WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 13 |

«1 Молекулярная биология клетки 2 Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray, Biology Julian Lewis, Martin Raff, of the Cell Keith Roberts, James D. Watson SECOND EDITION Garland Publishing, Inc. ...»

-- [ Страница 7 ] --

смещается за счет работы других миозиновых головок того же филамента. На «моментальном снимке» всего миозинового филамента в сокращающейся мышце было бы видно, что часть его головок находится в контакте с актиновыми филаментами, а часть остается свободной (для этого весьма существенна эластичность, «пружинистость» молекулы миозина). На каждом толстом филаменте сидит около 500 миозиновых головок, и каждая головка при быстром сокращении мышцы проходит примерно 5 рабочих циклов за секунду;

в результат скорость скольжения тонких филаментов относительно толстых достигает 15 мкм/с.

11.1.11. Мышечное сокращение инициируется внезапным повышением концентрации Са2+ в цитозоле [8] Только что описанный молекулярный механизм создания силы включается лишь тогда, когда мышца получает сигнал от своего мотонейрона. Нервный импульс вызывает на плазматической мембране мышечной клетки потенциал действия, и в результате электрическое возбуждение быстро распространяется по серии мембранных впячиваний, называемых поперечными трубочками (Т-трубочками), которые отходят внутрь от плазматической мембраны, вступая в контакт с каждой миофибриллой. Отсюда сигнал каким-то образом передается саркоплазматическому ретикулуму - своеобразной оболочке из сообщающихся уплощенных пузырьков, которая окружает каждую миофибриллу подобно сетчатому чулку (рис. 11-17).

Щель между Т-трубочкой и саркоплазматическим ретикулумом имеет ширину всего лишь 10-20 нм, но как через нее передается сигнал, остается неясным. Электрическое возбуждение Т-трубочек приводит (неизвестным пока способом) к открытию в мембране саркоплазматического ретикулума кальциевых каналов (рис. 11-17), и ионы Са2+, которых в ретикулуме очень много, выходят в цитозоль. Именно этот внезапный подъем концентрации свободных ионов Са2+ в цитозоле вызывает сокращение миофибрилл. Так как время прохождения сигнала от плазматической мембраны через Т-трубочки и саркоплазматический ретикулум до каждого из саркомеров измеряется миллисекундами, сокращение всех миофибрилл в клетке происходит одновременно. Повышение концентрации Са2+ в цитозоле кратковременно, поскольку ионы Са2+ быстро перекачиваются обратно в саркоплазматичес- Рис. 11-17. Система мембран, передающая сигнал к сокращению от плазматической мембраны мышечной клетки ко всем ее миофибриллам. На электронной микрофотографии видны две Т-трубочки и большие каналы для выброса Са2+ в мембране саркоплазматического ретикулума, которые выглядят как прямоугольные «ножки», соединенные с мембраной соседней Т-трубочки. (Микрофотографию любезно предоставила Clara Ftanzini-Armstrong.) Рис. 11-18. Здесь показано, каким образом на актиноном филаменте расположены тропомиозин и тропонин. Каждая молекула тропоми озина имеет семь регулярно расположенных участков с гомологичной последовательностью;

как полагают, каждый такой участок связывается с мономером актина. Обратите внимание, что концы соседних молекул тропомиозина слегка перекрываются, как если бы они полимеризовались вдоль актинового филамента «головой к хвосту». (По G.N. Phillips, J.P. Fillers, С. Cohen, J. Моl. Biol. 192: 111-131, 1986, с изменениями.) кий ретикулум Са2 + -АТРазой, которой в его мембране очень много (разд. 6.4.7). Обычно возвращение концентрации Са2 + в цитозоле к уровню покоя происходит за 30 мс, что приводит к расслаблению миофибрилл.

11.1.12. Сокращение скелетной мышцы регулируется ионами Са2 + при участии тропонина и тропомиозина [9] + Зависимость сокращения скелетной мышцы позвоночного от ионов Са2 (и тем самым - от команд, передаваемых нервами) всецело определяется наличием специализированных вспомогательных белков, тесно связанных с актиновыми филаментами. Если миозин смешать в + пробирке с очищенными актиновыми филаментами, АТРаза миозина активируется независимо от присутствия Са2, тогда как в нормальной миофибрилле, где на актиновых филаментах «сидят» вспомогательные белки, активация миозиновой АТРазы зависит от Са2 +.

Один из этих белков, названный тропомиозином (из-за сходства его с миозином на рентгеновских дифрактограммах), - жесткая стержневидная молекула длиной 41 нм. Как и хвост миозина, тропомиозин представляет собой димер, состоящий из двух одинаковых спиральных цепей по 284 аминокислоты в каждой. Цепи обвиваются друг около друга (см. разд. 11.1.6). Связываясь с актиновым филаментом по всей его длине, он стабилизирует филамент и придает ему жесткость (рис. 11-18).

Другой важный вспомогательный белок, участвующий в регулировании функции скелетных мышц позвоночных ионами кальция, - это тропонин. Он представляет собой комплекс из трех полипептидов-тропонинов Т, I и С (названных так за свои тропомиозин-связывающие, ингибиторные и Са2+-связывающие свойства соответственно). Тропониновый комплекс имеет удлиненную форму, причем субъединицы С и I образуют глобулярную головку, а тропонин Т-длинный хвост. Хвост тропонина Т связывается с тропомиозином и, как полагают, определяет положение всего комплекса на тонком филаменте (рис. 11-18). Тропонин I присоединяется к актину, и если его добавить к тропонину Т и тропомиозину, то образуемый ими комплекс будет ингибировать взаимодействие актина с миозином даже в присутствии Са2+.

Если же, наконец, добавить тропонин С и достроить таким образом тропониновый комплекс, его влияние на актин-миозиновые взаимодействия станет чувствительным к Са2+. Тропонин С способен связывать до четырех ионов Са2+, и в комплексе с Са2+ он ослабляет ингибирующее действие двух других компонентов тропонина на связывание миозина с актином. Тропонин С-близкий «родственник» кальмодулина - белка, который участвует в Са2 +-зависимых ответах всех клеток, в том числе в активации миозина в гладких мышцах (разд. 11.1.15). Поэтому тропонин С можно рассматривать как специализи- Рис. 11-19. Актиновый филамент в поперечном разрезе (схема): показано, каким образом в отсутствие Са2+ тропомиозин может блокировать взаимодействие миозиновых головок с актином.

рованную форму кальмодулина, приобретшую участки стабильного связывания с тропонином I и тропонином Т и обеспечивающую тем самым способность миофибрилл чрезвычайно быстро реагировать на повышение концентрации Са2 +.

На каждые семь мономеров актина в актиновом филаменте приходится только один тропониновый комплекс (рис. 11-18). Судя по данным структурных исследований, в покоящейся мышце связывание тропонина I с актином ведет к перемещению тропомиозина на актиновом филаменте в то самое место, с которым в сокращающейся мышце контактируют миозиновые головки, и в результате взаимодействие актина с + миозином подавляется. При повышении уровня Са2 тропонин С заставляет тропонин I «отцепиться» от актина, таким образом позволяя тропомиозину слегка изменить свое положение, и участок взаимодействия головок актина с миозином освобождается (рис. 11-19}.

11.1.13. Другие вспомогательные белки поддерживают архитектуру миофибрилл и обеспечивают их эластичность [10] Удивительная сила и быстрота мышечного сокращения обусловлена тем, что в каждой миофибрилле актиновые и миозиновые филаменты находятся на оптимальном расстоянии друг от друга и в правильном расположении. Тонкую организацию миофибрилл обеспечивает группа Таблица 11-1. Основные белковые компоненты миофибрилл скелетных мышц позвоночных1) Белок Доля общего Мол. Субъединицы, мол. Функция белка, % масса масса Миозин 44 510 2 х 223 {тяжелые Главный компонент толстых филаментов. Взаимодействует с цепи) актиновыми филаментами, создавая механическое усилие за счет гидролиза АТР Актин 22 42 - Главный компонент тонких филаментов, по которым скользят толстые филаменты при мышечном сокращении Тропомиозин 5 64 2 х 32 Стержневидный белок, который связывается с актиновыми филаментами по всей их длине Тропонин 5 78 30 (Тn = Т) Комплекс из трех мышечных белков, расположен через равные 30 (Тn = I) интервалы на актиновых филаментах и участвует в регуляции 18 (Тn = С) мышечного сокращения ионами Са2 + Титин 9 ~2500 - Очень большой гибкий белок, образует эластичную цепь, соединяющую толстые филаменты с Z-дисками Небулин 3 600 - Удлиненный нерастяжимый белок, связанный с Z-диском и ориентированный параллельно актиновым филаментам -Актинин 1 190 2 х 95 Актин-связывающий белок, который соединяет актиновые филаменты в области Z-диска.

Миомезин 1 185 - Миозин-связывающий белок, находящийся в области центральной М-линии толстых филаментов С-белок 1 140 - Миозин-связывающий белок;

образует полосы по обе стороны от М линии толстых филаментов.

1) Поперечно полосатые миофибриллы позвоночных содержат также не менее 20 других белков, не вошедших в эту таблицу.

Рис. 11-20. Электронная микрофотография молекул очищенного -актинина (любезно предоставлена J. Heuser.) структурных белков, из которых больше дюжины уже идентифицировано (табл. 11-1), Локализация большинства этих белков в саркомере была выяснена иммуноцитохимическими методами (разд. 4.5.3).

Актиновые филаменты «заякорены» своими плюс-концами в Z-диске, где их удерживают в правильно организованной решетке другие белки. Из них лучше всего охарактеризован а-актинин - актин-связывающий белок, имеющийся в большинстве животных клеток. В мышечных клетках он находится в области Z-диска. Очищенный а-актинин - биполярная палочковидная молекула (рис. 11-20), которая может связывать актиновые филаменты в параллельные пучки. Аналогичную функцию в случае миозина может выполнять белок миомезин, который сшивает соседние миозиновые филаменты в области М-линии (посередине биполярного толстого филамента), собирая их в гексагональную упаковку.

Стабилизирует упаковку миозиновых филаментов еще одна группа миозин-связывающих белков, выявляемых при окраске антителами как серия из 11 регулярно расположенных бледных полосок по обе стороны от М-линии.

В мышечных клетках есть также целая система очень плохо растворимых белковых филаментов, которые можно выделить лишь после полной экстракции миозина и актина из саркомера концентрированным раствором йодистого калия. Одна группа таких филаментов, построенных из очень крупного белка, названного титином, тянется параллельно толстым и тонким филаментам и соединяет толстые филаменты с Z-диском.

Титиновые филаменты очень эластичны и, по-видимому, действуют как пружины, «центрируя» толстые филаменты между Z-дисками (рис. 11-21).

Еще одна группа нерастворимых нитей - это промежуточные филаменты (разд. 11.5), которые расположены между Z-дисками соседних миофибрилл. Предполагается, что они удерживают саркомеры в определенных пространственных отношениях между собой и соединяют миофибриллы с плазматической мембраной мышечной клетки.

11.1.14. У позвоночных есть три основных типа мышц [11] До сих пор мы рассматривали лишь один из трех главных типов мышц, имеющихся у позвоночных, а именно скелетные мышцы. Два других-это сердечная мышца, которая за среднее время жизни человека успевает совершить около трех миллиардов циклов сокращения и расслабления, и гладкая мускулатура, обеспечивающая более медленное и продолжительное сокращение, характерное для таких органов, как кишечник. Во всех трех типах мышечных клеток, а также в еще одном типе сократи- Рис. 11-21. Сеть из нитей титина, которые, как предполагается, соединяют в саркомерах скелетных мышц толстые миозиновые филаменты с Z-дисками. Эластичные титиновые нити, по-видимому, присоединены к толстым филаментам вдоль всей их поверхности, так что свободно изменять длину и обусловливать эластичность саркомера может только отрезок нити между концом толстого филамента и Z-диском.

Такая упругая сеть удерживает толстые филаменты точно посередине между Z-дисками и позволяет мышцам растягиваться за пределы области перекрывания толстых и тонких филаментов без разрушения саркомера. Поперечные мостики между толстыми и тонкими филаментами для простоты не показаны. (По К. Wang, J. Wright, J. Cell Biol. 107: 2199-2212, 1988.) Рис. 11-22. Структура сердечной мышцы. Сердечная мышца состоит из множества отдельных клеток, каждая со своим ядром. Эти клетки соединены между собой с помощью специальных контактов, называемых вставочными дисками. В зоне каждого вставочного диска актиновые филаменты саркомеров соседних клеток входят в плотное вещество, связанное с плазматической мембраной, как если бы это был Z-диск. Таким образом, миофибриллы тянутся в мышце, игнорируя границы клеток.

мых клеток - миоэпителиалъных клетках (см. разд. 17,6)-работает механизм скользящих нитей.

Подобно скелетным мышцам, сердечная мышца выглядит исчерченной (поперечнополосатой), что отражает весьма сходную организацию актиновых и миозиновых филаментов. Сокращение тоже запускается сходным механизмом: потенциал действия, достигнув Т трубочек, вызывает выброс из саркоплазматического ретикулума Са2 +, который с помощью тропонин-тропомиозинового комплекса стимулирует сокращение. Однако клетки сердечной мышцы не являются многоядерными и соединены между собой конец в конец специальными вставочными дисками (рис. 11-22). Вставочные диски выполняют по крайней мере три функции: 1) они соединяют при помощи десмосом (разд. 14.1.4) каждую клетку со следующей;

2) они связывают тонкие филаменты, входящие в состав миофибрилл соседних клеток (играя роль, аналогичную роли Z дисков внутри клетки);

3) в них находятся щелевые контакты (разд. 14.1.5), через которые потенциал действия быстро распространяется от клетки к клетке, синхронизируя их сокращение.

Наиболее «примитивная» мышца - в том смысле, что она имеет наибольшее сходство с немышечными клетками - лишена исчерченности, откуда ее название «гладкая» мышца. Она образует сократимые структуры желудка, кишки, матки, стенок артерий, железистых протоков и многих других частей тела, где необходимо медленное и продолжительное сокращение. Гладкомышечная ткань состоит из слоев удлиненных веретенообразных клеток, в каждой из которых одно ядро. В клетках есть и толстые, и тонкие филаменты, но они не организованы в столь упорядоченные структуры, как в скелетной мускулатуре и в сердце (в частности, они не образуют отдельных миофибрилл). Филаменты сократительного аппарата гладкомышечных клеток распределены более диффузно, хотя в основном они вытянуты вдоль длинной оси клетки, соприкасаясь под косым углом с плазматической мембраной в дисковидных контактах, соединяющих группы клеток вместе.

Сократительный аппарат гладкой мускулатуры неспособен к такому быстрому сокращению, как миофибриллы поперечнополосатых мышц. Однако он имеет то преимущество, что допускает гораздо большую степень укорочения и может поэтому осуществлять значительные пере- Рис. 11-23, Модель сократительного аппарата гладкомышечной клетки. На этой гипотетической схеме пучки сократительных филаментов, содержащих антин и миозин, присоединены одним концом к плазматической мембране, а другим концом - к несократимым пучкам промежуточных филаментов через цитоплазматические плотные тельца. Сократительные актомиозиновые пучки расположены с наклоном к длинной оси клетки (которая обычно гораздо сильнее вытянута, чем показано на схеме), и их сокращение намного укорачивает клетку. Показана только небольшая часть всех пучков.

мещения, несмотря на отсутствие такой системы рычагов, как кости. Благодаря какой организации актиновых филаментов и миозина это становится возможным, пока не ясно;

одна из гипотетических моделей представлена на рис. 11-23.

