WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

«Научный совет Российской академии наук по хроматографии Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год Книга представляет собой практическое руководство по капиллярному электрофорезу - ...»

-- [ Страница 2 ] --

8.1. Непрямое Уф-детектирование анионов Из теории следует, что для детектирования анионов, непоглощающих в УФ-области, необходимо найти такую буферную систему, которая сама хорошо поглощает в этой области. При этом подвижность ионов буфера должна быть близка к подвижности анализируемых веществ. В качестве детектора анионов с большой и средней подвижно стью подходят хромат-ионы, вводимые в раствор серной кислоты с концентрациями от до 10 мМ. Для анализа быстрых и медленных анионов в одном потоке необходимо остановить или, что лучше, обратить направление потока и поменять полярность источника напряжения. В кварцевых капиллярах и приборах КЭ с нормальной полярнос тью (катод на выходе), как показано на рис. 41, в направлении детектора (к выходу) движутся только медленные анионы, в то время как быстрые анионы сразу после ввода пробы выходят из зоны разделения в направлении анодного сосуда с буфером.

Рис. 41. Направления движения анионов при разделении методом КЭ.

Заполненные стрелки здектрофоретические подвижности, незаполненные - абсолютные подвижности и ЭОП. Случай А способ с нормальной полярностью (нормальный способ), ЭОП направлен к катоду, выход заземлен. Случай В - способ с переключенной полярностью, ЭОП направлен к катоду, вход заземлен. Случай С - с переключенной полярностью и с анодным потоком, ЭОП направлен к аноду, вход заземлен.

Ситуация, обозначенная как случай А на рис. 41, приводит к распределению подвижностей, при котором детектируются только медленные анионы. На рис. 42 а представлено такое распределение подвижностей для некоторых часто встречающихся анионов. При этом абсолютные подвижности недетектируемых анионов рассчитываются по подвижности ЭОП и электрофоретической подвижности анионов (см. рис. 43).

Быстрые анионы удается детектировать только при переключении полярности источника напряжения (случай В). В этом случае они движутся "вверх по течению" против направления ЭОП. Однако медленные анионы выводятся из капилляра быстрым ЭОП. Это явление представлено на рис. 42 а, а также е виде исходных данных - на рис.

43. В этом случае разделение тестовой смеси, включая фториды, длилось примерно минут, а фосфат-ионы детектировались спустя почти 20 минут в виде очень слабого пика. Применяя аппаратуру КЭ и буфер, обращающий ЭОП и направляющий его тем самым к аноду, удается разделять быстрые и медленные анионы в одном потоке (случай С).

Рис. 42 а. Абсолютные подвижности при разделении анионов методом КЭ.

Случай А - нормальный способ, ЭОП направлен к катоду, выход заземлен. Случай В - способ с переключенной полярностью, ЭОП направлен к катоду, вход заземлен.

Условия: прибор КЭ Millipore Quanta 4000;

капилляр 75 мкм, 50/56 см. Поле в случае А 600 В/см, в случае В - 600 В/см;

буфер: 5 мМ хромат/серная кислота, рН 6.8;

ввод пробы гидростатический 4 см, 2 с;

детектирование: 214 нм. Пробы- каждая по 10 мг/л : бромид - 1, хлорид - 2, сульфат - 3, нитрит - 4, нитрат - 5, азид - 6, фторид - 7, фосфат - 8, карбонат - 9, ацетат - 10, пропионат - 11, бутират - 12, валериат- 13, Д-глюконат - 14, ЭОП- Рис. 42 б. Абсолютные подвижности при разделении анионов методом КЭ. Сйутая С - способ с переключенной полярностью, ЭОП направлен к аноду, вход заземлен.

Условия: буфер - 5 мМ хромат/серная кислота, 0.5 мМ ЦТАБ, рН 6.8;

остальные условия те же, что на рис. 42 а.

В ЭОП, направленном к аноду, анализ тестовых смесей вплоть до детектирования фторидов длится до 2 минут, анализ смесей, включающих глюконаты, обладающие малой подвижностью, длится менее 3 минут. Нейтральные вещества достигают детектора через 5.5 минут.

Обращение потока, необходимое для разделения, в этом случае достигается введением ЦТАБ. Этот катионный ПАВ положительно заряженными концами молекул адсорбируется на отрицательно заряженных силанольных группах стенки капилляра и при очень низких концентрациях (меньше 0.1 мМ) образует слой, компенсирующий за ряд поверхностных силанольных групп.

С помощью такой обработки капилляра электроосмотический поток прекращается.

При концентрациях ЦТАБ больше 0.2 мМ на стенках капилляра образуется двойной электрический слой. Вследствие гидрофобных взаимодействий на первый слой ЦТАБ накладывается второй электрический слой, молекулы которого направлены положи тельными зарядами внутрь капилляра.

Рис.43. Разделение смеси анионов в случае В. Условия: мкм, 42/50 см;

поде:

- 600 В/см, детектирование: непрямое, 10 см, 30 с;

буфер: 5 мМ хромат/серная кислота, рН 6.8;

пробы: анионный стандарт, детектируются анионы с 1 до 7 (сравн. рис.42) В данном случае ЭОП обусловлен положительными зарядами на стенках капилляра и направлен не к катоду, а к аноду. Зависимость ЭОП от значения рН и концентрации ЦТАБ показана на рис. 45. При этом следует работать с концентрациями ЦТАБ от 0.5 до 1 мМ, т.к. при более низких концентрациях требуется большее время установления равновесного потока, а также наблюдается нерегулярность подвижности ЭОП.

Наряду с ЦТАБ можно также использовать такие соединения, как соли додецилтриметиламмония и тетрадецилтриметиламмония или гексадецилпиридинхлорид. В частности, додецилтриметиламмоний-хлорид обладает двумя преимуществами по сравнению со ЦТАБ: 1 -концентрация его мицеллообразования выше, чем у ЦТАБ, 2 - растворимость его в воде больше, так что можно использовать концентрированные исходные растворы.

Подготовленный к использованию буфер с ЦТАБ и хроматом недостаточно стабилен, поэтому его следует ежедневно менять на свежий. Через несколько часов стояния появляется мелкокристаллический осадок, проявляемый на фореграммах как пик, который делает невозможным обработку результатов. Поэтому ежедневно необ ходимо применять свежий буфер, при этом работа с исходными растворами требует много времени. При использовании хромат-раствора с концентрацией хромата 50 мМ с 0.2 мМ серной кислоты и раствора ЦТАБ с такой же концентрацией, перед употреблением необходимо отмерить об. 10 % хромат-раствора в измерительную колбу, долить водой примерно до 2/3 объема колбы, добавить об. 1 % исходного раствора ЦТАБ и затем долить водой до метки измерительной колбы. Только при точном соблюдении такой последовательности при смешивании не образуется упомянутый осадок. Исходные растворы можно использовать в течение несколько месяцев. Концентрацию 50 мМ для раствора ЦТАБ можно получить только при температурах около 25°С, а при 18°С раствор теряет прозрачность.

Рис. 44. Разделение тестовых смесей анионов в случае С. Условия:

прибор КЭ: Waters Quanta 4000. Капилляр 75 мкм, 50/ см;

запись данных: 20 Гц.

Поле:

-517 В/см, непрямое детектирование 254 нм, ввод пробы гидростатический, см, 30 с;

буфер: 5 мМ хромат/серная кислота, рН 8.0 с 0.5 мМ ЦТАБ: проба:

анионный стандарт с Юррт, см. рис. 42.

Рис. 45. Зависимость электроосмотических потоков от значения рН при различных концентрациях ЦТАБ. Условия: прибор КЭ - Beck-man, Р/АСЕ 2000;

капилляр 75 мкм, 40/47 см.

Поле:-532 В/см, детектирование: 214 им, ввод пробы давлением 3 с, буфер - 10 мМ фосфат;

нейтральный маркер: бензиловый спирт.

Из-за очень высокой эффективности (300 - 500 тыс. тарелок на метр) и коротких времен анализа не исключены проблемы записи данных. Для ширины пиков меньше нескольких секунд достигается граница возможности записи данных для большинства приборов КЭ. Например, достичь необходимых для хорошего интегрирования 20 точек для каждого пика с частотой записи данных 20 Гц в этих условиях уже не удается.

Если вместо обращения потока проводить только его остановку, разделение анионов можно провести за 10-15 минут. Эта возможность часто рекламируется, однако для разделения анионов эта методика никаких преимуществ не дает.

Вещества, останавливающие, но не обращающие поток, представлены в таблице вместе с уже упоминаемыми буферными добавками. Эти вещества, хотя и нейтрализуют отрицательный поверхностный заряд капилляра, однако двойной электрический слой не образуют и, тем самым, обеспечить избыточный положительный заряд на поверхности капилляра не могут.

Таблица 17.

Возможности влияния на ЭОП.

Буферные добавки Используемые Влияние Проблемы концентрации, мМ ЦТАБ 0.2-1.0 Обращение ЭОП Мицеллообразование, растворимость до 50 мМ ДДТАБ 0.2-2.0 Обращение ЭОП Мицеллообразование ГДПХ 0.2-1.5 Обращение ЭОП Мицеллообразование, поглощение в УФ-области SB 14 1 -10 Очень малый ЭОП Спермин 2-10 Очень малый ЭОП Образование ионных пар Диэтилентриамин 1 -5 Очень малый ЭОП Полиэтилен-амин 0.5-2.0 Обращение ЭОП Покрытие SAX - Обращение ЭОП Низкая стабильность ЦТАБ - цетилтриметиламмонийбромид ДДТАБ - додецилтриметиламмонийбромид ГДПХ - гексадецилпиридинхлорид SB 14 - тетрадодецилдиметиламмонийпропансульфокислота.

SAX - сильный анионообменник Наряду с регулированием ЭОП в разделении анионов большую роль играет также подвижность анионов буфера. Ниже приведены характеристики ряда анионов, поглощающих в УФ-области (таблица 18).

Таблица 18.

Буферные вещества для непрямого УФ-детекгирования анионов.

Буферный ион Подвижность Область рН УФ-область (нм) Проблемы (см2/кВ.с) Хромат -0.8 6- 10 <220 и 250 -280 Токсичен Молибдат -0.7 <290 Изополикислоты, начиная от рН Сорбиновая 0.24 >3 225 - кислота N-ацетил- 0.23 >4.5 < триптофан Триптофан 0.23 >8.5 < 3-индолацетат 0.20 >5 214- Динитробензой 0.22 >2 < ная кислота Тринитробензо 0.20 >2 220 -275 Получается только как -сульфоновая раствор кислота Дили кол и 0.23 >5 <220 и 245-265 Комплексообразование новая кислота с кальцием Нафтол-1- 0.16 >2 200 - 225 Низкая растворимость в сульфоновая воде кислота Галловая кис- 0.26 >3 <230 Нестабильна лота (окисляется) (Подвижности определены при рН 9.0 в фосфатном буфере с концентрацией 10 мМ.) Хроматные буферные системы применяли, в частности, при определении анионов в воде озера Байкал. Разделение их представлено на рис. 46. При этом ионы с большей подвижностью - хлориды, сульфаты и карбонаты - определяются количественно методом стандартной добавки, в то время как содержание нитратов и фосфатов вследствие низких концентраций определяются путем сравнения с внешним стандартом.

Результаты сравнения для сульфат-ионов показаны на рис. 47. Данные аналогичных измерений с помощью ИОХ хорошо коррелируют с результатами, полученными методом КЭ.

Рис. 46. Определение анионов в воде, взятой с поверхности озера Байкал. Условия: прибор КЭ - Waters Quanta 4000. Запись данных: 20 Гц, капилляр 75 мкм, 50/58 см;

попе:

431 В/см, непрямое детектирование 254 нм, ввод пробы гидростатический, 10 см, с;

буфер: 5 мМ хромат/серная кислота, рН 8.0, 0.5мМ ЦТАБ;

порядок выхода пиков: хлорид - (0.5 ppm), сульфат - 2 (12.4 ppm), нитрат - 3 (<0.5 ppm), фосфат – (<0.5ppm), гидрогексакарбонат - (81.1 ppm).

Преимущества КЭ по сравнению с ИОХ заключаются в крайне коротких временах анализа и в возможности определять в одном потоке наряду с другими важными анионами также и карбонаты.

8.2. Непрямое Уф-детектирование катионов Методом непрямого УФ-детектирования можно обнаружить также и катионы.

Впервые разделение катионов этим методом описано Ф.Форетгом в 1990 году. В его статье было показано, что метод КЭ при разделении лантанидов по эффективности, времени анализа и разрешению пиков превосходит ИОХ. С помощью КЭ удается разде лить все лантаниды, что невозможно сделать даже при оптимизации ионно хроматографических систем.

Рис. 47. Сравнение по методу стандартной добавки для определения анионов в воде озера Байкал. Условия те же, что и описанные на рис. 46;

к 4000 мкл пробы были добавлены с помощью пипетки два раза по 40 мкл стандартного растворами один раз - 80 мкл стандарта с 1000 ppm сульфата. Подученные пики отложены в зависимости от концентрации.

Теоретические выкладки показывают, что ЭОП и движение катионов в капиллярах из плавленного кварца имеют одинаковое направление, поэтому аппаратура КЭ для разделения катионов должна быть такой полярности, чтобы выход был заземлен.

Таким образом, перенос ионов в ЭОП при КЭ налагается на движение катионов. Это дает возможность осуществить их быстрое разделение. В качестве буферной системы в этом случае хорошо подходит имидазол с концентрацией 5 мМ и значением рН ниже 6.0. Как показано на рис. 48, разделение заканчивается меньше, чем за 4 минуты.

Примерно через 5.5 минут на электрофореграммах появляется большой пик, вызванный ЭОП. Он объясняется введенной водой, которая обладает меньшим УФ-поглощением, чем буферная система, и тем самым вызывает каждый раз отрицательный пик, с помощью которого можно определить ЭОП.

Рис. 48. Разделение щелочных и щелочно-земельных ионов в буферной системе имидазола. Условия: прибор КЭ - Waters Quanta 4000;

капилляр мкм, 50/56 см. Поле: 446 В/см, буфер - 5 мМ имидазол/серная кислота, рН 4.0;

ввод пробы гидростатический, 30 с, непрямое детектирование 214 нм;

проба - катионный стандарт с 1 мг/л каждого: калия, натрия, магния, бария, кальция и 0.5 мг/л лития.

Из формы пиков ясно видно, что подвижность имидазола близка к подвижности кальция.

На форму пика оказывает большое влияние концентрация буфера: с ростом концентрации пики становятся более симметричными. Например, интенсивность пика калия при повышении концентрации буфера от 0.5 до 12 мМ возрастает в 4 раза.

Однако такой способ оптимизации имеет определенные четкие границы, т.к. при концентрации буфера больше 8 мМ резко возрастают шумовые помехи сигналов. Этот рост связан с градиентами плотности, возникающими из-за разности температур вследствие выделения джоулева тепла в электрическом поле. В капилляре с внутренним диаметром 100 мкм, применяемом в этих опытах, можно использовать имидазольный буфер с концентрациями вплоть до 5 мМ. В обычно используемых капиллярах с внутренним диаметром 75 мкм можно работать с концентрациями до мМ при величинах рН от 4 до 6. В капиллярах с внутренним диаметром 50 мкм можно достичь концентрации буфера до 50 мМ.

Рис. 49. Разделение тестовых ионов, оптимизированное во времени, в имидазодьной буферной системе. Условия: прибор КЭ Millipore Waters Quanta 4000, капилляр 75 мкм, 20/26 см. Поле:

1300 В/см;

буфер: 2 мМ имидазол/серная кислота, рН 6.0;

ввод пробы гидростатический 10с, непрямое детектирование им. Проба- катионный стандарт с I мг/л каждого:

калия, натрия, бария, кальция, магнияи0.5мг/л лития.

Используя низкоконцентрированный буфер (2 мМ) и значение рН 6.0, при большом напряжении электрического поля можно вызвать большой ЭОП и легко сократить время анализа.

