WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |   ...   | 11 |

«1 Молекулярная биология клетки 2 Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray, Biology Julian Lewis, Martin Raff, of the Cell Keith Roberts, James D. Watson SECOND EDITION Garland Publishing, Inc. ...»

-- [ Страница 8 ] --

42. Joklik W.K. ed. Virology, 2nd ed. Norwalk CT, Appleton and Lange, 1985. Shapiro J.A. ed. Mobile Genetic Elements. New York, Academic Press, 1983.

Watson J. D., Hopkins N. H., Roberts J. W., Steitz J. A., Weiner A. M. Molecular Biology of the Gene, 4th ed. Menlo Park CA, Benjamin Cummings, 1987. (Chapter 24 provides a modern overview of eucaryotic viruses.) 43. Hershey A.D., Chase M. Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. J. Gen. Physiol., 36, 39-56, 1952.

Luria S. E., Darnell J. E., Baltimore D., Campbell A. General Virology, 3rd ed.

New York, Wiley, 1978. (The introductory chapter provides a historical overview of the development of virology.) 44. Simons K., Garoff H., Helenius A. How an animal virus gets in and out of its host cell. Sci. Am., 246(2), 58-66, 1982.

45. Gierer A., Schramm G. Infectivity of ribonucleic acid from tobacco mosaic virus. Nature, 177, 702-703, 1956.

46. Cohen S.S. Virus-Induced Enzymes. New York, Columbia University Press, 1968.

47. Kornberg A. DNA Replication. San Francisco, Freeman, 1980. (Chapters 14 and 15 provide up-to-date, beautifully illustrated description of the varieties of ways phage and animal viral DNA's replicate.) 48. Campbell A.M. Bacteriophage lambda as a model system. Bioessys, 5, 277-280, 1986.

Daniels D., Sanger F., Coulson A. R. Features of bacteriophage lambda: analysis of the complete nucleotide sequence. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47, 1009-1024, 1982.

Lwoff A. Lysogeny. Bacteriol. Rev., 17, 269-337, 1952.

49. Watson J.D., Hopkins N.H., Roberts J. W., Steitz J.A., Weiner A.M. Molecular Biology of the Gene, 4th ed. Menlo Park CA, Benjamin Cummings, 1987. Chapter 26 describes the viruses that can cause tumors.) 50. Baltimore D. Virap DNA-dependent DNA polymerase. Nature, 226, 1209-1211, 1970.

Gallo R.C. The AIDS virus. Sci. Am., 256(1), 46-56, 1987.

Temin H. M., Mizutani A. RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature, 226, 1211-1213, 1970.

Varmus H. Retroviruses. Science, 240, 1427-1435, 1988.

51. Boeke J.D., Garfinkel D.J., Styles C.A., Fink G.R. Ту elements transpose through an RNA intermediate. Cell, 40, 491-500, 1985.

Fink G. R., Boeke J. D., Garfinkel D. J. The mechanisms and consequences of retrotransposition. Trends Genet., 2, 118-123, 1986.

52. Cohen S.N., Shapiro J.A. Transposable genetic elements. Sci. Am., 242(2), 40-49, 1980.

Mizuuchi K. Mechanism of transposition of bacteriophage Mu: polarity of the strand transfer reaction at the initiation of transposition. Cell, 39, 395-404, 1984.

53. Novick R.P. Plasmids. Sci. Am., 243(6), 102-127, 1980.

Reisner D., Gross H.J. Viroids. Annu. Rev, Biochem., 54, 531-564, 1985.

Rossmann M.G. The evolution of RNA viruses. Bioessays, 7, 99-103, 1987.

54. Drlica K. Understanding DNA and Gene Cloning. New York, Wiley, 1984.

Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

Watson J.D., Tooze J., Kurtz D. T. Recombinant DNA: A Short Course. New York, W.H. Freeman, 1983.

55. Smith H. O. Nucleotide sequence specifity of restriction endonucleases. Science, 205, 455-462, 1979.

56. Cohen S., Chang A., Boyer H., Helling R. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 3240-3244, 1973.

57. Maniatis T. et al. The isolation of structural genes from libraries of eucaryotic DNA. Cell, 15, 687-701, 1978.

Maniatis Т., Kee S. G., Efstratiadis A., Kafatos F. C. Amplification and characterization of a -globin gene synthesized in vitro. Cell, 8, 163 182, 1976.

58. Hedrick S. M., Cohen D. I., Nielsen E. A., Davis M. M. Isolation of cDNA clones encoding T cell-specific membrane-associated proteins.

Nature, 308, 149-153, 1984.

59. Grunstein M., Hogness D. S. Colony hybridization: a method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 72, 3961-3965, 1975.

Suggs S. V., Wallace R.B., Hirose Т., Kawashima E.H., Itakura K. Use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes: isolation of cloned sequences for human 2-microglobulin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6613-6617, 1981.

60. Coulson A., Sulston J., Brenner S.. Karn J. Toward a physical map of the genome of the nematode Caenorhabaitis elegans. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 83, 7821-7825, 1986.

Proustka A., Lehrach H. Jumping libraries and linking libraries: the next generation of molecular tools in mammalian genetics. Trends Genet., 2, 174-179, 1986.

61. Pelham H.R.B., Jackson R. J. An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem., 67, 247-256, 1976.

62. Geysen H. M. et al. Chemistry of antibody binding to a protein. Science, 235, 1184-1190, 1987.

Gilbert W., Villa-Komaroff L. Usefull proteins from recombinant bacteria. Sci. Am., 242(4), 74-94, 1980. Yokata T. et al. Use of a cDNA expression vector for isolation of mouse interleukin 2 cDNA clones: expression of T-cell growth-factor activity after transfection of monkey cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 68 72, 1985.

Young R. A., Davis R. W. Efficient isolation of genes by using antibody probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1194-1198, 1980.

63. Smith M. In vitro mutagenesis. Annu. Rev. Genet., 19, 423-462, 1985.

64. Hinnen A., Hicks J. В., Fink G. R. Transformation of yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929-1933, 1978.

Pa/miter R. D., Brinster R. L. Germ line transformation of mice. Annu. Rev. Genet, 20, 465-499, 1986.

Spradling A.C., Rubin G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science, 218, 341-347, 1982.

Thomas K. R., Capecchi M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell, 51, 503-512, 1987.

65. Marx J.L. Multiplying genes leaps and bounds. Science, 240, 1408-1410, 1988.

Saiki R. K. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239, 487-491, 1988.

66. Botstein D., White R. L., Skolnick M., Davis R. W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., 32, 314-331, 1980. Mapping and Sequencing the Human Genome. Washington DC, National Academy Press, 1988.

White R., LaLouel J.-M. Chromosome mapping with DNA markers. Sci. Am. 258(2), 40-49, 1988.