11.1.15. И в гладкомышечных, и в немышечных клетках миозин активируется фосфорилированием его легких цепей [12] Высокоспециализированные сократительные механизмы мышечных клеток, которые мы здесь рассмотрели, произошли от более простых силовых механизмов, имеющихся во всех эукариотических клетках. В связи с этим неудивительно то, что миозин немышечных клеток наиболее сходен с миозином гладких мышц - наименее специализированного типа мускулатуры. В клетках этого типа сокращение запускается повышением + + концентрации Са2 в цитозоле (так же как и в клетках сердечной и скелетных мышц), однако ионы Са2 действуют тут не через тропонин тропомиозиновый комплекс. Инициация сокращения происходит главным образом за счет фосфорилирования одной из двух цепей молекулы миозина, что контролирует взаимодействие миозина с актином.

Две легкие цепи миозина, входящие в состав каждой миозиновой головки (см. рис. 11-9), неодинаковы, и при сокращении гладкомышечных и немышечных клеток фосфорилируется лишь одна из них. Когда она фосфорилирована, головка миозина может взаимодействовать с актиновым филаментом, что приводит к сокращению;

при дефосфорилировании этой легкой цепи миозиновая головка стремится отделиться от актина, становясь тем самым неактивной. Это фосфорилирование катализируется специальным ферментом - киназоп легких цепей миозина, которая становится активной, лишь связываясь с комплексом Са2 +-кальмодулин (разд. 12.4.3). Таким образом, сокращение здесь тоже находится под контролем концентрации Са2+ в цитозоле (рис. 11-24). Фосфорилирование происходит сравнительно медленно, так что максимальное сокращение развивается нередко за время порядка секунды (в поперечнополосатых мышцах - за несколько миллисекунд), но для гладкомышечных и немышечных клеток быстрая активация сокращения и не нужна.

Миозин этих клеток гидролизует АТР примерно в 10 раз медленнее, чем миозин скелетных мышц, что отражается, естественно, на скорости «шагания» его по актиновым филаментам и быстроте сокращения в целом. Однако не следует рассматривать гладкомышечные клетки как Рис. 11-24. Сокращение гладкой мышцы активируется в присутствии Са2+ с помощью киназы легких цепей миозина, фосфорилирующей определенный участок одного из двух типов легких цепей в миозине. Регуляция немышечного миозина осуществляется таким же образом (см. рис.

11-25).

«плохой», медленно работающий вариант клеток скелетных мышц, пригодный на что-то только потому, что к этим клеткам предъявляется меньше требований. Они специально приспособлены для медленного продолжительного сокращения и способны поддерживать напряжение длительное время, гидролизуя при этом в 5-10 раз меньше АТР, чем требовалось бы для выполнения такой же задачи клеткам скелетных мышц. Кроме того, сокращение гладких мышц контролируется большим набором разнообразных сигналов, в том числе импульсами, приходящими от вегетативной нервной системы, и гормонами (например, адреналином). Многие из этих сигналов действуют через киназу легких цепей миозина. Так, во многих клетках адреналин, повышая уровень циклического AMP, вызывает фосфорилирование этой киназы, что резко уменьшает ее сродство к Са2+ кальмодулиновому комплексу;

тем самым адреналин ингибирует фосфорилирование легких цепей миозина, заставляя гладкомышечную клетку расслабляться.

11.1.16. При фосфорилировании легких цепей немышечный миозив способен объединяться в филаменты [13] Хотя миозин есть практически во всех эукариотических клетках, стабильные толстые филаменты он образует только в сердечной и скелетных мышцах. Молекулы миозина в немышечных клетках собраны в меньшие комплексы в зависимости от обстоятельств;

размеры и местоположение этих сократительных систем определяются внутриклеточными сигналами. Важным фактором, регулирующим степень агрегации миозина, служит его фосфорилирование киназой легких цепей, которое влияет не только на АТРазную активность миозина, но также на его форму и способность к самосборке.

Если немышечный миозин дефосфорилировать путем обработки фосфатазой, он становится легко растворимым. Седиментационный анализ показал, что единичные молекулы растворимого миозина имеют компактную конфигурацию, и, судя по данным электронной микроскопии, каждый миозиновый хвост складывается с самим собой, цепляясь за «липкий участок» на головке. В этой свернутой конформации миозиновые молекулы не способны эффективно образовывать филаменты. Когда киназа легких цепей миозина фосфорилирует головки, они теряют «липкость», хвосты освобождаются, распрямляются и могут ассоциировать друг с другом, образуя биполярные миозиновые филаменты (рис. 11-25 и 11-26).

Рис. 11-25. Сборка филаментов немышечного миозина контролируется фосфорилированием его легких цепей. Фосфорилирование вызывает два эффекта: оно изменяет конформацию миозиновой головки таким образом, что на ней обнажается актин-связывающий участок, и высвобождает миозиновый хвост из «липкого кармана» на миозиновой головке, тем самым позволяя молекулам миозина объединяться в короткие биполярные филаменты. Точно так же ведет себя гладкомышечный миозин.

Рис. 11-26. Короткие филаменты немышечного миозина, образовавшиеся в результате фосфорилировання его легких цепей (электронная микрофотография, негативный контраст). (С любезного разрешения John Kendrick-Jones.) Рис. 11-27. Примеры встречающихся в немышечных клетках сократительных пучков актиновых филаментов, в состав которых входит также миозин.

11.1.17. В немышечных клетках могут временно создаваться сократимые комплексы мышечного типа [14] Для немышечных клеток контроль над сборкой и разборкой миозиновых комплексов имеет особое значение, так как в них сократительные структуры из актиновых филаментов и миозина нередко образуются лишь для выполнения какой-нибудь специальной функции, после чего снова разбираются. В частности, при делении клетки под ее мембраной появляется так называемое сократимое кольцо - поясок из актиновых филаментов и миозина. Именно за счет его сокращения посередине клетки образуется перетяжка, что ведет затем к разъединению двух дочерних клеток (рис. 11-27;

см. также разд. 13.5.14). Поскольку сократительное кольцо не является постоянной клеточной структурой, оно должно формироваться в начале деления. Этот процесс можно наблюдать, окрашивая делящиеся клетки флуоресцентными антителами к миозину.

Например, в готовых к делению яйцах морского ежа молекулы миозина вначале равномерно распределены под плазматической мембраной, а затем, по мере образования сократительного кольца, мигрируют в экваториальную область;

распределение их снова становится дисперсным, когда деление клетки завершилось. Каким образом этот процесс контролируется - неизвестно.

Другой пример временно существующих сократимых структур - это так называемые стрессовые волокна (или нити), характерные элементы цитоскелета культивируемых фибробластов (см. рис. 11-27). И по своей структуре, и по функциям они напоминают тонкие миофибриллы (рис. 11-28). Одним концом эти волокна связаны с плазматической мембраной в особых участках, называемых фокальными контактами (см. разд.

11.2.8), и похожи по составу и ультраструктуре на участки присоединения к плазматической мембране актиновых филаментов в клетках гладких мышц (см. рис. 11-23). Другим концом они связаны либо с густой сетью промежуточных филаментов, окружающей ядро клетки (см. рис. 9-1), либо с другим фокальным контактом. Стрессовые волокна образуются при механическом растяжении клетки (например, когда она распластывается по субстрату) и исчезают во время митоза, когда клетка округляется и теряет связь с субстратом. Если ликвидировать натяжение, «оторвав» лазерным лучом один конец стрессового волокна от фокального контакта, оторванное волокно тоже быстро исчезнет. Стрессовые волокна фибробластов, находящихся в тканях, судя по всему, способны сокращаться, передавая создаваемое усилие на окружающий коллагеновый матрикс;

этот процесс играет большую роль в заживлении ран и в морфогенезе.

Некоторые сократительные структуры на основе актиновых фила- Рис. 11-28. Электронная микрофотография фибробласта в культуре (окраска антителами, меченными коллоидным золотом). Видно, что организация белков в стрессовых волокнах напоминает мышечную. Показано расположение двух типов актин-связывающих белков:

-актинин (крупные частицы золота) ассоциирован с периодически повторяющимися плотными участками в стрессовых волокнах (в поперечнополосатой мышце -актинин находится в Z-дисках), тогда как головки миозина (мелкие частицы золота) видны по обе стороны от полос с а-актинином. Такая организация имеет некоторое сходство с саркомером (сравните с рис. 11-2) и указывает на то, что молекулы миозина здесь собраны в филаменты.

(Фото любезно предоставлено М. de Brabander, J. de Mey, G. Langanger.) ментов оказываются более долгоживущими. Таковы, например, кольце вые пучки актиновых филаментов в опоясывающих десмосомах, расположенных вблизи апикальной поверхности клеток эпителия (разд. 14.1.3). Среди прочих функций, эти пучки, видимо, играют важную роль в изгибании эпителиальных пластов в ходе эмбриогенеза (разд. 11.6.9).

11.1.18. Мышечные белки кодируются генами, составляющими мультигенные семейства [15] Как мы видели, в мышечных клетках всех трех типов, а также в немышечных клетках сократительный аппарат имеет много общих черт, Различные типы сокращения, свойственные разным клеткам, отчасти определяются тканеспецифичностью экспрессии генов, кодирующих белки этого аппарата. У млекопитающих, например, имеются по меньшей мере шесть генов актина, шесть генов тяжелой цепи миозина, три тропомиозиновых гена и три гена тропонина Т. В некоторых случаях кодируемые разными генами белки несколько различаются по функции в других же случаях функциональных различий пока не обнаружено.

Из шести вариантов актина, экспрессируемых у млекопитающих один содержится только в скелетных мышцах, другой - в сердечной мышце, а еще два - только в гладкомышечных клетках (первый из них - в гладкой мускулатуре сосудов, а второй в мускулатуре других органов);

и наконец, два последних варианта, известные как немышечные, или цитоплазматические, актины, являются, по-видимому, универсальными компонентами цитоскелета и в значительных количествах присутствуют в большинстве немышечных клеток. Все эти виды, или изоформы, актина очень сходны по аминокислотным последовательностям;

например, мышечные актины отличаются от цитоплазматических менее чем по 7% аминокислот. Если не считать некоторых различий в N-концевой части молекулы, возможно, влияющих на процесс полимеризации актина, не ясно, имеют ли такие различия какое-либо функциональное значение, Экспрессия гена «сердечного» актина в культивируемых фибробластах не изменяет ни форму, ни поведение клеток, и синтезируемый белок легко включается в их нормальные актиновые структуры. Напротив, различия между миозинами влияют и на скорость сокращения, и на его регуляцию, а также на степень ассоциации молекул миозина в клетке.

11.1.19. Разнообразие мышечных белков увеличивается за счет альтернативных способов сплайсинга их мРНК [16] Все сказанное выше о различных типах мышц дает лишь частичное представление об их реально существующем разнообразии. В скелетных мышцах взрослого человека, например, мы находим смесь мышечных клеток трех типов: белые мышечные клетки, приспособленные для быстрого анаэробного сокращения (АТР синтезируется в них в основном за счет гликолиза);

красные мышечные клетки, специализированные для медленного и более продолжительного сокращения и использующие главным образом аэробный метаболизм (их цвет обусловлен высокой концентрацией запасающего кислород белка - миоглобина);

и наконец, мышечные клетки промежуточного типа, синтезирующие АТР как аэробным, так и анаэробным путем (разд. 2.3.2). В каждом из этих типов есть еще подтипы, с помощью которых происходит «тонкая настройка» каждой мышцы на выполнение характерных для нее физиологических функций и на соответствующий метаболизм. При этом одни и те же мышцы у взрослого человека и у плода различны.

Белковый состав каждого из этих типов мышц имеет свои особенности. Очень важным источником разнообразия служит тканеспецифическая регуляция сплайсинга пре-мРНК, позволяющая комбинировать различные наборы экзонов, так что продуктами одного гена могут быть несколько слегка различающихся молекул мРНК (разд. 10.4.2). Характер сплайсинга пре-мРНК может изменяться под действием гормональных, нервных и иных факторов, и в результате изменяются аминокислотные последовательности определенных мышечных белков в зависимости от ткани и стадии онтогенеза. Например, ген тропонина Т, который экспрессируется в скелетных мышцах, благодаря альтернативному сплайсингу РНК дает по меньшей мере 10 различных форм белка. Эти варианты, вероятно, по-разному взаимодействуют с тропонином С и тропомиозином, модифицируя таким образом регуляцию мышечного сокращения.

Заключение Сокращение мышц происходит в результате скольжения актиновых филаментов вдоль миозиновых. Головки молекул миозина, выступающие по бокам миозиновых филаментов, осуществляют АТР-зависимый цикл, в котором присоединяются к соседним актиновым филаментам, изменяют свою конформацию таким образом, что заставляют актиновые и миозиновые филаменты смещаться относительно друг друга, а затем снова отделяются от нитей актина. Эффективной работе этого цикла способствуют специальные вспомогательные белки, которые поддерживают пространственную организацию актиновых и миозиновых филаментов в виде параллельных, частично перекрывающихся пучков с правильной взаимной ориентацией и оптимальным расстоянием между ними. Еще два вспомогательных белка-тропонин и тропомиозин обеспечивают регуляцию сокращения скелетных и сердечной мышц ионами Са2 +.

Актин и миозин присутствуют также и в гладких мышцах, и в большинстве немышечных клеток. Сокращение в них осуществляется по тому же принципу, что и в сердечной и скелетных мышцах, но элементарные сократимые блоки здесь мельче и не обладают столь высокой + степенью упорядоченности;

кроме того, их активность и степень ассоциации находятся под контролем Са2 -зависимого фосфорилирования одной из легких цепей миозина.

Сократительный аппарат мышечных и немышечных клеток точно настроен на выполнение специфических функций в зависимости от типа клеток. Это определяется тканеспецифическоп экспрессией различных генов, кодирующих мышечные белки, и тканеспецифической же регуляцией сплайсинга мРНК, благодаря которой один ген может давать слегка различающиеся варианты белков.

11.2. Актиновые филаменты и клеточный кортекс [17] Во многих эукариотических клетках актин содержится в больших количествах, составляя нередко до 5% и более от общего белка клетки.

Хотя он распределен по всей цитоплазме, в большинстве животных клеток существует особенно густая сеть из актиновых филаментов и ассоциированных с ними белков под самой плазматической мембраной. Эта сеть образует клеточный кортекс, который придает механическую прочность поверхностному слою клетки и позволяет клетке изменять свою форму и двигаться. Структура кортекса может быть различной у разных клеток и даже в разных участках одной и той же клетки. Иногда это плотная трехмерная сеть из поперечносшитых актиновых филаментов, в которую не могут проникать органеллы и другие крупные частицы из прилежащих слоев цитоплазмы (рис. 11-29);

в других случаях кортекс заметно тоньше и больше похож на двумерную структуру. В одни участках животных клеток небольшие пучки актиновых филаментов, отходящие от наружной стороны кортекса, заполняют выступы клеточной поверхности, тогда как в других актиновые филаменты втягивают мембрану внутрь.

Плазматическая мембрана настолько тесно связана с кортикальным актиновым слоем, что для некоторых целей лучше считать их единым функциональным образованием.

В большинстве животных клеток примерно половина всех молекул актина находится в неполимеризованной форме - в виде свободных мономеров или небольших комплексов с другими белками. Между этим пулом актина и актиновыми филаментами существует динамическое равновесие, что помогает осуществлять движения клеточной поверхности. В этом разделе мы расскажем о том, как актин-связывающие белки регулируют сборку актиновых филаментов, соединяют их в пучки или сети и определяют их расположение, длину и другие свойства.

