WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 12 |

«1 2 3 Б. Албертс Д. Брей Дж. Льюис М. Рэфф К. Робертс Дж. Уотсон МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ 2-Е ИЗДАНИЕ, ПЕРЕРАБОТАННОЕ И ДОПОЛНЕННОЕ В 3 томах 3 Перевод с английского канд. ...»

-- [ Страница 3 ] --

Зрительный нерв является одним из простейших элементов центральной нервной системы млекопитающих и широко известен, как модельная система для таких исследований. Он содержит длинные аксоны нервных клеток сетчатки, направляющихся от глаза к мозгу.

Структурную и функциональную опору аксонов в нервах обеспечивают три типа глиальных клеток (см. разд. 19.1.6): олигодендроциты и два типа астроцитов, известных просто как астроциты типов 1 и 2 (рис. 16-37). Все три типа глиальных клеток различают с помощью антител;

с помощью такого же метода различают глиальные клетки и клетки-предшественницы. При исследовании клеток, выделенных из зрительного нерва на различных стадиях развития и помещенных в культуру, было показано, что три типа глиальных клеток (которые в норме делятся редко, если вообще делятся) возникают в различное время и происходят из двух ветвей генеалогического древа. Астроциты типа 1 возникают до рождения из клеток-предшественниц одного типа, а олигодендроциты и астроциты типа 2 образуются после рождения из другого типа клеток предшественниц, именуемых «клетки-предшественницы 02А».

Рис. 16-37. Зрительный нерв крысы содержит аксоны нейронов сетчатки (указана только одна такая клетка) и 3 типа глиальных клеток. Астроциты типа 1 обеспечивают структурную опору нерва, выполняя роль, аналогичную роли клеток соединительной ткани в конечности. Олигодендроциты и астроциты типа 2 вместе участвуют в образовании оболочки вокруг каждого аксона: олигодендроциты обворачиваются вокруг аксона, формируя изолирующий миелиновый слой (см. разд. 19.2.11), а астроциты типа 2 выпускают тонкие отростки, контактирующие с аксонами в местах, где миелиновая оболочка прерывается, образуя перехват Ранвье. Нервный импульс по мере прохождения по аксону распространяется от одного перехвата Ранвье к другому (см. разд. 19.2.4).

Олигодендроциты в норме возникают в момент рождения, астроциты типа 2 через неделю после рождения.

После выяснения родословной этих клеток и времени их появления усилия исследователей были сконцентрированы на вопросе о том, какими правилами руководствуются клетки в своем поведении. Например, что вынуждает дифференцироваться клетки-предшественницы 02А и почему, если они дифференцируются в одно время, то становятся олигодендроцитами, а если в другое, то астроцитами типа 2? В какой степени эти события управляются неким собственным автономным часовым механизмом клетки и в какой степени дифференцировка зависит от поступления в определенное время внешних сигналов?

Если из эмбрионального зрительного нерва выделить клетки-предшественницы 02А и культивировать в отсутствие астроцитов типа 1, которые в норме являются соседями клеток 02А, то клетки 02А прекращают делиться и досрочно начинают дифференцироваться;

при помещении в эту же культуру астроцитов типа 1 клетки 02А прекращают деление, и их дифференцировка задерживается до срока, соответствующего in vivo дню рождения. Оказалось, что действие астроцитов типа 1 связано с секретируемым ими фактором роста. Полагают, что этот фактор роста соответствует тромбоцитарному фактору роста (ТФР, или PDGF-platelet-derived growth factor;

см. разд. 13.3.4). Присутствие такого фактора приводит к предотвращению преждевременной дифференцировки клеток-предшественниц 02А;

однако повышение концентрации этого фактора не затягивает дифференцировку по сравнению с нормой. Вероятно, клетки-предшественниц 02А эмбрионального зрительного нерва еще раньше принимают определенную программу развития, согласно которой по истечении определенного времени или через определенное число клеточных делений клетки теряют чувствительность к фактору роста и дифференцируются независимо от его наличия. Отдельные клетки-предшественницы 02А принимают такую программу в разное время и первые из них в норме начинают дифференцироваться в момент рождения.

Чем же определяется конкретное направление дифференцировки клетки в олигодендроцит или в астроцит типа 2? Клетки 02А в культуре, развиваясь в условиях бессывороточной среды, дифференцируются только в олигодендроциты: для них это конститутивный путь развития или в терминах информатики развитие «по умолчанию». В противоположность этому, дифференцировка астроцитов типа 2 выглядит, как индуцируемый путь развития: клетки начинают такую дифференцировку под действием специфического белка, который можно выделить из зрительного нерва крысы. В значительных количествах этот белок синтезируется со второй недели развития, т.е. именно тогда, когда начинается дифференцировка астроцитов типа 2. Оказалось, что этот белок идентичен фактору роста нервов (ФРН, или CNTF-ciliary neurotrophic factor). Это позволяет предположить, что время синтеза ФРН определяет время дифференцировки астроцитов типа 2 в развивающемся нерве. До сих пор неясно, какие именно клетки синтезируют ФРН in vivo и какие факторы контролируют точное время начала его синтеза, однако известно, что в культуре этот фактор могут синтезировать астроциты типа 1.

Данные этих исследований еще раз подтверждают предположение о том, что развитие клеток представляет собой результат взаимодействия автономных процессов и поведения, контролируемого сигналами окружающей среды. Здесь были показаны преимущества метода культуры клеток для изучения молекулярных основ этих процессов. Можно попытаться суммировать эти находки в схеме потока информации, которая, в терминах информатики, представляет собой внутреннюю Рис. 16-38. Схема, в которой упрощенная модель программы межклеточного контроля представлена в виде программы компьютера. Вероятно, эта программа участвует в регуляции клеточных делений и дифференцировки у клеток-предшественниц олигодендроцитов и астроцитов типа 2 (02А) в развивающемся зрительном нерве млекопитающих. Широкие стрелки изображают «вход-выход» данных, т. е. внеклеточные сигналы принимаемые или испускаемые клеткой. Неполные или предполагаемые участки этой схемы указаны прерывистыми линиями;

соответствующая широкая стрелка, указывающая налево, демонстрирует возможность обратной связи от клеток-предшественниц 02А, которая могла бы содействовать регулировке сигналов, поступающих от клеток-предшественниц астроцитов типа 1. Считают, что клетки-предшественницы 02А постоянно возобновляются в условиях in vivo, начиная примерно с последней недели перед рождением (не показано).

программу клеток-предшественниц 02А, т.е. набор правил, согласно которым клетки прочитывают сигналы окружающей среды и выбирают время и место дифференцировки (рис. 16-38). Такая информация о поведении отдельных клеток особенно важна, если мы действительно пытаемся разобраться в закономерностях эмбрионального развития. Мы пока не в состоянии дать ответ на фундаментальный вопрос, каким образом возникает пространственное распределение множества клеток во всем организме, но к этой проблеме мы вернемся в следующем разделе.

Заключение Для понимания программ развития индивидуальных клеток эмбриона необходимо проследить их историю, проведя анализ клеточной родословной. Для генеалогии позвоночных характерна случайная изменчивость. Но у определенных нематод и некоторых других групп беспозвоночных схема клеточных делений в процессе развития контролируется настолько точно и настолько предсказуемо, что клетки, занимающие в теле животного определенное положение, у всех особей данного вида развиваются по одному и тому же пути. Была прослежена нормальная судьба всех клеток нематоды Caenorhabditis elegans в течение всего периода развития и изучены последствия экспериментального воздействия на уровне индивидуальных идентифицируемых клеток. Идентифицированы многие гены, определяющие реализацию программы, контролирующей развитие клеток. Для этого были изучены изменения клеточных родословных, возникающие вследствие мутации данных генов. В общем можно отметить, что мутации генов, контролирующих развитие, координированно влияют на дифференцировку и деление клеток. Эти наблюдения позволяют предположить, что контроль указанных клеточных процессов обеспечивается неким общим базовым ме- ханизмом. При разрушении клеток лазерным лучом было выявлено, что постоянство развития С. elegans является результатом точной взаимосвязи межклеточных взаимодействий и автономных процессов, реализуемых в отдельных клетках. Например, наблюдая за процессом развития вульвы, можно установить индукционные взаимодействия, которые могут быть связаны с действием определенных генов, контролирующих развитие.

Другим методом анализа программ, контролирующих развитие индивидуальных клеток, является изучение поведения клеток в культуре.

Этот подход был использован с целью выявить правила, определяющие клеточную дифференцировку и деление в процессе развития глиальных клеток зрительного нерва млекопитающих. Здесь было получено еще одно подтверждение того, что поведение клеток регулируется не только межклеточными сигналами, но и автономными программами развития отдельных клеток.

16.4. Принципы образования пространственных структур [34] Различные органы животного возникают не из хаотического скопления клеток;

пространственная организация разных типов клеток исходно предопределена. Взаимодействия, координирующие процесс становления пространственной организации, могут быть чрезвычайно разнообразными. В некоторых случаях, например в мозаичных яйцах, пространственная организация может быть заложена в одной клетке, и возникающее внутриклеточное распределение цитоплазматических детерминантов воспроизводится в расположении дочерних клеток эмбриона. В других случаях, например при индукции мезодермы у Xenopus или вульвы у нематод, определенная структура возникает как результат взаимодействия отдельных клеток. Следовательно, в формировании пространственной организации важная роль принадлежит всем видам пространственных сигналов, как внутриклеточных, так и межклеточных. Можно сказать, что эти сигналы обеспечивают клетки позиционной информацией, направляя их дальнейшую специализацию.

В этом разделе мы рассмотрим различные пути создания и использования позиционной информации. Здесь же мы увидим, как в процессе развития многих организмов происходит приобретение отдельными клетками точных молекулярных «адресов» или позиционных значений. Так, клетка раннего эмбриона может «знать» сравнительно немного, например, насколько близко она расположена по отношению к голове или к хвосту.

Что же касается ее потомков, существующих в теле взрослого животного, то многие клеточные поколения спустя они могут «знать» о том, что являются костными клетками, расположенными на конце третьего сустава передней конечности. Такая специализация выстраивается постепенно за счет механизмов, основанных на клеточной памяти: ранние пространственные сигналы лишь довольно приблизительно определяют общие координаты, а последующие сигналы местного значения обеспечивают клетки дополнительными уточнениями адреса, привязанными к местным координатам.

16.4.1. Асимметрия, определяемая пространственной организацией среды, может нарастать за счет положительной обратной связи [34, 35] Формирование пространственной организации начинается с создания асимметрии: будущая голова должна отличаться от хвоста, спина от живота. Мы уже видели, что у животных большинства видов яйцеклетки Рис. 16-39. Контроль полярности яйца дрозофилы со стороны среды, окружающей ооцит в яичнике. В норме питающие клетки поставляют запасаемые вещества на один из полюсов ооцита, который соответствует будущей голове. У мутантов Dicephalic ооцит расположен в центре фолликула и симметричен по отношению к питающим клеткам. Вследствие этого возникает симметричное яйцо, дающее начало эмбриону с головами на обоих концах.

асимметричны (см. разд. 16.2.2). Асимметрия зачастую возникает в яйцеклетке в процессе ее развития в яичнике. У насекомых, например, ооцит (будущая яйцеклетка) расположен в одном из концов фолликула, где одной стороной он соприкасается с питающими клетками, передающими ему запасаемые вещества по цитоплазматическим мостикам (см. разд. 15.3.4). По всей вероятности, асимметрическое поступление запасаемых веществ в ооцит создает химические различия между разными участками цитоплазмы яйца, которые соответствуют в будущем голове и хвосту эмбриона (см. рис. 16-39).

Исходно асимметрия может быть не слишком выражена: далее клетки воспользуются своими собственными внутренними механизмами для усиления слабой асимметрии и превратятся в поляризованные. Например, у яйцеклетки морской водоросли Fucus ризоид, или корешок, образуется только на одном конце. В норме ризоид растет вниз и от света. Таким образом, сила тяготения и освещенность вместе определяют, на какой стороне он образуется. Такая полярность обусловлена потоком ионов Са2+ через клетку (см. разд. 20.5.6): полагают, что случайный свет или сила тяготения вызывают появление небольшой асимметрии в распределении белков, участвующих в транспорте ионов Са2+ через плазматическую мембрану. Эта асимметрия позже усиливается за счет механизмов положительной обратной связи (см. рис. 20-66, разд. 20.5.7).

Таким же образом положительная обратная связь может действовать и на других стадиях развития многоклеточных организмов.

Например, при делении поляризованной клетки дочерние клетки наследуют слабо выраженную асимметрию и, усилив ее, становятся более поляризованными. Так происходит усиление поляризации в ряду клеточных поколений. Поэтому в принципе для возникновения сложной структуры многоклеточных организмов межклеточный обмен сигналами не обязателен (рис. 16-40). Возможно, что некоторые процессы формирования пространственной организации, зависящие от автономного поведения клетки, можно объяснить действием такого механизма.

Однако, как правило, формирование пространственной организации у многоклеточных организмов зависит и от межклеточных сигналов.

И здесь положительная обратная связь также выполняет важную роль усиления исходно слабых асимметрий, создавая локализованные группы клеток, свойства которых очень различны. Такие группы клеток могут в свою очередь испускать сигналы, влияющие на развитие соседних клеток.

Простейшим примером может служить примитивный организм Hydra. Тело гидры имеет форму трубки, на одном конце которой расположена «голова», снабженная щупальцами, и на другом конце - «нога» (см. рис. 1-33). Гидра известна способностью восстанавливать целостность организма после удаления какой-либо из его частей. Множество экспериментов по ампутации «головы», выполненных на гидре, позволяют предположить, что процесс регенерации осуществля- Рис. 16-40. Сложная многоклеточная структура в принципе может возникнуть в результате серии асимметричных клеточных делений без каких-либо межклеточных взаимодействий (помимо обеспечивающих соединение клеток). Внутренней полярности, наследуемой каждой из дочерних клеток в результате последовательных клеточных делений, может оказаться вполне достаточно для управления следующим циклом внутриклеточного структурообразования. Возникающие при последующих делениях дочерние клетки будут опять-таки весьма различными и внутренняя поляризация этих клеток не будет уменьшаться.

ется благодаря локальному аутокаталитическому процессу, усиливающему слабую тенденцию клеток к приобретению свойств клеток «головы». В создании данной утраченной структуры принимают участие все клетки тела;

они создают ингибирующий сигнал, диффундирующий вдоль продольной оси тела, и исключающий условия формирования «головы» в иных участках организма (рис. 16-41).

