WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 13 |

«1 Молекулярная биология клетки 2 Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray, Biology Julian Lewis, Martin Raff, of the Cell Keith Roberts, James D. Watson SECOND EDITION Garland Publishing, Inc. ...»

-- [ Страница 9 ] --

оказалось, что присоединение рецептора защищает от мягкого расщепления нуклеазами или химическими реагентами группу специфических нуклеотидных последовательностей ДНК. Если эти короткие узнаваемые последовательности из гена удалить, то стероидный гормон уже не будет активировать его транскрипцию. Более того, если короткий фрагмент ДНК, который содержит узнаваемую последовательность, слить с другим геном (репортером) и затем перенести в клетку, содержащую рецепторный белок, то соответствующий стероидный гормон будет активировать транскрипцию гена-репортера. Эти эксперименты показывают, что последовательности ДНК, узнаваемые in vitro активированными рецепторами стероидных гормонов, действительно опосредуют действие рецептора в клетке. Гены, чувствительные к стероидным гормонам, как правило, содержат несколько групп узнаваемых последовательностей, обычно расположенных «выше» (а иногда и «ниже») кодирующей области где-нибудь внутри гена (рис. 12-10). Ввиду значительной структурной гомологии между разнообразными рецепторами для стероидных гормонов близкое сходство распознаваемых ими последовательностей не вызывает удивления.

Однако под прямым влиянием стероидных гормонов находятся лишь немногие гены в любой клетке-мишени. Так, через 30 мин после добавления кортизола к культуре печеночных клеток крысы из тысячи белков, которые можно разделить методом двумерного гель-электрофо- Рис. 12-10. Локализация последовательностей ДНК в том гене вируса молочной железы, который узнают активированные рецепторы кортизола. Каждая цветная полоска соответствует одному месту связывания рецептора (длиной 8 нуклеотидов). [По К.. R. Yamamoto. In: Transfer and Expression of Eukaryotic Genes (H. Ginsbcig, H. J. Vogel, eds.), pp. 79-92. New York: Academic Press, 1984.] реза, затронутыми оказались всего семь: количества шести из них увеличились, а количество одного уменьшилось. Эффект был обратимым: после удаления гормона скорости синтеза этих белков возвратились к норме. Как полагают, упомянутым методом можно выявить около 10% клеточных белков;

таким образом, присоединение кортизола к 10000 молекул его рецептора в печеночной клетке, вероятно, влияет на транскрипцию лишь около полусотни генов-гораздо меньше, чем следовало ожидать, исходя из числа мест связывания на ДНК. Это означает, что многие активированные рецепторы связываются с ДНК в местах, где их присутствие не дает никакого эффекта.

Как связывание гормон-рецепторного комплекса с геном активирует его транскрипцию? Было показано, что узнаваемые гормоном участки ДНК могут стимулировать транскрипцию даже тогда, когда они удалены на тысячи оснований от промотора, где начинается синтез РНК.

Механизм действия таких участков ДНК, называемых транскрипционными энхансерами, обсуждается в гл. 10 (разд. 10.2.11).

12- 12.2.2. Стероидные гормоны часто вызывают и первичный, и вторичный ответ [7] Во многих случаях реакция на стероидный гормон бывает двухстадийной. Прямая индукция транскрипции нескольких специфических генов называется первичным ответом. Затем продукты этих генов могут в свою очередь активировать другие гены и вызвать через некоторое время вторичный ответ. Таким образом, простой гормональный пусковой сигнал способен производить весьма сложные изменения в картине экспрессии генов.

Поразительный пример мы находим у плодовой мушки дрозофилы. Уже спустя 5-10 мин после инъекции стероидного гормона линьки экдизона –в гигантских политенных хромосомах слюнных желез появляются шесть новых участков интенсивного синтеза РНК (они имеют вид пуфов;

см. разд. 9.2.6). Через определенное время некоторые из белков, синтезированных во время первичного ответа, индуцируют синтез РНК еще примерно в сотне новых участков, что приводит к появлению Рис. 12-11. Схема раннего первичного (А) и задержанного вторичного (Б) ответа клеток дрозофилы на экдизон. Некоторые из белков, синтезируемых при первичном ответе, включают гены, ответственные за вторичный ответ, а другие выключают гены, участвовавшие в первичном ответе. На самом деле в обоих ответах участвует больше генов, чем показано на схеме.

большой группы белков, характерных для вторичного ответа. Один или несколько первичных белков управляют всем ответом, выключая по принципу обратной связи транскрипцию всех генов, участвовавших в первичном ответе (рис. 12-11). Вполне вероятно, что аналогичные механизмы осуществляют усиление и регуляцию многих реакций на гормоны и в клетках млекопитающих.

12.2.3. В разных клетках-мишенях стероидные гормоны регулируют активность разных генов [8] Реакция на стероидные гормоны, как и на гормоны вообще, определяется не только природой гормона, но в не меньшей степени и природой клетки-мишени (см. рис. 12-5). В принципе этому может быть два объяснения: либо разные типы клеток имеют разные рецепторы для одного и того же гормона, либо рецепторы одинаковы, но они активируют разные гены. Имеющиеся данные говорят в пользу второго объяснения.

Такие данные были получены в молекулярногенетических экспериментах, показавших, что рецепторные белки для эстрадиола, кортизола и прогестерона кодируются каждый своим собственным единичным геном, и при изучении мутантов млекопитающих с дефектным рецептором мужского полового гормона тестостерона. Все млекопитающие, не подвергшиеся в эмбриональном периоде воздействию тестостерона, развиваются по женскому пути. Мутантные генетические самцы имеют нормальные семенники, вырабатывающие тестостерон, но ткани этих самцов не реагируют на гормон из-за дефектности соответствующих рецепторов. Поэтому у таких самцов развиваются все вторичные половые признаки самок, и семенники их не опускаются в мошонку, а остаются в брюшной полости. Этот синдром тестикулярной феминизации встречается у мышей, крыс, крупного рогатого скота, а также у человека. Хотя изменен только ген, кодирующий рецептор тестостерона, затронутыми оказываются все разнообразные типы клеток, в норме реагирующих на этот гормон (рис. 12-12).

Почему в клетках разного типа один и тот же стероидный гормон активирует разные группы генов? Как описано в гл. 10, для активации эукариотического гена нужно, чтобы с ним, как правило, связалось несколько регуляторних белков (разд. 10.1.5). Поэтому рецептор сте- Рис. 12-12. Различные клетки-мишени по-разному реагируют на тестостерон, хотя содержат одинаковые рецепторные белки. При синдроме тестикулярною феминизации мутация в одном-единственном гене, изменяющая рецептор тестостерона, приводит к тому, что все клетки мишени теряют способность реагировать на этот гормон.

роидного гормона может активировать ген только в присутствии необходимой комбинации регуляторных белков, причем некоторые из этих белков тканеспецифичны.

Таким образом, каждый стероидный гормон вызывает характерный комплекс ответов, так как 1) рецепторы для данного гормона имеются только в клетках определенных типов и 2) клетки каждого из этих типов содержат различные комбинации других тканеспецифичных регуляторных белков, которые совместно с активированным стероидным рецептором влияют на транскрипцию специфических групп генов.

Заключение Стероидные гормоны - это небольшие гидрофобные молекулы, производные холестерола. В крови они находятся в форме водорастворимого комплекса со специальным белком-переносчиком. Освободившись от переносчика, они диффундируют через плазматическую мембрану клетки-мишени и обратимо связываются в цитоплазме или в ядре со специфическими белками-рецепторами. Присоединив к себе гормон, рецептор приобретает повышенное сродство к определенным последовательностям ДНК, которые начинают действовать как энхансеры, т. е.

стимулируют транскрипцию нескольких соседних генов. Продукты некоторых из этих генов могут в свою очередь активировать другие гены и вызывать более поздний вторичный ответ, усиливая таким образом действие гормона. Каждый стероидный гормон узнается своим особым рецептором-представителем группы гомологичных белков. Один и тот же рецептор в разных клетках-мишенях регулирует разные наборы генов, вероятно потому, что для транскрипции специфических генов нужны также и другие связывающиеся с ДНК белки, которые в разных клетках различны.

12.3. Механизмы передачи сигнала с участием рецепторних белков клеточной поверхности [9] Все водорастворимые сигнальные молекулы (в том числе нейромедиаторы, пептидные гормоны и факторы роста), как, впрочем, и некоторые жирорастворимые, присоединяются к специфическим белковым рецепторам на поверхности клеток-мишеней. Поверхностные рецепторы связывают сигнальную молекулу (лиганд) с высоким сродством, и это внеклеточное событие порождает внутриклеточный сигнал, изменяющий поведение клетки.

Используя лиганды, меченные радиоактивными атомами, флуоресцентными красителями или электроноплотными частицами (типа коллоидного золота), можно изучать распределение рецепторов на поверхности клетки. Было показано, что число рецепторов для конкретного лиганда может варьировать в пределах от 500 до более чем 100000 на клетку и что они либо располагаются на мембране случайным образом, либо сосредоточены в определенных ее участках. Подобно другим мембранным белкам, рецепторы клеточной поверхности с трудом поддаются выделению в чистом виде и изучению, особенно в связи с тем, что они составляют менее 0,1% общей массы белка плазматической мембраны.

Методы клонирования последовательностей ДНК, кодирующих поверхностные рецепторы, и здесь позволили преодолеть многие трудности и в корне изменили наши представления о структуре и функциях рецепторов.

В отличие от внутриклеточных рецепторов для стероидных и тиреоидных гормонов, рецепторы клеточной поверхности не регулируют непосредственно экспрессию генов. Они лишь передают сигнал через плазматическую мембрану, а влияние, которое они оказывают на процессы в цитозоле или в ядре, связано с образованием новых внутриклеточных сигналов. Можно было бы подумать, что рецепторы клеточной поверхности просто переносят внешние сигнальные молекулы через мембрану в цитозоль, превращая их во внутриклеточный сигнал, однако это не так. Правда, многие белковые сигнальные молекулы, например инсулин, действительно поглощаются клеткой путем эндоцитоза при участии рецептора (разд.

12.5.1), но они не выходят из эндосомных или лизосомных пузырьков в цитозоль. По-видимому, задача внешнего лиганда сводится к тому, чтобы вызвать конформационное изменение белка-рецептора, находящегося на поверхности клетки. В самом деле, действие нормального лиганда нередко могут имитировать связывающиеся с рецептором антитела;

этот феномен лежит в основе ряда патологических состояний. Например, весьма обычной причиной гипертиреоза - избыточной функции щитовидной железы - у человека бывает аномальная выработка антител, присоединяющихся к рецепторам тиреотропного гормона;

рецепторы при этом активируются и вызывают гиперфункцию железы.

В этом разделе мы рассмотрим, как конформационное изменение белкового рецептора на клеточной поверхности, вызванное присоединением внеклеточного лиганда, позволяет рецептору прямо или косвенно превращать внешний сигнал в сигнал, действующий внутри клетки.

12.3.1. Известны по меньшей мере три класса белковых рецепторов клеточной поверхности: образующие канал, сопряженные с G-белками и каталитические [9] Большинство белковых рецепторов клеточной поверхности можно отнести к одному из трех классов в зависимости от механизма, используемого для передачи сигнала. Каналообразующие рецепторы - это регулируемые медиаторами ионные каналы, участвующие главным образом в быстрой синаптической передаче сигналов между электрически возбудимыми клетками. Для управления такого рода каналами используется небольшое число нейромедиаторов, которые на короткое время открывают или закрывают образуемый рецепторами канал, изменяя таким образом ионную проницаемость плазматической мембраны, а тем самым и возбудимость постсинаптической клетки. Изучение последовательностей ДНК, кодирующих эти рецепторы, показало, что они относятся к одному семейству гомологичных белков, насквозь пронизывающих мембрану. Эти рецепторы обсуждаются в гл. 19 (разд. 19.3) и здесь рассматриваться не будут.

Каталитические рецепторы при активации лигандом начинают работать как ферменты. Большинство известных каталитических рецепторов - трансмембранные белки с цитоплазматическим доменом, обладающим тирозин-специфической протеинкиназной активностью.

Рецепторы, сопряженные с G-белками, опосредованно активируют или ингибируют определенные ферменты или ионные каналы, связанные с плазматической мембраной. Взаимодействие между рецептором и ферментом или ионным каналом происходит через третий белок, который называют GTP-связывающим регуляторным белком (или G-белком). Рецепторы, связанные с G-белком, обычно запускают целую цепь событий, изменяющих концентрацию одного или нескольких малых внутриклеточных сигнальных молекул, часто называемых внутриклеточными посредниками или внутриклеточными медиаторами. Эти молекулы в свою очередь действуют, изменяя поведение других белков-мишеней в клетке. Два наиболее важных посредника-это циклический AMP (cAMP) и Рис. 12-13. Два главных механизма, с помощью которых рецепторы клеточной поверхности, сопряженные с G-белками, запускают образование внутриклеточных посредников. В обоих вариантах связывание внеклеточного лнганда изменяет конформацию цитоплазматического домена рецептора так, что он связывается с G-белком, который затем активирует (или ингибирует) определенный фермент плазматической мембраны. В некоторых случаях G-белок взаимодействует не с ферментом, а с ионным каналом. В сАМР-пути активируемый Gs-белком фермент синтезирует циклический AMP. В Са2 + -пути с помощью фермента образуется растворимый посредник, который освобождает из внутриклеточных хранилищ ионы Са 2+. И сАМР, и Са2+ связываются в клетке с другими специфическими белками, изменяя их активность.

Са2 +. Передаваемые ими сигналы генерируются разными путями (те и другие с участием G-белков) и используются во всех животных клетках (см.

рис. 12-13). Мы рассмотрим эти пути, прежде чем вернемся к каталитическим рецепторам с тирозин-специфической протеинкиназной активностью;

начнем с экспериментов, которые привели к открытию сАМР и проложили путь к нынешнему пониманию того, каким образом внутриклеточные посредники появляются в ответ на внеклеточный сигнал.

12.3.2. Циклический AMP-вездесущий посредник в животных клетках [10] В клетках мышц или печени воздействие адреналина стимулирует расщепление запасов гликогена. Оказалось, что адреналин активирует Рис. 12-14. Структурная формула и объемная модель циклического AMP (С, Н, N, О и Р-атомы углерода, водорода, азота, кислорода и фосфора соответственно).

фермент гликогенфосфорилазу, катализирующий это расщепление. Далее удалось выяснить, что обработка изолированных мембран печеночных клеток адреналином (в присутствии АТР) вызывает образование низкомолекулярного термостабильного фактора, способного заменять гормон и активировать фосфорилазу в экстракте тех же клеток, не содержащем мембран. В 1959 г. этот медиатор был идентифицирован как циклический AMP (cAMP, рис. 12-14), который, как было позже установлено, регулирует многие внутриклеточные реакции во всех до сих пор изученных прокариотических и животных клетках.

Идентификация циклического AMP привела к изучению ферментов, участвующих в его синтезе и разрушении. Чтобы сАМР мог служить внутриклеточным посредником, его концентрация в клетке (обычно 10-6 М) должна быть подвержена быстрым изменениям в ту и другую сторону под действием определенных внеклеточных сигналов (при гормональной стимуляции она может за несколько секунд увеличиться в 5 раз). Как мы увидим (разд. 12.4.7), для этого быстрый синтез молекул должен уравновешиваться быстрым их расщеплением или удалением. Циклический AMP синтезируется из АТР ферментом аденилатциклазой, связанным с плазматической мембраной клетки, но быстро расщепляется одним или несколькими ферментами - сАМР-фосфодиэстеразами, которые гидролизуют его до аденозин-5'-монофосфата (5'-АМР) (рис. 12-15).