11.2.1. Актин-связывающие белки «сшивают» актиновые филаменты в обширные сети [18] Актиновые филаменты часто связаны между собой в жесткие трехмерные сети с помощью специальных сшивающих белков. Наиболее Рис. 11-29. Актиновый кортекс на электронной микрофотографии тонкого среза лейкоцита. Хотя цитоплазму заполняют гранулы различного типа, в тонкий слой под самой плазматической мембраной (кортекс) они не попадают. Кортекс содержит сеть актиновых филаментов и связанных с ними белков, определяющих движения клеточной поверхности. (С любезного разрешения Dorothy Bainton.) Рис. 11-30. Образуя гибкие сшивки между соседними актиновыми нитями, филамин создает из них трехмерную сеть, обладающую механическими свойствами геля. Каждый димер филамина, если его полностью выпрямить, имеет длину Около 160 нм.

распространенный из них - филамин;

его длинная гибкая молекула состоит из двух одинаковых полипептидных цепей, соединенных «голова к голове», а участки связывания актиновых филаментов находятся на «хвостовых» концах (рис. 11-30). Во многих клетках белки такого типа составляют почти 1 % всего белка (примерно 1 димер на 50 мономеров актина).

Гели, образуемые in vitro актиновыми филаментами и сшивающими белками, обладают любопытными механическими свойствами: они сохраняют свою форму, если к ним приложить резкое короткое усилие, но легко деформируются под действием более слабой постоянной силы.

Предполагаемый молекулярный механизм, лежащий в основе такого поведения, характерного и для кортикальной цитоплазмы, показан на рис. 11 31. По-видимому, именно такие актиновые сети позволяют клетке легко восстанавливать свою фирму за счет упругости после мелких толчков, но в то же время подвергаться значительным деформациям при длительном воздействии слабых сил.

Рис. 11-31. Механические свойства геля из актиновых филаментов, образованного с помощью белков, сшивающих актин. Гель противостоит резким деформациям (Б), так как сшивающие белки не успевают отделиться от актиновых филаментов. Сопротивление медленным деформациям гораздо слабее: сшивающим белкам хватает времени, чтобы диссоциировать и вновь связаться с актиновыми филаментами в других положениях. (По М. Sato, W.H. Schwartz, T.D. Pollard, Nature 325: 828-830, 1987.) 11.2.2. Гельзолин, активированный ионами Са2+, вызывает фрагментацию актиновых филаментов [19] Экстракты, полученные из животных клеток многих типов, образуют гель, если к ним добавить АТР и прогреть до 37 °С. Этот процесс связан со взаимодействием актиновых филаментов и сшивающего белка, например филамина, однако поведение такого геля оказывается более сложным, чем у простой смеси филамина с актиновыми филаментами. Так, при увеличении концентрации Са2+ выше 10-7 М актиновый гель начинает разжижаться. Под микроскопом в участках, где происходит такой переход геля в золь, можно увидеть весьма энергичные локальные «течения». Очевидно, в экстрактах помимо актиновых филаментов и филамина должны присутствовать еще какие-то компоненты, благодаря которым ионы Са2+ вызывают превращение геля в золь и движение жидкости. Вероятно, именно эти компоненты ответственны за течение цитоплазмы, наблюдаемое в некоторых крупных клетках, где оно необходимо для равномерного распределения метаболитов и других веществ. Эти внутриклеточные движения связаны, по-видимому, с быстрыми локальными изменениями в консистенции цитоплазмы - переходами гель/золь.

Из клеточных экстрактов удалось выделить несколько белков, которые разжижают актиновый гель в присутствии Са2 +. Из них лучше + всего изучен гельзолин - компактный белок с мол. массой около 90 000. Связывая ионы Са2, гельзолин активируется, разрывает актиновные филаменты и образует «шапки» на появляющихся при этом плюс-концах филаментов, что ведет к разрушению сети из сшитых актиновых нитей.

Сходные белки содержатся в кортексе многих клеток позвоночных. фрагмонтирующие белки активируются при таких концентрациях Са2+ (около 10-6 М), которые создаются в цитозоле лишь на короткое время;

как полагают, они служат посредниками в реакциях клеточного кортекса на внешние сигналы. Например, когда фагоцитирующий лейкоцит вступает в контакт с микроорганизмом, сеть актиновых филаментов в этом участке кортекса распадается, что позволяет поверхностному слою цитоплазмы окружить и поглотить микробную клетку. К механизмам, лежащим в основе таких движений, мы вернемся несколько позже.

11.2.3. Движение цитоплазмы может осуществляться с участием миозина [20] + В искусственных смесях из актиновых филаментов, филамина и гельзолина наблюдаются Са2 -зависимые переходы геля в золь и обратно, однако к сокращению эти смеси не способны и в них не возникают такие потоки, как в богатых актином гелях, получаемых из клеток.

Судя по всему, для этого необходим миозин: неочищенные актиновые гели, из которых миозин избирательно экстрагирован, теряют сократимосгь и способность создавать течения. Поэтому можно предполагать, что источником силы для таких движений служит какое-то взаимодействие между актином и миозином.

Поскольку в исходном экстракте актиновые филаменты, видимо, образуют неупорядоченную трехмерную сеть, возникает вопрос: как могут актин и миозин производить согласованные движения? Актиновые филаменты, как мы знаем, обладают отчетливой полярностью, и миозиновые головки могут связываться с ними и скользить вдоль них только при правильной ориентации относительно этой полярности, Небольшие биполярные комплексы молекул немышечного миозина (см. рис. 11-26) могли бы до некоторой степени «упорядочивать» актиновые филаменты в растворе, просто подтягивая одну их группу относительно Рис. 11-32. Биполярные агрегаты молекул немышечного миозина (см. рис. 11-26) вызывают скольжение двух актиновых филаментов противоположной полярности (как и в мышце). Этим способом миозин может вызывать сокращение даже в сети из случайно ориентированных актиновых нитей.

другой, даже если эти миозиновые комплексы и актиновые филаменты вначале не были хорошо ориентированы (рис. 11-32).

11.2.4. Цитоплазм этические потоки в гигантских клетках водорослей создаются при участии актина и миозина [21] Растительные клетки могут достигать гораздо больших размеров, чем животные клетки, так как они обладают жесткой клеточной стенкой и содержат обширную центральную вакуоль (см. гл. 20, разд. 20.4.9). Диффузия при таких расстояниях недостаточно эффективна, поэтому очень крупным клеткам для перемешивания цитоплазмы нужны мощные цитоплазматические потоки. Гигантские многоядерные клетки зеленых водорослей Chara и Nitella достигают в длину 2-5 см, и белковой молекуле потребовались бы недели для диффузии от одного конца клетки до другого. Неудивительно, что у таких организмов мы находим самые яркие примеры цитоплазматических потоков. Непрерывный узкий поток цитоплазмы движется вдоль клетки в виде бесконечной спиральной ленты, обходя огромную центральную вакуоль (рис. 11-33, А). Этот поток увлекает с собой внутренние мембранные структуры, митохондрии и ядра со скоростью до 75 мкм/с.

Система, создающая потоки в таких клетках, находится между движущимся слоем цитоплазмы и неподвижным монослоем хлоропластов, лежащих под самой плазматической мембраной (рис. 11-33, Б), На электронных микрофотографиях в этой промежуточной области видны большие пучки актиновых филаментов с одинаковой полярностью. Эта полярность такова, что направленное движение вдоль них молекул миозина (от минус-конца к плюс-концу) совпадает с направлением наблюдаемых потоков цитоплазмы. Более того, можно «вскрыть» гигантскую клетку Nitella так, чтобы обнажились актиновые пучки на поверхности слоя хлоропластов;

если теперь добавить к препарату шарики латекса, покрытые миозином, то эти шарики в присутствии АТР будут двигаться по актиновой сети, причем движение их окажется очень похожим на перемещение органелл в интактной клетке. Таким образом, весьма вероятно, что цитоплазматические потоки создаются в клетке при участии миозина.

Для такого движения цитоплазмы, как у Nitella, биполярные миозиновые филаменты не нужны - ведь здесь происходит не сокращение, а непрерывное однонаправленное перемещение. Помимо немышечного миозина, организованного в филаменты (см. рис. 11-26), многие клетки содержат относительно небольшие молекулы так называемых мини-миозинов. Эти молекулы впервые были экстрагированы из крупных амеб Рис, 11-33. Схема токов цитоплазмы в гигантской клетке водоросли Nitella. А. Путь движения цитоплазмы в цилиндрической клетке. Для простоты диаметр клетки относительно ее длины преувеличен. Б. Продольный разрез участка такой клетки;

показана организация неподвижных и движущихся слоев цитоплазмы. В неподвижном кортикальном слое лежат хлоропласты, которые связаны с подлежащими пучками актиновых филаментов;

под этими пучками расположен движущийся слой цитоплазмы, в нем находятся ядра, митохондрии к другие органеллы. На самом деле относительные размеры вакуоли гораздо больше, чем на рисунке.

(Acanthamoeba);

они состоят из единственной глобулярной головки с которой гибким хвостом, который, вместо того чтобы образовать спираль с таким же хвостом другой молекулы, связывается с мембранами-непосредственно или через другой белок. Очищенные мини-миозины in vitro присоединяются к мембранным органеллам и могут перемещать их вдоль ориентированных пучков актиновых филаментов, По-видимому, именно так осуществляется активный транспорт многих органелл в клетках.

11.2.5. Организация кортекса определяется взаимодействием актиновых филаментов с плазматической мембраной До сих пор мы обходили вопрос, который является основным для понимания структуры и функций актинового кортекса: какова природа связи актиновых филаментов с плазматической мембраной? Полагают, что находящиеся в мембране специальные белки служат центрами организации для актиновой сети. Силы, возникающие в кортикальном слое актиновых нитей и ответственные за движения клеточной поверхности, должны передаваться на мембрану именно через эти или другие мембранные белки. О том, каковы эти белки и как они взаимодействуют с актином, мало что известно. Очевидно, однако, что есть по крайней мере три функциональных типа присоединения актина к плазматической мембране:

первый главным образом придает мембране прочность и определяет ее форму;

второй дает возможность актиновым филаментам втягивать участки мембраны внутрь;

и наконец, третий тип-тот, при котором актиновые филаменты вызывают быстрое выпячивание участков мембраны наружу.

Рассмотрим по порядку каждый из этих типов.

Рис. 11-34. Эта гипотетическая схема показывает, как цитоскелет, подстилающий мембрану эритроцитов у млекопитающих, мог бы получиться из более обычного кортекса с преобладанием актина. Клетка-предшественник с ядром имеет связанный с мембраной кортекс, состоящий из актиновых филаментов, удерживаемых вместе тетрамерами спектрина и другими сшивающими белками. Когда эта клетка созревает и превращается в эритроцит, большая часть ее актина теряется. В результате актиновые филаменты деполимеризуются и сшивающие белки в основном отделяются от них - остается лишь тонкая двумерная сеть из спектрина и коротких «отрезков» актиновых филаментов, связанных с плазматической мембраной.

11.2.6. Цитоскелетные сети, связанные с мембраной, создают для нее механический «каркас» [22] В гл. 6 (разд. 6.2.4) мы уже говорили о спектрине и анкирине - белках, которые впервые были открыты в эритроцитах млекопитающих как важнейшие компоненты цитоскелета, связанного с мембраной. В зрелых эритроцитах млекопитающих ядро и внутренние мембраны утрачены, так что из всех мембран остается только плазматическая. Ее поддерживает двумерная сеть из тетрамеров спектрина, концы которых соединены с помощью очень коротких актиновых филаментов;

через анкириновые мостики эти тетрамеры связаны с трансмембранным белком полосы 3 (см.

рис. 6-26). Белки, очень сходные и со спектрином, и с анкирином, имеются в кортексе многих клеток позвоночных. Было высказано предположение, что необычайно тонкая (всего около 20 нм) цитоскелетная сеть, лежащая под плазматической мембраной зрелого эритроцита, образуется из более толстого кортекса клетки-предшественницы, обладающей ядром, в результате постепенной деполимеризации актиновых филаментов (рис. 11-34). В этом случае пространственную организацию белков кортекса в эритроците можно было бы рассматривать как модель цитоскелетных сетей на актиновой основе, которые служат опорой для плазматической мембраны во всех других животных клетках.

11- 11.2.7. Микроворсинки - пример того, как пучки поперечносшитых актиновых филаментов могут стабилизировать локальные выпячивания плазматической мембраны [23] Микроворсинки - это пальцевидные выступы плазматической мембраны на поверхности многих животных клеток. Микроворсинок особенно много у тех эпителиальных клеток, которым для эффективного выполнения их функций необходима большая поверхность. Например, в тонкой кишке человека одна такая клетка несет на своей апикальной поверхности несколько тысяч микроворсинок. Каждая микроворсинка имеет длину около 1 мкм и ширину около 0,08 мкм;

в результате всасывающая поверхность клетки оказывается в 20 раз больше, чем если бы она была гладкой. Высокоспециализированная плазматическая мембрана микроворсинок покрыта снаружи плотным слоем из полисаха-ридов и пищеварительных ферментов.

Внутри каждой кишечной микроворсинки находится жесткий пучок из 20-30 параллельных актиновых филаментов, тянущихся от ее верхушки к основанию, где они погружены в клеточный кортекс. Все филаменты в пучке ориентированы плюс-концами наружу (от клетки) и удерживаются вместе на одинаковых расстояниях друг от друга несколькими актин-связывающими белками, в частности фимбрином и фасцином (рис. 11-35). В отличие от филамина и других сшивающих актиновые филаменты белков, молекулы которых гибки и объединяют филаменты в рыхлую сеть, эти актин-связывающие.белки относительно невелики и компактны, причем полипептидная цепь такого белка образует два Рис. 11-35. Сердцевину микроворсинки образует пучок параллельных актиновых филаментов, удерживаемый белками, сшивающими актин. Поверхность этого пучка соединена с окружающей его плазматической мембраной боковыми «ручками». Плюс-концы всех актиновых филаментов находятся в кончике микроворсинки, где они погружены в аморфный интенсивно окрашиваемый материал неизвестного состава.

Рис. 11-36. Эпителиальная клетка кишечника, в которой видна терминальная сеть, лежащая под апикальной плазматической мембраной (электронная микрофотография, метод замораживания-травления). Пучки актиновых филаментов, образующих сердцевину микроворсинок, продолжаются в терминальную сеть, где они соединены главным образом спектрином. Под терминальной сетью находится слой промежуточных филаментов. (N. Hirokawa, J. E. Heuser, J. Cell Biol. 91: 399-409, 1981. С разрешения Rockefeller University Press.) раздельных участка для связывания актина. Поэтому актиновые филаменты оказываются объединенными в плотные пучки, где они прочно удерживаются параллельно друг другу на расстоянии около 10 нм.

Нижний конец актинового пучка микроворсинки заякорен в специализированном кортексе апикальной части клетки. Этот кортекс.

называемый терминальной сетью, содержит густое сплетение из молекул спектрина, лежащее поверх слоя промежуточных филаментов (рис. И 36);

по-видимому, именно терминальная сеть фиксирует актиновые пучки, а тем самым и микроворсинки, под прямым углом к апикальной поверхности клетки.

Каким образом пучок актиновых филаментов микроворсинки присоединен к одевающей его плазматической мембране? Электронная микроскопия выявляет два различных типа такого соединения: по всей длине пучка, подобно ступенькам винтовой лестницы, расположены контактирующие с мембраной боковые отростки, а на верхушке микроворсинки плюс-концы актиновых филаментов соединены с мембраной через «шапочку» из бесструктурного, интенсивно окрашиваемого вещества (см. рис. 11-35).

Если плазматическую мембрану эпителиальной клетки кишечника растворить с помощью неионного детергента, боковые отростки актиновых пучков останутся связанными с обнажившимся цитоскелетом. Однако их можно отделить, добавив к такому препарату АТР, и оказалось, что каждый отросток состоит из молекулы мини-миозина, к которой прочно присоединен кальций-связывающий белок кальмодулин.