16.4.2. Локализованный участок, испускающий сигнал, может часто создавать градиент морфогена [36] Влияние головы на остальную часть тела гидры, которое характеризуется значительным радиусом действия, представляет собой весьма распространенное явление. Во многих развивающихся системах небольшие участки ткани способны приобретать какие-либо особые свойства, превращающие их в источник сигнала, который распространяется через прилежащие участки ткани, и может контролировать их поведение. В частности, сигналом могут служить диффундирующие молекулы, секретируемые сигнализирующим участком. Предположим, что по мере диффузии сигнального вещества через соседние ткани происходит его разрушение. В этом случае наивысшая концентрация сигнального вещества будет вблизи источника. С увеличением расстояния от источника количество этого вещества будет уменьшаться, вследствие чего в ткани возникнет концентрационный градиент (см. рис. 16-42). На разных расстояниях от источника сигнала клетки будут подвергаться различному действию этого вещества в зависимости от его концентрации и благодаря этому приобретут разные свойства. Гипотетическое вещество, подобное вышеупомянутому, концентрация которого прочитывается клетками и позволяет последним определить расстояние Рис. 16-41. Механизм создания пространственной структуры вследствие автокаталитического процесса. Вещество «активатор» в результате автокаталитического процесса накапливается до весьма высокого уровня в небольшом участке, расположение которого определяется слабовыраженной исходной асимметрией системы;

высокая концентрация активатора в этом участке вызывает образование ингибитора, диффундирующего на значительные расстояния и подавляющего синтез активатора в других участках. Например, при декапитации гидры оставшаяся ткань в норме регенерирует голову, но если на место ампутированной головы или на некотором расстоянии от него пересадить голову другой гидры, то новой дополнительной головы не образуется.

Рис. 16-42. Если какое-то вещество образуется в определенной точке и по мере диффузии из этой точки разрушается, то создается градиент концентрации этого вещества с максимумом в исходной точке. Такое вещество может служить морфогеном, локальная концентрация которого контролирует поведение клеток в соответствии с их расстоянием от источника вещества.

относительно неких ориентиров или «маяков», называется морфогеном. Сигнализирующий участок способен с помощью морфогена контролировать формирование пространственной организации больших полей прилежащей ткани. Градиенты морфогена представляют собой простое и эффективное средство обеспечения клеток позиционной информацией. Именно поэтому морфогены и оказались в центре нашего внимания. Здесь необходимо добавить, что клетки эмбриона способны приобретать позиционную информацию иными способами. Рис. 16- иллюстрирует одну из таких альтернатив: здесь в основе механизма лежат индукционные взаимодействия короткого радиуса действия.

И хотя известно множество примеров сигнализирующих участков, которые (с нашей точки зрения) через градиент морфогена могли бы оказывать воздействие на значительном расстоянии, на практике в настоящее время мы имеем дело всего лишь с несколькими случаями непосредственной химической идентификации морфогена. Как правило, известно лишь, что при изменении местоположения предполагаемого сигнализирующего участка после пересадки или иным способом, происходит изменение структуры прилежащих участков ткани. Наблюдения такого рода не позволяют выяснить, насколько изменения структуры отдельных клеток определяются прямым ответом на действие морфогена и каков вклад от взаимодействия реагирующих клеток. Вероятно, в большинстве случаев исходный градиент морфогена вызывает импульс, обеспечивающий формирование пространственной организации, широкого спектра действия, а локальные межклеточные взаимодействия участвуют в проработке деталей. Накапливаются данные, свидетельствующие о том, что именно таким образом возникает пространственная организация тела насекомых;

это будет обсуждаться ниже. Здесь же мы рассмотрим, какой тип пространственной организации может быть обусловлен действием градиента морфогена в поле клеток, каждая из которых реагирует назависимо.

16.4.3. Порог реакции клетки обусловливает строго определенный характер ее детерминации, несмотря на плавный градиент морфогена [37] При наличии плавного градиента концентрации морфогена можно ожидать, что и свойства клеток в разных участках будут изменяться постепенно. Такие слабо выраженные различия действительно встречаются в некоторых тканях. Но наибольший интерес вызывает возникновение резких качественных различий - таких, например, как различия между хрящевыми и мышечными клетками, не имеющими переходных форм. В популяции исходно однородных клеток благодаря порогу реакции на плавно изменяющийся сигнал могут возникать резкие различия между клетками: в каждой из реагирующих клеток эффект небольшого приращения сигнала может быть усилен по принципу положительной обратной связи так, что клетки, подвергающиеся действию сигнала, интенсивность которого изменяется слабо, выберут различные пути развития в зависимости от того, подверглись ли они действию сигнала над- или подпороговой интенсивности. При этом для каждого из сигналов могут существовать несколько порогов интенсивности, и одна переменная может контролировать несколько выборов. Если под влиянием какого-то фактора клетка определенно вступила на путь, ведущий к одному из стабильных состояний, то она будет развиваться в выбранном направлении даже в отсутствие фактора, исходно контролировавшего выбор. На этом пути временные, зависящие от положения клетки воздействия могут вызывать эффект «запоминания» воздействий, которые претерпела клетка. Выбор клеткой опре- деленного состояния зависит от того, какая позиционная информация сохранилась в ее клеточной памяти. Такую запись, воплощенную в виде определенного свойства клетки, можно назвать ее «позиционным значением».

16.4.4. Эмбриональные поля очень малы, поэтому основные черты строения взрослого животного должны детерминироваться достаточно рано с участием клеточной памяти [38] Независимо от природы механизмов, обеспечивающих клетки позиционной информацией, зона их действия довольно ограниченна: они обычно эффективны лишь в пределах небольших областей (морфогенетических полей), длина которых составляет около 1 мм, что соответствует примерно 100 или менее клеточным диаметрам. Отсюда следует, что существует предел количества деталей, которые могут быть заложены на столь ограниченном пространстве. Именно поэтому конечное позиционное значение клетки приходится фиксировать в виде последовательных элементов позиционной информации, записываемых на разных стадиях развития. В связи с этим механизм детерминации, основанный на клеточной памяти, совершенно необходим для развития крупных, сложно устроенных животных. Различие между головой и хвостом должно закладываться еще тогда, когда длина соответствующих зачатков не превышает 1 мм. К тому времени, когда длина животного достигнет сантиметра или метра, события, в результате которых возникли эти различия, будут уже «древней историей»;

и для того, чтобы данные различия сохранялись, клетки должны обладать хорошей памятью.

Таким образом, общий план строения тела определяется очень рано, а детали, все более и более тонкие, добавляются позже, по мере того, как зачатки отдельных органов достигают размеров, подходящих для записи дополнительной позиционной информации (рис. 16-43).

Как это происходит, мы рассмотрим более подробно на примере развития конечности.

16.4.5. В процессе развития конечности позиционная информация постепенно уточняется [39] Развитие конечностей и многих других органов (например, зубов, позвонков или кожи) обеспечивается весьма ограниченным числом Рис. 16-43. Когда эмбрион мал, он начинает подразделяться на несколько отличных друг от друга по своим свойствам областей, соответствующих основным частям тела взрослого организма. Клетки каждого такого участка, границы которого установить довольно трудно, приобретают достаточно широкие позиционные значения (представленные здесь в виде треугольников или кружочков). По, мере роста эмбриона эти области также растут и в свою очередь в них начинают обособляться подобласти, в результате чего возникает все более детализованная картина позиционных значений.

Рис. 16-44. А. Куриный эмбрион после трех дней инкубации. Показано расположение ранних зачатков (почек) конечностей. Б. Зачаток крыла и прилежащие к нему сомиты после еще одного дня развития;

зачаток растет, превращаясь в язычкообразный вырост (примерно I мм в длину, 1 мм в ширину и 0,5 мм в толщину). Микрофотография дорсальной стороны крыла, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа. (А - по W. H. Freeman, В. Bracegirdle. An Atlas of Embryology. London, Heinemann, 1967;

Б-с любезного разрешения Paul Martin.) различных способов дифференцировки. Конечность, например, образована клетками нескольких типов, а именно мышечными, хрящевыми, костными и клетками соединительной ткани. Но эти немногочисленные типы дифференцированных клеток организованы в пространстве весьма сложным образом. При этом различия между передней и задней конечностями не связаны с появлением дополнительных типов тканей;

каждая конечность характеризуется иным способом расположения тканей в пространстве. Эксперименты по трансплантации развивающихся конечностей у цыпленка показали, что внутренние различия клеток конечностей, связанные с возникающими структурами, определяются задолго до начала дифференцировки.

Ноги и крылья у куриного эмбриона возникают почти одновременно в виде небольших вытянутых зачатков, выступающих на боковых поверхностях зародыша (рис. 16-44). Клетки двух пар зачатков конечностей внешне не различаются и в это время не дифференцированы;

ни в чем не проявляется также и характер будущего скелета (рис. 14-20, разд. 14.2). На этой стадии из основания зачатка ноги можно вырезать небольшой участок недифференцированной ткани ( в норме этот участок образует голень) и пересадить его на верхушку зачатка крыла. В процессе развития трансплантата формируется не голень и не соответствующая часть кончика крыла, а палец (рис. 16-45). Из этого опыта следует, во-первых, что клетки раннего зачатка ноги детерминированы в качестве клеток ноги, и во-вторых, что, будучи детерминированы в этом качестве, они еще не восприняли детализованное позиционное значение вдоль оси зачатка и могут отвечать на информационные сигналы крыла формированием структур, соответствующих не основанию конечности, а ее концу. Можно заключить, что окончательная дифференцировка клеток у позвоночных детерминируется серией последовательных сигналов позиционной информации, регистрируемых клеточной памятью в разное время. Конечное состояние клетки возникает как результат определенной последовательности решений.

Рис. 16-45. Ткань будущего бедра после пересадки на край почки крыла (у куриного эмбриона) образует пальцы. (J. W. Saunders et al., Dev. Biol., 1, 281-301, 1959.) 16.4.6. После приобретения позиционных значений сходные клетки становятся неэквивалентными [40] Хотя зачатки передней и задней конечности образованы дифференцированными клетками одинаковых типов, совершенно очевидно, что эти клетки неэквивалентны. Они различаются по своему внутреннему состоянию, определяемому разными позиционными значениями. Клетки зачатков конечностей способны сохранять позиционное значение, отличающее ногу от крыла, даже после дифференцировки;

и если это так, то дифференцированные клетки одного и того же типа (например, хрящевые) будут неэквивалентны. Отсюда следует, что на самом деле клетки взрослого организма значительно более разнообразны, чем это учитывает традиционная классификация клеток позвоночных (см. гл. 17, дополнение).

В распоряжении исследователей имеются данные, свидетельствующие в пользу существования таких слабых различий между дифференцированными клетками одного и того же типа, расположенными в разных участках тела позвоночных. Примеры неэквивалентности клеток кожи и нервной системы будут рассмотрены в этой главе ниже (разд. 16.6.4) и в гл. 19 (разд. 19.7.9). Один из наиболее ярких примеров получен при изучении регенерации конечностей у хвостатых амфибий (Urodeles);

в этих исследованиях было показано, что неэквивалентность характерна не только для клеток передних и задних конечностей, но и для клеток, расположенных по оси конечности на разных уровнях.

Если у тритона или аксолотля удалить конечность на любом расстоянии от ее основания, то утраченная часть восстанавливается. На конце культи образуется бугорок из внешне недифференцированных клеток, покрытый эпидермисом;

это - так называемая регенерационная бластема. В результате роста и дифференцировки бластемы из нее образуются именно те части конечности, которые должны быть расположены дистально от места ампутации. Если удалена кисть, то образуется кисть, если удалены предплечья и кисть, то - недостающие предплечье и кисть. В данном случае не имеет значения, где развивается бластема: как обычно - на проксимальном конце культи, или (в условиях эксперимента) на конце дистального участка ампутированной конечности (рис. 16-46). В любом случае из клеток бластемы возникают только те части, которые в норме расположены дистально по отношению к уровню разреза;

при этом во втором случае возникает зеркальный дубликат имеющегося участка.

Вероятно, клетки, расположенные вдоль оси конечности на разных уровнях, запомнили различные позиционные значения и именно этими значениями они руководствуются в выполнении программы, восстанавливающей утраченные части конечности.

16.4.7. Клетки различных областей обеспечиваются одинаковой позиционной информацией, но интерпретируют ее по-разному [36, 41] Эксперимент, схематически представленный на рис. 16-45, позволяет приблизиться к пониманию процесса возникновения сложной позиционной детализированной информации в клетках конечности цыпленка. Из этого эксперимента следует, что у птиц сигналы, обеспечивающие клетки информацией о положении вдоль оси конечности, в крыле и ноге, принципиально не различаются. Клетки будущей ноги после трансплантации на кончик зачатка крыла точно прочитывают сообщения, указывающие на их дистальное положение, и поэтому участвуют в формировании пальцев. Но Интерпретируя эту информацию по-своему, они вместо пальцев передней конечности образуют пальцы задней конечности.

Механизмы, основанные на явлении клеточной памяти, могут быть использованы для обеспечения позиционной информацией клеток различных участков, или полей. Поэтому в каждом из полей возникнет определенная структура, как результат сочетания информации, закодированной в различной предыстории клеток, и информации определенного межклеточного сигнала.

Эти замечания относятся не только к сигналам, кодирующим формирование пространственной организации вдоль длинной (проксимодистальной) оси конечности, но по оси от большого пальца к мизинцу (переднезадней оси). Две этих оси (рис. 16-47) соответствуют различным компонентам позиционных значений, подобно декартовой системе координат, которые в свою очередь определяются за счет различных способов детализации позиционной информации. Регуляция формирования переднезадней оси имеет особое значение, поскольку это один из немногих примеров, где удалось химически идентифицировать морфоген.

16.4.8 Ретиноевая кислота - вероятный морфоген в зачатке конечности позвоночных [42] На заднем крае зачатка конечности куриного эмбриона расположена группа клеток, обладающих уникальными свойствами, которые выявляются при пересадке этих клеток в переднюю область зачатка другой конечности (рис. 16-48).

Под влиянием трансплантата зачаток-реципиент уже в первые сутки начинает разрастаться вширь и в результате формирует конечность, строение которой очень сильно изменено. В данном случае происходит удвоение всех частей скелета и всех соответствующих этим частям мягких тканей;

формируется второй набор элементов, организованный по принципу зеркальной симметрии по отношению к срединной плоскости конечности. Второй набор элементов конечности формируется не из тканей трансплантата, а практически полностью за счет клеток зачатка-реципиента. Можно предположить, что образование второго набора элементов конечности хозяина, расположенных в обратной последовательности, определяется клетками трансплантата. Область зачатка конечности, послужившая источником трансплантата, получила название зоны поляризующей активности или поляризующей области.

Поляризующая область присутствует и в зачатке ноги, и в зачатке крыла;

необходимо отметить, что поляризующие области двух пар конечностей и даже конечностей разных видов функционально взаимозаменяемы. Независимо от происхождения трансплантата (нога или крыло, куриный это зародыш или зародыш мыши) он во всех случаях приводит к образованию в крыле цыпленка дополнительного зачатка крыла, возникающего из тканей куриного зародыша, и из этого зачатка крыла формируются дополнительные «пальцы» цыпленка.

Следовательно, сигнал, испускаемый поляризующими областями разных конечностей у разных видов, один и тот же. Клетки конечности интерпретируют сигнал согласно своему геному и предыстории.