12- 12.3.3. Рецептор и аденилатциклаза - это отдельные белки, которые функционально взаимодействуют в плазматической мембране Многие гормоны и локальные химические медиаторы действуют, изменяя концентрацию сАМР, причем они делают это, активируя (или в некоторых случаях ингибируя) аденилагциклазу, а не влияя на активность фосфодиэстеразы. Подобно тому как один и тот же стероидный гормон неодинаково действует на различные клетки-мишени, разные клетки весьма по-разному реагируют на изменение внутриклеточной концентрации сАМР (табл. 12-2). Любой лиганд, активирующий адени-латциклазу в данной клетке, обычно вызывает одну и ту же реакцию. Например, в жировых клетках аденилатциклазу активируют по крайней мере четыре разных гормона, и все они вызывают расщепление тригли- Таблица 12-2. Некоторые клеточные ответы на гормоны, опосредуемые циклическим AMP Ткань-мишень Гормон Главный ответ Щитовидная железа Тиреотропный гормон (ТТГ) Синтез и секреция тироксина Кора надпочечников Адренокортикотропный гормон (АКТГ) Секреция кортизола Яичники Лютеинизирующий гормон Секреция прогестерона Мышцы, печень Адреналин Распад гликогена Костная ткань Паратгормон Резорбция кости Сердце Адреналин Увеличение частоты и силы сокращений Почки Вазопрессин Реабсорбция воды Жировая ткань Адреналин, АКТГ, глюкагон, ТТГ Расщепление триацил-глицеролов Рис. 12-15. Синтез и расщепление сАМР. Пирофосфатаза делает синтез сАМР необратимой реакцией, гидролизуя освобождаемый пирофосфат.

церидов (резервная форма жира) до жирных кислот (табл. 12-2). Похоже, что различные рецепторы для этих гормонов активируют общий пул молекул аденилатциклазы. То, что рецепторы и аденилатциклаза - отдельные молекулы, было показано в экспериментах с «трансплантацией» рецепторов. Например, рецепторы адреналина, выделенные из солюби-лизированных детергентами плазматических мембран, не обладают никакой аденилатциклазной активностью, но если поместить их в плазматическую мембрану других клеток, не имеющих собственных рецепторов для адреналина, то такие «пересаженные» рецепторы после активации их гормоном способны к функциональному взаимодействию с аденилатциклазой клетки-реципиента (рис. 12-16).

12.3.4. Рецепторы активируют аденилатциклазу через стимулирующий G-белок (Gs) [12] У бактерий рецепторы и молекулы аденилатциклазы сопряжены напрямую, но в животных клетках это сопряжение осуществляется еще одним белком. На мысль о таком опосредованном механизме впервые навел тот факт, что для гормональной активации аденилатциклазы в разрушенных клетках необходим GTP. Позднее были выделены мутантные клеточные линии, у которых связывание адреналина аденилатциклазу не активирует, несмотря на наличие нормальных количеств рецепторов и самой циклазы. Смешивая препараты плазматических мембран таких «разобщенных» клеток с экстрактами мембран других клеток, полученными с помощью детергентов, можно было реконструировать чувствительную к гормону аденилатциклазную систему, для работы которой необходим GTP. Оказалось, что упомянутые экстракты содержат особый мембранный GTP-связывающий белок (G-белок), которого нет в «разобщенных» мутантных клетках. Поскольку этот белок участвует в активации фермента, он получил название стимулирующего G-белка (Gs). Индивидуумы с наследственным дефицитом Gs слабо реагируют на многие гормоны и поэтому страдают нарушениями роста в полового созревания, умственной отсталостью и целым рядом метаболических аномалий. Не так давно удалось реконструировать активируемую адреналином аденилатциклазную систему из очищенных компонентов (рецептора адреналина, белка Gs и каталитического компонента аденилатциклазы), встроив их в липосомы из синтетических фосфолипидов (разд. 6.2.2). Эти эксперименты показали, что для активации аденилатциклазы гормоном достаточно этих трех белков.

Чтобы Gs -белок мог передать сигнал от рецептора аденилатциклазе, он должен каким-то образом изменять свою структуру при получении сигнала. Для этого используется GTP. Когда Gs активируется комплексом гормон-рецептор, он одновременно связывает молекулу GTP, после чего и приобретает способность активировать молекулу аденилатциклазы. Gs поддерживает аденилатциклазу в активном состоянии до тех пор, пока цела молекула GTP. Когда Gs, который является GTP-азой, гидролизует GTP до GDP, активация циклазы прекращается.

12- 12.3.5 Gs -белок - гетеротример, диссоциирующий при активации на субъединицы [13] Функция Gs -белка решающим образом зависит от его субъединичной структуры. В его состав входят три полипептида:

-цепь (Gs), которая связывает и гидролизует GTP и активирует аденилатциклазу, и прочный комплекс -цепи и -цепи (G), который заякоривает Gs на внутренней Рис. 12-16. Функционально активные адреналиновые рецепторы можно экстрагировать из клеток, в которых аденилатциклаза инактивирована нагреванием, и встроить в плазматическую мембрану клеток, не имеющих таких рецепторов. При активации адреналином «пересаженные» рецепторы активируют аденилатциклазу в плазматической мембране клеток-реципиентов (сопрягающий рецепторы и циклазу G белок на схеме не показан). Существует по меньшей мере три типа адреналиновых рецепторов (называемых также адренэргическими) -, и ;

аденилатциклазу активируют только -рецепторы.

Рис. 12-17. Современная модель, иллюстрирующая, каким образом белковые рецепторы могут функционально сопрягаться с аденилат циклазой через стимулирующий G-белок-GS,. Пока сигнальный лиганд остается связанным, рецепторный белок может активировать все новые молекулы GS-белка, усиливая таким образом ответ. Дополнительный механизм усиления (который в некоторых сигнальных системах имеет большее значение) заключается в удержании связанного GTP на -субъединице GS,-белка на протяжении многих секунд, так что все это время аденилатциклаза остается активированной. Согласно другой модели, аденилатциклаза остается связанной с GS и в активированном, и в неактивном состоянии.

стороне цитоплазматической мембраны. На рис. 12-17 показана современная модель сопряжения активации рецептора с активацией аденилат циклазы при помощи Gs. В своей неактивной форме Gs существует как тример, с -субъединицей которого связан GDP. При активации гормон рецепторным комплексом участок связывания гуаниловых нуклеотидов на Gs изменяется, и теперь вместо GDP здесь может присоединиться GTP.

Как полагают, в результате присоединения GTP Gsa отделяется от G и прочно связывается с молекулой аденилатциклазы, которая при этом активируется и начинает синтезировать сАМР. Менее чем за минуту Gsa гидролизует связанный с нею GTP до GDP, что приводит к отделению Gsa от аденилатциклазы (которая становится неактивной) и обратному присоединению Gsa к G с восстановлением неактивной молекулы Gs.

В аденилатциклазной системе бактерий нет промежуточного звена в виде GS. Почему же тогда у животных клеток выработался столь сложный многоступенчатый механизм передачи сигнала с участием G-белка, «вставленного» между рецептором и активируемым ферментом?

Одной из причин может быть необходимость усиления сигнала (см. разд. 12.4.6), а другой-нужда в дополнительных уровнях для контроля.

GS позволяет создать два вида усиления. В простейшем случае единичный активированный белковый рецептор может в принципе успеть столкнуться с многими молекулами СS-белка (и тем самым активировать их), а они затем вызовут активацию многих молекул аденилатциклазы. В ряде случаев, однако, внеклеточный лиганд может не связываться со своим рецептором на достаточно длительное время, чтобы мог сработать этот механизм усиления: некоторые лиганды, например, отделяются от своих рецепторов быстрее чем за секунду. Между тем сам Gs, как полагают, остается активным более 10-15 с, прежде чем произойдет гидролиз связанного с ним GTP. Таким образом, он будет удерживать аденилатциклазу в активном состоянии довольно долго даже после отделения внеклеточного лиганда. Подобный эффект можно продемонстрировать в преувеличенном виде, если к разрушенным клеткам добавить негидролизуемый аналог GTP: последующая обработка гормоном приводит к весьма продолжительному синтезу сАМР.

G-белки не только усиливают сигнал, но и служат важным звеном, где может регулироваться весь процесс активации. В принципе эффективность взаимодействия между рецепторами и ферментом может быть изменена ковалентной модификацией G-белка или изменением его концентрации в плазматической мембране. Наиболее впечатляющая иллюстрация этого - действие бактериального токсина, ответственного за симптомы холеры. Холерный токсин представляет собой фермент, катализирующий перенос ADP-рибозы с внутриклеточного NAD на а субъедини-цу GS-белка. Последняя при этом теряет способность гидролизовать связанный с нею GTP. Аденилатциклаза, активированная такой видоизмененной -субъединицей GS-белка, может оставаться в активном состоянии неопределенно долго. В результате длительное повышение уровня сАМР в клетках кишечного эпителия вызывает массированный выход воды и натрия из этих клеток в просвет кишечника, что и приводит к тяжелому поносу - характерному симптому холеры.

GS- только один из представителей большого семейства G-белков, обеспечивающих сопряжение рецепторов с разнообразными ферментами и ионными каналами в мембранах эукариотических клеток. Как мы сейчас увидим, другой представитель этого семейства не активирует, а, наоборот, ингибирует аденилатциклазу.

12.3.6 Рецепторы подавляют активность аценилатциклазы через ингибирующий G-белок (Gi) [13] Одна и та же сигнальная молекула может как повышать, так и понижать внутриклеточную концентрацию сАМР в зависимости от типа рецептора, с которым она связывается. Например, есть несколько типов рецепторов для адреналина:

-адренэргические рецепторы активируют адени-латциклазу, а 2-адренэргические ингибируют ее. Различный конечный эффект определяется G-белками, осуществляющими сопряжение этих рецепторов с аденилатциклазой:

-рецепторы действуют через Gs, а 2-рецепторы - через ингибиторный G-белок (Gi), который содержит тот же комплекс, что и Gs, но другую -субъединицу (Gia). Будучи активирован, а2-адренэргический рецептор взаимодействует с G приводя к замене GDP на GTP в участке связывания гуаниловых нуклеотидов на -субъединице. При этом, как полагают, Gia отделяется от G и обе эти субъединицы участвуют в ингибировании аденилатциклазы: Gia прямо подавляет активность аденилатциклазы, тогда как действие G обусловлено связыванием свободной Gsа-субъединицы и, как следствие, устранением ее активирующего влияния на аденилатциклазу.

Подобно тому как холерный токсин повышает уровень сАМР, ADP-рибозилируя субъединицу Gsa и инактивируя ее GTP-азную активность, коклюшный токсин-продукт бактерий, вызывающих коклюш, - дает тот же эффект, ADP-рибозилируя Gia. В этом случае, однако, модификация G-белка препятствует его взаимодействию с рецепторами;

поэтому при активации рецептора аденилатциклаза не ингибируется.

Хотя G-белки были открыты благодаря их влиянию на аденилатциклазу, они могут действовать и другими путями (см. табл. 12-3). В частности, активируя фосфолипазу С (разд. 12.3.9), некоторые G-белки могут Таблица 12-3. Некоторые GTP-связывающие регуляторные белки, участвующие в передаче сигнала в клетке Тип G-белка -Субъединица1 Функция Модифицирующий бактериальный токсин GS s Активация аденилатциклазы Холерный Gi i Инактивация аденилатциклазы Коклюшный Gp ? Активация фосфоинозитид-специфической фосфо- Коклюшный (только в некоторых клетках) липазы С GO Главный G-белок головного мозга;

может Коклюшный регулировать ионные каналы Трансдуцин T Активация cGMP-фосфо-диэстеразы в палочках Коклюшный и холерный сетчатки позвоночных (см. разд. 12.3.12) ras-Белки -2 Участвуют в стимуляции клеточного деления факторами роста (см. разд. 12.3.11 и 13.4.5) За исключением ras-белков (и Gp, структура которого не ясна), G-белки - гетеротримеры, в которых -субъединица непрочно связана с димером. Все известные -субъединицы (мол. масса 40000-50000) гомологичны, и у большинства из них одинаковые (или очень сходные) субъединицы (мол. масса 35 000) и -субъединицы (мол. масса 8000).

ras-Белки- одиночные полипептиды (мол. масса 21 000), гомология которых с субъединицами других G-белков незначительна;

участвуют ли они в сопряжении рецепторов с эффекторными белками таким же образом, как другие G-белки, не известно.

связывать активацию рецептора с изменением концентрации Са2+ в цитозоле, а Са2+ используется как внутриклеточный посредник еще более широко, чем сАМР.

12.3.7 Ионы Са2+ запасаются в специальном внутриклеточном компартменте [14] Концентрация свободных ионов Са2+ в цитозоле клеток очень низка (порядка 10 -7 М), тогда как концентрация их во внеклеточной жидкости (более 10 -3 М) и в специальном внутриклеточном запасающем Са2+ компартменте довольно высока. Столь значительный градиент ионов Са2+ стремится «проталкивать» их в цитозоль через плазматическую мембрану и мембрану запасающих внутриклеточных органелл. Когда какой-то сигнал на короткое время открывает в этих мембранах Са2+ -каналы, ионы Са2+ буквально врываются в цитозоль, резко повышая свою локальную концентрацию и активируя чувствительные к ним механизмы в клетке.

Рис. 12-18. Важнейшие механизмы, позволяющие клетке поддерживать очень низкую концентрацию свободных ионов Са2+ в цитозоле, несмотря на их высокую концентрацию во внеклеточной жидкости. Саг+ активно откачивается из цитозоля во внеклеточное пространство (А) и в окруженные мембраной внутриклеточные органеллы, запасающие Са2 + (Б). Кроме того, свободные ионы кальция прочно связываются различными внутриклеточными молекулами. Митохондрии тоже способны откачивать Са + из цитозоля, но делают это эффективно только при очень высокой концентрации Са2 +, создающейся обычно при повреждении клетки.

Рис. 12-19. Внутриклеточные депо для ионов Са2+, выявляемые с помощью антител к Ca2 + -связывающему белку кальсеквестрину. А.

Иммунофлуоресцентная микрофотография нервной клетки крысы в культуре;

видно, что места связывания кальция встречаются во всей цитоплазме. Б. Электронная микрофотография замороженного тонкого среза крысиной печени. Судя по распределению антител, меченных коллоидным золотом (указаны стрелкой), ионы Са2+ запасаются не в гранулярном эндоплазматическом ретикулуме, хотя они могут быть в каких-то элементах гладкого ретикулума. Количественный анализ таких электронных микрофотографий позволил оценить объем запасающих органелл - он составляет менее 1% объема клетки. (А - P. Volpe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1091-1095, 1988;

Б- любезно предоставлено J. Meldolesi.) Для работы этого сигнального механизма в цитозоле должна поддерживаться низкая концентрация Са2 +, и это достигается несколькими + способами (рис. 12-18). Все эукариотические клетки имеют в своей плазматической мембране Са2 -зависимую АТРазу, которая использует энергию расщепления АТР для откачивания ионов Са2+ из цитозоля. У мышечных и нервных клеток, особенно широко использующих + сигнализацию с помощью Са2, в плазматических мембранах есть дополнительный кальциевый насос, который связывает выход Са2+ с поступлением в клетку Na+. Этот Na+ -Са2 + -обменник обладает относительно низким сродством к Са2+ и поэтому начинает действовать эффективно только при 10-кратном превышении нормального уровня Са2 +, что случается при многократной стимуляции мышечной или нервной клетки.

Кальциевый насос в мембранах специализированных органелл тоже играет важную роль в поддержании концентрации Са2+ в цитозоле на + низком уровне: эта Са2 -АТРаза способна закачивать в органеллы большие количества ионов кальция из цитозоля против крутого градиента + концентрации даже тогда, когда их уровень в цитозоле низок. Ионы Са2 хранятся в полости запасающей органеллы в состоянии непрочной ассоциации с Са2 +-связывающим белком кальсеквестрином, который обладает низким сродством к Са2+ (Кл = 103 л/моль), но высокой емкостью + (~50 ионов Са2+ на молекулу). Если окрасить клетки антителами к кальсеквестрину и Са2 -АТР-азе, то выявятся одни и те же ограниченные мембранами органеллы, меньшие по размерам и отличные от гранулярного эндоплазматического ретикулума (рис. 12-19). Эти органеллы гомологичны саркоплазматическому ретикулуму в мышечных клетках (разд. 11.1.11) и, подобно этому ретикулуму, специализированы для хранения и освобождения Са2 +. В дальнейшем мы будем называть их Са2+-запасающнми органеллами.

