WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 13 |
-- [ Страница 1 ] --

1 Молекулярная биология клетки 2 Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray, Biology Julian Lewis, Martin Raff, of the Cell Keith Roberts, James D. Watson SECOND EDITION Garland Publishing, Inc.

New York London 3 Б.Албертс Д.Брей Дж.Льюис М.Рэфф К. Робертc Дж. Уотсон МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ 2-е ИЗДАНИЕ, ПЕРЕРАБОТАННОЕ И ДОПОЛНЕННОЕ В 3-х томах 2 Перевод с английского канд. биол. наук Т. Я. Абаимовой, канд. биол. наук В. М. Маресина, канд. биол. наук А. В. Никашина, канд. биол, наук Г. И. Эйснер под редакцией академика Г. П. Георгиева и д-ра биол. наук Ю.С. Ченцова Москва «Мир» 1994 4 ББК 28.070 М75 УДК 576.32/36 Федеральная целевая программа книгоиздания России Авторы: Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К. Уотсон Дж. Д.

Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. М75 и доп. Т. 2.: Пер. с англ.- М.: Мир, 1993.-539 с., ил. ISBN 5-03-001987-1 Созданный коллективом известных американских ученых (в их числе - лауреат Нобелевской премии Джеймс Уотсон) современный учебник молекулярной биологии. Энциклопедическая полнота охвата материала позволяет использовать его как справочное пособие. На русском языке выходит в 3-х томах. Читатель уже знаком с 1-м изданием (М.: Мир, 1986-1987). Новое издание переработано авторами и дополнено современным материалом. В т. 2 описана структура и функции ядра и цитоскелета, механизмы клеточного деления, организация процессов внутри и межклеточного транспорта.

Для биологов всех специальностей, преподавателей и студентов университетов, медицинских, педагогических и сельскохозяйственных институтов.

1903010000- М—————————— КБ 7-93-235 ББК 28. 041 (01)- Редакция литературы по биологии ISBN 5-03-001987-1 (русск.) © 1989 by Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts and James D. Watson ISBN 5-03-001985-5 ©перевод на русский язык, Абаимова Т.Я., Маресин В. М., Никашин А. В., Эйснер Г. И. ISBN 0-8240-3695-6 (англ.) 8 Внутриклеточная сортировка макромолекул и сохранение клеточных компартментов Известно, что бактериальная клетка не имеет внутренних перегородок, т. е. состоит как бы из одного отсека, окруженного плазматической мембраной. У эукариотической клетки таких отсеков несколько, эти клетки поделены на функционально различные, окруженные мембранами области (компартменты). Каждый компартмент, или органелла, имеет свой собственный набор ферментов и других специализированных молекул;

существуют и сложные системы распределения, проводящие специфические продукты из одного компартмента в другой. Чтобы разобраться в строении эукариотической клетки, необходимо знать, что происходит в каждом из ее компартментов, какие молекулы курсируют между ними и как возникают и сохраняются сами компартменты.

Центральную роль в компартментации эукариотической клетки играют белки. Они катализируют реакции, протекающие в каждой органелле, и избирательно переносят малые молекулы внутрь органеллы и из нее. Белки также служат специфичными для органелл поверхностными маркерами, которые направляют новые партии белков и липидов к соответствующим компартментам. Клетка млекопитающих содержит около 10 миллиардов (1010) молекул белков примерно 10000 разных типов, синтез почти всех этих белков начинается в цитозоле - общем пространстве, окружающем все органеллы. Каждый вновь синтезированный белок затем специфически доставляется в тот клеточный компартмент, который в нем нуждается. Прослеживая путь белка из одного компартмента в другой, можно разобраться в запутанном лабиринте клеточных мембран. Следовательно, нам надлежит сделать центральной темой этой главы внутриклеточные перемещения белков. Хотя здесь будут описываться и обсуждаться почти все клеточные органеллы, основное внимание будет обращено на эндоплазматический ретикулум (ЭР) и аппарат Гольджи, которые играют решающую роль в фиксации, сортировке и транспорте множества вновь синтезированных белков.

8.1. Компартментация в клетках высших организмов В этом вводном разделе мы дадим краткий обзор клеточных органелл и взаимоотношений между ними. Мы рассмотрим методы, с помощью которых можно проследить движение белков между компартментами, и перечислим основные способы перемещения молекул белка из одного компартмента в другой.

8.1.1. Все эукариотические клетки содержат набор основных ограниченных мембраной органелл [1] Многие важные биохимические процессы протекают внутри мембран или на их поверхностях. Например, при окислительном фосфорилировании и при фотосинтезе требуется полупроницаемая мембрана для Рис. 8-1. Схематическое изображение основных внутриклеточных компартментов типичной животной клетки. Цитозоль, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, ядро, митохондрия, эндосома, лизосома и пероксисома представляют собой индивидуальные компартменты, отделенные от остальной клетки по крайней мере одной избирательно проницаемой мембраной.

сопряжения транспорта протонов с синтезом АТР. Более того, мембраны служат каркасом для синтеза своих собственных компонентов.

Внутренние мембраны эукариотической клетки делают возможной функциональную специализацию различных мембран, что является, как мы увидим, решающим фактором в разделении множества различных процессов, протекающих в клетке.

Внутриклеточные компартменты, общие для всех эукариотических клеток, показаны на рис. 8-1. Ядро содержит основную часть генома и является главным местом синтеза ДНК и РНК. Окружающая ядро цитоплазма состоит из цитозоля и расположенных в нем цитоплазматических органелл. Объем цитозоля составляет чуть больше половины от общего объема клетки. Именно в нем синтезируется белок и протекает большинство реакций так называемого промежуточного обмена - т. е. реакций, в которых одни малые молекулы разрушаются, а другие образуются, обеспечивая необходимые строительные блоки для синтеза макромолекул. Около половины всех мембран клетки ограничивают похожие на лабиринт полости эндоплазматического ретикулума (ЭР). На обращенной к цитозолю стороне ЭР находится множество рибосом. Эти рибосомы заняты синтезом интегральных мембранных белков и растворимых белков, предназначенных для секреции или для других органелл. В ЭР также синтезируются липиды для всей остальной клетки. Аппарат Гольджи состоит из правильных стопок уплощенных мембранных мешочков, называемых цистернами Гольджи;

он получает из ЭР белки и липиды и отправляет эти молекулы в различные пункты внутри клетки, попутно подвергая их ковалентным модификациям. Митохондрии и хлоропласти растительных клеток производят большую часть АТР, используемого в реакциях биосинтеза, требующих поступления свободной энергии. Лизосомы содержат пищеварительные ферменты, которые разрушают отработанные органеллы, а также частицы и молекулы, поглощенные клеткой извне путем эндоцитоза. На пути к лизосомам поглощенные молекулы и частицы должны пройти серию органелл, называемых эндосомами. Наконец, пероксисомы (известные также Таблица 8-1. Относительные объемы главных внутриклеточных компартментов в типичной клетке печени (гепатоците) Внутриклеточный компартмент Проценты от общего объема Приблизительное число на одну клетки1) клетку1) Цитозоль 54 Митохондрии 22 Цистерны шероховатого ЭР 9 Цистерны гладкого ЭР плюс цистерны аппарата Гольджи Ядро 6 Пероксисомы 1 Лизосомы 1 Эндосомы 1 1) Считается, что все цистерны шероховатого и гладкого ЭР связаны между собой и образуют единый большой компартмент. Напротив, аппарат Гольджи в каждой клетке состоит из множества отдельных наборов собранных в стопки цистерн, и степень взаимосвязи между этими стопками до конца не выяснена.

как микротельца) представляют собой маленькие пузырьки, содержащие множество окислительных ферментов.

Кроме только что перечисленных главных мембранных органелл, клетка содержит множество мелких пузырьков, служащих переносчиками веществ между органеллами, а также пузырьков, связывающихся с плазматической мембраной в процессах эндоцитоза и секреции.

В целом, каждая мембранная органелла обладает как свойствами общими для любых клеток, так и специфическими особенностями, Таблица 8-2. Относительные количества мембран разных типов в двух эукариотических клетках Тип мембраны Процент от общего количества клеточных мембран Печень Гепатоцит1) Поджелудочная железа Экзокринная клетка1) Плазматическая мембрана 2 Мембрана шероховатого ЭР 35 Мембрана гладкого ЭР 16 < Мембрана аппарата Гольджи 7 Митохондрии Внешняя мембрана 7 Внутренняя мембрана 32 Ядро Внутренняя мембрана 0,2 0, Мембрана секреторных пузырьков не определен о Мембрана лизосом 0,4 не определено Мембрана пероксисом 0,4 - » - Мембрана эндосом 0,4 - » - 1) Эти клетки сильно различаются по размерам: средний объем гепатоцита около 5000 мкм3, а экзокринной клетки поджелудочной железы около 1000 мкм3. Общая площадь клеточных мембран составляет примерно 110000 мкм2 и 13000 мкм2 соответственно.

Рис. 8-2. Электронная микрофотография участка поперечного среза клетки печени. Отмечены основные внутриклеточные компартменты.

(С любезного разрешения D. S. Friend.) связанными со специализированными функциями дифференцированных клеток. Все вместе мембранные органеллы занимают около половины объема клетки (табл. 8-1). Вполне естественно, что для их построения требуется большое количество внутриклеточных мембран. В двух типах клеток млекопитающих, проанализированных для примера в табл. 8-2, общая поверхность мембран эндоплазматического ретикулума превышает поверхность плазматической мембраны соответственно в 25 и в 12 раз. Если говорить о массе и площади, то плазматическая мембрана в большинстве эукариотических клеток - всего лишь небольшая часть всех мембран (рис. 8-2).

8.1.2. Топология мембранных органелл связана с их эволюционным происхождением [2] Чтобы понять взаимоотношения между клеточными компартментами. полезно представить себе, как они могли возникнуть в процессе эволюции. Считается, что предшественниками эукариотических клеток были организмы, напоминающие бактерии. У бактерий, как правило, нет внутренних мембран;

соответствующие функции у них выполняет плазматическая мембрана. К таким функциям относится, например, транспорт ионов, синтез АТР и синтез липидов. Однако размеры современных эукариотических клеток превышают размер типичной бактериальной клетки (такой, как E.coli) в 10-30 раз. Изобилие внутренних мембран в клетках эукариот можно рассматривать как адаптацию к этому увеличению размеров. По-видимому, плазматической мембраны просто не хватает для поддержания многих жизненно важных функций эукариотической клетки.

Эволюция внутренних мембран, очевидно, шла параллельно со специализацией их функций. У некоторых современных бактерий есть такие участки плазматической мембраны, на которых определенные мембранные белки собраны вместе для выполнения ряда взаимосвязанных функций (рис. 8-3, А). В качестве примера можно привести «пурпурные мембраны» Halobacterium, содержащие бактериородопсин, и хроматофоры фотосинтезирующих бактерий. И те и другие можно назвать примитивными органеллами. У некоторых фотосинтезирующих бактерий эти участки преобразовались в глубокие впячивания плазматической мембраны (рис. 8-3, Б);

есть и такие, у которых эти впячивания полностью отшнуровались и превратились в замкнутые мембранные пузырьки, предназначенные для фотосинтеза. Внутренняя поверхность этих пузырьков топологически эквивалентна внешней поверхности клетки (рис. 8-3, В).

Можно предположить, что эукариотическая органелла, возникшая в результате событий, представленных на рис. 8-3, тоже будет иметь внутреннюю поверхность, топологически эквивалентную внешней поверхности клетки. Именно так обстоит дело в случае ЭР, аппарата Гольджи, эндосом и лизосом, а также многих промежуточных пузырьков, участвующих в эндоцитозе и секреции (см. разд. 8.6).

Как уже обсуждалось в гл. 7, митохондрии и хлоропласты отличаются от других окруженных мембраной органелл тем, что имеют свои собственные геномы. Природа этих геномов и близкое сходство белков митохондрий и хлоропластов с белками некоторых современных бактерий подтверждает гипотезу о том, что эти органеллы произошли от бактерий, которые были захвачены другими клетками и первое время существовали в симбиозе с ними (см. разд. 7.5.16). Согласно гипотетической схеме, приведенной на рис. 8-4, А, внутренняя мембрана митохондрий и хлоропластов соответствует исходной плазматической мембране бактерий, а матрикс этих органелл произошел из бактериальной цитоплазмы.

Таким образом, эти две органеллы оказались изолированы от путей транспорта, связывающих полости большинства органелл друг с другом и с внеклеточным пространством.

Происхождение клеточного ядра, имеющего особенным образом устроенную двойную мембрану, более загадочно. Известно, что единственная бактериальная хромосома прикреплена к совершенно определенным участкам с внутренней стороны прокариотической плазматической мембраны. Одно из предположений состоит в том, что двуслойная ядерная оболочка могла образоваться из глубокого впячивания плазматической мембраны, как показано на рис. 8-4, Б. Эта гипотеза объясняет, почему внутреннее пространство ядра топологически эквивалентно цитозолю. Действительно, во время митоза у высших эукариот ядерная оболочка разрушается, и содержимое ядра полностью смешивается с цитозолем, чего никогда не происходит ни с одной другой мембранной органеллой. Таким образом, во время митоза клетка временно возвращается к прокариотическому состоянию, когда хромосомы не имеют отдельного компартмента.

Эта эволюционная схема делит основные внутриклеточные компартменты эукариот на пять групп: 1) ядро и цитозоль, связанные между собой ядерными порами и поэтому являющиеся топологически неразрывными (хотя функционально различными);

2) митохондрии;

3) хлоропласты (встречаются только у растений);

4) пероксисомы (их эволюционное происхождение мы обсудим в разд. 8.5) и 5) остальные мембранные органеллы (ЭР, аппарат Гольджи, эндосомы и лизосомы).

Рис. 8-3. Некоторые специализированные мембраны бактерий. А. Участки поверхности клеточной мембраны, состоящие из скоплений специализированных мембранных белков. Б. Впячивание таких участков увеличивает поверхность мембран, приспособленных для выполнения функций, например, фотосинтеза. В. Внутренняя поверхность образовавшихся в результате впячивания мембранных пузырьков топологически эквивалентна внешней поверхности клетки. Ограниченные мембранами пузырьки существуют у некоторых видов фотосинтезирующих бактерий.

Их топологическое отношение к клеточной поверхности подобно отношению ЭР, аппарата Гольджи, эндосом и лизосом к поверхности эукариотических клеток.

Рис. 8-4. Гипотезы эволюционного происхождения митохондрий, хлоропластов, ЭР и клеточного ядра, объясняющие топологические взаимоотношения этих внутриклеточных компартментов в эукариотических клетках. А. Митохондрии и хлоропласты могли возникнуть при поглощении бактерий эукариотической клеткой. С помощью этой гипотезы можно объяснить, почему полость перечисленных выше органелл остается изолированной от обширного везикулярного транспорта, связывающего полости многих других внутриклеточных компартментов. Б.

Возможный путь эволюции ЭР и клеточного ядра. В некоторых бактериях ДНК присоединена к впячиванию плазматической мембраны, называемому мезосомой. Подобное впячивание у очень древней прокариотической клетки могло привести к образованию оболочки вокруг ДНК при сохранении доступа ДНК к цитозолю (так как ДНК должна управлять синтезом белка). Предполагается, что эта оболочка может полностью оторваться от плазматической мембраны, образуя ядерный компартмент, окруженный двойной мембраной. Как показано на рисунке, ядерная оболочка формируется при участии волокнистой структуры — ядерной ламины, и пронизана каналами, называемыми ядерными порами. Благодаря этим порам полость ядра топологически эквивалентна цитозолю. Полость ЭР переходит в пространство между внешней и внутренней ядерными мембранами и топологически эквивалентна внеклеточному пространству.

