WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

Научный совет Российской академии наук по хроматографии Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год Книга представляет собой практическое руководство по капиллярному электрофорезу -

новому методу анализа, обладающему высокой разрешающей способностью и сочетающему преимущества электрофоретических методов разделения с возможностью автоматизации анализа и простотой количественного расчета, характерного для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Быстрота анализа и эффективность разделения в сочетании с широкой областью применения делают капиллярный электрофорез одним из наиболее высокоэффективных аналитических методов.

Материал книги включает основы капиллярного электрофореза как количественного метода анализа сложных биологических смесей, описание аппаратурного оформления метода и некоторые конкретные методики анализа.

В приложении к книге дано краткое описание приборов для капиллярного электрофореза, выпускаемых некоторыми зарубежными и отечественными фирмами.

Книга рассчитана на ученых и специалистов, работающих в области определения состава сложных биологических смесей при анализе объектов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных препаратов, в клиническом и токсилогическом анализе.

Перевод: д.х.н. Р.Ш. Вартапетян Под редакцией д.х.н. А.М.Волощука Ил.107.Табл. 30.

Рецензент: к.х.н. И.В. Назимов ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ..................................................................................................................................................................... Предисловие....................................................................................................................................................................... 1. Введение......................................................................................................................................................................... 2. Основы капиллярного электрофореза (КЭ).................................................................................................................. 3. Эпектрофоретическое перемещение............................................................................................................................ 4. Электроосмотический поток (ЭОП)............................................................................................................................. 5. Уширение полос............................................................................................................................................................ 5.1. Потеря эффективности вследствие диффузии................................................................................................... 5.2. Потеря эффективности в результате температурных эффектов....................................................................... 5.3 Потеря эффективности в результате электрической дисперсии........................................................................ 5.4. Адсорбция на стенках............................................................................................................................................ 5.5. Перегрузка системы разделения.......................................................................................................................... 5.6. Наложение профилей потока................................................................................................................................ 5.7. Резюме.................................................................................................................................................................... 6. Аппаратура.................................................................................................................................................................... 6.1. Источники напряжения........................................................................................................................................... 6.2. Капилляры.............................................................................................................................................................. Характеристики капилляра........................................................................................................................................... Таблица 7................................................................................................................................................................... 6.3. Ввод пробы............................................................................................................................................................. 6.3.1. Ввод пробы давлением....................................................................................................................................... 6.3.3. Электрокинетический ввод пробы.................................................................................................................. Таблица. 10................................................................................................................................................................ 6.3.4. Делитель пробы............................................................................................................................................... 6.3.5. Эффекты обогащения при вводе пробы (стэкинг)........................................................................................ 6.4. Термостатирование................................................................................................................................................ 6.5. Детектирование...................................................................................................................................................... 6.5.1. Уф-детектирование......................................................................................................................................... Методы концентрирования («стэкинг»-мвтоды) в КЭ.......................................................................................... 6.5.2. Фпуоресцентное детектирование................................................................................................................... 6.5.3. Прочие методы детектирования..................................................................................................................... 6.6. Количественный анализ........................................................................................................................................ Методы детектирования в КЭ...................................................................................................................................... Таблица 13................................................................................................................................................................. Зависимость времени прохождения пиками «окна» детектора от............................................................................ Таблица 14................................................................................................................................................................. Таблица 16................................................................................................................................................................. 7. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ)................................................................................................................. 7.1. Влияние рН............................................................................................................................................................. 7.2. Влияние концентрации буфера............................................................................................................................. 7.3. Выбор буфера........................................................................................................................................................ 7.4. Области применения............................................................................................................................................. 8. Непрямое Уф-детектирование в КЭ............................................................................................................................ 8.1. Непрямое Уф-детектирование анионов............................................................................................................... 8.2. Непрямое Уф-детектирование катионов.............................................................................................................. 8.3. Сопоставление методов прямого и непрямого Уф-детектирования.................................................................. 9. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) белков.................................................................................................... 9.1. Оптимизация разделения в немодифицированных капиллярах........................................................................ 9.1.1. Значения рН..................................................................................................................................................... 9.1.2. Добавление солей к буферу........................................................................................................................... 9.1.3. Добавка органического модификатора к буферу.......................................................................................... 9.1.4. Применение буферных добавок для разделения белков............................................................................. (динамическое наполнение капилляров)................................................................................................................. 9.2. Использование капилляров с модифицированной поверхностью..................................................................... 9.2.1. Типы покрытий поверхности в КЭ................................................................................................................... 9.2.2. Изготовление химически модифицированных капилляров.......................................................................... 9.2.2.1. Предварительная обработка кварцевых капилляров............................................................................ 9.2.2.2. Методы покрытия...................................................................................................................................... 9.2.3. Характеристики заполненных капилляров в КЭ............................................................................................ 9.3. Обзор важнейших химических покрытий.............................................................................................................. 9.3.1. Общепринятые покрытия................................................................................................................................ 9.3.1.1. Алкил-силановые покрытия...................................................................................................................... 9.3.1.2. Арилпентафторидные покрытия.............................................................................................................. 9.3.1.3. Гидрофильные гидрокоил- и полиэфирные покрытия........................................................................... 9.3.1.4. Покрытия на основе белков..................................................................................................................... 9.3.2. Полимерные покрытия.................................................................................................................................... 9.3.2.1. Покрытия на основе линейных полиакриламидов.................................................................................. 9.3.2.2. Покрытия на основе поли(винилпирролидона)....................................................................................... 9.3.2.3. Покрытие капилляров поли(этиленимином)........................................................................................... (нанесение ионных слоев)..................................................................................................................................... 9.3.2.4. Покрытие капилляров поли(метилглутаматом)...................................................................................... 9.3.2.5. Капилляры для ГХ и СКФХ с нанесенным полимером, используемые в КЗ......................................... 9.4. Выводы................................................................................................................................................................... 10. Мицеллярная электрокинетическая хроматография............................................................................................... 11. Разделение энантиомеров......................................................................................................................................... 11.2. Смешанные химические разделяющие системы............................................................................................... 11.3. Капилляры с ЭОП и без него............................................................................................................................... 11.4. Выбор подходящего LLQ..................................................................................................................................... 11.5. Оптимизация концентрации ЦД.......................................................................................................................... 11.6. Оптимизация значений рН................................................................................................................................... 11.7. Оптимизация фоновых электролитов................................................................................................................. 11.8. Буферные добавки............................................................................................................................................... 12. Капиллярный гепь-эпектрофорез.............................................................................................................................. 12.1. Гели на основе акриламида................................................................................................................................ 12.1.1. Поперечносшитые полиакрипамидные гепи................................................................................................ 12.1.2. Линейные полиакриамидные цепи............................................................................................................... 12.1.3. Полиакриламидный гелевый электрофорез белков с ДДСН................................................................... 12.2. Гепи на основе пописахаридов и других полимеров....................................................................................... 12.3. Модели миграции биополимеров в полимерных растворах........................................................................... 13. Изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ) в капиллярах............................................................................................ 14. Изотахофорез (ИТФ)................................................................................................................................................. 15. Эпектрохроматография (ЭХ).................................................................................................................................... 16. Перспективы.............................................................................................................................................................. Рекомендуемые книги:......................................................................................................................................... Обзорные статьи.................................................................................................................................................. Список сокращений, часто встречающихся в тексте:........................................................................................ Предисловие В основу книги положены лекции профессора Саарбрюкенского университета (Германия) Х.Энгельгардта, предназначенные для специалистов, желающих овладеть капиллярным электрофорезом - новым современным методом анализа сложных смесей.

Книга выпущена в качестве учебного пособия для школы по капиллярному электрофорезу, проводимой для российских ученых и специалистов сотрудниками Саарбрюкенского университета под руководством проф. X. Энгельгардта в Москве в апреле 1996 года. Программа школы включает практические занятия на приборах некоторых зарубежных фирм. В приложении к "Руководству по капиллярному электрофорезу" приведена информация о фирмах, специализирующихся в выпуске аппаратуры для капиллярного электрофореза: Beckman, BioRad, Cheminst (Dionex, Gilson), Hewlett Packard, Perkin-Elmer, Termo Separation Products, Waters, Экотехника.

Издание данной книги стало возможным благодаря финансовой поддержке фонда "Фольксваген" ( Германия).

Научный совет РАН по хроматографии выражает искреннюю благодарность проф.

Х.Энгельгардту и его сотрудникам за предоставленные материалы, фонду "Фольксваген" за финансовую поддержку, а также д.х.н. Р.Ш. Вартапетяну, д.х.н. A.M. Волощука, к.х.н.

Л.Н. Коломиец, к.х.н. И.В. Назимову и Р.И.Хамидуллину за подготовку книги "Ру ководство по капиллярному электрофорезу" к изданию.

1. Введение Такие аналитические методы, как хроматография и электрофорез, находят широкое применение в определении состава сложных биологических смесей при анализе объектов окружающей среды и промышленной продукции.

Методы газовой хроматографии (ГХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) позволяют за короткое время проводить разделение, идентификацию и количественное определение состава сложных смесей. Благодаря сочетанию высокоэффективных разделительных систем с чувствительными, селективными и специфическими детекторами, такими, например, как диодно матричный детектор (ДМД) в видимой и УФ-областях спектра, масс-спектрометрия и ИК фурье-спектроскопия (ИКФС) удается надежно идентифицировать отдельные вещества.

Приборное оформление этих методов настолько хорошо развито, что почти всегда удается автоматизировать проведение хроматографических анализов.

Области применения методов ГХ и ВЭЖХ ограничиваются требованиями, предъявляемыми к пробам в каждом из этих аналитических методов. Поэтому ВЭЖХ в настоящее время является наиболее широко распространенным методом разделения с хорошими перспективами на дальнейшее расширение области его применения. (Темпы прироста рынка приборов для ВЭЖХ стабильно превышают 10% в год). Проблемы при применении ВЭЖХ возникают тогда, когда необходимо быстро и с большой эффективностью проанализировать полярные и ионогенные пробы, особенно пробы, обладающие высокой основностью, а также биополимеры. Это - одна из наиболее сложных проблем хроматографии, связанная с использованием стационарных фаз на основе силикагеля. Хотя в последние годы появились фазы, при использовании которых удается решить эти проблемы, для дальнейшего развития аналитических методов разделения ионогеннных веществ необходимо высокое мастерство и глубокое понимание протекающих при этом многообразных сорбционных ионообменных процессов. Фазы на основе чистых органических веществ из-за своей способности к набуханию обладают меньшей эффективностью и ограниченной устойчивостью к давлению по сравнению со стационарными фазами на основе силикагеля. Поэтому неудивительно, что эти фазы до настоящего времени не получили широкого распространения. Хотя в распоряжении исследователей имеются ионообменные фазы как на основе силикагеля, так и на основе полимеров, ионнообменная хроматография также не получила широкого распространения, так как для разделения компонентов неоходима градиентная техника (градиенты рН или ионной силы). Для ионогенных соединений предлагается элекрофоретическая техника разделения.

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами: (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут уско ряться в различной степени;

(б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения.

Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их мо лекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью).

Классический электрофорез (гель-электрофорез или электрофорез на бумаге) имеет две характерные особенности. Во первых, количественный анализ возможен только с помощью измерений в отраженном свете, а в случае белков только по степени их окрашивания, и поэтому часто бывает ошибочным. Во-вторых, падение напряжения при прохождении через гель не может быть выбрано слишком высоким. Степень нагрева возрастает пропорционально напряжению, так что необходимо эффективное охлаждение, чтобы избежать высыхания геля. Время анализа на отрезке геля длиной в 10 см может достигать нескольких часов. В любом случае при гель-электрофорезе воз можно проводить одновременно большое число разделений на одном геле, при этом производительность сильно увеличивается. В плоскостном варианте метода, кроме того, можно без затруднений проводить двумерные 2D-процессы с использованием различных механизмов разделения. Отметим также высокую разрешающую способность 2D-гель-электрофореза при анализе белков.

2. Основы капиллярного электрофореза (КЭ) Развитие КЭ началось с пионерских работ Миккерса и Эвериртса (конец 70-х годов) и Йортенсона и Лукаса (начало 80-х годов). Быстрое развитие метода было обусловлено двумя решающими усовершенствованиями: во-первых, был существенно уменьшен внутренний диаметр разделительного капилляра;

во-вторых, детектирование по электропроводности, пришедшее первоначально из изотахофореза, было заменено на прямое УФ-двтектирование в потоке жидкости. Предпосылкой для дальнейшего развития метода была возможность использования кварцевого капилляра с высокой прозрачностью в ближней УФ-области и с равномерным внутренним диаметром от до 100 мкм. При этом улучшились как разделение, так и возможности детектирования.

С помощью кварцевого капилляра с внутренним диаметром 50-100 мкм удалось достигнуть высокоэффективного разделения белков и дансил-аминокислот, при котором из-за сравнительно большого отношения поверхности к объему было сильно уменьшено влияние мешающей разделению термически индуцированной конвекции.

Применение кварцевого капилляра позволило использовать модифицированный ВЭЖХ-детектор для определения разделяемых веществ непосредственно в капилляре.

Простота аппаратуры и возросшая потребность в разделении биомолекул привели во второй половине 80-х годов к повышенному интересу к данному методу.

Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только за счет разницы в подвижности, и который в настоящее время представляет собой наиболее распространенный метод, выделяют также капиллярный гель электрофорез (КГЭ) с капилляром, заполненным гелем. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля, и поэтому достигается селективное разделение молекул по размерам. Незаряженные молекулы можно разделять с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). В данном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы распределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Поскольку в основе разделения лежит процесс распределения, можно с полным основанием говорить о хроматографическом методе. При изоэлектрической фокусировке (ИЭФ) происходит разделение в градиенте рН, формируемом добавлением амфолита к 6уферу в электрическом поле. Небольшое распространение получила пока электрохроматография (ЭХ), при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ, а течение эдюента и перенос пробы происходит только за счет электроосмотического потока. В качестве самой старой капиллярной техники следует упомянуть изотахофорез (ИТФ), который в настоящее время вновь приобрел значение для концентрирования проб в КЭ.