Обычно концентрация свободных ионов кальция в цитозоле варьирует в пределах примерно от 10-7 М во время покоя до 5- 10-б М при активации внешним сигналом. Но если клетка повреждена и не в состоянии эффективно откачивать ионы Са2+ из цитозоля, их концентрация может стать опасно высокой (> 10-5 М). В этих обстоятельствах начинает действовать высокоэффективный кальциевый насос с низким сродством во внутренней митохондриальной мембране, использующий энергию электрохимического градиента, который создается на этой мембране за счет энергии переноса электронов при окислительном фосфорилировании (разд. 7.1.8).

12.3.8 Ион Са2 + действует как вездесущий внутриклеточный посредник [15] Первые данные о роли иона Са2+ как внутриклеточного посредника были получены в 1947 г., когда выяснилось, что инъекция в клетку скелетной мышцы небольшого количества Са2+ вызывает ее сокращение. В последние годы стало ясно, что Са2+ служит внутриклеточным посредником в весьма разнообразных клеточных реакциях, включая секреторные процессы и пролиферацию. Были выявлены два типа передачи сигнала с участием ионов Са2+ (рис. 12-20), один из которых реализуется главным образом в электрически активных клетках, а другой - почти во всех клетках эукариот. Первый из этих путей был подробно исследован на нервных клетках, где деполяризация плазматической мембраны вызывает поглощение Са2+ нервным окончанием, инициируя секрецию нейромедиатора;

Са2+ входит через потенциал-зависимые кальциевые каналы, которые открываются при деполяризации плазматической мембраны нервного окончания в момент прихода потенциала действия (разд.

19.3.2). При втором, повсеместно распространенном способе связывание сигнальной молекулы с рецептором клеточной поверхности ведет к освобождению Са2+ из внутриклеточных хранилищ;

события на поверхности клетки сопряжены с открытием кальциевых каналов во внутриклеточной мембране с помощью другого внутриклеточного посредника-инозитолтрисфосфата. Он образуется в плазматической мембране в результате быстрого гидролиза минорных фосфолипидов (инозитолфосфолипидов).

12- 12.3.9 Инозитолтрисфосфат (InsP3) сопрягает активацию рецептора с освобождением Са2 из внутриклеточных хранилищ [16] Предположение о роли инозитолфосфолипидов (фосфоинозитидов) в передаче сигнала впервые возникло в 1953 г., когда было обнаружено, что некоторые внеклеточные сигналы стимулируют включение радиоактив- Рис. 12-20. Два главных пути, которыми Ca2+ может проникнуть в цитозоль, чтобы выполнить свою функцию внутриклеточного посредника для внеклеточных сигналов. В случае А кальций входит в нервное окончание из внеклеточной жидкости через потенциал-зависимые кальциевые каналы, когда мембрана нервного окончания деполяризуется потенциалом действия. В случае Б связывание внеклеточной сигнальной молекулы с поверхностным рецептором стимулирует выход Са2+ из его хранилищ внутри клетки.

Рис. 12-21. Инозитолфосфолипиды (фосфоинозитиды) в клетках млекопитающих составляют менее 10% всех фосфолипидов клеточной мембраны. Полифосфоинозитиды (PIP и Р1Р2)-продукты фосфорилирования фосфатидилинозитола (РІ). Хотя при воздействии внешнего сигнала могут расщепляться все три инозитолфосфолипида, наибольшую роль играет расщепление Р1Р2, хотя он составляет менее 10% общего количества инозитолфосфолипидов и менее 1% всех фосфолипидов клетки.

ного фосфата в фосфатидилинозитол (РІ) - минорный фосфолипид клеточной мембраны. Позднее было показано, что это включение обусловлено реакциями расщепления и ресинтеза инозитолфосфолипидов, запускаемыми рецептором, который активирует фермент фосфоинозитид специфическую фосфолипазу С. Из инозитолфосфолипидов наиболее важную роль в передаче сигнала играют два фосфорилированных производных PI-Р1-фосфат (PIP) и Р1-6исфосфат (Р1Р2), которые, как полагают, находятся главным образом во внутреннем листе липидного бислоя плазматической мембраны (рис. 12-21). Хотя Р1Р2 содержится в мембранах животных клеток в гораздо меньших количествах, чем PI, наибольшее значение имеет именно гидролиз Р1Р2.

Цепь событий, соединяющих внешний сигнал и внутренний ответ через гидролиз Р1Р2, начинается с присоединения сигнальной молекулы к ее рецептору в плазматической мембране. В настоящее время установлено, что гидролиз инозитолфосфолипидов участвует в передаче сигнала более чем от 25 различных рецепторов клеточной поверхности (табл. 12-4). Хотя детали этой активации менее ясны, чем в случае аденилатциклазы, накапливается все больше данных о том, что и здесь, в плазматической мембране, работает аналогичный многоступенчатый механизм. Вероятно, активированный рецептор активирует G-белок (пока условно названный Gp), а тот в свою очередь активирует фосфолипазу С.

Менее чем за секунду этот фермент превращает РІР2 в два продукта: инозитол- Таблица 12-4. Некоторые клеточные реакции, осуществляемые через фосфоинозитидный каскад.

Ткань-мишень Сигнальная молекула Главный ответ Печень Вазопрессин Распад гликогена Поджелудочная железа Ацетилхолин Секреция амилазы Гладкая мускулатура Ацетилхолин Сокращение -Клетки поджелудочной железы Ацетилхолин Секреция инсулина Тучные клетки Антиген Секреция гистамина Тромбоциты Тромбин Секреция серотонина и PDGF Рис. 12-22. При гидролизе Р1Р2 образуется инозитолтрисфосфат (InsP3), который диффундирует через цитозоль и освобождает Са2 + из Са2 +-запасающих органелл. Другой продукт гидролиза –диацил-глицерол - тоже играет важную роль во внутриклеточной передаче сигнала, активируя протеинкиназу С (см. ниже в тексте).

трисфосфат и диацилглицерол (рис. 12-22). Здесь путь передачи сигнала разделяется на две ветви. Поскольку обе названные молекулы играют важнейшую роль в последующем развитии ответа, мы рассмотрим их по отдельности.

Инозитолтрисфосфат (InsP3)-небольшая водорастворимая молекула, которая освобождает ионы Са2+ из их хранилищ внутри клетки (рис.

12-22). Когда lnsP3 добавляют к пермеабилизованным клеткам (мембрана которых путем специальной обработки сделана проницаемой) или к + выделенным внутриклеточным везикулам, он вызывает выход Са2 в среду. Очевидно, связывание InsP3 с рецептором на цитоплазматической поверхности внутриклеточной органеллы открывает кальциевые каналы в ее мембране. Два механизма делают выброс кальция кратковременным:

+ 1) ионы Са2, поступающие в цитозоль, быстро откачиваются оттуда, в основном за пределы клетки (позже, после удаления стимула, клетка постепенно восполнит свой запас Са2+, поглощая его через плазматическую мембрану);

2) часть InsP3 быстро дефосфорилируется (и тем самым инактивируется) специальной фосфатазой. Однако дефосфорилируется не весь InsP3: часть его, напротив, фосфорилируется до инозитол-1,3,4,5 тетракисфосфата (InsP4), при участии которого в клетке, возможно, развиваются более медленные и продолжительные реакции. В некоторых клетках освобождение Са2+ происходит в виде серии «импульсов», каждый из которых длится 10 с или более.

12.3.10. Диацилглицерол, образующийся при гидролизе Р1Р2, активирует протеинкиназу С [17] В то время как InsP3, образующийся при гидролизе Р1Р2, повышает концентрацию Са2+ в цитозоле, другой продукт расщепления Р1Р2 диацилглицерол - производит совершенно другие эффекты. У него есть две потенциально «сигнальные» роли: он может распадаться дальше с образованием арахидоновой кислоты, необходимой для синтеза простагландинов и родственных им медиаторов липидной природы (см. рис. 12-8), или, что важнее, способен активировать специфическую про- теинкиназу, которая затем фосфорилирует ряд белков с различными функциями в клетке-мишени.

+ Фермент, активируемый диацилглицеролом, называется протеннкнназой С или С-киназой, так как активность его зависит от Са2.

Диацил-глицерол - продукт активации рецептора - вместе с фосфолипидом внутреннего слоя плазматической мембраны фосфатидилсерином присоединяются к протеинкиназе С, повышая ее сродство к Са2 + настолько, что она становится активной уже при низких концентрациях Са2 + в + цитозоле. Во многих клетках, однако, С-киназа в норме активируется, вероятно, совместным воздействием диацилглицерола и ионов Са2, концентрация которых в цитозоле повышается под влиянием InsP3. Активация С-киназы кратковременна, так как через несколько секунд диацилгдицерол фосфорилируется до фосфатидной кислоты или расщепляется с высвобождением арахидоновой кислоты.

С-киназа, активированная диацилглицеролом и Са2 +, переносит концевую фосфатную группу с АТР на специфические сериновые или треониновые остатки белков-мишеней, которые в разных клетках различны. Например, во многих животных клетках С-киназа, по-видимому, фосфорилирует и тем самым активирует На+/Н+-обменник плазматической мембраны, контролирующий внутриклеточный рН (разд. 6.4.10);

повышение рН в клетке может способствовать пролиферации. Концентрации С-киназы выше всего в головном мозгу, где помимо прочего она фосфорилирует ионные каналы нейронов, изменяя таким образом их свойства и возбудимость клеток (разд. 19.5). В некоторых клетках активация С-киназы усиливает транскрипцию определенных генов. В промоторах по меньшей мере некоторых из этих генов есть общая энхансерная последовательность, узнаваемая регуляторним белком, активность которого растет при активации С-киназы (см. табл. 10-1). Пока, однако, остается невыясненным, как С-киназа активирует этот белок - фосфорилируя (и соответственно активируя) его прямо или же действуя косвенно, через каскад протеинкиназ.

Каждый из двух путей фосфоинозитидного сигнала можно имитировать, добавляя к иyтактным клеткам подходящий фармакологический агент. Эффекты InsP3 имитируются кальциевыми ионофорами, такими как А23187 или иономицин, которые позволяют ионам Са2+ входить в цитозоль из внеклеточного пространства (разд. 6.4.19). Действие Рис. 12-23. Две ветви инозитолфос-фолипидного пути. Как полагают, активированный рецептор связывается со специфическим G-белком (Gp), заставляя его -субъединицу диссоциировать и активировать фосфолипазу С, которая расщепляет Р1Р2 с образованием InsP3 и диацилглицерола. Истинная структура белка до сих пор не ясна. Диациглицерол (при участии не показанных на схеме связанных ионов Са2+ и фосфатидилсерина) активирует С-киназу. Оба фермента и фосфолипаза С, и С-киназа-присутствуют в клетках как в растворимой, так и в мембраносвязанной форме;

в процессе активации одна из них или обе они перемещаются из цитозоля на внутреннюю поверхность плазматической мембраны. Эффект InsP3 можно имитировать экспериментально на интактных клетках обработкой Са2+-ионофором, а эффект диацилглицерола обработкой моноацилпроизводными диацилглицерола или форбодовыми зфирами, которые связываются с С-киназой и активируют ее.

диацилглицерола может быть имитировано моноацильными производными диацилглицерола или форболовыми эфирами - веществами растительного происхождения, которые присоединяются к С-киназе и непосредственно активируют ее (рис. 12-23). С помощью этих реагентов было показано, что часто для получения полноценного клеточного ответа обе ветви должны действовать совместно. Например, пролиферацию клеток многих типов в культуре можно стимулировать, одновременно применяя кальциевый ионофор и активатор С-киназы, тогда как поодиночке эти реагенты неэффективны.

Когда по какой-то причине клетки начинают чрезмерно размножаться, это, разумеется, привлекает к себе внимание. Именно поэтому влияние форболовых эфиров на клеточную пролиферацию впервые было открыто благодаря их действию как «опухолевых промоторов» в организме животных. Опухолевые промоторы - это вещества, которые сами по себе рака не вызывают, но могут индуцировать опухолевый рост у животного после воздействия небольшой дозы канцерогена, недостаточной, чтобы вызвать рак. Когда позднее оказалось, что форболовые эфиры непосредственно активируют С-киназу, это помогло выяснить один из внутриклеточных механизмов реакции клеток на ростовые сигналы. Вообще фундаментальные исследования причин рака, и в особенности онкогенных вирусов животных, дали немало ценных сведений о путях передачи сигналов внутри клеток.

12.3.11. Так называемые ras-онкогены кодируют новый класс G-белков, участвующих в регуляции клеточного деления По-видимому, для регуляции роста и деления клеток используется несколько различных сигнальных путей. Некоторые гены, в норме кодирующие белки - компоненты этих путей, иногда случайным образом захватывались ретровирусами и встраивались в их геном, нередко в модифицированной форме (эти ретровирусы известны также как онкогенные РНК-содержащие вирусы). Такие «украденные» у клетки вирусные гены в некоторых случаях придают вирусам способность вызывать неконтролируемую пролиферацию зараженных клеток и таким образом становятся причиной развития опухолей. Такие гены получили название вирусных онкогенов. Изучение опухолей привело к открытию опухолеродных вирусов, затем онкогенов, а это в свою очередь-к открытию нормальных клеточных генов-протоонкогенов, из которых произошли вирусные онкогены (разд. 13.4.2).

Большой класс онкогенов и протоонкогенов, открытых таким путем, был назван ras-генами (так как они впервые были обнаружены в вирусах, вызывающих саркому у крыс-rat sarcoma). Эти гены кодируют G-белки, которые находятся на внутренней поверхности плазматической мембраны и здесь связывают и гидролизуют GTP. Эти ras-белки, кодируемые вирусными ras-онкогенами, отличаются от нормальных ras-белков (кодируемых протоонкогенами) заменой аминокислоты в одном из двух положений. Этого, как правило, достаточно для нарушения GTP-азной активности, а вместе с ней и механизма собственной инактивации G-белка (разд. 12.3.4). Если в культивируемые клетки ввести антитела против продуктов ras-протоонкогенов, то эти клетки теряют способность делиться в ответ на воздействие ростовых факторов. На этом основании полагают, что ras-белки каким-то образом участвуют в сопряжении рецепторов для факторов роста с внутриклеточными белками-эффекторами. Природа эффекторных белков и механизм сопряжения остаются невыясненными, хотя накапливается все больше данных о том, что эффекторные белки могут регулировать фосфоинозитидный путь передачи сигнала - по крайней мере это одна из их функций. ras-Белки- одиночные полипептиды, поэтому предположение, что Gp-белок, сопрягающий рецепторы с фосфолипазой С, кодируется ras-протоонкогеном, весьма маловероятно: тогда Gp слишком отличался бы от всех остальных G-белков-гомологичных гетеротримеров, рассмотренных в этой главе (см.

табл. 12-3). Гораздо более правдоподобно, что семейство ras-протоонкогенов, включающее как минимум три члена, кодирует особую группу G белков с новыми функциями. Несмотря на ряд неясных моментов, изучение онкогенов открыло важный новый подход к выяснению нормальных механизмов передачи клеточного сигнала с участием G-белков, а также и других клеточных сигнальных механизмов.