Внутренние пространства органелл, входящих в последнюю группу, связаны друг с другом и с внеклеточным пространством при помощи транспортных пузырьков, которые отпочковываются от одной органеллы и сливаются с другой. Нужно сказать, что внутренние пространства этих органелл топологически эквивалентны друг другу и внеклеточному пространству и представляют собой функционально связанные части единого комплекса.

8.1.3. Внутриклеточный транспорт белков по ЭР и аппарату Гольджи можно проследить с помощью радиоавтографии [3] Методы изучения транспорта белков внутри клетки были разработаны в 60-е гг. и впервые применены для наблюдения транспорта из ЭР во внеклеточное пространство в секреторных клетках поджелудочной железы.

Специализированные секреторные клетки, такие, как ацинарные клетки поджелудочной железы, содержат большие количества белкового секрета, заключенного в секреторные везикулы (пузырьки). При стимуляции клетки внешним сигналом содержимое этих пузырьков быстро выбрасывается во внеклеточное пространство путем экзоцитоза. Этот процесс известен как регулируемая секреция. Его следует отличать от конститутивной секреции, представляющей собой другую форму экзоцитоза, происходящего постоянно, в отсутствие стимулирующего сигнала.

Ацинарные клетки поджелудочной железы секретируют различные пищеварительные ферменты (амилазу, липазу, дезоксирибонуклеазу и рибонуклеазу), а также предшественники ферментов, так называемые зимогены (например, трипсиноген и химотрипсиноген). Эти предшественники активируются в результате их специфического расщепления протеазами.

Благодаря тому, что группа белков, синтезируемых в ацинарных клетках поджелудочной железы, предназначена для секреции, мы можем судить о пути их передвижения от места синтеза к месту высвобождения. Этот путь можно проследить, сочетая радиоавтографию с электронной микроскопией. Схема соответствующего эксперимента представлена на рис. 8-5. Если клетки кратковременно проинкубировать с [3Н] аминокислотами (импульсное мечение), а затем различное время выращивать в нерадиоактивной среде, то новосинтезированные белки в первую Рис. 8-5. Схема, объясняющая, как с помощью электронномикроскопической радиоавтографии можно проследить путь секреторных белков, в состав которых входят [3Н]-меченные аминокислоты. Важно, чтобы все свободные радиоактивные аминокислоты были отмыты до заключения и единственным радиоактивным источником в ткани оставались белки. Затем ткань покрывают тонким слоем фотоэмульсии.

Электроны, испускаемые тритием, засвечивают зерна серебра в положениях, несколько смещенных по отношению к источнику излучения, поэтому локализация радиоактивной молекулы определяется менее точно, чем позволяет разрешение электронного микроскопа.

очередь выявляются в ЭР, а затем в аппарате Гольджи (рис. 8-6). Позднее [3Н]-белки обнаруживаются в больших, незрелых секреторных везикулах вблизи стопки Гольджи (рис. 8-7), где они все более концентрируются;

в результате формируются зрелые пузырьки, хорошо различимые на электронных микрофотографиях благодаря их электроноплотному содержимому (рис. 8-7 и 8-8).

Секреторные везикулы накапливаются в апикальной части ацинарной клетки (т. е. в части, обращенной к системе протоков) между аппаратом Рис. 8-6. Электронномикроскопическая радиоавтография ацинарных клеток поджелудочной железы, импульсно меченных [3Н] аминокислотами и затем инкубированных различное время в немеченной среде ("pulse-chase''-метод). С течением времени зерна восстановленного серебра (выделены цветом) перемещаются по направлению к внеклеточному пространству, указывая путь, по которому следуют вновь синтезированные молекулы секреторных белков. Ацинарные клетки необычны тем, что 85% синтезируемых в них белков секретируется;

пока клетка не стимулирована к секреции, эти белки сохраняются в секреторных пузырьках.

Рис. 8-7. Электронная микрофотография аппарата Гольджи в ацинарной клетке поджелудочной железы, на которой видны секреторные пузырьки на разных стадиях созревания. Незрелые секреторные пузырьки (называемые в этих клетках конденсирующими вакуолями) отпочковываются от аппарата Гольджи. Секреторные белки в этих пузырьках становятся все более концентрированными (отсюда и название «конденсирующая» вакуоль), что в конечном счете приводит к преобразованию конденсирующих вакуолей в зрелые секреторные пузырьки (вверху слева). Эти секреторные пузырьки в ацинарных клетках поджелудочной железы называют зимогеновыми гранулами. (С любезного разрешения George Palade.) Гольджи и плазматической мембраной. Когда пузырек сливается с плазматической мембраной, его содержимое попадает во внеклеточное пространство. Эти пузырьки сливаются только с апикальной частью плазматической мембраны, тем самым исключается бесполезное и опасное выделение секрета в межклеточное пространство или в полость других органелл. Более того, экзоцитоз происходит только в ответ на соответствующий внеклеточный химический сигнал, подаваемый нервными клетками или клетками кишечника тогда, когда для пищеварения требуются панкреатические ферменты. Изучено множество секреторных белков из различных типов клеток. Оказалось, что все они проходят один и тот же путь: рибосома ЭР аппарат Гольджи внеклеточное пространство. Те белки, которые должны остаться в плазматической мембране, лизосомах или цистернах аппарата Гольджи, тоже сначала попадают в ЭР и затем оттуда через аппарат Гольджи направляются к местам конечной локализации.

Для выявления более тонких деталей метаболических путей, начинающихся в ЭР, необходимы более сложные методы. Некоторые из попавших в ЭР белков остаются там для выполнения ферментативных функций. Большинство же белков упаковывается в транспортные пузырьки (обычно 50-100 нм в диаметре), которые затем отшнуровываются в специальных местах мембран ЭР, называемых переходными элементами (рис. 8 9), и специфически сливаются с ближайшей цистерной аппарата Гольджи. После слияния мембрана пузырька становится частью мембраны аппарата Гольджи, а растворимые белки содержимого пузырька доставляются в полость цистерны Гольджи (рис. 8-10). Таким способом растворимые белки избирательно переносятся из одного окруженного мембраной компартмента в другой без проникновения сквозь мембраны.

Полагают, что с помощью такого же механизма отделения и слияния пузырьков белки переносятся из одной цистерны Гольджи в другую, и затем к различным местам конечного назначения, в соответствии с их различными функциями. На этом пути белки проходят через целую серию замкнутых пространств, топологически эквивалентных друг другу и внеклеточному пространству (рис. 8-11).

На каждом этапе метаболизма белки совершают выбор - остаться в цитозоле или проникнуть в ЭР, остаться в ЭР или поступить в аппарат Гольджи, стать содержимым транспортных пузырьков, направляющих- Рис. 8-8. Электронная микрофотография очищенного препарата крупных секреторных пузырьков. Такие пузырьки встречаются в специализированных секреторных клетках. (С любезного разрешения Daniel S. Friend.) Рис. 8-9. Транспортные пузырьки отпочковываются от особых областей ЭР, почти свободных от рибосом. Эти области называются переходными элементами. Пузырьки сливаются с ближайшей цистерной Гольджи, перенося, главным образом, вновь синтезированные белки и липиды от ЭР к аппарату Гольджи. (С любезного разрешения Brij J. Gupta.) Рис. 8-10. В процессе везикулярного транспорта сохраняется расположение «сторон» мембран. Обратите внимание, что в мембране компартмента-мишени сохраняется исходная ориентация как белков, так и липидов, а растворимые материалы переносятся из просвета в просвет.

Рис. 8-11. Схема клетки, в которой топологически эквивалентные области выделены цветом. В принципе, циклическое отпочковывание и слияние пузырьков позволяет связать просвет (полость) любой органеллы с другим просветом и с внеклеточным пространством. Однако некоторые органеллы (например, митохондрии и хлоропласты) не связаны с другими органеллами везикулярным транспортом. Таким образом, они изолированы от изображенных здесь транспортных путей между органеллами.

ся к лизосомам, или вместо этого попасть в пузырьки, перемещающиеся к клеточной поверхности, и так далее. Выбор в каждом случае зависит от аминокислотной последовательности молекулы белка, содержащей сигналы сортировки, которые определяют путь белка внутри клетки.

8- 8.1.4. Транспорт белков происходит по двум основным путям - через цитозоль и через ЭР [4] Основные пути транспорта белков показаны на рис. 8-12. Практически все белки образуются на рибосомах, расположенных в цитозоле (кроме нескольких, синтезирующихся на митохондриальных рибосомах хлоропластов). Затем их пути расходятся. Белки, принадлежащие одной транспортной ветви, после завершения их синтеза выделяются в цитозоль. Некоторые из них содержат сигналы сортировки, направляющие их из цитозоля в митохондрии, хлоропласты (у растений), ядро или пероксисомы, другие же - их большинство - не имеют специфических сигналов сортировки и остаются в цитозоле в качестве постоянных компонентов.

Другой основной путь транспорта используется при синтезе белков, предназначенных для выведения из клетки, а также белков, которые должны стать компонентами ЭР, аппарата Гольджи, плазматической мембраны или лизосом. Все эти белки по мере их образования переносятся в ЭР при помощи сигналов сортировки, расположенных обычно на N-конце. Рибосомы, на которых собираются такие белки, остаются связанными с мембраной ЭР в течение недолгого времени после начала синтеза полипептидной цепи. Как только очередной участок полипептидной цепи синтезируется, он проникает через липидный бислой этой мембраны. Некоторые белки затем попадают в просвет ЭР, другие остаются частично заключенными в мембрану в качестве трансмембранных белков.

Обычно проходит не больше одной или двух минут с момента высвобождения белка в цитозоль до поступления его в соответствующую органеллу. Белки, предназначенные для ядра, митохондрий или Рис. 8-12. Упрощенная схема путей метаболизма белков. Сигналы, направляющие движение конкретного белка по определенной «дороге» и, следовательно, определяющие локализацию этого белка в клетке, содержатся в его аминокислотной последовательности.

«Путешествие» начинается с синтеза белка на рибосоме и заканчивается его прибытием к месту конечного назначения. На каждой промежуточной стадии (изображены прямоугольниками) принимается решение - оставить данный белок на ней или транспортировать дальше. В принципе, сигнал может требоваться либо для удержания белка в каждом из указанных компартментов, либо для его продвижения дальше, а альтернативное событие может происходить «по умолчанию» (т. е. без специального сигнала). На этой схеме те пути, которые, вероятнее всего, требуют специальных сигналов, выделены цветом;

те же пути, которые, скорее всего, выбираются по умолчанию, показаны черными стрелками. Так как образование эндосом изучено плохо, здесь не изображено никаких путей, ведущих к эндосомам.

пероксисом, достигнув этих органелл, на этом заканчивают свой путь, между тем белки, попадающие в ЭР, вовлекаются в дальнейший транспорт, который, как полагают, происходит с помощью транспортных пузырьков, отделяющихся от одной мембраны и сливающихся с другой. По видимому, для достижения конечного пункта должно произойти несколько таких циклов, и путь от мембраны ЭР до места назначения может занять один час.

8.1.5. Белки могут перемешаться между компартментами двумя принципиально различными способами [5] Чтобы понять общие принципы работы сигналов сортировки, важно различать два совершенно различных пути, по которым белки перемещаются из одного компартмента в другой. Во-первых, они могут непосредственно проникать через мембрану, попадая из пространства, топологически эквивалентного цитозолю, в пространство, топологически эквивалентное внеклеточному, или наоборот. Этот путь требует наличия в мембране специального белка-транслокатора, кроме того, молекула транспортируемого белка должна развернуться, чтобы, подобно змее, «проползти» сквозь мембрану. В качестве примера такого рода событий может служить перемещение определенных белков из цитозоля в просвет ЭР. Второй путь передвижения белковых молекул опосредован транспортными пузырьками. Эти пузырьки захватывают определенные молекулы в полости одного компартмента (от которого они отшнуровываются) и переносят их в другой компартмент, сливаясь с ним. Именно так происходит перенос растворимых белков из ЭР к аппарату Гольджи (см. рис. 8-Ю). При таком везикулярном транспорте белки не пересекают никаких мембран, поэтому они переносятся только между компартментами, топологически эквивалентными друг другу.

Оба типа транспортных процессов избирательно контролируются с помощью специальных белков, выполняющих роль сигналов сортировки. У белка, который напрямую переносится через мембрану, эти сигналы распознаются транслокатором в мембране. А в транспортный пузырек белок попадает, если его сигнал сортировки связывается с рецептором на мембране пузырька. Вероятно, существуют и такие транспортные пузырьки, которые способны захватывать белки, утерявшие специфические сигналы сортировки. В любом случае вновь образующиеся пузырьки переносят только предназначенные для этого белки.

В настоящее время некоторые сигналы сортировки в составе белков известны, тогда как большинство комплементарных им мембранных рецепторов - нет. Кроме того, мы не знаем почти ничего о транспортных пузырьках. Можно предположить только, что их существует множество видов, в соответствии с различными переносами, которые они должны осуществлять. Чтобы выполнять свои функции, каждый пузырек должен захватывать только определенные белки и сливаться только с определенной мембраной-мишенью: например, пузырек, переносящий молекулы от ЭР к аппарату Гольджи, не должен включать белки, которые останутся в ЭР, и должен сливаться только с аппаратом Гольджи, а не с другими органеллами. В этой главе мы рассмотрим, каким образом транспортные пузырьки достигают такой избирательности.

8.1.6. Сигнальные пептиды и сигнальные участки определяют судьбу белка [6] Полагают, что на белках существуют два типа сигналов сортировки, направляющие их, шаг за шагом, вдоль разветвляющихся путей (рис.

8-12). Для некоторых стадий сигналы сортировки представляют собой протяженный участок аминокислотной последовательности длиной 15- остатков. Когда эта стадия пройдена, такой сигнальный пептид отрезается. Сигналом сортировки для других стадий, вероятно, служит определенная трехмерная структура, образуемая атомами поверхности белка при свертывании его молекулы. Аминокислотные остатки, формирующие такие сигнальные участки, могут быть расположены очень далеко друг от друга в линейной последовательности белка (рис. 8-13).

Сигнальные пептиды направляют белки из цитозоля в ЭР, митохондрии, хлоропласты и ядро;

они также отвечают за то, чтобы некоторые белки остались в ЭР. Сигнальные участки, видимо, играют важную роль при распознавании определенных лизосомных белков специальным ферментом в аппарате Гольджи.

Чтобы выяснить пункт назначения того или иного белка внутри клетки, необходимо определить тип его сигнального пептида (табл. 8-3).

Белки, которые должны попасть в ЭР, обычно несут N-концевой сигнальный пептид. Его центральная часть образована 5-Ю гидрофобными аминокислотными остатками. Большинство этих белков направляется из ЭР в аппарат Гольджи;

те же, которые имеют на С-конце специфическую последовательность из четырех аминокислот, остаются в качестве постоянных компонентов. Многие белки, предназначенные для митохондрий, имеют сигнальные пептиды, в которых положительно заряженные аминокислотные остатки чередуются с гидрофобными. Среди белков, направляющихся в ядро, большинство имеет сигнальные пептиды, образованные кластером положительно заряженных аминокислотных остатков.

Наконец, некоторым белкам цитозоля присущи сигнальные пептиды, с которыми ковалентно связывается жирная кис- Рис. 8-13. Два способа образования на белке транспортного сигнала. А. Сигнал представляет собой единственный дискретный отрезок аминокислотной последовательности, называемый сигнальным пептидом. В свернутом белке сигнальный пептид располагается снаружи.