На коротком участке разделения анализы проводятся очень быстро. Как показано на рис. 49, в поле 1300 В/см (30 кВт) тестовые ионы разделяются менее, чем за 30 с, при этом проявление пиков, несмотря на высокую напряженность поля, очень хорошее. При таком разделении можно, к примеру, для пика кальция достичь 600 тыс. тарелок на метр или, нормируя на время, - 320 тыс. тарелок в минуту. Сильным полем ионы ускоряются до скорости движения 0.96 см/с без существенного изменения профиля потока и проявления пиков.

Среди факторов, влияющих на детектирование, решающую роль играет прежде всего селективность разделяющих систем.

Используя взаимодействие ионов с комплексообразователем, можно влиять на подвижность. В то время как добавка оксалат-ионов к буферу не оказывает никакого влияния, цитрат-ионы резко понижают подвижность ионов щелочно-земельных металлов. Например, 100 мкМ цитрата достаточно для элюирования кальция и магния после лития.

Рис.50. Влияние цитрата на разделение щелочных и щелочно земельных ионов. Условия: прибор КЭ - Millipore Waters Quanta 4000;

капилляр: 75 мкм, 50/57 см;

поле:

438 В/см. Буфер - 5 мМ имидазол/серная кислота, рН 4.6, динатрийцитрат в качестве добавки;

ввод пробы давлением с, непрямое детектирование нм;

проба - катионный стандарт с 1 мМ каждого: калия, натрия, бария, кальция, магния и лития.

Еще меньшие концентрации буферных добавок достаточны при использовании Titriplex 3 (динатриевой соли ЭДТА). Менее 20 мкМ этой соли ЭДТА в буфере достаточны для того, чтобы комплексообразование со щелочно-земельными ионами происходило настолько сильно, что их невозможно детектировать. При этом подвижности однозарядных ионов даже при концентрациях ЭДТА 200 мМ практически не изменяются. ЭДТА оказался наиболее эффективным реагентом для маскировки щелочно-земельных ионов.

Как можно показать с помощью теоретических выкладок, использование ионов буфера с большими молярными коэффициентами экстинкции приводит к более чувствительному детектированию. Молярный коэффициент экстинкции в УФ-спектре имидазола в максимуме при 205 нм составляет 5000. Имидазольный буфер можно использовать в области от 190 до 220 нм для непрямого детектирования, т.е. область применения ограничена нижней УФ-областью. Вследствие того, что многие вещества также поглощают в УФ-области, при детектировании могут возникать помехи.

Расширение области непрямого детектирования в сторону более высоких длин волн и/или в область более щелочных значений рН достигается 4-аминопиридином (4-АП). В максимуме поглощения при 205 нм 4-АП обладает молярным коэффициентом экстинкции 15500, при 245 нм - около 15600. При 254 нм существует еще один пик с экстинкцией около 14000. Это примерно в три раза больше, чем молярный коэффициент экстинкции имидазола при 214 нм. Подвижность 4-АП примерно такая же, что и у имидазола. Преимущество 4-АП проявляется в том, что ом применим в более широкой области длин волн - даже при 270 нм можно проводить непрямое детектирование. Кроме того, буфер 4-АП можно использовать до значений рН 10.1 без уменьшения чувствительности буферной системы вследствие исчезновения заряда 4 АП.

В таблице 19 приведены другие буферные системы, применяемые для разделения катионов с непрямым детектированием. По подвижностям ионов пробы можно выбрать подходящий разделяющий буфер. Значения pKs берутся из литературы или определяются титрованием. Соответствующие УФ-спектры важнейших буферных компонентов представлены на рис. 51.

Воспроизводимость разделения в ионной аналитике при применении буферных систем очень хорошая. ОСО времен миграции лежат ниже 0.5%, воспроизводимость площади пика - важнейшая величина для количественных анализов - лучше 2.3%.

Наряду с точностью для количественных расчетов важной величиной является их достоверность, которая подтверждается данными других методов. В качестве альтернативных методов измерения выступают атомно-абсорбционный анализ, ИОХ, а также ионный анализ с ионно-селективными электродами. Как показывают некоторые примеры, результаты, полученные различными методами анализа, в пределах известных допустимых отклонений совпадают. Определение щелочных и щелочно земельных катионов в байкальской воде показано на рис. 52.

Для подтверждения полученных результатов эти же пробы воды изучали методами ИОХ, а также атомно-абсорбциомной спектроскопии (ААС).

При этом в методе ИОХ анализ пробы проводили по циклической схеме с применением синтетического ионита с детектором по электропроводности, а анализы методом ААС - по стандартному методу Шинкеля. Между найденными концентрациями ионов наблюдалось хорошее согласие.

Таблица 19.

Важнейшие параметры катионных буферных веществ.

Вещество Формула Подвижность Значение рKs Спектральная (см2/кВ-с) область использо вания (нм) Гистамин 0.53 6.5;

10.5 <220 нм 4-амино-пиридин 0.48 8.9 <220 нм и 240-270 нм Имидазол 0.46 6.9 <220 нм 9-амино-акридин 0.42 9.2 250-265 нм Креатинин 0.37 5.3 240-270 нм 2-амино-4,6- 0.32 8.1 265-280 нм диметилпиридин Эфедрин 0.31 9.9 < 4-амино-М,М- 0.27 8.1 <215 нм диэтиланилин 2-амино- 0.20 7.5 270-310 нм бензимидазол 1-амино- 0.17 3.9 <230 нм, нафталин =300нм Рис. 51. УФ-спектры буферных веществ, которые можно применять для непрямого детектирования катионов. УФ спектры веществ, протонированша уксусной кислотой, получены на детекторе Perkia Elmer LC Diodea Array.

Рис. 52. Разделение катионов в воде, взятой с поверхности озера Байкал. Условия: прибор КЭ:

Millipore Waters Quanta 4000;

капилляр: 75 мкм, 54/60 см;

поле:

446 В/см;

буфер - 5 мМ имидазол/серная кислота, рН 4.5;

ввод пробы гидростатический, с. Непрямое детектирование, им. Проба -байкальская вода: I - калий, 2 - натрий, 3 кальции, 4 - магний. Количественные результаты приведены в таблице 20.

В качестве другой пробы, для которой имелись в наличии контрольные данные, полученные другими аналитическими методами, изучали воду из лесного родника. Для минеральной воды лесного источника результаты анализов, полученные всеми тремя методами, приведены в таблице 20. Дополнительно здесь же приведены концентрации ионов, имеющиеся на этикетке бутылок с этой водой.

Таблица 20.

Количественные результаты КЭ по сравнению с данными ИОХи ААС (все концентрации приведены в ррm).

Проба Метод Калий Натрий Кальций Магний Байкальская ВЭЖХ 0.5 5.3 15.9 3. вода КЗЭ 0.6 3.1 14.5 2. ААС 1.1 3.4 14.6 3. Лесной ВЭЖХ 1.2 3.2 4.7 0. родник КЗЭ 1.6 3.2 4.1 1. ААС 2.6 3.4 4.5 0. БЭ 2.0 3.6 3.8 0. Яблочный ВЭЖХ 925 69 92 уксус КЗЭ 1125 74 114 БЭ - данные, приведенные на бутылочной этикетке Более проблематичен анализ катионов в крови. Размеры красных кровяных шариков составляют 7:5х2 мкм и граничат с размерами частиц, которые можно вводить в КЭ без проблем. После разжижения свежей крови в 100 раз эта проба уже не в состоянии коагулировать. Красные и белые кровяные тельца крови не допускают прямого ввода пробы в методе ВЭЖХ. Содержание белков в этих разжиженных растворах всегда выше 0.7 г/л, так что белки составляют существенную часть пробы. Несмотря на это, разделение катионов методом КЭ вследствие их очень высокой подвижности по сравнению с компонентами пробы не представляет большой проблемы.

Вследствие высокой чувствительности, детектирование ионов удается провести даже в таком разжиженном растворе. Значения концентраций, определенные по сравнительному методу с внешней сравнительной кривой, соответствуют литературным данным. Для калия найдено значение 6.8 мг-экв/л (литературное значение 5 мг-экв/л), для натрия - 147 мг-экв/л (литературное значение 150 мг-экв/л), для кальция - 3.4 мг-экв/л (литературное значение 2 мг-экв/л) и для магния - 5.4 мг-экв/л (литературное значение 3 мг-экв/л).

Белки в растворе все же нарушают воспроизводимость разделения. На рис. показаны времена миграции и площади пиков кальция для первых восьми вводов пробы.

В результате адсорбции белков, которые при каждом вводе пробы достигают капилляра, силанольные группы на стенках капилляра, ответственные за ЭОП, все более и более блокируются. По этой причине ЭОП замедляется, и ионы движутся к детектору медленнее. Уменьшение скорости движения напрямую отражается на площади пиков. С увеличением времени миграции ионы медленнее проходят через де тектор, из-за чего площадь пиков растет. Этим объясняется ход кривых зависимости площади пика от времени миграции, приведенных на рис.54.

Рис. 53. Разделение разжиженной пробы крови.

Условия: прибор КЭ - Milllpore Waters Quanta 4000;

капилляр: мкм, 50/57 см;

поле: 446 В/см, буфер: 5 мМ имидазол/сериая кислота;

ввод пробы гидростатический, 30с, непрямое детектирование им;

проба: суспензия 50 мкл крови в 5 мл воды;

I - калии, 2 -натрий, 3 - кальций, 4 - магний.

Нормировка площади пика на время миграции является лишь вычислительным приемом с результатами анализа. Однако, причина изменения времени миграции все же остается. Несмотря на это, путем такой нормировки ОСО площади пика уменьшается с 6.2% до 2.8%. Приемлемым решением этой проблемы является подготовка капилляра перед каждым пуском. В анализах, описанных до настоящего времени, для кондиционирования капилляра применяли только промывание разделяющим буфером в течение 3 мин.

Для удаления белков из капилляра после каждого разделения во второй серии измерений капилляр сначала промывали в течение 5 минут 0.1 М NaOH и затем минут разделяющим бусрером. Этим способом кондиционирования можно было удалять со стенок капилляра мешающие вещества, внесенные пробой, и в конце концов восстановить свойства капилляра новым буфером. Характеристическая кривая зависимости площади пика от времени миграции в этих случаях не имеет наклона, времена, как и площади пиков, колеблются произвольно. Воспроизводимость площади пика для кальция составляет после 8 вводов пробы 2.0%. Если площадь нормировать дополнительно на время, это значение составляет 1.5%.

Рис. 54. Разделение разжиженной пробы крови, характеристические кривые времени миграции/площади пика для проверки вос производимости с и без кондиционирования капилляра. Ус ловия аналогичны приведенным на рис. 53.

Амины также могут легко протонироваться, и, так же как ионы металлов или аммония, их можно легко разделять. Типичные значения pKs для алифатических аминов лежат в области от 9.5 до 10.8. На рис. 56 в качестве примера представлено разделение ионов металлов, аминов и аминоспиртов. И в данном случае непрямое УФ детектировамие достигается имидазольной буферной системой. Благодаря высокому разрешению пиков, все вещества, как видно из рисунка, отделены друг от друга на уровне базисной линии.

8.3. Сопоставление методов прямого и непрямого Уф-детектирования Сопоставление нижней границы детектирования (НГД) и верхней границы линейной области удается провести при анализе некоторых аминов, плохо поглощающих в УФ области. Аналогичные измерения со щелочными или щелочно-земельными ионами провести невозможно из – за их слишком малого УФ-поглощения. Из данных, приведенных в таблице 21, видно, что эта ионы при 200 нм можно детектировать прямым способом. В боратном буфере анализ длится до 5 мин. Непрямым УФ детектированием при 254 нм с эфедрином в качестве буфера нижняя граница детектирование уменьшается в 50 раз (примерно до 1 мг/л). Линейная область в методе прямого УФ-детектирование распространяется от 1.4 до 1.6 десятичных порядков, а при непрямом УФ-детектировании -от 1.7 до 2.0 десятичных порядков.

Рис. 55. Разделение разжиженной пробы крови, воспроизводимость времен миграции, площади пика и нормированные площади пика.

Условия аналогичны приведенным на рис. 53.

Из этого видно, что и при непрямом детектировании можно работать в линейной области.

Рис. 56. Разделение низших аминов и ионов металлов.

Условия: прибор КЭ Mill/pore Waters Quanta 4000;

капилляр:

75 мкм, 50/58 см;

поде: В/см, буфер: 5 мМ имидазол/серная кислота, рН 4,7;

ввод пробы гидростатический, 30 с, непрямое детектирование 214 нм, проба: 1.0- 2.5 ppm;

I - кадий, 2 - натрий, 3 диметиламин, 4 триметиламин, 5 - кальций, -магний, 7 - литий, 8 - диэтиламин, 9 - триэтиламин, 10 - диэтаноламин, 11 - триэтаноламии.

Таблица 21.

Нижняя и верхняя границы линейной области (в ppm) в методиках прямого и непрямого детектирования.

Детектирование Прямое УФ 200 нм Непрямое УФ 254 нм Вещество НГД Область линейности НГД Область линейности Этиламин 50 2000 1 Диэтиламин 50 2000 1 Триэтиламин 20 500 1 Условия разделения: прибор КЭ - Beckman P/FCE 2000;

капилляр 75 мкм, 50/57 см;

поле 439 В/см;

ввод пробы давлением 8 с, буфер при прямом УФ-детектировании - мМ борат, рН 9.5, при непрямом УФ-детектировании - 5 мМ эфедрин/серная кислота, рН 7.5;

прямое УФ-детектирование - 200 нм, непрямое - 254 нм;

пробы - амины в воде.

9. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) белков В КЗЭ белков между молекулами пробы и стенками капилляра могут возникнуть сильные, в основном электростатические, взаимодействия. Они происходят между отрицательно заряженными сила-нольными группами поверхности и положительно заряженными функциональными группами пробы. Некоторую дополнительную роль мо гут играть также неспецифические взаимодействия с образованием водородных мостиков или ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Адсорбция молекул белков на стенках капилляра может отрицательно сказываться на разделении при КЭ и поэтому нежелательна. Она приводит к ухудшению воспроизводимости времен миграции, уширению и асимметрии пиков, и даже к необратимой адсорбции компонентов пробы.

Поэтому при работе с немодифицированным капилляром рекомендуется после каждого проведенного разделения при вводе пробы из биологических матриц основательно промыть капилляр (например, NaOH). При этой операции молекулы, адсорбированные на стенках капилляра, удаляются, и воспроизводимость системы улучшается.

Существует несколько возможностей подавления нежелательных взаимодействий между белками и стенками капилляра.

9.1. Оптимизация разделения в немодифицированных капиллярах 9.1.1. Значения рН При значениях рН выше изоэлектрической точки (р!) белки существуют в анионной форме, то есть имеют те же заряды, что и стенки капилляра и во время разделения отталкиваются от них. Поскольку очень многие белки имеют значения pi, лежащие в области от нейтральных до слегка кислых, буфер для КЭ должен иметь явно щелочные значения рН (рН 9 - 11). Однако, в случае сильно основных белков ( рН > 10) эта возможность достигает своих естественных границ. Кроме этого, в данном случае дают себя знать высокая электропроводность применяемого буфера и отрицательно сказывающееся явление денатурирования, которое может возникнуть в этих характер ных условиях. На рис. 57 показано разделение белков в немодифицированном капилляре при рН 11.5.

Рис. 57. Разделение белков при рН 11.5 в немодифицированном капилляре. Буфер: мМ борат, рН 11.5;

пробы: 1 - DMF, 2 -РНК крупного рогатого скота, 3 - миоглобин кита, 4 - миог-лобин лошади, 5 - кональбумин, 6 - j3 - лактоглобулин, 7 -бычий сывороточный альбумин (БСА), 8 ферритин, 9 - а-амилоглюкозидаза.