Схематическое изображение аппаратуры КЭ представлено на рис. 1. Тонкий кварцевый капилляр (25-100 мкм) длиной от 20 до 100 см соединяет два буферных сосуда, между которыми приложено напряжение около 30 кВ. Сравнительно небольшое количество пробы (несколько нл) вводится на анодном конце капилляра. Это достигается подъемом или опусканием соответствующих буферных сосудов, созданием давления в сосуде для пробы, созданием вакуума в катодном буферном резервуаре или просто за счет электрофоретической миграции пробы в капилляр. Достоинства и недостатки разных способов ввода пробы подробно обсуждаются в разделе "Аппаратура".

Рис. 1. Схема аппаратуры КЭ.

Разделение пробы достигается приложением напряжения к буферным сосудам.

Возникающее в капилляре электрическое поле вызывает миграцию зоны пробы. На электрофоретическое перемещение всегда накладывается более или менее интенсивный электроосмотический поток (ЭОП), который способствует пассивному транспорту зоны пробы, а не ее разделению.

Этот ЭОП сильно зависит от значений рН буфера и от свойств поверхности капилляра.

Он может быть настолько большим, что будут двигаться не только нейтральные молекулы, но даже отрицательно заряженные ионы могут перемещаться к детектору, несмотря на их электрофоретическую миграцию.

После того, как в большинстве буферов на поверхности кварцевых капилляров из-за диссоциации силанольных групп образуются отрицательные заряды, вблизи стенки индуцируются положительные заряды и электроосмотический поток направлен к катоду.

Это обусловливает необходимость расположения детектора вблизи катодного пространства. ЭОП помогает переносить зоны проб к детектору настолько, что при достаточно больших значениях ЭОП к катоду могут переноситься даже анионы. Пример разделения катионных, анионных и нейтральных веществ посредством капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) приведен на рис. 2. При этих условиях все незаряженные молекулы перемещаются с одинаковой скоростью, равной скорости электроосмотического потока, и не могут быть разделены, в то время как разделение заряженных ионов возможно благодаря их различной электрофоретической подвижности.

Наряду с этой простейшей формой капиллярного электрофореза, существует множество его вариантов, которые будут обсуждаться в последующих разделах при рассмотрении наиболее типичных областей их применения Рис.2.

Пример разделения нейтральных, положительно и отрицательно заряженных проб в одном опыте. Условия разделения: L=30/37 см;

внутренний диаметр - 75 мкм;

буфер - 33 мМ борат, рН 9.5;

Е=350 В/см;

детектирование УФ/214 им. (1) триметилфениламмонийбромид, (2) гистамин, (3) 4 аминопиридин, (4) бензиновый спирт, (5) фенол, (6) сирингальдегид, (7) 2-(парагидроксифенил)-уксусная кислота, (8) бензойная кислота, (9) ванилиновая кислота, (10) пара гидроксибензойная кислота.

3. Эпектрофоретическое перемещение Увеличивающееся напряжение и возрастающая при этом напряженность поля Е приводят к постоянному повышению скорости перемещения U (скорости электрофореза) и, вследствие этого, к более высокой скорости анализа. Электорофоретическая подвижность ионов µ связана со скоростью электрофоретического перемещения U м напряженностью поля Е соотношением:

U=µ.E=Leff/t Здесь Leff- эффективная длина капилляра (от входа до детектора), t - время перемещения.

Эта формула может быть преобразована с учетом равновесия сил, действующих на перемещающийся ион.

На отдельный ион действует сила КB, ускоряющая его:

z F E KB = N A где F- константа Фарадея (96500 Кл/моль), z - эффективный заряд иона.

Эта сила приблизительно равна силе трения КR, которая в соответствии с законом Стокса выражается уравнением:

KR = 6 • • • r • U При этом -динамическая вязкость [Па-с], r -cтоксовский радиус [см]. Скорость электрофоретического перемещения U тогда может выражаться как :

z F E U = 6 r N A Если затем накладывается напряжение (обычно от 10 кВ до 30 кВ) то происходит разделение за счет различной скорости перемещения пробы в разделительном буфере.

При этом ионы перемещаются в электрическом поле со скоростью, которая может быть выражена следующим уравнением:

Leff Leff Lges µ = = t E t U При расчетах важно различать общую длину капилляра (Lges) и эффективную длину капилляра от места ввода пробы до детектора (Leff). так как электрическое поле уменьшается на протяжении общей длины капилляра, а молекулы мигрируют лишь в пределах эффективной длины капилляра. Поэтому данные о длине капилляров характеризуются отношением длин в см Leff/Lges.

Электрофоретическое разделение возможно лишь тогда, когда ионы различаются по их подвижности. Эффективный заряд представляет собой заряд иона за вычетом части заряда окружающего противоположно заряженного двойного электрического слоя. При перемещении ион притягивает эту часть двойного электрического слоя и передвигается из-за этого более медленно. Это явление называется электрофоретическим эффектом, который наиболее сильно проявляется в тонких диффузных двойных слоях вокруг ионов. Этот характеристический двойной электрический слой может быть рассчитан по теории Дебая-Хюккеля. Он обратно пропорционален корню квадратному из концентрации электролита. Отсюда следует, что эффективный заряд иона и, соответственно, скорость перемещения при увеличении ионной силы уменьшаются.

Для крупных частиц с радиусом большим, чем размер двойного электрического слоя, подвижность частиц близкого состава не зависит от их размеров, что затрудняет разделение больших молекул при электрофорезе, поскольку скорость перемещения молекул ДНК и белков, денатурированных ДДСН, в чистом растворителе идентична.

Разделение достигается лишь тогда, когда миграция обусловлена молекулярно-ситовым эффектом (например, в гелях).

4. Электроосмотический поток (ЭОП) В то время как электрофорез обусловливает разделение частиц с различной подвижностью, электроосмос определяет течение буферного раствора в электрическом поле.

В большинстве случаев при капиллярном электрофорезе на электрофоретическое перемещение ионов накладывается ЭОП. Этот поток зависит от распределения зарядов вблизи поверхности капилляра. Почти все поверхности несут на себе определенный заряд. В случае кварцевых капилляров - это отрицательные заряды, обусловленные диссоциацией силанольных групп. Этот поверхностный заряд локализуется в жидкости напротив соответстующих противоионов с противоположным зарядом. В таком двойном электрическом слое, схематически изображенном на рис. 3, преобладают положительные ионы, которые распределены между неподвижными и подвижными слоями.

Рис. 3. Разделение зарядов па поверхности кварца и образование -потенциала.

Если параллельно поверхности капилляра приложено электрическое поле, то оно притягивает противоионы из подвижного слоя вдоль оси и засасывает жидкость в капилляр. Поэтому в случае кварцевых капилляров электроосмотический поток направлен к катоду. Образуется очень плоский профиль потока. Это приводит к значительно меньшему уширению пиков, чем при гидродинамическом течении, при котором образуются сильно зависящие от радиуса капилляра и скорости течения параболические профили потока - профили Хагена-Пуазейля (рис. 4).

В капиллярах, загруженных стеклянными шариками или частицами силикагеля, ЭОП не должен зависеть от диаметра частиц, и направление потока в загруженном капилляре должно быть таким же, как и в пустом. При этом нет необходимости в применении очень маленьких частиц (с диаметром около 1 мкм или даже меньше) или длинных колонок, как при хроматографических методах. Поэтому метод ЭХ вызывает все возрастающий интерес, так как он сочетает селективность ВЭЖХ с высокой разделительной способностью КЭ. Благодаря применению непористых частиц можно исключить влияние диффузии в поры на уширение полос или пиков.

Рис. 4. Профиль ЭОП, обусловленный давлением (a), и идеальный профиль (b).

Величина ЭОП может быть упрощенно описана с помощью так называемого уравнения Гельмгольца.

E u = Она пропорциональна диэлектрической проницаемости, напряженности приложенного поля Е и количеству зарядов на стенке капилляра или возникающему при этом -потенциалу и обратно пропорциональна вязкости электролита. В кварцевых капиллярах ЭОП уменьшается при увеличении концентрации электролита и добавлении органических компонентов и возрастает с увеличением степени диссоциации поверхностных силанольных групп, что означает увеличение ЭОП с возрастанием значений рН (рис. 5). Если же при добавлении катионных поверхностно активных веществ (ПАВ) к разделительному буферу на поверхности капилляра адсорбируется положительный заряд (см. рис. 6), то ЭОП меняет направление и переносит разделительный буфер в направлении анода.

Зависимость ЭОП в кварцевых капиллярах от значений рН и соответствующая воспроизводимость подвижности представлены на рис. 5. ЭОП проявляет при циклическом обмене буферов типичный эффект гистерезиса. Наибольшие отклонения наблюдаются в средней области рН при значениях, близких к значению рК кремневой кислоты. Благодаря увеличению времени кондиционирования в зависимости от изменений значений рН буфера удается несколько уменьшить это отклонение, и яв ления гистирезиса уменьшаются. Для воспроизводимости работ с незагруженными капиллярами необходимо при обмене буферов стандартизовать время заполнения и кондиционирования с тем, чтобы можно было устранить явление гистерезиса ЭОП.

подвижность [ x10 -4 см2/В*с] Рис. 5. Зависимость электроосмотического потока от рН. Условия:

внутренний диаметр капилляра мкм, L=40/47 см, буфер: фосфат 10 мМ, нейтральный маркер:

бензиловый спирт;

Е=425В/см.

Как уже упоминалось, ЭОП уменьшается по мере возрастания ионной силы. При этом зависимость ЭОП от логарифма концентрации буфера носит линейный характер (рис. 7).

ЭОП присутствует во всех электрофоретических методах разделения, так как никогда не удается полностью исключить возникновение поверхностных зарядов. Он может привести, с одной стороны, к концентрационному перемещению электрофоретических зон, однако, с другой стороны, играет существенную и иногда решающую роль при переносе зон через капилляр. Из-за постоянно существующего ЭОП при капиллярном электрофорезе детектор во всех случаях располагается в непосредственной близости от катода.

Анионы сами переносятся к катоду, соответственно скорость их электрофоретического перемещения ниже, чем скорость ЭОП. Таким образом, ЭОП позволяет проводить разделение катионных и анионных соединений в одном анализе (сравни с рис. 2). При других методах капиллярного электрофореза (например, при мицеллярной электрохроматографии) ЭОП используется исключительно для переноса проб (частично незаряженных) к детектору.

Двойной электрический слой катионных ПАВ Рис. 6. Адсорбция катионных ПАВ на стенке капилляра.

Стенка капилляра Благодаря химической модификации поверхности капилляров, ЭОП может контролироваться, исключаться или даже обращаться. Определение значения ЭОП служит единственной возможностью определить изменения на поверхности капилляров, например, благодаря необратимой адсорбции компонентов пробы. Все другие методы характеристики поверхности капилляров исключаются при очень небольших поверхностях (1 см2). Поверхностно-модифицированные капилляры не проявляют явле ний гистерезиса при смене буферов и из-за незначительной адсорбции очень хорошо подходят для анализа белков (см. ниже).

За счет добавления длинноцепочечных катионных детергентов, таких как, например, цетилметиламмониевые соли, которые адсорбируются на силанольмых группах поверхности, можно осуществить даже обращение ЭОП. При этом образуется двойной слой детергента, обращенный положительным зарядом в направлении электролита.

При использовании капилляров с такими покрытиями удается осуществлять разделение быстро перемещающихся неорганических ионов. Таблица 1 дает представление о возможностях влияния на ЭОП.

Рис 7. Концентрационная зависимость ЭОП. Условия:

кружок - боратный буфер, квадрат - фосфатный буфер (в каждом случае рН 8.0). А: ЭОП в зависимости от ln концентрации буфера;

В: ЭОП в зависимости от In ионной силы буфера.

Таблица 1.

Возможности влияния на ЭОП.

Изменения в системе Воздействие на ЭОП Примечание разделения рН буфера ЭОП возрастает при Может также влиять на заряд уменьшении рН пробы Концентрация буфера ЭОП возрастает при Высокая концентрация уменьшении концентрации обусловливает сильное буфера течение, малая концентрация легко приводит к перегрузке Температура Изменяется вязкость ( 2 - Может также влиять на 3%на1°С) селективность Органические Изменение ЭОП и вязкости Комплексное изменение растворители буфера разделительной cистемы, в большинстве случаев с изменением селективности ПАВ как добавки к Адсорбция на стенке ка- Анионные ПАВ могут буферам или пилляра. увеличить ЭОП, катионные нейтральные гидрофобные Характерное изменение ЭОП ПАВ уменьшают или полимеры обращают ЭОП Динамические При образовании мицелл Проблемы со стабильностью покрытия сильное изменение се лективности Ковалентные покрытия Влияют на ЭОП, уменьшают Проблемы со стабильностью адсорбцию на стенках Радиальное Изменение ЭОП Ограниченное распро электрическое поле странение Изменение концентрации буфера представляется наиболее эффективной и простой возможностью влиять на ЭОП разделительной системы. Чтобы оценить действие концентрации буфера на разделение, было проведено разделение тест-смеси, содержащей ионы с различными отрицательными зарядами в боратном буфере с концентрацией от 5 мМ до 100 мМ как при постоянном токе, так и при постоянном напряжении.

Результаты испытаний представлены на рис. 8 и 9. Благодаря этим измерениям было четко показано, что ЭОП увеличивается по мере уменьшения концентрации буфера и поэтому подходит для анализа сильно отрицательно заряженных, мигрирующих против ЭОП проб. При постоянном напряжении (10 кВ) и концентрации буфера 5 мМ бензолтрикарбоновая кислота еще может быть обнаружена, однако при том же самом времени анализа и концентрации буфера 50 мМ можно детектировать только бензойную кислоту При этом ток повышается с 10 до 130 мА. Аналогичное поведение можно наблюдать для веществ, подвергаемых разделению при постоянном токе (100 мА). Работая с буфером 10 мМ при 26 кВ, в течение 8 минут можно обнаружить все четыре тестовых вещества, в то время как в буфере 50 мМ удается детектировать только нейтральный маркер (бензиловый спирт). В этом буфере при максимальной силе тока 100 мА можно достигнуть напряжения лишь в 5.5 кВ. Если пост роить зависимость времени анализа от концентрации буфера, то можно отчетливо видеть параллельный ход кривых бензойной кислоты и бензилового спирта. Наивысшая скорость перемещения достигается при самой низкой концентрации буфера. Если рассчитать электрофоретическую подвижность бензойной кислоты, то она при различных концентрациях буфера остается постоянной, поэтому бензойная кислота может служить веществом-индикатором при качественном анализе.