Сигнальные пептиды чаще находятся на конце полипептидной цепи (как показано здесь), но могут быть и в других местах. Сигнальные пептиды выявляют экспериментально по их эффекту на внутриклеточную сортировку белков. Для этого сигнальный пептид с помощью методов рекомбинантных ДНК «пришивают» к какому-нибудь другому белку. Б. Сигнальный участок может быть сформирован при наложении аминокислот из удаленных друг от друга районов при сворачивании молекулы;

или же такой сигнал образуется из отдельных «пятен» на поверхности свернутого белка, удаленных друг от друга на известное расстояние. И в том, и в другом случае транспортный сигнал зависит от трехмерной конформации белка. По этой причине точно локализовать такие сигналы чрезвычайно трудно.

Таблица 8-3. Типичные последовательности сигнальных пептидов Функция сигнального пептида Пример сигнального пептида Импорт в ЭР Оставление в просвете ЭР Импорт в митохондрии Импорт в ядро Присоединение к мембране путем ковалентного связывания миристиновой кислоты с N-концом Заряженные остатки обозначены + или —. Большой блок гидрофобных остатков заключен в рамку. H3N- обозначает N-конец белка;

— СOO- обозначает карбоксильный конец лота, направляющая эти белки к мембранам без проникновения в ЭР.

Роль каждого такого сигнального пептида в доставке белка по месту назначения была продемонстрирована в опытах по генной инженерии. Например, помещение N-концевого сигнального пептида, связывающегося с ЭР, в начало белка цитозоля, заставляло этот белок направляться к ЭР. Сигнальные пептиды белков, имеющих одно и то же конечное назначение, функционально взаимозаменяемы, хотя их аминокислотные последовательности могут сильно различаться. Возможно, для процесса распознавания сигнала физические свойства (такие, например, как гидрофобность) оказываются важнее, чем точная последовательность аминокислот.

Сигнальные участки анализировать гораздо труднее, чем сигнальные пептиды, поэтому об их структуре известно гораздо меньше.

Поскольку они образуются из сложной трехмерной конфигурации свернутого белка, их невозможно просто перенести от одного белка к другому.

Более того, экспериментальное повреждение сигнального участка часто влечет за собой повреждение белка как целого.

8.1.7. Клетки не могут строить свои мембранные органеллы de novo: им требуется информация, содержащаяся в самой органелле [7] Когда клетка воспроизводится и делится, она должна удваивать свои мембранные органеллы. Обычно это происходит путем увеличения размеров этих органелл при включении в них новых молекул;

увеличенные органеллы затем делятся и распределяются по двум дочерним клеткам.

Вряд ли клетка в состоянии создавать эти органеллы de novo. Если, например, из нее полностью удалить ЭР, она не сумеет его реконструировать.

Ведь мембранные белки, определяющие специфику ЭР и выполняющие множество его ключевых функций, сами являются продуктами ЭР: без ЭР или по крайней мере без мембраны, содержащей транслокаторы, необходимые для импорта белков в ЭР (и при отсутствии транслокаторов, которые требуются для импорта белков в другие органеллы), новый ЭР не может быть построен.

Следовательно, для формирования мембранных органелл недостаточно только информации ДНК, определяющей белки органелл.

Необходима также «эпигенетическая» информация в виде хотя бы одного характерного белка в мембране органеллы. Эта информация передается от родительской клетки потомству с самой органеллой. Вероятно, такая информация необходима для поддержания компартментации клетки, тогда как информация, содержащаяся в ДНК, необходима для «размножения» нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

Заключение Эукариотические клетки содержат внутриклеточные мембраны, замыкающие около половины общего объема клетки в отдельные внутриклеточные компартменты. Основные виды мембранных органелл во всех эукариотических клетках следующие: эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, ядро, митохондрии, лизосомы, эндосомы и пероксисомы;

растительные клетки содержат также хлоропласты. Каждая органелла имеет в своем составе различные белки, определяющие ее уникальные функции.

Каждый вновь синтезированный белок органелл проходит от рибосомы до органеллы особый путь, определяемый либо сигнальным пептидом, либо сигнальным участком. Сортировка белков начинается с первичной сегрегации, при которой белок либо остается в цитозоле, либо переносится в другой компартмент (например, в ядро, митохондрию или эндоплазматический ретикулум). Белки, попадающие в ЭР, претерпевают дальнейшую сортировку по мере того, как они переносятся в аппарат Гольджи и затем из аппарата Голъджи в лизосомы, в секреторные пузырьки или к плазматической мембране. Некоторые белки остаются в ЭР и в различных цистернах аппарата Гольджи. Белки, предназначенные для других компартментов, видимо, попадают в транспортные пузырьки, которые отшнуровываются от одного компартмента и сливаются с другим.

8.2. Цитозоль Цитозоль - это часть цитоплазмы, занимающая пространство между мембранными органеллами. Обычно на него приходится около половины общего объема клетки (см. табл. 8-1). В состав цитозоля входит множество ферментов промежуточного обмена, кроме того, он заполнен рибосомами, синтезирующими белки. Около половины всех белков, образующихся на рибосомах, остаются в цитозоле в качестве его постоянных компонентов. В данном разделе мы обсудим судьбу этих белков, а также некоторые механизмы, позволяющие контролировать их время жизни и направлять белки в определенные места цитозоля.

8.2.1. Организация цитозоля поддерживается белковыми филамептами [8] Цитозоль содержит множество белковых филаментов, собранных в фибриллярный цитоскелет (гл. 11). Именно цитоскелет определяет форму клетки, обеспечивает движение цитоплазмы и образует общую сеть, которая организует ферментативные реакции. Более того, поскольку белки составляют около 20% массы цитозоля, правильнее будет представлять его себе как высокоорганизованный гель, а не как pacтвор Рис. 8-14. Единственной известной формой гликозилирования, протекающего в цитозоле клеток млекопитающих, является присоединение N-ацетилглюкозамина к остаткам серина или треонина в белке. Таким способом модифицируются белки-регуляторы многих генов и некоторые белки ядерных пор;

назначение этой модификации неизвестно. В ЭР и аппарате Гольджи происходит гораздо более сложное гликозилирование (см. рис. 8-52).

Рис. 8-15. Три типа обратимых ковалентных модификаций, которым подвергаются белки и которые влияют на их активность. Каждая изображенная модификация изменяет заряд боковой цепи аминокислоты. Наиболее распространенная модификация - это фосфорилирование ОН групп боковых цепей серина, треонина и тирозина в белке. По существующим оценкам, в животных клетках этим способом модифицировано около 10% белков цитозоля.

ферментов. Исследования скорости диффузии, однако, показывают, что малые молекулы и некоторые небольшие белки диффундируют в цитозоле почти с той же скоростью, что и в дистиллированной воде. Таким образом, с точки зрения промежуточного обмена (где и субстраты, и продукты являются малыми молекулами) мы можем рассматривать цитозоль как простой раствор.

С другой стороны, известно, что большие частицы, такие, как транспортные пузырьки и органеллы, движутся очень медленно, отчасти потому, что часто сталкиваются с компонентами цитоскелета. Чтобы они передвигались с приемлемой скоростью, специальные белковые «моторы» гидролизуют АТР и используют освобождающуюся при этом энергию для переноса крупных частиц вдоль микротрубочек или актиновых филаментов. Специфические филаменты выполняют в данном случае роль «рельсов», направляющих транспортные пузырьки к соответствующей мембране-мишени. Большинство исследователей клетки, однако, считают функцию цитоскелета менее специализированной и полагают, что специфичность везикулярного транспорта обеспечивается в основном системами рецепторов, расположенных на обращенной к цитозолю поверхности самих пузырьков (см. разд. 8.8.6).

8.2.2. Многие белки претерпевают в цитозоле ковалентные модификации [9] Описано более 100 различных посттрансляционных модификаций белков. Роль большинства этих модификаций не выяснена;

некоторые из них случайны и, по-видимому, не имеют функционального значения, но есть и такие, которые важны для жизни клетки, так как они тщательно контролируются специфическими ферментами. Далее мы увидим, что некоторые модификации происходят в ЭР и аппарате Гольджи. В этих органеллах, например, ферменты гликозилирования добавляют к белкам сложные цепи остатков Сахаров, образуя гликопротеины (см. разд. 8.6.12).

Единственный известный случай гликозилирования в цитозоле клеток млекопитающих - это добавление к белкам N-ацетилглюкозамина (рис. 8-14).

Однако множество других ковалентных модификаций протекает в первую очередь именно в цитозоле. Некоторые из них стабильны, и необходимы для активности белка, например, ковалентное присоединение коферментов (биотина, липоевой кислоты или пиридоксальфосфата). Определенные ковалентные модификации, происходящие в цитозоле, обратимы и служат для регуляции активности многих белков (рис. 8-15).

Среди известных в настоящее время модификаций описана одна, чрезвычайно важная для доставки белков к месту назначения.

Присоединение жирной кислоты к белку направляет его к определенным мембранам, обращенным в цитозоль.

8.2.3. Некоторые белки цитозоля прикреплены к цитоплазматической стороне мембраны через цепь жирной кислоты [10] Клетки обладают специальным механизмом для транспорта растворимых белков из цитозоля к мембранам. Такие белки ковалентно связываются с цепью жирной кислоты, которая затем встраивается в липидный бислой с цитоплазматической стороны, заякоривая в нем белок.

Связывание белка с мембраной через жирную кислоту может иметь важные функциональные последствия. Например, онкоген src вируса Рис. 8-16. Ковалентное присоединение к белку жирной кислоты может направлять водорастворимый белок в мембрану. А. Образование амидной связи между N-концевым глицином и миристиновой кислотой вызывает заякоривание белка src (после его синтеза в цитозоле) с цитоплазматической стороны мембраны. Б. Тиоэфирная связь между пальмитиновой кислотой и цистеином вблизи карбоксильного конца заякоривает белок ras в плазматической мембране после его синтеза в цитозоле. В. Пальмитиновая кислота и другие жирные кислоты часто присоединяются тиоэфирной связью к некоторым остаткам цистеина, расположенным в цитоплазматическом домене трансмембранного белка. Это происходит при транспорте белка из ЭР в аппарат Гольджи. Ацетилированному цистеину обычно предшествуют три гидрофобные аминокислоты (X) в последовательности NH2-...-X-X-X-Cys-...-COOH. В примере (В), в отличие от (А) и (Б), белок остается связанным с мембраной даже без присоединения жирной кислоты.

саркомы Рауса кодирует тирозин-специфическую протеинкиназу, которая обычно связывается с мембраной при помощи ковалентно присоединенной цепи миристиновой кислоты (ненасыщенная жирная кислота с 14 углеродными атомами). В такой конфигурации эта протеинкиназа превращает нормальную клетку в раковую. Если же присоединению жирной кислоты предшествует замена в молекуле белка N концевого глицина на аланин, то src-белок сохраняет свою активность как протеинкиназа, но остается в цитозоле и не трансформирует клетку.

Очевидно, для эффективного связывания с субстратом эта киназа должна быть прикреплена к мембране. В сходных экспериментах было показано, что продукт другого онкогена, белок ras (см. разд. 12.3.1), для того, чтобы трансформировать клетку, должен прикрепиться к мембране через ковалентно присоединенную цепь пальмитиновой кислоты (ненасыщенная жирная кислота с 16 углеродными атомами).

Чем определяется, присоединится или нет к данному белку цепь жирной кислоты и какая это кислота: миристиновая или пальмитиновая?

Ферменты, катализирующие данные модификации, распознают различные сигнальные пептиды в белке: цепь миристиновой кислоты (рис. 8-16, А) добавляется к N-концевому остатку глицина, расположенному внутри определенной аминокислотной последовательности (см. табл. 8-3), а цепь пальмитиновой кислоты присоединяется к боковой цепи цистеина, расположенного за четыре остатка от карбоксильного конца в составе другого сигнального пептида (рис. 8-16,Б). Кроме того, в цитозоле протекает реакция, катализируемая другим ферментом, в ходе которой цепи пальмитиновой кислоты добавляются к обращенным в цитозоль концам многих трансмембранных белков, по мере того как они проходят из ЭР в аппарат Гольджи на пути к плазматической мембране или куда-либо еще (рис. 8-16,В).

8- 8.2.4. Некоторые белки цитозоля являются короткоживущими [11] Кроме сигналов, определяющих место их локализации, клеточные белки имеют сигналы, определяющие время их жизни. Белки подвергаются непрерывному обмену: часть их молекул случайным образом деградирует и замещается новыми копиями. Большинство постоянных белков цитозоля существуют относительно долго - несколько дней. Другие, однако, деградируют гораздо быстрее - иногда через несколько минут после их синтеза. К таким белкам относятся ферменты, катализирующие «быстрые» (определяющие скорость) стадии метаболизма;

скорости синтеза этих ферментов обычно регулируются в соответствии с внешними условиями, чтобы метаболизм был эффективен. Другие коротко живущие белки - это продукты таких клеточных онкогенов, как fos или myc, которые, как полагают, играют важную роль в регуляции роста и деления клетки (см. разд. 13.4.6). Поскольку белки указанных типов непрерывно и быстро разрушаются, их концентрации могут быстро меняться при изменении скорости их синтеза (см. разд. 12.4.7). В большинстве случаев для такой регуляции требуется еще и необычно быстрое обновление мРНК, кодирующих эти белки (см. разд. 10.4.12).

Большинство неправильно свернутых, денатурированных и других аномальных белков тоже быстро деградирует в цитозоле. Обычно они распадаются за несколько минут, тогда как нормальные копии этих же белков сохраняются. Аномальные белки возникают в результате ошибок при синтезе, когда в цепь встраивается неправильная аминокислота, или в результате химических повреждений, таких, как окисление боковых цепей некоторых аминокислот. Разнообразные мутантные формы обыч- Рис. 8-17. Трехмерная структура убикитина (убиквитина), термостабильного белка, состоящего из 76 аминокислотных остатков.

Присоединение к белку единичной молекулы убикитина является обратимой модификацией, играющей регуляторную роль (см. также рис. 8-15).

Однако добавление к белку разветвленной убикитиновой цепи вызывает его немедленную и полную деградацию (см. рис. 8-18). (По S. Vijay-Kumar, С. Е. Bugg, К. D. Wilkinson, W. J. Cook, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3582-3585, 1985.) ных белков также распознаются в качестве аномальных. Сейчас становится все более очевидным, что и аномальные белки, и белки, генетик запрограммированные на быструю замену, в конечном счете разрушаются в цитозоле при помощи одного и того же протеолитического механизма.

8- 8.2.5. У эукариот избирательная замена белков происходит при помощи убикитин-зависимого протеолиза [12] Те белки цитозоля, которые должны быстро разрушаться, несут сигналы, включающие ответственный за их деградацию протеолитический механизм. Один из таких сигналов чрезвычайно прост и представляет собой всего лишь первую аминокислоту в полипептидной цепи. Аминокислоты Met, Ser, Thr, Ala, Val, Cys, Gly и Pro, когда они находятся на N-конце, являются стабилизирующими, а остальные аминокислот вызывают протеолитическую атаку. Эти дестабилизирующие аминокислоты практически никогда не встречаются на N-конце стабильных белков цитозоля. Однако они часто присутствуют на N-конце белков, переносимых в другие компартменты, например, в ЭР. Поскольку цитозольный протеолитический механизм отсутствует в полости ЭР или аппарата Гольджи, такие белки в «своих» компартментах обычно являются долгоживущими. Дестабилизирующая N-концевая аминокислота таких нецитозольных белков может служить в клетке для удаления тех копий, которые направляются ошибочно: молекулы, которые нельзя быстро перенести из цитозоля, сразу разрушаются. Подобный же код, состоящий из одного аминокислотного остатка, видимо, существует у бактерий, где также вызывает быструю деградацию специфических белков.