Своим АТР-зависимым головным участком мини-миозин связывается с актиновыми филаментами срединного пучка микроворсинки, а коротким хвостовым участком-с плазматической мембраной. Почему для образования такой связи используется «двигательный» белок, неизвестно;

но, поскольку молекулы миозина движутся по актиновым филаментам в направлении к плюс-концу, следует ожидать, что в микроворсинке они должны тянуть компоненты мембраны к ее верхушке. Возможно, что такой механизм способствует непрерывному слущиванию плазматической мембраны с конца микроворсинки в просвет кишки, где связанные с мембраной пищеварительные ферменты продолжают свое действие.

О природе аморфной «шапочки» на кончике микроворсинки известно еще меньше. Как мы увидим, есть основания подозревать, что находящиеся в этой области белки контролируют толщину и длину пучка актиновых филаментов, определяя тем самым размеры микроворсинки (разд. 11.6.10). Если это так, то взаимодействие актиновых филаментов с плазматической мембраной микроворсинки на ее верхушке должно быть весьма сложным.

11.2.8. Благодаря фокальным контактам актиновые филаменты могут создавать тянущую силу, приложенную к субстрату [24] Пучки актиновых филаментов часто присоединяются к плазматической мембране способом, который позволяет им передавать тянущее усилие на субстрат - будь то внеклеточный матрикс или другая клетка. Мы уже упоминали о таких способах прикрепления пучков актиновых филаментов у фибробластов и гладкомышечных клеток (разд. 11.14 и 11.17). В подобном соединении конца пучка с плазматической мембраной участвуют трансмембранные линксрныс гликопротснпы. Лучше всего изучены места прикрепления культивируемых фибробластов к внеклеточному матриксу. Когда фибробласты растут в культуральной чашке, большая часть их обращенной к субстрату поверхности отделена от него промежутком более 50 нм. Однако в некоторых местах, называемых фокальными контактами или адгезионными пластинками, этот промежуток уменьшается до 10-15 нм. В отражательном интерференционном микроскопе, который собирает только свет, отраженный от нижней поверхности клетки, эти места имеют вид темных пятен. Окрасив клетку антителами к актину, можно показать, что именно здесь концы стрессовых волокон прикрепляются к плазматической мембране (рис. 11-37). В фокальном контакте клеточный кортекс соединяется при помощи Рис. 11-37. Взаимоотношения междуфокальными контактами и стрессовыми волокнами в фибробласте invitro. Фокальные контакты лучше всего видны в живой клетке при использовании отражательной интерферснционной микроскопии (А). Свет при этом отражается от нижней поверхности клетки, прикрепившейся к предметному стеклу, и фокальные контакты имеют вид темных пятнышек. На фото Б та же клетка окрашена (после фиксации) антителами к актину;

видно, что большая часть пучков ее актиновых филамснтов (или стрессовых волокон) оканчивается в фокальных контактах или в непосредственной близости от них. (С любезного разрешения Grenham Ireland.) Рис. 11-38. Модель, показывающая, как трансмембранные линкерные гликопротеины плазматической мембраны могут соединять внутриклеточные актиновые филаменты с внеклеточным матриксом в фокальных контактах. Фокальные контакты образуются, когда связывание гликопротеинов матрикса с поверхностью клетки приводит к группировке трансмембранных линкеров в области контакта (А). Справа (Б) показано возможное расположение внутриклеточных прикрепительных белков, осуществляющих связь между трансмембранными гликопротеинами линкерами (например, рецептором фибронектина) и актиновыми филаментами.

трансмембранных белков-линкеров с компонентами внеклеточного матрикса (в частности, с фибронектином;

см. разд. 14.2.13), которые адсорбированьт на чашке;

Типичным1 трансмембранным линкером является рецептор фибронектина-построенный из двух цепей гликопротеин из группы интегринов (разд. 14.2.17). Его наружный домен связывается с фибронектином, а цитоплазматический соединен с актиновыми филаментами в стрессовых волокнах (рис. 11-38, А). Это соединение непрямое, в нем участвуют еще по меньшей мере четыре прикрепительных белка, в том числе талин и винкулин талин связывается как с цито-плазматическим доменом рецептора фибронектина, так и с винкулином. Ни один из этих белков, однако, прямо с актиновыми филаментами не соединен;

по-видимому, с ними непосредственно связаны другие белки: белок, кэпирующий актиновые филаменты, который присоединяется к их плюс-концам, и -актинин, который в мышцах прикреплен к актиновым, филаментам около плюс-конца в области Z-диска (разд. 11.1.13). Возможное расположение всех этих белков в фокальном контакте показано на рис.

11-38,Б.

С фокальными контактами весьма сходны места прикрепления акти-новых филаментов к плазматической мембране гладкомышечных клеток (разд. 11.1.14). Другая сходная (но уже в меньшей степени) структура-это опоясывающие десмосомы (адгезионные пояса), соединяющие эпителиальные клетки в пласты и позволяющие сократимым пучкам актиновых филаментов взаимодействовать через две смежные плазматические мембраны (разд. 14.1.3). В этих межклеточных контактах имеются винкулин и -актинин, но нет талина, так что способ присоединения актиновых филаментов к плазматической мембране должен быть несколько иным, чем в фокальных контактах.

До сих пор мы обсуждали такие примеры прикрепления актиновых филаментов к мембране, где филаменты либо играют структурную роль (как в микроворсинках), либо способны передавать на мембрану тянущее усилие (как в фокальных контактах). В обоих этих случаях мы Рис. 11-39. Кинетика полимеризании актина in vitro. Полимеризацию инициируют повышением ионной силы в растворе актина, и она обычно начинается после некоторой вдержки (лаг-фазы).

имеем дело с постоянными структурами - продуктами относительно стабильной ассоциации актиновых филаментов. Быстрые же изменения формы клеточной поверхности (например, при движении клетки) часто зависят от кратковременной регулируемой полимеризации актина. Но прежде чем рассматривать механизм быстрого выпячивания плазматической мембраны в результате полимеризации актина, мы сделаем краткое отступление и выясним, что известно о процессах такой полимеризации in vitro.

11- 11.2.9. Рост актинового филамента происходит главным образом на плюс-конце [25] Как уже упоминалось, in vitro молекулы актина могут спонтанно полимеризоваться в присутствии АТР, образуя филаменты. Обычно этот процесс инициируют повышением ионной силы раствора актина, а следить за его протеканием проще всего, измеряя увеличение светорассеяния раствора или флуоресценции ковалентне связанного красителя. Полимеризация актина развивается нелинейно - вначале наблюдается лаг-фаза, отражающая первую стадию, самую медленную и затрудненную, в которой три молекулы актина должны соединиться в определенной геометрической конфигурации (рис. 11-39). Эта стадия называется нуклеациеп. Когда нуклеация произошла, дальнейшее присоединение новых молекул актина к концам филамента происходит быстро. Процесс сборки филаментов обратим, и в конце концов концентрация мономеров падает до уровня, при котором скорости ассоциации и диссоциации мономеров становятся равными. Такую концентрацию называют критической. Если быстро разбавить раствор актина так, чтобы концентрация мономеров упала ниже критической, актиновые филаменты начнут распадаться, и их деполимеризация будет продолжаться до тех пор, пока не восстановится критическая концентрация мономеров. Как мы увидим, и нуклеация, и полимеризация актина в клетке находятся под контролем различных актин-связывающих белков, которые и определяют таким образом местоположение и длину актиновых филаментов. У полимеризации актина есть еще одна особенность, которая позволяет объяснить направленность роста филаментов при осуществле- Рис. 11-40. Асимметричный рост актинового филамента. Если в качестве «затравки» для полимеризации актина использовать небольшие фрагменты актиновых нитей, помеченных головками миозина, можно увидеть, что сборка происходит гораздо быстрее на плюс-конце первоначального фрагмента, чем на минус-конце. (С любезного разрешения M.S. Runge, Т. D. Pollard.) нии различных клеточных движений. Как мы уже достаточно хорошо знаем, актиновые филаменты обладают полярностью, и важное следствие этой полярности - различная кинетика полимеризации плюс- и минус-концах. Это различие можно обнаружить, если пометить небольшой участок актинового филамента миозиновыми головками, а затем добавить к ним мономеры актина в условиях, благоприятных для полимеризации.

Зафиксировав через некоторое время растущие актиновые филаменты, можно под электронным микроскопом увидеть, что их плюс-концы выросли гораздо больше, чем минус-концы (рис, 11-40). Проведя серию таких экспериментов, можно измерить скорость роста обоих концов филамента при различных концентрациях актиновых мономеров. В среде, соответствующей по ионному составу внутриклеточным условиям, очищенные актиновые филаменты растут на плюс-концах в 5-Ю раз быстрее, чем на минус-концах. По-видимому, in vivol рост почти всегда происходит на плюс-конце;

поэтому, закрепив плюс-конец филамента в определенной ориентации, клетка может предопределить скорость и направление роста филамента.

11- 11.2.10. В актиновых филаментах происходит «тредмиллинг» составляющих их субъединиц [25] Эксперименты in vitro (вроде показанного на рис. 11-40) говорят о том, что концентрация актина, при которой рост филаментов прекращается, т. е. критическая концентрация, различна для разных концов филамента. Поэтому при полимеризации актина в пробирке достигается стационарное состояние, в котором присоединение мономеров происходит в основном на плюс-конце, а их отделение - на минус-конце. Скорости этих двух процессов в стационарном состоянии одинаковы, и потому концентрация свободных мономеров остается постоянной. Хотя общая длина полимера при этом не изменяется, отдельные молекулы актина непрерывно перемещаются от одного конца филамента к другому (рис. 11-41). Этот процесс, получивший название тредмиллинга, можно сравнить с продвижением людей в очереди.

Для тредмиллинга необходима энергия, иначе на его основе можно Рис. 11-41. Скорость роста актиновых филаментов на разных концах при различных концентрациях мономеров актина. График показывает, что два конца растут с разными скоростями и критические концентрации для них различны. Поэтому существует некоторый диапазон концентраций свободного актина (темная полоса), при которых плюс-конец актинового филамента полимеризуется, а минус-конец деполимеризуется. Когда in vitro свободный актин находится в равновесии с актиновыми филаментами, в целом роста не происходит, так как скорости отделения молекул от минус-конца и присоединения их к плюс-концу равны. При такой концентрации свободных актиновых субъединиц (промежуточной между критическими концентрациями для двух концов-показано цветной стрелкой) длина филаментов не изменяется, но молекулы актина в них все время движутся от одного конца полимера к другому. Этот процесс называют тредмил-лингом (см. схему 11-1).

Рис. 11-42. Ламеллоподии и микро-шипы на переднем крае человеческого фибробласта, передвигающегося в культуре (микрофотография, ученная с помощью сканирующего электронного микроскопа). Стрелкой указано направление движения. По мере того как клетка продвигается вперед, ламеллоподии и микрошипы перемещаются назад' по ее верхней стороне, что создает картину «раффлинга». (С любезного разрешения Julian Heath.) было бы создать вечный двигатель - машину, способную совершать работу, не расходуя энергии, т. е. нарушая законы термодинамики. В случае тредмиллинга энергию доставляет гидролиз АТР: каждый мономер актина связывает молекулу АТР, которую после своего присоединения к филаменту быстро гидролизует до ADP и фосфата. Каким образом гидролиз АТР делает возможным тредмиллинг, объясняется на схеме 11-1.

Вскоре мы увидим (разд. 11.2.11), что тредмиллинг может быть одним из механизмов, с помощью которого актиновые нити и связанные с ними компоненты выполняют в клетке двигательные функции.

11.2.11. Многие клетки образуют на своей поверхности подвижные структуры, содержащие актин, - микрошипы и ламеллоподии [26] Динамичные выступы клеточной поверхности с актиновыми филаментами внутри - весьма обычная черта животных клеток, особенно тех, которые в данный момент мигрируют или изменяют свою форму. Культивируемые клетки, например, часто образуют множество тонких жестких выростов толщиной около 0,1 мкм и длиной 5-10 мкм, называемых микрошипами, которые содержат рыхлые пучки примерно из актиновых филаментов, ориентированных плюс-концами наружу. Растущий конец аксона нервной клетки-конус роста - выпускает еще более длинные микрошипы - филоподии, длина которых может достигать 50 мкм (разд. 19.7.7). Эти выступы клеточной поверхности весьма подвижны, они могут очень быстро появляться и исчезать. Видимо, они действуют подобно щупальцам, которыми клетка исследует окружающее пространство;

те микрошипы, которые прочно прикрепляются к какому-то субстрату, направляют движущуюся клетку к этому более адгезивному участку, а те, которым прикрепиться не удалось, перемещаются.по верхней стороне клетки назад и там втягиваются.

Помимо микрошипов ползущие клетки и конусы роста периодически выбрасывают из своего активно продвигающегося («переднего») края тонкие пластинчатые отростки, получившие название ламеллоподии. Как и микрошипы, одни ламеллоподии успешно прикрепляются к субстрату, СКОРОСТИ РОСТА НА ПЛЮС- И МИНУС-КОНЦАХ РАЗЛИЧНЫ Сборка (полимеризация) и разборка (деполимеризация) актиновых филаментов осуществляются путем присоединения и отделения мономеров на концах филамента. В процессе сборки фипамент растет на одном из концов быстрее, чем на другом;

быстро растущий конец называют плюс-концом, а медленно растущий - минус-концом. Различие в скоростях роста противоположных концов обусловлено тем, что каждая субъединица, присоединяясь к полимеру, изменяет свою конформацию.

Это конформационное изменение влияет на присоединение субъединицы преимущественно на одном из концов.

КРИТИЧЕСКАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ СУБЪЕДИНИЦ Число субъединиц, присоединяющихся к полимеру за 1 с, пропорционально концентрации свободных субъединиц (kacc. [C] ) ;

в то же время субъединицы диссоциируют от концов полимера с постоянной скоростью (kдисс ), от [ С ] не зависящей. По мере роста полимера свободные субъединицы расходуются и [С] снижается до тех пор, пока не достигает постоянной величины — критической концентрации (Сc), при которой скорость присоединения субъединиц к полимеру равна скорости их отделения от него. В этом состоянии равновесия kасс. Сс = kдисс., откуда И хотя значения kасс и kдисс для плюс- и минус-концов будут различны, их отношения kдисс/kасс значит и Сс, должны быть одинаковы на обоих концах. Это обусловлено тем, что при отделении субъединицы от любого конца полимера разрушаются совершенно одинаковые связи, а конечные состояния субъединиц после этого тоже идентичны. Таким образом, изменение свободной энергии ДС при отделении субъединицы, определяющее константу равновесия для ассоциации субъединицы С концом (см. табл. 3-3), на обоих концах одно и то же;

если плюс-конец растет вчетверо быстрее, чем минус-конец, то и укорачиваться он должен тоже вчетверо быстрее.

Итак, при [С] <С0 оба конца растут;

при [С 1 > С0 оба конца укорачиваются (см. рис. 11 41) ГИДРОЛИЗ АТР ПРИВОДИТ К ИЗМЕНЕНИЮ КОНСТАНТЫ РАСНОВЕСИЯ НА КАЖДОМ ИЗ КОНЦОВ Каждая молекула актина несет прочно связанную молекулу АТР. Вскоре после коформационного изменения субъединицы актина при ее присоеди-нии к полимеру этот АТР гидролизуется до ADP. который остается прочно связанным с актином.

Гидролиз АТР уменьшает сродство субъединицы к соседним субъединицами и тем самым увеличивает вероятность ее отделения от любого конца. Обычно присоединяется к филаменту форма, а покидает его форма (которая затем в растворе превращается в, так что процесс отделения субъединицы от полимера не является просто обращением реакции присоединения.