В кислой области рН (рН<2) адсорбция белков также может уменьшаться вследствие протонирования силанольных групп и устранения тем самым отрицательного заряда поверхности. В данном случае проблемы представляют очень малый ЭОП и возможная денатурация белков. Использование крайних значений рН для анализа биополимеров ограничивает селективность системы, поскольку разница в зарядах анализируемых веществ заметно уменьшается. Кроме того, выгодно иметь в качестве свободно изменяемого параметра значение рН. Скорость движения заряженных проб в КЗЭ определяется степенью их ионизации, которую можно легко регулировать величинами рН. Наилучших результатов можно достичь, выбирая высокие концентрации буфера и область рН чуть ниже 3. На рис. 58 представлены некоторые тестовые буферы для разделения основных белков. Повышение рН от 2.4 до 4.7 при концентрации буфера 25 мМ приводит к явному уменьшению интенсивности пика, в то время как при повышении концентрации свыше 50 мМ (рН 4.3) до 100 мМ (рН 4.2) наблюдается заметное увеличение интенсивности пика.

И для этих буферов с высокой концентрацией можно улучшить проявления пика уменьшением значения рН до 2.9. Однако в данном случае, вследствие крайне высокой подвижности протонов (кислые значения рН), резко увеличивается ЭОП.

Поэтому дальнейшая оптимизация в сторону более кислых значений рН удается только с одновременным разбавлением разделяющего буфера, которое вызывает уменьшение интенсивности пика, Кроме того, работа в очень кислой области ( рН 2.3) приводит к уменьшению селективности. Этот способ оптимизации разделения стандартных белков показан на рис. 58.

9.1.2. Добавление солей к буферу В основе взаимодействия белков со стенкой лежит в основном механизм катионного обмена. Это возможно, поскольку и в случае отрицательного полного заряда молекулы (особенно при основных рН) всегда имеются в наличии катионные группы, например аргинин-радикалы в цепочках полипептидов. Поэтому путем добавления солей щелочных металлов (например сульфата калия) к буферу, как и в случае ионообменной хроматографии, достигается конкуренция кулоновскому притяжению и вызванное этим притяжением взаимодействие белок - стенка явно уменьшается. Следуя этой концепции, можно для стандартных белков в широкой области pI (pI 5-11) достичь эффективности 50000-100000 тарелок на метр. И в этом случае недостатком является сравнительно высокая электропроводность буфера (эффективное охлаждение!) которая вынуждает использовать поля низкого напряжения (5 кВ) и длинные капилляры с маленьким внутренним диаметром (25 мкм). Кроме того, большие ионные силы уменьшают как ЭОП, так и -потенциал пробы, что вместе с вышеназванными факторами приводит к длительным временам анализа.

В качестве буферных веществ могут служить также цвиттерионные молекулы (внутренние соли), которые обладают большой буферной емкостью, но не вносят значительного вклада в общую электропроводность системы. Цвиттерионы могут образовывать ассоциаты с белками и поверхностью капилляра и, тем самым, уменьшать адсорбцию белков. За счет применения аминосульфоната, аминосульфата и, в последнее время, фосфонийсульфоната в очень высоких концентрациях в качестве добавок к фосфатному буферу в нейтральных условиях можно разделять как основные, так и кислые белки.

9.1.3. Добавка органического модификатора к буферу Недостаток заключается в возможной денатурации белка.

9.1.4. Применение буферных добавок для разделения белков (динамическое наполнение капилляров) Простейший метод модифицирования поверхности кварцевого капилляра состоит в добавлении к буферному раствору такого компонента, который предпочтительнее адсорбируется на поверхностных силанольных группах. Формирование такого адсорбционного слоя дополнительно влияет на ЭОП и уменьшает адсорбцию вследствие гидрофобного или электростатического отталкивания. Разделяющие сис темы, применяемые в основном для разделения белков в немодифицированных капиллярах, приведены в таблице 22.

Добавка ПАВ ведет, прежде всего, к увеличению эффективности разделения белков.

При этом взаимодействия между молекулами различных ПАВ и пробами могут быть очень различными. С одной стороны, можно конечно обсуждать, вопрос адсорбции детергентов на биомолекулах. Следствием этого является улучшение растворимости и увеличение гидрофильного характера пробы. Наряду с этим, большую роль играет также адсорбция ПАВ на стенках капилляров. Это приводит как к увеличению гидрофильности поверхности, так, и к возможной блокировке адсорбционных центров.

При использовании катионных детергентов, например, ЦТАБ, формируется двойной электрический слой, в котором положительные заряды направлены внутрь капилляра.

Тем самым достигается обращение ЭОП. Вследствие того, что поверхность заряжена положительно, адсорбция катионных белков тормозится электростатическим от талкиванием от стенки. При этом в случае основных белков достигается большое число ступеней разделения и симметричность пиков. Вообще следует обращать внимание на то, чтобы добавленным детергентом не превысить критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ).

Рис. 58. Разделение стандартных белков в различных буферных сис темах. Условия: прибор самодельный с быстросканирую-щим детектором, капилляр 50 мкм, 37/44 см, поле: В/см;

ввод пробы гидродинамический, 15 см, 2с;

детектирование 214 нм;

буфер фосфатный;

проба: цитохром С, лизоцим, ри-бонуклеаза А.

Таблица 22.

Разделение белков с помощью буферных добавок в немодисрицированных капиллярах.

Буфер С (мМ) РН Pi N.(103/м) Трицин/КС! 10/20 8.3 5-7 СНЕ8/Кг304/ЭДТА 100/250/1 9.0 5-11 Фосфат/бетаин/Кг804 40/2000/100 6.7 9-11 Фосфат/Sulton 100/1000 7.0 5-11 1,3-диаминопропаи/К2304 40/20 3.5 9- 11 Фосфат/BRU 35 10/Юррт 7.0 3-11 Фосфат/FC 134 50/100 ррт 7.0 7-11 Борат/ДДСН 100/0.5 % 10.0 4-6 Рис. 59. Катионные ПАВ.

Неионные ПАВ, например BRIJ 35, также могут быть использованы для уменьшения взаимодействия белок-стенка. Для еще большего увеличения адсорбции этих детерегенов на поверхности капилляра и полного подавления ионных взаимодействий с силанольными группами, стенка обрабатывается дополнительно условно "толстым" покрытием С 18.

Принципиально должна существовать также возможность использования в КЗЭ испытанного в классическом электрофорезе и в жидкостной хроматографии анионного ПАВ ДДСН. Однако в систематических исследованиях кислых белков оказывается, что добавка ДДСН в количествах от ррт до одного процента к пробе и к буферу приводит к очень неопределенным результатам. В общем случае не улучшается ни эффективность, ни селективность, а даже наблюдается некоторое ухудшение этих характеристик. Возможным объяснением этого может быть хорошо известное действие денатурации, оказываемое ДДСН на белок. Наряду с этим, в наблюдаемой потере селективности большую роль играет, конечно, адсорбция ПАВ на биомолекулах и связанное с этим появление заряда пробы. Первоначальная структура заряда белков может полностью исчезнуть или перекрываться этим эффектом, так что разделение в электрическом поле произойдет только лишь по адсорбированным зарядам детергентов.

Этот эффект был использован в ДДСН-ПААГ-электрофорезе для определения ММ белков. Этот же способ может быть реализован в капилляре и позже будет описан в главе "Капиллярный гелевый электрофорез".

Резюмируя, можно отметить, что в случае добавок детергентов для разделения белков в КЭ многообещающим представляется использование в качестве динамических покрытий в основном неионных ПАВ, т. к. они лишь незначительно изменяют структуру заряда пробы. Конечно, этот метод включает совместное действие химического мо дифицирования поверхности и динамического покрытия, в результате чего преимущества доступности и простоты применения буферных добавок в конце концов теряются.

Неблагоприятную адсорбцию белков на поверхности капилляра можно уменьшить также добавками низших полиаминов, например, 1,3-ДАП. При этом получают высокую эффективность, однако из-за большой собственной электропроводности буфера следует использовать электрические поля низкой напряженности. Действие буферных добавок, вероятно, частично объясняется необратимой адсорбцией на стенках капилляра. Поэтому одновременно со снижением адсорбции пробы происходит резкое уменьшение электроосмоса. В качестве примера на рис. 60 показано разделение стандартных белков.

9.2. Использование капилляров с модифицированной поверхностью ЭОП можно регулировать также с помощью химического модифицирования поверхности капилляра. Одновременно с этим могут уменьшаться возможная адсорбция компонентов пробы на поверхности капилляра и улучшаться воспроизводимость анализов. Для химического покрытия капилляров можно использовать различные способы. Химически модифицированные капилляры коммерчески доступны.

Рис. 60. Разделение стандартных белков в буферной системе ДАП.

Условия: капилляр 75 мкм, 37/44 см, поле: 272 В/см;

детектирование: нм, фосфатный буфер со 100 мМ ДАП, рН 3.0;

проба: цитохром С, лизоцим, рибонуклеаза А.

9.2.1. Типы покрытий поверхности в КЭ Принципиально различаются два метода нанесения слоев на поверхность. Сначала использовали метод традиционной химии силанов, при котором моно-, ди-, или трисиланы присоединяются к силанольным группам на стенках капилляров с образованием силоксановых связей. Функциональные группы, введенные сначала поверх силанов, можно использовать еще и на второй стадии для окончательного модифицирования поверхности.

Перечень описанных к настоящему времени в литературе т. н. общепринятых типов покрытий, приведен в таблице 23. Основным ограничением метода является недостаточная стабильность силоксановых связей по отношению к гидролизу в щелочных условиях. Этот метод достаточно хорошо известен в жидкостной хроматографии.

Недостаток этого метода можно обойти, применяя способы покрытия стенок капилляра полимерами, которые представляют собой вторую большую группу используемых покрытий. Здесь опять различают два способа:

- поверхность предварительно обрабатывается классическим способом химии силанов и при этом на нее наносятся т.н. якорные группы, на второй стадии они могут сополимеризоваться с соответствующими мономерами или олигомерами;

- на соответствующий носитель адсорбируется первичный полимер, который затем сополимеризуется in situ и поперечно связывается в сетку.

Таблица 23.

Методы покрытия капилляров в разделении белков.

Обычные покрытия Функциональные группы Область рН Применение Триметилсилил- 7 Маленькие молекулы Триметилсилил- 9 МЭКХ Обращенная фаза С8 9 Белки Обращенная фаза С 18 9 Белки Полиэтиленгликоль- от 3 до 5 -"- Диол- от 3 до 5 -"- Глицеро-глицид-оксипропил- 5.".

Мальтоза от З до 7.".

Арилпентафтор- 7.".

Альфа-лактальбумин 8 к Поверхности с нанесенными слоями полимеров проявляют более высокую рН стабильность в щелочах при рН около 9.

Недостаток покрытия полимерами заключается в сильной гидрофобности (адсорбция белков!), так что такого рода фазы часто используются в присутствии неионных или внутреннеионных детергентов. Сопоставление применяемых до настоящего времени полимерных покрытий приведено в таблице 24.

Таблица 24.

Методы покрытия капилляров в разделении белков Полимерные покрытия Функциональные группы Область рН Применение Линейный полиакриламид от 2 до 8 Белки (до10*) ИЭФ Полиэтиленимин от 3 до 11 Белки 1 -винил-2-пирролидин от 2 до 6 Белки Поли(метилглутамат) 7 Белки Полиметилсилоксан (OV1) 7 МЭКХ Полиэтиленгликоль 7 МЭКХ Полисилоксан/бетациклодекстрин 7 Хиральное разделение *) указанная в литературе область стабильности или наивысшее используемое в опытах значение рН.

9.2.2. Изготовление химически модифицированных капилляров 9.2.2.1. Предварительная обработка кварцевых капилляров На основании многолетнего опыта изготовления кварцевых капилляров с покрытием для ГХ известно, что перед собственно химическим модифицированием очень полезно провести предварительную обработку материала. Капилляры, применяемые в КЭ, обычно изготавливаются либо из "некондиционных" трубок, применяемых в ГХ, либо из отходов производства световодов. Поэтому качество материалов различных трубок относительно их шероховатости и загрязнения адсорбированными ионами металлов очень различается.

Большинство описанных в литературе методов заключаются в обработке капилляров щелочами или кислотами для улучшения смачиваемости поверхности.

Кроме этого, поверхность также химически истощается, и образуются новые силанольные группы. Это выгодно, поскольку дополнительно образуемые SiOH-группы играют роль центров связи с покрытием и тем самым помогают улучшению химического обмена со стенкой капилляра. Эта стадия заканчивается обычно нейтральной промывкой в дистиллированной воде и сушкой в потоке газа при повышенных температурах (80-200 °С).

Не все авторы указывают на необходимость предварительной обработки для успешного покрытия капилляров.

9.2.2.2. Методы покрытия В ГХ известны два основных метода модифицирования поверхности капилляров.

Первый метод - это т.н. "метод динамического покрытия". В этом случае порция жидкости, состоящая из раствора стационарной фазы, пропускается через капилляр с помощью газового потока. Важными условиями при этом являются смачиваемость стенок растворителем, малый поверхностный заряд раствора и, прежде всего, отсутствие пыли. В качестве растворителя применяют в основном дихлорметан и пемтан.

Гомогенность и толщина полученного покрытия определяются в первую очередь концентрацией раствора. Полуэмпирическая оценка толщины пленки di может быть проведена по следующему уравнению:

di = Сr/200 (U/)1'2, где С - концентрация в об.%, г - радиус, U - линейная скорость, -вязкость, - поверхностное натяжение.

Для 10% раствора в области реализируемых скоростей достигается толщина пленки от 0.2 до 1 мкм. Процесс покрытия заканчивается сушкой в инертной атмосфере и, при необходимости, полимеризацией или поперечным сшиванием.

При статическом методе капилляр также заполняется разбавленным раствором стационарной фазы. После запаивания одного конца капилляра пары растворителя пропускаются через другой конец при нагревании и/или под давлением. Этот метод предъявляет существенно более высокие требования к аппаратуре и методике. Предпо сылкой гомогенного покрытия являются, в частности, постоянная температура и тщательное дегазирование.

Несмотря на то, что оба метода очень надежны в ГХ, до настоящего времени в КЭ они применяются довольно редко. Большинство авторов ограничиваются тем, что, как в ЖХ, наносят силаны за счет выдерживания в растворе и нагревания. Тем самым, коммерчески доступные капилляры обладают худшей стабильностью и воспроизводимостью покрытия. Кроме того, при этом теряется важная информация о модифицированной поверхности (толщина пленки и др.).

9.2.3. Характеристики заполненных капилляров в КЭ В ГХ и ЖХ стандартная фаза характеризуется с применением многочисленных стандартных тестов и тестовых смесей. Кроме того, в ЖХ существуют многочисленные независимые физико-химические методы, например, элементный СНN-анализ, ИК фурье-спектроскопия или ЯМР, способные дать информацию о модифицировании поверхности. Использование в КЭ трубок небольшой длины (<1 м) с крайне малым внутренним диаметром (<100 мкм) и, как следствие, малой внутренней поверхностью (<1 см2) делают невозможным применение инструментальных физико-химических методов.

Исходя из этого, в качестве характеристики покрытия капилляров используется изменение ЭОП, вызванное покрытием. Вследствие того, что в большинстве случаев покрытия делаются для подавления взаимодействия белок-стенка, естественно, что в качестве меры качества модифицирования поверхности может служить разделение стандартных смесей белков.

Характеристики неполярных или гидрофобных покрытий можно получить с помощью газохроматографических измерений. Для определения толщины пленки исследуются времена удерживания н-нонана как стандартного вещества. Для характеристики оставшихся силанольных групп служат времена удерживания различных полярных веществ.

9.3. Обзор важнейших химических покрытий 9.3.1. Общепринятые покрытия 9.3.1.1. Алкил-силановые покрытия Изготовление. Применение и реакционная способность моно-, ди- и трифункциональных алкилсиланов уже давно известны в ГХ и ВЭЖХ, поэтому здесь подробно на этом останавливаться не будем. Получаемая в результате поверхность имеет более или менее гидрофобный характер ("обращенная фаза"), в зависимости от длин цепочек нанесенных алифатаческих остатков. Благодаря слабой реакционной способности алкокси-силанов их можно наносить из водных растворов.