Протеолитический механизм, ответственный за избирательную деградацию белков, сложен и, будучи запущенным, гарантирует полное разрушение белка. У эукариот имеется убикитин-зависимый протеолиз. При таком протеолизе с белком, подлежащим разрушению, связывается множество копий небольшого белка убикитина (рис. 8-17). Связывание убикитина с белком-мишенью катализируется многоферментным комплексом, который, как полагают, присоединяется к N-концу белка, несущему дестабилизирующую N-концевую аминокислоту. Этот фер- Рис. 8-18. Убикитин-зависимое разрушение белков. Белок-мишень (содержащий «дестабилизирующую» N-концевую аминокислоту, которая служит сигналом для его деградации), узнается ферментным комплексом, присоединяющим убикитин (стадия I). Затем в последовательной серии реакций (стадия 2), молекулы убикитина соединяются друг с другом, образуя разветвленную мультиубикитиновую цепь, присоединенную к є аминогруппе в боковой цепи ближайшего остатка лизина в белке. Эта реакция требует подвижности белка-мишени и ускоряется, если белок свернут неправильно. Вслед за этим (стадия 3) большая протеаза, расщепляющая только белки, маркированные разветвленной цепью убикитина, разрезает белок-мишень на множество мелких фрагментов.

ментный комплекс присоединяет молекулу убикитина к ближайшему остатку лизина в полипептиде, а затем добавляет к первой другие молекулы убикитина, формируя разветвленную убикитиновую цепь (рис. 8-18). Вслед за этим большая АТР-зависимая протеаза быстро разрушает такие белки. По-видимому, субстратом для этой протеазы служат только белки, содержащие полиубикитиновые разветвленные цепи, а белки, содержащие одну молекулу убикитина, связанную с лизином (например, гистоны), сохраняются.

8- 8.2.6. Стабильность белка может определяться ферментами, повреждающими его N-конец [13] Поскольку у цитозольных белков N-концевая аминокислота определяет, будет ли данный белок разрушаться АТР-зависимой протеазой, важно знать, каким образом этот ключевой аминокислотный остаток присоединяется к белку. Вероятно, у белков, генетически запрограммированных на короткое время жизни, дестабилизирующая аминокислота присоединяется к N-концу сразу после окончания синтеза белка. Как обсуждалось в гл. 5 (см. разд. 5.1.10), все белки исходно синтезируются с метионином на N-конце (или формилметионином у бактерий).

Этот метионин, являющийся стабилизирующим остатком, часто удаляется при помощи специфической аминопептидазы вскоре после включения его в белок. Кроме того, аминоацил-тРНК-трансферазы могут добавлять один дестабилизирующий аминокислотный остаток на N-конце белка.

Условия протекания этих реакций изучены еще слабо.

Мишенями для присоединения убикитина и последующей деградации служат в первую очередь денатурированные, неправильно свернутые белки, а также белки, содержащие окисленные или другие аномальные аминокислоты, причем даже в тех случаях, когда на N-конце у них присутствует стабилизирующая аминокислота. Разрушение неправильно свернутых или денатурированных белков может начинаться с распознавания групп гидрофобных аминокислот, которые в нормальной молекуле белка расположены внутри глобулы, а в аномальной могут находиться снаружи (см. разд. 3.3.1). За этим, вероятно, следуют реакции расщепления или модификации белка, в результате которых образуется новый, дестабилизирующий N-концевой остаток. И наконец, благодаря действию убикитин-зависимого прогеолитического механизма, аномальный белок может быть разрушен. При построении любой гипотетической схемы распознавания денатурированных или неправильно свернутых белков главный вопрос состоит в том, как клетка отличает целые аномальные молекулы от множества растущих на рибосомах поли-пептидных цепей, которые могут выглядеть как «неправильно» свернутые. Показано, например, что если к клеткам добавить ингибитор белкового синтеза пуромицин (см. разд. 5.1.15), то незавершенные поли-пептиды быстро распадаются в ходе убикитин-зависимого протеолиза. Возможно, метаболическая стабильность и долго-, и короткоживущих белков во время их синтеза на рибосомах объясняется тем, что они временно защищены аппаратом трансляции.

Установлено, что N-концевой остаток часто бывает устойчив к гидролизу в процессе повторяющихся реакций, используемых в аминов кислотных секвенаторах (см. разд. 4.4.7). Секвенируемые белки обычно ацетилируют по N-концу, который, видимо, становится после этого «заблокированным». Возможно, некоторые белки, модифицированные таким образом, особенно устойчивы к внутриклеточному протеолизу и поэтому являются необычно долгоживущими;

к ним относятся многие белки цитоскелета и гистоны, участвующие в укладке ДНК в клеточном ядре. Однако механизм отбора белков, которые должны быть ацетилированы, неизвестен.

8.2.7. Белки теплового шока позволяют предотвратить накопление в клетке белковых агрегатов [14] Нормальные клетки млекопитающих растут в культуре при 37°С. Если их на короткое время подвергнуть «тепловому шоку», повышая температуру (обычно до 43°С), они начинают синтезировать в большом количестве набор специфических белков. Большинство этих белков теплового шока образуются и в ответ на другие повреждающие воздействия. Возможно, именно они помогают клетке пережить стрессовые ситуации. Сходные белки синтезируются у Drosophila, дрожжей и даже у бактерий. Изучение последовательностей ДНК показывает, что существует три основных семейства белков теплового шока: с мол. массой 25, 70 и 90 кДа. В нормальных клетках было обнаружено множество очень похожих между собой белков из каждого семейства.

Предполагают, что белки теплового шока помогают переводить в раствор и вновь сворачивать денатурированные или неправильно свернутые белки. Есть у них и другие функции (см. разд. 8.4.4. и 8.6.7). Например, белки из семейства 90 кДа, как было показано, связываются с неактивными формами белков - рецепторов стероидных гормонов и с тирозин-специфическими протеинкиназами, вероятно, таким образом участвуя в регуляции функций этих рецепторов. Лучше всего изучены белки семейства 70 кДа (hsp 70). Эти белки связываются с некоторыми другими белками, а также аномальными белковыми комплексами и агрегатами, от которых потом освобождаются, присоединяя АТР. Было доказано, что они помогают переводить в раствор и заново сворачивать агрегированные или неправильно свернутые белки путем нескольких циклов присоединения и гидролиза АТР. Аномальные белки имеются в любой клетке, но при некоторых воздействиях, например при тепловом шоке, их количество в клетке резко возрастает, и соответственно возникает необходимость в большем количестве белков теплового шока. Оно обеспечивается активацией транскрипции определенных генов. В клетках дрожжей S. cerevisiae, например, имеется восемь hsp 70-генов;

некоторые из них транскрибируются при любых условиях, а остальные - только под действием высоких температур или других экстремальных факторов.

Заключение Цитозоль, составляющий обычно около половины объема эукариотической клетки, представляет собой все внутриклеточное пространство за вычетом органелл. В цитозоле протекает большинство реакций промежуточного обмена и синтеза белка. Если вновь синтезированные белки не имеют сигналов для транспорта в органеллы, они остаются в цитозоле. Некоторые из этих белков разрушаются вскоре после синтеза. Единственная «дестабилизирующая» аминокислота на их N-конце способствует присоединению множества молекул убикитина к специфическим остаткам лизина в белке-мишени. Затем убикитин- и АТР-зависимая протеаза разрушает такой белок. Дефектные копии большинства цитозольных белков разрушаются при помощи того же убикитин-зависимого механизма.

Многие белки претерпевают в цитозоле ковалентные модификации. Некоторые из этих модификаций постоянны, другие же, например фосфорилирование, обратимы и играют валеную роль в регуляции актив- Рис. 8-19. Трехмерная модель двуслойной оболочки, окружающей ядро. Ядерная оболочка пронизана ядерными порами и переходит в эндоплазматический ретикулум.

ности этих белков. К определенным белкам ковалентна присоединяются жирные кислоты. После этого белок, бывший без такой модификации растворимым, приобретает способность связываться с цитоплазматической поверхностью клеточной мембраны.

8.3. Транспорт белков и РНК в ядро и из ядра [15] Содержимое клеточного ядра (нуклеоплазма) отделено от цитоплазмы ядерной оболочкой. Ядерная оболочка образована двойной мембраной. Сферическая внутренняя ядерная мембрана содержит специфические белки, выступающие в качестве сайтов связывания ядерной ламины, которая поддерживает мембрану и контактирует с хромосомами и ядерными РНК. Эта мембрана окружена внешней ядерной мембраной, очень схожей с мембраной эндоплазматического ретикулума, в которую она переходит (рис. 8-19). Внешнюю (наружную) ядерную мембрану можно рассматривать как особую часть мембраны ЭР. Подобно мембранам шероховатого ЭР (см. разд. 8.6.1), внешняя ядерная мембрана усеяна рибосомами, участвующими в синтезе белка. Белки, образованные на этих рибосомах, переносятся в пространство между внешней и внутренней ядерными мембранами (перинуклеарное пространство), которое в свою очередь связано с просветом ЭР (см. рис. 8-19).

Ядро содержит множество белков, необходимых для обеспечения его уникальных функций. Эти белки (к ним относятся гистоны, ДНК-и РНК-полимеразы, белки-регуляторы различных генов и белки, участвующие в процессинге РНК) синтезируются в цитозоле и затем попадают в ядро. Чтобы достигнуть внутреннего пространства ядра (просвета ядра), они должны пройти внешнюю и внутреннюю ядерные мембраны. Этот транспорт происходит избирательно: многие белки, образованные в цитозоле, никогда не попадают в ядро.

8.3.1. Двойную ядерную мембрану пронизывают ядерные поры [16] У всех эукариот, от дрожжей до человека, ядерная оболочка пронизана ядерными порами. Поры окружены большими кольцевыми структурами, называемыми поровыми комплексами (их внутренний диаметр состав- Рис. 8-20. Схема, показывающая расположение ядерных поровых комплексов в ядерной оболочке Вид сверху и поперечное сечение по центру поры (слева). Выделенная цветом «центральная гранула» присутствует в одних порах и отсутствует в других;

эти гранулы могут являться частью поры, но не исключено, что это просто крупные частицы, зафиксированные в момент прохождения перового канала. Схема небольшого участка ядерной оболочки (справа).

Рис. 8-21. Электронная микрофотография препарата ядерных поровых комплексов (негативное контрастирование). Каждую пору окружает кольцо из восьми гранул. Размер каждой гранулы примерно равен размеру рибосомы. (С любезного разрешения A. Faberge.) ляет 80 нм, а мол. Масса – 50-100 млн. Каждый комплекс образован набором больших белковых гранул, сгруппированных в октагональную структуру (рис. 8-20, А и 8-21). Поровый комплекс пронизывает двойную мембрану, связывая по окружности поры липидный бислой внутренней и внешней мембран в единое целое (рис. 8-20, Б). Несмотря на эту непрерывность, которая должна была бы обеспечивать диффузию компонентов между внешней и внутренней мембранами, они остаются химически различными.

«Дыра» в центре каждого комплекса (ядерная пора) представляет собой водный канал, сквозь который водорастворимые молекулы курсируют между ядром и цитоплазмой. Часто создается впечатление, что это отверстие «закупорено» большой гранулой, которая, как полагают, состоит из вновь синтезированных рибосом или других частиц, видимых в момент переноса в цитоплазму (см. рис. 8-20, Б). Эффективный размер поры в состоянии покоя был определен с помощью эксперимента, в ходе которого в цитозоль вводили различные меченые молекулы неядерного происхождения и измеряли скорости их диффузии в ядро. Оказалось, что малые молекулы (5 кДа и меньше) проникают в ядро с такой скоростью, что ядерную оболочку можно считать для них свободно проницаемой. Концентрация белка с мол. массой 17 кДа выравнивается между цитоплазмой и ядром за 2 мин;

для белка с мол. массой 44 кДа это происходит за 30 мин, а глобулярные белки, имеющие свыше 60 кДа, едва ли вообще проникают в ядро. Количественный анализ подобных данных подтверждает, что ядерный поровой комплекс содержит заполненный водой цилиндрический канал диаметром около 9 нм и длиной 15 нм (рис. 8-22). Эти размеры сравнимы с размером беспорядочно расположенных каналов, которые видны на некоторых электронных микрофотографиях.

По-видимому, ядерная оболочка приспособлена к тому, чтобы закрывать содержимое ядерного компартмента (нуклеоплазму) от множества частиц, филаментов и больших молекул, работающих в цитоплазме. Зрелые цитоплазматические рибосомы, например, слишком велики, чтобы проникать через эти 9-нанометровые каналы, поэтому весь белковый синтез ограничивается цитоплазмой. Непонятно только, как же попадают в ядро большие молекулы, которые там необходимы, например, ДНК- и РНК-полимеразы, имеющие мол. массу субъединиц от 100 до кДа? Недавно получены доказательства того, что эти и многие другие ядерные белки взаимодействуют с белками-рецепторами, расположенными на границе ядерных пор, и эти рецепторы активно переносят большие белки в ядро, увеличивая канал поры.

Рис. 8-22. Поперечный разрез ядерной поры (упрощенная схема). Воображаемый цилиндр, изображенный в центре поры, показывает эффективный размер открытого канала, рассчитанный путем измерений транспортируемых частиц. На некоторых электронных микрофотографиях можно различить нити, заполняющие почти все внутреннее пространство поры. Возможно, присутствие этих нитей приводит к уменьшению просвета поры до 9 нм.

Рис. 8-23. Эксперименты, демонстрирующие проникновение избранных белков в ядро через ядерные поры. Нуклеоплазмин представляет собой большой пентамерный белок с отличающимися «головными» и «хвостовыми» доменами. «Головки» можно отрезать от «хвостов» при помощи ограниченного протеолиза. Интактный нуклеоплазмин при введении его в цитоплазму ооцита шпорцевой лягушки быстро накапливается в ядре, несмотря на то, что он слишком велик, чтобы пассивно проникать сквозь маленький канал в центре перового комплекса. По-видимому, сигнал, направляющий импорт этого белка в ядро, расположен в «хвостовом» домене, потому что введенные в цитоплазму ооцита отдельные «хвосты» переносятся в ядро, а отдельные «головы»-нет. Роль ядерных пор в этом управляемом сигналом переносе показана с помощью электронной микроскопии. Нуклеоплазминовые «хвосты» связывали с частицами коллоидного золота, хорошо видимыми в электронном микроскопе из-за их высокой электроноплотности. Присоединенные нуклеоплазминовые «хвосты» вызывают проникновение частиц коллоидного золота через ядерные поры.

8.3.2. Белки активно проникают в ядро через ядерные поры [17] Если из ядра экстрагировать белки, а затем с помощью микроинъекции ввести их в цитоплазму, то даже очень крупные белки вновь будут накапливаться в ядре. Одним из наиболее хорошо изученных примеров является мажорный ядерный белок нуклеоплазмин, который можно протеолитически расщепить на «голову» и «хвост». В экспериментах с микроинъекциями «хвостовая» часть проникает в ядро, а «головная»-нет (рис, 8-23). Если «хвосты» связать с частицами коллоидного золота диаметром 20 нм (что гораздо больше внутреннего диаметра находящейся в покое ядерной поры), то частицы золота накапливаются в ядре, их можно видеть в ядерных порах и в процессе транспорта (рис. 8-23 и 8-24).

Следовательно, ядерная пора может «открываться» и пропускать такой большой и чужеродный объект, как частица золота. Похоже, что пора работает подобно клапану, который открывается в ответ на сигнал от достаточно крупного белка. Как все это происходит на молекулярном уровне - остается загадкой.

Белки, подобные нуклеоплазмину, активно транспортируются через поры, возможно даже оставаясь при этом в свернутом состоянии.

Эксперименты по воссозданию активного ядерного транспорта in vitro подтверждают, что необходимую для этого процесса энергию клетка получает в результате гидролиза АТР.