12.3.12. Активаторы G-белков образуют большое семейство гомологичных гликопротеинов, семикратно пронизывающих мембрану [19] Сигнальные системы, в которых используются G-белки, удивительно многообразны. Мы видели, что некоторые G-белки (Gs и Gi) сопрягают рецепторы с аденилатциклазой, а другие (Gp) с фосфолипазой С. В глазу позвоночных G-белок, называемый трансдуцином, сопрягает поглощение фотона молекулой родопсина с активацией фермента фосфодиэстеразы, который гидролизует cGMP (разд. 12.4.5);

падение концентрации этого внутриклеточного посредника приводит к электрическим изменениям в клетке-фоторецепторе. Все эти G-белки могут опосредованно, тем или иным способом изменять состояние ионных каналов, однако некоторые G-белки могут взаимодействовать с ними непосредственно. Например, присоединение ацетилхолина к рецепторам на клетках сердечной мышцы активирует Gi-подобный белок, который прямо активирует калиевый канал в плазматической мембране. (Эти рецепторы, чувствительные к алкалоиду мухомора мускарину, называют мускаринивыми рецепторами ацетилхолина в отличие от других - никотиновых рецепторов ацетилхолина, которые являются каналообразующими рецепторами скелетных мышц-см. разд. 6.4.17.) Все до сих пор охарактеризованные G-белки, которые работают в этих столь различных системах, эволюционно родственны. Они имеют сходную субъединичную структуру и аминокислотную последовательность: у -субъединицы трансдуцина и Gi, например, последовательности на 65% идентичны. Не удивительно, что многие, если не все, взаимодействующие с этими G-белками рецепторы тоже гомологичны между собой, что стало ясно после секвенирования их кДНК. Обобщение первичных структур рецепторов этого быстро растущего класса дало общую структуру, состоящую из одной полипептидной цепи, которая пронизывает липидный бислой семь раз. Это семейство семикратно трансмембранных белков рецепторов включает -адренэргические рецепторы (рис. 12-24), мускариновые рецепторы для ацетилхолина, несколько рецепторов для нейропептидов и даже родопсин. Похоже, что все эти гликопротеины входят в очень большое семейство эволюционно родственных рецепторов.

Общий структурный «мотив», вероятно, возник в эволюции рано, так как он свойствен уже бактериородопсину (светочувствительному протонному насосу, который, правда, действует не через G-белок - см. разд. 6.27) и рецепторным белкам, участвующим в регуляции созревания дрожжей (разд.

10.3.2). Однако не все рецепторы клеточной поверхности несколько раз пронизывают мембрану, и сейчас мы переходим к другому классу рецепторов - к семейству тирозин-специфических протеинкиназ.

Рис. 12-24. Схема предполагаемого расположения -адренэргического рецептора в плазматической мембране. Выделенные красным цветом участки цитоплазматического «хвоста» указывают положение остатков серина-потенциальных мишеней для фосфорилирования при десенсибилизации рецептора (разд. 15.5.2). Установлено, что у других рецепторов, сопряженных с G-белками, полипептидная цепь тоже семикратно пронизывает мембрану. (По данным R. A. Dixon et al., Nature 321: 75-79, 1986.) 12.3.13. Многие каталитические рецепторы – гликопротеины с тирозин-специфической протеинкиназной активностью, однократно пронизывающие мембрану [20] Обширная группа поверхностных рецепторов трансформирует внешний сигнал во внутриклеточный с помощью G-белков, но есть и такие рецепторы, которые действуют более коротким путем. Это каталитические белки-рецепторы, и наиболее изученные среди них - однократно пронизывающие мембрану тирозин-специфические протеинкиназы, каталитический домен которых находится с внутренней стороны плазматической мембраны. При связывании лиганда они активируются и переносят терминальную фосфатную группу от АТР на гидроксильную группу тирозинового остатка в определенных белках клетки-мишени. К этому семейству протеинкиназ относятся рецепторы инсулина, многих ростовых факторов, включая тромбоцитарный фактор роста (ТФР, или PDGF - platelet-derived growth factor, см. разд. 13.3.4) и фактор роста эпидермиса (ФРЭ, или EGP - epidermal growth factor), который стимулирует деление эпидермальных и многих других клеток (см. рис. 12-25).

Большинство других протеинкиназ фосфорилирует сериновые или, реже, треониновые остатки в белках, так что фосфотирозин содержится менее чем в 0,1% фосфорилированных белков клетки. Во всех изученных случаях белок-рецептор с тирозинкиназной активностью фосфорилирует и сам себя, когда активирован. В случае рецептора инсулина это самофосфорилирование повышает активность киназы по типу положительной обратной связи.

Каким образом связывание лиганда с внеклеточным доменом рецептора активирует каталитический домен на другой стороне плазматической мембраны? Трудно представить себе, как конформационные изменения могли бы передаваться через липидный бислой по одиночной трансмембранной -спирали. В случае рецептора для EGF связывание лиганда вызывает конформационные изменения наружного домена, что приводит к димеризации рецептора. Возможно, что в результате взаимодействия двух соседних цитоплазматических доменов димер приобретает каталитическую активность.

Имеется достаточно данных о том, что важную роль в сигнальном процессе играет киназная функция рецепторов. Например, клетки, содержащие мутантный рецептор инсулина с единственной аминокислотной заменой, избирательно подавляющей киназную активность, на инсулин не реагируют. Однако идентифицировать ключевые субстраты, которые фосфорилируются наряду с самим рецептором, чрезвычайно трудно, и поэтому конкретная роль фосфорилирования тирозина в передаче сигнала остается неясной. В случае рецептора для PDGF одним из субстратов, по-видимому, является киназа, фосфорилирующая фосфатидилинозитол (PI-киназа, см. рис. 12-21). Возможно, этим объясняется тот парадоксальный факт, что PDGF вызывает медленную активацию фосфоинозитидного сигнального пути, хотя его рецептор не сопряжен с Gp1.

После связывания лиганда многие каталитические рецепторы переходят внутрь клетки путем эндоцитоза в окаймленных пузырьках, содержащих комплексы рецептор-лиганд (разд. 6.5.7). В некоторых случаях такой эндоцитоз, по-видимому, определяется самофосфорилированием рецептора. Этот процесс может играть важную роль и в расщеплении сигнальных молекул, и в регуляции плотности рецепторов на поверх- _ В последнее время появились данные, что рецепторы по крайней мере некоторых факторов роста после связывания лиганда могут фосфорилировать и фосфолипазу С, усиливая гидролиз Р1В2.-Прим. перев.

ности клетки-мишени (разд. 12.5). Кроме того, происходящий при этом перенос домена с тирозинкиназной активностью в новый участок клетки тоже может быть существенным для сигнального процесса, хотя это пока еще не доказано.

12.3.14. Продукты некоторых онкогенов - это аномальные каталитические рецепторы с нерегулируемой киназной активностью [21] Первая тирозиновая протеинкиназа была открыта в 1979 г. Это был не поверхностный клеточный рецептор, а внутриклеточный продукт вирусного онкогена - белок, названный рр60 v-src (разд. 13.4.2). Первым рецептором, у которого обнаружили тирозинкиназную активность (в г.), был рецептор для EGF. Несколькими годами позже выяснилось, что вирусный онкоген erbB кодирует урезанный вариант рецептора для EGF.

Этот урезанный белок потерял EGF-связывающий наружный домен, но сохранил внутриклеточный домен с тирозинкиназной активностью, и поэтому клетки с такими дефектными рецепторами ведут себя так, как будто на них постоянно действует сигнал к пролиферации. Позднее выяснилось, что онкоген пеи, активный в некоторых химически индуцированных опухолях нервной системы у крыс, кодирует аномальный рецептор, являющийся тирозиновой киназой, хотя природа лиганда (предположительно это ростовой фактор) для нормального рецептора не установлена. В этом случае аномальный и нормальный рецепторы различаются только по одному аминокислотному остатку в единственном трансмембранном сегменте белка. Такого изменения оказалось достаточно, чтобы сделать тирозиновую киназу постоянно активной. Эти исследования подчеркивают важную роль тирозиновых киназ в контроле клеточной пролиферации.

Между онкогенами и нормальными путями передачи сигнала к пролиферации было обнаружено немало и других связей. Онкоген sis, например, кодирует функционально активную субъединицу PDGF, а онкоген erbA - измененную форму рецептора тиреоидного гормона. Как мы будем более подробно обсуждать в гл. 13, исследование онкогенов открывает перспективный путь к выявлению и пониманию целого спектра механизмов, с помощью которых пролиферативные сигналы достигают своей цели.

Продукты примерно половины всех открытых до сих пор онкогенов - это протеинкиназы, фосфорилирующие белки-мишени по остаткам тирозина, серина или треонина. Это не удивительно, так как фосфорилирование играет важную роль в процессах передачи сигнала, запускаемых как каталитическими рецепторами, так и рецепторами, сопряженными с G-белками, и для его осуществления имеется весьма обширное семейство протеинкиназ. Уже известно более 70 протеинкиназ, и все они, видимо, происходят от общего предшественника, так как их каталитические домены гомологичны (рис. 12-25). Фактически сейчас уже возможно предсказать, будет ли белок киназой и если да, то какие остатки - серина, треонина или тирозина - он будет фосфорилировать, просто исходя из данных о его аминокислотной последовательности. В следующем разделе мы увидим, что два главных внутриклеточных посредника - сАМР и Са2+-реализуют многие свои эффекты, активируя протеинкиназы, специфичные в отношении серина и треонина.

Рис. 12-25. Размеры и локализация каталитических доменов некоторых протеинкиназ, рассмотренных в этой главе. Во всех случаях каталитический домен (выделен цветом) состоит примерно из 250 аминокислотных остатков и имеет сходную аминокислотную последовательность;

это позволяет предполагать происхождение их всех от общего предшественника. Три представленные здесь тирозин специфические киназы-трансмембранные белки-рецепторы, которые при связывании специфического внеклеточного лиганда активируются и фосфорилируют ряд белков внутри клетки (в том числе и самих себя) по остаткам тирозина. Обе цепи рецептора инсулина кодируются одним геном, продукт которого - белок-предшественник - расщепляется на две цепи, связанные дисульфидными мостиками. Внеклеточная часть рецептора PDGF, по-видимому, сложена в пять иммуноглобулиноподобных доменов - возможно, этот белок относится к суперсемейству иммуноглобулинов (разд. 18.6.20). Регуляторные субъединицы А-киназы (см. рис. 12-27) и киназы фосфорилазы (см. рис. 12-31), в норме ассоциированные с этими киназами, на схеме не показаны.

Заключение Известны три основных семейства поверхностных клеточных рецепторов, передающих внеклеточные сигналы различными способами.

Рецепторы, образующие канал, - это чувствительные к нейромедиатору ионные каналы, которые быстро открываются или закрываются в ответ на связывание нейромедиатора и изменяют электрическую возбудимость клетки. Каталитические рецепторы являются в основном тирозин-специфическими киназами, которые прямо фосфорилируют определенные белки клеток-мишеней по остаткам тирозина. Рецепторы, сопряженные с G-белками, опосредованно активируют или инактивируют ферменты или ионные каналы, связанные с плазматической мембраной, через регуляторные GTP-связывающие белки (G-белки). Эти G-белки «выключают» сами себя, медленно гидролизу я связанный GTP. Некоторые из таких рецепторов активируют или ингибируют аденилатциклазу, изменяя этим концентрацию внутриклеточного посредника сАМР. Другие активируют фосфоинозитид-специфичную фосфолипазу С, которая гидролизует фос фатидилинозитол-бисфосфат (Р1Р2), образуя из него два внутриклеточных посредника: 1) инозитолтрисфосфат (InsP3), освобождающий ионы Са2+ из их внутриклеточных хранилищ и повышающий их концентрацию в цитозоле;

и 2) диацилглицерол, остающийся в плазматической мембране и активирующий протеинкиназу С, которая фосфорилирует различные клеточные белки. Разнообразные ответы, вызываемые активацией рецепторов, сопряженных с G-белками, быстро прекращаются после удаления внеклеточного сигнального лиганда. При этом G-белки инактивируются сами, InsP3 быстро дефосфорилируется фосфатазой, диацилглицерол превращается в фосфатидную кислоту или расщепляется с образованием арахидоновой кислоты, сАМР гидролизуется фосфодиэстеразой, а ионы Са2 + быстро откачиваются из цитозоля.

12.4. Механизм действия циклического AMP и ионов кальция [22] Так как сАМР и Са2+-возможно, самые важные внутриклеточные посредники, появляющиеся в результате активации рецепторов клеточной поверхности, механизм их действия заслуживает специального рассмотрения. Оба они действуют как аллостерические эффекторы - активируют определенные белки, присоединяясь к ним и изменяя их конформацию.

12- 12.4.1. с AMP активирует сАМР-зависимую протеинкиназу [23] В животных клетках сАМР действует главным образом путем активации специфического фермента, называемого сАМР-зависимой протеинкиназой (А-киназой). Этот фермент катализирует перенос концевого фосфата с АТР на определенные остатки серина и треонина в некоторых белках клетки-мишени. Остатки, фосфорилируемые А-киназой, отличаются тем, что со стороны N-конца около них расположены две или большее число основных аминокислот. Ковалентнеє фосфорилирование таких остатков в свою очередь регулирует активность этих белков.

Впервые сАМР-зависимое фосфорилирование белков было выявлено при изучении метаболизма гликогена в клетках скелетных мышц.

Гликоген - это основная резервная форма глюкозы;

как уже упоминалось, его распад в мышечных клетках регулируется адреналином (фактически адреналин регулирует как распад гликогена, так и его синтез в скелетной мускулатуре). Если, например, животное подвергнуть стрессу (испугать и т. п.), то надпочечники начнут выбрасывать адреналин в кровь, и это будет приводить различные ткани организма в состояние «готовности».

Циркулирующий в крови адреналин вызывает, в частности, расщепление гликогена в мышечных клетках до глюкозо-1-фосфата и в то же время подавляет синтез нового гликогена. Глюкозо-1-фосфат превращается в глюкозо-6-фосфат, который затем окисляется в реакциях гликолиза с образованием АТР, обеспечивая энергию для интенсивной работы мышц. Таким способом адреналин подготавливает мышечные клетки к усиленной работе.

Рис. 12-26. На этой схеме показано, как повышение уровня сАМР в клетках скелетных мышц (при связывании адреналина с адренэргическими рецепторами клеточной поверхности) стимулирует распад гликогена. Связывание сАМР с А-киназой активирует этот фермент, который в свою очередь фосфорилирует и тем самым активирует киназу фосфорилазы, а она фосфорилирует (и активирует) гликогенфосфорилазу - фермент, расщепляющий гликоген. А-киназа также прямо и опосредованно усиливает фосфорилирование гликогенсинтетазы (которая при этом ингибируется), и это ведет к прекращению синтеза гликогена (не показано).

Как уже говорилось, на поверхности мышечных клеток адреналин связывается с -адренэргическими рецепторами, что ведет к активации аденилатциклазы и повышению уровня сАМР в цитозоле. сАМР активирует А-киназу, и она фосфорилирует другой фермент -киназу фосфорилазы (первую протеинкиназу, которую удалось получить в очищенном виде в 1959 г.). Эта последняя в свою очередь фосфорилирует (и тем самым активирует) гликогенфосфорилазу, отщепляющую остатки глюкозы от молекулы гликогена (рис. 12-26). Активированная А-киназа, кроме того, усиливает фосфорилирование гликогенсинтазы - фермента, осуществляющего последний этап синтеза гликогена из глюкозы, фосфорилирование инактивирует гликогенсинтазу и прекращает синтез гликогена. С помощью такого каскада взаимодействий повышение уровня сАМР приводит одновременно как к уменьшению синтеза гликогена, так и к усилению его распада, что максимально увеличивает количество глюкозы, доступной для использования клеткой.

В некоторых животных клетках повышение уровня сАМР активирует транскрипцию специфических генов. В нейроэндокринных клетках гипоталамуса (разд. 12.1.2), например, сАМР «включает» ген, кодирующий пептидный гормон соматостатин. В промоторной области гена соматостатина есть короткая последовательность ДНК (около 30 нуклеотидов), найденная также в промоторах ряда других генов, активируемых сАМР. Эта последовательность узнается специфическим регуляторным белком, который, будучи фосфорилирован А-киназой, активирует транскрипцию этих генов.

В неактивном состоянии А-киназа - это комплекс из двух регуляторных субъединиц, связывающих сАМР, и двух каталитических субъединиц. Связывание сАМР изменяет конформацию регуляторных субъединиц, что приводит к отделению их от комплекса. Освобожденные каталитические субъединицы и представляют собой активную А-киназу;

они фосфорилируют молекулы белков-субстратов (рис. 12-27).

А-киназа имеется во всех животных клетках, и полагают, что почти все эффекты, вызываемые сАМР, реализуются благодаря ей. Хотя Рис. 12-27. Активация сАМР-зависимой протеинкиназы (А-киназы). Присоединение сАМР к регуляторным субъединицам фермента вызывает изменение их конформации, приводящее к отделению этих субъединиц от комплекса. Освобождаемые при этом каталитические субъединицы активируются. Каждая регуляторная субъединица имеет два участка для связывания сАМР, и освобождение каталитических субъединиц представляет собой кооперативный процесс, требующий присоединения более чем двух молекул сАМР на тетрамер. Это делает реакцию киназы на изменение концентрации сАМР значительно более резкой (см. разд. 12.4.8). Во многих клетках имеются А-киназы двух типов-с одинаковыми каталитическими субъединицами, но разными регуляторними.