Электроосмос. При добавлении поверхностных силанольных групп с нейтральными (незаряженными) алкилсиланами ЭОП уменьшается. На рис. 61 представлены зависимости электроосмоса от значения рН буфера для кварцевого капилляра, покрытого С8 и С18, по сравнению с исходным капилляром. Видно, что поток уменьшается примерно на 40% от исходного значения, и в этом случае трудно определить точку перелома. Меньший поток в 08-капилляре вероятно объясняется лучшим покрытием поверхности, т.к. "щетка" С8 предъявляет меньше стерических требований, чем С18.

Рис. 61. ЭОП/рН характеристшси различных покрытий (типов "щетки").

Стабильность. Из применения в хроматографии известно, что алкилсилановые покрытия стабильны по отношению к гидролизу только при рН 7. На рис. 62 показано изменение времени миграции некоего нейтрального маркера в течение 80 опытов при рН 7 для названных выше капилляров. Модифицированные капилляры показывают явный спад времени движения в течение первых 20 опытов. Возможные объяснения этого заключаются либо в потере несвязанного материала, либо в частичном гидролизе алкильной "щетки" на поверхности. После этого состояние капилляра, покрытого по крайней мере С8, стабилизируется.

Применимость. В капиллярах с покрытиями С8 и С18 может быть проведено разделение белков. Однако покрытия алкилсиланами имеют два больших недостатка: с одной стороны - гидрофобный характер алкильной "щетки", с другой стороны - неполное экранирование поверхностных силамольмых групп, которые все еще взаимодействуют с белками.

Рис. 62. Стабильность покрытий (типы "щетки"), литература Supelco.

9.3.1.2. Арилпентафторидные покрытия Изготовление. Синтез проводится по описанным стандартным методам с применением двухстадийной реакции: после обработки стенки гамма аминопропилтриметоксисиланом нанесенные аминогруппы обмениваются с пентафторобензоилхлоридом в сухом толуоле.

Электроосмос. Особенность арилпентафторидного (АПФ) покрытия заключается в том, что, в отличие от многих других покрытий, при нейтральном рН и средних ионных силах появляется отчетливый ЭОП (0.5 мм/с).

Применимость. Как показывают специальные хроматографические опыты, АПФ покрытия также относятся к гидрофобным. Поэтому АПФ-капилляры можно с успехом использовать при рН 7 для разделения белков. Для тестовых смесей с белками, которые перекрывали область рН от 6.9 до 11, получали эффективность в многие сотни тысяч теоретических тарелок на метр (рис. 63). Благодаря вкладу электроосмоса в условиях проводимого анализа можно разделять как катионные, так и анионные белки за один проход.

Рис. 63. Структура АПФ покрытия. Пример разделения белков: (А) с помощью покрытия АПФ;

(В) - в капилляре из плавленного кварца;

буфер - мМ КС], рН 7;

пробы: L - лизоцим, D - ДМСО, R - РНК крупного рогатого скота, Т - трипсино ген, WM - миоглобин кита, НМ - миоглобин лошади, НСА-В карбоксиангидраза В человека, ВСА-В - карбоксиангид-раза крупного рогатого скота.

9.3.1.3. Гидрофильные гидрокоил- и полиэфирные покрытия Изготовление. В ЖХ для разделения белков в основном используются гидрофильные фазы, например, с диол-полиэтиленгликолем (ДПЭГ) или полисахаридами. Кварцевые капилляры также можно модифицировать этими функциональными группами.

В данном случае для синтеза используются двухступенчатые реакции, на первой стадии которых применяют, например, глицидсилан. Он может впоследствии либо гидролизоваться диолом, либо соединиться с глицерином или полиэтиленгликолем (рис. 64). Нанесение углеводородов происходит на первой стадии с помощью аминофункци-ональных групп, с которыми впоследствии можно связать мальтозу с использованием, например, циано-боргидридного катализа.

Рис. 64. Схема синтеза ПЭГ-покрытия.

Электроосмос и стабильность. При покрытии диолом и полиэтиленгликолем (ПЭГ), как и ожидалось, электроосмос резко уменьшается. (В случае диола mЭОП=0.1 см2/кВс для 50 мМ фосфата и рН 6). Рабочая область для таких капилляров ограничивается значениями рН от 3 до 5. Долговременная стабильность в этих условиях достигает не скольких месяцев. При покрытии мальтозой возможна работа в области рН от 3 до 7.

Вследствие того, что при нанесении аминосиланов с мальтозой реакции обмена подвергаются не все функциональные аминогруппы, при низких значениях рН поверхность заряжается положительно.

Это приводит к обращению направления ЭОП в кислотах. Кроме того, хранение капилляров в этом случае возможно только при добавлении консервантов, защищающих покрытие от повреждения микроорганизмами.

Применимость: Покрытия на основе диола, ПЭГ и мальтозы в основном используются для разделения белков в КЭ.

Разделение стандартных белков показано на рис. 65.

В заключение можно отметить, что и в случае гидрофильных покрытий капилляров или на первой стадии синтеза введенной ''подложки" поверхность покрывается недостаточно плотным слоем, так что зачастую взаимодействия поверхности с пробой подавляются не полностью.

Рис. 65. Разделение белков в капилляре, покрытом ПЭГ. Буфер: 30 мМ фосфат, рН 3.8;

пробы: 1 - цитохром С, 2 - лизоцим, 3 миоглобин, 4 - трипсин, 5 - РНК, 6 - трипсиноген, 7 - химотрипсиноген.

9.3.1.4. Покрытия на основе белков Изготовление. Внутренние стенки капилляров можно покрыть не только углеводородами, но и белками, например, альфа-лактальбумином. Для того, чтобы свободные альдегидные группы служили центрами связи с белками, в капилляре, модифицированном аминогруппами, сначала проводится реакция обмена с глутардиальдегидом. Впоследствии эти группы реагируют с введенным в капилляр белком.

Электроосмос. Покрытия на основе белков показывают интересную зависимость ЭОП от рН. Вследствие того, что белки имеют амфотерные свойства, выше своих значений рI они существут в анионной, а ниже - в катионной формах. Если значения рН буфера соответствуют значениям pi, то белки незаряжены. Следовательно, в этой точке электроосмос должен падать до нуля, или, соответственно, менять направление на противоположное при переходе через эту точку. Таким образом, в принципе существует возможность подбором определенного белка или амфотерных молекул регулировать силу и направление ЭОП.

9.3.2. Полимерные покрытия 9.3.2.1. Покрытия на основе линейных полиакриламидов Поперечносшитые полиакрилимидные гели оказались прекрасными носителями и разделительными матрицами для электрофоретического разделения белков в способах, основанных на плоском слоевом электрофорезе, таких как ДИСК электрофорез, ДДСН-ПААГ-электрофорез или ИЭФ. Это указывает на гидрофильный характер таких гелей, которые проявляют только слабые взаимодействия с биомолекулами. В КЭ возможно также покрытие кварцевой поверхности акриламидом.

Изготовление. В двухстадийной реакции стенка капилляра сначала обрабатывается гаммаметакрилоксипропилтриметоксисиланом в разбавленной уксусной кислоте.

Нанесенные таким способом виниловые группы на второй стадии реакции сополимеризуются в водном растворе с акриламидом В качестве радикального инициатора реакции служит персульфат аммония, а катализатором является N,N,N’,N’ тетраметиленэтилендиамин (ТМЭД) (рис. 66).

Рис.66. Схема, образования полиакридамидного покрытия.

Электроосмос и стабильность. ЭОП полностью подавляется при покрытии поверхности капилляра линейным полиакриламидом. Стабильность таких капилляров при низких рН (до 3) очень высокая, однако в щелочной среде при рН>8 они нестабильны. Эта нестабильность проявляется в постепенном появлении ЭОП, а также колебаниях времени миграции проб.

Применимость. С учетом простоты производства, а также доступности приобретения покрытия на основе линейных полиакриламидов нашли широкое применение. В первую очередь речь идет не только о разделении белков, но и некоторых биомолекул - таких, как фрагменты ДНК.

На рис. 67 показано разделение стандартных проб при рН 2.8. Несмотря на заметно возросший ЭОП, можно работать с нормальными полями, так что разделение заканчивается примерно через 5 минут.

Вследствие того, что покрытия на основе линейных полиакриламидов позволяют полностью подавить ЭОП, можно перенести такой классический способ разделения, как ИЭФ, на КЭ.

В области биологически важных проб наряду с белками определенную роль играют также нуклеотиды, олигонуклеотиды и фрагменты ДНК. Такого рода пробы в КЭ до настоящего времени разделяли методом МЭКХ, а также полиакриламидгелевым КЭ.

Покрытия на основе линейных полиакриламидов в сочетании с макромолекулярными буферными добавками можно привлечь для разделения фрагментов радикалов ДНК в широкой области.

Использование покрытых капилляров для этих целей представляется вполне выгодным, поскольку проблемы, связанные с использованием капилляров, заполненных гелем (образование пузырей, воспроизводимость и стабильность гелей) еще не решены. Наконец, капилляры, покрытые линейными полиакриламидами, можно использовать также для изготовления гельзаполненных капилляров.

Рис. 67. Разделение стандартных белков при проверке стабильности капилляра, покрытого полиакриламидом.

Буфер: 30 мМ цитрат, рН 2.8;

пробы: А- лизоцим, В - РНК, С - химотрип-синоген.

9.3.2.2. Покрытия на основе поли(винилпирролидона) Капилляры, покрытые поли(винилпирролидоном) (ПВП) успешно применяли для разделения белков методами гельпроникающей эксклюзионной хроматографии (ГПХ) и хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) в ВЭЖХ. Применению ПВП в качестве покрытия уделяется внимание также в КЭ.

Изготовление. На первой стадии на стенку капилляра наносится виниловое покрытие. На заключительной стадии проводят сополимеризацию с 1-винил-2-пирролидоном в водном растворе с использованием ТМЭД в качестве катализатора и персульфата аммония как радикального инициатора реакции.

Рис. 68. Пример разделения белков в капилляре с ПВП-покрытием. Буфер: 58.5 мМ фосфат, рН 2.0;

пробы: А - бэта лактогдобулин В, В - бэта-лактоглобулин А, С - лизоцим, D серумальбумин человека, Е - РНК крупного рогатого скота, F - цитохром С, G - трипсиноген, Н - миоглобин кита, I -трансферрин, J - кональбумин, К • миоглобин лошади, L -карбоксиангидраза В, М - карбоксиангидраза А, N - гемоглобин, О - парвальбумин.

Свойства и применимость. Оптимальная рабочая область для такого типа покрытий для разделения белков приходится на область сильных кислот, в которой капилляры сохраняют стабильность в течение нескольких недель. На рис. 68 показано разделение 15 (!) стандартных белков в области р! от 4.5 до 11 (!) и ММ от 12000 до 77000.

Эффективность достигает 700000 теоретических тарелок в течение 25 минут. Покрытия на основе ПВП для кварцевых капилляров являются высокопроизводительными и при использовании в области, кислотных рН вполне конкурируют с покрытиями на основе линейных полиакриламидов.

9.3.2.3. Покрытие капилляров поли(этиленимином) (нанесение ионных слоев) Поли(этиленимин) (ПЭИ) является положительно заряженным полимерным покрытием, которое закрепляется на стенке капилляра под действием электростатических взаимодействий.

Изготовление. Способ нанесения такого покрытия похож на способ нанесения покрытия из анионообменных материалов на полимерные и силикатные подложки для ВЭЖХ: при этом сначала на поверхности носителя адсорбируются первичные ПЭИ с различными ММ и концентрацией, затем производится их поперечное сшивание.

В качестве сшивающего агента служит в данном случае этиленгликольдиглицидилэфир. ПЭИ содержит сдвоенные полимерные цепи с первичными, вторичными и третичными аминогруппами в соотношении 1:2:1. Эти функциональные группы делают возможными как электростатические взаимодействия, так и поперечную сшивку.

Электроосмос. Вследствие того, что концентрация основных аминогрупп в полимере высока, в широкой области рН покрытие остается заряженным положительно, что приводит к обращению направления ЭОП. При этом абсолютные значения элетроосмотических подвижностей, которые для данных покрытий достигаются при низших рН, лежат в той же области, что и скорости потоков для необработанных капилляров при основных рН (!). Подробная ЭОП/рН - характеристика, а также зависимость от количества нанесенного ПЭИ показана на рис. 69.

Как и ожидалось, с ростом значения рН буфера ЭОП увеличивается, т.к. при этом резко ускоряется депротонирование аминогрупп. Кроме того, в данном случае нельзя также полностью исключить влияние силанольных поверхностных групп (депротонирование в щелочи!).

Применимость. Наряду с интересными свойствами по отношению к ЭОП, капилляры, покрытые ПЭИ, пригодны также для разделения белков.

(Отталкивание положительно заряженных белков от стенки капилляра!). (Рис. 70).

Рис. 69. Зависимость ЭОП от рН (ЭОП/рН-характеристики) капилляров с нанесенным ПЭИ при различных концентрациях ПЭИ.

9.3.2.4. Покрытие капилляров поли(метилглутаматом) Исходным соединением для изготовления этого полипептидного покрытия является мономер М-карбоксиангидрид гаммаметилглутамата. Сначала проводят адсорбцию этого соединения на стенку капилляра, затем с помощью нагревания с одновременным расщеплением диоксида углерода проводят полимеризацию.

Электроосмос. Вследствие того, что нанесенный полимерный слой очень тонок, ЭОП уменьшается незначительно и стенка капилляра экранируется не полностью.

Применимость. Капилляры с поли(метилглутаматовым) (ПМГ) покрытием пригодны для разделения белков. Кроме того, ими можно разделять комплексные смеси ферментов (рис 71).

Рис.70. Разделение стандартных белков в капилляре, покрытом ПЭИ. Буфер: 20 мМ гидроксиламин/HCl, рН 7,0:

пробы: 1 -мезицилоксид. 2 - миоглобин кита, 3 - БСА, 4 - хямотрипси-моген А крупного рогатого скота, 5 - цитохром С лошади, 6 - лизоцим.

9.3.2.5. Капилляры для ГХ и СКФХ с нанесенным полимером, используемые в КЗ.

Еще на начальной стадии развития в КЭ было предложено использовать капилляры с нанесенными полимерами, применяемые в ГХ. При этом преследовалась цель регулировать ЭОП в МЭКХ с помощью капилляров, покрытых полиметилсилоксаном (ПМС) или ПЭГ.

Рис. 71. Разделение целлюлозного комплекса ферментов в капилляре с ПМГ покрытием. Буфер: ЗОмМ фосфат, рН 7,0.

При использовании неполярного ПМС-покрытия в МЭКХ с ДДСН в качестве мицеллообразователя ЭОП возрастает по сравнению с использованием необработанного капилляра. Это приводит к более коротким временам анализа, но одновременно с этим и к меньшим площадям пиков. Увеличение электроосмоса можно объяснить адсорбцией молекул ПАВ на гидрофобной поверхности и, как следствие, повышением ^-потенциала. В случае полиэтиленгликолевого покрытия наблюдается обратный эффект, т.е. меньшая скорость потока, большие времена анализа и большие площади пиков. Это значит, что такое покрытие экранирует поверхностные силанольные группы, однако, вследствие гидрофильного характера ПЭГ-цепочек, дополнительной адсорбции ДДСН не происходит. Областью применения таких капил ляров является разделение фенолов и производных нитробензола, в частности, производного пурина и циклических оснований.

9.4. Выводы Применение кварцевых капилляров с покрытием для КЭ описаны в последние годы многими авторами. Однако до настоящего времени коммерчески доступны капилляры только с очень ограниченным числом типов покрытий:

1. Applied Biosistems (Foster City, California) предлагают катионные реагенты, которые дают положительно заряженные покрытия и, тем самым, приводят к обращению направления ЭОП. Этими покрытиями также заметно понижаются взаимодействия белков со стенками капилляров при значениях рН ниже их изоэлектрической точки.

2. BioRad (Hercules, California) предлагают капилляры, модифицированные гидрофильными покрытиями. Тем самым, как ЭОП. так и адсорбция биомолекул уменьшаются.

3. Supeico, Inc. (Bellefonte, Pennsylvania) предлагает различные связанные фазы.

Тем самым, кроме уменьшения адсорбции белков должно обеспечиваться постоянство ЭОП в области рН от 3 до 10. Предлагаемыми к продаже фазами являются:

нейтральные гидрофильные, слабо гидрофобные фазы С1, гидрофобные фазы С8 и сильно гидрофобные фазы С18.