6. Плазматическая мембрана Плазматическая мембрана, окружающая каждую клетку, определяет ее величину и обеспечивает сохранение существующих различий между клеточным содержимым и окружающей средой. Мембрана служит высокоизбирательным фильтром и, кроме того, отвечает за активный транспорт;

с ее помощью регулируется поступление внутрь клетки питательных веществ и выход наружу продуктов выделения. Благодаря мембране устанавливается разница в концентрации ионов внутри клетки и во внеклеточном пространстве. Еще одна функция мембраны заключается в восприятии внешних сигналов, что позволяет клетке быстро отвечать на изменения, происходящие в окружающей среде.

Все биологические мембраны, включая плазматическую мембрану и внутренние мембраны эукариотических клеток, имеют общие структурные особенности: они представляют собой ансамбли липидных и белковых молекул, удерживаемых вместе с помощью нековалентных взаимодействий. Благодаря этим взаимодействиям поддерживается структурная целостность мембран: Однако сами по себе клеточные мембраны являются подвижными, «текучими» структурами и большинство входящих в их состав молекул способны перемещаться в плоскости мембраны. Как показано на рис. 6-1, липидные молекулы образуют непрерывный двойной слой толщиной около 5 нм. Липидный бислой - это основная структура мембраны, которая и создает относительно непроницаемый барьер для большинства водорастворимых молекул. Белковые молекулы как бы «растворены» в липидном бислое. С их помощью выполняются разнообразные функции мембраны. Одни мембранные белки обеспечивают транспорт молекул внутрь клетки или из нее, другие являются ферментами и катализируют ассоциированные с мембраной реакции. Еще один класс белков осуществляет структурную связь плазматической мембраны с цитоскелетом, с одной стороны, и(или) с внеклеточным матриксом либо с соседней клеткой - с другой. Отдельную группу составляют белки, выполняющие роль рецепторов для получения и преобразования химических сигналов из окружающей среды. Как и следовало ожидать, мембраны асимметричны;

оба их слоя различаются по липидному и белковому составу, что отражает, по-видимому, функциональные различия их поверхностей.

Несмотря на то что каждому типу мембран присущи определенные липидные и белковые компоненты, основные структурные и функциональные особенности, обсуждаемые в этой главе, характерны как для внутриклеточных, так и для плазматических мембран. Прежде всего нам хотелось бы рассмотреть структуру и организацию главных компонентов всех биологических мембран - липидов, белков и углеводов. Затем мы обсудим механизмы, используемые клетками для транспорта малых молекул через плазматическую мембрану, а также способы поглощения и выделения клетками макромолекул и крупных частиц. В последующих главах будут проанализированы некоторые дополнительные функции плазматической мембраны: роль в клеточной адгезии (гл. 14) и в сигнальных функциях (гл. 12).

Рис. 6-1. Схематическое трехмерное изображение небольшого участка клеточной мембраны.

6.1. Липидный бислой [1] Первые сведения о том, что молекулы липидов в биологической мембране образуют бислой, были получены в ходе простых, но элегантных экспериментов, выполненных в 1925 году. Было показано, что липиды из мембран эритроцитов, экстрагированные ацетоном, всплывают на поверхность воды, образуя пленку. Площадь пленки уменьшали с помощью подвижного барьера до тех пор, пока не формировался сплошной мономолекулярный слой. При этом оказалось, что площадь монослоя примерно в два раза больше первоначальной площади поверхности клеток. Поскольку единственной мембраной эритроцитов является плазматическая мембрана, экспериментаторы заключили, что молекулы липидов в ней должны быть организованы в виде непрерывного бислоя. Это заключение имело глубокое влияние на всю клеточную биологию. В настоящее время наличие липидного бислоя в клеточных мембранах доказано и более тонкими методами. Например, с помощью рентгеноструктурного анализа было продемонстрировано существование липидных бислоев в высокоорганизованных складках клеточных мембран, которые формируют изолирующую миелиновую оболочку, окружающую нервные клетки (см. разд. 19.2.4). О том, что все биологические мембраны содержат липидные бислой, убедительно свидетельствуют и данные электронно-микроскопических исследований: при изучении образцов, приготовленных методом замораживания скалывания, оказалось, что все клеточные мембраны могут быть механически расщеплены как раз между двумя липидными монослоями (см. разд. 6.2.6). Самопроизвольное формирование бислоя является особым свойством молекул липидов, которое реализуется даже вне клетки.

6- 6.1.1. Мембранные липиды - это амфипатические молекулы, самопроизвольно формирующие бислой [2] Липиды нерастворимы в воде, но хорошо растворяются в органических растворителях. В большинстве животных клеток они составляют около 50% массы плазматической мембраны животных, а почти все остальное приходится на белки. На 1 мкм2 липидного бислоя расположено пример- Рис. 6-2. Молекула фосфолипида фосфатидилхолина, представленная схематически (А), химической формулой (Б), в виде пространственной модели (В) и символом (Г). Чтобы отличить ненасыщенную цепь жирной кислоты от насыщенной, на этом рисунке (и далее везде) ненасыщенная цепь изображена с отчетливым изгибом. На самом же деле в ненасыщенной жирной кислоте жесткостью обладает только двойная связь. Вокруг всех одинарных связей возможно свободное вращение, поэтому в каждом липидном монослое обе цепи жирных кислот - как насыщенная, так и ненасыщенная - будут стремиться упаковаться параллельно.

Рис. 6-3. Фосфолипидная мицелла и фосфолипидный бислой в поперечном разрезе. Фосфолипидные молекулы самопроизвольно образуют подобные структуры в воде.

но 5 х 106 молекул липидов. Из этого следует, что в плазматической мембране небольшой животной клетки содержится около 109 молекул липидов.

В клеточной мембране присутствуют липиды трех типов: фосфолипиды (наиболее распространенный тип), холестерол и гликолипиды. Все они представляют собой амфипатические молекулы, т. е. у них есть гидрофильный («любящий воду», или полярный) и гидрофобный («боящийся воды», или неполярный) концы. Типичная молекула фосфолипида изображена на рис. 6-2. Она имеет полярную голову и два гидрофобных углеводородных хвоста. Длина хвостов варьирует от 14 до 24 атомов углерода в цепи. Один из хвостов, как правило, содержит одну или более цис-двойных связей (т. е. это ненасыщенный углеводород), тогда как у другого (насыщенного углеводорода) двойных связей нет. Как показано на рис. 6-2, каждая двойная связь вызывает появление изгиба в хвосте. Различия в длинах хвостов и насыщенности углеводородных цепей имеют важное значение, поскольку именно они влияют на расположение фосфолипидных молекул друг против друга и, следовательно, обусловливают текучесть мембраны (см. ниже).