большинство ее белков-субстратов еще не охарактеризовано, ясно, что многие из них в клетках разных типов различны, и это позволяет понять, почему сАМР неодинаково влияет на разные клетки-мишени.

12.4.2. сАМР ингибирует внутриклеточную протеинфосфатазу [24] Так как эффекты сАМР обычно непродолжительны, ясно, что клетка способна дефосфорилировать белки, фосфорилированные А киназой. Отщепление фосфата катализируют две главные протеинфосфатазы, одна из которых сама регулируется циклическим AMP. Уровень фосфорилирования всегда будет зависеть от баланса между активностями киназ и фосфатаз.

В клетках скелетных мышц с AMP-регулируемая протеинфосфатаза наиболее активна в отсутствие сАМР, и она дефосфорилирует все три ключевых фермента метаболизма гликогена, которые уже упоминались ранее, - киназу фосфорилазы, гликогенфосфорилазу и гликогенсинтазу.

Это дефосфорилирование противодействует фосфорилированию белков под действием сАМР. Однако А-киназа в активном состоянии фосфори- Рис. 12-28. Циклический AMP ингибирует протеинфосфатазу, которая в активном состоянии противодействовала бы реакциям фосфорилирования, запускаемым сАМР. Он активирует А-киназу, а она фосфорилирует белок-ингибитор, который после этого присоединяется к протеинфосфатазе и подавляет ее активность.

Рис. 12-29. Структура кальмодули-на (по данным рентгеноструктурного анализа). Молекула имеет форму гантели с двумя глобулярными юнцами, соединенными длинной открытой -спиральго. Каждый конец имеет два Са2+-связывающих домена, представляющих собой петли из аминокислотных остатков, в которых боковые цепи аспартата и глутамата образуют ионные связи с Са2 +. У двух участков связывания ионов кальция в С-концевой части молекулы сродство к ним в десять раз больше, чем в N-концевой части. (По данным Y. S. Babu et al., Nature 315: 37-40, 1985.) лирует и тем самым активирует также специальный белок - ингибитор фосфатази. Этот белок присоединяется к фосфопротеинфосфатазе и инактивирует ее (рис. 12-28). Таким образом, А-киназа, активируя киназу фосфорилазы и одновременно подавляя активность фосфопро теинфосфатазы, намного усиливает и ускоряет воздействие повышенного уровня сАМР на синтез и распад гликогена по сравнению с тем, что было бы, если бы А-киназа действовала лишь на один из этих ферментов.

12- 12.4.3. Кальмодулин является вездесущим внутриклеточным рецептором для ионов кальция [25] Поскольку концентрация свободных ионов Са2 + в цитозоле обычно составляет около 10-7 М и, как правило, не поднимается выше 5 • 10-б М даже при поступлении их извне, любая структура клетки, чтобы быть непосредственной мишенью кальциевой регуляции, должна иметь константу сродства к Са2+ (Ка) порядка 106 л/моль. Если же учесть, что концентрация свободных ионов Mg2+ в цитозоле относительно постоянна и составляет около 10-3 М, то связывающие кальций центры должны обладать по меньшей мере 1000-кратной избирательностью к Са2+ по сравнению с Mg2+. Этим требованиям удовлетворяют несколько специфических Са2+-связывающих белков.

Первым из этих белков был открыт тропонин С в клетках скелетных мышц;

роль его в мышечном сокращении обсуждалась в гл. 11 (разд.

11.1.12). Другой, близко родственный ему кальций-связывающий белок-кальмодулин - обнаружен во всех до сих пор изученных клетках животных и растений. Типичная животная клетка содержит более 107 молекул кальмодулина, что может составлять до 1% всего клеточного белка.

+ Кальмодулин функционирует как многоцелевой внутриклеточный рецептор для Са2, участвующий в большинстве процессов, регулируемых + этими ионами. Это очень консервативный одиночный полипептид примерно из 150 аминокислот, имеющий четыре высокоаффинных Са2 связывающих центра;

при связывании кальция он претерпевает большие конформационные изменения (рис. 12-29).

Аллостерическая активация кальмодулина кальцием аналогична активации А-киназы циклическим AMP, с тем отличием что комплекс Са2+-кальмрдулин сам по себе не обладает ферментативной активностью и действует, связываясь с другими белками. В некоторых случаях кальмодулин служит постоянной регуляторной субъединицей ферментного комплекса (как в случае киназы фосфорилазы, см. ниже), но чаще Рис. 12-30. Здесь показано, каким образом повышение концентрации свободных ионов Са2+ в цитозоле может косвенным образом активировать фермент, изменяя конформацию молекул кальмодулина. Подобно связыванию сАМР с А-киназой, связывание Са2+ с калъмо-дулином кооперативно: для активации этого белка требуется больше одного иона Са2 + (см. разд. 12.4.8).

всего связывание Са2 + ведет к присоединению кальмодулина к различным белкам-мишеням и, как следствие, к изменению их активности (рис. 12 30).

К числу мишеней, регулируемых комплексом Са2 +-кальмодулин, относится много ферментов и мембранных транспортных белков. Среди них выделяются Са2+/кальмодулин-зависимые протеинкиназы (Са-киназы), фосфорилирующие белки по остаткам серина и треонина. Первые из открытых Са-киназ -киназа легких цепей миозина и киназа фосфорилазы - имели узкую субстратную специфичность. Позже была идентифицирована широкоспецифичная Са-киназа, называемая Са2+/калъмодулин-регулируемой «полифункциональной» киназой (или Са-киназой II);

она может служить посредником во многих эффектах Са2+ в клетках млекопитающих. Как и в случае сАМР, ответ клетки-мишени на повышение концентрации свободного Са2+ в цитозоле определяется тем, какие Са2+/кальмодулин-регулируемые белки имеются в клетке.

12.4.4. Пути с участием сАМР и Са2+ взаимодействуют между собой [26] Пути с участием вторичных посредников сАМР и Са2+ взаимодействуют по крайней мере тремя способами. Во-первых, внутриклеточные уровни Са2+ и сАМР влияют друг на друга. Например, комплексы Са2+/кальмодулин связываются с ферментами, которые разрушают или синтезируют сАМР,-с сАМР-фосфодиэстеразой и аденилатциклазой соответственно - и регулируют их активность;

а в свою очередь А-киназа способна фосфорилировать некоторые кальциевые каналы и насосы и изменять их активность. Во-вторых, некоторые Са-киназы фосфорилируются А-киназой. В-третьих, А-киназа и Са-киназы нередко фосфорилируют различные участки одного белка, который, таким образом, регулируется сразу и циклическим AMP, и ионами Са2 +.

В качестве примера взаимодействия путей Са2 + и сАМР рассмотрим киназу фосфорилазы скелетных мышц, роль которой в расщеплении гликогена мы уже обсуждали. Эта киназа фосфорилирует гликогенфосфорилазу, расщепляющую гликоген (см. рис. 12-26). Киназа фосфорилазы - мультисубъединичный фермент, но только одна из его четырех субъединиц фактически катализирует фосфорилирование: три другие - регуляторные и дают комплексу возможность активироваться и циклическим AMP, и ионами кальция. Каждая из четырех субъединиц, обозначаемых,, и, представлена в комплексе четырьмя копиями. -Субъединица осуществляет катализ;

чувствительность фермента к Са2+ определяется в основном -субъединицей-кальмодулином;

субъединицы же и - мишени для сАМР-зависимой регуляции;

обе они фосфорилируются А-киназой (рис. 12-31).

+ Тот же Са2 -сигнал, который инициирует мышечное сокращение, обеспечивает и достаточный для этого источник энергии в виде + глюкозы. Массированный выброс в цитозоль ионов Са2 из саркоплазматического ретикулума, вызывающий сокращение миофибрилл (разд.

11.1.11), одновременно повышает активность киназы фосфорилазы, изменяя конформацию ее -субъединицы, и в результате скорость расщепления гликогена за несколько секунд увеличивается в сотни раз. Кроме того, выброс Са2 ' активирует две Са-киназы, которые фосфорилируют и ингибируют гликогенсинтазу, прекращая синтез гликогена. Рассмотренная выше цепь реакций фосфорилирования, запускаемая в мышечных клетках адреналином, заранее приспосабливает их метаболизм к повышенным энергозатратам;

так, например, фосфорилирование киназы фосфорилазы А-киназой делает ее более чувствительной к Са2 + -для актива- Рис. 12-31. Сильно схематизированное изображение четырех субъединиц киназы фосфорилазы из мышц млекопитающих.

Каталитической активностью обладает -субъединица;

- и -субъединицы участвуют в регуляции этой активности циклическим AMP, а субъединица (кальмодулин)-в ее регуляции ионами Са2 +. В действительности полный ферментный комплекс содержит по четыре копии каждой субъединицы.

ции требуется теперь меньшее число ионов кальция, связанных с кальмоду лином.

Используя двумерный гель-электрофорез, в эукариотических клетках удается выявить сотни различных фосфорилированных белков.

Лишь малая их часть фосфорилируется известными киназами, большинство же киназ еще ждет своего открытия. Действительно, по оценкам, одна клетка млекопитающего может содержать более 100 различных протеинкиназ, регулирующих мириады внутриклеточных реакций. Помимо фосфорилирования существует и много других обратимых ковалентных модификаций, регулирующих активность белков, например метилирование - деметилирование, ацетилирование - деацетилирование, уридилирование-деуридилирование, аденилирование-деаденилирование. Кажется вероятным, что активность большинства клеточных белков, катализирующих протекание скорость-лимитирующих этапов в биологических процессах, регулируется с помощью той или иной из этих модификаций. Если же учесть, насколько сложны могут быть обратные связи в одном только метаболизме гликогена, станет ясно, что раскрытие механизмов этих важных регуляторных процессов представляет собой сложную задачу.

12- 12.4.5. cGMP тоже служит внутриклеточным посредником [27] сАМР - не единственный циклический нуклеотид, используемый для внутриклеточной сигнализации. Большинство животных клеток содержит также циклический гуанозинмонофосфат (cGMP, рис. 12-32), хотя его концентрация по крайней мере в 10 раз меньше концентрации сАМР. Известно, что cGMP служит активатором специфической протеинкиназы (G-киназы), фосфорилирующей в клетке определенные белки (см.

рис. 12-25), однако роль циклического GMP в передаче сигналов от рецепторов клеточной поверхности, за несколькими исключениями, не ясна.

Гуанилатциклаза, катализирующая образование cGMP из GTP, в отличие от аденилатциклазы обычно является растворимым ферментом и не сопряжена явным образом с поверхностными рецепторами, хотя уровень cGMP часто повышается при активации инозитолфосфолипидного пути.

Однако недавно в некоторых клетках были обнаружены формы гуанилатциклазы, связанные с плазматической мембраной, которые либо сопряжены с поверхностными рецепторами, либо сами выполняют их функцию.

Лучше всего сигнальная роль cGMP выяснена в реакции на свет палочек в сетчатке позвоночных, где cGMP прямо воздействует на Na+ каналы плазматической мембраны. В отсутствие света молекулы cGMP связаны с натриевыми каналами и удерживают их в открытом состоянии.

Свет активирует в мембранных дисках палочек родопсин;

активированный родопсин взаимодействует с G-белком трансдуцином, также активируя его. -Субъединица трансдуцина (T) в свою очередь активирует cGMP-фосфодиэстеразу, которая гидролизует cGMP, резко снижая его концентрацию в цитозоле, и молекулы cGMP, связанные с натриевыми каналами, отделяются от них, позволяя им закрыться. Таким образом, световой сигнал преобразуется в электрический (подробнее см. разд. 19.6.7). Это прямое управление ионными каналами, осуществляемое сGМР, - один из немногих известных случаев, когда циклический нуклеотид в клетках позвоночных действует независимо от протеинкиназы. Но этот случай не единственный;

другой такой пример - обонятельные рецепторные клетки носа. Связывание некоторых пахучих веществ со специфическими рецепторными белками в этих клетках активирует (через одну из форм G5-белка) аденилатциклазу;

это ведет к повышению концентрации сАМР в цитозоле, и сАМР непосредственно Рис. 12-32. Циклический GMP.

воздействует на натриевые каналы плазматической мембраны, открывая их и вызывая тем самым деполяризацию.

Несмотря на разницу в молекулярных деталях, все сигнальные системы, запускаемые рецепторами, сопряженными с G-белками, имеют ряд общих черт и основаны на сходных принципах. Все они, например, представляют собой сложные каскады или передаточные цепочки внутриклеточных посредников. Каковы же преимущества таких на первый взгляд запутанных систем, что они используются в столь многих типах клеток для столь разнообразных целей?

12.4.6. Использование вторичных посредников и ферментных каскадов позволяет в огромной степени усиливать реакцию на внеклеточные сигналы [28] В отличие от более прямых сигнальных систем, таких как системы стероидных гормонов, каталитические каскады внутриклеточных посредников предоставляют много возможностей для усиления и регулирования ответов на внеклеточные сигналы. Из рис. 12-33 видно, что, например, когда внешний лиганд активирует аденилатциклазу опосредованно, связываясь с рецептором, одна молекула рецептора может активировать много молекул СS-белка, каждая из которых способна активировать молекулу циклазы. В свою очередь каждая молекула аденилатциклазы превращает множество молекул АТР в сАМР. Такого же рода усиление происходит и в инозитолфосфо липидном пути. В результате наномолярные (10-9 М) концентрации внеклеточного лиганда нередко вызывают образование вторичных посредников, таких как сАМР или Са2+, в микромолярных (10~6 М) концентрациях. Так как сами эти молекулы являются аллостерическими эффекторами, активирующими определенные ферменты, одна внешняя сигнальная молекула способна вызвать изменения во многих тысячах молекул внутри клетки-мишени.

Кроме того, каждый белок в такой цепи может служить независимой мишенью для регуляторного воздействия, как, например, в каскаде расщепления гликогена в скелетных мышцах (разд. 12.4.1).

Работа такого рода «взрывных» метаболических каскадов должна жестко регулироваться. Не удивительно поэтому, что клетки обладают + эффективными механизмами для быстрого расщепления сАМР и для понижения концентрации Са2, а также для инактивации ферментов и транспортных белков, активированных при ответе на сигнал. Ясно, что быстрое удаление или инактивация сигнальных молекул необходимы для выключения клеточного ответа;

менее очевидно то, что они столь же важны и для его быстрого включения.

12- 12.4.7. Концентрация какого-либо вещества может быстро изменяться лишь в том случае, если оно имеет короткое время жизни [29] Если для клетки важно очень быстро изменять концентрацию каких-либо молекул (например, с AMP или Са2+), то эти молекулы должны непрерывно разрушаться или быстро удаляться каким-нибудь иным способом - другими словами, подвергаться быстрому обновлению. Рассмотрим, например, два внутриклеточных вещества X и Y, каждое из которых обычно представлено в клетке тысячей молекул. Пусть X имеет низкую оборачиваемость - каждую секунду разрушается и синтезируется 10 молекул X;

таким образом, среднее время жизни молекулы в клетке 100 с.

Скорость синтеза и распада Y в 10 раз больше, т.е. 100 молекул в секунду, и соответственно время жизни молекулы Y равно 10 с. Если Рас. 12-33. Сопряжение поверхностных рецепторов с активацией аденилатциклазы через G-белок позволяет не только преобразовывать внеклеточный сигнал во внутриклеточный, но и многократно его усиливать. Такого же рода усиление происходит при активации инозитолфосфолипидного пути. На первом этапе усиления для активации множества молекул GS-белка вовсе не обязательно длительное связывание сигнального лиганда с рецептором (см. разд. 12.3.5).