На обеих поверхностях образуется регенерационная В нормальном крыле три «пальца» соответствуют трем средним пальцам бластема;

из клеток бластемы в обоих случаях пятипалой руки и могут быть обозначены цифрами 2, 3, 4. Палец 4 образуется формируются те части конечности, которые в норме вблизи поляризующей области, палец 3-несколько дальше, а палец 2-еще дальше.

расположены дистально от места разреза Такое же правило справедливо в отношении тканей, расположенных в непосредственной близости к трансплантату поляризующей области, как если бы Рис. 16-46. Как показывают результаты эксперимента, характер формирующихся пальцев соответствовал характеру некоего морфогена, схема которого приведена на этом рисунке, характер секретируемого поляризующей тканью (рис. 16-49). Градуальный характер структур (в данном случае у саламандры), образующихся сигнала, при регенерации бластемы, определяется тем, на каком уровне была отсечена конечность, а не тем, какие из структур в ней сохранились. Предплечье и кисть образуются как из дистального, так и из проксимального отдела исходной конечности.

Рис. 16-47. Проксимодистальная и переднезадняя оси конечности позвоночных.

исходящего от клеток поляризующей области, можно продемонстрировать, пересаживая меньшее число клеток. При пересадке примерно 30 клеток образуется дополнительный палец 2, при пересадке 80 клеток дополнительный палец 3 и при пересадке 130 клеток - дополнительный палец 4.

Действие пересаженных клеток поляризующей области можно воспроизвести путем имплантации инертного носителя, пропитанного ретиноевой кислотой. Ретиноевая кислота диффундирует из носителя, и при этом вдоль зачатка конечности создается градиент концентрации, высшая точка которого по крайней мере в три раза превышает минимальную концентрацию;

дополнительные пальцы начинают возникать при концентрации около 20 нМ. Благодаря применению высокочувствительных методов хроматографии удалось показать, что в нормальном зачатке конечности существует естественный градиент ретиноевой кислоты именно такого порядка, причем высшая концентрация характерна для клеток поляризующей области. Весьма вероятно, Рис. 16-48. Трансплантат из зоны поляризующей активности вызывает зеркальное удвоение структур крыла у реципиента.

Рис. 16-49. Расстояние между трансплантированным участком зоны поляризующей активности и участком такой же зоны хозяина определяет тип структур, формируемых клетками зачатка крыла. Числа 2, 3 и 4 показывают, какой палец развивается из каждой части зачатка.

Рис. 16-50. Химическая структура ретиноевой кислоты.

что природным морфогеном является именно ретиноевая кислота (рис. 16-50).

Недавно удалось идентифицировать рецептор ретиноевой кислоты. Им оказался белок, гомологичный рецепторам стероидных и тиреоидных гормонов;

он связывается с определенными последовательностями ДНК и регулирует транскрипцию определенных генов. Была выделена и секвенирована кДНК, кодирующая рецептор. В настоящее время для выявления рецепторов в тканях, подобных зачаткам конечностей, используются как ДНК-зонды, так и соответствующие антитела.

16.4.9. Процесс роста контролируется характером позиционных значений, которые могут изменяться при интеркаляции [43] До сих пор при обсуждении механизмов формирования пространственной организации и позиционных значений мы пренебрегали одним важным аспектом этого процесса: мы не обсуждали регуляцию роста, которая исключительно важна для приобретения различными частями и органами зародыша соответствующих размеров. В некоторых случаях эти механизмы основаны на автономных клеточных программах, запускаемых на ранних стадиях закладки зачатков определенных органов. Однако во многих других случаях рост и структура позиционных значений определяются как результат постоянных межклеточных взаимодействий и тесно связаны с ними. Изучая процессы регуляции, происходящие у многих организмов при замене фрагментов ткани, обладающих различными позиционными значениями, исследователи обнаружили, что клетки этих фрагментов растут и приспосабливаются к локальным условиям. Из этих экспериментов следует простое правило общего характера. Его лучшей иллюстрацией являются результаты исследований по регенерации конечностей у тараканов.

Тараканы относятся к насекомым, у которых в процессе развития от личинки до взрослой формы не наблюдается радикального метаморфоза;

развитие протекает постепенно путем смены нескольких ювенильных форм. Конечности молодых тараканов хорошо дифференцированы, но в отличие от клеток конечностей человека здесь дифференцированные клетки способны реагировать на сигналы, управляющие формированием пространственной организации конечности. При нарушении такой организации происходит ее восстановление.

Благодаря этим особенностям объекта можно исследовать деятельность систем, контролирующих становление пространственной организации. Для этого по завершении процесса эмбрионального развития на молодых особях проводят необходимые операции.

Мы опишем эксперименты, в которых изучалось поведение клеток эпидермального слоя и кутикулы, покрывающей тело таракана и образующей наружную поверхность конечности. Рост наружного покрова связан с последовательными линьками, когда молодая особь сбрасывает старую кутикулу и вместо нее возникает новая, более просторная. Материал для построения кутикулы выделяют лежащие под ней клетки эпидермиса, образующие один клеточный слой. Позиционные значения этих клеток определяют структуру образуемой ими кутикулы, и если эти значения в результате экспериментального воздействия изменяются, то такой результат можно выявить, исследовав кутикулу после линьки.

Регенерация наблюдается только у молодых особей, так как взрослые насекомые не растут и не линяют.

Нога таракана состоит из нескольких частей, расположенных (от основания к концу) в следующем порядке: тазик, вертлуг, бедро, голень, лапка. Лапка в свою очередь состоит из нескольких мелких члеников и оканчивается парой коготков (рис. 16-51). Если удалить две ноги, Рис. 16-51. Нога таракана. При каждой из последовательных линек нога растет, но ее строение не меняется.

Рис. 16-52. После соединения несовпадающих частей голени таракана происходит интеркаляция новой ткани (показана светлой краской), заполняющей разрыв в ряду позиционных значений (числа от 1 до 10). В первом случае (А) в результате интеркаляции восстанавливается недостающий участок, а во втором (Б) образуется третья, средняя часть голени между двумя уже имеющимися. Направление щетинок указывает на полярность интеркалирующей ткани. В обоих случаях восстанавливается непрерывность ряда позиционных значений.

перерезанные в голени на разных уровнях, то можно трансплантировать дистальную часть одной ноги на проксимальную культю другой. В результате получается «составная» нога без средней части голени. Тем не менее после линьки насекомого образуется внешне нормальная конечность: утраченная средняя часть голени регенерирует (рис. 16-52, А). Операцию можно видоизменить, так что ее результат будет еще более удивительным. Голень одной ноги перерезают около проксимального конца, а голень другой - около дистального. Длинную отрезанную голень одной ноги присоединяют к длинной культе другой, в результате чего образуется удлиненная конечность с удвоенной средней частью (рис. 16-52, Б). После линьки оказывается, что эта нога удлинилась еще больше: между двумя имевшимися срединными частями голени образовалась третья срединная часть. Как показано на рис. 16-52, Б, щетинки на этом вновь образовавшемся участке направлены противоположно по отношению к щетинкам на остальных частях голени.

Было проведено много операций такого типа. Все они указывают на существование системы позиционных значений, наличие которых делает клетки, расположенные в различных участках, неэквивалентными. Характеристика позиционного значения тесно связана с контролем пролиферации клеток. Принято определять позиционное значение числом, изменяющимся от максимума на одном конце участка конечности до минимума на другом. При описанных выше операциях рядом оказывались эпидермальные клетки, резко различающиеся по своим позиционным значениям. Поэтому в месте соединения двух отрезков начиналась пролиферация клеток и новые клетки при этом приобретали значения, которые плавно, без скачков, заполняли разрыв между позиционными значениями клеток, сближенных при операции (рис. 16-52). Такой результат можно обобщить, сформулировав правило интеркаляции: разрывы в плавном ряду позиционных значений вызывают местную пролиферацию клеток и вновь образующиеся клетки приобретают промежуточные позиционные значения, восстанавливая таким образом непрерывность структуры. Пролиферация прекращается только после заполнения промежутка клетками, обладающими всеми утраченными позиционными значениями. При этом восстанавливается нормальное распределение клеток в пространстве. Весь этот процесс получил название интеркалярной (или вставочной) регенерации.

Правило интеркаляции и вытекающее из него следствие, согласно которому рост продолжается до приобретения определенного распределения позиционных значений, - это важный организующий принцип для систем, где он действует. Начиная со структуры, определяемой приблизительно и в миниатюрном масштабе (например, за счет градиента морфогена), это правило предопределяет создание полного набора позиционных значений и регулирует рост каждой из частей данной структуры до определенных размеров. Все это необходимо для того, чтобы возникающая структура качественно, а следовательно, топологически, была верна. Если применить правило интеркаляции к двух- и трехмерным структурам, то оно окажется справедливым для широкого спектра явлений, включая как нормальную регенерацию ампутированных частей тела, так и аномальные эффекты (возникновение дополнительных конечностей при некоторых трансплантациях). По всей вероятности, это правило справедливо по отношению ко многим процессам органогенеза и регенерации не только у насекомых, но и у ракообразных и амфибий. Например, у дрозофилы в соответствии с этим правилом происходит коррекция ранних ошибок спецификации структуры (рис. 16-60). Даже у млекопитающих, утраченные структуры которых во взрослом состоянии не регенерируют, правилу интеркаляции может подчиняться регуляция роста и пространственной организации в эмбриональный период. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этого важного способа контроля роста, пока неизвестны.

Заключение Возникновение различных типов клеток эмбриона строго упорядочено в пространстве. Этот процесс обычно начинается с возникновения асимметрии яйцеклетки и продолжается благодаря межклеточным взаимодействиям в эмбриогенезе. На каждом из этапов этого процесса асимметрия, изначально выраженная очень слабо, усиливается положительной обратной связью и приводит к появлению четко выраженной пространственной организации. Можно сказать, что сигналы, координирующие формирование пространственной организации, снабжают клетки позиционной информацией. В простейшем случае градуальная концентрация диффундирующего морфогена может контролировать свойства клеток в зависимости от их расстояния по отношению к источнику морфогена;

вероятно, при развитии конечности у куриного зародыша роль морфогена выполняет ретиноевая кислота, контролирующая возникновение элементов по оси «большой палец-мизинец».

Дискретные различия клеток по своим свойствам могут соответствовать пороговым значениям реакции на морфоген.

Пространственная характеристика клетки определяется позиционной информацией, поступившей к ней в разное время. Пока эмбрион мал, эта характеристика весьма приблизительна, однако по мере роста эмбриона к ней добавляются уточняющие детали. Клетки ранних зачатков передней и задней конечностей эмбрионов позвоночных приобретают различные позиционные значения, вследствие чего свойства клеток разных конечностей становятся неэквивалентными задолго до дифференцировки. Уточнения структуры каждого органа возникают после появления в каждом из зачатков этих органов более детализированной внутренней сети позиционной информации. Вероятно, эта система детализированной позиционной информации в гомологичных органах, каковыми являются передние и задние конечности, может быть весьма сходной. Обладая памятью, клетки различных полей интерпретируют уточняющую позиционную информацию по-разному, в соответствии со своей предысторией.

Структура позиционных значений у многих животных тесно связана с контролем клеточной пролиферации по простому правилу интеркаляции. Это правило было сформулировано при изучении регенерации конечностей у насекомых и амфибий. Оно гласит, что нарушение непрерывности позиционных значений вызывает местную пролиферацию клеток, и вновь возникающие клетки приобретают промежуточные позиционные значения, восстанавливающие непрерывность нарушенной структуры. Этот же механизм может функционировать при нормальном развитии зародыша, восстанавливая неточности исходных характеристик позиционной информации.

16.5. Дрозофила и молекулярная генетика формирования пространственной организации [44] Вся классическая генетика основана на предположении о том, что строение любого организма контролируется его генами. Роль ДНК в обеспечении наследственности известна уже более ста лет, однако механизмы генетического контроля, которые отвечают за образование нормальной структуры тела взрослых животных, до сих пор остаются неразгаданными. Однако в последние годы этот пробел в наших знаниях начал заполняться. Новые открытия были сделаны главным образом при изучении развития плодовой мушки-дрозофилы. Опыты на дрозофиле привели к открытию класса контролирующих развитие генов, специфическая функция которых состоит в формировании пространственной организации тела. Сочетание подходов классической и молекулярной генетики помогло установить функции этих генов. Далее мы покажем, что общая стратегия формирования пространственной организации тела у позвоночных близка к таковой у дрозофилы, и более того, у позвоночных имеются близкие аналоги генов, контролирующих этот процесс у дрозофилы.

Первые представления о существовании такой генетической системы сформировались под влиянием открытия мутаций, вызывающих причудливые нарушения плана строения тела взрослой дрозофилы. Например, мутация Antennapedia приводит к тому, что на голове вместо антенн растут ноги (рис. 16-53);

в результате мутации bithorax вместо придатков, именуемых жужжальцами, появляется дополнительная пара крыльев.

Такие мутации, превращающие те или иные части тела в структуры, которые в норме должны находиться в других местах, были названы гомеозисными;

нормальные гены, подверженные таким му- Рис. 16-53. Голова нормальной взрослой дрозофилы (А) и дрозофилы, несущей гомеозисную мутацию Antennapedia. Б. Крайняя форма такой мутации;

обычно в структуры ноги превращается только часть антенны. (Рисунок мутанта Antennapedia выполнен по фотографии, предоставленной Peter Lawrence.) тациям, называют гомеозисными селекторными генами. Открытие гомеозисных мутантов подтолкнуло к проведению весьма искусных экспериментов, показавших, что тело нормальной мухи формируется наподобие лоскутного одеяла, в каждом из лоскутов-участков которого экспрессируется разный набор гомеозисных селекторных генов. Продукты этих генов служат молекулярными адресами, в первом приближении обеспечивающими клетки позиционными значениями. Гомеозисная мутация, таким образом, нарушает нормальное обеспечение информацией всех клеток данного участка: клетки дезинформируются в отношении своего местоположения и из них формируются структуры. которые в норме располагаются в иных участках тела.

Гомеозисные селекторные гены являются лишь одной из частей сложной генетической системы, ответственной за создание нормальной мозаичной структуры тела насекомого. В этом разделе мы опишем систему в целом и вкратце рассмотрим некоторые из ее молекулярных механизмов. Воспользуемся для этого концепцией формирования пространственной организации, которая обсуждалась в предыдущем разделе. Мы увидим, что эта система состоит из трех классов генов, контролирующих становление пространственной организации:

1) вначале действуют гены полярности яйца, продукты которых определяют пространственные координаты эмбриона, устанавливая градиент морфогена в яйце;

2) гены сегментации интерпретируют позиционную информацию, обеспечиваемую первичными градиентами морфогенов: эти гены размечают зародыш на серию сегментов - основных модулей, из которых состоит тело у всех насекомых;

3) гены сегментации посредством своих продуктов влияют на экспрессию гомеозисных селекторных генов, которые создают различия между сегментами;

в результате сочетания активности гомеозисных селекторных генов и генов сегментации клетки каждого сегмента посредством импринтинга запоминают определенные позиционные значения, которые обусловливают их дальнейшее поведение. И, наконец, внутри каждого сегментированного отдела тела возникают межклеточные коммуникации, определяющие самые мелкие детали взрослого организма. В этом клетки руководствуются, по всей вероятности, правилом интеркаляции.