Расмотрим события, происходящие на плюс-конце:

Как и прежде, полимер будет расти, пока [ С ] не снизится до СС. Для большей наглядности мы можем Пренебречь величинами kасс и kдисс как малый;

рост полимера прекратится при kacc. CC = kдисс., т.е. С0 = kдисс./kасс. = 1/К Это не истинное равновесие, а стационарное состояние, поскольку гидролизованный АТР должен быть восполнен путем обмена нуклеотидов на свободной субъединице ( ) ТРЕДМИЛЛИНГ Так как kасс и kдисс относятся к различным реакциям, их отношение kдисс/kасс не обязательно будет одинаковым на разных концах полимера.

Действительно, оказалось, что гидролиз АТР создает для противоположных концов различные критические концентрации, причем Сс (для минус-конца) > сс (для плюс-конца).

Если оба конца полимера "открыты", полимеризация будет преобладать, пока [С] не достигнет некоторого уровня выше С для плюс конца и ниже Сс для минус-конца (см. рис. 11-14). В этом стационарном состоянии нз •плюс-конце будет идти сборка субьединиц в полимер, а на минус-конце — разборка полимера, причем скорости этих процессов будут одинаковы, так что длина полимера не будет изменяться, несмотря на перемещение субъединиц в полимере — тредмиллинг:

Для сборки филаментов гидролиз АТР не нужен. В подходящих условиях полимеризуются и мономеры актина, несущие негидролизуемый аналог АТР. Однако образующиеся при этом филаменты не способны к тредмиллингу - он возможен лишь благодаря гидролизу АТР, который сопутствует полимеризации.

Рис. 11-43. Актиновые филаменты в переднем крае культивируемого фибробласта. А. Электронная микрофотография цельного переднего края клетки, экстрагированной неионным детергентом для удаления плазматической мембраны и основной массы растворимых белков. Обратите внимание на ориентированную сетку актиновых филаментов в ламеллоподии, в которую погружен микрошип. Б. Схема расположения актиновых филаментов ламеллоподии. (А-J.V. Small, J. Cell Biol. 91: 695-705, 1981. С разрешения Rockefeller University Press.) другие же «соскальзывают» и в этом случае тоже волнообразно перемещаются назад по верхней поверхности клетки - этот процесс получил название «раффлинга» (ruffling-волнение, рябь) (рис. 11-42).

Ламеллоподию можно рассматривать как двумерный вариант микрошипа;

на ее переднем крае нередко находится ряд коротких микрошипов. Если клетку осторожно зафиксировать и окрасить для электронной микроскопии, актиновые филаменты в ламеллоподиях двигавшейся клетки будут выглядеть гораздо более организованными, чем в других участках кортекса;

упорядоченные группы филаментов вытянуты к переднему краю, где их плюс-концы упираются в плазматическую мембрану (рис. 11-43).

Исследование движущихся клеток в культуре показывает, что тредмиллинг мономеров в актиновых филаментах на переднем крае клетки идет гораздо быстрее, чем в филаментах, образованных in vitro. Движение молекул актина в клетке можно выявить в экспериментах с «гашением» флуоресценции. Если флуоресцентно меченные молекулы актина инъецировать в движущуюся клетку, они быстро включаются во все актиновые филаменты. Если теперь с помощью лазерного луча разрушить флуоресцирующую метку в небольшом пятнышке на тонком переднем крае клетки, то можно увидеть, как это темное пятнышко постепенно перемещается от края клетки внутрь со скоростью около 0,8 мкм/мин, что указывает на быстрый тредмиллинг молекул актина в филаментах ламеллоподии и микрошипов (рис. 11-44). Очевидно, мономеры актина все время присоединяются к плюс-концам у плазматической мембраны и отделяются от минус-концов в глубине клетки.

Если таким же образом погасить флуоресценцию актиновых филаментов на небольшом участке в любой другой области клетки, свечение через несколько минут восстановится без всякого видимого перемещения: очевидно, в организации или поведении актина в переднем крае клетки есть какие-то особенности. Было высказано предположение, что непрерывная полимеризация актина непосредственно под плазматической мембраной может использоваться для вытягивания переднего края клетки и помогать тем самым ее движению вперед (см. разд. 11.6.5). Изучение механизма перемещения спермиев некоторых беспозвоночных действительно показало участие в этом процессе полимеризации актина.

Рис. 11 -44. Тредмиллинг актина в культивируемых фибробластах. Флуоресцирующие молекулы актина были введены путем микроинъекции в клетку, где они включились в актиновые филаменты. Небольшое пятнышко на актиновом филаменте в переднем крае клетки было «погашено» лучом лазера. Затем клетку фотографировали через определенные промежутки времени при помощи флуоресцентного микроскопа с видеоприставкой (разд. 4.1.6). Быстрое перемещение пригашенного пятна назад говорит о том, что молекулы актина непрерывно движутся по филаменту, удаляясь от переднего края.

11- 11.2.12. Взрывообразная полимеризация актина способствует образованию акросомалыгого отростка у спермиев некоторых беспозвоночных [27] Хотя появление многих выступов на клеточной поверхности, как полагают, зависит от полимеризации актиновых филаментов, о механизме запуска этого процесса мало что известно. Одно из исключений-акросомальная реакция у спермиев некоторых беспозвоночных (разд.

15.4.1). У спермия голотурии, например, область акросомы (в головке) «битком набита» неполимеризованным актином, связанным с небольшим белком профилином, которого довольно много в большинстве животных клеток. Профилин образует с молекулами актина эквимолярный комплекс и блокирует тем самым стадию нуклеации при самопроизвольной полимеризации актиновых филаментов, однако на рост плюс-концов уже имеющихся филаментов он значительного влияния не оказывает. Когда спермий вступает в контакт с наружной оболочкой яйцеклетки, рН его цитоплазмы возрастает и актин отделяется от профилина. Происходит взрывообразная полимеризация актина, благодаря которой быстро формируется одетый мембраной длинный и тонкий акросомалънып отросток, который, как гарпун, прокалывает оболочку яйца, позволяя мембранам яйца и спермия слиться (рис. 11-45). Кроме полимеризации актина вытягиванию акросомального отростка, видимо, способствует также поступление воды в головку спермия, создающее в ней гидростатическое давление.

Процесс образования акросомального отростка указывает на то, что полимеризация актина, вероятно, может вызывать быстрое выпячивание плазматической мембраны, не нарушая ее непрерывности. Хотя маловероятно, что ламеллоподии и микрошипы образуются за счет изменения доступного для полимеризации пула мономеров актина, все же выпячивание их, по-видимому, происходит точно так же - благодаря локальному росту актиновых филаментов у самой плазматической мембраны.

11.2.13. Сборка актина находится под контролем плазматической мембраны [28] Клетка должна каким-то образом регулировать образование актинсодержащих выростов на своей поверхности, чтобы они появлялись только там, где нужно, и тогда, когда нужно. Например, макрофаг выпускает псевдоподии для захвата бактерии только в области контакта с ней (разд. 6.5.15), а полимеризация актина, помогающая выбросу акросомального отростка у активированного спермия голотурии, про- Рнс. 11-45. Последовательные стадии удлинения акросомального отростка у спермия голотурии. Фотографии сделаны с помощью светового микроскопа, первая - через 2 с после искусственной стимуляции акросомальной реакции, остальные - с интервалами 0,75с. Дуга справа от головки спермия - часть его изогнутого хвоста, попавшая в поле зрения. (L. G. Tilney, S, Inoufe, J. Cell Biol. 93: 820-827, 1982. С разрешения Rockefeller University Press.) исходит лишь тогда, когда головка спермия соприкасается со студенистым слоем на поверхности яйца.

«Время и место» для таких актин-зависимых ответов, по-видимому, регулируются путем контроля над участками нуклеации для роста актиновых филаментов около плазматической мембраны. В качестве иллюстрации можно взять хемотаксическую реакцию нейтрофилов. При местной бактериальной инфекции эти фагоцитирующие лейкоциты в больших количествах проникают сквозь стенки кровеносных капилляров и ползут сквозь ткани, пробираясь к очагу инфекции. К цели их направляют небольшие, свободно диффундирующие молекулы, которые высвобождаются в инфицированном участке. Процесс этот носит название хемотаксиса: клетки «чувствуют» градиент химического вещества и реагируют на него, изменяя направление своего движения. На поверхности нейтрофилов имеются белки-рецепторы, с помощью которых они могут обнаруживать очень низкие концентрации (~ 10-10 М) специфических хемоаттрактантов. При благоприятных условиях нейтрофилы способны воспринимать разницу концентраций пептида-хе-моаттрактанта на противоположных сторонах клетки всего лишь в 1 % и соответствующим образом переориентировать свой передний край, чтобы двигаться вверх по градиенту.

Некоторый свет на то, как связаны активация рецепторов и переориентация, пролили эксперименты, где изучали реакцию нейтрофилов на внезапное повышение концентрации пептида-хемоаттрактанта. Нейтрофилы при этом начинали выбрасывать микрошипы и ламеллоподии по всей своей поверхности, а доля полимеризованного актина в клетке за 20 секунд возрастала с 30 до 60%. Такая быстрая полимеризация актина происходила, вероятнее всего, благодаря увеличению числа участков нуклеации в плазматической мембране: когда такие обработанные хе моаттрактантом клетки подвергали лизису, лизат обладал повышенной способностью к нуклеации роста актиновых филаментов in vitro;

кроме того, каждый активированный рецептор клеточной поверхности индуцировал рост значительного числа актиновых филаментов. К роли контролируемой полимеризации актина в направленной миграции клеток мы вернемся позже, когда будем рассматривать клеточную подвижность как интегрированный ответ целой клетки (разд. 11.6.3).

11.11.

11.2.14. Некоторые вещества влияют на поведение клеток, изменяя состояние полимеризации актина [29] Можно было бы думать, что многие из производимых клеточным кортексом движений, как, например, фагоцитоз или локомоция, зависят от динамического равновесия между свободным (неполимерным) актином и актиновыми филаментами. Однако по сравнению со «взрывными» изменениями, происходящими в активированном спермин, изменения в полимеризации актина при этих движениях обычно слишком малы и краткоеременны, чтобы их легко было обнаружить. Однако на важную роль полимеризации и деполимеризации актина в таких движениях указывают эффекты ряда веществ, которые предотвращают изменения в состоянии актина и тем самым нарушают его двигательную функцию.

Например, цитохалазины (рис. 11-46)-семейство метаболитов, выделяемых различными плесневыми грибами,-подавляют многие формы подвижности клеток позвоночных, включая локомоцию, фагоцитоз, цитокинез, образование ламеллоподии и микрошипов и сворачивание эпителиальных пластов в трубки. В то же время эти вещества не влияют на расхождение хромосом в митозе, которое зависит в основном от функции микротрубочек веретена, и на мышечное сокращение, в кото- Рис. 11-46. Химическая структура цитохалазина В.

ром участвуют стабильные актиновые филаменты, не подвергающиеся сборке и разборке. Главная «точка приложения» для цитохалазинов - быстро растущие плюс-концы актиновых филаментов, с которыми цитохалазины специфически связываются и блокируют присоединение к ним новых мономеров актина.

Фаллоидин - высокотоксичный алкалоид бледной поганки (Атпіta phalloides) - в отличие от цитохалазинов стабилизирует актиновые филаменты, подавляя их деполимеризацию. Однако он очень плохо проникает сквозь плазматическую мембрану, и для того, чтобы он подействовал, его нужно вводить в клетку путем микроинъекции. При таком способе введения фаллоидин блокирует миграцию как амеб, так и культивируемых клеток позвоночных, что указывает на ключевую роль динамической сборки-разборки актиновых филаментов в этой форме подвижности. Так как фаллоидин специфически связываете именно с нитями актина, его флуоресцентные производные часто используют вместо антител к актину для выявления актиновых филаментов в клетке.

11.2.15. Свойства клеточного кортекса зависят от баланса кооперативных и конкурентных взаимодействий обширной группы актин-связывающих белков Об актин-связывающих белках сейчас известно куда больше, чем о белках, взаимодействующих с двумя другими важными видами нитчатых Рис. 11-47. Некоторые главные классы актин-связывающих белков, имеющихся в большинстве клеток позвоночных.

Рис 11-48. Некоторые примеры конкурентных и кооперативных взаимодействий между актин-связывающими белками. Тропомиозин н филамин прочно связываются сатиновыми филаментами, но при этом конкурируют друг с другом. Так как тропомиозин связывается с актиновыми нитями кооперативно, на обширных участках их сети будет преобладать либо тропомиозин, либо филамин. Другие актин-связывающие белки, такие как и актинин или миозин, будут конкурентно вытесняться из специфических участков;

например, а-актинин in vitro связывается по всей длине очищенных актиновых филаментов, но с такими же филаментами в клетке он связывается относительно слабо - там он находится в основном вблизи плюс-концов из-за конкуренции с другими белками. Напротив, кооперативные взаимодействия могут усиливать связывание;

так, тропомиозин, по-видимому, способствует связыванию миозина. Как полагают, множество подобных взаимодействий между актин-связывающими белками, представленными на рис. 11-47 (и некоторыми другими), обусловливает необычайное многообразие актиновых структур во всех эукариотических клетках.

цитоскелетных структур - промежуточными филаментами и микротрубочками. Наши знания о тех актин-связывающих белках немышечных клеток позвоночных, которые мы рассмотрели в этой главе, резюмированы на рис. 11-47. Эта картина далека от завершения;

каждая из указанных здесь функциональных категорий включает несколько их представителей, свойства которых слегка различаются. Кроме того, известны актин связываюшие белки без каких-либо очевидных функций, и несомненно также, что существуют еще не открытые актин-связывающие белки. В частности, клетки должны как-то различать противоположные концы актиновых филаментов и контролировать их ориентацию и местонахождение в цитоплазме. По-видимому, в механизмах такого различения используются «кэшрующие белки», которые избирательно связываются с плюс концами актиновых филаментов, удерживают их вблизи плазматической мембраны и регулируют присоединение мономеров актина. В отличие от этого минус-концы, относительно инертные в отношении как полимеризации, так и деполимеризации, возможно, часто остаются «открытыми».

Немало еще предстоит узнать о природе мембраносвязанных центров организации актина;

например, почти ничего не известно о молекулярной природе электроне плотного вещества в кончиках микроворсинок, которое, по-видимому, ответственно за организацию актиновой сердцевины этих выступов и за контроль их роста и регенерации (разд. 11.2.7).

Даже после того, как все компоненты актиновых сетей будут идентифицированы, останется еще более трудная задача - выяснить, к каким последствиям приводят их многочисленные взаимодействия. Белки, представленные на рис. 11-47, связываются с актином не одновременно и не случайным образом: они кооперируются или(и) конкурируют друг с другом, благодаря чему и возникает упорядоченная картина их взаимоотношений, столь важная для клетки (рис. 11-48). Кроме того, взаимодействия компонентов сети модулируются локальными изменениями в концентрациях ионов и механическими силами, растягивающими или сжимающими сеть и тем самым сдвигающими ее компоненты относительно друг друга. В связи с этим понятно, что изучение всей этой ключевой части цитоскелета находится еще в начальной стадии.

Заключение В эукариотических клетках имеется особый кортикальный слой акт новых филаментов, лежащий непосредственно под плазматической мембраной. В целом он представляет собой однородную трехмерную сеть обладающую благодаря поперечным сшивкам, свойствами геля. Вместе с тем кортикальные актиновые филаменты образуют и ряд специализированных структур. Например, пучки актиновых филаментов, находящихся в комплексе с миозином, прикрепляются к плазматической мембране и обеспечивают клетку структурами, способными к сокращению. В других участках контролируемая полимеризация актиновых филаментов на их плюс-концах способна выпячивать плазматическую мембрану наружу, создавая подвижные выступы клеточной поверхности. Разнообразие структур кортекса и выполняемых ими функций за-висит от обширного спектра актин-связывающих белков, которые cшивают актиновые филаменты в рыхлый гель, объединяют их в жесткие пучки, движутся по актиновым филаментам, создавая механическое усилие, или прикрепляют их к плазматической мембране.