4. Isco, Inc. (Lincoln, Nebraska) предлагает три фазы для покрытий: ковалентно связанную фазу С18 (белки), глицериновое покрытие (белки, пептиды) и сульфокислотное покрытие (нуклеотиды).

5. Коммерчески доступны также капилляры с различными полимерными покрытиями для применения в ГХ.

Тот факт, что в торговле других предложений нет, показывает, что многие покрытия не соответствуют требованиям рутинных аналитических измерений. Так, получаемые обычными способами слои на стенках капилляров являются прежде всего гидролитически нестабильными, тем более, что в КЭ многие разделения проходят в среде сильных оснований. Кроме того, экранирование активных адсорбционных центров на стенках капилляров является в большинстве случаев неполным, так что их применение для разделения белков достаточно условно.

Полимерные покрытая проявляют себя в последнем случае лучше, однако, как показывают опыты по разделению белков, и здесь при рН>9 не обеспечивается гидролитическая стабильность.

Что касается разделения биомолекул, то ни одно из известных покрытий не позволяет одинаково хорошо разделять сильно различающиеся пробы (белков).

Поэтому цель дальнейших исследований в этой области должна заключаться в получении более стабильных и универсальных покрытий.

В таблице 25 проведено сопоставление различных свойств модифицированных и немодифицированных капилляров.

Таблица 25.

Сравнение покрытых и непокрытых капилляров для применения в КЭ.

Непокрытые капилляры Капилляры с покрытием 1. Катоднонаправленный электроосмос 1. Управление электроосмосом (направление,величина) 2. Проблемы с воспроизводимостью ЭОП 2. Лучшая воспроизводимость ЭОП (гистерезис при изменении рН) (меньший гистерезис) 3. Сильная адсорбция биомолекул 3. Пассивация стенки капилляра по (необходима работа с добавками к отношению к молекулам пробы (уменьшение адсорбции на стенках) буферам) 4. Необходимо тщательное приготовление 4. Проблемы с воспроизводимостью буфера приготовления и долговременной стабильностью покрытий 10. Мицеллярная электрокинетическая хроматография В КЗЭ нейтральные пробы достигают детектора вместе с катионами и анионами и не могут быть разделены. Метод МЭКХ, предложенный Терабе и др. в 1984 году, позволяет разделять незаряженные компоненты пробы за счет различной вероятности нахождения их в водной подвижной и псевдостационарной фазах. С помощью добавок детергентов к буферу при превышении ККМ образуются мицеллы. Эти мицеллы носят гидрофобный характер внутри и заряжены снаружи, чем и достигается электрофоретическая подвижность в электрическом поле. В зависимости от знака заряда эта электрофоретическая подвижность направлена в сторону катода или анода.

МЭКХ может быть реализована в той же аппаратуре, что КЗЭ и требует лишь добавок детергента. Наиболее часто в качестве детергента применяют ДДСН. Получаемые мицеллы имеют отрицательный заряд и, как следствие, приобретают электрофоретическую подвижность в направлении анода. По аналогии с КЗЭ эффективная скорость перемещения компонентов пробы, так же, как и мицелл, представляет собой векторную сумму электрофоретической и электроосмотической скоростей. На рис. 71 представлена схема разделения посредством МЭКХ. Речь идет о наиболее часто встречающемся случае, когда анионный детергент растворен в нейтральном или щелочном буфере.

ЭОП направлен в сторону катода. Если вклад электрофоретической подвижности мицелл меньше вклада электроосмотической подвижности, то мицеллы движутся в сторону катода, т.е. в сторону детектора. Полярные молекулы, которые задерживаются только в водной фазе, движутся со скоростью электроосмотического потока и, спустя "мертвое" время, достигают детектора. Сильно гидрофобные молекулы пробы задерживаются прежде всего внутри мицелл и движутся со скоростью мицеллы.

Следовательно, задержанные молекулы пробы появляются в детекторе в отрезок времени между to и tмс. Получаемое разделение нейтральных веществ основано на их различном распределении между буферным раствором и внутренней частью мицелл.

Вследствие того, что молекулы пробы взаимодействуют с псевдостационарной фазой, точность метода МЭКХ соответствует точности обычного хроматографического метода.

Значение к', по аналогии с хроматографией, можно определить как соотношение между числом молекул пробы в подвижной (naq) и стационарной (nmc) фазах:

k'= (nmc) / (naq) С учетом того, что стационарная фаза подвижна, для значения V:' получим:

k'=(tR-to)/{to(1-tR/tMC)} В отличие от ВЭЖХ, в данном случае через детектор могут проходить также молекулы пробы с бесконечными значениями k'. В этом случае молекулы пробы задерживаются исключительно внутри мицелл. Влияние распределения ионов пробы между псевдостационарной фазой и буфером на разделение смеси веществ представлено на рис.73.

При постоянном Дк' расстояния между пиками с ростом значения k' уменьшаются.

Для вычисления k' необходимо знать to и tмс. Однако для МЭКХ не существует идеального маркера. Маркер для to должен быть электрически нейтральным и полностью свободным от мицелл. В качестве инертных маркеров подходят, например, ацетон;

формамид или метанол, взаимодействием которых с мицеллами можно пренеб речь и которые движутся со скоростью ЭОП. В дальнейшем эти вещества можно детектировать с помощью УФ-поглощения или изменения показателя преломления как пик показателя преломления.

Рис. 72. Механизм разделения в МЭКХ Труднее определить скорость движения мицелл. В качестве маркера для (мс находят применение такие водорастворимые соединения, которые задерживаются только внутри мицелл, например, судан III и судан IV.

Область применения метода МЭКХ не ограничивается только разделением нейтральных веществ, им можно разделять и заряженные пробы. Распределение веществ между водной и мицеллярной фазами может приводить к росту селективности и воздействовать тем самым на разделение ионов с очень схожими электрофоретическими подвижностями. В этих случаях разрешение пиков, достигаемое методом МЭКХ, перекрывает разрешение КЗЭ.

Для МЭКХ необходимы ионные детергенты. Многие детергенты можно приобрести в торговле, однако только немногие из них пригодны в качестве добавок в МЭКХ. Для того, чтобы детергент подходил к МЭКХ, он должен отвечать следующим требованиям:

-растворимость в соответствующем буфере должна быть достаточно высокой (> ККМ), чтобы могли образоваться мицеллы;

- мицеллярный раствор должен быть гомогенным и УФ-прозрачным;

- мицеллярный раствор должен обладать невысокой вязкостью.

В МЭКХ могут применяться как анионные, так и катионные детергенты. Однако наиболее распространены анионные детергенты. Наиболее часто применяется, как уже отмечалось, ДДСН. Меньше подходят гомологи ДДСН. Так, например, расвор децилсульфата натрия с необходимой концентрацией (50 мМ) обладает высокой электропроводностью, что увеличивает поток и, как следствие, возникают проблемы с джоулевым теплом. Тетрадецилсульфат натрия обладает при комнатных температурах слишком малой растворимостью, что ограничивает его применение только высокими температурами. В общем случае сульфаты и сульфонаты предпочтительнее карбоксилатов, поскольку они сохраняют постоянную часть заряда в широкой области рН. В таблице 26 приведены некоторые детергенты со своими КМК и числами агрегирования. Величина ККМ представляет собой минимальную концентрацию детергента, необходимую для образования мицеллы. Под числом агрегирования понимают число молекул детергента, укладываемых по диаметру мицеллы.

Данные относятся к чистой воде. В буферном растворе значения ККМ ниже, а числа агрегирования больше.

В качестве катионных детергентов в основном находят применение аммонийные соли с гидрофобными алкильными цепочками.

Рис. 73. А) Соотношение между временем миграции и зна чением k'. В) Разделение методом МЭКХ ароматических соединений: буфер: мМ ДДСН в 25 мМ борате, рН 8.5:

капилляр 75 мкм, 50/70 см;

напряжение 20 кВ, детектирование 200 нм;

! формамид (to), 2 - анилин, 3 - фенол, 4 - бензиловый спирт, 5 - бензойная кислота, 6 - бензальдегид, 7 нитробензол, 8 -фенилацетон, бензилцианид, 9 - ацетофенон, 10 - толуол, 11 -хлорбензол, 12 этилбензол+о-ксилол, 13 - нафталин, 14 -суданIII (1мс).

Таблица ККМ и числа агрегирования (nагр) некоторых детвргенгов.

Детергент ККМ (мМ) Nагр Децилсульфат натрия 33 Додецилсульфат натрия 8.2 Тетрадецилсульфат натрия 2.05 Гексадецилсульфат натрия 0.45 Лаурилметилсульфат натрия 8.7 Хелат натрия 13 Дегидрохелат натрия 10 Таурохелат натрия 10 Тауродегидрохелат натрия 6 Децилтриметиламмонийбромид 65 Додецилтриметиламмонийбромид 15 Тетрадецилтриметиламмонийбромид 3.5 Гексадецилтриметиламмонийбромид 0.92 Адсорбция молекул детергента на стенках капилляра приводит к обращению направления ЭОП уже при концентрациях несколько ниже ККМ. Вследствие этого анализируемые вещества движутся к аноду. Электрическое поле в данном случае должно налагаться таким образом, чтобы анод находился со стороны детектора.

Противоион ионного детергента при данной температуре оказывает определенное влияние на ККМ. Например, ДДСН более растворим в воде, чем додецилсульфат калия.

Если в буфере присутствуют ионы калия, это может привести к обмену противоионов, в результате чего растворимость детергента может уменьшиться настолько, что ККМ не будет достигаться.

Разрешающая способность в методе МЭКХ определяется аналогично хроматографическому методу:

С учетом подвижности мицелл получим соотношение для разрешающей способности:

Уравнение описывает зависимость разрешающей способности от факторов N, a, k', to/two. Разрешение растет пропорционально квадратному корню из числа тарелок. Чем больше наложенная разность потенциалов, тем число теоретических тарелок больше до тех пор, пока с увеличением переноса вещества в потоке джоулево тепло вырастет не слишком сильно. Среднее число теоретических тарелок для большинства веществ пробы лежит в пределах от 100 до 200 тысяч. Если эффективность заметно ниже, то это означает, что молекулы пробы адсорбируются на стенках капилляра. В этом случае капилляр следует промыть и условия опыта оптимизировать, например, с помощью изменения рН.

Гидрофобные вещества пробы или анализируемые вещества с большими временами миграции дают, как правило, большее число теоретических тарелок вследствие того, что коэффициент диффузии мицелл меньше, чем для анализируемых веществ в буфере. Число теоретических тарелок несущественно зависит от длины капилляра, однако все же при использовании коротких капилляров вводимый объем должен уменьшаться для того, чтобы избежать уширения пиков, вызванного перегрузкой объема.

Селективность а - важнейший фактор, т.к. за счет селективности можно достичь большого улучшения разрешающей способности. Селективность определяется коэффициентами распределения между подвижной и стационарной фазами и, следовательно, зависит от химических свойств разделяемой системы. На разрешающую способность можно воздействовать как изменением состава буфера, так и выбором другого детергента. Методом МЭКХ без труда можно разделить два вещества пробы, обладающие селективностью 1.02. С ростом величины к' разрешающая способность, обусловленная подвижностью стационарной фазы, растет не постоянно, а проходит через максимум. Эта характерная для МЭКХ зависимость представлена на рис. 74. При постоянной селективности расстояния межу максимумами пиков уменьшаются для маленьких и больших значений k'. С помощью расчетов можно показать, что оптимальное значение k' составляет (tмc/to)1/2.

Рис. 74. Зависимость между селективностью и значением k'.

Как и в хроматографии, в МЭКХ значение k' зависит от коэффициента распределения через соотношение фаз' k'=KVMC/Vaq k- коэффициент распределения, VMC - объем мицеллы, Vaq - оставшийся объем буфера и УмсЛ/aq - представляет собой соотношение фаз. В отличие от хроматографии, соотношение фаз в методе МЭКХ зависит от объема мицелл и, тем самым, от концентрации детергента. Зависимость между k' и концентрацией детергента линейна. Таким образом, если известна величина ККМ, величиной k' можно управлять с помощью концентрации детерегента. В большинстве случаев во избежание слишком больших потоков концентрация детергента лежит в интервале между 20 и 200 мМ.

Линейная зависимость между k' и концентрацией детергента при разделении ароматических соединений показана на рис. 75.

Влияние соотношения фаз на разрешение показано на рис. 76. Рост соотношения фаз приводит сначала к улучшению разрешающей способности, которая однако при дальнейшем увеличении соотношения фаз ухудшается. В представленных хроматограммах речь идет о расчетных величинах, которые делают этот эффект более наглядным. Вследствие того, что повышение концентрации детергента влияет также на ЭОП, вязкость и ионную силу буфера, на практике хроматограммы выглядят иначе.

Рис. 75. Линейная зависимость между k' и концентрацией детергента. Капилляр мкм, 50/57 см, буфер ДДСН в 50 мМ борате, рН 8.5, напряжение 20 кВ.

Интервал времен миграции молекул пробы дается величинами to и tмс. Чем меньше отношение времен миграции tо/tмс, тем больше интервал времен миграции и, тем самым, разрешение. Влияние ЭОП на интервал времен элюирования показан на рис.

77. Уменьшение ЭОП приводит к росту интервала времен элюирования и, тем самым, к росту разрешения пиков. Недостатком, однако, является то, что при уменьшении ЭОП резко возрастает время анализа. На практике уменьшение ЭОП достигается добавлением некоторых органических растворителей, например, метанола или изопропанола (< 20%). Другая возможность уменьшения ЭОП состоит в снижении рН буфера.

Изменение поверхности капилляра, например при нанесении покрытия, представляет собой еще одну возможность влияния на ЭОП. Некоторые добавки, такие как производные метилцеллюлозы или этиленгликоль, применяются в КЭ для увеличения вязкости буфера. Увеличение вязкости приводит не только к уменьшению ЭОП, но влияет в одинаковой степени и на электрофоретическую подвижность.

Следовательно, увеличением вязкости невозможно улучшить разрешающую способность.

Рис. 76. Влияние соотношения фаз на разрешение пиков.

Рис. 77. Влияние ЭОП на разделение.

Увеличение электрофоретической подвижности также может приводить к увеличению интервала времен миграции. Однако этот метод не имеет большого практического значения, т.к. выбором другого детергента можно влиять на селективность. Небольшие изменения селективности могут, особенно при малых а, вызвать большие изменения разрешающей способности. Это, в свою очередь, может свести к нулю и даже обратить эффект повышения разрешения за счет увеличения электрофорети ческой подвижности мицелл.

Ниже более подробно будут рассмотрены факторы, влияющие на селективность.

Рост температуры приводит к уменьшению времени миграции, поскольку как коэффициент распределения, так и вязкость при этом уменьшаются. Вследствие того, что температурные зависимости коэффициентов распределения для каждого компонента пробы различаются, селективность изменяется. Несмотря на то, что изменение температуры не очень сильно влияет на селективность, для воспроизводимости анализов и из-за колебаний времени миграции температура должна поддерживаться постоянной. Условий разделения, вызывающих большие потоки, следует избегать, поскольку большие потоки приводят к нагреванию буфера и капилляра. Поэтому выгодно эффективно охлаждать капилляр.

Молекула детергента состоит из гидрофильной и гидрофобной частей. Вследствие того, что молекулы пробы взаимодействуют с поверхностью мицеллы, гидрофильная группировка (ионная часть) оказывает большее влияние на селективность мицелл. Так, например, ДДСН и тетрадецилсульфат натрия имеют аналогичные свойства, в то время как селективность при переходе от ДДСН к натрий-М-лаурил-М-метилтаурату (НЛМТ) резко изменяется. Предположительно здесь речь идет о полярных веществах пробы.

Изменения селективности могут быть легко достигнуты добавками других детергентов.