Рис. 8-24. Электронная микрофотография, показывающая прохождение частиц коллоидного золота, покрытых нуклеоплазмином (см. рис. 8-23) в ядро через ядерные поры, локализация которых отмечена цветными скобками. Сходный результат получается, если частицы золота связаны только с хвостовыми частями молекул нуклеоплазмина. Эти частицы больше в диаметре, чем покоящаяся пора. Следовательно, пора должна «открываться», чтобы обеспечить их прохождение в ядро. (По С. Feldherr, E. Kallenbach, N. Schultz, J. Cell Biol. 99: 2216-2222, 1984.) 8- 8- 8- 8.3.3. В ядро активно переносятся только белки, содержащие специальные сигналы [18] Избирательность ядерного транспорта обеспечивается сигналами ядерного импорта, которые имеются только у ядерных белков. Мы уже говорили о том, что у нуклеоплазмина сигнал такого типа расположен в хвостовой части молекулы. Для некоторых других ядерных белков сигналы ядерного импорта были локализованы более точно с помощью методов генной инженерии. Оказалось, что они могут находиться в любой части молекулы белка, состоят из короткого пептида (обычно от четырех до восьми аминокислотных остатков), обогащенного положительно заряженными аминокислотами лизином и аргинином и обычно содержат пролин. Сигнал такого типа впервые был идентифицирован в белке вируса SV40, так называемом Т-антигене, большом (90 кДа) белке, необходимом для репликации вирусной ДНК в ядре. В норме Т-антиген накапливается в ядре вскоре после его синтеза в цитозоле. Однако замена одной-единственной аминокислоты делает невозможной транспортировку белка и вызывает его накопление в цитоплазме (рис. 8-25). Было высказано предположение, что мутация затрагивает последовательность сигнала ядерного импорта. В ходе дальнейших экспериментов ДНК нормального Т-антигена, кодирующую этот район, состыковали с геном, кодирующим мутантный цитоплазматический белок. При этом была определена минимальная последовательность, обусловливающая способность «гибридного» белка проникать в ядро. Удалось показать, что сигнал ядерного импорта для Т-антигена представляет собой цепочку из восьми следующих друг за другом аминокислот, расположенных во внутреннем районе его полипептидной цепи (см. табл. 8-3). Дальнейшие эксперименты убедили в том, что эта сигнальная последовательность успешно функционирует и в том случае, если ее синтезировать в виде короткого пептида и химически присоединить к любой случайно выбранной боковой цепи лизина в «цитоплазма-тическом» мутантном белке. Таким образом, локализация сигнала ядерного импорта в белке, по-видимому, не важна.

Механизм транспорта белков в ядро принципиально отличается от механизмов транспорта белков в другие органеллы (которые будут описаны далее). Отличие состоит в том, что транспорт белков в ядро происходит через регулируемые водные поры, а не через одну или более мембран. Более того, когда ядро «разбирается» в митозе, его содержимое перемешивается с цитозолем, и ядерные белки выбрасываются наружу.

Когда ядро собирается вновь, группы хромосом сначала упаковываются в собственные двойные мембраны, прилежащие к ним так плотно, что растворимые белки, включая множество прежних компо- Рис. 8-25. Местонахождение Т-антигена вируса SV40, содержащего или не содержащего сигнальный пептид, определяющий ядерную локализацию.

Т-белок дикого типа содержит приведенную здесь богатую лизином последовательность и импортируется в ядро к месту конечного назначения, что показано с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания антителами к Т-антигену (А). Т-антигены с измененным сигнальным пептидом (например, с заменой лизина на треонин) остаются в цитоплазме (Б). (По D. Calderon, В. Roberts, W. Richardson, A. Smith, Cell 39: 499-509, 1984.) нентов ядра, там «не помещаются». Затем эти заключенные в оболочку хромосомы объединяются, формируя одно ядро, в которое надо транспортировать необходимые белки из цитозоля. Возможно, именно потому, что молекулам ядерного белка предстоит повторный перенос в ядро, сигнальный пептид ядерного импорта не отрезается от них после попадания в ядро. Напротив, когда молекула белка попадает в любую другую мембранную органеллу, она передается от поколения к поколению уже внутри данного компартмента, и ее никогда не приходится транспортировать в него вновь. Поэтому сигнальные пептиды таких молекул удаляются, как только белок переносится внутрь компартмента.

8.3.4. Некоторые РНК покидают ядро через ядерные поры [19] Ядерная оболочка типичной клетки млекопитающих содержит от 3000 до 4000 пор (примерно 11 пор на 1 мкм2 площади мембраны). Если в клетке синтезируется ДНК, то для упаковки в хроматин вновь синтезированных молекул необходимо каждые 3 минуты переносить из цитоплазмы в ядро около 106 молекул гистонов. Это значит, что каждая пора должна пропускать приблизительно 100 молекул гистонов в минуту. Если клетка быстро растет, то каждая пора должна еще пропускать около трех вновь образованных рибосом из ядра в цитоплазму, поскольку рибосомы формируются в ядре, а функционируют в цитозоле (см. разд. 9.4.17). И это лишь очень небольшая часть всего транспорта, проходящего через ядерные поры.

Особый интерес вызывает механизм экспорта новых субъединиц рибосом. Эти частицы слишком велики (около 15 нм в диаметре), чтобы проникать через 9-нанометровые каналы. Более вероятно, что они проникают сквозь ядерные поры, используя систему активного транспорта.

Полагают, что и молекулы информационной РНК в составе рибонуклеопротеиновых частиц (в комплексе со специальными белками) переносятся из ядра в цитоплазму активно. Если частицы коллоидного золота диаметром 20 нм, подобные тем, что были использованы в экспериментах с нуклеоплазмином (см. рис. 8-24), связать с молекулами малых РНК (тРНК или 5S-PHK) и затем инъецировать в ядро ооцита лягушки, то они быстро переносятся через ядерные поры в цитоплазму. С другой стороны, если их ввести в цитоплазму ооцита, они останутся там. Видимо, помимо рецепторов, узнающих сигналы ядерного импорта, поры содержат один или более рецепторов, распознающих молекулы РНК (или связанные с ними белки), предназначенные для цитозоля;

когда эти рецепторы связаны, пора катализирует активный транспорт наружу вместо транспорта внутрь ядра. Заметим, что хотя некоторые белки ядерных пор (включая мажорный мембранный белок с мол. массой 190 кДа) недавно были выделены, до сих пор неизвестно, как именно работает ядерная пора.

Заключение Ядро заключено в оболочку, состоящую из двух концентрических мемб- ран. Внешняя ядерная мембрана переходит я мембрану ЭР, а пространст- f во между внешней и внутренней ядерными мембранами переходит в полость ЭР. Молекулы РНК и рибосомы образуются в ядре и переносятся в цитозолъ, тогда как все белки, функционирующие в ядре, синтезируются в цитозоле и переносятся в ядро. Обмен материалом между ядром и цитоплазмой происходит через ядерные поры, обеспечивающие прямой путь сквозь внутреннюю и внешнюю ядерные мембраны.

Рис. 8-26. Основные субкомпартменты митохондрий и хлоропластов. Топология хлоропласта может быть получена из топологии митохондрий простым способом: если впячивания внутренней митохондриальной мембраны полностью отпочкуются, то получится компартмент, топологически эквивалентный тилакоидам хлоропластов.

Белки, содержащие сигналы ядерного импорта, активно переносятся в ядро через поры, и узнаются эти белки по коротким, положительно заряженным сигнальным пептидам;

поскольку сигнальный пептид не удаляется после переноса, ядерные белки могут быть перенесены в ядро тогда, когда это требуется при сборке ядра после митоза. Молекулы РНК и, возможно, субъединицы рибосом, активно переносятся через поры из ядра в цитоплазму.

8.4. Транспорт белков в митохондрии и хлоропласти [20] Как мы уже хорошо знаем (гл. 7.), митохондрии и хлоропласты представляют собой окруженные двойной мембраной органеллы, специализирующиеся на синтезе АТР - путем транспорта электронов и окислительного фосфорилирования в митохондриях и фотосинтетического фосфорилирования в хлоропластах. Хотя обе органеллы имеют свою собственную ДНК и аппарат белкового синтеза, большинство их белков кодируется клеточной ДНК и поступает из цитозоля. Более того, каждый поступивший в органеллу белок должен достичь определенного субкомпартмента, в котором он функционирует. В митохондриях имеется четыре субкомпартмента: митохондриальный матрикс, внутренняя мембрана, межмембранное пространство и внешняя мембрана, обращенная к цитозолю (рис. 8-26, А). В хлоропластах, кроме этого, имеется тилакоидная мембрана и тилакоидное пространство (рис. 8-26, Б). Каждый из этих субкомпартментов содержит отличный от других набор белков. Рост митохондрий и хлоропластов возможен за счет импорта цитоплазматических белков, включающего последовательный избирательный перенос белков через одну, две или (в хлоропластах) даже три мембраны.

Те сравнительно немногие белки, которые кодируются собственными геномами этих органелл, расположены в основном во внутренней мембране в митохондриях и в тилакоидной мембране в хлоропластах. Полипептиды, кодируемые геномами этих органелл, обычно образуют субъединицы белковых комплексов, другие компоненты которых кодируются ядерными генами и поступают из цитозоля. Образование таких гибридных белковых агрегатов требует сбалансированности синтеза этих двух типов субъединиц;

каким образом координируется синтез белка на рибосомах разных типов, разделенных двумя мембранами, остается загадкой.

8- 8.4.1. Митохондриальные сигнальные пептиды представляют собой амфипатические аминокислотные последовательности [21] В изучении биогенеза митохондрий оказалось чрезвычайно полезным использование в качестве объекта дрожжей. В их клетки можно эффективно вводить гибридные гены, кодирующие «смешанные» белки (полученные с помощью методов рекомбинантных ДНК). О механизмах переноса веществ в митохондрии известно гораздо больше, чем о механизмах переноса в хлоропласты. Скорее всего, эти механизмы идентичны, хотя хлоропласты и содержат еще один, самый внутренний мембранный компартмент - тилакоид.

Белки, импортируемые в митохондриальный матрикс, обычно поступают из цитозоля в течение одной-двух минут после их отделения от полирибосом. Эти белки почти всегда несут на N-конце сигнальный пептид длиной от 20 до 80 аминокислотных остатков. После Рис. 8-27. Сигнальный пептид для импорта белков в митохондрии. Цитохромоксидаза - это большой, состоящий из многих белков комплекс, расположенный во внутренней митохондриальной мембране, где он функционирует как терминальный фермент в цепи переноса электронов. А.

Первые 12 аминокислот предшественника субъединицы IV этого фермента служат сигнальным пептидом для импорта данной субъединицы в митохондрию. Б. Если на сигнальный пептид, свернутый по всей длине в -спираль с 3,6 остатками на виток, смотреть сверху, то видно, что положительно заряженные остатки (выделены цветом) сгруппированы с одной стороны спирали, а незаряженные (отмечены прямоугольниками) собраны с противоположной стороны. Последовательности митохондриальных сигнальных пептидов почти всегда способны образовывать такую амфипатическую спираль. Полагают, что спирали данного типа играют важную роль в переносе белков через митохондриальные мембраны.

поступления белка в митохондрию сигнальный пептид быстро удаляется при помощи специфической протеазы (сигнальной пептидазы) матрикса и затем, вероятно, деградирует в матриксе до аминокислот. Сигнальный пептид может быть исключительно простым. Молекулярно-генетические эксперименты, в которых сигнальную последовательность постепенно укорачивали, показали, что для обеспечения импорта одного митохондриального белка требуется всего 12 аминокислот. Эти 12 остатков можно присоединить к любому митохондриальному белку, и он окажется в митохондриальном матриксе. Физические исследования полных сигнальных пептидов подтверждают, что они могут образовывать амфипатические -спиральные структуры (рис. 8-27), в которых все положительно заряженные остатки выстроены с одной стороны спирали, а незаряженные гидрофобные остатки уложены с противоположной стороны.

Считается, что внешняя мембрана митохондрий содержит белки-рецепторы, связывающие митохондриальные сигнальные пептиды и тем самым помогающие процессу переноса, однако до сих пор эти гипотетические рецепторы не были как следует охарактеризованы.

8.4.2. Перенос веществ в митохондриальный матрикс зависит как от электрохимического градиента на внутренней мембране, так и от гидролиза АТР [22] Практически все сведения о молекулярном механизме переноса белков внутрь митохондрии были получены при анализе бесклеточных транспортных систем. Суть экспериментов заключается в следующем. Вначале из гомогенизированных клеток методом дифференциального центрифугирования выделяют митохондрии, а затем инкубируют их с радиоактивно меченными белками, предназначенными для этих органелл (митохондриальные белки-предшественники). Очищенные белки-предшественники очень быстро и эффективно включаются в такие митохондрии.

Все формы направленного движения и транспорта нуждаются в энергии. В большинстве случаев эта энергия используется в форме АТР.

Однако для переноса белков в митохондрии требуется еще наличие электрохимического градиента на внутренней митохондриальной мембране.

Этот градиент образуется в процессе транспорта электронов по мере того, как протоны откачиваются из матрикса в межмембранное пространство (см. разд. 7.1.7). Внешняя митохондриальная мембрана свободно проницаема для ионов, поэтому на ней не поддерживается никакой градиент.

Электрохимический градиент на внутренней мембране используется как аккумулятор энергии для осуществления большей части синтеза АТР в клетке. Кроме того, энергия градиента расходуется для переноса внутрь митохондрии белков, несущих положительно заряженные митохондриальные сигнальные пептиды. Если добавить ионо-форы, сбрасывающие митохондриальный мембранный потенциал (см. разд. 7.2.10), этот перенос блокируется. Каким образом электрохимический градиент способствует переносу белков? Ответ на этот вопрос пока не получен.

8.4.3. Митохондриальные белки проникают в матрикс в зонах слипания, связывающих две мембраны [23] Пересекает ли белок на пути к митохондриальному матриксу две мембраны поочередно, или он проникает через обе мембраны сразу?

Чтобы ответить на этот вопрос, можно охладить бесклеточную систему до температуры льда, задержав таким образом белки на промежуточ- Рис. 8-28. При переносе белков в матрикс они в течение короткого времени соединяют внутреннюю и внешнюю митохондриальные мембраны.

Если изолированные митохондрии инкубировать с белком-предшественником при 5°С, предшественник переносится лишь частично. В матриксе N концевой сигнальный пептид отрезается;

большая часть полипептидной цепи остается вне митохондрии (и доступна для протеолитических ферментов). При нагревании до 37°С перенос происходит полностью. Для изначального внедрения белка в митохондриальную мембрану при 5°С требуется разность потенциалов на внутренней мембране. Последующий перенос может происходить без этой разности потенциалов, но для него необходимо присутствие АТР с цитоплазматической стороны внутренней мембраны. Полагают, что гидролиз АТР необходим при разворачивании полипептидной цепи для того, чтобы белок мог пройти сквозь мембрану.

ной стадии переноса. Оказалось, что их N-концы находятся при этом в матриксе (они могут быть удалены протеазой матрикса), а остальная часть молекул расположена вне митохондрии (поскольку чувствительна к добавленным извне протеолитическим ферментам). Этот результат показывает, что белок-предшественник, когда проникает в матрикс, проходит через обе митохондриальные мембраны сразу. Специалисты по электронной микроскопии заметили многочисленные зоны слипания, в которых, внешняя и внутренняя митохондриальные мембраны сливаются, и предположили, что это именно те участки, через которые происходит перенос белков в матрикс. Недавно эти точки контакта были идентифицированы биохимически (по их связыванию с частично перенесенными внутрь митохондрии белками-предшественниками) и очищены.