Именно амфипатический характер молекул липидов заставляет их самопроизвольно формировать бислои в водных растворах. Когда амфипатические молекулы находятся в водном окружении, они стремятся агрегировать так, чтобы их гидрофобные хвосты были спрятаны от молекул воды, а гидрофильные головки оказались в контакте с молекулами воды. Агрегация такого типа осуществляется двумя способами: либо путем образования сферических мицелл, с хвостами, обращенными внутрь, либо путем формирования бимолекулярных пленок, или бислоев, в которых гидрофобные хвосты располагаются между двумя слоями гидрофильных голов. Обе эти возможности проиллюстрированы на рис. 6-3.

Большинство фосфолипидов и гликолипидов в водной среде самопроизвольно образуют бислои. Более того, эти липидные бислои имеют тенденцию к замыканию самих на себя, что приводит к формированию закрытых отсеков (компартментов). При этом устраняются свободные края, на которых гидрофобные хвосты могли бы соприкасаться с водой. По той же причине компартменты, построенные из липидных бислоев, стремятся сами залечить свои повреждения, смыкая края разорванных участков. Кроме способности к самосборке липидный бислой обладает и другими характеристиками, делающими его идеальным материалом для клеточных мембран. Важнейшее из этих свойств - текучесть, которая, как мы увидим в дальнейшем, обусловливает многие функции мембраны.

6- 6- 6.1.2. Липидный бислой - это двумерная жидкость [3] О том, что отдельные молекулы липидов способны свободно диффундировать в пределах липидного бислоя, исследователи впервые узнали, как это ни странно, только в начале 1970-х годов. Первоначально это было показано на искусственных липидных бислоях. Для экспериментальных исследований оказались весьма полезными искусственные бислои двух типов: 1) липосомы, имеющие форму сферических пузырьков, диаметр которых варьирует от 25 нм до 1 мкм в зависимости от способа их получения (рис. 6-4), и 2) плоские бислои, называемые черными мембранами, «закрывающие» отверстие в перегородке между двумя отделениями сосуда, заполненными водой (рис. 6-5).

Для измерения подвижности отдельных липидных молекул и их частей используются разнообразные методы. Так, к полярной голове молекулы липида можно присоединить «спиновую метку», например нитроксильную группу (= N — О), имеющую неспаренный электрон. Спин этого электрона порождает парамагнитный сигнал, обнаруживаемый методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) (принципы этого метода сходны с принципами ядерного магнитного резонанса. ЯМР). Этот метод позволяет легко определить движение и ориентацию в бислое подобного спин-меченного липида. Такие исследования показывают, что липидные молекулы в синтетических мембранах чрезвычайно редко перескакивают из одного монослоя мембраны в другой. Любая индивидуальная молекула липида осуществляет подобный пере- Рис. 6-4, А. Электронная микрофотография нефиксированных неокрашенных фосфолипидных пузырьков (липосом) в воле. Обратите внимание, что бислойная структура везикул легко различима. Б. Схематическое изображение небольшой сферической липосомы в поперечном разрезе. Липосомы обычно используются в экспериментальных исследованиях в качестве модельных мембран. (А - с любезного разрешения Jean Lepault.) Рис. 6-5. Схематическое изображение искусственного липидного бислоя, называемого черной мембраной, в поперечном разрезе. Мембрана закрывает небольшое отверстие в перегородке между двумя отделениями сосуда, заполненными водой. Черные мембраны используются для измерения проницаемости искусственных мембран.

скок (флип-флоп) реже, чем один раз в две недели (рис. 6-6). С другой стороны, липидные молекулы без труда меняются местами со своими соседями в пределах одного монослоя (примерно 107 раз в 1 с), что приводит к быстрой латеральной диффузии, причем коэффициент диффузии D составляет около 10-8 см2с-1. Это означает, что липидная молекула средних размеров диффундирует на расстояние, равное длине большой бактериальной клетки (~ 2 мкм), приблизительно за 1 с. Кроме того, подобные исследования показывают, что молекулы липидов очень быстро вращаются вокруг своих продольных осей, а их углеводородные цепи обладают гибкостью;

при этом наибольшая подвижность наблюдается у центра бислоя, а наименьшая - около полярной головы (рис. 6-6).

Изучение меченых липидных молекул в изолированных биологических мембранах и относительно простых целых клетках, таких как микоплазма, бактерии и эритроциты, показало, что поведение липидных молекул в клеточных мембранах в основном сходно с поведением этих молекул в искусственных бислоях. Липидный компонент биологической мембраны представляет собой двумерную жидкость, в которой отдельные молекулы липидов могут свободно передвигаться в плоскости мембраны. Как и в синтетических бислоях, индивидуальные молекулы липидов обычно не выходят за пределы своего монослоя. Однако существуют исключения: в таких мембранах, в которых липиды активно синтезируются (например, в мембранах эндоплазматического ретикулума) должен идти быстрый флип-флоп специфических липидов. Для ускорения этого процесса имеются даже специальные мембраносвязанные ферменты - транслокаторы фосфолипидов (см. разд. 8.6.14).

6.1.3. Текучесть липидного бислоя зависит от его состава [4] Синтетический липидный бислой, состоящий из фосфолипидов одного типа, при понижении температуры до строго определенного значения (точки замерзания) переходит из жидкого состояния в кристаллическое (или гелеобразное). Это изменение состояния называется фазовым переходом. Температура перехода оказывается ниже (т. е. мембрану трудно заморозить), если углеводородные цепи короткие или в них содержатся двойные связи. При меньшей длине цепи взаимодействие углеводородных хвостов становится менее вероятным, а изломы, вызванные наличием цис-двойных связей, мешают более компактной упаковке хвостов (рис. 6-7).

В синтетическом бислое, содержащем смесь фосфолипидов с различной степенью насыщенности (и, следовательно, с различными температурами фазового перехода), может происходить разделение фаз: при снижении температуры до точек замерзания фосфолипидные молекулы определенного типа спонтанно агрегируют внутри бислоя, образуя Рис. 6-6. Типы движений фосфолипидных молекул в липидном бислое.

Рис. 6-7. Двойные связи в ненасыщенных углеводородных цепях увеличивают текучесть липидного бислоя, затрудняя совместную упаковку гидрофобных хвостов.

Рис. 6-8. Молекула холестерола, представленная в виде химической формулы (А), схематического изображения (Б) и в процессе взаимодействия с двумя фосфолипидными молекулами в монослое (В).

«замороженные» частицы. Поскольку в биологических мембранах в одной и той же липидной молекуле обычно содержится как насыщенная, так и ненасыщенная цепь жирной кислоты, в клетке такое разделение фаз невозможно.

Другим фактором, влияющим на текучесть мембраны, служит холестерол. Плазматические мембраны эукариот содержат довольно большое количество холестерола - приблизительно одну молекулу на каждую молекулу фосфолипида. Молекулы холестерола ориентируются в бислое таким образом, чтобы их гидроксильные группы примыкали к полярным головам фосфолипидных) молекул. При этом их жесткие, плоские стероидные кольца частично иммобилизуют участки углеводородных цепей, непосредственно примыкающих к полярным головам. Остальные части углеводородных цепей не утрачивают своей гибкости (рис. 6-8). Хотя холестерол делает липидный бислой менее текучим, при его высоких концентрациях (что характерно для большинства плазматических мембран эукариотических клеток), он предотвращает слипание и кристаллизацию углеводородных цепей. Таким образом, холестерол также ингибирует возможные фазовые переходы.