Некоторые из белков, выполняющих эту последнюю функцию, прикрывают плюс-концы актиновых филаментов, контролируя тем самым их полимеризацию и деполимеризацию в клетке. Именно этим белкам, как полагают, принадлежит ключевая роль в сложных движениях клеточной поверхности, например при фагоцитозе или при перемещении клеток по субстрату.

11.3. Движение ресничек [30] После мышечного сокращения наиболее изученным видом клеточной подвижности является биение ресничек. Реснички - это миниатюрные волосовидные образования толщиной около 0,25 мкм, построенные из микротрубочек (микротрубочки - это вторая из трех главных груші нитевидных элементов цитоскелета). Реснички имеются у клеток многих типов и встречаются у большинства животных и некоторых низших растений. Их главная функция - создавать ток жидкости около поверхности клетки или продвигать клетку вперед сквозь толщу воды. Простейшие, например, используют реснички и для передвижения, и для сбора пищевых частиц. У человека огромное множество ресничек (10' и более на 1 см2), принадлежащих клеткам эпителия нижних дыхательных путей, непрерывно перемещает слизь с частицами пыли и остатками отмерших клеток вверх, к ротовой полости, где слизь проглатывается и удаляется. Реснички обеспечивают также передвижение яйцеклетки по яйцеводу, а сходная с ними структура - жгутик -движет сперматозоиды позвоночных.

Подобно тому как изучение мышечного сокращения вносит большой вклад в наше понимание двигательных процессов на основе актина и миозина в немышечных клетках, так и наши знания о механизме биения ресничек помогают понять, каким образом системы микротрубочек порождают движение иного рода - например, обеспечивают внутриклеточный транспорт или процессы, связанные с митозом.

11.3.1. Для ресничек и жгутиков характерны колебательные движения - волны изгиба Реснички движутся координированно, образуя на поверхности клетки однонаправленные бегущие волны (рис. 11-49). Каждая ресничка работает подобно крошечному хлысту: активный удар вперед, при котором ресничка полностью выпрямляется и преодолевает сопротивление окру- Рис. 11-49, Микрофотографии ресничного эпителия из кишки морского червя, полученные с помощью панирующего электронного микроскопа. Хотя реснички распределены по всей поверхности равномерно, их биение координируется таким образом, что возникают ряды бегущих в одном направлении волн. Эти волны более отчетливо видны при меньшем увеличении справа).

жающей жидкости, сменяется пассивной фазой, во время которой она возвращается в исходное положение, изгибаясь при этом так, чтобы уменьшить сопротивление среды (рис. 11-50, А). Циклы соседних ресничек едва заметно сдвинуты во времени, что приводит к волнообразной картине, которую можно видеть под микроскопом.

Жгутики спермиев и многих простейших по своей внутренней структуре очень похожи на реснички, но обычно они гораздо длиннее, и характер движения у них иной: не удары хлыста, а бегущие квазисинусоидальные волны (рис. 11-50, Б). Тем не менее молекулярная основа движения здесь одна и та же. Следует, однако, отметить, что жгутики бактерий - это нечто совсем иное, чем реснички и жгутики эукариотических клеток (см. разд. 12.5.4).

11.3.2. Ресничка содержит пучок параллельных микротрубочек, образующих структуру типа 9+ Биение реснички обусловлено изгибанием ее осевой структуры - так называемой аксонемы. Это сложный комплекс микротрубочек и связанных с ними белков. Микротрубочки обычно представляют собой полые белковые цилиндры с наружным диаметром 25 нм (см. ниже). В аксономе они видоизменены и расположены весьма характерным образом. Открытие этой системы явилось одним из самых впечатляющих результатов ранних электронно-микроскопических исследований: девять сдвоенных трубочек расположены по окружности, в центре которой находятся две одиночные микротрубочки (рис. 11-51). Такая структура типа 9 + 2 характерна для ресничек и жгутиков почти всех эукариотических организмов, от простейших до человека. Микротрубочки тянутся Рис. 11-50. Различный характер биения ресничек и жгутиков. А. Удар реснички (например, реснички эпителия дыхательных путей) напоминает гребное движение пловца. За рабочим ходом (стадии 1 и 2), при котором жидкость прогоняется по поверхности клетки, следует совершенно иной по характеру возвратный ход (стадии 3, 4, 5). Каждый цикл длится обычно 0,1-0,2 с и создает силу, перпендикулярную оси аксонемы. Б. Здесь для сравнения показано волнообразное движение жгутика у спермия оболочника. Клетка была заснята при стробоскопическом освещении с частотой 400 вспышек в 1 с. Обратите внимание, что волны, имеющие постоянную амплитуду, непрерывно движутся от основания жгутика к его концу. В результате клетка движется прямо вперед, как бы отталкиваясь от своей аксонемы, т.е. совершенно иначе, чем в случае с ресничкой. (Б-с любезного разрешения С. J. Brokaw.) Рис. 11-51. Электронная микрофотография жгутика зеленой водоросли Chlamydomonas (поперечный срез) (с любезного разрешения Lewis Tilney). Видна характерная структура типа 9 + 2, свойственная почти всем ресничкам и жгутикам эукариот. Схема, показывающая основные компоненты этой структуры, представлена на рис. 11-53.

по всей длине аксонемы, которая обычно составляет около 10 мкм, в некоторых клетках может достигать 200 мкм.

Если микротрубочки центральной пары одинаковы, и каждая представляет собой отдельный полный цилиндр, то наружные дублеты состоят из двух слившихся микротрубочек - одной полной и одной неполной (субфибриллы А и В соответственно). По линии контакта эти субфибриллы имеют участок общей стенки. На поперечных срезах видно, что полная микротрубочка дублета образована кольцом из субъединиц, а неполная (субфибрилла В)-только из 11.

11.3.3. Микротрубочки - полые цилиндры, образованные молекулами тубулина [31] Микротрубочки состоят из молекул тубулина, каждая из которых представляет собой гетеродимер, образованный двумя прочно связанными глобулярными субъединицами. Эти субъединицы - родственные белки (около 450 аминокислот в каждом), получившие название - и тубули нов. Хотя тубулин присутствует практически во всех клетках эукариот, главным источником его для биохимических исследований служит головной мозг позвоночных: 10-20% растворимого белка, экстрагируемого из мозга большинством методов, составляет тубулин;

и это неудивительно, так как отражает высокое содержание микротрубочек в длинных аксонах и в дендритах нервных клеток.

В ходе сборки микротрубочек молекулы тубулина образуют линейные протофиламенты, в которых -тубулин одного димера контактирует с -тубулином следующего. Целая микротрубочка содержит 13 таких протофиламентов, уложенных параллельно бок о бок вокруг центральной области, которая на электронных микрофотографиях кажется пустой (рис. 11-52). Так как все протофиламенты уложены параллельно и имеют одинаковую ориентацию, микротрубочки, подобно актиновым филаментам, являются полярными структурами, у которых есть плюс концы, растущие быстро, и минус-концы, растущие медленно (см. схему 11-2). Плюс-концы микротрубочек находятся на кончике реснички.

Подобно актину и многим другим белкам цитоскелета, тубулин у большинства организмов закодирован целым семейством близко родственных генов. У одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas оказалось два гена -тубулина и два гена -тубулина, а у плодовой мушки Drosophila-no четыре и того и другого. Аминокислотные по- Рис. 11-52. А. Электронная микрофотография поперечного среза микротрубочки, где видно кольцо из 13 субъединиц, каждая из которых соответствует отдельной молекуле тубулина. Б. Электронная микрофотография микротрубочки (негативный контраст). В и Г. Схемы строения микротрубочки, показывающие, как молекулы тубулина образуют стенку цилиндра. В-13 молекул на поперечном разрезе микротрубочки;

Г - вид сбоку короткого отрезка микротрубочки с уложенными в продольные ряды (протофиламенты) молекулами тубулина. Каждый из протофиламентов состоит из цепи молекул тубулина, представляющих собой -гетеродимеры. Микротрубочка-полярная структура;

разные концы молекулы тубулина ( и ) обращены к разным концам микротрубочки. [С любезного разрешения Richard Linck (А) и Rolley Williams (Б);

Г-по данным Linda Amos.] следовательности тубулинов у разных организмов также очень сходны, хотя они не столь консервативны, как у актина:

-тубулин дрожжей, например, на 70% идентичен с куриным -тубулином, тогда как актины этих видов имеют более 90% идентичных аминокислотных остатков.

Необычайная эволюционная консервативность актина и тубулина может, по крайней мере отчасти, быть следствием структурных ограничений, которые накладываются связыванием их с многочисленными (и разнообразными) белками. Молекулы тубулина, так же как и актина, взаимодействуют не только между собой, но и со многими вспомогательными белками. Как мы увидим, эти белки модифицируют свойства микротрубочек и соединяют их с другими структурами клетки. По-видимому, большинство случайных мутационных изменений нарушают хотя бы одну из функций микротрубочек или актиновых филаментов и поэтому оказываются вредными для организма.

Все ныне известные тубулины, будучи смешаны in vitro, образуют одинаковые микротрубочки. Тем не менее кажется вероятным, что некоторые вариации в структуре тубулинов имеют для клетки функциональное значение. В частности, у высших позвоночных участки тубулинов обоих типов ( и ), содержащие необычно много кислых аминокислотных остатков, обнаруживают явные тканеспецифические различия. Эта область в молекулах тубулина, как полагают, участвует в связывании вспомогательных белков, и изменения ее аминокислотной последовательности могут изменять функции микротрубочек, влияя на связывание этих белков.

11.3.4. Вдоль стенки дублета микротрубочек проходит длинная тонкая нить [32] Хотя большинство микротрубочек состоит, по-видимому, только из субъединиц тубулина, для построения специальных видов микротрубочек (каковы, например, дублеты микротрубочек в ресничке) используются дополнительные белки. Если заставить микротрубочки ресничек или жгутиков диссоциировать в разбавленном солевом растворе, то из такой смеси удается выделить особенно устойчивые фрагменты субфибриллы А-ленты, состоящие из двух-четырех протофиламентов. Помимо тубулина эти фрагменты содержат белок тектин, образующий длинные нити толщиной 2-3 нм, видимо, родственные промежуточным филаментам. Тектиновые филаменты вытянуты вдоль стенки дублета микротрубочек и, вероятно, способствуют образованию общей стенки А- и В-субфибрилл. Как полагают, эти филаменты или какие-то еще не известные нитевидные молекулы определяют расположение на микротрубочках специальных периодических структур, которые будут описаны ниже.

11.3.5. Аксонема ресничек и жгутиков содержит белковые связки, «ручки» и «спицы» [33] В аксонеме с микротрубочками связано много других белковых структур, взаимодействие которых обеспечивает ресничку энергией и дает возможность использовать эту энергию для волнообразных движений. Пожалуй, самые важные из этих структур - короткие боковые выступы («ручки»), отходящие от каждого дублета микротрубочек внешнего кольца по направлению к соседнему дублету (рис. 11-53). Пары таких выступов располагаются по всей длине субфибриллы А с интервалами в 24 нм. Они состоят из белка, называемого динеином, и, как мы увидим, играют важную роль в движении ресничек и жгутиков. Другой белок – нексин - образует между соседними дублетами поперечные связи, рас- Рис. 11-53. Схема поперечного среза реснички (соответствующая микрофотографии на рис. 11-51). Вдоль всей реснички с определенной периодичностью расположены различные структуры, отходящие от микротрубочек (см. табл. 11-2).

положенные на несколько большем расстоянии друг от друга, чем динеиновые «ручки»;

по-видимому, они весьма эластичны и стягивают аксонему по окружности, ограничивая скольжение соседних микротрубочек.

От каждого наружного дублета внутрь отходит радиальная «спица», доходящая до внутреннего чехла, окружающего центральную пару одиночных микротрубочек (рис. 11-53). Если смотреть на аксонему сбоку, то все эти структуры - динеиновые ручки, нексиновые связки, радиальные «спицы» и отростки центрального чехла - предстанут в виде боковых выступов, повторяющихся с характерной для каждой из этих структур периодичностью (табл. 11-2).

Таблица 11-2. Основные белковые структуры аксонемы Компоненты аксонемы (периодичность Функция расположения вдоль аксонемы) Тубулин (8 нм) Динеиновые ручки (24 нм) Главный компонент микротрубочек Выступают из дублетов микротрубочек, взаимодействуют с соседними дублетами, вызывая изгибание Нексиновые связки Удерживают соседние дублеты микротрубочек вместе (86 нм) Радиальные спицы Тянутся от каждого из 9 наружных дублетов по направлению к центральной паре (29 нм) Выступы внутреннего чехла (14 нм) Отходят в виде ряда боковых ручек от центральной пары микротрубочек;

вместе с радиальными спицами регулируют характер биения реснички Рис. 11-54. Электронная микрофотография изолированной аксонемы (из реснички Tetrahymena), подвергнутой кратковременному воздействию трипсина с целью частично разрушить белковые связи, поддерживающие ее нормальную структуру. После обработки АТР отдельные дублеты микротрубочек скользят относительно друг друга, что ведет к значительному-вплоть до 9-кратного-увеличению длины аксонемы. (F.D.

Warner, D.R. Mitchell, J. Cell Biol. 89: 35-44, 1981. С разрешения Rockefeller University Press.) 11- 11.3.6, Аксонема движется благодаря скольжению микротрубочек [34] Если жгутик отделить от клетки с помощью лазерного луча, он сохраняет способность производить волнообразные движения. Это означает, что двигательный аппарат находится в самой аксонеме жгутика, а не в его основании (как в случае жгутиков бактерий, см. разд. 12.5.4).

Действительно, даже изолированная аксонема может совершать движения в солевом растворе, содержащем АТР.

Изгибание ресничек и жгутиков обусловлено взаимным скольжением микротрубочек. Это было показано в экспериментах, где изолированную аксонему обрабатывали протеолитическими ферментами, которые разрушают нексиновые связки и радиальные спицы, оставляя неповрежденными динеиновые ручки и сами микротрубочки. Если к такой частично «переваренной» аксонеме добавить АТР в концентрации всего лишь 10 мкМ, она начинает удлиняться (причем длина ее может превысить первоначальную в 9 раз);

это происходит из-за того, что образующие аксонуму волокна (дублеты) телескопически выдвигаются из ослабленной структуры (рис. 11-54). По-видимому, соседние наружные дублеты активно скользят относительно друг друга, будучи освобождены от скрепляющих боковых сшивок (например, нексиновых). В интактной же структуре это скользящее движение преобразуется в изгиб, что схематически показано на рис. 11-55.

11.3.7. За скольжение ответствен динеин [35] Если дублеты микротрубочек способны активно скользить друг по другу, то должна существовать сила, вызывающая это движение. Эта сила не может создаваться нексиновыми сшивками, так как после их разрушения путем протеолиза способность к скольжению сохраняется. Между тем динеиновые ручки при протеолизе не разрушаются. Обычно ручки, отходящие от каждого наружного дублета аксонемы, не дотягиваются до соседнего дублета, однако они приходят в соприкосновение с ним, когда ресничка израсходует весь свой запас АТР (рис. 11-56).