Если охлажденные митохондрии, содержащие частично перенесенные промежуточные продукты, опять нагреть, то перенос быстро завершается (рис. 8-28), даже если мембранный потенциал на внутренней мембране сброшен. По-видимому, мембранный потенциал необходим лишь для начальной стадии переноса белка через мембрану, которая происходит даже при низкой температуре. Дальнейшие события, однако, требуют наличия АТР. Эти факты означают, что в норме перенос проходит в два этапа: 1) управляемое электрически проникновение сигнального пептида и связанных с ним последовательностей сквозь обе митохондриальные мембраны и 2) продвижение остатка цепи в митохондриальный матрикс, требующее гидролиза АТР и физиологических температур (рис. 8-29).

8.4.4. Когда белки проникают в митохондриальный матрикс, они разворачиваются [24] По всей вероятности, белки-предшественники разворачиваются перед тем, как пересечь две митохондриальные мембраны в точке контакта. Трудно представить себе, что свернутый водорастворимый белок мог бы «протаранить» два (или даже один) липидных бислоя, оставаясь в своей нативной трехмерной конформации. Точно также невозможно вообразить, что пора могла бы пропускать глобулярные белки, которые сильно варьируют по размерам и форме. Ведь при этом она становилась бы проницаемой для протонов, и в результате электрохимический градиент на внутренней мембране исчезал бы. Между тем, в развернутом состоянии все белки имеют сходную конформацию и могут быть перенесены с помощью общего механизма. Но поскольку белки в свернутом состоянии обладают меньшей свободной энергией, чем в развернутом (по этой причине полипептиды спонтанно сворачиваются), разворачивание молекулы белка требует затрат энергии. Предполагается, что эту энергию обеспечивает гидролиз АТР.

Чтобы проверить, разворачиваются ли белки-предшественники, когда они пересекают митохондриальную мембрану, был сконструирован гибридный ген, кодирующий «смешанный» белок. В этом как бы состыкованном белке митохондриальный сигнальный пептид присоединен к N концу цитоплазматического фермента-дигидрофолатредуктазы (ДГФР). Такой гибридный белок обладал почти ненарушенной ферментативной активностью, а значит ДГФР была в нативной трехмерной конформации. При смешивании с препаратом митохондрий этот белок поступал в матрикс. Однако если его предварительно обрабатывали метатрексатом, который прочно связывается с активным центром фермента и мешает разворачиванию его молекулы, то перенос резко подавлялся.

Генетические эксперименты на дрожжах подтверждают, что для Рис. 8-29. Импорт белков в митохондрии. N-концевой сигнальный пептид белка-предшественника распознается рецептором, который, как полагают, расположен во внешней мембране. Белок переносится через обе митохондриальные мембраны в специальных точках контакта. Для начала этого процесса необходим электрохимический градиент по сторонам внутренней мембраны. В матриксе сигнальный пептид отрезается специфической протеазой, и образуется зрелый белок.

АТР-зависимой реакции разворачивания белков необходимы некоторые гены семейства hsp 70. Если эти гены инактивировать, то и митохондриальные белки-предшественники, и белки, предназначенные для ЭР, не могут пересечь соответствующие мембраны и вместо этого накапливаются в цитозоле.

8- 8.4.5. Для транспорта белков в межмембранное пространство митохондрий необходимы два сигнала [25] Транспорт некоторых белков-предшественников в межмембранное пространство митохондрий начинается с их переноса в матрикс (рис.

8-29). Однако за N-концевым сигнальным пептидом, инициирующим этот перенос, расположена очень сильно гидрофобная аминокислотная последовательность. Как только сигнальный пептид отщепляется матриксной протеазой, эта гидрофобная последовательность начинает, в свою очередь, выполнять роль сигнального пептида для обратного встраивания данного белка во внутреннюю мембрану. Вероятно, этот перенос происходит с помощью механизма, сходного с механизмом встраивания белков в мембрану ЭР. Аналогичный способ используется и для встраивания во внутреннюю мембрану митохондрий белков, кодируемых митохондриальным геномом (рис. 8-30, А).

После того, как белки, предназначенные для межмембранного пространства, встроятся во внутреннюю мембрану, они отрезаются протеазой в межмембранном пространстве (рис. 8-30, Б}. Многие из этих зрелых растворимых белков в конце концов присоединяются к «внешней» поверхности внутренней мембраны, где они образуют субъединицы комплексов, содержащих также и трансмембранные белки.

Для транспорта белков из цитозоля во внутреннюю мембрану митохондрий также требуется гидрофобный сигнальный пептид.

Возможно, этот транспорт происходит по схеме, изображенной на рис. 8-30, А, но прямо это доказано не было. Такой двухстадийный путь трудно отличить в эксперименте от альтернативного пути, при котором транспорт в точке контакта прерывается по достижении гидрофобного сигнала, и белок остается заключенным в бислой внутренней мембраны.

Рис. 8-30. Импорт белков из цитозоля в межмембранное пространство митохондрий или внутреннюю мембрану требует многих сигналов. Вначале белок переносится в пространство матрикса, как это показано на рис. 8-29. Однако при отрезании сигнального пептида, использованного для первичного переноса, обнажается смежный гидрофобный сигнальный пептид на новом N-конце. Этот сигнал вызывает встраивание белка во внутреннюю мембрану таким же образом, каким в нее встраиваются белки, кодируемые митохондриальным геномом (А.) Этот механизм предположительно сходен с тем, который бактериальные предки митохондрий использовали для встраивания белков в плазматическую мембрану, и, как полагают, напоминают механизм встраивания белков в ЭР. Для транспорта белков в межмембранное пространство требуется еще третья стадия, на которой протеаза с активным центром, обращенным в трансмембранное пространство, отрезает белок от его трансмембранного сигнального пептида, находящегося во внутренней мембране (Б). Путь, изображенный на рис. (А), может быть использован и для переноса белков из цитозоля во внутреннюю мембрану, который тоже требует гидрофобного пептида.

8.4.6. Для переноса белков из цитозоля во внешнюю митохондриальную мембрану также необходимо их разворачивание [26] Во внешней мембране митохондрий имеется одна необычная структура (она напоминает внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий), липидный слой которой содержит большие количества образующего поры белка-порина. По этой причине внешняя мембрана свободно проницаема для неорганических ионов и метаболитов и для молекул белков размером меньше 10 кДа. Но для больших по размеру белков внешняя мембрана является барьером и поэтому помогает удержать белки межмембранного пространства от утечки обратно в цитозоль.

Включение во внешнюю мембрану белков, кодируемых основным клеточным геномом - таких, как порин, - происходит по АТР зависимому механизму, но не требует использования специальных пептидов, которые бы потом отрезались. Мембранный потенциал тоже не требуется. О том, как происходит подобное включение, известно очень мало. По крайней мере у одного белка внешней мембраны имеется нормальный матриксный транспортный сигнал, за которым следует последовательность, каким-то образом прерывающая перенос на внешней мембране.

8- 8.4.7. Для того, чтобы направлять белки в тилакоидную мембрану хлоропластов, необходимы два сигнальных пептида [27] Транспорт белков в хлоропласти во многих отношениях напоминает транспорт в митохондрии: и тот, и другой процесс происходят после трансляции, и тот, и другой нуждаются в энергии, и в том, и в другом случае используются гидрофильные N-концевые сигнальные пептиды, которые затем удаляются. Однако имеется по крайней мере одно важное отличие: в митохондриях для проведения этого транспорта используется еще электрохимический градиент на их внутренней мембране. В хлоропластах же, где электрохимический градиент имеется не на внутренней мембране, а на мембране тилакоида (см. гл. 7), по-видимому, для транспорта через внешнюю двумембранную оболочку в качестве источника энергии используется только гидролиз АТР.

Сигнальные пептиды для переноса белков в хлоропласты напоминают раннее описанные пептиды для импорта в митохондрии. Но в растительных клетках имеются и митохондрии, и хлоропласты, и соответственно, белки должны «выбирать» между ними. Например, в растительных клетках бактериальный фермент, присоединенный (методами генной инженерии) к N-концевой последовательности митохондри ального белка, направляется в митохондрии. Тот же белок, связанный Рис. 8-31. Для переноса белков в полость (тилакоидное пространство) тилакоида в хлоропластах требуется два сигнальных пептида, такой перенос осуществляется в две стадии. Полипептнд-предшественник содержит N-кондевой сигнальный пептид для переноса в хлоропласт, за которым непосредственно следует тилакоидный сигнальный пептид. Хлоропластный сигнальный пептид вызывает перенос белка в строму через точки контакта в мембране (см. рис. 7-73);

механизм этого переноса сходен с механизмом переноса в митохондриаль-ный матрикс (рис. 8-29). Затем сигнальный пептид отрезается, открывая тилакоидный сигнальный пептид, который вызывает перенос через мембрану тилакоида. Этот процесс имеет много общего с перемещением белков в ЭР.

с N-концевой последовательностью белка хлоропластов, оказывается в хлоропластах.

Хлоропласты содержат еще один окруженный мембраной компартмент - тилакоид. Множество белков хлоропластов, включая белковые субъединицы фотосинтетической системы и АТР-синтетазы, импортируются в мембрану тилакоида из цитозоля. Подобно некоторым митохондриальным белкам-предшественникам, эти белки доставляются к месту назначения в два этапа. Сначала они проникают через двумембранную оболочку в матрикс хлоропласта (называемый стромой), а затем переносятся в мембрану тилакоида (или сквозь нее в тилакоидное пространство). Предшественники этих белков имеют кроме N-концевого сигнального пептида для хлоропластов еще гидрофобный тилакоидный сигнальный пептид. После того, как белок с помощью N-концевого сигнального пептида проникает в строму, этот пептид удаляется стро-мальной протеазой (аналогичной протеазе матрикса митохондрий). В результате открывается тилакоидный сигнальный пептид, который затем инициирует транспорт через мембрану тилакоида (рис. 8-31). Как и в митохондриях, этот второй этап служит для встраивания собственных белков хлоропласта в мембрану тилакоида;

необходимый для этого белок-транслокатор, вероятно, происходит от бактериального предка хлоропластов.

Заключение Большинство белков проникает в митохондрии и хлоропласты из цитозоля сходным образом. Этот механизм был наиболее хорошо изучен для митохондрий, особенно у дрожжей. Белок переносится в матрикс митохондрии через зоны слипания внешней и внутренней мембран. Для этого переноса требуется гидролиз АТР, а также электрохимический градиент на внутренней мембране. Транспортируемый белок разворачивается, когда пересекает мито хондриальные мембраны. В митохондрии или хлоропласты переносятся только те белки, которые содержат специфический сигнальный пептид. Этот сигнальный пептид обычно расположен на N-конце молекулы белка и отрезается после переноса ее внутрь органеллы. На втором этапе транспорта белок может переноситься во внутреннюю мембрану. Для этого он должен иметь еще гидрофобный сигнальный пептид;

этот пептид открывается после удаления первого сигнала. В случае хлоропластов для переноса белков из стромы в тилакоид также требуется второй сигнальный пептид.

8.5. Пероксисомы [28] Перокснсомы (называемые также микротельцами) во многом отличаются от митохондрий и хлоропластов. Прежде всего, они окружены только одной мембраной и не содержат ДНК и рибосом. Поскольку пероксисомы не имеют собственного генома, все их белки должны поставляться из цитозоля. В этом отношении пероксисомы напоминают ЭР: они являются самовоспроизводящейся мембранной органеллой, существующей без своего собственного генома.

Прежде чем рассматривать биосинтез пероксисом, мы остановимся на функциях этого пестрого семейства органелл. Хотя пероксисомы есть во всех эукариотических клетках, их функции сильно различаются в клетках разных типов.

В начале 60-х гг. было показано, что главным источником по крайней мере трех окислительных ферментов - оксидазы D-аминокислот, уратоксидазы и каталазы - являются самостоятельные органеллы диаметром около 0,5 мкм. У млекопитающих пероксисомы этого размера встречаются в основном в печени. На электронных микрофотографиях их можно различить по «кристалловидной» сердцевине, состоящей из уратоксидазы (рис. 8-32). Позже, когда была разработана гистохимическая окраска на каталазу - фермент, составляющий до 40% общего белка пероксисом, было показано, что пероксисомы имеются во всех клетках. В большинстве клеток пероксисомы мельче (0,15-0,25 мкм в диаметре), чем в клетках печени.

Подобно митохондрии, пероксисома - это один из главных центров утилизации кислорода в клетке. Существует гипотеза, согласно которой пероксисома представляет собой остаток древней органеллы, выполняющей у примитивных предков эукариотических клеток все функции метаболизма кислорода. Когда в атмосфере начал накапливаться кислород, производимый фотосинтезирующими бактериями, вероятно, он был токсичен для большинства клеток. Пероксисомы могли служить для снижения концентрации кислорода в клетках, одновременно используя его химическую активность для проведения важных окислительных реакций. В соответствии с этой точкой зрения последующее появление митохондрий сделало пероксисомы в значительной мере ненужными, так как многие реакции, ранее протекавшие в пероксисомах без производства энергии, теперь с помощью окислительного фосфорилирования были сопряжены с образованием АТР. Таким образом, окислительные реакции, протекающие в современных клетках - это, возможно, те реакции, которые остались необходимыми, несмотря на появление митохондрий.

Рис. 8-32. Электронная микрофотография трех пероксисом в клетке печени крысы. Паракристалличес-кие электроноплотные включения-это фермент уратоксидаза. (С любезного разрешения Daniel S. Friend.) 8.5.1. Пероксисомы используют в реакциях окисления молекулярный кислород и перекись водорода [29] Пероксисомы получили такое название благодаря тому, что обычно в их состав входит один или более ферментов, использующих молекулярный кислород для отщепления атомов водорода от некоторых органических субстратов (обозначенных здесь R) в окислительной реакции с образованием перекиси водорода (Н2О2):

RH2 + О2 R + Н2О Каталаза использует Н2О2, образованную другими ферментами в пероксисоме, для окисления множества субстратов - например, фенолов, муравьиной кислоты, формальдегида и спирта -с помощью «окислительной» реакции Н2О2 + R'H2 R' + 2Н2О. Этот тип окислительных реакций особенно важен в клетках печени и почек, пероксисомы Рис. 8-33. Электронная микрофотография двух типов пероксисом, встречающихся в растительных клетках. А. Пероксисома с паракристаллической сердцевиной в клетке мезофилла листа табака. Полагают, что ее тесная связь с хлоропластами облегчает обмен материалами между этими органеллами, происходящий при фотодыхании. Б. Пероксисомы в жирозапасающей клетке семядоли семени томата, 4 дня после прорастания. Здесь пероксисомы (глиоксисомы) ассоциированы с липидными тельцами, в которых запасается жир, что отражает их центральную роль в мобилизации жиров и глюконеогенезе при прорастании семян. (А-с любезного разрешения P. Gruber и Е. Newcomb;

Б с любезного разрешения S. Frederick и Е.

Newcomb.) которых обезвреживают множество ядовитых веществ, попадающих в кровоток. Почти половина этанола, который мы выпиваем, окисляется до ацетальдегида этим способом. Кроме того, когда в клетке накапливается излишек Н2О2, каталаза превращает ее в Н2О(2Н2О2 2Н2О + О2).

Пероксисомы представляют собой необычно разнообразные орга-неллы, содержащие в различных клетках даже одного и того же организма сильно различающиеся наборы ферментов. В некоторых случаях в зависимости от условий изменяются размеры пероксисом. Например, клетки дрожжей, растущие в среде, содержащей сахар, имеют маленькие пероксисомы. Однако, если эти клетки выращивать на среде с метанолом, в них появляются большие пероксисомы, окисляющие метанол;

если в среде есть жирные кислоты, в клетках появляются большие пероксисомы, в которых жирные кислоты расщепляются до ацетил-СоА.