Несмотря на то, что МЭКХ обычно применяется для разделения нейтральных со единений, этим методом можно разделять также ионные соединения. В случае ионных соединений МЭКХ в основном применяют там, где разделение не может быть проведено методом КЗЭ. Так как мицеллы заряжены снаружи, на молекулы пробы с тем же знаком заряда, что и мицеллы, будут действовать более сильные силы отталкивания, чем на молекулы пробы с противоположным зарядом. Следовательно, в случае ионных молекул пробы гидрофобность и эффекты заряженности оказывают влияние на коэффициент распределения.

Изменение селективности можно вызвать не только полной заменой детергента, но и модифицированием мицелл. При добавлении второго детергента образуется смешанная мицелла. Мицелла, состоящая из одного ионного и одного неионного детергента, имеет меньший эффективный заряд и больше по размерам. Тем самым оказывается влияние не только на коэффициент распределения – смешанная мицелла имеет меньшую подвижность, чем мицелла, состоящая только из ионного детергента.

Добавление нейтральных веществ к водной фазе также является очень эффективным средством влияния на селективность. Добавки циклодекстринов (ЦД) повышают вероятность нахождения вещества пробы в подвижной фазе, поскольку молекулы пробы могут диффундировать в полости ЦД. Если добавлять к подвижной фазе вещества-образователи ионных пар, можно очень сильно влиять на селективность, особенно по ионным соединениям. Если, например, к раствору ДДСН добавить тетраалкиламмонийную соль, вследствие образования ионных пар увеличивается время миграции анионных молекул пробы. Кроме того, уменьшается электростатическое отталкивание от мицелл. Напротив, времена миграции катионных компонентов пробы уменьшаются, т.к. образователь ионных пар проявляет себя как кон курент во взаимодействии с мицеллами. Высокие концентрации мочевины могут увеличить растворимость гидрофобных веществ пробы в воде.

В МЭКХ можно добавлением мочевины влиять на коэффициент распределения и, как следствие, на селективность. Аналогичные эффекты можно получить добавлением органических модификаторов к водной фазе. Речь идет об органических растворителях, смешиваемых с соответствующим буфером. Однако добавками модификаторов можно влиять не только на полярность подвижной фазы. Это приводит также к изменениям ЭОП и свойств мицелл. Влияние органических модификаторов в МЭКХ представлено на рис. 78.

Рис. 78. Влияние органических модификаторов в МЭКХ.

Селективность можно также улучшить добавлением солей и образованием, тем самым, комплексных соединений.

На примере разделения смеси производных аминокислот флуоренилметилоксикарбонилов (ФМОК) можно показать возможности оптимизирования в методе МЭКХ. На рис. 79 показано разделение 11 ФМОК- аминокислот.

Из-за относительно большого и одинакового для всех проб вклада нейтральных производных электрофоретическая подвижность производных очень схожа и поэтому их полное разделение вряд ли возможно.

Рис. 79. Разделение смеси ФМОК-аминокислот методом КЗЭ.

Капилляр: 50мкм х 50/75 см, буфер:

бора г 50 мМ, рН 9.5:

УФ-детектирование 200 нм;

поле 330 В/см.

Добавлением ДДСН к буферу при прочих равных условиях, как показано на рис. 80, достигается лучшее разделение.

Добавлением органических компонентов к буферу можно еще лучше оптимизировать разделение. На рис. 81 показано разделение проб при идентичных условиях за исключением того, что в данном случае к буферу добавлен метанол. Эта добавка влияет на равновесное распределение пробы между буфером и мицеллой, при этом изменяется также ЭОП и растворимость пробы в буфере.

Рис. 80. Разделение 16 ФМОК аминокислот методом МЭКХ. Иден тификация пиков - в буквенном коде для аминокислот. Буфер: 50 мМ борат, 50мМДДСН, рН 9.5.

Принцип разделения МЭКХ может применяться также в хроматографическом методе с обращением фаз. В качестве примера на рис. 82 показано разделение смеси компонентов взрывчатых веществ, в состав которых обычно входят незаряженные производные нитробензола.

Рис. 81. Разделение 16 ФМОК аминокисдот методом МЭКХ с добавлением метанола к буферу. Буфер: 50мМ борат, 50мМ ДДСН, рН 9.5, об. 10% метанола.

Рис. 82. Разделение компонентов взрывчатых веществ (ароматических нитросоединений). Условия прибор КЭ типа HP 3D СЕ;

капилляр: 50 мкм, 47/55 см, поле:

363 В/ см;

буфер: 2.5 мМ борат, 50 мМ ДДСН, рН 8.7;

ввод пробы электрокинетический 5 кВ, 2 с;

детектирование: ячейка де тектора 150 мкм, 250±20 им;

проба: 2-амино-б-нитротолуол, 2 амино-2,6-нитротолуод, 2 нитротолуол, 3-нитротолуол, 4 нитротолуол, 1,3-динитробензол, 1,2-динитробензол, 2,6 динитротолуол, 2,4 динитротолуол, нитробензол, 2,4,6-тринитротолуол.

11. Разделение энантиомеров Разделение энамтиомеров представляет собой одну из важнейших областей аналитической химии. Хотя энантиомеры и относятся друг к другу как изображение и его зеркальное отражение и не различаются по своим физико-химическом свойствам, один из энантиомеров вращает поляризованный свет направо, в то время как его зеркальное отражение - налево (т.е. они проявляют оптическую активность). Смесь эквимолярных количеств пары энантиомеров не проявляет оптической активности, поскольку направления вращения света противоположны.

Если смесь энантиомеров, которую необходимо разделить, добавить к оптически активной среде, состоящей из чистого энантиомера, то в разделяющей системе поведение анализируемых веществ будет очень различным, что позволяет осуществить их разделение. Различное поведение можно объяснить тем, что в оптически активной среде с оптически активным окружением взаимодействует только один из энамтиомеров, в то время как его зеркальное отражение не взаимодействует. Если различие во взаимодействиях достаточно велико, смесь энамтиомеров разделяется на чистые компоненты.

Поэтому при разделении эмантиомеров основное внимание следует уделять выбору подходящей оптически активной среды - так называемого хиральмого селектора (см.

таблицу 27). Поскольку универсальных хиральных селекторов не существует и проблемы разделения каждый раз необходимо оптимизировать по-новому, основная задача разделения эмантиомеров заключается в выборе подходящего селектора.

В КЭ оптически активная среда обычно создается добавками оптически активных веществ к разделяющему буферу. Этот простой способ обладает большим преимуществом, поскольку в этом случае отпадает необходимость в длительных и требующих интенсивной работы стадиях иммобилизации хиральмых селекторов на различных носителях. Поиск хирального селектора происходит, как и в ВЭЖХ, методом "проб и ошибок". Основным недостатком КЭ в разделении эмантиомеров является чисто аналитическая направленность. Для решения препаративных задач метод малопригоден.

Рис. 83. Схемы замещения на центре хиральности. А, В, X, Y: различные замещения на одном центре хиральности (асимметричный атом углерода).

Таблица Хиральные селекторы, применяемые в настоящее время в КЭ Классы селекторов Хиральные селекторы Проблемы ЦД а-,Ь-,g-ЦД, метилированные ЦД Добавляются пре имущественно к ароматическим Гидроксипропилирован-ныеЦД или частично гидрофобным Карбоксиметилирован-ные ЦД пробам Карбоксиэтилирован-ные ЦД Суцилинированные ЦД Фосфатированные ЦД Сульфобутилэфирные ЦД Хиральный ДДСН- дигитонин ДДСН-SDVal До настоящего времени имеет мицеллообразователь ДДСН-SDAIa ограниченное применение (часто добавляется Тауродезоксихолат вместе с ДДСН в Дезоксихолат Хиральные Медно-Ь-гистидимовые До настоящего времени металлические комплексы применяли только для комплексы дансиламинокислот;

Медyо-аспартамовые флуоресцентное комплексы детектирование Хиральный краун- 18-краун-б-тетракарбоксиловые Высокая цена, имеет эфир кислоты ограниченное применение Чистые энантиомеры L-винная кислота До настоящего времени использовалась только для разделения хиральных комплексов Белки и глюкобелки Альбумин, полученный из Проблемы с детектированием, крупного рогатого скота связанные с собственной адсорбцией 11.2. Смешанные химические разделяющие системы Вышеназванные хиральмые селекторы часто применяются не сами по себе, а вместе с другими буферными добавками. Используются в основном такие мицеллообразователи, как ДДСН, который наряду с хиральным селектором образует вторую разделяющую систему. Ниже приводится краткий анализ некоторых таких комбинаций.

1) ДДСН-ЦД. Из смешанных методов этот вариант наиболее распространен.

Мицеллярная система в данном случае отвечает за разделение отдельных компонентов пробы, а ЦД в качестве хирального селектора - за разделение компонентов пробы в чистых онантиомерах. Однако, при применении детергентов вместе с ЦД часто наблюдается их отрицательное влияние. Детергенты с длинными алкановыми це почками могут внедряться внутрь ЦД-колец и препятствовать воздействию хирального селектора.

2) Добавка второго хирального селектора, В этом методе в буферной системе находятся два различных хиральных селектора. Однако этот способ до настоящего времени только в отдельных случаях приводил к улучшению разрешения при разделении энантиомеров. Например, комбинация хирального краун-эфира с ЦД для некоторых проб проявляет синергический эффект. Иногда к улучшению селективности приводит также использование двух различных ЦД в одной буферной системе. Однако, в общем случае введение второго селектора и, таким образом, второй равновесной системы в буфер приводит к потере селективности.

3) Смешанные мицеллообразующие системы. Использование чистых хиральных детергентов в качестве мицеллобразователей во многих случаях приводит к плохому разрешению из-за несимметричности пиков и плохой эффективности. Добавление ДДСН как добавочного мицеллообразователя в некоторых случаях разделения приводило к улучшению формы пика и, тем самым, к лучшему разрешению. Смешанные мицеллы, образующиеся при добавлении ДДСН, сами ускоряют обменные процессы в мицеллах и уменьшают взаимодействия с хиральным селектором (эффект разбавления).

Поскольку в настоящее время ЦД и их производные обладают наиболее широким спектром применения в качестве хиральных селекторов, а также наибольшими перспективами в КЭ, остановимся на них более подробно.

Реакции, в результате которых получаются производные ЦД, позволяют проводить синтез множества новых хиральных селекторов с существенно разным воздействием на хиральные различия между селектором и анализируемым веществом. В общем случае за хиральные отличительные свойства отвечают гидрофобные и ионные взаимодей ствия, а также стерические эффекты и образование мостиковых водородных связей.

Было показано, что при разделении энантиомеров важную роль наряду с выбором подходящего хирального селектора играют и другие параметры электрофоретической системы, которые требуют дальнейшей оптимизации. Например, на процесс оптимизации разделения энантиомеров решающее влияние оказывает величина рН.

Вследствие того, что разделение энантиомеров методом КЭ основано на различии в подвижностях между D- и L-формами, анализируемые вещества необходимо перевести в ионную форму, что обеспечивается подходящим значением рН. При электрофоретическом движении анализируемых веществ через "квазистациомарную" фазу (в данном случае - ЦД) происходит разделение пары энантиомеров. Важнейшими оптимизирующими параметрами в данном случае являются концентрация хирального селектора в используемой буферной системе, сама буферная система (вид фонового электролита), а также другие буферные добавки, такие как ДДСН, метанол и др. Их действие на разделение энантиомеров будет рассмотрено ниже.

11.3. Капилляры с ЭОП и без него Как правило, проблемой в разделении энантиомеров является невысокая селективность и, вследствие этого, длительные времена анализов, даже в случае, когда найдем подходящий хиральный селектор для разделения. Причиной этого являются небольшие различия в подвижностях D- и L-форм анализируемых веществ, а также наличие сильного ЭОП, который перекрывает эффект разделения в немоди фицированных капиллярах. Небольшие различия в подвижностях приводят к разделению только в тех случаях, когда эффективные участки движения максимальны.

Это означает, что анализируемое вещество в электрическом поле должно двигаться от точки ввода до детектора самостоятельно. Наличие ЭОП в данном случае мешает разрешению. Для достижения максимального разрешения по возможности за короткое время покрытые (модифицированные) капилляры используются при сильно заторможенном ЭОП. При этом можно использовать очень короткие капилляры (7- см) и сильные электрические поля (до 1000 В/см). При использовании подходящего хирального селектора это приводит к очень малым временам анализа при высоком разрешении. Различие между немодифицированным и покрытым капилляром про демонстрировано на рис. 84.

Заметно более высокая эффективность для непокрытого капилляра основана на том, что ЭОП перекрывает подвижность анализируемых веществ, и они очень быстро проходят через детектор. Здесь ясно видно, что более высокая производительность за более короткое время при разделении достигается при применении покрытого капил ляра. Использование покрытого капилляра в выборе подходящего хирального селектора играет большую роль, так как в данном случае можно много быстрее определить применимость данного селектора, т.е. его селективность.

11.4. Выбор подходящего LLQ При использовании ЦД в качестве хиральных селекторов решающее влияние на селективность оказывает не только тип ЦД, но и тип заместителя в производных ЦД.

Растворимость ЦД в воде также может резко увеличиться при применении производных.

Это показано для тестовой смеси различных типов ЦД и их производных на рис. 85.

Рис. 84. Разделение энантиомеров гексабарбитала в капилляре с покрытием (А) и без покрытия (В). Условия разделения: 0.1 М TEE, рН 8.3, детектирование при 214 нм;

ввод пробы: 1 с, 2 кВ, об. 1.56%р ЦД, t=25°C. А) Покрытие капилляра: 4% линейный полиакриламид, Е=710 В/см (выход заземлен), L=7/27 см. В) Капилляр без покрытия, Е=400В/см. Ь=50/57см.

11.5. Оптимизация концентрации ЦД Следующая важная составная часть оптимизации состоит в установлении подходящей концентрации ЦД. В зависимости от типа анализируемых веществ с ростом концентрации ЦД могут наблюдаться улучшение разрешения, потеря или даже инверсия разрешения. Это может приводить к неправильным выводам о различных механизмах разделения энантиомеров с помощью ЦД. На рис. 86 показано влияние концентрации ЦД на разделение энантиомеров.

Рис. 85. Разделительный потенциал различных типов ЦД.

Условия разделения: L=50/57 см, Е= 350 В/см, буфер: 0.1 М ТВЕ, рН 8.3;

детектирование при 214 нм, об.

1.5% ЦД;

пробы: 1 - d,1 гексабарбитал, 2 - (!,1-дансил фенидалании;

А) -ЦД, В) гидроксилропил - -ЦД, С) метил - -ЦД, D) гидроксипропил--ЦД.

В немодифицированной с помощью ЦД буферной системе отрицательно заряженные энантиомеры обладают высокой подвижностью относительно ЭОП, так как они без сопротивления могут проходить сквозь буфер (нижняя электрофореграмма)..

Уже небольшие добавки хирального селектора вызывают сильное уменьшение подвижности анализируемых веществ, причем в этом случае наблюдается вполне Достаточная селективность. Разделение при очень низких концентрациях ЦД объясняется различным временем пребывания D- и L-форм в ЦД. Энантиомер с большим временем пребывания в ЦД проявляет меньшую подвижность и детектируется ближе к ЭОП.

Дальнейший рост концентрации хирального селектора может резко ограничить подвижность анализируемых веществ, так что они ;

Детектируются очень близко к ЭОП.

В этом случае из-за слишком малой зоны движения разделение энантиомеров может стать невозможным. Кроме того, при повышении концентрации ЦД растет вязкость буфера, что замедляет ЭОП и увеличивает время анализов. В капиллярах с заторможенным ЭОП рост концентрации ЦД также приводит к уменьшению подвижности анализируемых веществ, повышению вязкости буферной системы и, вследствие этого, к увеличению времени анализов.

Наряду с уменьшением разрешения вследствие небольшого времени пребывания в капилляре при высоких концентрациях ЦД могут наблюдаться также и другие эффекты.

В некоторых случаях оказывается, что уже при очень низких концентрациях ЦД наблюдается хорошее разделение пар энантиомеров (разрешение больше 1.5). Однако, при более высоких концентрациях хирального селектора (об. 4 - 10 %) разрешение снова падает. При более высоких концентрациях ЦД время пребывания D- и L-форм анализируемых веществ в ЦД увеличивается, однако разность этих времен постоянно уменьшается.