Для уменьшения времени анализа или для анализа многозарядных анионов необходимо работать с буферами низкой концентрации и при щелочных значениях рН. Этот эффект представлен на рис. 10.

Рис. 8. Разделение тестовой смеси анионов при постоянном напряжении. Условия: прибор - Beckmaa Р/АСЕ 2000;

капилляр -75 мкм, поле:

227 В/см;

буфер - борат, рН 9.5;

ввод пробы давлением, 2 с.;

детектирование - 214 им;

проба - бензоловый спирт (1), бензойная кислота (2), фталевая кислота (3), 1,3,5 бензолтрикарбоновая кислота (4).

Рис.9. Разделение тестовой смеси анионов при постоянном токе.

Условия: прибор - Beckman Р/АСЕ 2000;

капилляр - 75 мкм;

поле - варьируется;

буфер - борат, рН 9.5;

ввод пробы - дав лением, 2 с.;

детектирование - 214 нм;

проба - бензоловый спирт (1), бензойная кислота (2), фталевая кислота (3), 1,3,5 бензолтрикарбоновая кислота (4).

Рис. 10. Зависимость времени анализа от выбранной концентрации буфера. Условия аналогичны рис. 8.

5. Уширение полос Для описания уширения полос в КЭ используют известные хроматографические величины, употребляемые также для описания переноса в капиллярах. Так, число теоретических тарелок рассчитывается по аналогии с хроматографическими методами из ширимы пика и времени переноса.

Основной вклад в уширение полос при хроматографии в открытых трубках вносит профиль потока Хагена-Пуазейля. Этот вклад пропорционален квадрату диаметра капилляра и обратно пропорционален коэффициентам диффузии веществ в электролите (параметр С в уравнении Голея).

Профиль потока жидкости из-за медленной радиальной диффузии не выравнивается. По этой причине капиллярная жидкостная хроматография с диаметром капилляра > 50 мкм невозможна. При газовой хроматографии коэффициенты диффузии больше в 104 раз и параболический профиль потока быстро выравнивается вследствие радиальной диффузии. Поэтому капиллярная газовая хроматография является высокоэффективным методом разделения. Поскольку профиль потока в КЭ формируется с помощью ЭОП, вкладом профиля потока в уширемие полос можно пренебречь, так что в идеальном случае во внимание принимается исключительно параметр продольной диффузии. По этой причине не нужно разделять, как это делается в ВЭЖХ, отдельные вклады в уширение полос на три составляющие: продольную диффузию, вихревую диффузию и составляющую массопереноса, так как в КЭ плохое разделение пиков вызвано преимущественно другими причинами, и лишь понятие продольной диффузии может быть позаимствовано из теории хроматографии.

5.1. Потеря эффективности вследствие диффузии Если пренебречь в первом приближении другими причинами уширения полос, то оказывается, что число теоретических тарелок прямо пропорционально напряженности электрического поля Е и обратно пропорционально коэффициенту диффузии D.

Определяя уравнение для числа теоретических тарелок и применяя закон диффузии Эйнштейна, получаем связь между важнейшими величинами: числом теоретических тарелок, напряженностью поля Е и коэффициентом диффузии D.

L L N = H = L L 2D Leff Lges = 2D t = µ U где N - число тарелок, обратно пропорциональное уширению полосы Н, D - коэффициент диффузии вещества в разделительном буфере, U - напряжение, µ - скорость.

Число теоретических тарелок возрастает с увеличением напряжения и уменьшением коэффициента диффузии (в противоположность ВЭЖХ, где число тарелок с уменьшением коэффициента диффузии сильно уменьшается).

Коэффициенты диффузии различных веществ в водных растворах представлены в таблице 2. С увеличением молекулярной массы перенос веществ за счет диффузии замедляется и коэффициенты диффузии уменьшаются.

Гиддингс показал, что при комнатной температуре и в широкой области значений параметров уравнение для числа теоретических тарелок сводится к соотношению:

N=20*z*U, где z - эффективный заряд пробы в буфере.

Таблица 2.

Коффициенты диффузии и молекулярные массы (ММ) различных веществ в водных растворах Вещество ММ [г/моль] 10-5D [см2/с] Ионы натрия 23 1. Этанол 46 1. Валим 117 0. Триптофан 204 0, Глюкоза 180 0. Цитохром С 13400 0. Сывороточный альбумин человека 68500 0. Фибриноген человека 340000 0. Вирус табачной мозаики 40590000 0. При напряжении от 100 до 35000 В, а также эффективном заряде от 1 до достигается величина до 107 теоретических тарелок на метр. Эта величина показывает, что в этом отношении КЭ превосходит ВЭЖХ.

Предсказанное высокое число теоретических тарелок было измеренов заполненных гелем капиллярах для молекул ДНК. Молекулы ДНК представляют собой особый случай, так как из-за большого числа отрицательных зарядов они не вступают в обменное взаимодействие с поверхностью капилляра. С белками достигнуть такого числа тарелок не удается, хотя с покрытыми капиллярами можно получить до тарелок на метр.

Необходимо заметить, что в хроматографии прохождение всех проб через детектор после элюирования на колонке и соответствующего разбавления всегда происходит с постоянной скоростью. Однако в КЭ с детектированием в колонке скорость перемещения проб к окну детектора различна. Только поэтому возможно выравнивание достижимого числа теоретических тарелок в ВЭЖХ и в КЭ.

Для практического расчета числа теоретических тарелок можно использовать ширину пика на половине высоты и время удерживания (время выхода пика). В этом случае число теоретических тарелок рассчитывается по формуле:

t N = 5,54 b t - время удерживания вещества (выхода пика), b - ширина пика на половине высоты.

На практике кроме продольной диффузии в КЭ существуют другие эффекты, которые способствуют уширению пиков. К этим причинам уширения полос в КЭ относятся:

- адсорция пробы стенками капилляра, - искажение плоского "поршневидного" профиля потока из-за температурного эффекта, - наложение электроосмотического потока, - слишком длинная зона ввода пробы, - слишком большая концентрация пробы, - разница в подвижностях буфера и анализируемых ионов.

Как и в ВЭЖХ, в КЭ имеет место аддитивность дисперсий (2) при совместном действии различных причин, приводящих к суммарному уширению полос. В итоге это приводит к уменьшению числа теоретических тарелок N или, соответственно, к увеличению значения Н.

2 2 2 2 2 2 = VU + + + + WA + + MU LD DE T µ 2 -дисперсия пика при гауссовой форме, индексами обозначены причины дисперсии:

VU - перегрузка по объему, MU - перегрузка по массе, LD - продольная дифузия, DE - детектирование, WA - адсорбция на стенках, Т -температурные эффекты, µ - разница в подвижности иона пробы и буфера.

Впоследствие мы остановимся на некоторых из этих причин более подробно.

Особый интерес при этом будут представлять прежде всего эффекты перегрузки, ионной силы буфера, адсорбции на стенках, температурные эффекты и разница в подвижности ионов пробы и буфера.

5.2. Потеря эффективности в результате температурных эффектов В результате наложения поля в капилляре протекает электрический ток. Этот ток, помимо других причин, зависит от удельной проводимости буфера и диаметра капилляра. Приведенная ниже формула описывает связь между мощностью электрического тока и некоторыми характеристиками процесса разделения.

k 2 2 P = U I = R I = U d 2L где Р- мощность, d - внутренний диаметр капилляра, k удельная электропроводность буфера.

Из уравнения видно, что мощность зависит от квадрата напряжения и квадрата радиуса капилляра. Например, при удвоении внутреннего диаметра капилляра напряжение уменьшается в два раза. При этом мощность остается постоянной.

Поэтому время анализа при использовании капилляра большого диаметра выше.

Отвод тепла, выделяемого за счет электрической мощности, происходит исключительно через стенки капилляра, так что в буфере возникает радиальный температурный градиент, а с ним и градиент вязкости, перпендикулярный электрофоретическому потоку. При этом тепло будет отводиться через различные материалы с различной скоростью.

Рис. 11. Градиент температуры в буфере для разделения и на стенках капилляра.

В то время как вода обладает относительно высоким тепловым сопротивлением (6.0*10-3 Вт/см К), через кварц тепло будет отводиться быстро (тепловое сопротивление 1.4*10-2 Вт/см К). Типичное значение для разницы температур между внутренними и внешними стенками капилляра лежит в интервале между 0.3 и 0.7 °С.

Как показывают расчеты, при этом образуется параболический температурный градиент. Середина капилляра нагревается наиболее сильно, и температура здесь может быть на 10 °С выше, чем на внутренней стенке капилляра. Радиальный температурный градиент вызывает градиент вязкости, который оказывает влияние на профиль потока. Поэтому вещество перемещается медленее в зоне с высокой вязкостью (стенки капилляра), чем в зоне с меньшей вязкостью (середина капилляра).

Образование температурного градиента сильно зависит от размеров капилляра, элект ропроводности буфера и охлаждения капилляра. Охлаждение капилляра усиливает температурный градиент, однако оно необходимо для того, чтобы избежать дегазации и локального перегрева. Различие в вязкости между серединой капилляра и стенками приводит к различию переноса и, как следствие, к уширению полос и потере эффективности разделения.

Влияния радиальных градиентов температуры и вязкости можно избежать только за счет уменьшения диаметра капилляра.

Разница в температуре между серединой капилляра и стенками в цилиндрической трубке возрастает пропорционально квадрату диаметра капилляра. Поэтому в КЭ применяют очень тонкие капилляры (диаметром от 50 до 100 мкм). Сам градиент температуры не может быть измерен из-за очень малых размеров капилляра. При уменьшении диаметра оптическая плотность слоя и, вместе с тем, чувствительность обнаружения уменьшаются (закон Ламберта-Бера). Другая возможность уменьшения влияния джоулева тепла состоит в снижении концентрации буфера и/или применении буфера с низкой ионной электропроводностью.

Так как повышение температуры увеличивает электропроводность буфера в капилляре, ток при постоянном напряжении в начале анализа изменяется до тех пор, пока не образуется стабильный температурный градиент. В этом состоянии основное джоулево тепло отводится через стенки капилляра. При неэффективном охлаждении температура буфера повышается, и поэтому ток увеличивается непропорционально приложенному напряжению. При этом перестает выполняться закон Ома.

В целом действием температурных эффектов можно пренебречь при работе в области выполнения закона Ома. Максимальное необходимое напряжение зависит, таким образом, от диаметра капилляра, электропроводности буфера и эффективности охлаждения.

Как ясно видно из рисунка, применение капилляра с очень маленьким внутренним диаметром позволяет повысить электрическое сопротивление, при этом одновременно увеличится линейная область U/1-кривой. Так, к примеру, с исследуемым буфером (рис.

12 А) в капилляре с внутренним диаметром 50 мкм можно работать до 25 кВ. В то же время для капилляра диаметром 100 мкм рабочая область не превышает примерно 12 кВ.

Можно повысить электрическое сопротивление, применяя цвиттер-ионный буфер.

Уменьшая удельную электропроводность, можно, как показано на примере буфера, содержащего циклогексиламинопропановую кислоту (ЦАПК), работать вплоть до 20 кВ даже с капилляром, имеющим внутрений диаметр 100 мкм.

Рис. 12. А: Достигаемое число теоретических тарелок в капиллярном электрофорезе с учетом и без учета джоулева тепла. В: Зависимость уширения полос вследствие температурного эффекта от напряженности поля при различных диаметрах капилляра.

5.3 Потеря эффективности в результате электрической дисперсии Уменьшение электропроводности буфера устанавливает, однако, некоторые ограничения. Если между электропроводностью в буфере и в зоне пробы существует большое различие, то локальное нарушение электрического поля приводит к искажениям зон и, вследствие этого, к уменьшению эффективности разделения. Если электропроводность внутри зоны пробы больше, чем в несущем электролите, то уменьшение сопротивления приводит к снижению напряженности поля. Из-за этого молекулы пробы в зоне концентрационного максимума перемещаются медленнее, чем на краях. Это приводит к сильному искажению зон с медленным подъемом и быстрым падением в них концентрации веществ. В другом случае возникает пик с большим "хвостом". Симметричный пик получается только, если электропроводности в зоне пробы и в буфере одинаковы.

Рис. 13. Увеличение силы тока в зависимости от напряжения и внут реннего диаметра капилляра. Условия:

прибор для КЭ - МП-lipore Quanta 4000;

капилляр - 360 мкм (внешний диаметр), 50/56 см;

буфер (А): 20 мМ борат, рН 10.0;

буфер (В): 25MM ЦАПК. рН 11,0.

Поэтому концентрацию буфера необходимо подбирать применительно к конкретной проблеме разделения (диссоциация и подвижность пробы). Кроме того, разница в подвижности между ионами пробы и буфера может привести к изотахофоретическому эффекту. Это дает в большинстве случаев треугольную форму пика, которая вызывает проблемы при интегрировании.

При этом, если электропроводность зоны пробы больше, чем у разделительного буфера, это приводит к разбавлению пробы при ее вводе. Это объясняется законом Кольрауша, который требует постоянной электропроводности на всем участке разделения.

n i (x)= c µizi = const i= i - ионы в зоне разделения, i - функция Кольрауша.

Если при этом существует еще и разница в подвижности между ионами пробы и буфера, то происходит искажение формы пика. Эта сложная взаимосвязь наглядно обобщена еще раз в таблице 3.

Электропроводность буфера в зонном электрофорезе должна быть одинаковой на всем участке разделения. Только этим обеспечивается то, что напряжение на участке разделения падает равномерно и скачков напряженности поля не возникает.

Таблица Взаимосвязь между формой пика и подвижностью, а также между электропроводностями раствора (s )и буфера (p ) s>p s=p s

µp Фронтальные пики Фронтальные пики Появление градиента напряженности электрического поля в зоне перемещения молекул пробы определяется ионной силой (или концентрацией) буфера. Если электропроводностью зоны пробы нельзя пренебречь по сравнению с электропроводностью буфера, это приводит к уширению полос. Эффект усиливается с ростом различия в подвижностях ионов пробы и буфера.