Холестерол уменьшает не только текучесть липидного бислоя, такое же действие он оказывает на его проницаемость для малых водорастворимых молекул. Кроме того, холестерол увеличивает упругость и механическую прочность бислоя. Именно благодаря холестеролу мембрана может менять свою форму в ответ на приложенную к ней силу. Дело в том, что в отличие от фосфолипидов, холестерол может быстро перераспределяться между монослоями. Объясняется это тем, что маленькая полярная голова холестерола (гидроксильная группа) относительно легко проходит через центр бислоя, энергетический барьер для флип-флоп молекул холестерола оказывается низким, и, следовательно, его перераспределение осуществляется быстро.

О важности холестерола для поддержания механической прочности мембран говорят данные по изучению мутантных линий животных клеток, не способных его синтезировать. При отсутствии холестерола в культуральной жидкости такие клетки быстро лизируются (разрываются с высвобождением их содержимого). Добавленный в среду холестерол встраивается в плазматическую мембрану, тем самым стабилизируя липидный бислой;

в результате клетки выживают.

Определенная текучесть плазматической мембраны имеет важное биологическое значение. Об этом свидетельствует тот факт, что бактерии, дрожжи и другие пойкилотермные организмы, принимающие температуру окружающей среды, изменяют жирнокислотный состав своих плазматических мембран таким образом, чтобы текучесть мембраны оставалась примерно постоянной. Например, при падении температуры начинают синтезироваться жирные кислоты с большим числом цис двойных связей, для того чтобы предотвратить уменьшение текучести бислоя, которое может при этом произойти. Было показано, что некоторые процессы мембранного транспорта приостанавливаются и определенные ферментативные активности исчезают как только вязкость бислоя превышает некое пороговое значение. Остается установить, какие именно процессы, связанные с мембранами, наиболее сильно зависят от текучести бислоя.

6.1.4. Липидный бислой служит растворителем для мембранных белков [5] Липидные составы различных биологических мембран сравниваются в табл. 6-1. Плазматические мембраны бактерий обычно имеют фосфолипид только одного типа и не содержат холестерол;

в отсутствие холестерола механическая прочность обеспечивается окружающей клеточной стенкой (см. рис. 5-54). В то же время в большинстве плазматических мембран эукариотических клеток имеется не только значительное количество холестерола, но и множество различных фосфолипидов. Например, в плазматической мембране многих животных клеток обнаруживаются четыре основных фосфолипида: фосфатидилхолин, сфингомиелин, фомфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин. Структуры этих молекул приведены на рис. 6-9;

отметим, что из них только фосфатидилсерин имеет отрицательный заряд, а остальные три при физиологических рН оказываются электрически нейтральными. Эти четыре фосфолипида вместе составляют более половины всей массы липидов для большинства мембран (табл. 1-6). Другие фосфолипиды, такие, как инозитолфосфолипиды (см. разд. 12,3.9), тоже важны в функциональном отношении, но представлены в относительно малых количествах. Исключительная роль инозитолфосфолипидов в передаче клеточных сигналов обсуждается в гл.

12.

Таблица 6-1. Примерный липидный состав различных клеточных мембран Процент от общего содержания липидов (по весу) Липиды Плазматическая Плазматическая Миелин Внешняя и ЭР Е. coli мембрана клеток мембрана внутренняя печени эритроцитов мембрана митохондр ий Холестерол 17 23 22 3 6 Фосфатидилэтаноламин 7 18 15 35 17 Фосфатидилсерин 4 7 9 2 5 следы Фосфатидилхолин 24 17 10 39 40 Сфингомиелин 19 18 8 0 5 Гликолипиды 7 3 28 следы следы Другие 22 13 8 21 27 Рис. 6-9. Формулы и символы четырех главных фосфолипидов, содержащихся в плазматических мембранах. Обратите внимание, что различные полярные головы обозначены разными символами (на этом и следующем рисунке). Все представленные липидные молекулы построены на основе глицерола, за исключением сфингомиелина, происходящего от серина. Структура и формула церамида представлены на рис. 6-11.

Возникает вопрос;

с чем связано такое разнообразие фосфолипидов в плазматических мембранах эукариот? Возможно, липидный бислой является двумерным растворителем для белков в составе мембраны, подобно тому как вода служит трехмерным растворителем в водном растворе.

Можно предположить также, что некоторые мембранные белки функционируют только в присутствии специфических фосфолипидных полярных групп, напоминая в этом отношении многие ферменты, для активирования которых в водном растворе необходим какой-либо определенный ион.

Это предположение подтверждается данными о том, что в искусственных липидных бислоях для оптимальной активности функционирующих мембранных белков требуются определенные специфические фосфолипиды.

6- 6- 6.1.5. Липидный бислой асимметричен [6] Во всех изученных плазматических мембранах две половины бислоя поразительно различаются по липидному составу. Например, в мембране эритроцитов человека большинство липидных молекул, оканчивающихся холином (СН3 )3 N+ СН2 СН2 ОН - т. е. фосфатидилхолин и сфингомиелин, располагаются во внешней половине бислоя, а основная часть фосфолипидов, несущих на конце аминогруппу (фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин), - во внутренней (рис. 6-10). Хвосты жирных кислот, входящих в состав фосфатидилхолина и сфингомиелина более насыщенны, чем те, которые находятся в составе фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина. В связи с этим асимметрия в распределении полярных голов сопровождается асимметрией распределения углеводородных хвостов. Это может привести к тому, что текучесть внутреннего монослоя будет несколько больше, чем внешнего. Известно также, что отрицательно заряженный фосфатидилсерин локализован во внутренней половине бислоя;

следовательно, две стороны бислоя существенно различаются и по заряду.

Рис. 6-10. Асимметрическое распределение фосфолипидов и гликолипидов в липидном бислое эритроцитов человека. Символы, используемые для обозначения фосфолипидов, те же, что и на рис. 6-9. Полярные головы гликолипидов изображены в виде шестиугольников. Холестерол (не показан), по-видимому, распределяется между монослоями примерно одинаково.

Большинство мембран эукариотических клеток, включая плазматическую мембрану, синтезируется в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). Это значит, что асимметрия в распределении фосфолипидов является следствием работы транслокаторов фосфолипидов в ЭР, которые переносят специфические молекулы фосфолипидов из одного монослоя в другой (см. разд. 8.6.14). Несмотря на то что функциональный смысл асимметричного распределения липидов во многом непонятен, показано, что существуют мембраносвязанные ферменты, использующие этот феномен. Например, при активации протеинкиназы С она связывается с цитоплазматической стороной плазматической мембраны, где концентрируется фосфатидилсерин - отрицательно заряженный фосфолипид, необходимый для работы фермента (см. разд. 12.3.10). Важность существования специфических инозитолфосфолипидов, сконцентрированных на цитоплазматической стороне бислоя, где они могут использоваться для генерации внутриклеточных медиаторов в ответ на внеклеточные сигналы, обсуждается в гл. 12.