16.5.1. Тело насекомого формируется путем видоизменения основного плана строения, предусматривающего наличие повторяющихся сегментов [45] Развитие дрозофилы от яйца до взрослой особи представлено на рис. 16-54. Период эмбрионального развития начинается с момента оплодотворения и занимает примерно сутки, в конце которых зародыш вылупляется из яйца и превращается в личинку. Развитие личинки протекает в три стадии, каждую из которых называют возрастом с соответствующим порядковым Рис. 16-54. Схема развития дрозофилы номером;

возраст заканчивается линькой, когда сбрасывается старая кутикула и образуется новая, от яйца до взрослой мухи.

более просторная. В конце третьего возраста личинка окукливается. Внутри куколки происходит существенная перестройка всех структур и через 9 дней после оплодотворения появляется взрослая муха, или имаго.

Тело мухи состоит из головы, трех грудных (торакальных) сегментов, обозначаемых Т1-ТЗ, и девяти брюшных (абдоминальных) сегментов, обозначаемых А1-А9. Каждый сегмент характеризуется неким общим планом строения, обладая при этом отдельными только ему присущими чертами. Сегмент Т1, например, снабжен парой ног, Т2 - парой ног и парой крыльев, ТЗ - парой ног и парой жужжальцев – небольших Рис. 16-55. Возникновение сегментов тела дрозофилы в процессе эмбрионального развития. Представлено на рисунках (вид сбоку) (А-В) и на соответствующих микрофотографиях, полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа (Г-Е). А, Г - после двухчасового развития эмбрион находится на стадии синцитиальной бластодермы (см. рис. 16-57).

Сегментации не наблюдается, хотя уже можно нарисовать (окрашенные участки) карту презумптивных зачатков с расположением будущих сегментов. Б, Д - после 5-8 ч развития эмбрион находится на стадии удлинения зародышевой полоски:

произошла гаструляция, начинают появляться сегменты и сегментированная ось тела удлиняется, изгибаясь на хвостовом конце и как-будто принимая форму яйцевой оболочки. В, Е - после 10 ч развития зародыша ось тела сокращается и вновь выпрямляется, все сегменты четко определены;

структуры головы, видимые на этой стадии на поверхности личинки, начинают погружаться вглубь последней с тем, чтобы появиться вновь только после окукливания. (Г, Д - с любезного разрешения Rudi Turner, Anthony Mahowald;

E - c любезного разрешения Jane Petschek.) булавовидных балансёров, необходимых для обеспечения полета (они образовались в результате эволюции второй пары крыльев, существовавших у более примитивных насекомых). Такая квазиповторяющаяся сегментация более выражена у личинки, у которой сегменты выглядят более унифицированными;

на более ранних стадиях (у зародышей) можно видеть, что зачатки головы и участки, формирующие рост взрослого насекомого, также выглядят сегментированными (рис. 16-55). Границы сегментов в данном случае носят несколько условный характер, Рис. 16-56. Сегменты личинки дрозофилы и их соответствие участкам бластодермы. Обратите внимание, что концевые области бластодермы соответствуют несегментированным структурам, которые формируют в основном внутренние части личинки, а также сегментированные зачатки ротового аппарата взрослой мухи. Сегментацию у дрозофилы можно описать, используя термины «сегменты» или «парасегменты»;

их взаимосвязь указана в нижней части рисунка. До сих пор не установлено точное число сегментов брюшка: наличие восьми доказано, однако, вероятно, имеется и девятый. Мn-мандибула;

Мх-максилла;

La-губа и на этот счет имеются особые соглашения. При обсуждении характера экспрессии генов мы увидим, что в целом принято говорить о существовании 14 парасегментов (обозначаемых Р1-Р14);

это составляет половину числа традиционно определяемых сегментов (рис. 16-56). И, наконец, на обоих концах тела животного расположены высокоспециализированные структуры, не имеющие сегментарного происхождения.

Общий план строения всего тела, где представлены два специализированных конца и набор модулируемых повторений основной единицы, возникает в результате процессов, которые происходят в яйце и раннем эмбрионе в первые часы после оплодотворения.

16.5.2. Развитие дрозофилы начинается с образования синцития [46] Длина яйца дрозофилы составляет около 400 мкм, а диаметр около 160 мкм;

яйцо обладает ярко выраженной полярностью. Как и у других насекомых, развитие яйца в данном случае происходит достаточно необычно: в результате последовательных делений ядра, не сопровождающихся делением цитоплазмы, возникает синцитий. Ранние деления ядер синхронны и происходят в быстром темпе - через каждые мин. В результате первых 9 делений возникает группа ядер, большая часть которых мигрирует из центра яйца к поверхности, где и формируется монослой, именуемый синцитиальной бластодермой. После следующих 4 делений ядер плазматические мембраны прорастают внутрь от поверхности яйцеклетки и окружают каждое из ядер. Так синцитиальная бластодерма превращается в клеточную бластодерму, которая содержит около 5000 отдельных клеток (рис. 16-57). Небольшая группа ядер, расположенных на самом заднем конце яйца, образует клетки на несколько циклов деления раньше. Эти полярные клетки представляют собой первичные половые клетки, которые положат начало поколениям яйцеклеток или спермиев. Как и в процессе деления у амфибий, высокая скорость репликации ДНК тормозит транскрипцию, так что до стадии клеточной бластодермы развитие в основном (хотя и не полностью) зависит от запасов материнской мРНК и белка, накапливающихся в яйцеклетке до оплодотворения. После образования клеток их деления приобретают более привычный характер, становятся асинхронными, скорость деления замедляется и резко повышается скорость транскрипции.

Зародыш дрозофилы на стадии клеточной бластодермы соответствует полой бластуле амфибий или морских ежей;

отличие же состоит в том, что бластула амфибий и морских ежей заполнена жидкостью, а в центре зародыша на этой стадии у насекомых располагается желток.

Гаструляция начинается после образования клеток. Хотя у насекомых геометрия этого процесса носит крайне специфические черты, общий результат сходен: благодаря координированным движениям клеток вдоль оси эмбриона возникает кишечная трубка из энтодермальных клеток;

трубка окружена мезодермой, которая занимает пространство между этой трубкой и наружным листком эктодермы. В ходе гаструляции длинная ось эмбриона сначала вытягивается («удлинение Рис. 16-57. Развитие яйца дрозофилы от момента оплодотворения до стадии клеточной бластодермы. [Н.А. Schneiderman, in Insect Development (P.

A. Lawrence, ed.), pp. 3-34, Oxford, U.K., Blackwell, 1976.] Рис. 16-58. Карта презумптивных зачатков эмбриона дрозофилы на стадии клеточной бластодермы (вид сбоку и поперечный разрез), раскрывающая связь между дифференцировкой важнейших типов тканей в дорсовентральном направлении и расположением сегментов вдоль переднезадней оси.

Утолщенная линия окружает участок, где формируются сегментированные структуры. В процессе гаструляции клетки, расположенные вдоль вентральной срединной линии, инвагинируют, образуя мезодерму, а клетки, которые позже сформируют пищеварительный тракт, инвагинируют вблизи обоих концов эмбриона. (V. Hartestein, G. M. Technau, J. A. Campos-Ortega, Wilhelm Roux Archiv Dev. Biol., 194, 213-216, 1985.) зародышевой полоски») и затем вновь укорачивается («сокращение зародышевой полоски»);

в результате удлинения ось тела изгибается в соответствии с упаковкой эмбриона под яйцевой оболочкой (рис. 16-55).

Наблюдая за поведением клеток в ходе сложных гаструляционных движений, можно нарисовать карту презумптивных зачатков для монослоя клеток, расположенных на поверхности бластодермы (рис. 16-58). Карта презумптивных зачатков выглядит наиболее просто на поперечных срезах через среднюю часть эмбриона;

здесь будущая мезодерма расположена вентрально, а будущая эктодерма находится по обе стороны от нее. В данном случае как и у позвоночных вдоль всего тела проходит вытянутое скопление нервных клеток, возникающих из части эктодермы. В развитии насекомых мы находим этапы, соответствующие не только гаструляции и нейруляции, но и образованию сомитов: по завершении гаструляции на поверхности эмбриона наблюдаются бороздки и выступы, отмечающие подразделение тела на парасегменты вдоль переднезадней оси (рис. 16-55). Более точные тесты показывают, что основные черты такой сегментарной структуры определяются уже на стадии клеточной бластодермы до начала гаструляции.

16.5.3. План строения эмбриона контролируется в двух прямоугольных системах координат [47] Для упрощения ориентации на бластодерме принято пользоваться двумя координатами - условными широтой и долготой. Было также показано, что, согласно генетическим тестам, формирование пространственной организации происходит за счет двух механизмов, один из которых определяет организацию по дорсовентральной оси, а другой - по переднезадней. Дорсовентральная ось контролируется группой, состоящей примерно из 20 генов: мутации любого из них приводят к развитию эмбрионов, которые как бы «дорсализованы», т. е. лишены вентральных структур, или «вентрализованы», т. е. лишены дорсальных структур. Другая группа, состоящая примерно из 50 генов, куда входят гены сегментации и гомеозисные селекторные гены, уже упоминавшиеся ранее, контролирует пространственную организацию вдоль переднезадней оси.

Мутации этих генов приводят к развитию эмбрионов, у которых либо отсутствуют какие-либо элементы вдоль переднезадней оси, либо эти элементы дуплицированы. Хотя к настоящему времени многие гены из обеих групп клонированы и даже определены их белковые продукты, тем не менее мы ограничимся рассмотрением пространственной организации зародыша только вдоль переднезадней оси.

16.5.4. Переднезадняя полярность эмбриона контролируется сигналами с обоих концов яйца дрозофилы [48] Исходная полярность яйцеклетки контролируется распределением веществ, запасенных до оплодотворения в период нахождения ооцитов в яичнике (рис. 16-39). Если на переднем конце яйцеклетки дрозофилы проделать маленькое отверстие с тем, чтобы вытекло небольшое количество цитоплазмы, расположенной в самой передней части клетки, то эмбрионы теряют способность формировать структуры головы. Более того, если вместо утраченной цитоплазмы переднего конца инъецировать цитоплазму заднего конца из другой яйцеклетки, то в передней половине яйцеклетки-реципиента возникнет второй набор брюшных сегментов с обратной полярностью (рис. 16-59).

Были идентифицированы мутации, приводящие к подобным нарушениям структуры передней или задней частей эмбриона. Гены полярности яйца, которые были обнаружены с помощью таких мутантов, являются первыми элементами иерархической генетической системы, участвующей в формировании пространственной организации вдоль переднезадней оси. Гены полярности яйца относятся к числу генов, транскрибируемых в материнском геноме в ходе оогенеза;

их запасенные продукты начинают действовать вскоре после оплодотворения. По этой причине фенотип эмбриона определяется аллелями матери, а не сочетанием отцовских и материнских аллелей, представленных в самом эмбрионе.

Гены, экспрессируемые таким образом, называют генами материнского эффекта.

У матерей-гомозигот по мутации полярности яйца bicoid образуются эмбрионы без головы и торакальных (грудных) структур и за счет этого абдоминальные (брюшные) структуры занимают необычно большую часть всего тела;

в свою очередь мутация полярности яйца oskar приводит к образованию зародышей, полностью лишенных абдоминальных сегментов. (Несегментированные структуры обоих концов тела находятся на особом положении: они не затрагиваются этими мутациями, но могут исчезнуть вследствие мутаций torso и некоторых других.) Рис. 16-59. Локализованные детерминанты на концах яйца дрозофилы определяют его переднезаднюю полярность. Если на переднем конце яйца удалить небольшой участок цитоплазмы и заменить его цитоплазмой с заднего конца, то возникает аномальная личинка, имеющая два задних конца (фото справа);

на фото слева представлена нормальная личинка. Личинки сфотографированы в темном поле. [H.J. Frohnhofer, R. Lehmann, С.

Nusslein-Volhard, J. Embryol. Exp. Morphol, 97 (suppl.): 169-179, 1986.] Мутации bicoid и oskar приводят к отсутствию соответствующих генных продуктов. Эти мутации можно устранить посредством инъекции мутантным эмбрионам нормальной цитоплазмы. Мутанты bicoid развиваются сравнительно нормально после инъекции цитоплазмы переднего конца нормальных эмбрионов в передний конец мутантного яйца, а мутант oskar нормализуется вследствие инъекции цитоплазмы заднего конца нормального эмбриона в будущий брюшной отдел мутанта. В обоих случаях нормальный генный продукт локализован на одном из концов яйца и действует как источник определенного сигнала, контролируя возникновение позиционных значений вдоль переднезадней оси.

Молекулярно-генетические эксперименты позволили прояснить ситуацию. С помощью гибридизации in situ клонированных кДНК зондов bicoid было показано, что мРНК, соответствующая гену bicoid, концентрируется на переднем конце яйца. Исходно эта мРНК синтезируется в яичнике питающими клетками, связанными с ооцитами (см. разд. 16.4.1, рис. 16-39). По мере перемещения bicoid-мРНК по цитоплазматическим мостикам в ооцит она прикрепляется к некоторым компонентам цитоплазмы (вероятно, к элементам цитоскелета) на переднем конце ооцита.

Трансляция начинается только после откладки яйца. В результате возникает градиент концентрации белка bicoid с максимумом на переднем конце эмбриона. Градиент концентрации можно изменить генетически, создав мутанты, несущие множественные копии нормального гена bicoid: с увеличением дозы гена у матери увеличивается концентрация белка в яйце. Соответственно происходит смешение сегментов эмбриона по направлению к заднему концу, даже несмотря на то, что их расположение определяется позиционной информацией, возни- Рис. 16-60. Градиент белка bicoid в яйцеклетке дрозофилы и его влияние на структуру сегментов. Градиент обнаруживается при обработке антителами против белка bicoid;

характер сегментации выявляется при окрашивании антителами к продукту гена группы pair-rule, именуемого even skipped (см. разд. 16.5.5). Сравниваются три эмбриона: не имеющий гена bicoid, имеющий одну копию этого гена и имеющий 4 копии. В отсутствие гена bicoid сегменты на переднем конце не формируются;

с увеличением дозы гена они формируются все дальше от переднего конца зародыша, как если бы их расположение определялось концентрацией белка bicoid в данном участке. Изменение этой концентрации, как следует из интенсивности окраски, может быть представлено в виде графика. Несмотря на значительные различия в расположении зачатков сегментов, которые обнаруживаются между эмбрионами с одной и с четырьмя копиями гена, и те, и другие образуют вполне нормальные личинки и взрослых особей.

Механизмы такой регуляции обсуждаются в разд. 16.4.9.