Рис. 14. Схематическое объяснение уширення полос из-за электрической дисперсии.

Из-за скачка напряжения на границе пиков происходит деформация и образуются крутой и пологий края пика. На рис 15 представлена зависимость значений Н от концентрации боратного буфера для четырех соединений. Значения Н при этом для всех веществ с увеличением концентрации буфера снизились, например, для (1 гидроксибензойной кислоты с 31 мкм до 4 мкм.

Для ионов пробы с большим отличием в подвижности от ионов буфера значение Н на несколько порядков выше, чем в случае пробы, имеющей подвижность такую же, как у ионов буфера.

Эти явления более подробно рассмотрены в главе "Непрямое УФ-детектирование", поскольку при этом способе детектирования часто необходимо использовать маленькие концентрации буфера.

Рассмотрим эти проблемы на примере разделения гомологического ряда карбоновых кислот.

В то время как низшие гомологи детектируются с отчетливым искажением, каприловая кислота выходит в виде симметричного пика. Карбоновые кислоты, перемещающиеся медленнее, обладают значительно меньшей подвижностью, чем ионы буфера, и поэтому детектируются в виде асимметричных пиков с увеличивающимися "хвостами".

Рис. 15. Влияние концентрации буфера на уширение полос. Условия:

прибор для КЭ - Beckman Р/АСЕ 2000;

капилляр - 50 мкм, 54/ см;

поле • 400 В/см;

буфер:

борат, рН 8.5;

ввод пробы давлением, 1 с.;

детектирование - 214 нм: А - фенилтриметиламмонийхлори д, В - фталевая кислота, С - п гидроксибензойная кислота, D - бензиновый спирт.

5.4. Адсорбция на стенках Молекулы пробы могут адсорбироваться на стенках за счет взаимодействия с отрицательно заряжеными силанольными группами кварца. При нейтральных и щелочных условиях разделения многие силанольные группы депротонируются и способствуют адсорбции положительных ионов пробы на стенке. В результате этого потенциал, образовавшийся на поверхности кварца, изменяется и, как следствие, изменяется подвижность электроосмотического потока, из-за чего происходит изменение времени выхода всех пиков. Кроме этого, из-за сильной адсорбции молекул пробы на стенках капилляра уменьшается интенсивность пика и это приводит в экстремальном случае к асимметричным пикам с большими "хвостами". Обработка таких пиков трудна, а часто невозможна.

Рис. 16. Влияние разницы в подвижности между ионом пробы и ионом буфера на форму пика.

Условия разделения: L=50/57 см;

внутренний диаметр - 75 мкм;

буфер - 5 мМ динитробензойная кислота, 0.5 мМ ЦТАБ (цетилтриметиламмонийбромид) рН 9.0;

Е=-431 В/см;

детектирование - непрямое, УФ 214 нм;

проба -карбоновые кислоты по 25ррм каждой.

Из-за локальных воздействий на поверхностный потенциал кварца следует ожидать дополнительного изменения профиля потока, который отклоняется от идеальной "поршнеобразной" формы, что также способствует уширению полос.

Особенно отчетливо можно наблюдать это явление в пробах, содержащих многозарядные положительные ионы. Вследствие повышения концентрации буфера ионообменное взаимодействие между пробой и силанольными группами подавляется, благодаря чему анализ становится возможным.

Особенно важным становится подавление адсорбции на стенках при разделении белков с помощью КЭ. В этом случае можно показать,что уже повышение емкостного отношения (как меры адсорбции на стенках) с 0.001 до 0,1 приводит к росту высоты эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ) с 0.5 мкм до 15 мкм.

При повторных вводах растворов, содержащих белок, часто наблюдается изменение времени выхода. Для раствора проблема решается в основном двумя различными способами. Согласно первому можно связать ковалентно с поверхностью капилляра гидрофильный слой, второй состоит в возможности добавления к разделительному буферу веществ, которые препятствовали бы ионному обмену.

В представленном на рис. 17 примере разделения белков ионообменное взаимодействие между стенками капилляра и молекулами белка подавляется введением в буфер добавок ДАП (1,3-диаминопропана). Из-за экранирующего действия ДАП пик лизоцима при повышении концентрации ДАП всегда симметричен, и при этом даже возрастает высота пика.

С улучшением симметрии пиков, обусловленным малой адсорбцией на стенках, сильно уменьшается разбавление веществ и пик становится выше. Поэтому снижения границы обнаружения можно добиться не только улучшая детектирование, но также в значительной мере за счет сокращения уширения полос. Этот пример ясно показывает, что только для пиков с высокой интенсивностью (малым разбавлением) достигается низкий порог обнаружения.

Из-за высокой концентрации добавок электропроводность буфера становится такой большой, что для разделения белков можно применять поле только небольшой напряженности, что ведет к удлинению времени анализа.

Устранение адсорбции на стенках будет более подробно описано в разделе, посвященном разделению белков.

5.5. Перегрузка системы разделения Явление перегрузки наблюдается тогда, когда в систему разделения вводится слишком большое количество пробы. Так как в КЭ нет стационарной фазы, а разделительный объем ограничивается несколькими мкл, легко наступает явление перегрузки. Прежде всего, к перегрузке может привести неправильная регулировка прибора или слишком большая концентрация пробы. В качестве рабочего правила можно принять, что пробой может быть заполнено максимум 1-2% от объема капилляра. Для капилляра длиной 50 см это соответствует максимальной длине зоны пробы 10 мм.

Рис. 17. Уширение полос из-за, адсорбции на стенках.. Условия:

капилляр - 50 мкм;

42/50 см;

поле - 300 В/см;

буфер - 50 мМ фосфат, 20 мМ сульфат лития, 10-50 мМ ДАП;

рН 3.5;

ввод пробы давлением, I с.;

детектирование - 214 нм;

проба -0,5 мг/мл лизоцим.

Наряду с объемной перегрузкой в случае слишком больших времен ввода при высокой концентрации пробы наблюдается также перегрузка по массе. Перегрузка по массе отчетливо видна при рассмотрении зависимости значения Н от коцентрации пробы. При равном времени ввода проб увеличивается только количество введенной пробы, а не ее объем. Доля VU как вклада в уширение полос остается при этом постоянной. В качестве примера на рис.

18 показан эффект перегрузки из-за большого объема и высокой концентрации пробы.

Время ввода пробы повышается с 1 до 5 с, так что, хотя порог обнаружения и понижается примерно до 0.2 мМ, одновременно возрастает значение Н, поэтому вклад перегрузки по объему увеличивается. Отсюда видно, что вкладом перегрузки по объему в уширение полос пренебречь нельзя Даже при маленькой концентрации в области, в которой можно пренебречь перегрузкой по массе, значение Н остается при вводе пробы за 5 с больше, чем при вводе за 1 с.

Низкий порог обнаружения при вводе больших объемов пробы нивелируется сильным уширением полос (таблица 4) и связанными с этим трудностями разделения соседних пиков.

Рис. 18. Эффект перегрузки из-за большого объема и концентрации пробы. Условия: прибор для КЭ Beckman P/ACE;

капилляр - 75 мкм, 65/72 см;

поле - 347 В/см;

буфер А - мМ борат, рН 8.5;

буфер В - 40 мМ борат, рН 8.5;

ввод пробы давлением, I или 5 с;

проба фенилтриметидаммонийхлорид.

Таблица Рассчитанное влияние длины вводимой зоны пробы на уширение полос Длина вводимой зоны N для D=10-5 см2/с N для D=10-6 см2/с [мм] 1 238000 2 164000 10 81000 5.6. Наложение профилей потока При разделении в КЭ всегда надо обращать внимание на то, чтобы не было разницы в уровнях между обоими сосудами с электролитом. Даже при незначительной разнице уровней в капилляре возникает течение, которое приводит к параболическому профилю потока. Этот эффект вызывает дополнительный вклад в уширение полос и сильно зависит от радиуса капилляра. В то время как в случае капилляра с внутренним диаметром 25 мкм этим эффектом можно практически пренебречь, в капилляре диаметром 100 мкм этот эффект сильно ухудшает эффективность разделения и оказывает влияние на разрешение пиков.

5.7. Резюме Важнейшие причины уширения полос в КЭ представлены в таблице 5.

Таблица Основные причины уширения полос Причина уширения Примечание полос Продольная Соответствует теоретическому пределу;

увеличивается с диффузия уменьшением ММ и с увеличением времени анализа Термические Приводят к конвекции и к локальным изменениям вязкости буфера эффекты Длительность вво- Должна быть меньше, чем зона, возникающая в результате да пробы диффузии;

может увеличиваться для того, чтобы снизить порог обнаружения.

Адсорбция пробы Причина появления пиков с "хвостами" и плохой на стенках воспроизводимости времени миграции Электродисперсия Причина треугольной формы пиков (различие в подвижностях) Различие в Гидродинамический поток с соответствующим профилем потока уровнях жидкости 6. Аппаратура Аппаратура для КЭ появилась в продаже с 1988 года, количество предложений постоянно растет. Отдельные приборы принципиальных различий не имеют, так как сами системы разделения очень просты. Различия связаны с вводом пробы, а также числом и видом предлагаемых детекторов. Здесь не дается обзор рынка, а приводятся только типичные требования, предъявляемые к различным элементам аппаратуры.

Обзор рынка дается в журнале Nachr. Tech. Lab. (март 1993).

6.1. Источники напряжения Напряжение должно регулироваться в области от -30 кВ до +30 кВ и при заданном значении по возможности оставаться постоянным. Максимально допустимый ток составляет 250 мкА, применение существенно больших значений на практике нецелесообразно. Кроме того, оказалось выгодным, если или напряжение, или ток могли бы поддерживаться постоянными независимо друг от друга. Автоматическая переполюсовка источника напряжения необходима только тогда, когда последовательность проб нужно обработать с помощью различных методов анализа и с применением по-разному ориентированного электрического поля.

Запись кривых напряжения и тока может указать на случайные нарушения во время анализа и быть полезной при поиске ошибок. В коммерческих приборах источник высокого напряжения автоматически отключается при открывании емкости, в которой происходит анализ, так что несчастные случаи исключаются. В приборах собственной конструкции, а также в коммерческих модульных приборах КЭ также обязательны меры предосторожности.

6.2. Капилляры В КЭ обычно применяются кварцевые капилляры диаметром от 50 мкм до 100 мкм. В принципе возможно также применение стеклянных и пластиковых капилляров, которые, однако, не обладают достаточной проницаемостью в коротковолновой УФ-области, Полиамидный слой кварцевого капилляра перед применением должен быть удален на месте детектирования механически или с помощью выжигания. С недавних пор в продаже появились также капилляры с покрытиями, проницаемыми для УФ-лучей. В большинстве случаев используются необработанные и немодифицированные капилляры. Кварцевые капилляры разных фирм различаются по точности непо стоянству внутреннего диаметра, а также обработке внутренней поверхности и оптической проницаемости в области коротких волн. По этой причине для полного гидроксилирования поверхности новые капилляры перед их первым употреблением должны обрабатываться в течение 10 минут 1 М раствором NaOH и затем выдерживаться примерно 20 минут в разделительном буфере.

Наиболее дешевыми являются капилляры, которые предлагаются различными фирмами-производителями на метры. Цена их в настоящее время около 10 марок ФРГ за метр. Существенно дороже капилляры, которые продаются поштучно готовыми к употреблению. Цена здесь колеблется в зависимости от типа капилляра (с покрытием или без, с ячейкой детектора или без и т.д.) и находится в пределах от 100 до 400 марок ФРГ за капилляр.

При подготовительной работе, связанной с установкой капилляров, отрезанных самостоятельно, необходимо контролировать место среза. Только ровное место среза гарантирует безупречный ввод пробы.

Для изготовления окна для детектирования имеются две возможности: во-первых, полиимид может выжигаться, во-вторых он может удаляться с помощью концентрированной кислоты (время обработки около 1 часа). Выжигание можно осуществить просто нагретой до красного каления проволокой. Этот метод однако не следует применять для капилляров, модифицированных покрытием внутри.

Соскабливание (лезвием бритвы) полиимида довольно трудно, и при этом можно разбить капилляр.

Модификация поверхности капилляра может достигаться теми же методами, которые описаны для модификации силикагеля с целью получения стационарной фазы для ВЭЖХ или для покрытия капиллярных колонок в ГХ. Как уже отмечалось ранее, для характеристики модифицированной поверхности капилляра применяется в основном изменение ЭОП. Иногда применяется также газохроматографический метод.

Преимущества и недостатки модифицированных капилляров обсуждаются в конкретных методиках разделения, в которых используются эти капилляры. То же самое относится к капиллярам, заполненным гелем.

В КЭ типичный вводимый объем находится в пределах между 2 и 20 нл, так что при объеме пробы 1 мкл возможно многократное впрыскивание. Раствор пробы после анализа с помощью КЭ может использоваться для дальнейших исследований. В таблице 6 представлены вводимые объемы вместе с другими важными характеристиками системы разделения. Объем рассчитывался для введенной зоны про бы длиной 1 мм в капилляре с внутренним диаметром от 250 до 25 мкм. Вводимый объем в используемых капиллярах с внутренним диаметром 75 мкм составляет около нл, что соответсвует от 0.5 до 2 ppm от объема пробы 1 мкл.

Таблица 6.

Характеристики капилляра Внутренний Вводимый Объем Относительное Поверхность Отношение диаметр объем при капилляра сопротивление на метр поверхность/объем [мкм] длине 1 при длине 1 [%] [MM2] [1/мкм] мм [нл] м [мкл] 250 49,4 49,4 625 785 160 20,1 20,1 256 502 100 7,9 7,9 100 314 75 4,4 4,4 56 236 50 2,0 2,0 25 157 25 0,5 0,5 6 79 Помимо вводимого объема, важным параметром разделительной системы является также сопротивление капилляра. Эта характеристика была занесена в табл. 6 как отношение сопротивления данного капилляра к сопротивлению капилляра с внутренним диаметром 100 мкм. Из таблицы также видно, что сопротивление при уменьшении внутреннего диаметра от 100 мкм до 50 мкм падает до 25% от первоначального значения. Это означает, что при идентичных экспериментальных условиях джоулево тепло уменьшается на четверть. Поскольку удваивается также отношение поверхности к объему, возникающее тепло будет легче отводиться. Вот почему для разделения выгодно использовать узкие капилляры. Однако имеются также и два осложняющих обстоятельства: во-первых, при этом уменьшается толщина слоя при УФ детектировании в режиме реального времени и поэтому снижается чувствительность детектирования, во-вторых, возрастает время, необходимое для обновления разделительного буфера.