6.1.6. Гликолипиды обнаруживаются на поверхности всех плазматических мембран, однако их функция неизвестна [7] В плазматических мембранах животных клеток наиболее асимметрично распределены липидные молекулы, принадлежащие к классу олигосахаридсодержащих липидов, называемых гликолипидами. Эти удивительные молекулы обнаруживаются только в наружной половине бислоя, а их сахарные группы ориентированы к поверхности клетки (рис. 6-10), что свидетельствует об участии данных молекул во взаимодействии клетки с ее окружением. Асимметричное распределение гликолипидов в бислое создается при присоединении сахарных остатков к молекулам липидов, происходящем в цистернах аппарата Гольджи.

Гликолипиды, вероятно, присутствуют в плазматических мембранах всех животных клеток и составляют обычно около 5% липидных молекул наружного монослоя. Они сильно различаются у разных видов и даже в разных тканях одного и того же вида. У бактерий и растений почти все Гликолипиды - это производные липидов на основе глицерола, например, широко распространенного фосфатидилхолина. В животных клетках Гликолипиды построены на основе церамида, каковым является, например, фосфолипид сфингомиелин (см. рис. 6-9). Структура гликосфинголипидов в целом аналогична структуре фосфолипидов, образованных из глицерола. Они также имеют полярную голову и две гидрофобные цепи жирных кислот. Однако одна из цепей жирных кислот первоначально соединяется с серином, образуя аминоспирт сфингозин, с которым затем связывается вторая цепь жирной кислоты, образуя церамид (рис. 6-11).

Все гликолипидные молекулы различаются по числу сахарных остатков в их полярных головах. Среди множества гликолипидов плазмати- Рис. 6-11. Заключительные этапы биосинтеза простого гликосфинголипида - галактоцереброзида. Сфингозин образуется при конденсации аминокислоты серина с одной молекулой жирной кислоты. Затем присоединяется вторая молекула жирной кислоты. При этом образуется церамид.

Синтез церамида идет в ЭР, а углевод присоединяется в аппарате Гольджи. Церамид используется и при синтезе основного фосфолипида - сфингомиелина (см. рис. 6-9).

Рис. 6-12. Структура сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты, или NANА). В клетках она существует, как изображено на рисунке, в ионизованной форме (—СОС-).

ческих мембран эукариотических и прокариотических клеток можно выделить группу нейтральных гликолипидов. Их полярные головы содержат от 1 до 15 и более нейтральных (незаряженных) Сахаров, в зависимости от организма и типа клеток. Пример - галактоцереброзид, один из простейших гликолипидов, полярная голова которого состоит только из одной галактозы. Галактоцереброзид - это главный гликолипид миелина, многослойной мембранной оболочки, окружающей аксоны. Миелин представляет собой плазматическую мембрану специализированной миелинообразующей клетки, уложенную в виде множества концентрических слоев вокруг нервного волокна. Отличительная особенность этих клеток заключается в высоком содержании галактоцереброзида в их плазматической мембране (до 40% массы наружного монослоя). В мембранах других клеток галактоцереброзида мало. Это. возможно, означает, что он играет важную роль в специфическом взаимодействии миелинообразующей клетки и аксона.

Самые сложные из гликолипидов - ганглиозиды - содержат один или более остатков сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты, или NANA), которые придают молекулам ганглиозидов отрицательный заряд (рис. 6-12). Особенно много ганглиозидов содержится в плазматической мембране нервных клеток, где они составляют 5-10% от общей массы липидов, однако в большинстве типов клеток они встречаются в гораздо меньших количествах. В настоящее время идентифицировано Рис. 6-13. Некоторые типичные ганглиозиды и их структурные обозначения. В GM1, GM2, GM3, GD1, GT1, буквы M, D и Т обозначают число остатков сиаловой кислоты -один, два и три соответственно, а цифры 1, 2 и 3 представляют собой разность, полученную вычитанием числа незаряженных углеводных остатков из 5. NANA-N-ацетилнейраминовая (сиаловая) кислота, Gal-галактоза, Glc-глюкоза, GalNAc-N-ацетилгалактозамин. GaJ, Glc и GalNAc не заряжены, a NANA несет отрицательный заряд (см. рис. 6-12).

более 40 различных ганглиозидов. Некоторые из них представлены на рис. 6-13, где приводится и номенклатура, используемая для описания этих соединений.

О функциях гликолипидов известно мало. Установлено, например, что ганглиозид GM1 (рис. 6-13) действует как поверхностный рецептор для бактериального токсина, вызывающего изнурительный понос при холере. Холерный токсин, связывается с поверхностью и попадает внутрь только тех клеток, у которых в плазматической мембране присутствует GM1 (к ним относятся, например, эпителиальные клетки кишечника).

Проникновение холерного токсина внутрь клетки приводит к долговременному увеличению концентрации внутриклеточного сАМР, которое обусловливает сильный приток Na+ и воды внутрь кишечника. Конечно, связывание бактериальных токсинов не может быть нормальной функцией ганглиозидов. Можно предположить, что они выступают в роли рецепторов для определенных медиаторов, осуществляющих нормальную связь между клетками.

Заключение Биологические мембраны состоят из непрерывного двойного слоя липидных молекул с погруженными в него различными белками.

Липидный бислой представляет собой жидкость, в которой отдельные молекулы липидов способны быстро диффундировать в пределах своего монослоя, но чрезвычайно редко спонтанно перемещаются из одного монослоя в другой. Мембранные липиды - амфипатические молекулы и в водной среде самопроизвольно образуют бислой. Эти бислой самоорганизуются в закрытые компартменты, которые способны самопроизвольно восстанавливаться при повреждениях. В плазматической мембране имеются три основных класса липидных молекул - фосфолипиды, холестерол и гликолипиды, причем составы внутреннего и наружного монослоев отличаются друг от друга. Разный липидный состав характерен как для плазматических мембран различных типов клеток, так и для разных мембран одной и той же эукариотической клетки. Функциональное значение различных компонентов разных мембран в большинстве случаев остается неизвестным.

6.2. Мембранные белки Хотя основные структурные особенности биологической мембраны определяются свойствами липидного бислоя, большинство их специфических функций осуществляется белками. Вот почему типы белков и их количества в мембране сильно варьируют: в миелиновой мембране, которая служит преимущественно для изоляции аксонов, Белки составляют менее 25% массы мембраны, а в мембранах, связанных с процессами превращения энергии (например, во внутренних мембранах митохондрий и хлоропластов) на их долю приходится около 75% массы мембраны. В обычной плазматической мембране количество белков равно приблизительно половине ее массы, т. е. значение этого показателя среднее между указанными выше крайними величинами. Поскольку размер липидной молекулы весьма мал по сравнению с размерами молекулы белка, можно сделать вывод, что в мембране всегда содержится значительно больше молекул липидов, чем белков. Например, если белки составляют 50% массы мембраны, то на одну молекулу белка приходится приблизительно 50 липидных молекул.

