинской экспертизы вместе с бригадой быстрого реагирования. По прибытии на место незамедлительно организуются сбор информации и предварительный анализ медико-тактической обстановки аварии. При оценке возможных безвозвратных санитарных потерь учиты ваются такие влияющие на их рост факторы, как длительность пребывания пострадавших в фазе изоляции и время начала оказания им первой меди цинской помощи после происшествия. Данные литературы свидетельст вуют, что угроза увеличения летальных исходов зависит от времени про ведения лечебных мероприятий. Оптимальными сроками оказания первой медицинской помощи являются первые 4—6 ч с момента аварии. Отсутст вие помощи после травмы само по себе увеличивает показатель смертно сти: в течение 1-го часа среди тяжелораненых на 30 %, до 3 ч — на 60 % и до 6 ч — на 90 %, т.е. количество погибших возрастает в 2 раза [Мешков В.В., 1990]. По расчетам В.В.Фролова и В.В.Шаховца (1990), выполнен ным для групп пострадавших с механическими травмами, не получивших медицинской помощи в ближайшие часы после поражения, до 87 % смер тельных исходов приходится на 1-е сутки.

С учетом предварительных сведений о числе погибших начальник бю ро определяет силы и средства, необходимые для выполнения объема экс пертных исследований, и место работы. Информация об этом передается в органы и штаб судебно-медицинской экспертизы, которому даются указа ния о развертывании мероприятий согласно скорректированному для кон кретной ситуации плану.

В связи с тем что в условиях крупномасштабных катастроф и аварий в ближайшие часы после случившегося проводятся аварийно-спасательные работы, судебно-медицинская разведка бывает отсрочена и осуществляет ся в уже измененной обстановке. Поэтому не могут быть проведены соот ветствующие мероприятия по организации осмотров трупов на месте про исшествия при массовой гибели людей и выполнены действия, предусмот ренные «Правилами работы врача-специалиста в области судебной меди цины при наружном осмотре трупа на месте его обнаружения (происшест вия)». И в этих случаях первоначальная деятельность судебно медицинской бригады быстрого реагирования может быть сведена к ос мотру места происшествия с целью розыска останков погибших.

Управление службой начинается с работы оперативно информационного центра, который участвует в мероприятиях по налажи ванию связей, обеспечению бригад необходимыми бланками судебно медицинской документации и канцелярскими принадлежностями, по ор ганизации смены, определению продолжительности их работы и обеспе чению полноценным питанием.

Одним из важных моментов в судебно-медицинском обеспечении в сложившейся обстановке является организация места работы. Наиболее эффективно она осуществляется на базе бюро судебно-медицинской экс пертизы, где можно легко перепрофилировать имеющиеся и временно со- здать новые организационные структуры, а судебно-медицинская лабора тория приближена непосредственно к отделу по исследованию и идентифи кации трупов. При невозможности использования базы экспертного учреж дения для этих целей может служить специально выделенный морг патоло гоанатом ическо го отделения либо другое временно приспособленное поме щение или строение. Отсутствие холодильной камеры для хранения трупов или ее малая емкость могут быть компенсированы морским, железнодо рожным и автомобильным рефрижераторами. При разрушении зданий ме дицинских учреждений и других производственных строений деятельность судебно-медицинской службы развертывается в полевых условиях. В этих случаях выбор места работы производится так, чтобы к нему был хороший подъезд и обеспечивалось быстрое размещение всех экспертных подразде лений.

Четкая организация и высокая эффективность работы судебно-меди цинских формирований при ликвидации последствий стихийных бедствий, технологических катастроф и аварий с массовой гибелью людей достигает ся путем соблюдения последовательности технологического процесса на эта пах приема трупов, производства их экспертизы и выдачи тел для захороне ния.

Прием трупов осуществляется в приемно-сортировочном отделении, где их маркируют и фотографируют. В тех случаях, когда в отделение по ступают трупы и их останки с различной степенью разрушения, их сорти руют по 4 группам. В 1-ю группу включают трупы, у которых сохранились все основные части тела (голова, туловище, конечности) независимо от характера и степени выраженности телесных повреждений. При отсутст вии одной из частей тела (головы, верхних или нижних конечностей на различных уровнях) погибших относят ко 2-й группе. Отдельные части тела, которые дифференцируются только по сохранности их общей анато мической структуры (голова, части торса, конечности, внутренние орга- ны), составляют 3-ю группу. К последней, 4-и, группе относятся струк турно не связанные в единое целое фрагменты кожи, мышц, костей, внут ренних органов. В этих случаях целесообразна организация обслуживания двух потоков погибших — с 1-й группой сортировки и останков тел 2— 4 й групп.

Pages:     | 1 |   ...   | 10 | 11 || 13 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.