Таблица Теоретическая оценка времени, необходимого для замены буфера в капилляре, в зависимости от внутреннего диаметра капилляра.

Внутренний диаметр Время для промывки Время для промывки 5 капилляра [мкм] определенным объемом (около кратным объемом капилляра 100 мкл) 160 1 мин 1 мин 100 6 мин 33 с 2 мин 34 с 75 20 мин 43 с 4 мин 33 с 50 1 час 44 мин 51 с 10 мин 14 с 25 1 день 3 часа 57 мин 43 с 40 мин 10 45 дней 12 часов 16 мин 4 часа 16 мин 5 2 года 4 часа 16 мин 17 часов 4 мин Времена относятся к буферной системе с вязкостью воды, капилляру длиной 1 м и разнице давлений около 0.5 бар. Причина сильного увеличения времени промывки заключается в зависимости потока от внутреннего диаметра капилляра, которая формулируется законом Хагена-Пуазейля:

dV p r t = dt 8 L В таблице 7 приведены времена, которые необходимы для промывки капилляра определенным объемом (колонка 2) или объемом, в несколько раз превышающим объем капилляра (колонка 3). Времена, рассчитанные в этой таблице, дают также представление о зависимости времени ввода при вводе зон пробы одинаковой длины и, соответственно, одинаковых объемов в капиллярах с различным внутренним диаметром. Если, например, мы будем вводить в капилляр диаметром 50 мкм такой же объем пробы, как в капилляр диаметром 100 мкм, то время ввода будет в 16 раз больше. Если же будем вводить зоны пробы одинаковой длины, необходимо по крайней мере еще 4-х кратное время ввода.

6.3. Ввод пробы Таблица 8.

Сопоставление способов ввода пробы для КЭ.

Электро- Гидростатический Гидродина- Ввод дроблением пробы кинетический ввод мический ввод ввод Движущая Электрическое Сифон-эффект Давление или Электрическое сила ввода поле вакуум "дробление" пробы и пробы система "расщепления" Автомати- да да Да нет зация Минимальное <2,0 мкл <2,0 мкл 2,0 мкл >10 мкл с помощью количество многократный многократный многократный дозировочного капилляра пробы ввод ввод ввод или ВЭЖХ-шприца многократный ввод пробы невозможен Побочные да нет нет да (для электрического эффекты при "дробления") вводе пробы нет (для системы "расщепления" потока) Относи- 4,1% <2,9% 2-3% <3% (идеальный случай тельное (опытная для электрического "дроб средне- величина) ления", 2% (для системы квадратичное "расщепления" потока) отклонение Воспроизводимый ввод пробы представляет в КЭ наиболее сложную проблему.

Для того, чтобы не вызвать уширения полос, зона пробы должна быть мала. Поэтому необходимо вводить очень маленький объем пробы - от 5 до 50 нл. Слишком большой объем пробыочень быстро приводит к искажению пика и ухудшению разделения. Чтобы отвечать этим высоким требованиям, а также для облегчения работы со столь малыми объемами, необходима миниатюризация и автоматизация ввода пробы.

Воспроизводимый ввод маленьких объемов пробы является важной предпосылкой для количественного анализа и стандартизации отклонений. Важнейшие способы ввода пробы, которые находят применение в различных автоматизированных коммерческих приборах, представлены в табл. 8.

6.3.1. Ввод пробы давлением Ввод пробы обеспечивается созданием разницы давлений между сосудом для пробы и концом капилляра, при этом давление либо повышается в сосуда для пробы, либо снижается на конце капилляра. Обе эти возможности допускают также простую промывку капилляра свежим буферным раствором. Количество вводимой пробы рассчитывается по соотношению:

p r4 ti c Q = 8 L и зависит только от разницы давлений и времени ввода пробы. При временах ввода порядка нескольких секунд разность давлений лежит в области нескольких миллибар. В коммерческих приборах это наиболее распространенный способ ввода проб.

Проблему при этом методе ввода пробы составляет сжимаемость газа. Схема на рис. 19 поясняет эту проблему. Во-первых, выбранное для ввода давление должно быстро достигаться, во-вторых, падение давления после ввода пробы не должно быть резким. Поэтому полезно использовать в работе интеграл давление-время.

Относительное стандартное отклонение, по нашим оценкам, лежит в интервале между 2% и 3%;

применяя внутренний стандарт можно уменьшить эту величину до 1% и ниже.

Для определения вводимого объема существуют две принципиальные возможности.

Во-первых, это удается сделать с помощью расчета, во-вторых, его легко можно контролировать посредством измерения. Расчет вводимого объема базируется на законе Хагена-Пуазейля и сильно зависит от параметров, которые обычно известны. В качестве примера можно назвать вязкость, а также радиус капилляра. Колебание радиуса капилляра только на 1% вызывает очень большую ошибку в расчетах, по скольку в законе Хагена-Пуаэейля радиус входит в четвертой степени.

Рис. 19. Кривая давление-время при вводе проб:

а) неконтролируемое повышение давления (например, в результате простого открывайся вентиля давления);

b) контролируемое повышение и понижение давления. Затемненная площадь - нормальный интеграл давление-время, заштрихованная площадь - коррекция посредством дополнительного импульса давления.

Практическое определение осуществляется очень просто измерением проскока:

время ввода выбирается так, чтобы зона пробы УФ-активного раствора доходила до детектора. Полученный ступенчатый сигнал анализируется таким образом, что отыскивается точка сигнала на половине высоты, и перпендикуляр на ось времени дает время проскока растворителя. Поскольку в данном случае можно работать с таким же растворителем, который вводится в систему, ошибка, связанная с вязкостью или радиусом капилляра, может быть незначительной. Расчет вводимого объема проводится теперь просто через время. Например, известно, что поток перемещается на 17.7 мм в минуту. При времени ввода 30 секунд (типично для анализа ионов в КЭ) и длине вводимой зоны пробы 8.9 мм это соответствует количеству почти 40 нл (при внутреннем диаметре 75 мкм).

6.3.3. Электрокинетический ввод пробы При этом способе ввода сосуд с пробой, в который погружен капилляр, соединяется с источником напряжения, и под действием короткого импульса напряжения компоненты пробы перемещаются в разделительный капилляр. Количество введенной пробы при этом способе зависит от величины приложенного напряжения (Uj), времени (tj), в течение которого приложено напряжение, и подвижности компонентов пробы:

(µ + µ ) r2 Ui ti c p Q = L где с - концентрация пробы в растворе. Из этой зависимости видна проблема данного способа ввода пробы: компоненты пробы с различной подвижностью будут детектироваться по-разному. Если сравнить площади пиков проб с различными подвижностями при электрокинетическом и гидростатическом способах ввода пробы, то отчетливо видно, что ион, перемещающийся быстрее, при электрокинетическом вводе всегда даст больший пик и будет вводиться в капилляр с некоторой селективностью.

Таблица 10 показывает отношение площадей для растворов пробы равной концентрации быстро перемещающегося рубидия и более медленных тестовых ионов.

Если разделить отношение площадей пиков из колонок 2 и 3, то получим "фактор различия" обоих ионов. Он показывает, во сколько раз больше концентрируется более быстрый ион при электрокинетическом вводе пробы. Колонка 4 дает дополнительно отношение подвижностей ионов. Корреляция с колонкой 3 убедительно показывает, что "фактор различия" совпадает с отношением подвижностей. Различная скорость миграции при электрокинетическом вводе проб определяет разную скорость отбора разных ионов.

Электрическое сопротивление раствора пробы (ионная сила) по сравнению с раствором электролита также влияет на воспризводимость метода. Это явление проще всего может быть показано при непосредственном сравнении обоих способов ввода пробы и представлено на рис. 20. Если вводится раствор ионов калия и лития в чистой воде (сопротивление 18 кОм), то разница между гидростатическим и электрокинетическим вводами пробы наибольшая. Разница будет меньше при увеличении электропроводности раствора пробы. В результате повышенной электропроводности при электрокинетическом вводе будет происходить перенос зарядов и других ионов и будет вводиться меньше ионов пробы.

Таблица. Сравнение отношения площадей пиков при электрокинетическом и гидростатическом способах ввода пробы.

Пара Отношение Отношение Фактор различия Отношение под пиков площадей при площадей при ("дискриминационное вижностей электронети- гидростатическом отношение") ческом вводе вводе пробы Rb+/ K+ 1.0 0.94 1.06 1. Rb+ /TMA 2.08 1.33 1.57 1. Rb+/ Li+ 1.17 0.69 1.70 1. Rb+ /ДЭА 6.91 3.93 1.76 1. Rb+ /apr 4.34 1.92 2.26 2. ТМА - триметиламин, ДЭА - диэтиламин, арг - аргинин.

Если существует электроосмотический поток, то при небольшом сопротивлении раствора пробы ионы вводятся в капилляр в основном в результате переноса раствора пробы за счет ЭОП, и электрофооретическое перемещение ионов играет только второстепенную роль.

Из рисунка также ясно видно, что этот эффект появляется только у ионов с очень высокой подвижностью. Наклон прямой для электрокинетического ввода калия больше, чем для лития. Причина заключается в большей подвижности калия. В случае гидродинамического ввода наклоном обеих прямых можно пренебречь, поскольку в данном случае вводимое количество пробы не зависит от сопротивления раствора пробы.

Несмотря на эти недостатки, с недавнего времени широко используется электрокинетический ввод пробы. С помощью так называемого "электростэкинга" удается сконцентрировать пробу от 10 до 500 раз, так что порог обнаружения метода вследствие этого в целом может быть снижен. Рис. 21 показывает процесс "электростэкинга" на примере ввода раствора с ионами, которые мигрируют с ЭОП.

Подробности оптимизации этой техники даются а разделе "Эффекты обогащения при вводе проб (стэкинг)".

Для автоматизированного электрокинетического ввода пробы было установлено относительное стандартное отклонение (ОСО) 4.1%. В общем, как и во всех методах с проблемами при вводе пробы, например, при капиллярной ГХ, за счет применения внутреннего стандарта можно существенно улучшить воспроизводимость количественного анализа.

Рис. 20. Зависимость площади пика от электрического сопротивления раствора пробы при гидростатическом и электрокинетическом способах ввода пробы.

6.3.4. Делитель пробы По аналогии с капиллярной ГХ, при КЭ также описана система деления при вводе пробы. Электрические и гидродинамические системы деления пробы различаются между собой.

У электрического делителя пробы (см. рис. 22) в середине дозировочного капилляра находится ответвление в разделительный капилляр. К обоим капиллярам (дозировочному и разделительному) приложено поле различной напряженности. Таким образом, проба движется в двух различных токовых цепях, причем отношение деления можно давать как отношение обоих токов в капиллярах. Сообщалось, что погрешность этого метода не более 3%.

При системе деления потока с помощью шприца, обычно применяемого в ВЭЖХ (ВЭЖХ-шприца), объем пробы вводится в Т-образную часть. Отношение деления дается через отношение диаметров и длин разделительного и сливного капилляров.

Для этого метода ОСО, как описано в литературе, составляет около 2%, однако необхо дим относительно большой объем пробы. Другие системы деления, в частности, основанные на использовании ВЭЖХ-насосов, обладают худшей воспроизводимостью.

Рис. 21. Ввод раствора пробы с низкой электропроводностью. А:большой объем пробы впрыскивается гидродинамически;

В:молекулы пробы перемещаются к пограничному слою между зоной ввода пробы и разделительным буфером;

С: скон центрированные молекулы пробы перемещаются в разделительный буфер.

6.3.5. Эффекты обогащения при вводе пробы (стэкинг) Проблемы, связанные с воспризводимостью ввода пробы при КЭ, обусловлены, кроме всего прочего, небольшой разницей в давлении и коротким временем ввода пробы. Большие вводимые объемы при нормальных условиях очень быстро уменьшают эффективность разделения за счет перегрузки по объему. Поэтому пытаются вводить большие объемы и концентрировать зоны перед разделением. Это удается за счет использования различных эффектов перед собственно разделением с помощью КЗЭ.

Эффекты концентрирования получаются, если работают с негомогенными буферными системами. В простейшем случае проба вводится из чистого водного раствора. Из-за различия в электропроводности между раствором пробы и буфером проба сначала ускоряется в сильном поле до границы между буфером и раствором пробы, но затем замедляется после входа в область буфера с пониженнной напряженностью поля. Этот эффект уже был показан на рис. 21 и при электрокинетическом вводе пробы описан как "электростэкинг".

Рис. 22. Схематическое представление электрического разделения пробы. I1, I2, I соответствуют потокам в различных частях капилляра;

n1 соответствует количеству пробы перед ее разделением;

n2- введенное и n3- оставшееся количества пробы.

В качестве альтернативы раствору пробы с высоким сопротивлением непосредственно перед вводом пробы в капилляр вводится "водяная пробка". Падение напряжения в непроводящей электричество воде так велико, что следующая зона пробы концентрируется при имеющемся там существенно более высоком напряжении.

При этом степень концентрирования доходит до 100 (см. рис.23).

При "электростэкинге", однако, концентрация молекул пробы во время процесса ввода падает на входе в капилляр до достижения равновесного состояния. Это будет представлять проблему для ионов с малой подвижностью, поскольку в этом случае допустимая длина вводимой зоны пробы будет превышена прежде, чем будет достигнуто равновесное состояние. В этом случае достигается очень незначительное концентрированно пробы. ЭОП также играет при "электростэкинге" важную роль. Если ЭОП и направление перемещения ионов ориентированы одинаково, это также будет мешать концентрированию пробы. При вводе пробы на входе в капилляр образуется зона, которая обладает очень малой электропроводностью. При увеличении подвижности ЭОП она будет формироваться быстрее и возможность "электростэкинга" сужается.