6- 6- 6.2.1. Полипептидная цепь многих мембранных белков пронизывает липидный бислой один или несколько раз [8] Многие мембранные белки пронизывают бислой насквозь (пример 1 и 2 на рис. 6-14). Подобно их липидным соседям эти, так называемые трансмембранные белки, обладают амфипатическими свойствами: у них есть гидрофобные участки, проходящие через мембрану и взаимодействующие с гидрофобными хвостами липидных молекул внутри бислоя, и гидрофильные участки, обращенные к воде с обеих сторон мембраны. Гидрофобность некоторых мембранных белков увеличивается за счет ковалентного присоединения цепи жирной кислоты, которая внедряется в бислой с его цитоплазматической стороны (примеры 1 и 2 на рис. 6-14). Некоторые внутриклеточные мембранные белки присоединены к бислою только с помощью цепи жирной кислоты (пример 3 на рис. 6-14), есть и такие поверхностные белки, которые ассоциированы с бислоем за счет ковалентных взаимодействий (через специфический олигосахарид) с фосфатидилинозитолом - минорным фосфолипидом, находящимся во внешнем липидном монослое плазматической мембраны (пример 4 на рис. 6-14).

Рис. 6-14. Пять способов ассоциации мембранных белков с липидным бислоем. Трансмембранные белки пронизывают бислой в виде одиночной спирали (1) или нескольких -спиралей (2). Некоторые из таких белков (1 и 2) имеют присоединенную ковалентно цепь жирной кислоты, погруженную в цитоплазматический монослой (1). Другие мембранные белки ассоциируют с бислоем только за счет ковалентно присоединенного к ним липида - либо цепи жирной кислоты, погруженной в цитоплазматический монослой (3), либо, гораздо реже, через фосфолипид фосфатидилинозитол, погруженный во внешний монослой и соединенный с белком через олигосахарид (4). Наконец, многие белки ассоциируют с мембраной только благодаря нековалентным взаимодействиям с другими мембранными белками (5). Детали обсуждаются в гл. 8.

Рис. 6-16. Типичный трансмембранный гликопротеин, пересекающий мембрану 1 раз. Обратите внимание, что полипептидная цепь пронизывает липидный бислой в виде правозакрученной -спирали, и что олигосахаридные группы и дисульфидные связи в Рис. 6-15. Сегмент цепи трансмембранного полипептида, цитоплазматическом домене не образуются из-за восстановительных пронизывающего липидный бислой в виде -спирали (по данным условий в цитозоле клетки.

рентгеноструктурного анализа кристаллов мембранного белка).

Показана только скелетная модель полипептидной цепи. Гидрофобные аминокислоты выделены цветом. Торчащие неполярные боковые группы аминокислотных остатков (не показаны) взаимодействуют с гидрофобными цепями жирных кислот внутри липидного бислоя.

Полярные пептидные группы образуют между собой водородные связи (не показаны) и, таким образом, экранируются от гидрофобного окружения бислоя. Представлен фрагмент полипептида из бактериального фотосинтезирующего реакционного центра, изображенного на рис. 6-32. (J. Deisenhofer et al., Nature 318, 618-624, 1985 и H. Michel et al., EMBO J., 5, 1149-1158, 1986.) Некоторые белки, связанные с мембранами, вовсе не взаимодействуют с гидрофобной внутренностью липидного бислоя. Они соединены с той или другой стороной мембраны за счет нековалентных взаимодействий с другими мембранными белками (пример 5 на рис. 6-14). Многие из них высвобождаются из мембраны в сравнительно мягких условиях, например путем экстракции растворами с очень высокой или низкой ионной силой или растворами с крайними значениями рН, которые влияют на взаимодействия белок-белок, но оставляют интактным липидный бислой.

Такие белки называют периферическими мембранными белками. Напротив, трансмембранные белки, белки, связанные с фосфатидилинозитолом, и некоторые белки, удерживаемые в бислое с помощью цепи жирной кислоты (так же как и другие, крепко связанные белки, которые могут быть высвобождены только после разрушения бислоя детергентами или органическими растворителями) называются интегральными мембранными белками.

Та часть полипептидной цепи трансмембранных белков, которая погружена в гидрофобное окружение липидного бислоя, состоит в основном из аминокислотных остатков с неполярными боковыми группами. Однако, поскольку пептидные группы полярны, а молекулы воды недоступны, все пептидные группы в бислое стремятся образовать водородные связи между собой (см. рис. 3-26). Число водородных связей между пептидными группами оказывается максимальным, если участок полипептидной цепи, проходящей через бислой, образует регулярную -спираль.

Именно так большинство полипептидных цепей пересекает мембрану (рис. 6-15). В тех же случаях, когда через бислой проходит несколько участков полипептидной цепи, пептидные группы могут в принципе быть насыщены водородными связями, если эти участки организованы в виде -СЛОЕВ. Однако чаще полипептидная цепь белков, пронизывающих мембрану несколько раз, образует серию -спиралей, а не -СЛОЕВ (пример на рис. 6-14). Строгое условие максимизации числа водородных связей в отсутствие молекул воды (запрет на дегидратацию) означает также, что полипептидная цепь, пронизывающая мембрану, вероятно, не меняет своего первоначального направления до полного пересечения мембраны, поскольку наличие изгиба в цепи привело бы к уменьшению числа регулярных водородных связей. Видимо, по этой причине до сих пор не обнаружено мембранных белков, погруженных в мембранный слой лишь частично.

Трансмембранные белки всегда имеют уникальную ориентацию в липидном бислое. Это отражает асимметричный характер их биосинтеза и встраивания в мембранный бислой эндоплазматического ретикулума, а также различные функции цитоплазматических и внеклеточных доменов этих белков. Основная масса трансмембранных белков гликозилирована. Как и в случае с гликолипидами, олигосахаридные цепи всегда присутствуют на внеклеточной стороне мембраны, поскольку сахарные остатки присоединяются в цистернах эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. Другая асимметрия заключена в белковых сульфгидрильных группах (SH), которые остаются восстановленными (цистеины) в цитоплазматических доменах, но часто используются для формирования внутри- или межцепных дисульфидных (S — S) связей во внеклеточных доменах (рис. 6-16).