кающей под действием концентрации белка bicoid в данном участке (рис. 16-60). Эти соображения позволяют отнести данный белок к морфогенам (см. разд. 16.4.2).

16.5.5. Действие трех классов генов сегментации приводит к подразделению эмбриона на сегменты [49] Продукты генов полярности яйца обеспечивают появление универсальных градуальных сигналов, определяющих возникновение системы отдельных сегментов. Этот процесс зависит от действия генов сегментации, образующих группу примерно из 20 генов. Мутации этих генов способны изменять число сегментов или их основные внутренние свойства, не затрагивая общую полярность яйца. Гены сегментации по сравнению с генами полярности яйца действуют на более поздних стадиях. С учетом действия этих генов фенотип эмбриона будет полностью или частично определяться генотипом эмбриона, а не только матери. Таким образом, эти гены следует отнести к группе генов эффекта зиготы.

Большинство мутаций генов сегментации летальны;

их эффект не проявляется у взрослых мух, поскольку мутанты погибают, не достигнув продвинутых стадий развития. Однако такие летальные мутации могут распространяться в рецессивном состоянии (как это обычно и бывает). Следовательно, жизнеспособными оказываются гетерозиготы, обладающие двумя копиями гена: одной нормальной и другой мутантной.

При скрещивании гетерозиготных родителей четвертую часть потомства составляют гомозиготы, несущие две копии мутантного гена. Такие потомки погибают преждевременно на поздних эмбриональных или ранних личиночных стадиях, но они живут достаточно долго, чтобы мог проявиться измененный фенотип. Почти все гены сегментации были обнаружены в результате воздействия на мух мутагенами и последующего изучения десятков тысяч погибающих личинок, которые были получены в результате скрещивания мутантных форм.

Гены сегментации подразделяют на три класса (рис. 16-61). Первыми в действие вступают по меньшей мере три gap-гена, действие продуктов которых приводит к появлению наиболее грубого подразделения эмбриона. Мутации любого gap-гена сопровождаются исчезновением обширных участков последовательных сегментов, а мутации различных gap-генов приводят к появлению различных, но частично перекрывающихся дефектов. Например, личинка мутантная по гену Krppel лишена 8 сегментов от Т1 до А5 включительно (соответственно парасегменты РЗ-Р10).

Рис. 16-61. Фенотипическое проявление мутаций, затрагивающих три типа генов сегментации. В каждом случае участки, выделенные цветом у нормальных личинок (слева), у мутанта делетированы или заменены зеркальными повторами не затронутых участков. Доминантные мутации принято обозначать прописными буквами, а рецессивные - строчными. Несколько мутаций, затрагивающих строение тела дрозофилы, относят к доминантным вследствие их выраженного влияния на фенотип гетерозигот, хотя по основной характеристике (летальному эффекту) они рецессивны, т.е. проявляются только у гомозигот. (С. Nsslein-Volhard, Е. Wieschaus, Nature, 287, 795-801, 1980;

с небольшими изменениями.) Следующими генами сегментации, вступающими в действие, являются 8 генов pair-rule. Мутации этих генов вызывают серию делеций, повреждающих чередующиеся сегменты, что приводит к сохранению только половины сегментов. Такая парно-сегментарная периодичность характерна для всех мутантов по генам pair-rule, но они отличаются по локализации мутаций в границах сегментов или парасегментов. Например, один из мутантов pair-rule, именуемый even-skipped, теряет все четные парасегменты, а другой -fushi tarazu (ftz) - теряет все нечетные парасегменты.

Мутация этого же класса, названная hairy, приводит к исчезновению серии участков одинаковой ширины, которые не совпадают с парасегментами.

Наконец, существует около 10 генов полярности сегментов. Мутации этих генов приводят к утрате части сегмента и ее замещению зеркальной копией всего сегмента либо его части. Например, у мутантов gooseberry задняя половина каждого сегмента, т. е. передняя половина каждого парасегмента, заменяется почти зеркально перевернутой передней половиной соответствующего сегмента (см. рис. 16-61).

Анализ фенотипа различных мутантов по генам сегментации приводит к предположению, что гены сегментации формируют координированную систему, которая делит развивающийся эмбрион на все более мелкие домены, различающиеся по характеру генной экспрессии.

И здесь молекулярная генетика также позволяет изучать механизмы, лежащие в основе действия этой системы.

16.5.6. Локализованная экспрессия генов сегментации регулируется иерархической системой позиционных сигналов [44, 50] Несколько генов из каждой группы генов сегментации было клонировано и соответствующие зонды использованы для локализации транскриптов в нормальных эмбрионах по методу гибридизации in situ (см. разд. 4.6.11). Мы уже обсуждали ранее, как этот метод был использован для демонстрации того, что транскрипты гена bicoid являются источником позиционного сигнала: транскрипты локализуются на одном из концов яйца, хотя эффекты мутации гена распространяются на большую часть эмбриона. Подобным образом было показано, что некоторые гены сегментации (а именно gap-гены) в свою очередь прямо или косвенно участвуют в формировании позиционных сигналов, которые позволяют контролировать характер развития в ближайшем окружении. Например, мутанты, дефектные по gap-гену Krppel, обладают выраженной аномалией, распространяющейся через участок, где были выявлены транскрипты данного гена в нормальном эмбрионе, а также на несколько сегментов за его пределами (рис. 16-62). Ген Krppel был секвенирован и оказался гомологичен (равно, как и другой gap-ген-hunchback) семейству генов, о которых известно, что у позвоночных они кодируют Рис. 16-62. Пространственные домены, в которых действует дар-ген Krppel, картированный на бластодерме дрозофилы. А. На рисунке показано, как дефект, вызванный отсутствием функционального продукта Krppel, простирается за пределы участка, в котором в норме локализованы транскрипты Krppel. Б. Нормальное распределение транскриптов Krppel согласно результатам гибридизации in situ на стадии бластодермы. В.

Нормальное распределение белка Krppel, выявляемое с помощью окрашивания антителами на этой же стадии. На других стадиях белок может быть распространен более широко. Фенотип мутанта, у которого отсутствует функциональный продукт Krppel, указан на рис. 16-61, А. (Б - из Н.

Jackele, D. Tautz, R. Schuh, E. Seifert, E. Lehmann, Nature, 324, 668-670, 1986;

В - из U. Gaul, E. Seifert, R. Shuh, H. Jackle, Cell, 50, 639-647, 1987, copyright Cell Press.) Рис. 16-63. При гибридизации in situ радиоактивного ДНК-зонда для гена ftz с бластодермой дрозофилы среди продуктов транскрипции данного гена обнаруживается семь полос, что соответствует проявлению дефектов у мутантов по ftz. На радиоавтографе полосы экспрессии ftz выявляются на продольном срезе в виде черных точек, образованных зернами серебра. (С любезного разрешения Philip Ingham.) ДНК-связывающие регуляторные белки, включая фактор транскрипции TFIIIA у Xenopus (см. разд. 9.1.9). Возникает соблазн предположить по аналогии с bicoid, что белок Krppel в роли диффундирующего морфогена распространяется из участка транскрипции Krppel, хотя наблюдаемое распространение белка не столь обширно, как требуется в соответствии с этой гипотезой.

Некоторые гены группы pair-rule участвуют в передаче сигналов на более короткие расстояния, оказывая воздействие на клетки, соседствующие с участками транскрипции этих генов;

другие гены, напротив, оказывают воздействие на развитие только в тех участках, где они транскрибируются. Например, транскрипты нормального гена ftz на стадии бластодермы проявляются в виде семи кольцевых полосок, наподобие полос у зебры (рис. 16-63), отмечающих ширину и расположение зачатков четных парасегментов, которые утрачиваются у мутантов ftz.

Подводя итоги этих наблюдений, можно предположить, что продукты генов полярности яйца обеспечивают эмбрионы универсальными позиционными сигналами, вынуждающими экспрессироваться определенные gар-гены в определенных местах. В свою очередь продукты gap-генов представляют как бы второй ярус позиционных сигналов, действующих более локализованно и используемых для регуляции более тонких деталей пространственной организации эмбриона, и оказывающих в свою очередь влияние на экспрессию еще одной группы генов, куда входят и гены группы pair-rule. Таким образом, универсальные градиенты, создаваемые генами полярности яйца, принимают участие в формировании более мелких деталей пространственной организации путем постепенного подразделения по принципу иерархии последовательных позиционных контролей. Это весьма надежная стратегия: поскольку позиционные сигналы не определяют подробных деталей, отдельные ядра, отвечающие на них, не должны реагировать с высокой точностью на минимальное изменение величины таких сигналов.

16.5.7. Продукты одного гена сегментации контролируют экспрессию другого [44, 50, 51] Согласно представленной выше схеме, иерархия позиционных сигналов должна соответствовать иерархии регулярных взаимодействий между генами, управляющими формированием пространственной организации. Это положение можно проверить при изучении влияния мутации одного гена на экспрессию другого. Оказалось, что гены, участвующие в процессе формирования пространственной организации вдоль переднезадней оси, формируют иерархическую пирамиду в пяти основных ярусах, причем продукты генов каждого яруса регулируют экспрессию генов нижележащих ярусов. На вершине этой пирамиды находятся гены полярности яйца, за ними gap-гены, затем гены pair-rule, затем гены полярности сегментов и, наконец, гомеозисные селекторные гены.

Можно получить мутантные эмбрионы, лишенные нормальных продуктов гена Krppel, и определить методом гибридизации in situ экспрессию нормального гена ftz, используя клонированный зонд комплементарный последнему. Характерные полоски ftz не образуются именно в тех участках бластодермы, которые затронуты мутацией Krppel. Следовательно, продукт гена Krppel прямо или косвенно регулирует экспрессию гена ftz. Вместе с тем, у мутантов ftz распределение нормального продукта Krppel не нарушено: подукт ftz не регулирует экспрессию гена Krppel.

Иногда наблюдается взаимодействие между генами одного яруса иерархической пирамиды;

в отличие от взаимодействия генов Krppel и ftz некоторые из этих взаимодействий могут иметь реципрокный (т. е. перекрестный) характер. Например, gap-гены Krppel и hunchback взаимно ингибируют друг друга, что не позволяет экспрессироваться их продуктам в ядрах эмбриона одновременно. Поэтому в норме они экспрессируются в соседних участках бластодермы с четкой границей между областью экспрессии гена hunchback, расположенной спереди, и областью экспрессии гена Krppel, расположенной сзади. Но в отсутствие одного из продуктов этой пары генов область другого продукта расширяется за пределы обычной демаркационной линии. Явление взаимного ингибирования, проявляемое этими двумя генами, которое вынуждает ядро каждой из клеток совершать выбор между тем или иным направлением специализации, может быть использовано для объяснения того, каким образом в ответ на непрерывный градиент морфогена возникает набор строго определенных неперекрывающихся областей экспрессии.

Рис. 16-64. А. Характер транскрипции четырех из восьми известных генов группы pair-rule и одного гена полярности сегмента engrailed в бластодерме дрозофилы. Хотя каждый из генов группы pair-rule сам по себе определяет только простое чередование с шагом в два сегмента, деятельность всего набора генов pair-rule в сочетании приводит к определению соседствующих и перекрывающихся структур и может вызывать значительно более тонкое и сложное разбиение всей бластодермы на полосы шириной всего в одну клетку, в которых и экспрессируется ген engrailed.

Б. Проявление экспрессии гена engrailed у пятичасового эмбриона (стадия удлинения зародышевой полоски), десятичасового эмбриона и у взрослой мухи, крылья которой на этом препарате были удалены. Данная картина экспрессии выявляется с помощью антител против белка engrailed (для пятичасового) или (для двух других образцов) путем создания линии мух, несущих регуляторные последовательности гена engrailed, связанные с кодирующей последовательностью гена фермента репортера, чье присутствие легко выявляется гистохимически по образованию окрашенного продукта в процессе реакции, катализируемой этим ферментом. Обратите внимание, что распределение белка engrailed после его появления сохраняется в течение всей жизни животного.

(А -по М. Akam, Development, 101, 1-22, 1987;

Б - с любезного разрешения Тот Kornberg.) Вероятно, регулярная периодическая картина экспрессии генов pair-rule устанавливается сходным образом. Здесь градуальные позиционные сигналы, определяемые экспрессией генов дар, задают примерное направление развития, а взаимодействие генов pair-rule (например, генов hairy и runt) приводит к более строгой и точной детализации. Таким образом, области экспрессии различных генов группы pair-rule формируют точно воспроизводимое распределение взаимных исключений и перекрываний в каждом из двусегментных модулей бластодермы нормального эмбриона (рис. 16-64). Различные полоски клеток бластодермы, опоясывающих зародыш, характеризуются различной комбинацией экспрессии генов pair-rule, которая, будучи организована по принципу иерархии, спускается до минимально возможного уровня детализации-до ширины одиночной клетки, что соответствует примерно 1/4 ширины будущего сегмента или парасегмента.

16.5.8. Гены полярности яйца, gap-гены и раir-rule-гены создают временную пространственную организацию;

гены полярности сегментов и гомеозисные селекторные гены обеспечивают постоянную запись [44, 52] События, описанные в предыдущем разделе, происходят в течение первых нескольких часов после оплодотворения. Gap-гены и гены pair-rule активируются один за другим и кодируемые ими мРНК (наблюдаемые с помощью гибридизации in situ) создают усредненную и сильно огрубленную (по сравнению с конечным результатом) картину. Вновь синтезируемые продукты сами регулируют экспрессию генов до тех пор, пока вследствие реализации серии взаимных приспособлений, исходное распределение генных продуктов не выявляется в виде четко определенной системы повторяющихся полос. Но и эта система нестабильна и носит временный характер. По мере развития эмбриона от стадии гаструлы и далее регулярное посегментное расположение продуктов генов групп дар и pair-rule исчезает. Но их действие привело к возникновению временного набора позиционных значений, т. е. молекулярных адресов клеток бластодермы, которые будут поддерживать сегментарную организацию личинки и взрослого животного. Эти позиционные значения записаны с помощью сохраняющейся активации генов полярности сегментов и гомеозисных селекторных генов.

16.5.9. Гены полярности сегментов контролируют основные подразделения каждого из парасегментов [44, 53] В отдельных участках всех парасегментов наблюдается сходная картина экспрессии генов полярности сегментов. Хорошим примером тому является ген engrailed. Присутствие его мРНК можно продемонстрировать с помощью гибридизации in situ на стадии клеточной бластодермы, где эта мРНК формирует серию из 14 полос шириной в одну клетку, расположенных в самых передних частях будущих парасегментов. Появление этих полос тесно связано с экспрессией полос, соответствующих генам pair-rule (см. рис. 16-64);

наблюдая за нарушениями распределения полос engrailed у мутантов pair-rule, можно сформулировать правила включения генов engrailed. По всей вероятности, ключевую роль здесь выполняет одно из двух специфических сочетаний продуктов генов pair-rule: в четных парасегментах ген engrailed проявляется только после экспрессии генов ftz и odd-paired, а в нечетных - после экспрессии сочетания even-skipped и paired. Иные сочетания продуктов генов pair-rule активируют или подавляют другие гены полярности сегментов: транскрипция гена wingless включается в полосах шириной в одну клетку, которые расположены в наиболее близких к хвостовому концу областях парасегментов. Таким образом, каждый будущий парасегмент уже на стадии клеточной бластодермы подразделен по крайней мере на три различных области. Химические различия будут сохраняться и поддерживаться постоянной транскрипцией по меньшей мере некоторых генов полярности сегментов и после того, как продукты генов pair-rule в основном исчезнут (см. рис. 16-61, Б). Некоторые из экспрессируемых таким образом генов полярности сегментов (включая, например, wingless) создают продукты, которые в последующем развитии действуют в качестве локальных морфогенов внутри сегментов, регулируя более тонкие детали внутренней пространственной организации парасегмента и его рост.