Диненн - это крупный белковый комплекс, содержащий две или три (в зависимости от источника) глобулярные головки, соединенные с общим основанием тонкими гибкими нитями (рис. 11-57). Каждая глобулярная головка обладает АТРазной активностью, которая усиливается примерно в шесть раз при ассоциации с микротрубочкой. Вся динеиновая ручка состоит из одной молекулы динеина. Кинетические исследования Рис, 11-55. Взаимное скольжение двух наружных дублетов микротрубочек (слева) приводит к изгибу, если дублеты скреплены на одном из концов (справа). Основания молекул динеина соединены только с А-трубочкой, оставляя головки свободными, так что они могут контактировать с соседней В-трубочкой. По-видимому, иная структура В-трубочки мешает связыванию с ней основания молекулы динеина. Такая асимметрия в организации молекул динеина необходима, чтобы предотвратить бесплодное «перетягивание каната» между соседними микротрубочками;

возможно, именно поэтому каждая из девяти внешних микротрубочек представляет собой дублет А-В.

Рис. 11-56. Электронная микрофотография реснички (после замораживания-травления). Видны динеиновые ручки, отходящие от дублета микротрубочек через равные интервалы. (С любезного разрешения John Heuser.) Рис. 11-57. Динеин - крупный белковый комплекс (мол. масса около 2 млн.), в его состав входят от 9 до 12 полипептидных цепей, самая большая из которых с мол. массой около 450 000. Основание молекулы прочно связано с А-трубочкой (это связывание независимо от АТР), тогда как большие глобулярные головки имеют участки для АТР-зависимого присоединения к другой микротрубочке. Когда головки гидролизуют связанный с ними АТР, они движутся по направлению к минус-концу этой второй микротрубочки, вызывая таким образом относительный продольный сдвиг двух соседних дублетов в ресничке или жгутике (см. рис. 11-55).

показывают, что головки, видимо, вызывают скольжение микротрубочек в ресничке с помощью механизма, который в своей основе похож на работу миозиновых головок в мышце (разд. 11.1.10): однонаправленное - от плюс-конца к минус-концу-движение головок динеина по микротрубочке обеспечивается повторными циклами конформационных изменений в каждой головке, обусловленных связыванием и гидролизом АТР. Это движение и создает силу, которая стремится сдвинуть сосед-ний дублет микротрубочек к концу аксонемы (см. рис. 11-55).

11- 11- 11.3.8. Скольжение микротрубочек должно регулироваться, чтобы оно могло вызвать изгиб ресничек [36] Если бы все динеиновые ручки активировались одновременно, как головки миозина в сокращающейся мышце, то аксонема попросту закрутилась бы в тугую спираль. Поэтому для того, чтобы возник локальный изгиб реснички и чтобы этот изгиб распространялся в виде волны от ее основания до самого кончика, должны существовать специальные регуляторные механизмы, координирующие активность молекул динеина. Эта регуляция не может зависеть от потоков Са2+ или других ионов, поскольку аксонема способна изгибаться и после удаления плазматической мембраны. Судя по всему, активация отдельных динеиновых ручек зависит от механических перемещений других компонентов аксонемы, и сигнал передается динеину через белок-белковые взаимодействия. Важную роль играет также упругость жгутика, который в отсутствие активной работы стремится восстановить равновесную конфигурацию всей структуры.

11- 11.3.9. Аксонему можно изучать генетическими методами [37] Если выделить аксонемы в очищенном виде и подвергнуть их белки анализу с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (разд. 4.4.5), в них можно обнаружить около 200 различных полипептидов. Изучение функций этих белков и их локализации в аксонеме значительно облегчается при использовании для этой цели мутантних организмов. Излюбленный объект для таких исследований - одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii, имеющая два жгутика, с помощью которых она плавает (рис. 11-58). Было выделено много мутантов этой водоросли с нарушенной подвижностью. У некоторых из них имеются дефекты в механизме сборки жгутика, и поэтому жгутики не образуются или получаются рудиментарными;

у других жгутики есть, но они неподвижны или движутся очень медленно. На электронных микрофотографиях таких мутантных жгутиков можно видеть различные структурные аномалии. У одного класса неподвижных мутантов единственным заметным изменением оказалась потеря динеиновых ручек. У другого класса нет только радиальных спиц, тогда как у третьего отсутствуют одновременно центральная пара микротрубочек и центральная капсула. Изолированные, свободные от мембран аксонемы от мутантов всех трех классов не способны двигаться в присутствии АТР.

Наиболее ценными для понимания работы жгутиков оказались такие мутанты, которые могут двигаться несмотря на утрату некоторых компонентов аксонемы. Выделены, например, медленно плавающие мутанты, у которых нет внутренних или внешних динешювых ручек;

Рис. 11-58. Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii. Этот организм плавает с помощью двух жгутиков, которые совместно производят хлыстообразные движения, напоминающие гребок пловца (в отличие от жгутика спермия). (С любезного разрешения John Hopkins.) следовательно, для создания движущего усилия достаточно присутствия одного-любого - типа динеина, но в норме каждый из них вносит свой вклад в подвижность жгутика. Более неожиданными оказались вторичные мутации, которые восстанавливают подвижность неподвижных жгутиков, лишенных центрального дублета или радиальных спиц, без восстановления исчезнувших компонентов. Существование таких мутантов позволяет думать, что отсутствие центрального дублета или комплекса радиальных спиц каким-то образом выключает активность динеиновых ручек, «замораживая» мотор жгутика, а мутация во втором гене «отключает выключатель» и восстанавливает биение аксонемы. Интересно, что подвижные двойные мутанты с дефектной сердцевиной могут двигаться только по жгутиковому типу и не способны к обычным для Chlamydomonas хлыстообразным ударам, характерным для ресничек. По-видимому, ресничный тип движения требует более сложной структуры, чем волнообразное движение типичного жгутика (см. рис. 11-50).

Дефекты ресничек и жгутиков встречаются и у человека, например при различных формах наследственного мужского бесплодия, обусловленного неподвижностью спермиев. В зависимости от типа генетической аномалии жгутик спермия может быть лишен динеиновых ручек, головок радиальных спиц или центральной капсулы с одной или обеими центральными микротрубочками. Точно такие же дефекты обнаруживаются в клетках ресничного эпителия этих индивидуумов, и нередко они страдают хроническими респираторными заболеваниями - рецидивирующим бронхитом и хроническим синуситом: из-за нарушенной функции ресничного эпителия у них не происходит надлежащего удаления слизи из бронхов и придаточных пазух носа. Примечательно, что около половины людей, страдающих таким синдромом неподвижных ресничек, имеют также весьма редкую особенность - situs inversus viscerum, т. е. обратную симметрию тела, когда сердце расположено справа, печень и аппендикс слева и т.д. (весь комплекс аномалий носит название синдрома Картагенера). В связи с этим было высказано предположение, что однонаправленное биение ресничек на ранних стадиях развития организма может играть ключевую роль в определении нормальной асимметрии нашего тела.

Рассмотрев движение ресничек и жгутиков, мы перейдем теперь к вопросу о том, как они образуются.

11.3.10. Центриоли выполняют в клетке две различные функции [38] Можно оторвать у Chlamydomonas пару ее жгутиков так, что центриоли сохранятся;

в этом случае жгутики быстро образуются вновь.

Почти все необходимые для этого белковые компоненты имеются в растворимой форме в цитоплазме клетки;

из них и строятся новые жгутики.

Некоторые стадии сборки могут происходить и в бесклеточных экстрактах: молекулы тубулина полимеризуются в микротрубочки (этот процесс мы подробнее рассмотрим в разделе 11.4), а динеиновые ручки могут снова прикрепляться к аксонеме, с которой они были предварительно смыты раствором с высокой ионной силой. Однако сами по себе белки аксонемы не способны восстановить характерную структуру 9 + 2. Для этого необходима «затравка», играющая роль матрицы, на которой происходит дальнейший рост. В клетке такой затравкой служит иентриоль.

Центриоль - это небольшая цилиндрическая органелла толщиной около 0,2 мкм и длиной 0,4 мкм. Стенку центриоли образуют девять групп из трех слившихся микротрубочек (9 триплетов), причем каждый триплет наклонен в сторону центральной оси под углом 45° к огибающей окружности - как лопатки турбины (рис. 11-59). Соседние триплеты Рис. 11-59. Электронная микрофотография поперечного среза, проходящего через три центриоли в кортексе простейшего. Каждая центриоль (называемая также базальным тельцем) образует нижнюю часть аксонемы реснички. Справа схематическое изображение центриоли.

Центриоль состоит из девяти триплетов микротрубочек, причем каждый триплет (c b a) содержит одну полную микротрубочку и две примыкающие к ней неполные микротрубочки. Особые белки образуют поперечные сшивки, поддерживающие цилиндрическую структуру (выделены цветом). (С любезного разрешения D. Т. Woodrum, R. W. Linck.) соединены между собой через определенные интервалы, а на электронных микрофотографиях часто видны бледные белковые «спицы», идущие к каждому триплету из центральной области, что напоминает колесо телеги (рис. 11-59, А). Нередко центриоли бывают объединены в пары, где они расположены под прямым углом друг к другу (рис. 11-60).

Центриоль - неизменный компонент аксонемы реснички, и в этом случае ее по традиции называют базалъным тельцем. Специальные отростки, называемые исчерченными корешками, соединяют эту центриоль с другими компонентами цитоскелета. При образовании или регенерации каждый дублет микротрубочек аксонемы берет начало от двух из трех микротрубочек триплета центриоли, так что девятилучевая симметрия центриоли сохраняется в строении аксонемы. Данные радиоавтографии указывают на то, что тубулин и другие белки аксонемы пристраиваются к дистальному концу всей структуры, т. е. к плюс- Рис. 11-60. На этой электронной микрофотографии показаны две новые центриоли, которые образовались в результате репликации двух материнских центриолей. На срезе одна центриоль в каждой паре видна в поперечном сечении, а другая в продольном, т.е. в каждой паре центриоли расположены перпендикулярно друг другу. (М. McGill, D. P. Highfield, Т. М. Monahan, R. В. Brinkky. J. Ultrastruct. Res. 57: 43-53, 1976.) концам микротрубочек. Как в аксонеме возникает центральная пара микротрубочек, не известно;

в центриоли этой пары нет.

Те центриоли, которые образуют базальные тельца ресничек, выполняют в клетке весьма специализированную функцию, так как реснички сами по себе - структуры специализированные. Наряду с этим почти во всех животных клетках имеется пара центриолей, которая служит как бы срединным элементом центросомы, или клеточного центра. Центросома (разд. 13.5.2) организует цитоплазматические микротрубочки в интерфазных клетках, а в делящихся клетках удваивается и дает начало двум полюсам митотического веретена (мы обсудим это в следующем разделе). Иногда центриоли могут выполнять поочередно то одну функцию, то другую: у Chlamydomonas, например, перед каждым митозом оба жгутика исчезают, а базальные тельца покидают свое место, чтобы стать полюсами веретена.

11.3.11. Новые центриоли обычно возникают путем дупликации уже имеющихся [39] На фоне непрерывного увеличения массы животной клетки в ходе клеточного цикла выделяются два дискретных акта дупликации:

удвоение числа хромосом (репликация ДНК) и удвоение центриолей. В культивируемых фибробластах последний процесс приблизительно совпадает по времени с началом синтеза ДНК. Прежде всего происходит разделение двух «половинок» центриолярной пары, а затем на каждой такой «половинке» достраивается дочерняя центриоль - снова под прямым углом к исходной (рис. 11-60). Незрелая центриоль содержит одиночных микротрубочек;

по-видимому, каждая микротрубочка затем становится матрицей при сборке триплетов, свойственных зрелой центриоли.

У позвоночных ресничные клетки могут нести сотни ресничек, и центриоли клеток-предшественников обеспечивают образование необходимого числа базальных телец. Например, при дифференцировке клеток ресничного эпителия яйцеводов и трахеи пара центриолей перемещается со своего обычного места около ядра в апикальную область клетки, где будут формироваться реснички. Там, вместо того чтобы образовать, как обычно, одну дочернюю центриоль, каждая материнская центриоль дает начало многочисленным электроноплотным «сателлитам».

Из этих сателлитов и образуются затем базальные тельца, которые мигрируют к плазматической мембране, чтобы инициировать там рост ресничек.

Однако известны случаи, когда центриоли, по всей видимости, возникают de novo. Так, хотя неоплодотворенные яйцеклетки многих животных лишены функционирующих центриолей и для первого митотического деления (после оплодотворения) используют центриоли спермиев (разд. 15.4.8), в определенных экспериментальных условиях (резкое нарушение ионного баланса или электрическая стимуляция) они могут образовывать различное число центриолей. Каждая такая центриоль инициирует образование небольшой фигуры звезды, и одна из этих звезд может затем использоваться клеткой для деления;

при этом из неоплодотворенной яйцеклетки развивается гаплоидный организм (такой ход событий называется партеногенезом - см. разд. 13.4.8). Вероятно, в цитоплазме неоплодотворенных яйцеклеток имеются какие-то предшественники центриолей, которые при особых обстоятельствах могут превращаться в новые настоящие центриоли.

Необычный способ удвоения центриолей и их непрерывность в длинном ряду клеточных поколений заставили в свое время предположить, что центриоли представляют собой полностью автономные, саморепли- цирующиеся органеллы. Хотя сейчас мы знаем, что это не так и при определенных условиях они могут образовываться в цитоплазме de novo, возможно все же, что какая-то часть информации, необходимая для формирования центриолей, содержится в них самих (подобно тому как размножение митохондрий и хлоропластов зависит от их собственных, внехромосомных генов-см. разд. 7.5). У Chlamydomonas группа генов, которые кодируют белки, участвующие в создании структуры базальных телец и аксонем, находится в дискретном генетическом элементе, и этот элемент передается дочерним клеткам независимо oт основных хромосом;

его природу и локализацию, однако, еще предстоит выяснить.

Заключение Реснички и жгутики эукариот содержат цилиндрический пучок из девяти дублетов микротрубочек. Скольжение дублетов относительно друг друга преобразуется в изгиб pecничкu или жгутика. Силу, сдвигающую дублеты, создают боковые динеиновые ручки, которые тянутся от каждого дублета к соседнему;

они используют для этого энергию гидролиза АТР. Ряд вспомогательных белков «увязывает» дублеты в цилиндрическую структуру и ограничивает амплитуду их скольжения. Другие вспомогательные белки образуют своего рода «молекулярна механическое реле», регулирующее активность динеина таким образом, что изгибание реснички совершается циклически, и это обеспечивает характерное для ресничек биение. Сложная структура аксонемы образуется путем самосборки белковых компонентов, а нуклеацию процесса сборки осуществляет цент-риоль (базальнеє тельце), которая служит матрицей для формирования специфической структуры аксонемы системы дублетов микротрубочек типа 9 + 2.

11.4. Цитоплазматические микротрубочки [40] Почти во всех животных клетках актин и тубулин содержатся в больших количествах, но тубулина в них все же, как правило, меньше.

Кроме того, поскольку микротрубочки толще, чем актиновые филаменты, для образования полимера одинаковой длины тубулина требуется примерно в 10 раз больше, чем актина (см. табл. 11-4). Поэтому общая длина актиновых филаментов в клетке по крайней мере в 30 раз больше общей длины микротрубочек. Это отражает фундаментальную разницу в структурной организации и функциях этих двух цитоскелетных полимеров: в то время как актиновые филаменты образуют соединенные сшивками сети и небольшие пучки в периферической цитоплазме, микротрубочки обычно существуют в виде отдельных нитей, которые расходятся в стороны через всю цитоплазму из небольшой области вблизи ядра. Микротрубочки образуют систему волокон, по которой могут перемещаться различные пузырьки и другие органеллы, ограниченные мембраной;

тем самым они влияют на полярность клетки, могут регулировать ее форму и движение и определяют ориентацию плоскости клеточного деления.

11.4.1. Микротрубочки - это высоколабильные структуры, чувствительные к антимитотическим агентам [41] Многие системы микротрубочек в клетках весьма лабильны, причем эта лабильность важна для их функции. Один из наиболее ярких примеров-митотическое веретено, которое образуется после того, как в начале митоза микротрубочки цитоплазмы распадаются (разд. 13.5.2).