6.2.2. Мембранные белки могут быть растворены и очищены в растворах детергентов [9] Как правило, трансмембранные белки (и некоторые другие, прочно связанные с мембраной) могут быть солюбилизированы только с помощью реагентов, разрушающих гидрофобные взаимодействия и, в конечном счете, бислой. Наиболее успешно это можно сделать, используя детергенты - небольшие амфипатические молекулы, стремящиеся образовать в воде мицеллы (рис. 6-17). При смешивании детергента с мембраной гидрофобные концы его молекул связываются с гидрофобными участками мембранных белков, вытесняя оттуда молекулы липидов. Поскольку противоположный конец молекулы детергента полярный, такое связывание приводит к тому, что мембранные белки переходят в раствор в виде комплексов с детергентом. Некоторые прочно связанные с белками молекулы липидов также остаются в этих комплексах (рис. 6-18). Полярные концы детергентов могут быть либо заряженными (ионными), как в додецилсулъфате натрия (ДСН), либо незаряженными (неионными), как в случае тритонов. Структуры этих двух используемых повсеместно детергентов изображены на рис. 6-19.

Сильным ионным детергентом типа ДСН можно солюбилизировать даже самые гидрофобные белки мембран. Это позволяет анализировать такие белки методом электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Разработка данной методики произвела настоящую революцию в изучении мембранных белков. Детергенты такого типа разворачивают (денатурируют) полипептидную цепь белка, внедряясь в его внутреннее «гидрофобное ядро» (см. рис. 3-22). Обычно при этом белки утрачивают активность и становятся непригодными для исследования их функции. Тем не менее белки могут быть легко очищены в денатурированной под действием ДСН форме. В некоторых случаях удаление детергента приводит к ренатурации и восстановлению функциональной активности.

Менее гидрофобные мембранные белки можно солюбилизировать при низких концентрациях мягкого детергента. Это позволяет получить их если не в нативной, то по крайней мере в функционально активной форме. Если же детергент затем удалить в отсутствие фосфолипидов, то мембранные белки обычно агрегируют и выпадают в осадок (рис. 6-20). Однако если очищенные белки смешать с фосфолипидами до удаления детергента, то белки в активной форме обычно встроятся в липидный бислой, формируемый молекулами фосфолипидов (рис. 6-21). Таким образом можно реконструировать функционально активные системы мембранных белков из очищенных компонентов. Это один из возможных подходов к изучению их функциональной активности. Например, если удается показать, что очищенный белок перекачивает ионы через Рис. 6-17. Поперечный разрез мицеллы, образовавшейся в воде из молекул детергента. Молекулы детергента являются амфипатическими, поскольку имеют полярный и неполярный концы.

Рис. 6-18. Солюбилизация мембранных белков с помощью детергента. Детергент разрушает липидный бислой, в результате чего белки оказываются в растворе в виде комплексов с молекулами липидов и детергента. Фосфолипиды мембран также солюбилизируются с помощью детергента.

Рис. 6-19. Структуры молекул двух широко распространенных детергентов: додецилсульфата натрия (ДСН, анионного детергента) и тритона Х- (неионного детергента). Заметьте, что участок в скобках повторяется семь раз.

синтетический липидный бислой в отсутствие других белков, можно со всей определенностью сказать, что это ионный насос. Более того, контролируя в экспериментах условия реакции (доступность белков для АТР и ионов), можно выяснить детальный механизм действия этого белка (см. разд. 6.4.4).

6- 6.2.3. Поверхность мембранных белков, обращенную к цитоплазме, можно изучать на примере «теней» эритроцитов [10] О плазматической мембране эритроцитов человека (рис. 6-22) известно гораздо больше, чем о любой другой мембране эукариотической клетки. Такая ситуация сложилась вследствие ряда причин. 1) Эритроциты можно получать в большом количестве (например, из банков крови).

При этом они практически не загрязнены клетками других типов. 2) Поскольку эритроциты не имеют ядра и внутренних органелл, их плазматическая мембрана - это единственная мембрана данных клеток и ее можно выделить в чистом виде, без примеси внутренних мембран.

Между тем при получении плазматической мембраны из клеток других типов, в которых она обычно составляет менее 5% от массы всех мембран (см. табл. 8-2), это представляет серьезную проблему. 3) Мембраны эритроцитов, или «тени» (пустые оболочки), легко получить, поместив клетки в гипотетический солевой раствор. Концентрация соли в таком растворе ниже, чем в клетке, поэтому вода устремляется внутрь эритроцитов, заставляя их разбухать и лопаться (лизис), высвобождая гемоглобин (главный немембранный белок). 4) Мембранные «тени» можно изучать как в поврежденном виде (в этом случае реагенты взаимодействуют с молекулами на обеих сторонах мембраны), так и после самопроизвольного восстановления их целостности, когда водорастворимые реагенты не могут проникать во внутреннее пространство. Кроме того, из теней эритроцитов можно получить замкнутые, вывернутые наизнанку пузырьки (рис. 6-23);

это дает возможность изучать независимо друг от друга внешнюю и внутреннюю (цитоплазматическую) стороны мембраны. Использование теней эритроцитов с разрывами и без разрывов впервые позволило установить, что некоторые мембранные белки пронизывают липидный бислой (см. ниже), и что состав липидов на двух сторонах бислоя различен. Как и в большинстве основных принципов, первоначально установленных при изучении мембран эритроцитов, эти факты постепенно были подтверждены и при изучении мембран ядерных клеток.

Характер расположения в мембране того или иного белка можно определить несколькими способами. Один из них основан на том, что меченные (флуоресцентными красителями или радиоактивными изотопами) водорастворимые реагенты не способны проникать через мембрану и поэтому ковалентно связываются со специфическими группами только на ее наружной стороне. После этого мембраны растворяют, белки разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле, а меченые белки идентифицируют либо по радиоактивности (радиоавтография гелей), либо по флуоресценции в ультрафиолетовом свете. Используя такое направленное мечение, можно определить, как конкретный белок (полоса в геле) ориентирован в мембране: если он метится одновременно и на внешней стороне (вместе с нативными клетками и тенями без разрывов), и на цитоплазматической стороне (вместе с замкнутыми вывернутыми наизнанку пузырьками), то это, несомненно, трансмембранный белок.

Альтернативный подход состоит в обработке либо наружной, либо внутренней поверхности мембраны не проникающими через нее протеолитическими ферментами: если какой- Рис. 6-20. Схема, показывающая, что при удалении детергента из солюбилизированных с его помощью мембранных белков, почти не защищенные от контактов с водой гидрофобные участки на поверхности белков стремятся взаимодействовать друг с другом, в результате чего образуются большие агрегаты белков, осаждающиеся из раствора.

Рис. 6-21. Солюбилизация, очистка и реконструкция функциональных молекул (Na+ + К+ )-АТРазы в фосфолипидных пузырьках (Na+ + К+ )-АТРаза - это анионный насос, присутствующий в плазматических мембранах большинства животных клеток. Он использует энергию гидролиза АТР для перекачки ионов Na+ из клетки, а К+ внутрь клетки. Реконструкция проводится в присутствии высоких концентраций Na+ и АТР, так как АТРаза функционирует в качестве насоса только при достаточной концентрации этих веществ внутри пузырьков. Детергент удаляется продолжительным диализом или с помощью хроматографии.