При миграции пробы против ЭОП нужно различать два случая:

если µel>>µЭОП, то возможно получение хороших результатов;

при µel>µЭОП проба не может быть введена.

Резюмируя, можно сказать, что при нормальной полярности прибора КЭ (выход заземлен) и направленном к катоду ЭОП могут концентрироваться положительно заряженные молекулы пробы, в то время как при противоположном поле при вводе пробы концентрируются анионы.

Еще эффективнее может концентрироваться проба, если поле после гидродинамического ввода прикладывается на короткое время в противоположном направлении. При условии, что ионы, которые нужно определять, перемещаются в направлении против ЭОП, капилляр может заполняться раствором пробы почти до детектора (гидродинамический ввод), и раствор пробы может удаляться из капилляра исключительно за счет инверсии полярности. Одновременно ионы, перемещающиеся против ЭОП, могут концентрироваться в пограничном слое между раствором пробы и разделительным буфером. Прежде, чем этот пограничный слой достигнет входа в капилляр, с помощью переполюсовки источника напряжения может начинаться собственно разделение. Точный момент времени для переполюсовки можно установить, следя за изменением тока, так как ток в процессе концентрирования постоянно увеличивается. Причина этого в том, что зона раствора пробы (с высоким сопротивлением) удаляется из капилляра, Когда сила тока достигает примерно 90% от максимального значения (капилляр заполнен только разделительным буфером), то источник напряжения может переполюсовываться и молекулы пробы, удерживаемые в узкой зоне вблизи входа капилляра, разделяются. На рис. 24 показаны отдельные стадии этого способа ввода, который в целом называется "стэкинг" с обращением поля.

Из-за большого вводимого объема ионы пробы концентрируются примерно тысячекратно. Недостатком метода является то, что при слишком поздней переполюсовке часть ионов пробы выходит из капилляра, и что могут анализироваться только либо анионы, либо катионы.

Рис. 23. Разделение РТН-аргинина и РТН-гистидина. А) электрокинетический ввод из буфера;

В) электрокинетический ввод из воды;

С) электрокинетический ввод из воды с "водяной пробкой" между пробой и буфером.

Другая возможность использовать негомогенность буфера для концентрирования молекул пробы состоит в выборе буфера и (или) растворов пробы с различными значениями рН. При этом подвижность ионов при прохождении скачка рН на приграничной поверхности между буфером и раствором пробы изменяется и происходит концентрирование. Например, белки вводятся из раствора при высоком значении рН и разделяются в буфере с низким значением рН, поэтому молекулы пробы перемещаются в щелочной среде из-за их отрицательного заряда сначала в направление анода, протонируются в приграничном слое буфера и прекращают свое перемещение (отсутствие эффективного заряда). Благодаря диффузии и миграции протонов и гидроксид-ионов ступенька рН исчезает, что приводит к разделению пробы с помощью КЗЭ. Аналогично концентрируются пробы с помощью ИЭФ. ИТФ может также использоваться как "стэкинг" в режиме реального времени. Сам принцип разделения будет описан позже Для проведения "стэкинг"-процесса необходимо использовать веду щий и конечный электролиты, чьи подвижности несколько больше (ведущий электролит) или несколько меньше (конечный) чем подвижности ионов пробы. При этом в большинстве случаев в качестве разделительного буфера будет применяться ведущий электролит и после ввода пробы часть капилляра будет заполнена конечным элект ролитом. Вначале, после включения напряжения, компоненты пробы подвижность которых находится между подвижностью ведущего и конечного электролитов, за счет ИТФ концентрируются в узкие полосы через некоторое время зона конечного электролита из-за диффузии и миграции ионов расплывается и это приводит к зонно электрофоретическому разделению ионов. При этом методе порог обнаружения снижается примерно в 500 раз. В этой форме можно проводить ИТФ-обогащение компонентов пробы с помощью коммерческой аппаратуры. Более эффективного обогащения можно достичь применяя два разделительных капилляра. Сначала ИТФ проводится в относительно толстом капилляре, снабженном на конце детектором по электропроводности. С помощью измеренного там сигнала можно точно определить, когда сконцентрированная проба может переводиться в разделительный капилляр, установленный также на конце этого капилляра. При этом достигалось примерно 10000 кратное обогащение. Другой метод совмещает хроматографическое обогащение с последующим КЗЭ. Для этого предлагаются специальные капилляры, которые со стороны «входа» имеют зону несколько миллиметров заполненную хроматографической фазой (в основном С18).

Обогащение осуществляется при прокачивании раствора пробы через капилляр, при этом гидрофильные молекулы пробы адсорбируются в режиме обращенной фазы и могут быть десорбированы после ввода пробы с помощью метанола или ацетонитрила.

При этом растворитель может переноситься к стационарной фазе как с помощью давления, так и с помощью ЭОП При этом, однако, важно, чтобы пространство между стационарной фазой и детектором заполнялось разделительным буфером.

Преимуществом этого метода является его пригодность для неионной гидрофобной пробы. Эта техника, однако, из-за плохой воспроизводимости, а также из-за высокой стоимости разделительного капилляра мало распространена. Обзор методов снижения порога обнаружения при КЭ за счет концентрирования пробы в режиме реального времени дан в таблице 11.

6.4. Термостатирование Термостатирование служит главным образом отведению джоулева тепла.

Воздушные и жидкостные термостаты находят применение в коммерческих приборах, где температура может изменяться от 15 °С до 60 °С. Помимо охлаждения капилляра за счет окружающего воздуха, имеются также хорошо разработанные методы отвода джоулева тепла от капилляра. В большинстве случаев отвод тепла достигается за счет сильного воздушного охлаждения, при котором капилляр обдувается воздухом со скоростью до 20 см/с. Еще эффективней отвод тепла с помощью охлаждающей жидкости (тепловое сопротивление 2.5*10-4 В/см*К) вместо воздуха. Она будет омывать кроме этого "вход" около детектора и "выход" около капилляра. При этом с водой можно работать до разделительного напряжения 15 кВ, для более высокого напряжения применяют дорогостоящие фторуглеводороды. Влияние температуры на эффективность и селективность разделения в настоящее время еще обсуждается. По этой причине в случае коммерческих приборов термостатируются только капилляры (или их часть), а в сосуде для буфера не всегда поддерживается такая же температура, как в капилляре. Для разделения фрагментов ДНК в заполненных гелем капиллярах было показано, что хотя с повышением температуры производительность разделения снижается, относительная миграция, т.е. селективность разделения, может улучшиться.

Дополнительно к термостатированию капилляра в некоторых приборах имеется возможность термостатировать автозагрузчик пробы. Это особенно полезно при анализе термолабильных проб. Недостатком этих конструкций является то, что помимо пробы охлаждается также разделительный буфер и поэтому существует разность между температурой разделительного буфера и выбранной температурой раздели тельного капилляра.

6.5. Детектирование При детектировании в КЭ компоненты пробы проходят через часть капилляра, в которой происходит детектирование в режиме реального времени или детектируются на конце капилляра в режиме с разделением времени. При этом, в отличие от хроматографии, необходимо обратить внимание на то, что через детектор пробы движутся с различными скоростями.

6.5.1. Уф-детектирование Большинство аппаратурных требований не в последнюю очередь относятся к детектированию, так как при детектировании непосредственно в колонке УФ поглощение происходит в слое очень малой толщины. Несмотря на это, наиболее часто применяемыми детекторами для измерения УФ-поглощения являются детекторы, применяемые в ВЭЖХ. Из-за очень малой толщины слоя (средняя величина внутреннего диаметра капилляра) к детекторам предъявляются высокие требования, касающиеся чувствительности, шумов, влияния светорассеяния и т.д. Для того, чтобы избежать потери эффективности из-за смешивания вне капилляра, детектирование осуществляют прямо в капилляре.

Типичная ширина зоны в капилляре находится в пределах 5 мм (N= 500000), что соответствует объему 10 нл (капилляр диаметром 50 мкм). Этот крайне малый объем является также причиной очень высокой чувствительности по массе, часто встречающейся в рекламе. Мировым рекордом является в настоящее время порог обнаружения в 300 молекул при отношении сигнал/шум три к одному для аминокислот и индуцируемой лазером флуоресценции. Для рутинного применения, однако, более важна концентрационная чувствительность. Она более чем скромна из-за короткого пути поглощения (средний диаметр капилляра).

При УФ-детектировании в КЭ концентрационная чувствительность в 30-100 раз ниже, чем в ВЭЖХ. Это зависит для поперечно облучаемых капилляров от шумов детектора и эффективной толщины слоя, которая отличается от номинальной (равной диаметру капилляра) в сторону уменьшения. Заметно мешает также частичное свето рассеяние из-за несовершенной фокусировки (свет стенок капилляра) и неидеальной цилиндрической формы капилляра. Оптимизацией оптики (щель, линза и т.д.) можно в основном исключить эти эффекты. Очень трудной оптимизацию оптики УФ-детекторов для КЭ делает также полное внутреннее отражение. На рис 25 показаны рассчитанные световые пути для различных апертур диафрагмы и капилляров. Большинство фирм производителей применяют поэтому или фокусирующие системы линз, которые освещают область капилляра примерно в 0.5 нм и меньше, или щели, которые имеют ширину от 50 до 200 мкм и длину от 100 до 300 мкм.

Рис. 24. Обогащение пробы с помощью изменения направления поля.

Существует много примеров улучшения чувствительности при УФ-опредёлении в КЭ за счет увеличения толщины слоя детектирования Чтобы увеличить толщину слоя и снизить границу обнаружения, были протестированы различные экспериментальные разработки Помимо применения капилляров прямоугольной формы, было также изучено применение в КЭ известных из микро-ВЭЖХ Z-ячеек.

Таблица 11.

Методы концентрирования («стэкинг»-мвтоды) в КЭ Метод Снижение порога Применимость Примечание обнаружения "Электростэкинг" 10-100 прямая Быстро развивающийся метод Результат зависит от электропроводности раствора пробы и подвижности ионов пробы Обращение поля 50-1000 прямая Развитие методов для катионов и анионов различно ИЭФ 10-100 прямая Хорошо применимо для слабых кислот и оснований ИТФ 100-1000 условная Необходима адаптация метода для каждой новой молекулы пробы Хроматографичес 100-500 только со спе- Необходим дорогой и трудно кое обогащение циальным ка- устанавливаемый капилляр пилляром Применение прямоугольных капилляров улучшает детектирование примерно в раз. Практическая польза этого улучшения может не реализоваться из-за больших проблем при вводе пробы.

Применение Z-ячейки в КЭ не повышает чувствительность определения, так как помимо сигнала за счет светорассеяния также сильно увеличиваются шумы. Новейшие разработки этих систем показывают, что за счет сферической линзы на стороне источника света непосредственно перед изломом капилляра светорассеяние может быть минимизированно. Благодаря этому можно достигнуть улучшения чувствительности примерно в 11 раз для Z-ячейки с длиной светового пути 3 мм. При выбранной длине пути 3 мм отсутствия влияния или очень малое влияние на эффек тивность следует ожидать только для "широких" пиков. Из ВЭЖХ известно, что объем пика должен быть в 5 раз больше, чем объем ячейки детектора. Это означало бы для ячейки длиной 3 мм в КЭ, что пик должен иметь в капилляре ширину 1.5 см. Однако, поскольку в капиллярном электрофорезе происходит детектирование в режиме реального времени, и благодаря малому объему ячейки детектора и отсутствию соединительных элементов размывания зон не происходит, это правило, конечно, не вполне применимо.

Удлинение участка детектирования, как в случае описанной Z-ячейки со световым путем 3 мм, имеет определенное влияние на эффективность и, как следствие, на разделение зон пробы, особенно, если в течение короткого времени анализа достигается высокая эффективность. При эффективности анализа 500 тыс.

теоретических тарелок и времени миграции 5 минут от начала колонки до ячейки де тектора ширина пика составляет 1.0 мм.

Это отчетливо указывает на несоответствие между объемами детектирования и пика в Z-ячейках, Такие проблемы менее существенны в капиллярах с ячейкой детектирования, имеющей форму пузырька, так как объем пика при прохождении ячейки детектирования остается приблизительно постоянным, и длина пика в капилляре будет сокращаться. Поэтому с увеличением внутреннего диаметра длина пика автоматически сокращается. Это относится не только к прохождению зон веществ через ячейку детектора, но также и к электрофоретическому перемещению веществ, так как они перемещаются вдоль линий поля через весь объем ячейки детектирования.

Рис. 26 показывает структуру и расположение стандартных блоков детекторов с одной длиной волны, сканирующих детекторов, а также ДМД. Наиболее часто используемым является УФ-детектор с постоянной или изменяемой длиной волны. Для этого в качестве источника света должен использоваться непрерывный излучатель.

Даже если энергия света из-за этого значительно снижена, возможна работа в области длин волн от 190 до 320 нм.

Еще большие длины волн вряд ли можно использовать, так как только очень немногие молекулы обладают поглощением в этой области. Рис. 27 показывает сравнение интенсивности света дейтериевой лампы и некоторых других дискретных излучателей. При этом интенсивность света дискретных излучателей выше, чем у дейтериевой лампы. Это наглядно показывает возможности оптимизации УФ детектирования за счет повышения количества испускаемого света. Ртутную (185 нм и 254 нм) или цинковую (214 нм) лампы удается использовать только в одноволновых детекторах. Количество света, производимого этими лампами, может быть примерно в 50 раз больше, чем в случае употребляемых обычно дейтериевых ламп, так как в дан ном случае не возникают потери, связанные с дифракцией на решетке.

Рис. 25. А) апертурная диафрап-ta шириной 50 мкм, капилляр с внутренним диаметром 50 мкм и внешним диаметром мкм;

В) апертурная диафрагма шириной 145 мкм, капилляр с внутренним диаметром 50 мкм и внешним диаметром 350 мкм;

С) апертурная.циафрагмл шириной 350 мкм, капилляр с внутренним диаметром 50 мкм и внешним диаметром 350 мкм;

D) с линзой, капилляр с внутренним диаметром 75 мкм и внешним диа метром 275 мкм;

Е) с линзой, капилляр с внутренним диаметром SO мкм и внешним диаметром 350 мкм.