Продукты генов pair-rule не только регулируют активность генов полярности сегментов, но также взаимодействуют с продуктами генов дар (и, очевидно, генами полярности яйца) и вызывают точно локализованную дифференциальную активацию генов, формирующих пятый и последний ярус иерархической пирамиды - гомеозисных селекторных генов, в результате деятельности которых и сохраняются постоянные различия между разными парасегментами. Далее мы более детально рассмотрим проявление активности этих селекторных генов и тщательно обсудим их роль в обеспечении механизмов клеточной памяти.

16.5.10. Гомеозисные селекторные гены комплекса bithorax и комплекса Antennapedia обусловливают возникновение различий между парасегментами [54] У дрозофилы изучено множество различных гомеозисных мутаций и каждая из них приводит к замене одной части тела другой;

например, вместо глаз возникают крылья, вместо антенн-ноги и т.д. (см. рис. 16-53). Особенно важные наборы мутаций могут возникать в пределах двух кластеров генов, известных как комплекс bithorax и комплекс Antennapedia. Каждый из комплексов содержит несколько генов, обладающих различными функциями: гены комплекса bithorax контролируют возникновение различий между абдоминальными и торакальными сегментами тела, а гены комплекса Antennapedia контролируют возникновение различий между торакальными сегментами и сегментами головы. Гены этих двух комплексов именуются гомеозисными селекторными генами, поскольку они осуществляют выбор между состояниями детерминации, соответствующими различным, но гомологичным, или гомеоморфологичным, структурам. Каждый гомеозисный селекторный ген ограничен в своем действии специфическим доменом, или областью тела, которая трансформируется в результате мутации данного гена. Обычно такие домены обладают четко очерченными границами, которые приблизительно соответствуют половине «сегмента», не совпадающего с границами сегмента, но совпадающими с границами парасегмента (рис. 16-56).

Гомеозисные селекторные гены идентифицированы, как было показано в разд. 16.5, благодаря открытию мутантных взрослых мух;

многие мутации этой группы являются рецессивными леталями. Такие мутации приводят к гибели особи практически сразу же после вылупления. Таким образом, как и в случае рецессивных летальных мутаций генов сегментации (см. разд. 16.5.5), эффект этих генов никогда не проявляется у взрослых мух, но может наблюдаться у эмбрионов или ранних личинок. Следовательно, анализ этих ранних стадий позволяет получить наиболее четкую и в некоторых отношениях наиболее полную картину, Рис. 16-65. Нормальный эмбрион дрозофилы (А) и мутантный эмбрион (Б), у которого утрачена большая часть генов комплекса bithorax.

У мутантов все парасегменты, расположенные сзади от Р5, сходны с Р5. [С любезного разрешения Gary Struhl;

A - перепечатано (с разрешения) из Nature, 293, 36-41, Copyright 1981, Macmillan Journals Limited.] дающую представление о роли гомеозисных селекторных генов.

Личинки, дефектные по всем генам комплекса bithorax, обладают относительно простым строением: голова и передняя часть груди до парасегмента Р4 нормальны, но все остальные 10 парасегментов приобретают свойства парасегмента Р4. Частичные делеции в комплексе bithorax приводят не к столь серьезным трансформациям: например, Р5 и все остальные парасегменты, расположенные впереди, могут выглядеть нормальными, а парасегменты, расположенные от Р5 сзади, превращаются в Р5 (рис. 16-65). Эти наблюдения, а также аналогичные находки в отношении комплекса Antennapedia иллюстрируют существенную роль гомеозисных селекторных генов в определении различий между параcегментами: при отсутствии этих последних генов такой дифференцировки парасегментов не происходит.

16.5.11. Гомеозисные селекторные гены кодируют систему молекулярных адресов [44, 55] Как и гены сегментации, гомеозисные селекторные гены впервые активируются на стадии бластодермы. Поскольку вся ДНК комплексов Antennapedia и bithorax была клонирована, в настоящее время с помощью гибридизации in situ и имеющихся ДНК-зондов можно выявить последовательность транскрипции всех гомеозисных селекторных генов. Выводы из этих исследований удивительны: на первый взгляд каждый гомеозисный селекторный ген экспрессируется нормально только в тех участках, которые развиваются аномально, т. е. как будто они находятся не на своем месте, когда этот ген мутирует или отсутствует. Это кажущееся отсутствие логики позволяет рассматривать продукты селекторных генов как молекулярные адреса. Каждый парасегмент обладает собственным набором таких адресов, и если адреса изменены, то парасегмент ведет себя таким образом, как если бы он находился в другом месте. Активация гомеозисных селекторных генов контролируется генами сегментации, и поэтому характер экспрессии гомеозисных селекторных генов совпадает с границами парасегментов, определяемых продуктами генов pair-rule и полярности сегментов. Таким образом, сочетание продукта определенного гомеозисного селекторного гена (или набора таких продуктов) с определенными продуктами генов полярности сегментов надежно определяет единственный адрес, которым обладают только клетки одного из участков данного сегмента.

16.5.12. Продукты гомеозисных селекторных генов участвуют в регуляции экспрессии этих генов [56] Как и в случае генов сегментации, характер экспрессии гомеозисных селекторных генов с момента появления транскриптов в бластодерме претерпевает сложные настройки и с определенного момента в пределах каждого парасегмента приобретает свои строго определенные черты;

окончательный характер экспрессии устанавливается только после завершения гаструляции. На рис. 16-66, А указывается характер экспрессии на стадии удлинения зародышевой полоски, т. е. примерно через 5 ч после оплодотворения (см. рис. 16-55).

Этот характер частично изменяется в результате взаимодействия нескольких гомеозисных селекторных генов. Если гомеозисные селекторные гены расположены по порядку, начиная с генов, экспрессирующихся на головном конце, и кончая генами хвостового конца, то, следовательно, каждый ген этой серии репрессируется продуктами последующих ее Рис. 16-66. А. Характер экспрессии генов в комплексах Antennapedia и bithorax в зависимости от их хромосомной локализации. Обратите внимание, что последовательность генов в каждом из хромосомных комплексов соответствует пространственной последовательности, с которой экспрессируются эти гены. Б. Характер транскрипции гомеозисных селекторных генов через 5 ч после оплодотворения. Все эти гены, за исключением гена caudal, расположены в комплексах Antennapedia и bithorax, и все они на этой стадии экспрессируются, по-видимому, в доменах парасегментов. Большинство этих генов активно экспрессируется по меньшей мере в одном парасегменте (выделены наиболее темным цветом) и на менее высоком уровне в некоторых соседних парасегментах: там, где присутствие транскрипта необходимо для проявления нормального фенотипа (более светлый цвет) и там, где транскрипты не нужны (самый светлый цвет). (Б - из М. Akam, Development, 101, 1-22, 2987;

с изменениями.) членов. Таким образом, в отсутствие продуктов последующих генов любой данный ген в этой серии будет характеризоваться высоким уровнем экспрессии как в своем обычном домене, так и в парасегментах, расположенных позади этого домена. Такое расположение генов, соответствующее их пространственной экспрессии и контролируемое взаимосвязями, отражено последовательностью, в которой они расположены вдоль хромосомы в каждом из двух комплексов генов (рис. 16-66, Б). Этот вопрос обсуждается в разд. 10.3.19.

16.5.13. Взрослая муха развивается из набора имагинальных дисков, которые запомнили позиционную информацию [57] Характер экспрессии гомеозисных селекторных генов устанавливается в эмбрионе дрозофилы и определяет строение не только личинки, но и взрослой мухи. Для того чтобы в полной мере оценить роль этих Рис. 16-67. Имагинальные диски у личинки дрозофилы (изображены схематично) и образующиеся из них структуры взрослого организма. Из трех пар дисков ноги показана только одна. [J. W. Fristom et al. Problems in Biology: RNA in Development (E. W. Hanley, ed.), p. 382, Salt Lake Sity, University of Utah Press, 1969.] генов, необходимо иметь представление о том, каким образом в конце концов развивается взрослая особь, или имаго.

Взрослая муха формируется главным образом за счет недифференцированных так называемых имагинальных клеток, собранных в группы, которые расположены по бокам в каждом из сегментов тела личинки. Источником имагинальных клеток является эмбриональный эпителий, который покрывает все тело. Эти клетки сохраняют связь с эпидермисом и в основном участвуют в формировании эпидермальных структур взрослого организма. Имагинальные клетки, из которых возникнет голова, грудь и гениталии, организованы в Имагинальные диски, а имагинальные клетки брюшка собраны в кластеры, именуемые абдоминальными гистобластными гнездами. Подробно были исследованы в основном клетки дисков. Всего известно 19 дисков, один из которых расположен на средней линии тела, а остальные 18 лежат попарно по бокам личинки (рис. 16-67). Диски представляют собой эпителиальные мешки в виде смятых и расплющенных шариков;

в процессе метаморфоза они выпрямляются и дифференцируются. Из одной пары дисков возникают глаза и антенны, из другой - крылья и часть груди, из третьей - первая пара ног и т. д. Внешне клетки разных имагинальных дисков различить невозможно, и в процессе дифференцировки из них возникает сходный набор дифференцированных клеточных типов. Однако результаты экспериментов по трансплантации дисков показывают, что фактически они регионально детерминированы и неэквивалентны.

Если имагинальный диск пересадить в пределах личинки с одного участка на другой и позволить ей развиваться до начала метаморфоза, то трансплантированный диск независимо от нового местоположения будет дифференцироваться автономно в структуру, соответствующую его происхождению. Отсюда следует, что клетки имагинальных дисков в процессе дифференцировки руководствуются памятью о своем исходном местоположении. При использовании более сложных методов трансплантации, когда клетки имагинальных дисков до дифференцировки пролиферируют в течение более длительного времени, можно показать, что состояние клеточной памяти наследуется (за некоторыми исключениями из этого общего правила) в течение неопределенно большого числа клеточных поколений (рис. 16-68).

Гомеозисные селекторные гены являются существенным компонентом механизмов клеточной памяти. Если их элиминировать из клеток имагинального диска на любой стадии длительного периода, приводя- Рис. 16-68. Эксперименты по определению состояния детерминации клеток имагинальных дисков. Метод состоит в имплантации клеток личинкам накануне метаморфоза;

клетки дифференцируются, образуя определенные структуры взрослого организма, которые после метаморфоза располагаются в полости тела мухи-реципиента и не интегрированы с ее организмом. Клетки можно тестировать сразу же после извлечения дисков или после имплантации в брюшко взрослой мухи, которое является в этом случае естественной культуральной камерой. Гормональные условия в организме взрослых мух позволяют клеткам, которые, таким образом, не претерпели метаморфоз, размножаться без дифференцировки (до проведения теста на клеточную детерминацию). В обоих случаях клетки после имплантации в личинку, как правило, дифференцируются и образуют структуры, соответствующие назначению исходного диска.

щего к дифференцировке в процессе метаморфоза, то клетки начинают дифференцироваться в другие структуры, как если бы они принадлежали иным сегментам тела. Это явление можно продемонстрировать с помощью метода митотической рекомбинации, индуцированной рентгеновскими лучами. Этот подход можно рассматривать как аналог генетической хирургии отдельных клеток, используемой для получения на любой стадии развития клонов мутантных клеток с определенным генотипом. Именно эти вопросы будут обсуждаться в следующем разделе.

16.5.14. Гомеозисные селекторные гены играют важную роль в запоминании позиционной информации клетками имагинальных дисков [58] Нормальная соматическая клетка содержит два гомологичных набора хромосом. Один из гомологов каждой пары происходит от отца, другой от матери. В норме обмен ДНК за счет кроссинговера между гомологичными хромосомами отцовского и материнского происхождения имеет место только в мейозе при формировании половых клеток. Но иногда кроссинговер происходит в процессе деления обычных соматических клеток. Хотя в норме митотическая рекомбинация - событие довольно редкое, его можно вызвать у насекомых облучением рентгеновскими лучами (вероятно, это побочный результат воздействия излучения на хромосомы). Как указано на рис. 16-69, если материнские и отцовские хромосомы несут различные аллели гена, то клетка является гетерозиготной. Вследствие единичного акта митотической рекомбинации можно получить две гомозиготные дочерние клетки, отличающиеся генетически как от родительских клеток, так и друг от друга: одна наследует две копии отцовского, другая - две копии материнского аллеля. Далее каждая из дочерних клеток воспроизводится обычным образом, создавая пару гомозиготных клонов, которые расположены в окружении гетеро- Рис. 16-69. Нормальный митоз (А) и митоз, сопровождающийся рекомбинацией (Б). На схеме указана судьба одиночной пары гомологичных хромосом, одна из которых отцовского происхождения (выделена цветом с центромерой в виде черного кружка), а другая материнского (с центромерой в виде белого кружка). Эти хромосомы содержат ген пигментации (либо иной маркерный ген) с аллелем А дикого типа (белый квадрат на отцовской хромосоме) и рецессивным мутантным аллелем а (красный квадрат на материнской хромосоме). Гомозиготная А/А и гетерозиготная А/а клетки обладают нормальным фенотипом, а гомозиготные а/а клетки - измененным фенотипом. Рекомбинация за счет обмена ДНК между отцовской и материнской хромосомами приводит к образованию пары дочерних клеток, одна из которых является гомозиготой А/А (нормальный фенотип), а другая - гомозиготой а/а (мутантный фенотип). Митотическая рекомбинация - редкое случайное событие.

зиготных тканей (рис. 16-70). Если, например, все клетки организма исходно гетерозиготны по мутации, которая вызывает желтую пигментацию вместо нормальной коричневой, но эта мутация рецессивна (так что гетерозиготные клетки обладают коричневым фенотипом), то в результате митотической рекомбинации может возникнуть клон гомозиготных желтых клеток на коричневом фоне.

Конечно же, невозможно проконтролировать в каких именно клетках произойдет митотическая рекомбинация, равно как и невозможно преду- Рис. 16-70. Митотическую рекомбинацию можно использовать для создания в крыле дрозофилы клона генетически маркированных мутантных клеток. Чем раньше происходит рекомбинация, тем больше будет возможный клон.