Особенно важную роль пероксисомы играют в растительных клетках. У растений хорошо изучены два очень различных типа пероксисом.

Одни из них обнаруживаются в листьях (рис. 8-33, А). Эти пероксисомы катализируют окисление побочного продукта реакции, в которой СО превращается в углевод (такой окислительный процесс называют фотодыханием, т. к. в нем используется О2 и освобождается СО2). Другой тип пероксисом встречается в прорастающих семенах (рис. 8-33, Б). Они служат здесь для превращения жирных кислот, запасенных в липидах семян, в сахара, необходимые для роста молодого растения. Поскольку это превращение жиров в сахара происходит в серии реакций, известных под названием глиоксилатного цикла, такие пероксисомы называют еще Рис. 8-34. Модель сборки пероксисом. Мембрана пероксисом содержит специфические белки-рецепторы для импорта. Все белки пероксисомы, включая новые копии этих рецепторов, синтезируются рибосомами в цитозоле и затем переносятся из цитозоля в пероксисому. Следовательно, пероксисомы образуются только из предсуществовавших пероксисом в процессе их роста и деления;

подобно митохондриям и хлоропластам, они непрерывно импортируют новые компоненты из цитозоля.

глиоксисомами. В глиоксилатном цикле две молекулы ацетил-СоА, образованные в результате расщепления жирной кислоты в пероксисоме, используются для образования янтарной кислоты, которая покидает пероксисому и превращается в глюкозу. В клетках животных глиокси-латный цикл отсутствует, и поэтому они не способны превращать жирные кислоты, содержащиеся в жирах, в углеводы.

8- 8- 8.5.2. Все компоненты пероксисом поступают из цитозоля [30] Пероксисомы можно рассматривать как набор органелл с одинаковой мембраной и различным содержимым. Как отмечалось ранее, в них нет ДНК и рибосом;

все их белки кодируются ядерными генами и синтезируются в цитозоле. Как белки мембраны, так и внутренние белки пероксисом поступают из цитозоля после трансляции. Из всех белков пероксисом лучше всего была изучена катализа. Это тетрамерный гем содержащий белок, который образуется в цитозоле в виде мономеров, не содержащих гем. Мономеры переносятся в просвет пероксисом и там собираются в тетрамеры в присутствии гема. Хотя каталаза не содержит сигнальной последовательности, отрезаемой после использования, она должна иметь какой-то сигнал, направляющий ее в пероксисому. Согласно последним данным, эту роль, по крайней мере частично, играет специфическая последовательность из трех аминокислот, расположенная вблизи карбоксильного конца многих пероксисомных белков.

Пероксисомы, по-видимому, содержат по крайней мере один уникальный белок, расположенный на обращенной к цитозолю поверхности их мембраны, который работает в качестве рецептора, распознающего сигнал на вносимом белке. Одно время полагали, что мембранная «скорлупа» пероксисом образуется путем отшнуровывания от ЭР, тогда как их содержимое переносится из цитозоля. В настоящее время имеется ряд данных, доказывающих, что новые пероксисомы всегда возникают из предсуществовавших и формируются путем роста и деления органел-лы, как это описано ранее для митохондрий и хлоропластов (см. разд. 7.5.1). Считают, что все мембранные белки пероксисом, включая предполагаемый рецептор(ы), поступают из цитозоля (рис. 8-34). Вероятно, и липиды, требуемые для построения новой мембраны пероксисом, также доставляются из цитозоля. Возможно, они переносятся от мест их синтеза в мембране ЭР белками, участвующими в обмене фосфолипидов (см. разд. 8.6.15).

Рис. 8-35. Микрофотография культивируемой клетки млекопитающих. На препарате белки, остающиеся в ЭР, связаны с флуоресцентно меченными антителами. ЭР, подобно сети, распространяется по всей цитоплазме клетки, так что любая область цитозоля прилегает к какой-нибудь части мембраны ЭР. (С любезного разрешения Hugh Pelham.) Заключение Пероксисомы специализируются на проведении окислительных реакций с использованием молекулярного кислорода. Они вырабатывают перекись водорода (которая им нужна для окисления), разрушая ее избыток с помощью каталазы. Считают, что, подобно митохондриям и хлоропластам, пероксисомы являются самовоспроизводящимися органеллами. Однако они не содержат ДНК или рибосом. Полагают, что в их состав входит уникальный мембранный рецептор, позволяющий вносить внутрь органеллы все белки (включая и сам рецептор) путем избирательного транспорта из цитозоля.

8.6. Эндоплазматический ретикулум [31] Все эукариотические клетки имеют Эндоплазматический ретикулум (ЭР). Его чрезвычайно извилистая мембрана обычно составляет более половины общего количества клеточных мембран (см. табл. 8-2). Полагают, что хотя мембрана ЭР имеет многочисленные складки и изгибы, пронизывающие всю цитоплазму, она образует непрерывную поверхность, ограничивающую единое внутреннее пространство. Это внутреннее пространство, называемое полостью ЭР, часто занимает более 10% общего объема клетки (см. табл. 8-1). Полость ЭР отделяется от цитозоля одиночной мембраной (мембраной ЭР), служащей связующим звеном между этими двумя компартментами. Наоборот полости ЭР и каждой цистерны аппарата Гольджи отделены друг от друга двумя мембранами и цитозолем, поэтому транспорт макромолекул между этими органеллами осуществляется при помощи транспортных пузырьков (рис. 8-36), ЭР играет важнейшую роль в клеточных биосинтезах. На мембранах ЭР начинается синтез трансмембранных белков и липидов ЭР, аппарата Гольджи, лизосом и плазматической мембраны. Здесь же производится большинство липидов для мембран митохондрий и пероксисом (см. разд. 8.6.14). Кроме того, все вновь синтезированные белки, независимо от их места назначения (полость ЭР, аппарат Гольджи, лизосомы или внеклеточное пространство), сначала поступают в полость ЭР. Так как ЭР служит отправной точкой для синтеза всех секретируемых белков, он также является местом, где начинается формирование внеклеточного матрикса.

Рис. 8-36. Связь полости ЭР с другими внутриклеточными компартментами, с которыми ЭР контактирует. Просвет ЭР отделен как от ядра, так и от цитозоля всего одной мембраной, тогда как от собранных в стопку цистерн аппарата Гольджи он отделен двумя мембранами. В большинстве случаев ЭР и аппарат Гольджи можно рассматривать как единую функциональную единицу, части которой связаны с помощью транспортных пузырьков.

8.6.1. Прикрепленные к ЭР рибосомы определяют границы его гранулярных (шероховатых) областей [32] ЭР удаляет некоторые белки из цитозоля сразу после их синтеза. Это белки двух типов: 1) трансмембранные, которые лишь частично переносятся через мембрану ЭР и остаются заключенными в нее, и 2) водорастворимые, которые полностью переносятся через мембрану ЭР и освобождаются в его полость. Трансмембранные белки предназначены для плазматической мембраны или для мембран других органелл, а водорастворимые направляются либо в полость органелл, либо секретируются. Все эти белки переносятся через мембрану ЭР с помощью одного и того же механизма и одного и того же вида сигнального пептида.

В клетках млекопитающих импорт белков в ЭР начинается еще до того, как полипептидная цепь полностью синтезирована, т. е. он происходит одновременно с трансляцией (котрансляционно). Этим он отличается от импорта в митохондрии, хлоропласты, ядра и пероксисомы, который является посттрансляционным и требует различных сигнальных пептидов. Так как белок переносится внутрь ЭР сразу после образования полипептидной цепи, рибосомы, на которых происходит его синтез, должны быть прикреплены к мембране ЭР. Области ЭР, покрытые связанными с мембраной рибосомами, называют гранулярным (шероховатым) эндоплазматическим ретикулумом (рис. 8-37).

Таким образом, в цитоплазме имеется две пространственно изолированные популяции рибосом. Одни из них (связанные с мембраной рибосомы) расположены на обращенной к цитоплазме поверхности мембраны ЭР и заняты синтезом белков, которые сразу же переносятся внутрь ЭР. Другие (свободные рибосомы) не прикреплены ни к какой мембране и производят все остальные белки, кодируемые ядром. Связанные и свободные рибосомы идентичны по строению и функции. Они различаются только по белкам, которые синтезируются на них в каждый данный момент. Если рибосоме достается синтез белка с сигнальным пептидом для ЭР, то такой сигнал направляег рибосому к мембране ЭР. Поскольку с одной молекулой мРНК может связаться много рибосом, обычно образуется полнрибосома, которая прикрепляется к мембране сразу многими растущими полипептидными цепями. Отдельные рибо- Рис. 8-37. А. Электронная микрофотография, на которой видны значительные различия в морфологии шероховатого и гладкого ЭР.

Показанная здесь клетка Лейдига вырабатывает стероидные гормоны в семеннике и имеет поэтому необычно развитый гладкий ЭР. Видна также часть большой сферической липидной капли. Б. Трехмерная реконструкция участков гладкого и шероховатого ЭР в клетке печени. Шероховатый ЭР получил свое название из-за множества рибосом, расположенных на его цитоплазматической поверхности;

он образует поляризованные стопки уплощенных цистерн, каждая из которых имеет просвет (полость) шириной от 20 до 30 нм. С этими цистернами соединены мембраны гладкого ЭР, который представляет собой сеть тонких трубочек диаметром от 30 до 60 нм. Считается, что мембрана ЭР непрерывна и ограничивает единую полость. (А-с любезного разрешения Daniel S. Friend;

Б- по R. Krstic, Ultrastructure of the Mammalian Cell. New York: Springer-Verlag, 1979.) Рис. 8-38. Для синтеза белков цитозоля и белков, поступающих в ЭР, используются одни и те же рибосомы. Если на вновь синтезированной молекуле белка имеется сигнальный пептид, то он направляет связанную с этой молекулой рибосому к мембране ЭР. Молекула мРНК может все время оставаться связанной с мембраной ЭР, тогда как рибосомы, движущиеся вдоль нее, постоянно рециркулиру-ют;

в конце каждого цикла белкового синтеза субъединицы рибосом освобождаются и возвращаются в общий пул рибосом в цитозоле.

сомы, связанные с такой молекулой мРНК, могут возвращаться в цито-золь, как только они закончат трансляцию вблизи ее З'-конца. Сама мРНК, однако, стремится остаться связанной с мембраной ЭР через меняющуюся популяцию связанных с мембраной рибосом (рис. 8-38). Напротив, если мРНК кодирует белок, не имеющий сигнального пептида для ЭР, то образующаяся полирибосома остается в цитозоле и ее белковый продукт остается там же. Следовательно, с мембранами шероховатого ЭР связываются только те мРНК, которые кодируют белки, несущие сигнальные пептиды ЭР;

те же молекулы мРНК, которые кодируют все остальные белки, остаются в цитозоле. Считают, что отдельные рибосомы случайным образом перемещаются между этими двумя различными популяциями молекул мРНК.

8.6.2. Некоторые специализированные клетки изобилуют гладким ЭР [33] Участки ЭР, не несущие связанных рибосом, называются гладким ЭР. Как правило, если клетки и содержат настоящий гладкий ЭР, то в очень малых количествах;

в действительности большинство областей ЭР частично являются гладкими, а частично-гранулярными. Их называют промежуточным ЭР. Именно от этих районов отшнуровываются транспортные пузырьки, переносящие вновь синтезированные белки в аппарат Гольджи (см. рис. 8-9). Однако существуют специализированные клетки, в которых гладкий ЭР хорошо развит и выполняет особые функции. В частности, гладкий эндоплазматический ретикулум преобладает в клетках, специализирующихся на метаболизме липидов. Например, клетки, синтезирующие стероидные гормоны из холестерола, имеют обширный гладкий ЭР, предназначенный для «расквартирования» ферментов, участвующих в синтезе холестерола и его преобразовании в гормоны (см. рис. 8-37,А).

Еще одним примером клеток, богатых гладким ЭР, являются гепатоциты. Это главное место, где образуются липопротеиновые частицы, предназначенные «на экспорт». Ферменты, синтезирующие липидные компоненты липопротеинов, локализованы на мембранах гладкого ЭР. На этих же мембранах расположены ферменты, катализирующие ряд реакций детоксикации, в результате которых обезвреживаются как лекарственные препараты, так и вредные соединения, образующиеся в процессе метаболизма. Наиболее широко изучены реакции детоксикации, катализируемые ферментами семейства цитохрома Р450. Эти белки используют высокоэнергетические электроны, полученные от NADPH, для присоединения гидроксильных групп к любому из множества потенциально вредных водонерастворимых углеводородов, попадающих в бислой. Другие ферменты на мембране ЭР добавляют затем к этим гидроксильным группам отрицательно заряженные растворимые в воде молекулы (такие, как сульфат или глюкуроновая кислота). После нескольких подобных реакций тот нерастворимый в воде лекарственный препарат (или метаболит), который в противном случае мог бы накапливаться в клеточных мембранах, становится достаточно растворимым, чтобы покинуть клетку и выделиться с мочой. Поскольку один только шероховатый ЭР не может вместить все эти и другие необходимые ферменты, значительная часть мембран гепатоцита в норме представлена гладким ЭР (см. табл. 8-2).

Если в кровоток попадают большие количества некоторых соединений, таких, как фенобарбитал, то в печени в необычно больших количествах синтезируются ферменты детоксикации, и поверхность гладкого ЭР может за несколько дней удвоиться. После удаления лекарственного вещества избыток мембран гладкого ЭР разрушается с помощью лизо-сом (при участии особых образований, называемых аутофагосомами - см. разд. 8.8.3), и через 5 дней гладкий ЭР приобретает нормальный объем. Как регулируются все эти изменения, неизвестно.

Мышечные клетки имеют специализированную, подобную гладкому ЭР, органеллу, называемую саркоплазматическим ретикулумом, которая захватывает из цитозоля Са2+. Основной мембранный белок саркоплазматического ретикулума-Са2+ -АТРаза, накачивающая внутрь ионы + Са2. Быстрое сокращение и расслабление миофибрилл в каждом цикле мышечного сокращения опосредуется высвобождением Са2+ из саркоплазматического ретикулума и затем повторным захватом его из цитозоля. Захватывающие Са2+ органеллы меньшего объема имеются в большинстве эукариотических клеток, где они высвобождают Са2+ в цитозоль в ответ на внеклеточные сигналы. Раньше считалось, что они являются частью ЭР, но теперь кажется более вероятным, что это самостоятельный мембранный компартмент неизвестного происхождения.

Перейдем теперь к обсуждению двух основных функций ЭР: синтеза и модификации белков и синтеза липидов.

8.6.3. Гранулярные и гладкие области ЭР могут быть разделены центрифугированием [34] Чтобы изучать функции и биохимию эндоплазматического ретикулума, необходимо сначала отделить его мембраны от других компонентов клетки. На первый взгляд эта задача кажется невыполнимой, поскольку ЭР как бы прослаивает все другие компоненты цитоплазмы (см. рис. 8-35). К счастью, когда ткани или клетки разрушают гомогенизацией, ЭР распадается на множество мелких («100 нм в диаметре) замкнутых пузырьков, называемых микросомами, которые относительно легко очистить.