Рис. 26. Путь свети различных. УФ детекторов для КЭ. А - детектор одной длины волны с ртутной лампой (1), фильтр (5);

В многоволновой детектор с дейтериевой и вольфрамовыми лампами (2), поворачиваемое зеркало (3) и решеточный мо нохроматор (6);

С— быстросканирующий детектор с враща ющимся решеточным монохроматором;

D ДМД (8).

Несмотря на незначительную толщину слоя, запись УФ-спектров возможна с помощью чувствительных быстрых сканирующих детекторов или ДМД.

Применением многоволнового детектора в КЭ могут быть привнесены известные из ВЭЖХ преимущества. К ним относятся облегчение оптимизации буфера за счет автоматического распознавания пика, контроль гомогенности пика за счет сравнения спектров в пределах пика, а также оптимизация чувствительности для веществ с сильно различающимися УФ-спектрами за счет интегрирования сигналов при различных длинах волн.

Вставить рис 27 стр Рис. 27. Сравнение полезной интенсивности светя дейтериевой, ртутной и цинковой ламп, измеренной с помощью фотоэлемента.

Из-за осложнений в процессе записи данных в случае быотросканирующего детектора измеряется только ограниченное количество точек Б секунду. Поэтому шумы детектора при приеме спектральной информации при переходе от одноволнового режима к режиму быстрого сканирования увеличиваются примерно в 10 раз. Кроме того, спектральные данные из-за медленной записи при появлении пика с очень крутыми краями могут быть представлены искаженно. Диодная матрица, напротив, позволяет записывать многоволновой спектр в режиме реального времени. При этом УФ-спектры не могут искажаться за счет медленной записи данных. Так как именно при КЭ, когда из за высокой эффективности пиков и короткого времени анализа возникают очень резкие края пиков и может реализоваться ширина пиков в несколько секунд, особенно важна быстрая запись спектров.

Пробы, не обладающие поглощением в УФ-области, можно обнаружить с хорошей чувствительностью на коммерческих УФ-детекторах с помощью непрямого УФ детектирования. Для этого к буферу добавляют электролит, обладающий УФ поглощением, подвижность которого близка к подвижности разделяемой пробы.

Количество добавленного вместо пробы электролита (механизм вытеснения) должно быть чрезвычайно мало из-за соблюдения условия необходимой электронейтральности, так что буфер в данном случае будет обладать более высокой прозрачностью, что выражается в появлении отрицательного пика. Это схематично представлено на рис.

28. Примеры применения даются в разделе, посвященном анализу ионов.

Чувствительность обнаружения при непрямом УФ-детектировании зависит от молярного коэффициента экстинкции добавляемого фонового электролита, поглощающего в УФ области, и соответствует чувствительности обнаружения нормального УФ-поглощения.

Рис. 28. Принцип непрямого УФ детектироваиия.

6.5.2. Фпуоресцентное детектирование Помимо УФ-детекторов, с недавнего времени выпускаются также флуоресцентные детекторы. Отличия от детекторов ВЭЖХ заключаются в основном в длинах волн источников света. Кроме обычно используемых дейтериевой и импульсной ксеноновой ламп предлагаются также существенно более дорогие лазерные системы, причем возбуждение в них происходит в видимой области длин волн, так что должны применяться соответствующие производные проб.

Возможно также непрямое флуоресцентное детектирование, при этом речь может идти об универсальной методике детектирования, если имеется в распоряжении подходящий флуорофор без эффекта тушения.

6.5.3. Прочие методы детектирования Предлагаются методы электропроводности, а также другие электрохимические детекторы. Однако в настоящее время они еще коммерчески недоступны. В качестве примера здесь можно упомянуть определение следов щелочных и щелочно-земельных металлов с помощью микроэлектродов непосредственно в капилляре.

При детектировании по электропроводности возникает проблема, которая заключается в том, что помимо фоновой электропроводности электролита обнаруживается и некоторая электропроводность в зоне вещества. Техника подавления этого нежелательного явления, используемая в ВЭЖХ, здесь не применима. Успешное использование детектора по электропроводности в КЭ описано много раз. С помощью амперометрического детектирования удается прямое обнаружение мейромедиаторов в нервных клетках, причем толщина капилляров, которые применяются для разделения, составляют 5 мкм.

Низкие скорости потока (100 нл/мин) делают возможным сочетание КЭ с масс спектрометрией (МС). Главная проблема при таком сочетании состоит, однако, в том, что в переходнике из капилляра в источник ионов элюент не будет всасываться из капилляра за счет существующего там вакуума. При падении давления 1 бар в капилля ре длимой 1 м (внутренний диаметр 50 мкм) линейная скорость потока составляет см/с. Возникающий в результате этого ламинарный параболический профиль потока привел бы к заметной потере эффективности. По этой причине перед ионизацией нужно проводить "улучшение" потока в капилляре. Ионизация электрораспылением позволяет осуществлять МС-детектирование биополимеров в результате образования множества заряженных частиц. В качестве примера показано разделение четырех фосфониевых ионов. Если записать общий ионный ток, то получим только два пика. Селективное детектирование отдельных соединений возможно при определенном соотношении масса/заряд (правая часть рис. 30).

Рассматривались также другие методы детектирования (спектроскопия комбинационного рассеяния, измерение радиоактивности в режиме реального времени, круговой дихроизм, коэффициенты преломления света, капиллярная вибрация). Их возможности для рутинного использования в настоящее время еще не определены.

Само собой разумеется, что могут использоваться УФ-неактивные и нефлуоресцирующие пробы, если применять реагенты, употребляемые обычно для получения соответствующих производных перед разделением хромофоров и флуорофоров. В результате этого, однако проявляют себя недостатки предколоночного происхождения, известные из ВЭЖХ. Специальные реагенты для электрофореза, имеющие помимо хромофора еще и соответствующий заряд, являются темой для обсуждения.

Рис. 29 Конструкция интерфейса соединения КЭ-МС.

При детектировании на основе лазерной флуоресценции для определения с помощью возбуждения на длине волны около 380 нм в большинстве случаев пробу перед разделением необходимо подвергнуть воздействию флуоресцентной метки. В качестве примера назовем разделение 3-(4-карбоксибензоил)-2-хинолин карбоксиальдегид (КБХКА)- производных аминокислот.

Описаны первые экспериментальные разработки для получения производных после прохождения колонки, однако они пока еще не пригодны для использования вне стен исследовательских лабораторий.

В таблице 12 представлены достижимые границы обнаружения наиболее часто встречающихся систем детектирования. Из таблицы видно, что благодаря небольшому объему может достигаться высокая чувствительность по массе. Концентрационная чувствительность находится в пределах ВЭЖХ.

Рис. 30. МС-дегектирование при КЭ: а) универсально!,- дстсктчрона-ние при регистрации полного ионного тока;

и) tV.7i.-A 7 ивное детектирование при регистрации отдельных читнчтенпи массы к заряду.

6.6. Количественный анализ На воспризводимость получаемых результатов влияет множество факторов:

разница в электропроводности между разделительным электролитом и раствором пробы, большое различие в концентрации компонентов пробы и их электрофоретическая подвижность, различие в составе пробы. С другой стороны, преимущества КЭ проявляются тогда, когда не-~ обходимо проанализировать очень малые объемы проб;

например, при 5 анализе ионов в дождевых каплях или в биологических пробах.

Рис. 31 Некоторые часто используемые реакции получения производных.

Таблица Методы детектирования в КЭ Принцип Граница Граница Типовое при- Примечание детектирования обнару- обнаруже- менение жения. ния. Кон- Абсолют- центрация ное коли- [моль/л] чество [моль] УФ-поглощение 10-15-10-13 10-7-10-4 Ароматические В настоящее время соединения, стандартное белки, детектирование в КЭ, нуклеиновые имеется во всех кислоты коммерческих приборах Непрямое УФ- 10-16-10-13 10-8-10-4 Ионы метал- Имеются в коммерческих детектирование лов, амины, приборах органические и неоганичес-кие ионы, сахара Флуоресценция 10-18-10-13 10-9-10-4 Производные Для большинства проб аминокислот, необходимо получение ДНК, пептиды, производных белки Лазерная 10-21-10-17 10-13-10-7 Фрагменты ДНК, Лазер еще очень дорог, в флуоресценция производные основном применима аминокислот только в видимой и УФ-об ластях Непрямая 10-16-10-14 10-7-10-5 Спирты, амины, Известно только немного флуоресценция анионы, катионы, приложений сахара Амперометрия 10-16-10-14 10-8-10-6 Легко окисляе- Пригоден для капилляров с мые и вос- внутренним диаметром до станавливаемые мкм вещества, например, нейромедиаторы Кондуктометрия 10-18-10-16 10-7-10-5 Ионные пробы, Недостаток: трудное например, ионы манипулирование при за металлов, амины, мене капилляра карбо-новые Потенциометрия 10-19 10-8 Щелочные и Недостаток: трудное щелочноземе- манипулирование и по льные ионы, лучение микроэлектродов селективное определение за счет ионоселективных микроэлектродов МС 10-17 10-10-10-8 Белки, пептиды, Отсутствуют проблемы мониторинг совмещения, доступны лекарств коммерческие интерфейсы 32 Радиоактивные 10-18-10-16 10-15-10-13 Р и С в био- Хорошая чувствительность измерения химических определения с помощью объектах системы остановки потока Миниатюризация ввода пробы в коммерческих приборах, между тем, прогрессирует так сильно, что из общего объема пробы 3 мкл в автоматизированных приборах можно сделать множество вводов. При этом, однако, не исключено, что состав пробы во время ввода изменится. Причина заключается в занесении буфера в пробу или в селективном вводе определенных компонентов пробы при электрокинетическом вводе. Работа со столь малыми объемами затруднена, если объем пробы в автозагрузчике может изменяться за счет испарения. Эти эффекты можно уменьшить при помощи охлаждения пробы или использования герметичного затвора в сосуде для пробы. Если нео бработанные данные анализа представлены в форме хроматограмм или фореграмм, то количественные результаты анализа получают или определением высоты пиков, или после интегрирования в виде площади пиков. Только в области определения примесей количественное выражение их концентрации через высоту более надежно, чем через площадь пика. Этому есть две причины: первая заключается в том, что при анализе примесей высота пика пропорциональна их концентрации, так как эффекты насыщения и перегрузки можно исключить, а вторая заключается в том, что ошибка автоматизированного определения высоты в этом случае меньше, чем при интегрировании пиков. Как только высота пиков возрастает, интегрирование становится рациональным и необходимым.

Это будет показано на примере калибровочной кривой натрия при определении ионов металла с применением непрямого УФ-детектирования. В то время, как линейная область при использовании высоты пика для количественного определения очень мала, и кривая уже при 4 ppm выходит в область насыщения, при представлении зависимости площади пика от концентрации корреляционная зависимость линейна. Причиной нелинейности калибровочной кривой с высотами пиков является, кроме всего прочего, треугольная форма пиков. Как можно показать теоретически, только при гауссовой форме пиков концентрация пропорциональна как площади пика, так и его высоте. При других формах пика интегрирование обязательно для того, чтобы получить линейную калибровочную кривую.

Рис. 32 показывает полученную калибровочную кривую в области концентраций от до 10 ppm.

При КЭ, в отличие от ВЭЖХ, пробы перемещаются мимо детектора не с одинаковыми скоростями. По этой причине компоненты пробы с одинаковыми молярными коэффициентами экстинкции при одинаковом вводимом количестве проявляются в виде пиков различной площади.

В простейшем случае УФ-детектора это можно легко показать, если рассчитать время, за которое движущиеся объекты с различными скоростями проходят область УФ детектирования.

Аналогичные явления встречаются при каждом разделении в КЭ. Компоненты пробы, которые первыми движутся мимо детектора, обладают высокой скоростью, поэтому ширина их пиков на самописце меньше. Табл. 13 показывает зависимость изменения ширины пика (в сив мм при записи на самописце) стандартного прямоугольного пика шириной 0.5 см. Если бы в КЭ отсутствовало уширение полос, то первые пики были бы самыми узкими, так как они перемещаются мимо детектора быстрее других.

Рис. 32. Калибровочные кривые, построенные по высоте пика (А) и плотили пикя (В).

Условия: прибор для КЭ - Millipore Waters Quanta 4000;

капилляр - мкм, 50/56 см;

поле - 446 В/см;

буфер: S мМ имидазол/серная кислота, рН 5.3;

ввод пробы гидростатический, 30 с, детектирование непрямое. 214 им;

проба - калий, натрий, барии, кальций, магний и литии с концентрациями 4, 6, 8 и lOppm.

Таблица Зависимость времени прохождения пиками «окна» детектора от скорости миграиии Скорость пика [мм/с] Время пика в "окне" [с] Ширина пика на самописце [мм] 0.1 10 0.5 2.0 3. 1.0 1.0 1. 5.0 0.2 0. 10 0.1 0. Скорость движения самописца: 60 см/мин.

Таблица Зависимость площади и ширины пика от времени миграции.

Время Скорость Время в де- Ширина пика на са- Площадь пика миграции перемещения текторе [с] мописце [см] сигнала с h=10см [мм/с] [см2 ] 90 0.58 0.87 0.144 1. 120 0.43 1.16 0.192 1. 150 0.35 1.44 0.239 2. Если привести полученные площади пиков к времени миграции, то получим сигнал пробы, независящий от скорости перемещения. С помощью такого нормирования удается в некоторых случаях сгладить колебания времени миграции.

Колебания ЭОП являются тем фактором, который через скорость миграции непосредственно влияет на площадь пика. На рис. 33 для некоторых тестовых соединений представлены времена миграции, соответствующие первым 27 вводам пробы. После первых 4 вводов (нестационарный период) достигается первое постоянное значение, при котором время миграции колеблется весьма слабо. После вводов пробы капилляр был помещен на 48 часов в разделительный буфер и после этого использовался вновь. При этом уже после короткой переходной фазы появляется большой ЭОП. Это плато остается постоянным при последующих 20 вводах.

Рис.33. Воспроизводимость времени миграции.