гадать точно участок хромосомы, в котором произойдет кроссинговер. Однако здесь экспериментаторы могут довольно четко контролировать время таких событий (облучая клетки в строго определенное время) и, что еще важнее, исходный генотип. Во-первых, можно скрещивать гомозигот, у которых мутация интересующего гомеозисного селекторного гена связана с маркерной мутацией (например, мутацией, вызывающей аномальную пигментацию). В данном случае маркер позволит, выявлять гомозиготные клоны, полученные в результате митотической рекомбинации, по их аномальной окраске. Такие маркированные клоны можно с уверенностью считать гомозиготными по интересующей нас мутации.

Основные эффекты мутаций гомеозисных селекторных генов в своем большинстве рецессивны: только у гомозиготных мутантных организмов проявляется гомеозисная трансформация. Используя описанную митотическую рекомбинацию, можно создать клон клеток, меченных в имагинальном диске по гомеозисному гену, и наблюдать их поведение на гетерозиготном, фенотипически нормальном фоне. Именно так было показано, что меченые клетки (и только они) способны к гомеозисной трансформации (чем доказывается их расположение в пределах участка действия гомеозисного селекторного гена);

на основе этого можно сделать вывод, что в раннем развитии имело место рекомбинационное событие.

Например, можно подвергнуть действию рентгеновских лучей двухдневную личинку, гетерозиготную по мутации, которая нарушает функцию гена Ultrabithorax (Ubx) из комплекса bithorax. В результате в данных имагинальных дисках будут получены изолированные клоны гомозиготных клеток Ubx /Ubx. Если эти клоны расположены на диске жужжальца, то в жужжальце возникнут скопления ткани дикого типа. Такие наблюдения показывают, что в каждой из клеток память о позиционной информации определяется постоянной активностью нормального гомеозисного селекторного гена и что эта память в каждой из клеток проявляется автономно.

16.5.15. Гомеозисные селекторные гены и гены полярности сегментов определяют компартменты тела [59] Запоминаемые различия, контролируемые гомеозисными селекторными генами, дискретны: экспрессия генов в клетках соседних парасегментов характеризуется четкими различиями. Это же справедливо по крайней мере в отношении одного гена полярности сегментов - engrailed (см. рис. 16-64, Б), дифференциальная экспрессия которого соответствует четкому различию между клетками задней и передней части парасегмента (что соответствует клеткам передней и задней части сегмента). Таким образом, благодаря дифференциальной экспрессии этих двух классов генов, тело делится с образованием серии отдельных участков, клетки которых характеризуются различным состоянием детерминации.

На границе двух таких участков клетки не смешиваются, как если бы селективное слипание клеток, обладающих одинаковым молекулярным адресом, позволяло им отделяться от клеток, несущих другой адрес. Так, например, если в результате генетической рекомбинации в крыле появляется клон маркированных, но все же нормальных клеток, то этот клон располагается лишь по одну сторону четко определенной границы, разделяющей два парасегмента, образующих крыло. Подразделения тела (в крыле или любом ином органе), образующиеся таким образом, называют компартментами (рис. 16-71). Хотя границы компартментов, как правило, не соответствуют границам нормальных органов, они совпадают с границами доменов, в пределах которых действуют гомеозисные селекторные гены, и это можно наблюдать по экспрессии гена Рис. 16-71. А. Форма маркированных клонов в крыле дрозофилы указывает на существование границы компартментов. У такой границы край каждого пятна получается прямым. Даже если маркированный клон генетически изменен, что позволяет ему расти быстрее остального крыла и стать очень большим, он все равно не переходит границы компартментов (крайний рисунок справа). Обратите внимание, что эта граница не совпадает с центральной жилкой крыла. Б.

Характер экспрессии гена engrailed в крыле, выявляемый тем же методом, что и на рис. 16-64, Б.

Границы компартмента совпадают с границами экспрессии гена engrailed. (А -по F.H.C. Crick, P.A.Lawrence, Science, 189, 340-347, 1975;

Б - с любезного разрешения Тот Kornberg.) engrailed (см. рис. 16-71, Б). У соответствующих мутантов ткань по одну из сторон границы компартмента трансформирована;

с другой стороны располагается нормальная ткань (рис. 16-72).

Границы компартментов по определению являются границами двух популяций клеток, различающихся по состоянию своей детерминации, которые не могут смешиваться. Хотя в норме состояние детерминации необратимо, тем не менее каждый из компартментов должен быть самоподдерживающейся единицей. Он не способен использовать клетки соседнего компартмента или делиться с соседом своим собственным избытком клеток. Однако он способен регулировать свою внутреннюю организацию за счет усовершенствований, которые не нарушают этих ограничений. Каждый из компартментов обладает собственной детализованной внутренней структурой, возникающей в имагинальном диске в результате межклеточных взаимодействий на относительно поздних стадиях развития. Молекулярная основа этих местных механизмов формирования пространственной организации до сих пор не изучена, хотя, как упоминалось в разд. 16.5.9, не исключено, что в них принимает участие продукт гена полярности сегмента wingless. Можно показать, однако, что постоянные межклеточные взаимодействия определяют не только пространственную организацию, но и рост частей имагинальных дисков: данная система подчиняется правилу интеркаляции (см. разд. 16.4.9). В процессе регуляции роста и формирования пространственной организации каждый из компартментов ведет себя как более или менее независимое целостное образование. Это было показано в экспериментах, где митотическую рекомбинацию использовали для создания меченых клонов клеток с генотипом, позволяющим пролиферировать им быстрее других клонов имагинального диска. В процессе роста эти клоны занимают непропорционально большую часть компартмента, в пределах которого они расположены, но тем не менее они не способны нарушать границы компартментов;

они не могут увеличить размеры компартмента или изменить его пространственную организацию (см. рис. 16-71).

16.5.16. Саморегуляция гомеозисных селекторных геноввносит вклад в механизмы клеточной памяти [60] Совершив экскурс в будущее, т. е. рассмотрев более поздние стадии развития дрозофилы, вернемся в прошлое, чтобы с молекулярной точки зрения обсудить важные свойства гомеозисных селекторных генов. И прежде всего следует обсудить, каким образом эти механизмы обеспечивают каждую из клеток памятью о том, в каком из сегментов она находится. Один из способов достижения такого эффекта состоит в выработке механизма, действующего по принципу положительной обратной связи, где продукт гена стимулирует свою собственную транскрипцию (см. разд. 16.2.10). Существуют данные о том, что гомеозисные Рис. 16-72. Жужжальце мутанта bithorax (5);

для сравнения приведена фотография нормального крыла и нормального жужжальца (А).

Передний компартмент мутантного жужжальца превратился в передний компартмент крыла. (А - с любезного разрешения Peter Lawrence, Б - из F.

H.C. Crick, P. A. Lawrence, Science, 189, 340 347, 1975. Copyright, 1975 by the American Association for the Advancement of Science.) селекторные гены действительно обладают таким самоподдерживающим свойством. Например, клетки в культуре можно трансфицировать искусственно созданным вектором-плазмидой, которая содержит либо последовательность гомеозисного селекторного гена, кодирующую белок и соединенную с каким-либо иным сильным промотором, либо регуляторную последовательность того же гена, соединенную с последовательностью другого гена, кодирующего другой белок (например, фермент, выявление которого не вызывает трудностей). В первом случае можно обеспечить на необходимом уровне синтез белка, кодируемою гомеозисным селекторным геном, а во втором - проверить насколько эффективна регуляторная функция данного белка (это определяется по синтезу фермента-репортера в клетках, трансфицированных одновременно плазмидами обоих типов).

В таких опытах было показано, что белок Ultrabithorax может оказывать влияние по типу обратной связи на регуляторную последовательность Ultrabithorax, стимулируя экспрессию соответствующего гена (рис. 16-73). Более того, он также способен воздействовать на регуляторную последовательность Antennapedia, контролируя синтез соответствующего белка, а белок ftz, возможно, стимулирует как Ultrabithorax, так и Antennapedia. Конечно же, условия, создаваемые в клеточной культуре как в модели, не соответствуют условиям, возникающим в зародыше, тем не менее эти наблюдения показывают, что гомеозисные селекторные гены и их родичи могут не только стимулировать или ингибировать друг друга, но и стимулировать самих себя.

Вероятно, такая положительная обратная связь важна для исходной установки состояния активации гена, но для поддержания этого состояния в течение длительного времени могут использоваться другие меха- Рис. 16-73. Эксперименты, в которых были использованы клетки, трансфицированные искусственно созданными плазмидами с встроенными генами Ultrabithorax (Ubx) и fushi tarazu (ftz), показывают, что белки ftz (Б) и Ubx (А) могут влиять на регуляторную область гена Ubx, стимулируя его экспрессию. Самостимуляция Ubx (A) создает положительную обратную связь, которая обеспечивает самоподдерживающуюся экспрессию Ubx in vivo. Аналогичный эффект наблюдается для гена Antennapedia. На данном рисунке ситуация, однако, значительно упрощена. В реальном эмбрионе существует, по-видимому, множество регуляторных белков, которые объединяются и/или конкурируют, осуществляя контроль экспрессии этих генов.

низмы. Тем не менее сейчас мы начинаем понимать, каким образом продукты гомеозисных селекторных генов могут использоваться одновременно в качестве молекулярных адресов, памятных записей и инструментов для регуляции активности других генов.

16.5.17. Экспрессия гомеозисных селекторных генов регулируется по принципу дифференциального сплайсинга, а также за счет контроля транскрипции [56, 61] В широком смысле система гомеозисных селекторных генов, вероятно, обладает простой рациональной организацией и функцией. Однако в деталях существует много сложностей. Например, взаимодействия продуктов гомеозисных селекторных генов с другими генами как такового, по-видимому, недостаточно для стабилизации исходного характера экспрессии. Необходим дополнительный набор генов, и при их инактивации в результате мутации гомеозисные селекторные гены включаются независимо во всех клетках эмбриона (рис. 16-74). Постоянные отличия парасегментов друг от друга в своей основе могут быть связаны с наследуемыми изменениями регуляторных участков гомеозисных селекторных генов, которые каким-то образом подверглись импринтингу на уровне строения хроматина (см. разд. 10.3.10). Более того, несмотря на то, что комплекс bithorax определяет характер девяти парасегментов, он содержит всего 3 гена: Ultrabithorax, abdominal-A и abdominal-B. Эти гены, как и гены комплекса Antennapedia, необычайно велики. Для них характерно наличие очень сложных регуляторных последовательностей. Поэтому с каждого гена образуется набор различным образом сплайсированных транскриптов. Например, ген Ultrabithorax содержит примерно 75 000 пар нуклеотидов, и соответствующие ему транскрипты в зависимости от стадии развития и расположения данной клетки в эмбрионе сплайсируются по-разному. Мутации, локализованные в разных участках в пределах гена, могут воздействовать на разные парасегменты или на какие-либо части парасегментов. Так, например, мутации, локализованные в одном из участков гена Ultrabithorax, превращают переднюю половину жужжальца в переднюю половину крыла (см. рис. 16-72), а мутации другого участка превращают заднюю часть жужжальца в заднюю часть крыла. Эти мутации расположены в разных местах и затрагивают разные участки тела, поэтому одно время полагали, что они соответствуют разным генам;

в результате они получили разные названия - bithorax и postbithorax. К настоящему времени выяснилось, что многие мутации гомеозисных селекторных генов, которые влияют на отдельные парасегменты либо части парасегментов, не являются мутациями различных генов, а могут быть отнесены к различным участкам одного и того же большого сложного гена (см. разд. 10.3.19).

16.5.18. Многие гены, контролирующие становление пространственной организации, содержат консервативные последовательности гомеобокса, кодирующего часть ДНК-связывающего белка [62] Поразительным результатом клонирования гомеозисных селекторных генов было открытие последовательности примерно из 180 пар нуклеотидов, названной гомеобоксом;

она с небольшими вариациями содержится практически во всех генах данного типа, а также в некоторых других генах.

Рис. 16-74. Мутантный эмбрион, Например, ген группы pair-rule (ftz) содержит последовательность нуклеотидов, на 77% идентичную дефектный по гену extra sex combs гомеобоксу Antennapedia, а совпадение последовательности аминокислот, которые кодируются этими (esc), полученный от матери, у генами, еще больше и достигает 83%. У дрозофилы мини- которой также отсутствует этот ген.

Все сегменты трансформированы и напоминают последний брюшной сегмент (сравните с рис. 16-65). У этого мутанта характер экспрессии гомеозисных селекторных генов (сначала почти нормальный) становится нестабильным и вследствие этого вскоре наблюдается включение всех данных генов вдоль всей оси тела.

(G. Struhl, Nature, 293, 36-41, 1981.) мум 16 генов содержат гомеобокс, хотя пределы гомологии варьируют достаточно широко, и почти все гомеобокс - содержащие гены являются ключевыми среди примерно 50 генов, контролирующих пространственную организацию вдоль переднезадней оси тела. Сюда относятся гены полярности яйца (bicoid), pair-rule-гены (ftz, even-skipped, paired), гены полярности сегментов (gooseberry, engrailed), практически все гомеозисные селекторные гены из комплексов Antennapedia и bithorax. Существует как минимум один ген (zerknllt), участвующий в формировании пространственной организации по дорсовентральной оси, содержащий гомеобокс. Из этих наблюдений следует, что наличие гомеобокса - один из характерных признаков генов, контролирующих становление пространственной организации.

Гены, содержащие гомеобокс, как правило, кодируют белки, локализованные в клеточных ядрах, что предполагает их прямое участие в контроле экспрессии генов. Кроме того, последовательность аминокислот, образующая гомеобокс, вероятно, позволяет белкам дрозофилы, которые ее содержат, связываться со специфическими участками ДНК, функционирующими как энхансеры и сайленсеры (разд. 10.2.7) генной экспрессии, в том числе экспрессии других содержащих гомеобокс генов.

Существование специфических регуляторных последовательностей в ДНК, узнаваемых белками, которые содержат домен, соответствующий гомеобоксу, позволяет предположить, что и они являются характерной чертой генов, содержащих гомеобокс и участвующих в формировании пространственной организации. Нетрудно представить, как такие гены с крайне незначительными различиями в регуляторных последовательностях и последовательностях, кодирующих белки, могут объединиться и образовать сложную сеть, в которой продукты одного гена контролируют экспрессию другого;

подобный механизм обсуждался, когда мы рассматривали формирование пространственной организации вдоль переднезадней оси эмбриона дрозофилы. В такой системе механизмы клеточной памяти и детерминацию можно достаточно просто объяснить саморегуляцией экспрессии генов, сходной с саморегуляцией, которая была описана для генов Ultrabithorax (см. рис. 16-73).