Микросомы, полученные из гранулярного (шероховатого) ЭР, усеяны рибосомами и называются шероховатыми микросомами. Рибосомы всегда расположены на их внешней поверхности;

это свидетельствует о том, что пространство внутри микросом с биохимической точки зрения эквивалентно полости ЭР (рис. 8-39). В таких гомогенатах обнаруживается также множество пузырьков, сходных по размерам с шероховатыми микросомами, но лишенных рибосом. Такие гладкие Рис. 8-39. Когда клетки разрушают гомогенизацией, цистерны шероховатого ЭР (А) распадаются на маленькие замкнутые пузырьки, называемые шероховатыми микросомами (Б). Сходным образом, гладкий ЭР распадается на маленькие пузырьки, лишенные рибосом и называемые гладкими микросомами. (А-электронная микрофотография любезно предоставлена Daniel S. Friend;

электронная микрофотография любезно предоставлена George Palade.) микросомы образуются частично из гладких участков ЭР, частично - из фрагментов плазматической мембраны, аппарата Гольджи, эндосом и митохондрий (соотношение их зависит от ткани, из которой получают фракцию микросом). Таким образом, если шероховатые микросомы можно отождествить с шероховатым ЭР, то происхождение гладких микросом нельзя установить с такой же легкостью. Исключением является печень. Так как в гепатоцитах содержится чрезвычайно много гладкого ЭР, источником большинства гладких микросом в гомогенатах печени служит гладкий ЭР.

Рибосомы, содержащие большое количество РНК, придают шероховатым микросомам большую плотность по сравнению с гладкими.

Поэтому гладкие и шероховатые микросомы можно отделить друг от друга путем седиментации их смеси в градиенте плотности сахарозы (рис. 8 40). Если сравнить шероховатые и гладкие микросомы печени по таким параметрам как ферментативная активность или полипептидный состав, они окажутся чрезвычайно схожими (но не идентичными). Отсюда следует, что большинство компонентов мембраны ЭР может свободно перемещаться между ее гладкими и шероховатыми областями, чего и следовало ожидать, принимая во внимание текучесть и непрерывность мембранной системы.

Поскольку шероховатые микросомы легко поддаются очистке и сохраняют при этом свою функциональную активность, они исключительно полезны для изучения множества процессов, происходящих в ЭР.

Рис. 8-40. Процедура, используемая для выделения шероховатых и гладких микросом из ЭР.

Эти органеллы топологически устроены таким же образом, как и шероховатый ЭР;

их поверхность, обращенная в сторону цитоплазмы, легко доступна для ингредиентов, которые можно добавить in vitro. Для биохимика шероховатые микросомы есть не что иное, как уменьшенный вариант шероховатого эндоплазматического ретикулума, способный к синтезу белка, гликозилированию и синтезу липидов.

8.6.4. Гранулярные (шероховатые) участки ЭР содержат белки, ответственные за связывание рибосом [35] Поскольку мембрана ЭР, как и все мембраны, представляет собой двумерную жидкость, большинство белков и липидов должно свободно распределяться в ней (при отсутствии специальных ограничений) между шероховатыми и гладкими участками. Тем не менее оказалось, что шероховатые микросомы, выделенные из печени, содержат более 20 белков, отсутствующих в гладких микросомах. Этот факт говорит о существовании определенных ограничивающих механизмов. Некоторые из таких «неравновесных» белков мембраны шероховатого ЭР помогают связывать рибосомы, другие, вероятно, определяют ее уплощенную форму (см. рис. 8-37). Неясно, каким образом эти белки удерживаются в мембране: образуют ли они большие двумерные агрегаты или взаимодействуют с сетью структурных белков на той или другой поверхности мембраны ЭР (см. разд. 6.2.10).

Рибосомы шероховатого ЭР удерживаются на мембране частично благодаря растущим полипептидным цепям, продвигающимся сквозь мембрану по мере своего синтеза (см. ниже). Однако, если образование полипептидных цепей прерывается под действием какого-либо ингибитора (например, пуромицина), то рибосомы все равно остаются связанными с мембраной шероховатых микросом. Это сродство значительно повышается в растворах с низкими концентрациями солей. Если в таких условиях смешать очищенные рибосомы с мембранами шероховатых микросом, предварительно лишенными рибосом, то такие «ободранные» мембраны вновь приобретают то же количество рибосом, которое было на них после выделения из клеток. Участок связывания с мембраной находится на большой субъединице рибосомы, но до сих пор еще неясно, с каким из многочисленных белков мембраны шероховатого ЭР связывается рибосома. Установлено, однако, что для связывания рибосом с мембраной ЭР в физиологических условиях требуется дополнительное, более специфическое прикрепление, для которого необходим вновь созданный белок, несущий сигнальный пептид.

8.6.5. Впервые сигнальные пептиды были обнаружены в белках, попадающих в ЭР [36] Сигнальные пептиды (и способ переноса белков с их помощью) были открыты в начале 70-х гг. при изучении секреторных белков, которые перед переносом в аппарат Гольджи и выведением из клетки, попадают в ЭР. Суть эксперимента заключалась в следующем: мРНК, кодирующую секреторный белок, транслировали в системе in vitro. Когда из этой бесклеточной системы исключали микросомы, синтезированный белок оказывался немного больше, чем нормальный секреторный продукт. Избыток длины можно было объяснить наличием N-концевого лидер ного пептида. Однако в присутствии микросом, полученных из шероховатого эндоплазматического ретикулума, белок имел нормальный размер.

Эти результаты были объяснены с помощью сигнальной гипотезы. Она постулирует, что лидерный участок служит сигнальным пептидом, который направляет секреторный белок к мембране ЭР и затем отре- Рис. 8-41. Упрощенная схема переноса белков в ЭР, согласующаяся с исходной «сигнальной гипотезой». Как только на рибосоме синтезируется сигнальный пептид, он направляет рибосому к белку-рецептору на мембране ЭР. Считается, что по мере синтеза полипептидная цепь переносится через мембрану сквозь белковую пору, связанную с этим рецептором. В процессе трансляции сигнальный пептид отрезается, и сразу после синтеза в просвет ЭР высвобождается зрелый белок.

зается специальной протеазой на мембране ЭР еще до того, как полипептидная цепь будет синтезирована полностью (рис. 8-41).

В соответствии с сигнальной гипотезой секреторный белок в процессе его синтеза in vitro должен проникать в полость микросом. Чтобы убедиться в этом, применили протеазную обработку. Оказалось, что вновь синтезированный белок, образованный в отсутствие микросом, при добавлении протеазы деградирует. Тот же белок, синтезированный в присутствии микросом, остается интактным благодаря защите микросомной мембраны. Когда в бесклеточной системе транслировали белки, лишенные сигнального пептида, эти белки не попадали в микросомы и поэтому оставались чувствительными к протеазной обработке.

Сигнальная гипотеза была проверена и в генетических, и в биохимических экспериментах. Доказана ее справедливость и для растительных, и для животных клеток. Эта гипотеза подтверждается и для случая переноса белков через плазматическую мембрану прокариот.

Более того, N-концевые лидерные пептиды были обнаружены не только у секреторных белков, но и у предшественников белков плазматической мембраны и лизосом, которые также переносятся с помощью ЭР. Как отмечалось ранее, сигнальная роль этих лидерных пептидов была напрямую продемонстрирована с использованием техники рекомбинантных ДНК при присоединении сигнальных последовательностей к белкам, в норме их лишенных;

полученные гибридные белки направлялись в ЭР.

Бесклеточная система для переноса белков in vitro обеспечила мощную экспериментальную базу для изучения молекулярного механизма импорта белков в ЭР.

8- 8.6.6. Частица, распознающая сигнал, направляет сигнальный пептид ЭР к специфическому рецептору в мембране ЭР [37] В направлении сигнального пептида к мембране ЭР участвуют 1) частица, распознающая сигнал (a signal-recognition particle, SRP), связывающая сигнальный пептид, и ее рецептор, известный также как стыкующий белок. Частицы, распознающие сигнал, были открыты в ходе экспериментов, которые показали, что отмывка микросом в растворах солей уничтожает их способность импортировать секреторные белки. Эту способность можно восстановить, добавляя супернатант, содержащий солевой экстракт. Впоследствии «фактор переноса» был выделен. Он Рис. 8-42. Сильно упрощенная схема частицы, распознающей сигнал (SRP). Она представляет собой вытянутый комплекс, состоящий из шести полипептидных цепей (закрашенные участки) и одной молекулы 7SL-PHK. Один конец этой частицы связывается с рибосомой, а другой-с сигнальным пептидом вновь синтезированной полипеп-тидной цепи. Было сделано предположение, что часть 7SL-PHK может сворачиваться в тРНК-подобную структуру, которая конкурирует в А-участке рибосомы с поступающими аминоацил-тРНК, вызывая, таким образом, паузу в трансляции. (По V. Stegel и P. Walter, Nature 320: W-84, 1986.) оказался сложной частицей, состоящей из шести различных полипептидных цепей, связанных с одной молекулой 7SL-PHK (рис. 8-42).

Частица, распознающая сигнал, связывается с сигнальным пептидом, как только он «сходит» с рибосомы. Это приводит к временной остановке синтеза белка, а иногда полностью прерывает его. Возникшая пауза в трансляции, вероятно, дает возможность рибосоме связаться с мембраной ЭР до того, как синтез полипептидной цепи будет завершен. Благодаря этому ненужного высвобождения белка в цитозоль не происходит.

SRP состоит из двух групп белков, соединенных единым РНК-каркасом (см. рис. 8-42). В соответствии с одной из моделей, эта частица плотно захватывает рибосому, присоединяясь и к сигнальному пептиду (как только он появляется на большой субъединице рибосомы), и к ри босомному участку связывания аминоацил-тРНК. В результате трансляция останавливается, поскольку блокируется связывание следующей аминоацил-тРНК с рибосомой (рис. 8-43).

Пауза в трансляции длится до тех пор, пока захватившая рибосому частица не свяжется с SRP-рецептором, находящимся на цитоплазматической стороне мембраны шероховатого ЭР. Рецептор, как и сама частица, был вначале идентифицирован in vitro как необходимый компонент для переноса белка в ЭР. Теперь известно, что это интегральный мембранный белок, состоящий из двух цепей. Он взаимодействует с SRP-связанными рибосомами таким образом, что частица меняет свое положение и трансляция возобновляется. Одновременно рибосома связывается с мембраной ЭР, и растущая на ней полипептидная цепь переносится к системе транслокации в мембране. Эта система изучена Рис. 8-43. Полагают, что частица, распознающая сигнал, и белок-рецептор SRP действуют согласованно, направляя в ЭР белок с сигнальным пептидом ЭР. SRP связывается с экспонированным сигнальным пептидом и с рибосомой, возможно закрывая А-участок. Поскольку поступление очередной аминоацил-тРНК блокируется, трансляция прерывается. Рецептор SRP в мембране ЭР связывает комплекс SRP-рибосома;

затем, в процессе сложной и плохо изученной реакции, SRP удаляется, и трансляция возобновляется, теперь уже на рибосоме, расположенной на мембране ЭР. Для механизма, с помощью которого полипептидная цепь исходно встраивается в мембрану, необходим еще отдельный трансмембранный белок, который связывается с сигнальным пептидом (рецептор сигнального пептида), а также другие белковые компоненты, вовлеченные в перенос и пока как следует не охарактеризованные.

Рис. 8-44. Одно из представлений о транспорте белка через мембрану. После того, как рецептор распознает N-концевой сигнальный пептид, активируется энергозависимый белковый насос, который проталкивает весь белок сквозь мембрану;

при этом полипептидная цепь временно разворачивается. Альтернативная возможность состоит в том, что разворачивание белка происходит с цитозольной стороны мембраны и является АТР-зависимым, а белок направляется сквозь мембрану только за счет энергии, высвобождаемой при обратном сворачивании.

плохо, известно только, что она включает белок-рецептор второго сигнального пептида, отличающийся от SRP (см. рис. 8-43). По-видимому, ее роль заключается в связывании рибосомы, на которой синтезировался сигнальный пептид ЭР, с мембраной ЭР;

участвует она и в последующем переносе белка через мембрану.

8- 8.6.7. При переносе через мембрану ЭР не всегда продолжается удлинение полипептидной цепи [38] Выше шла речь о том, что перенос белков в митохондрии, хлоропласти и пероксисомы происходит после трансляции (посттрансляционно), когда белок синтезирован и поступил в цитозоль, между тем перенос через мембрану ЭР протекает одновременно с трансляцией (котрансляционно). Именно поэтому рибосомы связываются с мембраной ЭР, а не с цитоплазматической поверхностью других органелл. В течение многих лет считалось, что рибосомы шероховатого ЭР могут использовать энергию, освобождающуюся при синтезе белка, для «протаскивания» растущих полипептидных цепей сквозь мембрану ЭР. Однако последние исследования in vitro показали, что предшественники некоторых белков могут поступать в ЭР уже после того, как их синтез закончен. Этот перенос требует гидролиза АТР, но не продолжения синтеза белка (рис. 8-44). Считается, что, как и при переносе в митохондрии, гидролиз АТР необходим для разворачивания белка при прохождении его через мембрану. Об этом свидетельствуют как генетические, так и биохимические эксперименты на дрожжах.

Большинство белков-предшественников не могут проникнуть в ЭР, если они синтезировались в другом месте. Либо они сворачиваются таким образом, что маскируется сигнальный пептид, либо аппарат переноса на ЭР оказывается неспособным развернуть данный белок. Возможно, котрансляционный перенос позволяет этим белкам созревать без свертывания их молекулы, что характерно для белков, переносимых в другие органеллы.

8- 8.6.8. Различные пространственные структуры трансмембранных белков могут определяться комбинациями пептидов, детерминирующих начало и конец переноса [39] Большинство сигнальных пептидов удаляется специальной сигнальной пептидазой, связанной с мембраной ЭР. Однако само по себе присутствие сигнального пептида еще недостаточно для работы этой пептидазы: необходимо наличие no-соседству сайта разрезания, который не требуется для переноса. Показано, что у некоторых белков сигнальные Рис. 8-45. Топология переноса белка через мембрану ЭР, проиллюстрированная для двух простых случаев. Считается, что промежуточный продукт переноса содержит петлю полипептидной цепи, в которой сигнальный пептид (называемый также сигналом начала переноса) формирует половину вертикального участка петли, а вторая половина в каждый данный момент образована переносимым участком полипептида. В случае, когда имеется только старт-пептид, а стоп-пептид отсутствует, полипептид переносится через мембрану целиком, и после отрезания стартового пептида в просвет (полость) ЭР высвобождается зрелый растворимый белок (А). Если имеется один старт-пептид и один стоп пептид, перенос прекращается, когда стоп-пептид достигнет вертикального участка петли, в то время как синтез белка с цитозольнои стороны мембраны продолжается;

после отрезания сигнала начала переноса зрелый белок остается в мембране, он пронизывает липидный бислой ЭР, и с каждой стороны мембраны выступает по домену (Б).

пептиды расположены внутри полипептидной цепи и никогда не вырезаются.

Полагают, что неудаленные сигнальные пептиды играют важную роль в реализации различных способов встраивания в мембрану, обнаруженных у трансмембранных белков. Все эти способы можно рассматривать как варианты той последовательности событий, в результате которой растворимый белок переносится в полость ЭР. В соответствии с современными представлениями, гидрофобный сигнальный пептид растворимого белка, кроме прочих функций, служит сигналом начала переноса и остается погруженным в мембрану все то время, пока остальная часть молекулы белка протаскивается сквозь нее в виде большой петли (рис. 8-45, А). Когда через мембрану проходит карбоксильный конец молекулы, белок остается связанным с ней только сигнальным пептидом. Следовательно, если этот пептид отрезается, белок высвобождается в полость ЭР.

Для мембранных белков ситуация сложнее, поскольку часть их полипептидной цепи переносится через мембрану, а часть - нет. В простейшем случае такой белок переносится таким же способом, какой только что был описан для растворимых белков (кроме того, что его сигнальный пептид не несет участка разрезания и поэтому не удаляется сигнальной пептидазой). В результате белок становится трансмембранным, пронизывающим мембрану один раз. В мембрану погружен N-конец, на котором сигнальный пептид образует сегмент из 20-30 гидрофобных аминокислот, находящийся в форме -спирали (см. рис. 8-48,А).

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 13 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.