Тем самым, разрешение пиков при разделении в этой системе уменьшается или даже совершенно исчезает. Экстремальный случай оптимизации концентрации ЦД приведен на рис. 87.

При очень низких концентрациях хирального селектора в системе достигается хорошая селективность. Если повысить концентрацию, разрешение полностью исчезает и снова появляется при очень высоких концентрациях ЦД. Это показано на рис. 88, где представлены зависимости относительных времен миграции от концентрации ЦД.

Хорошо видно, что относительная миграция с ростом концентрации ЦД резко падает и примерно при об. 6% достигает минимума. В этой области разрешение зависит только от различия времен нахождения D- и L-форм в ЦД. При концентрациях больше об. 6% подвижность анализируемых веществ практически не изменяется. Следует отметить, что разрешение снова возрастает при концентрациях ЦД больше об. 12%. Это можно объяснить только тем, что при высоких концентрациях образуются диастереомерные комплексы между ЦД и анализируемым веществом. Диастереомеры по своей природе проявляют различные физические свойства, и поэтому их можно разделить. Из-за различия механизмов разделения в начале и конце кривых последовательность выхода энантиомеров неизбежно обращается.

11.6. Оптимизация значений рН Значение рН в КЭ является одним из важнейших параметров оптимизации. С помощью значений рН можно не только воздействовать на ЭОП, но и перевести анализируемые вещества в определенную ионную форму. Из этого вытекают различные электрофоретические подвижности, которые приводят затем к разделению анализируемых веществ. Если используются незаряженные ЦД, пара энантиомеров при определенном рН должна иметь такую собственную подвижность, чтобы смогла пройти сквозь псевдостационарную фазу (в данном случае - ЦД).

Рис. 86. Влияние концентрации гидроксипропил - р-ЦЦ на разрешение пиков при разделении производных дигидропириди-на. Условия разделения: L=50/57 см, Е= В/см;

буфер: 0.1 М Т BE, рН 8.3, различные концентрации ЦД, детектирование при 214 нм.

На рис. 89 в качестве примера представлена зависимость разделения рацемированной смеси от значения рН. При низких значениях рН анализируемые вещества практически не обладают собственной подвижностью и проходят через детектор со скоростями, близкими к ЭОП, не разделяясь. Из рис. 89 также видно, что при низких значениях рН ЭОП очень мал.

Рис. 87. Изменение последовательности выхода энантиомеров при различных концентрациях ЦД. Условия разделения (слева):

L=50/57 см, Е=350 В/см, 20 мМ фосфатный буфер, рН 7.7 с об. 0.5 % гидроксипропил- ЦД. (Справа): L=80/87см, Е= В/см, 20 мМ фосфатный буфер, рН 7.0 с об. 15% гидроксипропил--ЦД;

детектирование при 214 нм.

При средних значениях рН анализируемые вещества обладают достаточно высокой собственной подвижностью, так что в этом случае различие в подвижности между D- и L-формами может привести к переносу. Анализируемые вещества в данном случае должны пройти достаточно большой эффективный участок пути в капилляре. Потеря разрешения при высоких значениях рН часто объясняется тем, что очень высокий ЭОП не дает достаточно времени анализируемым веществам для разделения в капилляре.

Высокий ЭОП приводит к слишком коротким временам пребывания анализируемых веществ в капилляре. При очень высоких значениях рН ЦД сами могут депротонироватъся, из-за чего селективность снова изменяется. Если ЦД имеет одинаковый заряд с анализируемыми веществами, из-за электростатического отталкивания хиральные отличительные черты теряются.

Рис. 88. Зависимость относительных времен миграции D- и L-дансил фенилаланина от концентрации гидроксипропил - р-ЦД.

11.7. Оптимизация фоновых электролитов После выбора подходящего хирального селектора и оптимального значения рН следует оптимизировать также ионный состав разделяющего буфера. Как показано на рис. 90, подвижность буферных ионов влияет на форму пика и разрешение анализируемых веществ.

Во всех трех случаях выдерживались одинаковые условия ввода пробы, и все условия разделения, за исключением буферных ионов, поддерживались одинаковыми.

Ясно видно, что в случае применения в качестве буфера лимонной кислоты получается лучшее разрешение и, как следствие, более высокая эффективность разделения. Это приводит также к большей чувствительности системы. Этот пример показывает, что и при низких значениях а путем улучшения эффективности можно достичь достаточного хорошего разрешения анализируемых веществ.

Рис. 89. Влияние значений рН на разделение производных дигидро-пиридииа. Условия разделения: L=50/57см, Е= В/см, буфер: 20 мМ фосфат, об.

0.4 % гидроксипропил--ЦД, раз личные значения рН;

детектирование при 214 нм.

11.8. Буферные добавки Наряду с уже описанными параметрами определяющее влияние на разделительную способность хирального селектора могут оказывать многие добавки к разделяющему буферу. Однако заранее невозможно предсказать, может ли добавка таких компонентов, как органические растворители, комплексообразующие средства, детергенты и т.д., привести к улучшению или исчезновению разделения.

В некоторых публикациях предпринята попытка представить модель такого поведения. В нижеописанном уравнении приведены основные факторы, влияющие на различия подвижностей.

Рис. 90. Влияние фонового электролита на форму и разрешение пиков. Условия разделения: L=20/27 см, покрытие полиакриламидное, Е=370 В/см (выход заземлен), об. 0.3% гидроксипропил--ЦД, детектирование при 214 нм, пробы: дансил-фенилаланин (1), производное дигидропиридина (2).А) 10 мМ лимонная кислота, рН 6.0. В) 25 мМ MES/Трис, рН 6.0. С) 20 мМ фосфатный буфер, рН 6.0.

[С](µ1 - µ2 )(KB - K ) A µ = 1+[C](K + KB + K KB[C]) A A Здесь µ - разность подвижностей энантиомеров, µ1 - подвижности энантаомера 1 или 2 в свободном растворе, µ2 - подвижности комплексов "энантиомер-ЦД", [С] - коцентрация хирального детектора, Ка, Кв - констаны равновесия между энантиомером А или В и ЦД.

Разность подвижностей и, соответственно, селективность зависят в основном от концентрации ЦД, констант равновесия между анализируемыми веществами и хиральным селектором и разности подвижностей в комплексном и некомплексном состояниях анализируемых веществ. Из вышесказанного следует, что при постоянной концентрации ЦД добавка органического компонента к буферу может изменить константу равновесия в положительную (улучшение разрешения) или отрицательную (потеря разрешения) сторону. Характер изменения зависит в основном от концентрации ЦД.

На рис.91 представлено влияние мочевины, метанола и ДДСН на время миграции, проявление пика и разрешение. Для буферного раствора, насыщенного -ЦД (об.

1.56%), в данном примере наблюдается наиболее быстрое время миграции (А).

Рис. 91. Влияние буферных добавок на разделение энантиомеpoв. Условия разделения: L:::40/47 см, Е=232 В/см, (анод на стороне детектора), капилляр с покрытием (4% линейный полиакриламид), детектирование при 214 нм;

буфер: 0,1 M ТВЕ, рН 8.3, добавки-.А) об. 1.56% -ЦД.В) об. 12% ЦД, 7 М мочевина, 0.1% ДДСН.С) об. 12% -ЦД, 7 М мочевина, 10% метанол, 0.1 М ДДСН,D) об. 12% -ЦД, 7 М мочевина.Е) об. 12% -ЦД, М мочевина, 10% метанол.

С помощью добавки раствора 7 М мочевины можно поднять концентрацию ЦД (случай D). Однако, в данном случае время анализов заметно растет вследствие увеличения вязкости буфера и низкой подвижности анализируемых веществ, обусловленной высокой концентрацией хирального селектора.

При этом улучшения разрешения не наблюдается. В данном случае положительное влияние оказывает добавка метанола (Е). Время миграции при этом несколько возрастает, однако достигается лучшее разрешение. Если использовать буфер, соответствующий случаю D, вместе с 0.1 М ДДСН, время миграции резко уменьшается (случай В). Это объясняется тем, что в данных условиях ДДСН и анализируемые вещества движутся в одном направлении (оба анионные), тем самым создается синергический эффект. Разрешение по сравнению со случаем (D) резко улучшается, а время анализов уменьшается. И в этом случае добавка метанола в буферную систему приводит к увеличению времени анализов, однако улучшения разрешения не наблюдается (случай С). В рассматриваемых здесь случаях улучшение разрешения определяется в основном более высокой эффективностью конкретной разделяющей среды. Значения а в этих примерах практически не изменяются.

12. Капиллярный гепь-эпектрофорез Сильный подъем в применении КЭ, особенно КГЭ, а также появление в продаже промышленных приборов связаны с американским проектом "Геном человека". С помощью метода КГЭ практически полностью были разделены молекулы ДНК в реакции определения последовательности нуклеотидов ДНК или остаточных фрагментов. Из применяемых типов гелей в классическом планарном гелевом электрофорезе в капиллярах в качестве матриц применяют в основном акриламид, агарозу и целлюлозу.

Эти гели очень сильно различаются по своим физическим свойствам, таким как вязкость, стабильность в электрическом поле, пористая структура и размер пор.

Применение гелей в электрофорезе основано на том, что биополимеры с точки зрения зарядов являются полианионами или поликатионами с одинаковыми поверхностями, поэтому разделение в постоянном электрическом поле без дополнительных вспомогательных средств становится невозможным. Поскольку эти биополимеры в самом деле резко различаются по своим размерам, добавка некоторого геля может сильнее влиять на подвижность полимера с большими размерами молекул.

Это приводит впоследствии к разделению молекул по размерам, т.е. по растущим ММ.

Основной областью применения гелевого электрофореза является разделение молекул ДНК, а также разделение белков, которые подвергаются денатурированию в растворе ДДСН. Кроме того, гели в классическом электрофорезе применяются обычно в качестве стабилизаторов, хотя и не дающих вклад в разделение.

Ниже будут рассмотрены некоторые типы гелей и показаны основные области их применения в КЭ.

12.1. Гели на основе акриламида В общем случае различаются гели, обладающие определенной степенью поперечной сшивки (поперечносшитые гели), состоящие из двух мономеров, и гели, состоящие только из одного мономера (линейные гели). Последние сплетены только из линейных полимерных цепочек, и их связи основаны только на физическом взаимодействии (физические гели). Поперечносшитые гели, в отличие от линейных, состоят из отдельных полимерных цепочек, поперечно связанных друг с другом и, тем самым, обладают более жесткой структурой (химические гели), поскольку между волокнами существуют ковалент-ные связи. К тому же эти гели содержат в достаточном количестве поры определенного размера, что обеспечивает их высокую раздели тельную способность.

На рис. 92 представлены структуры применяемых радикалов-стартеров и мономеров, а также схематический разрез гелевой структуры. Сравнение "линейного" и "сшитого" полиакриламидов представлено на рис. 93.

12.1.1. Поперечносшитые полиакрипамидные гепи Важнейшей предпосылкой применения геля (в классическом смысле) в капилляре является полное исключение ЭОП.

Если это условие не выполняется в достаточной степени, гель вымывается из капилляра наружу, и разделение ставновится невозможным. Регулирование ЭОП достигается нанесением слоя или химическим модифицированием капилляра, которые уже подробно рассматривались в разделе о способах нанесения покрытий капилляров.

За то время, когда раствор мономера смешивают с радикалом-стартером и катализатором и быстро заполняют капилляр, гель в капилляре полимеризуется.

В некоторых случаях покрытия стенок капилляра, например, виниловыми группировками, гель при полимеризации в капилляре может сшиваться с нанесенным поверхностным слоем. Этот способ дает высокую целостность покрытия капилляра и, как следствие, приводит к очень высокой эффективности. Используя этот метод с применением поперечносшитых и связанных со стенкой капилляра ковалентными сила ми гелей, удалось получить наивысшие эффективности в КЭ (30 млн. теоретических тарелок на метр).

Рис. 92. Структура мономера - акриламидного геля с разрезом гелевой структуры.

Показаны также структуры радикалов-стартеров.

Рис. 93. Схема структуры линейного и поперечносшитого полиакриламидов.

Селективность гелей можно изменять с помощью выбора отношения концентрации наносимого мономера (%Т) к концентрации сшивающего агента (% С).

Свойства поперечносшитых гелей на полиамидной основе приведены в таблице 28.

Таблица 28.

Области применения поперечносшитых полиакриламидных гелей.

Концентрация Свойства Область применения мономера Различные Жесткий гель, нетекучий, Реакции определения соотношения % Т и % С замена невозможна последовательности в геле для управления нуклеотидов в ДНК селективностью Чувствителен к температуре Анализ олигонуклеотидов Стационарно связан в Гиалуроновые кислоты капилляре Олигосахариды Высокая целостность покрытия капилляра ДДСН-белковые комплексы Однако, перечисленные гели имеют некоторые недостатки:

- во время хранения капилляров, заполненных такими гелями (в отсутствие смачивания концов капилляра буфером) гель на концах капилляра может высохнуть, и, таким образом, капилляр становится непригодным для дальнейшей работы, - обмен в среде буфера в капилляре невозможен или требует длительного времени, - термостабильность такого рода гелей недостаточна. Растворенные газообразные компоненты буфера при высоких температурах образуют пузыри в капилляре. Похожий эффект наблюдается также в сильных полях (>500 В/см). Образование воздушных пузырей в капилляре, заполненном гелем, всегда приводит к локальным нарушениям геля и непригодности капилляра, - поскольку для разделения применяют всегда один и тот же гель, неизбежны явления старения, вызванные "обескровливанием" геля. По сравнению с этим в классическом гелевом электрофорезе применяют всегда только одну зарядку гелем на один анализ, что может устранить этот эффект, - изготовление самодельных капилляров (как было принято) требовало многих "ноу хау" при модифицировании поверхности и, особенно, при проведении полимеризации в капилляре.

Эти проблемы стали причиной того, что попытки промышленного выпуска таких капилляров потерпели неудачу. На рис. 94 в качестве примера показана огромная производительность при разделении олигонуклеотидов таким поперечносшитым полиакриламидным гелем.

Рис. 94. Разделение поли(уридин 5'фосфата). УСЛОВИЯ разделения:

L=45, E=300 В/см, буфер: O.I M Тряс, 0.25 М борная кислота, 7М мочевина, 6% Т, 5"/о С, полиакриламид, детектирование при 260 нм.

12.1.2. Линейные полиакриамидные цепи.

Вышеописанные проблемы в основном преодолеваются при применении в капиллярах несшитых гелей. Свойства этих гелей при их использовании в капиллярах сильно зависят от концентрации мономера. В таблице 29 приведены свойства и основные области применения несшитых полиакриламидных гелей.

Таблица 29.

Области применения и свойства линейных полиакриламидных гелей различной концентрации.

Чистые акриламидные гели (Линейные, не поперечносшитые полиакриламидные гели) Концентрация Свойства Область применения мономера (об. % Т) 0-6 Жидкий. Замена после Остаточные фрагменты ДНК каждого анализа 6 -9 Высоковязкий Остаточные фрагменты ДНК (еще летучий) Замена под высоким Анализ последовательности нук давлением после каждого леотидов в ДНК анализа Олигонуклеотиды ДДСН-белковые комплексы 9- 12 Желати мообразный Анализ последовательности ДНК жесткий гель, уже нетекучий Олигонуклеотиды ДДСН-белковые комплексы При низких концентрациях мономера акриламида уже нельзя говорить о геле в обычном смысле этого слова, поскольку до концентрации примерно 4% Т имеет место только жидкий, хорошо текучий высокомолекулярный раствор полимера. Эти полимерные растворы можно назвать также "жидкими гелями", "полимерными матрицами" или "буфером с ситовыми свойствами". Такие растворы можно вводить в капилляр под давлением, под которым они находятся в сосуде с буфером. Это делает возможной легкую замену "жидких гелей" в капилляре после каждого анализа. Тем самым, перед каждым разделением будет иметься в распоряжении свежая, ненапряженная разделительная матрица, что отражается положительно на стабильности метода и результатах анализа. Таким образом, в данном случае обра зование пузырей и высыхание капилляра исключаются. Это показано на рис. 95, где приведены данные после 400 анализов, показывающие, что капилляр все еще работоспособен.