Рис 11-61. Химическая структура колхицина.

Рис. 11-62. Полярность микротрубочек, выявленная методом «навешивания крючков». В данной группе все микротрубочки (они видны на этой электронной микрофотографии в поперечном разрезе) имеют одинаковую полярность. Крючки, образованные присоединившимися сбоку молекулами тубулина, изогнуты по часовой стрелке, и это означает, что мы смотрим на микротрубочки вдоль в направлении от плюс-конца к минус-концу. Полярность микротрубочки можно также выявить путем присоединения молекул динеина (не показано). (По U. Euteneuer, Cell Muscle Motil. 5: 1-82, 1984, с изменениями.) Таблица 11-3. Некоторые вещества, связывающиеся с тубулином (антимитотические агенты) Вещество Механизм действия Колхицин, колцемид, нокодазол Ингибируют присоединение молекул тубулина к микротрубочкам, вызывая деполимеризацию последних Винбластин, винкристин Вызывают образование паракристаллических агрегатов тубулина, что приводит к деполимеризации микротрубочек Таксол Стабилизирует микротрубочки, прочно связываясь с полимером Микротрубочки митотического веретена пребывают в состоянии необычайно быстрой сборки и разборки, что объясняет крайнюю чувствительность веретена к различным препаратам, способным связываться с тубулином (разд. 13.5.2). Один из алкалоидов безвременника осеннего, колхицин, использовался в лечебных целях еще древними египтянами. Молекулы колхицина (рис. 11-61) прочно связываются с молекулами тубулина (образуя эквимолярный комплекс) и препятствуют тем самым их полимеризации;

поэтому обработка делящихся клеток колхицином вызывает через несколько минут исчезновение митотического веретена и блокирует клетки в митозе. Вещества, обладающие подобным действием, называются антимитотическими агентами (табл. 11-3). Во многих случаях их действие обратимо, и удаление препарата дает возможность веретену образоваться вновь, а митозу завершиться. Так как разрушение микротрубочек веретена избирательно убивает многие быстро делящиеся клетки, ряд антимитотических препаратов, в частности вин-бластин и винкристин, широко используются в терапии рака.

Другое вещество - таксол - оказывает противоположное действие. Он прочно связывается с микротрубочками и стабилизирует их. Будучи добавлен к клеткам, он заставляет значительную часть тубулина включиться в микротрубочки. Подобно тому как стабилизация актиновых филаментов фаллоидином останавливает миграцию клеток, стабилизация микротрубочек таксолом фиксирует делящиеся клетки в митозе.

Так же как и полимеризация актиновых филаментов, сборка микротрубочек имеет сложную кинетику, что играет важную роль во многих клеточных процессах. Большая часть наших знаний о динамическом поведении микротрубочек была получена при изучении полимеризации очищенного тубулина in vitro.

11.4.2. Противоположные концы микротрубочек различны и растут с разной скоростью [42] Мы уже говорили о том, что микротрубочки обладают полярностью: мономеры тубулина в них определенным образом ориентированы.

Как и в случае актиновых филаментов, структурная полярность микротрубочек обусловливает различия между их двумя концами, важные для понимания того, как образуются микротрубочки в клетках. Если растворенному тубулину дать возможность некоторое время полимеризовать-ся на фрагментах аксонемы, а затем исследовать в электронном микроскопе то, что получилось, будет видно, что одни концы микротрубочек удлиняются втрое быстрей других. Быстро растущие концы были названы плюс-концами, а медленно растущие -минус-концами.

Полярность микротрубочек можно определить и на их поперечных срезах, если предварительно добавить к ним растворенные молекулы тубулина;

в определенных условиях мономеры тубулина будут при- соединяться к микротрубочкам не с концов, а с боков, образуя искривленные листки из протофиламентов. На поперечном срезе эти листа напоминают крючья, загнутые в ту или другую сторону в зависимости от полярности микротрубочки (рис. 11-62). Таким способом, например, удалось показать, что в аксонах нервных клеток и в ресничках все микротрубочки имеют одинаковую полярность: те их концы, что расположены дальше от тела клетки, всегда бывают плюс-концами. Когда микротрубочки растут от центров их организации (от центросом или полюсов веретена), их плюс-концы тоже всегда обращены вперед по направлению роста (рис. 11-63).

11- 11.4.3. Гидролиз нуклеотида усиливает нестабильность медленно растущих микротрубочек [43] В некоторых отношениях сборка молекул тубулина в микротрубочкя напоминает полимеризацию актина. Она самопроизвольно протекает in vitro и в норме сопровождается гидролизом одной молекулы связанного нуклеотида на каждый присоединенный мономер (нуклеотид в случае сборки тубулина - не АТР, a GTP, см. табл. 11-4). Энергия, освобождаемая при гидролизе нуклеотида, для полимеризации не нужна: тубулин благополучно полимеризуется и тогда, когда с ним связан негидролизуемый аналог GTP-GTPS. Однако гидролиз нуклеотида приводит к тому, что критическая концентрация для полимеризации на плюс-конце оказывается ниже, чем для полимеризации на минус-конце;

иными (словами, с плюс концом мономеры актина или тубулина связываются прочнее (см. схему 11-1 в разд. 11.2.10). Благодаря этому в случае актиновых филаментов возможен непрерывный тредмиллинг субъединиц по полимеру (разд. 11.2.10). Хотя в принципе тредмиллинг может происходить и в микротрубочках, фактически здесь, видимо, доминирует явление, получившее название динамической нестабильности.

Динамическую нестабильность можно продемонстрировать просто с помощью светового микроскопа, оборудованного темнопольной оптикой и видеоприставкой, наблюдая за процессом сборки микротрубочек из очищенного тубулина на предметном стекле. В этих условиях видно, что концы отдельных микротрубочек либо медленно растут, либо быстро укорачиваются;

каждая стадия длится многие секунды, а переход от ;

роста к укорочению и обратно происходит случайным образом Таблица 11-4. Сравнение полимеров актина и тубулина Актин Тубулин Мол. масса полипептида 42000 50000 (-тубулин) 50000 (-тубулин) Неполимерная форма Глобулярный мономер Глобулярный димер (1 +1) Нуклеотид, связываемый неполимерной АТР (1 на мономер) GTP (2 на димер) формой Структура полимера Спиральная нить Полая трубка из 13 протофиламентов Толщина фибриллярной структуры 8 нм 25 нм Число субъединиц на 1 мкм длины полимера 370 мономеров 1600 димеров Мол. масса на 1 мкм длины полимера 370 х 42000 = 15,5 х 106 1600 х 100000 =160 х Рис. 11-63. Минус-концы микротрубочек в клетках обычно находятся в центре организации микротрубочек, а плюс-концы часто располагаются вблизи плазматической мембраны.

НАБЛЮДАЕМОЕ ПОВЕДЕНИЕ МИКРОТРУБОЧЕК Микротрубочки - динамичные структуры, и процессы их сборки и разборки определяют, где и когда они будут существовать в клетке.

Подобно актиновым филаментам, они растут за счет обратимого присоединения субъединиц, которое сопровождается их информационным изменением и гидролизом нуклеотида (см. схему 11-1 в разд. 11.2.10). Однако полимеризация микротрубочек имеет некоторые особенности, отличающие ее от сборки актиновых филаментов.

В клетках минус-концы микротрубочек прочно связаны с центрами организации микротрубочек, что предотвращает (или контролирует) сборку и разборку субъединиц на этих концах (разд. 11.4.4). Поэтому мы будем рассматривать только плюс-концы. In vitro плюс-конец отдельной микротрубочки самопроизвольно переходит от состояния медленного роста к состоянию быстрого укорочения и обратно, причем каждое состояние продолжается много секунд. В любой данный момент популяция микротрубочек в целом состоит из полимеров двух типов, переходы между которыми происходят относительно медленно:

Это поведение, названное динамической нестабильностью, можно объяснить, если вспомнить, как влияет на полимеризацию задержка гидролиза GTP.

СТРУКТУРНАЯ ОСНОВА ДИНАМИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ Изменения, которые происходят с молекулами тубулина при их полимеризации, в основе своей такие же, как и в случае с актином. Поэтому мы воспользуемся теми же обозначениями, что и в схеме 11-1: будет означать мономер, несущий GTP, — субъединицу в составе полимера, уже претерпевшую конформационное изменение, но все еще с GTP (до его гидролиза), а - субъединицу в составе полимера, несущую GDP (после гидролиза GTP).

Поскольку гидролиз GTP осуществляется лишь после включения субъединицы в полимер, субъединицы типа будут обычно обнаруживаться только на растущем конце мТІкротрубочки. Эта "шапка' из субъединиц типа должна быть тем больше, чем быстрее растет трубочка:

Так как субъединицы типа диссоциируют легче, чем, всякий конец, потеряв "шапку" из, начнет терять субъединицы (деполимеризоваться) с большей скоростью. (От конца с микротрубочки отделяются примерно в 100 раз быстрее, чем от конца с.

Поэтому, если началась быстрая деполимеризация, новой шапке образоваться трудно. Вдобавок микротрубочки, видимо, могут претерпевать дальнейшее структурное изменение, в результате которого они теряют способность легко присоединять субъединицы тубулина.

В показанном здесь случае "шапка" на микротрубочке зачастую так и не образуется, и тогда микротрубочка продолжает укорачиваться вплоть до полного распада.

У ОТДЕЛЬНОЙ МИКРОТРУБОЧКИ СТАЦИОНАРНОЕ СОСТОЯНИЕ ОТСУТСТВУЕТ При стационарном состоянии концентрация свободных субъединиц - [С] -постоянна, так что [доля укорачивающихся микротрубочек] х [скорость деполимеризации] = = [доля растущих микротрубочек] х [скорость полимеризации] Так как скорость деполимеризации гораздо выше скорости роста, в любой момент времени много микротрубочек растет и лишь малая доля их укорачивается. Критической концентрации свободного тубулина, при которой отдельная микротрубочка имела бы неизменную длину, просто не существует;

вместо этого в широком диапазоне [С] мы находим смесь растущих и укорачивающихся микротрубочек. Хотя при высоких [С] наблюдаемая доля растущих микротрубочек возрастает, каждая отдельная микротрубочка (в отличие от актинового филамента) никогда не достигает стабильного "стационарного состояния".

ВАЖНОСТЬ "ЗАЩИТЫ" КОНЦОВ ПОЛИМЕРА Из-за своей динамической нестабильности вновь организованная микротрубочка сможет сохраниться лишь в том случае, если оба конца защищены от деполимеризации. Минус-концы микротрубочек в клетках обычно защищены тем центром организации микротрубочек, из которого они растут, а некоторые плюс-концы, как полагают, прикрыты специальными белками, контролирующими стабильность, а тем самым и расположение микротрубочек в клетке. Так, в неполяризованной клетке (А) новые микротрубочки могут расти и укорачиваться равновероятно во всех направлениях от центросомы. Затем какая-то часть их вступает в определенном участке в контакт со структурами клеточного кортекса, которые могут кэпировать свободные плюс-концы микротрубочек (Б). Избирательная стабилизация тех микротрубочек, которые случайно столкнулись с этими кэпирующими структурами, приведет в результате к быстрому перераспределению всей массы микротрубочек и превращению клетки в полярную (В и Г).

Схема 11-2. Полимеризация микротрубочек.

Вообще говоря, можно было бы ожидать, что и актиновые филаменты будут проявлять динамическую нестабильность. Однако концы этих филаментов устроены много проще, чем концы микротрубочек, и сами филаменты, судя по всему, так легко переходят от фазы роста к фазе укорочения и обратно, что их поведение выглядит иначе — см. схему 11-1.

(рис. 11-64). Вероятное объяснение этой динамической нестабильное приведено на схеме 11-2. Как полагают, это следствие «запаздывающего» гидролиза GTP, происходящего при сборке микротрубочки. При ее быстром росте присоединение молекул тубулина к полимеру идет быстрее, чем гидролиз связанных с ними молекул GTP. В результате на растущем конце микротрубочки образуется «шапочка» из GTP;

а так как молекулы тубулина, несущие GTP, связываются между собой с большим сродством, чем несущие GDP, эта «шапочка» благоприятствует дальнейшему росту микротрубочки. Если же микротрубочка почему-либо лишится своей шапочки из GTP (например, вследствие замедлении полимеризации), то она начнет укорачиваться и будет склонна продолжать укорачиваться и дальше. Следует отметить, правда, что укорочению микротрубочек, по видимому, существенно способствуют и другие факторы, например устойчивое искажение упаковки тубулина, обычно возникающее на конце микротрубочки (см. схему 11-2).

Как мы сейчас увидим, динамическая нестабильность позволяет клетке контролировать расположение своих микротрубочек с помощью специальных цитоплазматических структур, которые связываются с концами микротрубочек и стабилизируют их.

11- 11.4.4. Большинство микротрубочек в животных клетках растет от центросомы, которая служит центром организации микротрубочек [44] Микротрубочки в цитоплазме интерфазной клетки, растущей in vitro, можно увидеть, если клетку зафиксировать и окрасить флуоресцентными антителами к тубулину. Наиболее густо они расположены вокруг ядра, откуда расходятся радиально к периферии в виде тонких переплетенных нитей (рис. 11-65, А). Откуда начинается рост микротрубочек в клетке, становится ясно, если их деполимеризовать с помощью колхицина, а затем позволить вырасти заново (рис. 11-65, Б). Регенерирующие микротрубочки вначале появляются в виде небольшой околоядерной лучистой структуры, называемой звездой. Затем ее лучи удлиняются по направлению к периферии клетки, пока не восстановится их первоначальное распределение. Если пометить микротрубочки культивируемой клетки тубулиновыми «крючками» (для определения полярности), можно увидеть, что у всех у них плюс-концы обращены в сторону от центра организации микротрубочек - точки, в которой образуется звезда, Главным центром образования микротрубочек почти во всех животных клетках служит клеточный центр, или центросома. Центросома расположена сбоку от ядра и содержит пару центриолей, лежащих под прямым углом друг к другу (в форме буквы L, см. рис. 11-60). Однако не во всех центрах организации микротрубочек есть центриоли. Например, в митотических клетках высших растений концы микротрубочек погружены в слабо структурированную электроноплотную область, где никаких центриолей нет. Центриоли не обнаруживаются также в мейоти- Рис. 11-64. Изменения длины одной микротрубочки, выявленные с помощью видеосъемки в темном поле микроскопа. Изображения регистрировали с интервалом 1 -2 мин и располагали в последовательном порядке на экране монитора. Два конца проходят через циклы удлинения и укорочения независимо, причем флуктуации на плюс-конце сильнее. (Т. Ногіо и Н. Hotani, Nature 321: 605-607, 1986.) Рис. 11-65. Распределение микротрубочек в культивируемых клетках (иммунофлуоресцентные микрофотографии, окраска антителами к тубулину). А. Нормальная клетка. Б. Клетки были обработаны колцемидом в течение часа, чтобы деполимеризовать их микротрубочки, после чего им дали возможность восстановиться: микротрубочки появляются вначале как маленькие звездочки, а затем удлиняются по направлению к периферии клетки. (А-с любезного разрешения Eric Karsenti и Marc Kirschner;

Б-из М. Osborn, К. Weber, Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 73: 867-871, 1976.) Рис. 11-66. Центриоли могут быть центрами организации для систем микротрубочек совершенно разного типа. Две центриоли в клетке слева служат базальними тельцами для аксонем ресничек, тогда как в клетке справа две центриоли образуют часть организующего центра (центросомы) для микротрубочек, радиально расходящихся по всей цитоплазме. Обратите внимание, что во втором случае микротрубочки растут не из самой центриоли, а из аморфного перицентриолярного материала.

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 13 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.