16.5.19. В эволюции гомеобокс обладает высокой степенью консерватизма [62, 63] Удивительная гомология генов, содержащих гомеобокс, дает возможность предполагать, что они возникли за счет собственной дупликации и дивергенции. Возникновение генов путем тандемной дупликации и дивергенции следует также из кластерного расположения многих этих генов в геноме дрозофилы. Комплекс Antennapedia, например, включает гены ftz, bicoid, zerknllt, а также набор гомеозисных селекторных генов. Формирование кластеров генов, содержащих гомеобокс, может быть отражением их истории и не является физиологической необходимостью;

у мух, у которых вследствие генетических перестроек ген Ultrabithorax выщеплен из комплекса bithorax, не обнаруживается никаких аномалий в строении тела.

Представляется вероятным, что по мере усложнения строения тела к геному добавляются серии измененных генов, содержащих гомеобокс. Мутанты дрозофилы, у которых отсутствуют те или иные наборы генов, содержащих гомеобокс, характеризуются фенотипическими признаками, свойственными, возможно, структурам предкового организма. Например, удалив определенные гомеозисные селекторные гены, можно получить животное с характерным расположением множества идентичных сегментов наподобие многоножки;

если бы удалось пройти по пути эволюции еще на шаг назад, удалив гены полярности сегментов и гены pair-rule, то можно было бы получить гипотетического предка, организованного наподобие нематод без сегментации, но с сохранением различив между головой и хвостом. Исходя из такой последовательности событий, ген полярности яйца bicoid, вероятно, можно считать предковым представителем семейства генов, содержащих гомеобокс. Конечно, это пока всего лишь плод нашего воображения, но не исключено участие такого предкового гомеобокс содержащего гена в формировании пространственной организации тела, так как именно эту функцию выполняют практически все его потомки у дрозофилы.

Открытие гомеобокса ставит перед нами вопросы более широкого эволюционного значения. Гомеобокс-содержащие гены обнаружены не только у насекомых и других членистоногих, но и у нематоды С. elegans, у кольчатых червей (пиявок и дождевых червей), у морских ежей, примитивных хордовых и у позвоночных (включая лягушек, кур, мышей и человека). Гомеобоксная последовательность обладает удивительной степенью консерватизма на уровне структуры белка;

один из белков, соответствующих гомеобокс содержащему гену Xenopus, обладает последовательностью, 59 из 60 аминокислот которой идентичны гомеодомену в белке Antennapedia дрозофилы;

и это несмотря на 500 млн. лет независимой эволюции. Такая высокая степень консерватизма позволяет предполагать, что механизмы, контролирующие основной план строения тела у насекомых и позвоночных, Рис. 16-75. А. Ряд сомитов (передний конец могут иметь фундаментальное сходство.

тела находится слева, задний - справа) двухдневного куриного эмбриона, 16.5.20. Механизмы региональной клеточной детерминации у окрашенных антителами, распознающими позвоночных и насекомых могут быть сходными [63, 64] клетки нервного гребня: последние Описывая строение раннего зародыша дрозофилы (разд. 16.5.2), мы отмечали мигрируют только через переднюю половину сходство с позвоночными. Животные и того, и другого класса в своем развитии проходят каждого из сомитов, поскольку клетки, через стадию гаструляции, обеспечивающую появление различных зародышевых листков;

составляющие эту переднюю половину, тело представителей обоих классов подразделяется на сегменты, располагающиеся более или существенно отличаются от клеток задней менее перпендикулярно по отношению к закладкам зародышевых листков. Сомиты эмбриона половины (в первом случае условия для позвоночных и сегменты эмбрионов дрозофилы внешне сходны, но анализ их поведения миграции клеток благоприятны, во втором - показывает, что они обладают различными позиционными значениями, которые и нет). Б. Участок более взрослого куриного определяют их (сомитов) дальнейшую дифференцировку. Как и в случае имагинальных эмбриона, окрашенный для выявления дисков дрозофилы, такую позиционную детерминацию можно продемонстрировать в корешков спинальных нервов в тех местах, экспериментах по трансплантации. Так, например, у ранних куриных эмбрионов вновь где они проходят через сомиты. Подобно формирующиеся сомиты можно пересадить на другое место. На этой стадии грудные и клеткам нервного гребня, нервные корешки шейные сомиты внешне практически неразличимы, хотя грудные сомиты после пересадки в мигрируют только через переднюю половину область шеи дадут начало грудным позвонкам с ребрами, а сомиты шеи после пересадки в сомита. Результаты экспериментов по область груди дают начало характерным шейным позвонкам. На этом сходство не пересадке тканей показывают, что такое заканчивается. Известно, что каждый сегмент тела насекомых делится на передний и задний сегментарное строение периферической компартменты, отличающиеся друг от друга по экспрессии генов engrailed. Так же резко нервной системы определяется исходными различаются по своей химической природе передние и задние половины сомитов куриного различиями между передними и задними зародыша (рис. 16-75), что проявляется в свойствах клеточной поверхности, регистрируемых клетками сомита в отношении детерминации с помощью некоторых лектинов, а также в их влиянии на направление роста нервных (это напоминает характер экспрессии гена волокон.

engrailed у дрозофилы). (А - из М. Rickman, После открытия гомеобокса появилась возможность проверить, не являются ли такие J.W. Fawsett, R.J. Keynes, J. Embryol. Exp.

аналогии отражением распределения определенных молекул. К настоящему времени было Morphol., 90, 437-455, 1985;

Б - с любезного показано, что последовательность нуклеотидов некоторых из гомеобокс-содержащих генов разрешения Claudio Stern.) позвоночных гомологичны соответствующим генам дрозофилы и эта гомология простирается за пределы гомеобокса;

с помощью метода гибридиза- Рис. 16-76. А. Характер экспрессии двух гомеобокс-содержащих генов мыши, Нох 2.1 и Нох 3.1, выявляемый по методу гибридизации in situ в соседних продольных срезах через весь 13,5-дневный эмбрион мыши. Высокая концентрация транскриптов соответствует высокой концентрации зерен серебра на радиоавтографах. Два этих гена экспрессируются в различных, частично перекрывающихся участках вдоль переднезадней оси в головном и спинном мозге, а также в некоторых других тканях. Б. Характер экспрессии гомеобокс содержащего гена курицы (куриного а), обладающего особенно близкой гомологией с геном engrailed дрозофилы. В данном случае были использованы антитела, демонстрирующие распределение в двухдневном курином эмбрионе белка, кодируемого этим геном. В отличие от своего аналога у дрозофилы, который образует серию сегментных полос, белок en у курицы локализуется в виде отдельного скопления в среднем и заднем мозге. (А - из P. W.H. Holland, B.L. M. Hogan, Development, 102, 159-174, 1988;

Б - с любезного разрешения Tom Kornberg.) ции in situ было показано, что эти гены позвоночных экспрессируются в строго определенных участках эмбриона позвоночных (рис. 16-76). Эти данные позволяют считать, что молекулярные механизмы формирования пространственной организации у позвоночных и насекомых в своей основе очень схожи, однако оценить масштабы сходства до сих пор не представляется возможным. Например, у позвоночных пространственная организация обеспечивается в основном межклеточными взаимодействиями на стадиях дробления. Здесь нет аналога процессам, которые происходят в синцитиальном зародыше насекомых. Более того, многие специалисты по филогенезу полагают, что сегментированность тела у этих групп животных возникла в процессе эволюции независимо. К сожалению, приходится отметить, что у позвоночных не зарегистрировано ничего даже отдаленно напоминающего гомеозисные мутации, сходные с таковыми у дрозофилы. И если это так, то возникают сомнения, что исследования дрозофилы помогут внести существенный вклад в выявление общей взаимосвязи между генами и пространственной организацией тела у всех организмов.

Заключение Тело дрозофилы, как и тело других насекомых, состоит из набора повторяющихся модифицированных базовых модулей (сегментов) со специализированными несегментированными структурами на переднем и заднем концах тела. Любое крупное подразделение каждого из сегментов определяется экспрессией особого набора контролирующих генов, уточняющих молекулярные адреса этих подразделений.

Пространственная организация начинает формироваться с возникновения асимметрии яйцеклетки. Здесь можно различить две группы генов с материнским эффектом, которые также называют генами полярности яйца. Одна группа этих генов отвечает за дорсовентральное распределение зародышевых листков и основных видов тканей, а другая - за переднезаднее (от головы к хвосту) расположение сегментов. Примером гена этого последнего класса служит ген bicoid, мРНК которого концентрируется на переднем конце яйца. Поскольку зародыш на начальных этапах развития представляет собой синцитий, продукт гена bicoid способен легко диффундировать через цитозоль по всему эмбриону, создавая градиент морфогена, определяющий общую организацию передней половины эмбриона. Этот градиент запускает упорядоченную экспрессию иерархически организованной структуры генов, образованной генами групп gap и pairrule, генами полярности сегментов и гомеозисными селекторными генами. Эти последние гены под влиянием гена bicoid и взаимодействия между собой начинают экспрессироваться в отдельных участках эмбриона, что постепенно приводит к разделению тела на повторяющиеся сегменты и их части.

Экспрессия генов группы gap и pair-rule носит временный характер, но она накладывает отпечаток на экспрессию генов полярности сегментов и гомеозисных селекторных генов;

экспрессия этих последних генов сохраняется, подвергаясь некоторым уточнениям в процессе дальнейшего развития и обеспечивает клетки позиционной информацией. Механизм клеточной памяти частично обеспечивается положительной обратной связью (предполагающей, что белковые продукты гомеозисных селекторных генов стимулируют транскрипцию собственных генов) и частично наследуемыми изменениями структуры хроматина. Необходимость некоторых форм запоминания позиционных значений можно продемонстрировать в экспериментах на клетках имагинальных дисков, из которых возникают наружные структуры тела взрослого организма;

эти клетки сохраняют память о своих исходных назначениях в течение неопределенного числа клеточных делений. Такое поведение определяется постоянным присутствием гомеозисных селекторных генов в каждой отдельной клетке любого имагинального диска. Границы компартментов, которые, по всей вероятности, поддерживаются благодаря избирательному слипанию отдельных клеток, делят клетки, характеризуемые различным состоянием дифференцировки, согласно экспрессии этих генов.

В геноме гомеозисные селекторные гены сгруппированы в два класса: комплекс Antennapedia и комплекс bithorax. Все они содержат гомеобоксную последовательность, которая кодирует высококонсервативную последовательность примерно из 60 аминокислот. Эта нуклеотидная последовательность присутствует и в некоторых генах полярности яйца, генах группы pair-rule, генах полярности сегментов, что свидетельству об общности эволюционного происхождения этих генов из гена-npeдшесвенника, который принимал участие в регуляции формирования пространственной организации. Гены, содержащие гомеобокс, обнаружены у различных животных, в том числе у круглых червей и млекопитающих. позволяет предположить, что становление пространственной организации у этих животных основано на молекулярных механизмах, сход с молекулярными механизмами, действующими у дрозофилы.

16.6. Органогенез: координированная сборка сложных тканей Формирование пространственной организации до сих пор рассматривалось нами с точки зрения изменения свойств клеток и при этом гор меньше внимания уделялось их положению;

мы следили за нарастанием этих изменений в отдельной ткани, в частности, у дрозофилы мы рассматривали эпидермис, а в конечностях позвоночных - соединитель- ную ткань скелета. Однако на самом деле вследствие сложных движений в эмбриогенезе все органы представляют собой сложное сочетание различных тканей, образованных клетками, которые происходят из разных источников и руководствуются различными правилами. Клеточные движения позволяют собрать все эти компоненты воедино. В этом последнем разделе мы рассмотрим, каким образом позиционная информация управляет клеточными движениями и координирует построение сложных органов, каковыми являются конечности.

16.6.1. Избирательное слипание стабилизирует клеточные структуры, образованные по-разному детерминированными клетками [65, 66] В процессе развития животного клетки движутся, пролиферируют и приходят в контакт друг с другом, вследствие чего потомки этих клеток перемешиваются. У химерных зародышей мыши, например, перемешаны клетки двух исходных морул, вследствие чего во взрослом организме хаотически перемешаны клетки двух генотипов (см. разд. 16.2.5). Но если нарушение расположения клеток происходит после их детерминации, то могут наблюдаться нарушения в пространственном распределении клеток, характеризующихся различными состояниями. Приобретение клетками свойств, определяемых их положением, предупреждает возможность случайного перемешивания клеток.

Феномен компартментов у дрозофилы (см. рис. 16.5.15) демонстрирует один из способов достижения этого. Вероятно, детерминированные клетки остаются в соответствующих компартментах за счет селективного слипания с клетками, обладающими таким же состоянием детерминации. Клетки, экспрессирующие одинаковые молекулярные адреса, по всей вероятности, слипаются между собой сильнее, чем клетки с иными молекулярными адресами. Очевидно, позиционная информация, записанная в результате активации таких генов, как engrailed и Ultrabithorax, проявляется посредством определенного выбора молекул адгезии клеточной поверхности.

У ранних эмбрионов амфибий стабилизирующие эффекты межклеточной адгезии в отношении организации структуры, обеспечивающей взаимное расположение различных клеточных типов, вероятно, настолько сильны, что способны восстанавливать нормальное расположение даже после искусственной диссоциации клеток, приводящей к образованию бесформенной неупорядоченной массы клеток. Клетки мезодермы, нейральной пластинки и клетки эпидермиса способны, сортируясь из такой смеси, формировать структуры с эпидермисом снаружи, мезодермой под эпидермисом и структурой, напоминающей нервную трубку, внутри (рис. 16-77). Исследования, проведенные на курином и мышином эмбрионах, дают основания полагать, что такое поведение определяется, по крайней + мере частично, семейством Са2 - зависимых гликопротеинов (кадгеринов), обеспечивающих клеточную адгезию (см. разд. 14.3.7). Эти и другие Са2 +-зависимые молекулы клеточной адгезии, такие, как N-CAM (см. разд. 14.3.6), дифференциально экспрессируются в различных тканях раннего эмбриона и антитела против этих молекул нарушают нормальную селективную адгезию клеток одного типа.

16.6.2. Пространственные структуры, образуемые молекулами клеточной адгезии, регулируют характер морфогенетических движений [66, 67] Изменение характера экспрессии различных кадгеринов тесно коррелирует с изменением ассоциации клеток в процессе гаструляции, нейруля- Рис. 16-77. Клетки различных участков раннего эмбриона амфибий сортируются в соответствии со своим происхождением. В классическом эксперименте, который схематически представлен на этом рисунке, клетки мезодермы, нервной пластинки и эпидермиса были дезагрегированы.

После пересортировки клетки формируют структуру, похожую на нормальный эмбрион с «нервной трубкой» внутри, эпидермисом снаружи и мезодермой между ними. (P. L. Townes, J. Holtfreter, J. Exp. Zool., 128, 53-120, 1955;

с небольшими изменениями.) ции и формирования сомитов (рис. 16-78);

такие изменения в раннем эмбриогенезе могут регулироваться и по крайней мере частично зависеть от распределения кадгеринов. В частности, кадгерины, вероятно, играют важную роль в контроле образования и рассасывания эпителиальных слоев и клеточных кластеров.

Следовательно, движения, участвующие в построении раннего зародыша, определяются характером химических различий между клетками, расположенными в разных местах.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 12 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.