скорость синтеза обоих веществ увеличится в 10 раз, а скорость разрушения останется неизменной, то спустя 1 с число молекул Y в клетке возрастет почти на 900 (10-100 — 100), а число молекул Х-всего лишь на 90. В общем случае время, за которое концентрация каких-либо молекул пройдет половину пути от прежней равновесной концентрации до новой после ускорения или замедления их синтеза, равно обычному времени полужизни этих молекул - времени, за которое концентрация их уменьшилась бы вдвое, если бы их синтез прекратился (рис. 12-34).

Этот принцип справедлив как для малых молекул, так и для белков, как для внутриклеточных, так и для внеклеточных веществ. Время полужизни многих внутриклеточных белков, подвергающихся быстрому расщеплению или ковалентной модификации, составляет 2 ч и меньше, а у некоторых оно не превышает 10 мин. В большинстве случаев это белки с ключевыми регуляторними функциями, и концентрация их в клетке легко контролируется изменением скорости их синтеза.

Рис. 12-34. Относительная скорость изменения внутриклеточной концентрации молекул с различным временем полуобновления при уменьшении (А) или увеличении (Б) скорости их синтеза в 10 раз (теоретические кривые). В обоих случаях концентрация молекул, быстро разрушающихся в клетке (цветные линии), изменяется быстро, а концентрация молекул с большими периодами полуобновления - пропорционально более медленно. Цветные цифры справа - время полужизни различных молекул.

12.4.8. Клетки могут резко отвечать на плавное повышение концентрации внеклеточного сигнала [30] Некоторые реакции клеток на сигнальные молекулы бывают плавными (градуальными) и усиливаются прямо пропорционально увеличению концентрации лиганда. Таковы обычно первичные ответы клеток на стероидные гормоны, вероятно потому, что каждый рецепторный белок связывает одну молекулу гормона, а каждая специфическая узнаваемая последовательность ДНК в гормоночувствительном гене действует независимо (разд. 12.2.1). С повышением концентрации гормона пропорционально возрастает концентрация гормон-рецепторных комплексов, а значит, и число этих комплексов, присоединившихся к специфическим участкам генома. Клеточный ответ в этом случае будет градуальным и линейным.

Однако другие реакции клеток на увеличение концентрации сигнальных молекул могут начинаться более резко, а некоторые - даже практически по типу «всё или ничего». В последнем случае не наблюдается никакого ответа до тех пор, пока концентрация лиганда не достигнет определенного порогового уровня, а после достижения этого уровня сразу развивается максимальная реакция. Например, некоторые факторы роста действуют как сигналы типа «всё или ничего», заставляя клетку приступить к репликации ДНК, предшествующей клеточному делению. Каковы могут быть молекулярные основы такого резкого или даже внезапного ответа на плавно изменяющийся сигнал?

Один из возможных механизмов основан на принципе кооперативности, когда для активации какой-то макромолекулы-мишени необходимо присоединение к ней двух или нескольких внутриклеточных эффекторов (или их комплексов с рецептором). Например, при некоторых реакциях на стероидные гормоны для активации надлежащего гена, по-видимому, требуется одновременное связывание со специфическим участком хроматина нескольких гормон-рецепторных комплексов. В результате при увеличении концентрации гормона ген активируется более резко, чем если бы для его активации было достаточно одного такого комплекса Рис. 12-35. Наблюдаемый ответ клеток куриного яйцевода на стероидный гормон эстрадиол. Активированные рецепторы эстрадиола переходят в ядро и включают транскрипцию нескольких генов. Показана зависимость реакции от доли активированных рецепторов для двух из этих генов, кодирующих белки яйца - кональбумин и овальбумин. Линейная зависимость для кональбумина указывает на то, что ген этого белка включается одной молекулой активированного рецептора. Напротив, замедленное начало синтеза овальбумина с последующим крутым подъемом кривой означает, что для запуска транскрипции овальбуминового гена, вероятно, необходимо присоединение к нему более одной молекулы активированного рецептора (в данном случае двух молекул). (Из Е. R. Mulvihill, R. D. Palmiter, J. Biol. Chem. 252: 2060-2068, 1977, с изменениями.) (рис. 12-35). Аналогичный механизм кооперативности действует при активации с участием А-киназы и кальмодулина;

поскольку кальмодулин принимает активирующую конформацию только тогда, когда он свяжет два или больше ионов Са2+ (см. рис. 12-30), повышение внутриклеточной концентрации этих ионов всего лишь в 10 раз вызывает уже 50-кратное усиление активации. Такие кооперативные реакции становятся тем более резкими, чем больше молекул-эффекторов нужно для активации молекулы-мишени, и если их число становится достаточно большим, то дело может дойти до реакции типа «всё или ничего» (рис. 12-36 и 12-37).

Ответы становятся намного более резкими и в том случае, если лиганд активирует один фермент и одновременно подавляет активность другого, катализирующего обратную реакцию. Мы уже рассмотрели один пример такого регуляторного принципа, когда говорили о стимуляции распада гликогена в мышечных клетках, где повышение уровня сАМР одновременно активирует киназу фосфорилазы и ингибирует фосфопротеинфосфатазу, действующую в противоположном направлении (разд. 12.4.1, 12.4.2).

Другая возможная причина реакции типа «всё или ничего» на постепенное повышение концентрации сигнального лиганда - механизм положительной обратной связи. С помощью этого механизма нервные и мышечные клетки генерируют по принципу «всё или ничего» потенциалы действия при связывании нейромедиаторов. Например, при активации ацетилхолиновых рецепторов нервно-мышечного соединения в + плазматической мембране мышечной клетки открываются каналы для катионов, и переходящие внутрь клетки ионы Na вызывают местную деполяризацию мембраны. Если эта деполяризация достигает определенного порогового уровня, в том же участке мембраны открываются потенциалзависимые натриевые каналы, что приводит к дальнейшему притоку натрия;

в результате деполяризация усиливается, это приводит к открытию еще большего числа натриевых каналов и т. д. Так возникает потенциал действия, который распространяется по всей мембране мышечной клетки.

Рис. 12-36. Как видно из этого графика, кривые с крутым подъемом типа «всё или ничего» получаются в тех случаях, когда для активации макромолекулы-мишени необходимо присоединение к ней нескольких молекул-эффекторов. Приведены теоретические кривые для случаев активации при одновременном связывании различного числа (1, 2, 8 и 16) зффекторных молекул.

Рис. 12-37. Схема одного из возможных сигнальных механизмов, при котором следует ожидать реакции с резким порогом. В данном примере для образования активного белкового комплекса необходимо одновременное связывание восьми молекул сигнального лиганда. При низких концентрациях лиганда число активных комплексов будет возрастать пропорционально примерно восьмой степени концентрации.

Такой механизм положительной обратной связи может регулировать работу не только ионных каналов, но и рецепторов, действующих как ферменты. Представим себе, что некий сигнальный лиганд активирует фермент и что две или больше молекул продукта ферментативной реакции вновь связываются с тем же ферментом и еще больше активируют его (рис. 12-38). Количество продукта такого фермента будет расти очень медленно, пока концентрация активирующего лиганда не достигнет пороговой величины, при которой накопится достаточно продукта, чтобы вызвать самоускоряютщуюся активацию фермента. В этот момент концентрация продукта начнет резко возрастать. Благодаря такому механизму клетка может отвечать на постепенное изменение концентрации сигнального лиганда скачкообразным изменением количества определенного метаболита.

Механизм, проиллюстрированный на рис. 12-38, в принципе относительно прост, но он имеет важную особенность, которая делает его непригодным для одних целей и чрезвычайно ценным для других, Если такая система была «включена» в результате достаточного повышения концентрации сигнального лиганда, то она, как правило, продолжает находиться в этом состоянии даже тогда, когда сигнал падает ниже порогового уровня: вместо того чтобы все время отражать текущую величину сигнала, система обнаруживает своего рода «память». В качестве примера можно привести Са2+/кальмодулин-регулируемую полифункциональную протеинкиназу (разд. 12.4.3), которая, видимо, работает как активируемый ионами Са2+ молекулярный переключатель. При активации комплексами Са2+/кальмодулин эта киназа помимо других клеточных белков фосфорилирует также и сама себя. В результате такого самофосфорилирования ее активность становится независимой от ионов кальция и сохраняется на повышенном уровне дольше, чем вызвавший это повышение кальцевый сигнал. Такое состояние поддерживается до тех пор, пока не возрастет активность клеточных фосфатаз и фермент не будет ими «выключен».

Заключение Непрерывное и быстрое удаление из клетки свободных ионов Са2+ и сАМР делает возможными быстрые изменения концентраций этих двух внутриклеточных медиаторов в ответ на внеклеточные сигналы. Повышение уровня сАМР активирует сАМР-зависимые протеинкиназы (А киназы), которые фосфорилируют определенные белки-мишени. Этот эффект обратим, так как при падении уровня сАМР фосфорилированные белки быстро дефосфорилируются. Аналогичным образом, повышение внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция влияет на клетки благодаря связыванию Са2+ с кальмодулином, который при этом изме- Рис. 12-38. Схема механизма с «ускоряющей положительной обратной связью». Начальное связывание сигнального лиганда активирует фермент, а затем продукт ферментативной реакции связывается с самим ферментом, еще больше повышая его активность.

няет свою конформацию;

комплекс Са2+/кальмодулин активирует много различных белков-мишеней, в том числе Са2+ /кальмодулин-зависимые протеинкиназы (Сa2 + -киназы). Клетки каждого типа имеют свой характерный набор таких белков-мишеней, поэтому изменение уровня сАМР и Са2+ вызывает в клетках разного типа различные, характерные для каждого типа реакции. Использование с AMP и Са2 + в качестве вторичных посредников позволяет во много раз усиливать реакцию на внеклеточный сигнал и регулировать ее разнообразными способами.

12.5. Адаптация клеток-мишеней Реагируя на стимулы почти любого типа, клетки и целые организмы обычно могут воспринимать одинаковое относительное изменение внешнего сигнала в широком диапазоне его абсолютных величин. На клеточном уровне для этого необходимо, чтобы клетки-мишени, длительно подвергающиеся воздействию какого-то стимула, теряли способность реагировать на него с первоначальной чувствительностью. Это явление, называемое адаптацией или десенситизацией (десенсибилизацией), позволяет клеткам регулировать свою чувствительность к данному стимулу. В случае химических сигналов десенситизация дает клеткам возможность воспринимать именно изменения в концентрации сигнального лиганда (а не его абсолютную концентрацию).

Десенситизация к химическим сигналам достигается разными способами. Иногда она бывает результатом уменьшения числа поверхностных рецепторов или же их инактивации;

в других случаях это следствие изменения белков, участвующих в передаче сигнала уже после активации рецептора.

12- 12.5.1. Некоторые формы десенситизации - результат эндоцитоза поверхностных рецепторов [31] Белковые гормоны и факторы роста, присоединившиеся к поверхностным рецепторам клеток-мишеней, нередко захватываются клеткой путем эндоцитоза, опосредованного рецептором (разд. 6.5.7). Эндоцитозные пузырьки (эндосомы) впоследствии переносят свое содержимое в лизосомы, где лиганды, а иногда и их рецепторы подвергаются расщеплению гидролитическими ферментами. Этот процесс не только представляет собой важный путь разрушения некоторых сигнальных лигандов, но может играть существенную роль и в регулировании концентрации определенных рецепторных белков на поверхности клеток-мишеней. Хотя распад рецепторов и замена их новыми происходит непрерывно, в отсутствие лиганда время полужизни рецептора составляет около суток. Некоторые лиганды заметно повышают скорость расщепления рецепторов, вызывая эндоцитоз: например, у фибробластов человека, растущих в культуре без EGF, время полужизни рецепторов EGF около 10 ч, а при добавлении избытка EGF рецепторы расщепляются со временем полужизни 1 ч. При высоких концентрациях таких лигандов число поверхностных рецепторов постепенно уменьшается;

в результате снижается и чувствительность клетки к данному лиганду.

Большинство типов эндоцитируемых рецепторов, однако, «не доходят» до лизосом: они освобождаются в эндосомах от своих лигандов и затем возвращаются в плазматическую мембрану для дальнейшего использования (разд. 6.5.10). Но и в этом случае при повышении концентрации лиганда большая доля циркулирующих таким образом рецепторов оказывается внутри клетки и становится недосягаемой для внеклеточного лиганда. Эту форму десенситизации называют секвестрацией рецепторов.

12- 12- 12.5.2. Десенситизация часто бывает связана с фосфорилированием рецепторов [32] Для десенситизации многих рецепторов клеточной поверхности используется их обратимое фосфорилирование. Как уже говорилось ранее, эндоцитоз некоторых каталитических рецепторов (т.е. их удаление с поверхности или разрушение) зависит от их самофосфорилирования по тирозиновым остаткам (разд. 12.3.14). Другой пример - десенситизация эритроцитов лягушки при длительном воздействии адреналина. Их адренэргические рецепторы постепенно модифицируются так, что через несколько часов они уже не способны активировать аденилатциклазу;

инактивированные рецепторы удаляются с поверхности, по-видимому в эндосомы. Эта модификация состоит в фосфорилировании нескольких остатков серина в рецепторном белке (см. рис. 12-24), и ее осуществляет специальная протеинкиназа, которая может фосфорилировать только активированную форму рецептора. Судя по некоторым данным, фосфорилирование косвенно выключает функцию -рецепторов, позволяя им связываться с ингибиторным белком, что делает их неспособными активировать СS-белки. Родопсин, структурно родственный -адренэргическим рецепторам (разд. 12.3.12), инактивируется после фотоактивации с помощью сходного механизма: специфическая родопсинкиназа фосфорилирует его активированные молекулы, позволяя им связаться с ингибиторным белком аррестином, который не дает им возможности активировать G-белок трансдуцин. Это, однако, лишь один из механизмов, используемый фоторецепторами для адаптации к свету (разд. 19.6.8).

12.5.3. Некоторые формы десенситизации связаны с изменениями не в рецепторах, а в G-белках [33] Хотя большинство известных механизмов десенситизации обусловлено модификацией рецепторов, в принципе десенситизация может быть следствием изменений в любом из компонентов сигнального пути, Показано, что в некоторых случаях она связана с изменениями в G-белке.

Например, если культуру фибробластов инкубировать с простагландином PGE1, который в норме активирует аденилатциклазу через GS-белок, клетки вскоре станут нечувствительными не только к PGE1, но и к другим лигандам, рецепторы которых действуют через GS-аденилат - циклазный путь (это называется гетерологичной десенситизацией в отличие от гомологичной, при которой рецепторы эндоцитируются или инактивируются, так что клетки теряют чувствительность только к одному лиганду - тому, который связывается с этими рецепторами). Когда GS-белки из десенситизированных фибробластов добавляли к мембранам мутантных клеток, лишенных собственного С8-белка, они оказывались неэффективными (по сравнению с нормальными GS-белками) активаторами аденилатциклазы. Природа изменений в GS-белке у десенситизированных к PGE1 фибробластов еще не известна, но если и здесь причиной окажется фосфорилирование, это не вызовет удивления.

Изменения в G-белках позволили бы также объяснить некоторые аспекты наркомании. У морфинистов клетки-мишени в мозгу десенситизированы к морфину (рис. 12-39), поэтому для достижения того же Рис. 12-39. Структура морфина, получаемого из маковых зерен. Почему некоторые из наших клеток имеют рецепторы для препаратов, подобных морфину? Фармакологи давно предполагали, что морфин имитирует какие-то эндогенные сигнальные молекулы, регулирующие восприятие боли и настроение. В 1975 г. из мозга свиньи были выделены два пептида с морфиноподобным действием, названные энкефалинамн.

Вскоре из гипофиза и других тканей удалось выделить более длинные пептиды, получившие название эндорфинов. Все эти так называемые эндогенные опиаты содержат общую последовательность из 4 аминокислот и связываются с теми же поверхностными рецепторами, что и морфин (и родственные наркотики). Однако в отличие от морфина они быстро разрушаются в организме и поэтому не накапливаются в количествах, достаточных для развития привыкания, наблюдаемого у морфинистов.