Для достижения высокой эффективности и селективности и в этом случае следует останавливать ЭОП. Любой поток внутри капилляра уменьшает эффективность разделения. Следует также упомянуть, что в случае применения этих гелей возможна также работа с капиллярами без покрытия. В общем случае разрешение будет хуже, причем разделение начинается при достаточно высоких ММ. В покрытых капиллярах разделяются вещества с достаточно длинными цепочками.

Рис. 95. Тест на стабильность капилляра, покрытого линейным по лиакриламидом (ЛПА).

Условия разделения: L=30/ см, Е=300 В/см, температура 30 С, 3% Т, 0% С, ЛПА, 0.1 М ТВЕ, рН 8.3. Проба: Phi Х 174 RFДНК Нае III;

А - 1-ый, В 144-ый, С - 344-ый, D - 420-ый опыты.

На рис. 96 показано разделение остаточных фрагментов в капилляре, покрытом линейным гелем (3% Т, 0% С). Поскольку все фрагменты присутствуют в эквимолярных соотношениях, но большие фрагменты обладают большим числом адсорбционных центров, с ростом длины цепочек растет и площадь пиков. По этой причине маленькие фрагменты дают маленькие пики и, вследствие малого сопротивления миграции в геле, на фореграммах проявляются в первую очередь. Нумерация фрагментов ДНК в данном случае проводилась в предположении роста молекулярных размеров. Число ступеней разделения здесь равно примерно 600 тысячам теоретических тарелок на метр. При таких высоких числах ступеней разделения капилляры желательно располагать в горизонтальном положении, поскольку поворот капилляра может привести к потере эффективности. Эти потери эффективности, зависящие от расположения капилляра, наблюдаются в КЭ при очень высоких эффективностях ( > 1 млн. теоретических тарелок).

Рис. 96. Разделение остаточных фрагментов ДНК в капилляре, покрытом ЛПА. Условия разделения: L=40/47см, Е= В/см, 1=50 0С. Буфер: 0.1 М ТВЕ, рН 8.3, 3% Т, 0% С ЛПА, пробы:

pBR 322 MSP I, pBR 322 Hae III, детектирование: 254 нм.

Большое влияние на селективность и эффективность оказывает также температура. Вообще эффективность падает с ростом температуры, однако для фрагментов некоторых размеров может достигаться лучшее разрешение, что обусловлено улучшающейся селективностью.

Влияние температуры, напряженности поля, пористой структуры геля и буферных добавок на селективность и последовательность миграции анализируемых веществ будет рассматриваться в дальнейшем при обсуждении моделей миграции.

В случае более высоких концентраций мономера растворы полимера становятся высоковязкими, поэтому начиная с концентрации 8% их следует полимеризовать в капилляре. Селективность этих высокомолекулярных линейных гелей (например 12% Т) схожа с селективностью поперечносшитых гелей, которые всегда следует полимеризовать в капиллярах. Поскольку, однако, в таких гелях не образуются ковалентные связи цепочек между собой, а также со стенками капилляров, сильное напряжение геля не приводит к разрушению его структуры. Эта незафиксированность цепочек в геле придает полимеру большую гибкость и, вследствие этого, повышает его продолжительность жизни. На рис. 97 представлено разделение олигонуклеотидного стандарта в покрытом капилляре, заполненном 12% Т ЛПА.

Рис. 97. Разделение смеси полидеоксиаденозииа (pd (A) 40-60) с олигонуклеотидами в капилляре, заполненном гелем 12 % Т, 0% С. Условия разделения: L=30/37 см, Е=300 В/ см;

буфер: 0.1 М ТВЕ, 7 М мочевина, рН 8.3.

Эти гели находят применение также в определении последовательности нуклеотидов в ДНК, причем для детектирования в данном случае применяют лазерно индуцируемую флуоресценцию. Гели непроницаемы для УФ-лучей с длиной волны меньше 250 нм. Кроме того, поскольку в распоряжении имеются очень малые пробы, в данном случае требуется очень высокая чувствительность детектора. Граница определения в данном случае составляет примерно 10-11 М.

12.1.3. Полиакриламидный гелевый электрофорез белков с ДДСН КГЭ применялся почти исключительно для разделения молекул ДНК, поскольку чувствительное определение белков в гельзаполненных капиллярах невозможно из-за поглощения самого полиакриламида в области относительно коротких УФ-лучей (< нм). Взаимодействия белков с гелями также могут играть определенную роль, так что до настоящего времени в гельзаполненных капиллярах описано только успешное разделение белков, денатурированных ДДСН.

Обычно белки соответственно своим значениям р1 обладают различным зарядом молекул, на этом основано их разделение при применении нормальных буферных систем в условиях, исключающих денатурацию. Для достижения разделения по ММ белки должны обладать одинаковым отношением заряда к поверхности. В этом случае возможно разделение в геле по молекулярным размерам или ММ.

Белки полностью денатурируются в избытке ДДСН и 2-меркаптоэтанола (разрушение бисульфидных мостиков). Возникающие цепочки полипептидов связывают независимо от своих размеров и структуры постоянное количество ДДСН (1,4 г ДДСН/1 г белка). Поскольку ДДСН гасит заряды белково-детергентных комплексов, все белки, обработанные таким способом, будут иметь одинаковые соотношения зарядов на единицу массы. Из этого следует, что подвижность в буферной среде без "ситовых свойств" будет однородна. Если использовать теперь гель, то измеряемая подвижность анализируемых веществ будет пропорциональна эффективным ионным радиусам и, следовательно, ММ этих веществ (цепочек полипептидов). Из линейной зависимости между логарифмом ММ и временем миграции можно определить ММ белка. На рис. показано разделение ДДСН белкового стандарта с высокой ММ.

Таким образом, полиакриламидный гелевый электрофорез с ДДСН представляет собой метод, альтернативный методу ИЭФ и применяется также в классическом 20 электрофорезе (ИЭФ, совмещенный с ДДСН-ПААГ-электрофорезом) в качестве высокоразрешающего способа разделения.

Рис. 98. Разделение белков большой ММ в поперечносшитом полиакриламидным геле. Условия разделения: L=20 см (эффективная), Е=180 В/см, буфер: 0.12 М Трис, 0.12 М гистидин, рН 8.8, 0.1 МДДСН, 1% 2-пропанол, 5% Т, 1% С, полиакриламид. Проба: 1 - овальбумин, 2 - альбумин крупного рогатого скота, 3 - бета-галактозидаза, 4 - миозин.

12.2. Гепи на основе пописахаридов и других полимеров В КГЭ в качестве разделяющей среды наряду с полиакриламидными гелями применяют ряд других водорастворимых полимеров. В таблице 30 приведены используемые до настоящего времени полимеры и основные области их применения.

Таблица 30.

Полимеры, применяемые наряду с акриламидами для разделения в КГЭ.

Типы гелей Используемые материалы Применение Агарозные гели Агароза (в широких пределах) Остаточные фрагменты ДНК (до 1300 основных пар), ДДСН белковые комплексы Целлюлозные гели Гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ) Остаточные фрагменты ДНК (SeaPlaque, SeaPrep) (до -12000 основных пар) (различные концентрации) Метилцеллюлоза (0,5 %) Остаточные фрагменты ДНК (до -20000 основных пар) Декстраны Декстраны различной ДДСН-белковые комплексы концентрации (ММ 10000- 2000000) ПЭГ ПЭГ различной концентрации ДДСН-белковые комплексы (ММ 1000000) Основным преимуществом этих разделительных матриц является их УФ проницаемость в области длин волн ниже 260 нм. Низкая токсичность этих полимеров по сравнению с мономером акриламидом упрощает работу с этими растворами и их хранение. К тому же эти полимеры при применяемых концентрациях менее вязки, так что может проводиться их замена после каждого анализа. Однако, для некоторых длин ДНК они дают меньшую разрешающую способность, чем акриламидные гели. Эти гели очень выгодно применять для разделения ДДСН-белковых комплексов, т.к. в данном случае их можно детектировать с большой чувствительностью при относительно коротких длинах волн (214 нм). В этом случае следует дополнительно оптимизировать выбор некоторых буферных сред, не поглощающих в УФ-области На рис. представлено разделение стандартного ДДСН-белкового комплекса в растворе декстрана, прозрачном по отношению к УФ-лучам. Три разделения показывают воспроизводимость при замене полимерных растворов в капилляре.

Различия между этими полимерными матрицами заключаются в основном в пористой структуре. Размеры пор и упругость встроенных в гель полимерных цепочек оказывают значительное влияние на работоспособность при разделении по молекулярным размерам. На рис. 100 представлена структура агарозного геля и ее формирование из мономерных волокон (слева). Гидроксиэтилагароза (рис. 100, справа) обладает сильно измененной структурой. Образование сдвоенной структуры приводит к сужению пор, и такой гель лучше применять для биополимеров с меньшими размерами.

РИС. 99. Разделение ДДСН бедковых комплексов и стабильность капилляра при замене декстранового полимерного раствора.

Условия разделения: L=30 см (эффективная), Е=300 В/см, буфер: 0.06 М 2-амино 2метил=1-3 пропандиод/какодидовая кислота, рН 8.8, 0.1% ДДСН, об. 10% декстраи (ММ 2000000), детектирование:

214 им.

Рис. 100. Формирование агарозного геля и образование сдвоенной структуры. Слева - регулярная агароза, справа - гидрокси-этилагароза.

12.3. Модели миграции биополимеров в полимерных растворах Поскольку подвижности молекул ДНК различных размеров в свободных растворах из-за одинаковых соотношений поверхность/заряд не различаются, разделение по молекулярным размерам может не достигаться. Это делает необходимым применять среду с ситовыми свойствами. Ситовые свойства в простейшем смысле описываются взаимодействиями молекул анализируемых веществ с волокнами разделяющего полимера (геля).

В зависимости от размеров пор и длин биополимеров между полимерными волокнами имеют место различные конформации анализируемых веществ. Эти конформации отвечают за различные подвижности и возникающие нерегулярности.

Ясно, что молекулы в компактной или разреженной конформациях обладают подвижностью, отличной, например, от подвижности молекул вытянутой формы.

Конформации можно наблюдать с помощью лазерной флуоресцентной микроскопии.

Для различных взаимодействий молекул ДНК обсуждаются различные механизмы разделения. Сила взаимодействия с полимерной матрицей больше для больших молекул ДНК, на этом и основано разделение по молекулярным размерам. В зависимости от конформации и размеров молекул анализируемых веществ (биополимеров), а также от пористой структуры полимерного раствора (геля) можно придти к различным механизмам разделения. Как правило, для подвижности анализируемых веществ в разделяющем полимере находят зависимость от размеров молекул анализируемых веществ. Такая зависимость показана на рис. 101.

Рис. 101. Зависимость логарифма подвижности анализируемых ве ществ от логарифма длины сегментов этих вешеств при по стоянном размере пор разделяющей матрицы.

Здесь можно выделить 4 области:

A) В начальной области кривой подвижность изменяется слабо с ростом длины анализируемых веществ, т.е. для маленьких фрагментов селективность невысока. В этой области, называемой областью Огстона, размеры пор геля больше, чем размеры самих молекул, которые без заметного сопротивления проходят через гель. При этом молекулы могут сохранять свою глобулярную структуру. Это является причиной низкой селективности в данной области размеров молекул анализируемых веществ.

B) В так называемой области рептации имеет место большое изменение подвижности анализируемых веществ с ростом длины их цепочек и, тем самым, высокая селективность. В этой области молекулы анализируемых веществ больше, чем поры геля, так что молекула может проникнуть в поры только в вытянутом состоянии, огибая в "змеевидном" движении волокна гелевой матрицы (рептация). Таким образом, могут возникнуть сильные взаимодействия анализируемых веществ с матрицей геля, что приводит к появлению максимума селективности.

C) При средних длинах цепочек анализируемых веществ достигается минимум подвижности. Это объясняется тем, что оба конца молекулы движутся в одном направлении и сильно переплетаются с волокнами разделяющего полимера (ловушка).

Это приводит впоследствии к уже независящей от размеров молекул подвижности (аномальная миграция и даже инверсия). Однако это переплетение для маленьких молекул не играет существенной роли, т.к. они могут быстро освободиться от такой конформации. Для больших молекул вероятность выхода из такого состояния очень мала.

D) В последней области при очень больших длинах молекул различия анализируемых веществ относительно их размеров становятся все меньше, что приводит в дальнейшем к отсутствию различий в подвижностях.

Как видно из рис. 102, экспериментально полученные зависимости согласуются с теорией. Однако, было обнаружено, что сильное влияние на правильную последовательность миграции (маленькие молекулы перед большими) и подвижность анализируемых веществ оказывают также температура, сила поля и концентрация геля.

В экстремальных случаях может наблюдаться инверсия последовательности миграции, т.е. более длинные фрагменты ДНК движутся сквозь разделяющий гель быстрее, чем меньшие фрагменты ДНК. Это нежелательное явление можно в общем случае устранить следующими способами:

- уменьшением напряжения налагаемого поля, -повышением температуры в системе, -уменьшением концентрации геля, -буферными добавками.

Качественно нелинейность подвижности можно описать также моделью рептации:

µ = (Q / 3 f )([1/ N]+ (qEa / 3kbT ) +...) Здесь µ - подвижность биополимера, Q - общий заряд молекулы, f - коэффициент трения между волокнами геля и полимером, N- число сегментов биополимера (число основных пар), q - заряд на величину N, Е - сила поля, а - длина поры геля, Т - температура и Кь - константа Больцмана. Из этого уравнения видно, что подвижность обратно пропорциональна длине цепочки только в том случае, когда второй член пренебрежимо мал. Это бывает только при работе с относительно слабыми полями (<200 В/см). Согласно этому соотношению следует работать при повышенных температурах, что также подтверждается на практике.

Рис. 102. Зависимость между подвижностями смеси остаточных фрагментов ДНК и числом основных пар в логарифмическом масштабе.

Условия разделения: L=40/47 см, буфер: 0.1 М ТВЕ, рН 8.3, 3% Т, 0% С, ЛПА, различные температуры и силы поля (указаны на рисунке).

В зависимости от размеров пор геля и длины биополимера наблюдается различная конформация анализируемых веществ между волокнами полимера. Эти конформации в конце концов ответственны за различную подвижность и наблюдаемые нерегулярности.

Ясно, что компактная или напряженная конформация вызовет подвижность, от личающуюся, например, от подвижности для вытянутой формы.

Конформации, показанные на рис. 103, можно наблюдать методом лазерной флуоресцентной микроскопии.

Вышеупомянутые модели миграции описывают и объясняют все наблюдаемые картины и аномалии. С помощью этих моделей можно также объяснить причины нелинейности между последовательностью миграции и размерами молекул и устранить их.

Рис. 103. Зависимость подвижности биоподимеров от их конформации в разделяющем геле (см. также рис. 100).

13. Изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ) в капиллярах В классической форме электрофореза ИЭФ представляет собой разработанный способ разделения с высокой эффективностью. В основном он применяется для цвиттерионов и амфотерных проб, таких как белки и пептиды, которые различаются не по своей подвижности, а по изоэлектрическим точкам (значениям pi). Изоэлектрическая точка представляет собой специфическую величину для амфотерных веществ и показывает, при каком значении рН это вещество перестает двигаться в электрическом поле и внешне выглядит как электрически нейтральное. Таким образом, ИЭФ можно применять также для определения изоэлектрической точки белков и других амфотерных веществ.

Сначала необходимо вдоль участка разделения с помощью цвит-терионных соединений, так называемых амфолитов, создать градиент значений рН. В качестве амфолитов применяют смесь различных полиамино-поликарбокси-кислот, различающихся по своим значениям Pi.

Под влиянием сильной кислоты в анодном и сильной щелочи в катодном пространствах эти амфолиты при наложении напряжения располагаются согласно своим значениям р! вдоль участка разделения и, тем самым, создают градиент рН (см.

рис. 104).

Pages:     | 1 || 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.