Эти эксперименты ясно показывают, что после короткого времени установления равновесия могут быть получены воспроизводимые условия анализа. При замене буфера необходимо, однако, менять и капилляры или, по крайней мере, промывать их новым буфером от 10 до 15 минут. Так как ЭОП существенно более эффективно изменяет слой буфера на внутренней поверхности капилляра, чем приводимый в движение давлением поток, можно сильно сократить время установления равновесия, если промывать капилляр новым буфером и затем подвергать его действию электрического напряжения в течение 5-10 мин. Точное время уравновешивания капилляра нельзя привести, так как эта величина сильно зависит как от буфера, так и от конкретных стадий кондиционирования.

Кроме того, на воспроизводимость результатов сильно влияет количество вводимой пробы. Рис. 34 показывает воспризводимостъ системы и точность количественного анализа в зависимости от количества введенной пробы. В этом ряду измерений каждый из 12 анализов был проведен при различных концентрациях пробы, и определялись площади пиков. Для каждой новой концентрации пробы разделительный буфер в сосуде обновлялся. Статистическая обработка отчетливо показала, что при концентрации, которая превышает границу обнаружения от 20 до 50 раз, интегрирование пиков приводит к хорошим результатам. Воспроизводимость находится в пределах от 2 до 3%.

Ошибка очень быстро возрастает до 7% при интегрировании вблизи границы обнаружения. В этом случае эффективность, а поэтому и возможности разделения соседних пиков улучшаются. Эффективность падает с увеличением коцентрации, и при перегрузке системы (при использовании пробы с концентрацией 100 мМ) значение Н составляет 140 мкм.

При оптимизации анализа необходимо находить компромисс между воспризводимостью и эффективностью. Если требуется количественно проанализировать пробу, то для получения надежных результатов следует работать с коцентрациями, превышающими границу обнаружения по крайней мере от 10 до 20 раз.

Только при оптимальных условиях удается получить хорошую эффективность и высо кую воспроизводимость площадей пиков в пределах от 1.5 до 3%.

Рис.34.

Воспроизводимость (площади пиков каждых 12 измерений) и уширение полос в зависимости от концентрации пробы.

Эти опытные данные хорошо совпадают с характеристиками, приводимыми фирмами-производителями и опубликованными результатами.

Воспроизводимость, таким образом, зависит от многих индивидуальных факторов.

Сравнительные измерения на различных приборах КЭ в разных лабораториях показывают, что методы являются принципиально переносимыми, однако точность анализа колеблется от 1 до 2.5%. Эти испытания отчетливо показывают, что при оценке индивидуальных ошибок большее внимание следует обращать на те из них, которые вызваны аппаратурой и методом.

Таблица. Сравнение воспроизводимости в различных лабораториях Значение ОСО Лаборатория (п=10) 1 2 3 4 5 6 Время миграции 1.3 0.3 0.8 0.4 0.6 0.5 0. Высота пика 1.0 2.3 2.1. 1.7 1.4 1. Площадь пика 1.2 2.6 0,6 1.3 2.2 2.5 1. Нормированная 0.8 2.5 1.0 1.2 2.1 1.1 1. площадь пика Линейность 0.999 0.997 0.999 0.992 0.996 0.990 0. калибровочной Измерение: Beckman P/ACE в лабораториях 1,2,3 и 6;

ABI в лабораториях 5 и 7;

SpectraPhysics в лаборатории 4.

Таблица Факторы, влияющие на воспроизводимость площадей пиков Фактор Причина, эффект Улучшение за счет:

Колебания Различие в вязкости Вводятся Термостатирования капилляра и температуры различные количества пробы буфера Испарение раствора Повышенная температура в Герметичного затвора у сосуда пробы автозагрузчике или охлаждения сосуда для пробы Повышение концентрации пробы Неточности при Детектор: увеличить время или Применения больших времен обслуживании понизить частоту данных ввода пробы системы Неточный ввод пробы по давлению или времени Пики становятся Плохая система ввода пробы Применения капилляров с больше/меньше плоской поверхностью среза Удаления полиамида(2 мм) на "входе" Плохая форма пика Адсорбция на стенках Покрытия или высоко концентрированных буферов Малое отношение Ошибка при интегрировании Оптимизации параметров сигнал/шум интегрирования Повышения концентрации пробы "Стэкинга" образца Изменение времени Значение рН буфера не Более частой смены миграции постоянно разделительного буфера Проба адсорбируется на Кондиционирования капилляра с стенках помощью NaOH Изменяется уровень буфера Электрокинетиче- Площадь пика зависит от Гидродинамического ввода ский ввод пробы пробы пробы 7. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) Зонный электрофорез является самым простым из описанных здесь способов разделения. Так как многие методы анализа, которые будут обсуждаться ниже, основаны на КЗЭ, необходимо детально рассмотреть его основные принципы. При зонном электрофорезе буфер, значение рН, а также напряженность поля во всем пространстве разделения остаются постоянными. Пробы разделяются за счет их различных подвижностей. Они вводятся в виде отдельной зоны на входе в капилляр и обнаруживаются в виде дискретных, отделенных друг от друга зон на конце детектора.

Назначение буфера при этой технике разделения - поддерживать постоянное значение рН и обеспечивать транспортный поток. Выбор рН буфера определяет заряд ионов пробы. Концентрация буфера влияет на ЭОП. Для дальнейшей оптимизации могут использоваться добавки к буферу.

Рис. 35. Схема КЗЭ: а) начальное состояние, б) различная миграция отдельных зон образцов, в) профиль напряженности поля (сплошная линия) и рН (пунктирная линия) в сечении разделительной камеры.

7.1. Влияние рН Влияние рН на перенос пробы к детектору объясняется двумя причинами. Как уже отмечалось, на разделение, основанное на электрофоретической миграции, в большей или меньшей степени накладывается ЭОП, на величину которого влияет диссоциация поверхностных силанольных групп. Кроме того, подвижность ионов определяется их степенью диссоциации в несущем электролите и, следовательно, его значением рН.

Поэтому можно оптимизировать разделение изменением величины рН и вида буфера.

Наибольшее различие в способности к перемещению для слабых электролитов, т.е.

наивысшую селективность получают тогда, когда значение рН буфера лежит между значением pKs компонентов пробы (Ks - константа диссоциации). Это поведение аналогично разделению в ионнообменной хроматографии.

Рис. 36. Зависимость подвижности двух слабых кислот от значения рН.

Достижимое разрешение двух пиков можно рассчитать по соотношению:

R = 2(t2 - t1)/(w1 + w2 ) где t- время миграции и w-ширина пика у его основания.

Переходя к уравнению и рассчитывая время миграции из подвижностей, получим:

R = 0.177(µ2 - µ1) V / D(µ - µЭОП ) Наилучшее разрешение получается, когда ионы движутся против ЭОП. Высокое напряжение также приводит к улучшению разрешения. Рис. 37 показывает рассчитанное разрешение пары пиков. Пик 2 перемещается при этом с подвижностью 0.5 см2/кВс, а пик 1 - с подвижностью, составляющей от 0 до 30 % от минимальной, в поле 300 В/см в капилляре длиной 50 см (D=10-5 см2/с-1).

Недиссоциированные компоненты пробы движутся через капилляр со скоростью ЭОП. ЭОП зависит, как было показано, также от рН и других свойств электролита, особенно от ионной силы. Возможности, которые появляются из-за наложения электрофоретического перемещения и ЭОП, можно продемонстрировать на примере разделения нуклеотидов. Если ЭОП направляется к катоду, нуклеотиды движутся к аноду, причем наиболее быстро движется трифосфат благодаря наиболее высокому заряду.

Даже при высоком значении рН (>10) ЭОП недостаточен для того, чтобы перенести трифосфат к детектору на катоде. Если электрофоретическая подвижность моно- и дифосфата меньше, чем ЭОП, оии переносятся к детектору, которого достигают через различное время. Разделение этой пробы показано на рис 38. При таких эксперимен тальных условиях векторного вклада ЭОП недостаточно для переноса трифосфата, который в данном случае перемещается в анодное пространство. При переполюсовке можно определить трифосфат, в то время как ди- и монофосфаты вместе с ЭОП движутся в другом направлении.

Рис. 37. Разделительная способность R двух пиков в зависимости от ЭОП и разницы лодвижностей.

При добавлении веществ, образующих ионные пары, подвижность изменяется так, что при анализе могут разделяться все нуклео-тиды. С помощью обращения ЭОП в результате модификации поверхности и одновременного изменения направления поля возможно разделение ионов с сильно различающимися подвижностями (см.анализ ионов).

Рис. 38. Разделение некоторых нуклеотидов с помощью КЗЭ.

7.2. Влияние концентрации буфера На рис. 6 уже было показано влияние ионной силы на ЭОП. Подвижность ионов должна зависеть от концентрации буфера. Важной является также ранее описанная зависимость интенсивности пиков от концентрации буфера. С одной стороны, концентрацию буфера нужно выбирать настолько высокой, чтобы значение рН оставалось постоянным и по возможности минимизировались бы эффекты перегрузки, но, с другой стороны, чтобы ЭОП еще допускал быстрое время анализа и не появлялось бы дополнительное уширение полос из-за тепловыделения. При этом, естественно, в капиллярах с маленьким внутренним диаметром применяется высокая концентрация буфера. Для большинства применяемых капилляров с внутренним диаметром 75 мкм применяются обычно буферы с концентрациями от 10 до 50 мМ.

7.3. Выбор буфера При выборе буфера следует обращать внимание на множество факторов. Как было показано, для достижения хороших результатов разделения необходимо совпадение подвижностей ионов пробы и буфера. Концентрация ионов буфера должна быть больше, чем концентрация ионов в растворе пробы. Это приводит к симметричным четким зонам, так как только тогда на ионы пробы не влияет электрическое поле. С другой стороны, высокая ионная сила при заданном падении напряжения означает высокую плотность тока и поэтому увеличение джоулева тепла. Этот эффект можно просто измерить как отклонение от закона Ома. Преимущество буфера на основе орга нического цвиттериона (например, 3(-циклогексиламино)-1-пропан-сульфокислотный буфер) с его очень маленькой электропроводностью является решающим при использовании капилляров с большим внутренним диаметром.

Значение рН определяет заряд пробы и поэтому существенно изменяет селективность разделительной системы. Обзор влияния отдельных параметров на систему разделения приведен на рис. 39.

Поскольку время анализа обратно пропорционально приложенному напряжению, при низкой концентрации буфера всегда достигается более короткое время анализа.

Резюмируя, можно предъявить следующие требования к буферной системе в КЗЭ:

- селективность для разделяемых ионов, - стабилизация значения рН, буферная емкость (воспроизводимость), - малое УФ-поглощение при детектируемых длинах волн, - соответствие между подвижностями ионов пробы и буфера, - противоионы должны обладать очень малой подвижностью (отсутствие тока), - воспроизводимое получение буфера.

7.4. Области применения Электрофорез в гомогенной буферной системе при унифицированной напряженности поля является стандартным методом, который особенно эффективен при разделении маленьких молекул с постоянным зарядом. Поэтому можно без больших трудностей разделить алифатические и ароматические карбоновые кислоты, сульфокисло-ты, аминокислоты, фенолы, нуклеотиды и амины. Показательные примеры разделений, имеющих важное прикладное значение, приведены в двух обзорных статьях Кура (см. список литературы).

Рис. 39. Факторы, влияющие на КЗЭ.

Примером может служить разделение природной смеси танинов, представленное на рис. 40. Показаны также УФ-спектры, записанные в режиме реального времени с помощью ДМД.

Как типичное применение КЗЭ, в следующей главе будет описано разделение ионов, не имеющих собственного УФ-поглощения. С помощью КЗЭ может также осуществляться разделение белков, если подавляется обменное взаимодействие между пробой и стенками капилляра. Этому разделению также посвящена отдельная глава.

Разделение заряженных молекул с относительно большими гидрофобными остатками можно улучшить добавлением ДЦСН;

возможности оптимизации разделения методом КЭ с добавлением детерген-та подробно обсуждаются в разделе, посвященном мицеллярной электрохроматографии.

Рис. 40. Разделение смеси танинов (галловых кислот).

8. Непрямое Уф-детектирование в КЭ Вещества, которые во всей УФ-области обладают небольшим коэффициентом экстинкции, часто необходимо вводить в высокой концентрации, для того, чтобы получить сигнал этого соединения в детекторе. Однако для такой пробы разделительная система часто бывает перегружена и интенсивность пиков так мала, что невозможно практическое применение такого разделения. Существенно чувстви тельнее такие вещества могут анализироваться при использовании других принципов детектирования (детектирование по электропроводности, потенциометрическое детектирование). Но поскольку до настоящего времени нет других детекторов для рутинных исследований в коммерческих приборах КЭ, непрямое Уф-детектирование в КЭ имеет особенное значение.

Этот вариант УФ-детектирования известен в хроматографии с начала 80-х годов и применялся для детектирования ионов в ионно-обменной хроматографии (ИОХ). С помощью традиционных УФ-детекторов могут также обнаруживаться непоглощающие в УФ-области вещества. Недостатки этого метода заключаются в следующем: 1 - появление так называемых "системных пиков", которые необходимо разделить от зон веществ при помощи дополнительного оптимизирования разделения;

2 - необходимость работы с высокими концентрациями буфера для вымывания проб из стационарной фазы, что в случае толстых слоев покрытия капилляра в ВЭЖХ приводит к большой величине адсорбции на стенках и, тем самым, к повышению шумов и других помех.

Большого развития этот метод не получил, поскольку появление детекторов по теплопроводности в ВЭЖХ при рутинных измерениях составило ему сильную конкуренцию. Кроме того, сочетанием детектирования по теплопроводности с техникой подавления ЭОП в рутинных измерениях удается увеличивать чувствительность детектирования в 10-100 раз.

В КЭ техника непрямого УФ-детектирования описана уже давно, еще до того, как стали известны ее большие возможности. Только позднее, в работах Джандика (Jandik) и Джонса (Jones) были выяснены преимущества применения непрямого УФ детектирования в КЭ. Наряду с короткими временами анализов для многих анионов этот метод показал чрезвычайно низкую границу обнаружения в области концентраций от 0. мг/л и ниже.

Pages:     || 2 | 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.