Рис. 12-40. Четыре возможных способа десенситизации клеток-мишеней при длительном воздействии сигнальной молекулы. Изображен рецептор, в норме активирующий или ингибирующий эффекторный фермент (или ионный канал) через G-белок. Хотя механизмы инактивации, показанные здесь для рецептора и для G-белка, включают фосфорилирование, возможны и другие виды модификаций (они описаны при обсуждении бактериального хемотаксиса, разд. 12.5.4). Кроме того, в инактивации рецептора путем фосфорилирования не всегда участвует белок- ингибитор.

Рис. 12-41. Фотографии бактерий Salmonella typhimurium, собирающихся у кончика стеклянного капилляра с аминокислотой серином (А) и избегающих капилляра с фенолом (Б). Снимки сделаны через 5 мин после внесения капилляров в чашки с бактериями. Такой тест-простой способ демонстрации хемотаксиса. (В. A. Rubik, D.E. Koshland, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 2820-2824, 1978.) эффекта обезболивания или эйфории требуется значительно большая доза наркотика, чем нормальным людям. Десенситизированные клетки, однако, имеют нормальный уровень функциональных поверхностных рецепторов морфина (опиатных рецепторов). Механизм десенситизации изучали с помощью морфин-чувствительных линий нервных клеток. Морфиновые рецепторы на поверхности этих клеток вызывают активацию Gi белков (разд. 12.3.6), которые ингибируют аденилатциклазу и снижают таким образом уровень сАМР. Клетки, культивируемые в присутствии постоянных концентраций морфина, десенситизируются, так что аденилатциклазная активность и уровень внутриклеточного сАМР у них возвращаются к норме, хотя морфин по-прежнему связывается поверхностными рецепторами. Если теперь удалить морфин из культуральной среды, произойдет заметное повышение активности аденилатциклазы и концентрация сАМР внутри клетки необычно возрастет. Возможно, именно избыток сАМР вызывает те крайне неприятные симптомы, которые возникают при резком прекращении употребления наркотика (беспокойство, потливость, дрожь и т.д.). Действительные механизмы привыкания к морфину достоверно не известны, но предполагают, что они связаны с изменениями Gi-белков.

Различные механизмы десенсибилизации клеток-мишеней, которые мы рассмотрели, суммированы на рис. 12-40.

12.5.4. Адаптация играет центральную роль в бактериальном хемотаксисе [34] Многие виды химической сигнализации между клетками многоклеточных животных могли возникнуть из тех приспособлений, с помощью которых одноклеточные организмы реагируют на химические изменения в окружающей среде. В самом деле, как уже говорилось, некоторые внутриклеточные посредники используются организмами того и другого типа. К наиболее изученным реакциям одноклеточных на внешние сигналы относятся явления хемотаксиса, при которых движение клетки направляется к источнику определенного вещества или от него.

Хемотаксис эукариотических клеток рассмотрен в разд. 14.3.2 на примере клеточной стадии слизевика Dictyostelium discoideum и в разд. 11.6.4 на примере нейтрофилов человека. Мы закончим эту главу описанием бактериального хемотаксиса, который в основном благодаря успехам генетического анализа - особенно четко и элегантно иллюстрирует центральную роль адаптации в ответах на химические сигналы.

Подвижные бактерии плывут в сторону более высоких концентраций питательных субстратов (аттрактантов), например Сахаров и аминокислот, и «убегают» от высоких концентраций вредных веществ (репеллентов) (рис. 12-41). Это сравнительно простое, но весьма целесообраз- Рис. 12-42. Схема «мотора», вращающего жгутик Е. coli. «Ротором» служит белковый диск, расположенный в плазматической мембране.

Под действием трансмембранного протонного градиента он быстро вращается (около 100 об/с) в липидном бислое относительно другого белкового диска («статора»). «Ротор» расположен на одной оси с крючком и жгутиком и заставляет их вращаться. Белковый «подшипник» служит для герметизации наружной мембраны в месте прохождения через нее вращающегося стержня. На рисунке неподвижные детали окрашены, а вращающиеся оставлены белыми (По М. L. de Pamphilis, J. Adler, J. Bacteriol. 105: 384-395;

396-407, 1971, с изменениями.) ное поведение - хемотаксис - наиболее интенсивно изучалось на бактериях E.coli и Salmonella typhimurium. Мы будем говорить здесь в основном о хемотаксисе по направлению к аттрактантам;

движение прочь от репеллентов обеспечивается теми же механизмами, но действующими «наоборот».

Бактерии плавают с помощью жгутиков, устроенных значительно проще, чем жгутики эукариотических клеток (разд. 11.3.2).

Бактериальный жгутик - это спиральная трубочка из одинаковых субъединиц белка флагеллина. Основание каждого жгутика прикреплено с помощью короткого гибкого крючка к маленькому белковому диску, погруженному в бактериальную мембрану. Этот диск составляет часть микроскопического «мотора», который приводит в быстрое вращение спиральный жгутик, используя энергию трансмембранного протонного градиента (рис. 12-42).

Поскольку жгутики на поверхности бактерии закручены в спираль в одну определенную сторону, направление их вращения не безразлично для движения. Вращение против часовой стрелки позволяет всем жгутикам собраться в общий пучок, так что бактерия равномерно плывет в одном направлении. Но при вращении по часовой стрелке пучок рассыпается на отдельные жгутики и бактерия начинает беспорядочно кувыркаться на месте (рис. 12-43). В отсутствие внешних стимулов вращение дисков изменяется на противоположное каждые несколько секунд, что приводит к характерной картине: прямолинейное движение прерывается резкими изменениями направления в периоды кувыркания (рис. 12-44, А\ Аттрактанты и репелленты видоизменяют обычное движение бактерий. Они присоединяются к специфическим белковым рецепторам и влияют на частоту кувырканий, увеличивая или уменьшая интервал между двумя последовательными сменами направления, в котором вращаются жгутики. Когда бактерии плывут в сторону большей концентрации аттрактанта, они кувыркаются реже, чем тогда, когда плывут в противоположную сторону (или когда вообще нет градиента). Поскольку периоды прямолинейного движения длиннее при перемещении «вверх» по градиенту концентрации, бактерии будут постепенно приближаться к источнику аттрактанта (рис. 12-44, ). И наоборот, встретив возрастающую концентрацию репеллента, бактерии будут кувыркаться чаще обычного и в результате постепенно удаляться от его источника.

Рис. 12-43. Схема расположения жгутиков Е. coli при движении клетки. Если жгутики вращаются против часовой стрелки (А), то они собираются в единый пучок, который действует как пропеллер и обеспечивает прямолинейное движение. При вращении жгутика по часовой стрелке (Б) пучок рассыпается, и бактерия начинает кувыркаться.

Рис. 12-44. Траектории плывущих бактерий. В отсутствие хемотаксического сигнала (А) периоды прямолинейного движения прерываются короткими периодами кувыркания, которые случайным образом изменяют направление движения. В присутствии аттрактанта (Б) кувыркание частично подавляется, когда бактерия случайно движется в сторону большей его концентрации. Это ведет к постепенному приближению бактерии к источнику аттрактанта.

В естественных условиях бактерии улавливают пространственные градиенты различных веществ, замечая изменения их концентрации во времени при своем равномерном передвижении с места на место (из-за малых собственных размеров бактериям было бы чрезвычайно трудно выявлять пространственные градиенты путем сравнения концентраций на разных концах клетки). В лабораторных условиях изменения концентраций во времени можно моделировать быстрым добавлением или удалением какого-либо вещества. Если добавить в культуральную среду аттрактант, кувыркание, как и следовало ожидать, быстро (за десятые доли секунды) подавляется, однако через некоторое время, несмотря на присутствие аттрактанта, частота кувыркания возвращается к норме. Бактерии остаются в этом адаптированном состоянии до тех пор, пока концентрация аттрактанта не изменится снова: добавление аттрактанта быстро подавляет кувыркания, а его удаление - усиливает, пока бактерия не приспособится к новому уровню. Адаптация играет в хемотаксисе важнейшую роль, так как позволяет бактериям реагировать не на постоянную абсолютную величину, а на изменение концентрации аттрактанта и продолжать движение, когда оно происходит в нужном направлении.

12- 12.5.5. В бактериальном хемотаксисе участвуют четыре гомологичных трансмембранных рецептора [35] Раскрытие молекулярных механизмов бактериального хемотаксиса стало возможным в основном благодаря выделению и анализу мутантов с различными нарушениями этого процесса. Таким путем было показано, что хемотаксические реакции на ряд веществ зависят от небольшого семейства близко родственных трансмембранных белков-рецепторов, ответственных за передачу сигналов через плазматическую мембрану. Эти хемотаксические рецепторы метилируются во время адаптации (см. ниже), и поэтому их часто называют метил-акцептирующими белками хемотаксиса (рис. 12-45).

В плазматической мембране есть четыре типа рецепторов хемотаксиса и каждый из них обусловливает ответ на узкую группу химических Рис. 12-45. Структура хемотаксического рецептора. Два участка полипептидной цепи, подвергающиеся метилированию, содержат весьма консервативную последовательность из 13 аминокислот.

Этот рисунок отражает структуру рецептора для аспартата, однако сходное строение имеют хемотаксические рецепторы всех четырех типов. (По A. F. Russo, D. Е. Koshland, Jr., Science 220: 1016-1020, 1983. Copyright 1983 by the A A AS.) Рис. 12-46. Этапы преобразования сигнала при хемотаксисе у бактерий. Химические аттрактанты связываются с хемотаксическими рецепторами типа 1 или 2 в плазматической мембране или с периплазматическими субстрат-связывающими белками, которые затем присоединяются к хемотаксическим рецепторам типа 3 или 4. Это приводит к активации рецепторов, и они передают внутрь клетки сигнал, заставляющий «мотор» жгутика вращаться против часовой стрелки;

в результате кувыркание подавляется и периоды прямолинейного движения становятся более длительными. Аттрактанты проникают в периплазматическое пространство снаружи через широкие каналы во внешней мембране (не показано).

соединений. Два опосредуют реакцию на серии и на аспартат соответственно, прямо связывая эти аминокислоты и преобразуя это событие во внутриклеточный сигнал. Два других передают ответ на сахара и дипептиды, но они активируются косвенно через периплазматические субстрат связывающие белки, которые участвуют также в транспорте Сахаров и дипептидов через плазматическую мембрану (разд. 6.4.13). Эти белки, «плавающие» в периплазматическом пространстве (между внешней мембраной бактерии и плазматической мембраной), специфически связывают сахара и дипептиды и затем образуют комплексы с подходящими рецепторами хемотаксиса в плазматической мембране, активируя их (рис. 12-46).

Хотя в системах транспорта этих Сахаров и дипептидов и в соответствующих системах хемотаксиса используются одни и те же первичные рецепторы (субстрат-связывающие белки), в остальном их механизмы различны. На это указывают мутации, инактивирующие транспорт, но не влияющие на хемотаксис, и наоборот.

12.5.6. Адаптация обусловлена метилированием белков [35] Имеются убедительные данные в пользу того, что адаптацию при хемотаксисе бактерий обеспечивает ковалентное присоединение метальной группы к белковым рецепторам хемотаксиса. Если метилирование блокировано мутацией, адаптации не происходит, и тогда присутствие аттрактанта подавляет кувыркание в течение нескольких дней, а не минут. Таким образом, активация рецепторов хемотаксиса имеет два различных (и раздельных) следствия: 1) быстро развивается возбуждение, так как активированный рецептор создает внутриклеточный сигнал, заставляющий мотор жгутика продолжать вращение против часовой стрелки, и в результате клетка продвигается вперед без кувырканий;

2) происходит медленная адаптация, обусловленная тем, что активированный рецептор становится доступным для метилирования цитоплазмати-ческими ферментами, и за несколько минут его активация сходит на нет (рис. 12-47).

Метилирование рецептора катализируется растворимым ферментом (метилтрансферазой), который переносит метильную группу на свободный карбоксил остатка глутаминовой кислоты в активированном рецеп- Рис. 12-47. Последовательные процессы активации и адаптации (в результате метилирования) хемотаксического рецептора. Обратите внимание, что активность рецептора (а значит, и частота кувырканий бактерии) в исходном и в адаптированном состоянии одинакова. Для простоты рецептор показан с двумя участками метилирования, в действительности же у каждого рецептора их четыре. При повышении концентрации лиганда доля времени, когда рецептор занят лигандом, увеличивается. Более высокая концентрация лиганда вызывает большее конформационное изменение рецептора, чем низкая, и приближает его состояние к предельно измененному. Однако медленное усиление метилирования через несколько минут восстанавливает исходную конформацию, причем большей концентрации аттрактанта соответствует большее число метильных групп на рецепторе. Рецептор теперь адаптирован. Хотя на схеме показано прямое присоединение лиганда к рецептору, в некоторых случаях он сначала присоединяется к периплазматическому субстрат-связывающему белку, который затем взаимодействует с рецептором.

торе (рис. 12-48). На один рецептор может быть перенесено до четырех метильных групп;

степень метилирования повышается с ростом концентрации аттрактанта, когда каждый рецептор в течение большей доли всего времени находится в комплексе с лигандом. При удалении аттрактанта рецептор деметилируется растворимым ферментом (рис. 12-48). Хотя уровень метилирования во время хемотаксических реакций изменяется, у адаптированных бактерий он остается постоянным, так как при этом достигается точное равновесие между скоростями метилирования и деметилирования.

12.5.7. Активация рецептора и изменения во вращении жгутиков сопряжены через каскад фосфорилирования белков [36] Активация рецептора хемотаксиса аттрактантами и репеллентами должна создавать внутриклеточный сигнал, влияющий на направление вращения жгутика. Генетические исследования показали, что в передаче этого сигнала участвуют четыре цитоплазматических белка - CheA, CheW, CheY я CheZ. CheY и CheZ действуют в конце зффекторного пути и контролируют направление вращения жгутика, видимо, связываясь с его «мотором». CheY дает сигнал вращаться по часовой стрелке, и бактерия начинает кувыркаться. Мутанты, у которых функциональный CheY утрачен, плавают совсем без кувыркания. CheZ оказывает действие, противоположное CheY, заставляя «мотор» вращаться против часовой стрелки, что ведет к прямолинейному движению клеток. Белки CheA и, возможно, CheW передают сигнал от рецептора хемотаксиса белкам CheY и CheZ с помощью механизма, включающего фосфорилирование и дефосфорилирование белков.

Рис. 12-48. Реакции метилирования и деметилирования белковых хемотаксических рецепторов. С помощью эфирных связей к каждому рецептору может присоединиться до четырех метильных групп.

Рис. 12-49. Система фосфорилирования, с помощью которой, как полагают, хемотаксические рецепторы способны контролировать «мотор» жгутика. Связывание репеллента активирует рецептор, что приводит к кратковременному фосфорилированию CheA. CheA быстро переносит свой ковалентне связанный высокоэнергетический фосфат прямо на CheY. CheY-фосфат связывается с «мотором» жгутика и заставляет его вращаться по часовой стрелке, вызывая кувыркание. Связывание аттрактанта дает противоположный эффект, снижая фосфорилирование CheA и CheY, и вращение жгутика против часовой стрелки приводит к прямолинейному движению. CheZ ускоряет дефосфорилирование CheY-фосфата, действуя как антагонист CheY. Каждый из этих фосфорилированных интермедиатов живет около 10 с, что позволяет бактерии быстро реагировать на изменение среды (см. рис. 12-34). Как хемотаксический рецептор взаимодействует с CheA и какую роль в процессе играет CheW, пока не известно.

Опыты in vitro с очищенными белками показали, что CheA-это протеинкиназа, которая в присутствии АТР фосфорилирует сама себя, а затем быстро переносит фосфатную группу на CheY. Фосфорилирован-ный CheY дефосфорилируется с участием CheZ, который, как уже говорилось, является антагонистом CheY in vivo. По-видимому, CheY активируется (и вызывает кувыркание), будучи фосфорилирован киназой CheA, а инактивируется (что позволяет бактерии плыть прямо), когда его дефосфорилирует CheZ. Как полагают, при связывании хемотаксическими рецепторами аттрактанта фосфорилирование CheA и CheY снижается, CheY инактивируется и бактерия меньше кувыркается и дольше плывет по прямой линии;

репелленты же, напротив, активируют CheA-зависимое фосфорилирование CheY, что приводит к активации CheY и стимулирует кувыркание (рис. 12-49).

Этот же набор белков осуществляет адаптацию. CheA фосфорилирует фермент, деметилирующий рецепторы хемотаксиса (см. рис. 12 48), повышая его активность и обеспечивая тем самым регуляцию хемотаксических рецепторов по принципу обратной связи.

По-видимому, все гены и белки, участвующие в бактериальном хемотаксисе, уже идентифицированы, а большинство белков секвенировано и выделено в больших количествах. Похоже, что мы быстро приближаемся к выяснению практически полной молекулярной картины этой формы адаптивного поведения.

Заключение Временно и обратимо адаптируясь к высоким концентрациям сигнального лиганда, клетки могут регулировать свою чувствительность к величине стимула, отвечая, таким образом, на изменение концентрации лиганда, а не на ее абсолютную величину. Адаптация достигается разными способами: 1) связанный лиганд может вызывать переход рецепторов внутрь клетки, где они некоторое время остаются в «скрытом» состоянии или же разрушаются в лизосомах;

2) активированные рецепторы могут обратимо инактивироватъся путем фосфорилирования или метилирования;

3) нерецепторные белки сигнального пути (типа G-белков) тоже могут обратимо инактивироватъся с помощью неясных пока механизмов. Пример адаптации, лучше всего изученный на молекулярном уровне, - это бактериальный хемотаксис: обратимое метилирование ключевого мембранного белка в цепи передачи сигнала позволяет клеткам передвигаться в оптимальном направлении.

Литература Цитированная 1. Smith E.L. et al. Principles of Biochemistry: Mammalian Biochemistry, 7th ed, pp. 355 619. New York, McGraw-Hill, 1983.

Snyder S. H. The molecular basis of communication between cells. Sci. Am., 253 (4), 132-140, 1985.

2. Norman A. W., Litwack G. Hormones. San Diego, CA, Academic, 1987.

Wilson J. D., Foster D. W. Williams' Textbook of Endocrinology, 7th ed. Philadelphia, Saunders, 1985.

3. Simpson I. A., Cushman S. W. Hormonal regulation of mammalian glucose transport. Annu. Rev. Biochem., 55, 1059-1089, 1986.

4. Beer D. J., Matloff S. M., Rocklin R. E. The influence of histamine in immune and inflammatory responses. Adv. Immunol., 35, 209-268, 1984.

Gospodarowicz D., Cheng J., Lui G. M., Baird A., Bohlen P. Isolation of brain fibroblast growth factor by heparin sepharose affinity chromatography: identity with pituitary fibroblast growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6963-6967, 1984.

5. Smith W. L., Borgeat P. The eicosanoids: prostaglandins, thromboxanes, leukotrienes, and hydroxyeicosaenoic acids. In: Biochemistry of Lipids and Membranes (D. E. Vance, J. E. Vance, eds.), pp. 325-360. Menlo Park, CA, Benjamin-Cummings, 1985.

6. Evans R. M. The steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science, 240, 889-895, 1988.

Gehring U. Steroid hormone receptors: biochemistry, genetics, and molecular biology. Trends Biochem. Sci., 12, 399-402, 1987.

Ivarie R. D., O'Farrell P. H. The glucocorticoid domain: steroid-mediated changes in the rate of synthesis of rat hepatoma proteins. Cell, 13, 41-55, 1978.

Yamamoto K. R. Steroid receptor regulated transcription of specific genes and genenetworks. Annu. Rev. Genet., 19, 209-252, 1985.

7. Ashburner M., Chihara C., Meltzer P., Richards G. Temporal control of puffing activity in polytene chromosomes. Cold Spring Harbor Symp.

Quant. Biol., 38, 655-662, 1974.

8. Attardi В., Ohno S. Physical properties of androgen receptors in brain cytosol from normal and testicular feminized (Tfrn/y) mice.

Endocrinology, 103, 760-770, 1978.

9. Berridge M. The molecular basis of communication within the cell. Sci. Am., 253 (4), 142-152, 1985.

Kahn C. R. Membrane receptors for hormones and neurotransmitters. J. Cell Biol., 70, 261-286, 1976.

Levitski A. Receptors: A Quantitative Approach. Menlo Park, Ca. Benjamin-Cummings, 1984.

Rees Smith В., Buckland P. R. Structure-function relations of the thyrotroprin receptor. In: Receptors, Antibodies and Disease. Ciba Foundation Symposium 90 (D. Evered, J. Whelan, eds.), pp. 114-132. London, Pitman, 1982.

Snyder S. H. The molecular basis of communication between cells. Sci. Am., 253 (4), 132-140, 1985.

10. Pastan I. Cyclic AMP. Sci. Am., 227(2), 97-105, 1972.

Sutherland E. W. Studies on the mechanism of hormone action. Science, 177, 401-408, 1972.

11. Schramm M., Selinger Z. Message transmission: receptor controlled adenylate cyclase system. Science, 225, 1350-1356, 1984.

12. Casperson G.F., Bourne H. R. Biochemical and molecular genetic analysis of hormone-sensitive adenylate cyclase. Annu. Rev. Pharmacol.

Toxicol., 27, 371-384, 1987.

Feder D. et al. Resonstruction of beta1-adrenoceptor-dependent adenylate cyclase from purified components. EMBO J. 5, 1509-1514, 1986.

Rodbell M. The role of hormone receptors and GTP-regulatory proteins in membrane transduction. Nature, 284, 17-22, 1980.

13. Oilman A.G. G proteins and dual control of afenylate cyclase. Cell, 36, 577-579, 1984.

Gilman A. G. G proteins: transducers of receptor-generated signals. Annu. Rev.

Biochem., 56, 615 649, 1987. Lai C.-Y. The chemistry and biology of cholera toxin. CRC Crit. Rev. Biochem., 9, 171-206, 1980.

Levitzki A. From epinephrine to cyclic AMP. Science, 241, 800-806, 1988. Stryer L., Bourne H. R. G proteins: a family of signal transducers.

Annu. Rev. Cell Biol., 2, 391-419, 1986.

14. Carafoli E. Intracellular calcium homeostasis. Annu. Rev. Biochem., 56, 395-433, 1987.

Carafoli E., Penninston J.T. The calcium signal. Sci. Am., 253(5), 70-78, 1985.

Evered D., Whelan J., eds. Calcium and the Cell. Ciba Foundation Symposium 122. Chichester, U.K., Wiley, 1986.

Volpe P. et al. "Calciosome", a cytoplasmic organelle: the inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive Ca2 + store of nonmuscle cells? Proc. Natl.

Acad. Sci. Usa, 85, 1091-1095, 1988.

15. Augustine G.J., Charlton M.P., Smith S.J. Calcium action in synaptic transmitter release. Annu. Rev. Neurosci., 10, 633-639, 1987.

Heilbrunn L. V., Wiercenski F. J. The action of various cations on muscle protoplasm. J. Cell. Соmр. Physiol., 29, 15-32, 1947.

16. Berridge M.J. Inositol lipids and calcium signalling. Pro. R. Soc. Lond. (Biol.), 234, 359-378, 1988.

Cockcroft S. Polyphosphoinositide phosphodiesterase: regulation by a novel guanine nucleotide binding protein, Gp. Trends Biochem. Sci., 12, 75-78, 1987.

Majerus P. W. et al. The metabolism of phosphoinositide-derived messenger molecules. Science, 234, 1519-1526, 1986.

Michell R. H., Putney J. W., eds. Inositol Lipids in Cellular Signaling. Current Communications in Molecular Biology. Cold Spring Harbor, NY. Cold Spring Harbor Laboratory, 1987.

Sekar M. C., Hokin L. L. 1 he role of phosphoinositides in signal transduction. J. Membr. Biol., 89, 193-210, 1986.

Woods N. M., Cuthbertson K. S. R., Cobbold P. H. Repetitive transient rises incytoplasmatic free calcium in hormone-stimulated hepatocytes.

Nature, 319, 600-602, 1986.

17. Angel P. et al. Phorbol ester-inducible genes contain a common cis element recognized by a TPA-modulated /raws-acting factor. Cell, 49, 729 739, 1987.

Bell R. M. Protein kinase С activation by diacylglycerol second messengers. Cell, 45, 631-632, 1986.

Lee W., Mitchell P., Tijan R. Purified transcription factor AP-1 interacts with TPA-inducible enhancer elements. Cell, 49, 741-752, 1987.

Nishizuka Y. Studies and perspectives of protein kinase C. Science, 233, 305-312, 1986.

Parker P. J. et al. The complete primary structure of protein kinase С - the major phorbol ester receptor. Science, 233, 853-859, 1986.

18. Barbacid M. ras genes. Annu. Rev. Biochem., 56, 779-827, 1987.

19. Dohlman H.G., Caron M.G., Lefkowitz R.J. A family of receptors coupled to guanine nucleotide regulatory proteins. Biochemistry, 26, 2657 2664, 1987.

Dunlap K., Holz G. G., Rane S. G. G proteins as regulators of ion channel function. Trends Neurosci., 10, 241-244, 1987.

Kubo T. et al. Cloning, sequencing and expression of complementary DNA encoding the muscarinic acetylcholine receptor. Nature, 323, 411 416, 1986.

Masu Y. et al. cDNA cloning of bovine substance-K receptor through oocyte expression system. Nature, 329, 836-838, 1987.

Stryer L. The molecules of visual excitation. Sci. Am., 257(1), 42-50, 1987.

20. Carpenter G. Receptors for epidermal growth factor and other polypeptide mitogens. Annu. Rev. Biochem., 56, 881-914, 1987.

Kaplan D. R. et al. Common elements in growth factor stimulation and oncogenic transformation: 85 kd phosphoprotein and phosphatidylinositol kinase activity. Cell, 50, 1021-1029, 1987.

Rosen O.M. After insulin binds. Science, 237, 1452-1458, 1987. Schlessinger J. Allosteric regulation of the epidermal growth factor receptor kinase. J. Cell Biol., 103, 2067-2072, 1986.

Yarden Y, Ullrich A. Growth factor receptor tyrosine kinases. Annu. Rev. Biochem., 57, 443-478, 1988.

21. Deuel T.F. Polypeptide growth factors: roles in normal and abnormal cell growth. Annu. Rev. Cell Biol., 3, 443-492, 1987.

Hanks S. K., Quinn A. M., Hunter T. The protein kinase family: conserved features and deduced phylogeny of the catalytic domains. Science, 241, 42-52, 1988. Hunter T. A thousand and one protein kinases. Cell, 50, 823-829, 1987.

Ullrich A. et al. Human insulin receptor and its relationship to the tyrosine kinase family of oncogenes. Nature, 313, 756-761, 1985.

22. Cohen P. Control of Enzyme Activity, 2nd ed. London. Chapman and Hall, 1983. Edelman A.M., Blumenthal D.K., Krebs E. G. Protein serine/threonine kinases. Annu. Rev. Biochem, 56, 567-613, 1987.

23. Cohen P. Protein phosphorylation and the control of glycogen metabolism in skeletal muscle. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.), 302, 13-25, 1983.

Montminy M. R., Bilezikjian L. M. Binding of a nuclear protein to the cyclic-AMP response of the somatostatin gene. Nature, 328, 175-178, 1987.

Pilkis S. J., El-Maghrabi M. R., Claus Т. Н. Hormonal regulation of hepatic gluconeogenesis and glycolysis. Annu. Rev. Biochem, 57, 755 784, 1988.

Smith S. В., White H. D.. Siegel J. В., Krebs E. G. Cyclic AMP-dependent protein kinase I: cyclic nucleotide binding, structural changes, and release of the catalytic subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1591-1595, 1981.

24. Alemany S., Pelech S., Brier ley С. Н., Cohen P. The protein phosphatases involved in cellular regulation. Evidence that dephosphorylation of glycogen phosphorylase and glycogen synthase in the glycogen and microsomal fractions of rat liver are catalysed by the same enzyme: protein phosphatase-1. Eur. J. Biochem., 156, 101-110, 1986.

Ingebritsen T.S., Cohen P. Protein phosphatases: properties and role in cellular regulation. Science, 221, 331 338, 1983.

25. Baku Y.S. et al. Three-dimensional structure of calmodulin. Nature, 315, 37-40, 1985.

Cheung W.Y. Calmodulin. Sci. Am., 246(6), 48-56, 1982.

Gerday C., Gilles R., Bolis L., eds. Calcium and Calcium Binding Proteins. Berlin, Springer-Verlag, 1988.

Klee C.B., Crouch Т.Н., Richman P.O. Calmodulin. Annu. Rev. Biochem., 49, 489-515, 1980.

26. Cohen P. Protein phosphorylation and hormone action. Proc. R. Soc. Lond. (Biol.), 234 115-144, 1988.

27. Golberg N. D., Haddox M. K. Cyclic GMP metabolism and involvement in biological regulation. Annu. Rev. Biochem., 46, 823 896, 1977.

Nakamura Т., Gold G. H. A cyclic nucleotide-gated conductance in olfactory receptor cilia. Nature, 325, 442-444, 1987.

Schnapf J.L., Bay lor D.A. How photoreceptor cells respond to light. Sci. Am., 256, (4), 40-47, 1987.

Stryer L. Cyclic GMP cascade of vision. Annu. Rev. Neurosci., 9, 87-119, 1986.

28. Cohen P. Protein phosphorylation and hormone action. Proc. R. Soc, Lond. (Biol.), 234, 115-144, 1988.

29. Schimke R. T. On the roles of synthesis and degradation in regulation of enzyme levels in mammalian tissues. Curr. Top. Cell. Regul., 1, 77 124, 1969.

30. Lewis J., Slack J., Wolpert L. Thresholds in development. J. Theor. Biol., 65, 579-590, 1977.

Miller S. G., Kennedy M. B. Regulation of brain type II Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase by autophosphorylation: a Ca2 +-triggered molecular switch. Cell, 44, 861-870, 1986.

Mulvihill E. R., Palmiter R. D. Relationship of nuclear estrogen receptor levels to induction of ovalbumin and conalbumin mRNA in chick oviduct. J. Biol. Chem., 252, 2060-2068, 1977.

31. Lefkowitz R.J., ed. Receptor regulation. Receptors and Recognition. Series B, Vol. 13. London, Chapman and Hall, 1981.

Soderquist A.M., Carpenter G. Biosynthesis and metabolic degradation of receptors for epidermal growth factor. J. Memb. Biol., 90, 97-105, 1986.

32. Sibley D. R., Benovic J. L., Caron M. G., Lefkowitz R. J. Regulation of transmembrane signaling by receptor phosphorylation. Cell, 48, 913-922, 1987.

33. Kassis S., Fishman P. H. Different mechanisms of desensitization of adenylate cyclase by isoproterenol and prostaglandin Et in human fibroblasts: role of regulatory components in desensitization. J. Biol. Chem., 257, 5312-5318, 1982.

Klee W.A., Sharma S.K., Nirenberg M. Opiate receptors as regulators of adenylate cyclase. Life Sci., 16, 1869-1874, 1975.

Snyder S.H. Opiate receptors and internal opiates. Sci. Am., 236(3), 44-56, 1977.

34. Adler J. The sensing of chemicals by bacteria. Sci. Am., 234(4), 40-47, 1976. Berg H. How bacteria swim. Sci. Am., 233(2), 36-44, 1975.

35. Koshlad D. E., Jr. Biochemistry of sensing adaptation in a simple bacterial system. Annu. Rev. Biochem., 50, 765-782, 1981.

Russo A.F., Koshland D.E. Receptor modification and absolute adaptation in bacterial sensing. In: Sensing and Response in Microorganisms (M. Eisenbach, M. Balaban, eds.), pp. 27-41. Amsterdam, Elsevier, 1985.

Springer M.S., Goy M.F., Adler J. Protein methylation in behavioral control mechanisms and in signal transduction. Nature, 280, 279-284, 1979.

36. Hess J. F., Oosawa K., Kaplan N., Simon M. I. Phosphorylation of three proteins in the signaling pathway of bacterial chemotaxis. Cell, 53, 79 87, 1988.

Oosawa K., Hess J. F., Simon M. L Mutants defective in bacterial chemotaxis show modified protein phosphorylation. Cell, 53, 89-96, 1988.

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 13 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.