Рис. 6-22. Микрофотография эритроцитов человека, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа. Клетки имеют двояковогнутую форму и не содержат ядер. (С любезного разрешения Barnadette Chialley.) Рис. 6-23. Получение теней эритроцитов с разрывами и без разрывов, а также замкнутых пузырьков с правильной ориентацией бислоя и вывернутых наизнанку. Показано, что эритроциты разрываются только в одном месте, давая тени с единственным отверстием. Маленькие пузырьки получаются при механическом разрушении теней. Ориентация мембран в пузырьках определяется ионными условиями во время процедуры разрушения.

Рис. 6-24. Картина, полученная при электрофорезе белков, входящих в состав мембраны эритроцитов человека, в присутствии ДСН. Окрашивание проводилось кумасси синим (А). Положение в геле некоторых белков (Б);

полоса, соответствующая гликофорину, выделена цветом для облегчения её идентификации вблизи полосы 3. Другие полосы в геле на рисунке опущены. Многочисленные углеводные остатки в гликофорине замедляют движение молекул этого белка настолько, что они движутся почти так же, как значительно более крупные молекулы полосы 3. (С любезного разрешения Ted Steck.) либо белок частично расщепляется в обоих случаях, то он должен быть трансмембранным. Кроме того, с помощью меченых антител можно определить, на какой стороне мембраны находится специфическая часть трансмембранного белка.

При изучении белков плазматической мембраны эритроцитов человека методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН удается идентифицировать около 15 главных белков с молекулярной массой от 15000 до 250000. Три из них - спектрин, гликофорин и так называемая полоса 3- составляют в сумме более 60% (по весу) всех мембранных белков (рис. 6-24). Все три белка связываются с мембраной по-разному.

Поэтому мы рассмотрим данные белки в качестве примеров трех главных способов ассоциации белков с мембранами.

6- 6.2.4. Спектрин - белок цитоскелета, нековалентно связанный с цитоплазматической стороной мембраны эритроцитов [11] Большинство мембранных белков эритроцитов человека - это периферические мембранные белки, ассоциированные с бислоем на его плазматической стороне. Самый распространенный из таких белков спектрин представляет собой длинную, тонкую, гибкую «палочку» длиной около 100 нм. Его масса составляет около 25% массы мембранных белков, что соответствует 2,5 х 105 копий на клетку. Спектрин является важным компонентом белковой сети (цитоскелета), поддерживающей структурную целостность и двояковогнутую форму эритроцитов (см. рис. 6-22).

Если цитоскелет экстрагировать из теней эритроцитов растворами с низкой ионной силой, мембрана фрагментируется на мелкие пузырьки.

Рис. 6-25. Молекулы спектрина из эритроцитов человека. А. Схематическое изображение. Б. Электронная микрофотография. Каждый гетеродимер состоит из двух антипараллельных слегка перекрученных друг с другом, гибких полипептидных цепей, которые нековалентно взаимодействуют во множестве точек, включая оба конца. Фосфорилированная «головка» - место, где объединяются два димера, образуя тетрамер, расположена слева.

Каждая из а и (3 цепей состоит из большого числа повторяющихся доменов, длиной 106 аминокислотных остатков. Предполагают, что каждый домен организован группой из трех -спиралей (не показано), связанных нерегулярными перетяжками. На (Б) показаны спектриновые молекулы, оттененные платиной. (A-D. W. Speicher и V.Т. Marcher, Nature 311, 177-180;

Б - с любезного разрешения D. М. Shotten et al., J. Моl. Biol., 131, 303 329, 1979. Academic Press Inc. (London) Ltd.) Молекула спектрина состоит из двух больших полипептидных цепей:

-спектрина (около 240 000 дальтон) и -спектрина (около 220 даль-тон). По-видимому, каждая цепь должна быть построена из множества -спиральных сегментов, объединенных в группы по три и связанных между собой неспиральными участками (рис. 6-25). Такие спектриновые гетеродимеры самопроизвольно агрегируют (голова к голове), образуя тетрамеры длиной 200 нм. Концы пяти или шести тетрамеров соединяются между собой, связываясь с короткими активными филаментами и с другим белком (полосой 4.1), в так называемый «узловой комплекс». Таким образом, образуется гибкая сетеподобная структура на цитоплазматической поверхности мембраны (рис. 6-26). Именно цитоскелет, в основу которого входит спектрин, позволяет эритроцитам противостоять давлению на мембрану при прохождении через узкие капилляры. У анемичных мышей и людей с наследственной аномалией спектрина эритроциты имеют сферическую (а не двояковогнутую) форму и повышенную хрупкость. Степень тяжести анемии прямо пропорциональна степени недостаточности спектрина.

При связывании радиоактивно меченного спектрина с мембранами эритроцитов, из которых предварительно был удален спектрин и некоторые другие периферические белки, удалось идентифицировать белок, ответственный за соединение спектринового цитоскелета с плазматической мембраной. Крупный внутриклеточный белок был назван анкирином. Он связывал как -спектрин, так и цитоплазматический домен трансмембранного белка полосы 3 (см. рис. 6-26). Соединяя белок полосы 3 со спектрином, анкирин связывал сеть, образуемую спектрином, с мембраной. При этом сильно уменьшалась скорость диффузии молекул белка полосы 3 в липидном бислое. Однако цитоскелет на основе спектрина может соединяться с мембраной и по другому механизму. Было показано, что цитоскелетный белок полосы 4.1 (который Рис. 6-26. Схематическое изображение (А) и электронная микрофотография (Б) цитоскелета (на основе спектрина) на цитоплазматической поверхности мембраны эритроцитов человека. Структура, представленная на (А), вытекает главным образом из исследований взаимодействия очищенных белков in vitro. Спектриновые димеры ассоциируют «голова к голове», образуя тетрамеры, которые объединяются с помощью коротких актиновых филаментов (содержащих 15 мономеров) и белка полосы 4.1 (а два или три других белка не показаны), в результате чего образуется сеть.

Эта цитоскелетная сеть связана с мембраной благодаря взаимодействию спектриновых тетрамеров с молекулами белка полосы 3, но не прямо, а через молекулы анкирина. Она может также связываться с мембраной при взаимодействии белка полосы 4.1 с молекулами гликофорина (не показано). Электронная микрофотография демонстрирует эритроциты после фиксации и негативного контрастирования. Спектриновая сеть была специально растянута, для того чтобы были видны отдельные детали структуры;

в нормальной клетке такая сеть занимает лишь 1/10 изображенной площади. (С любезного разрешения Т. Byers и D. Branton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6153-6157, 1985.) связывает спектрин и актин) соединяется с цитоплазматическим доменом гликофорина, другого трансмембранного белка эритроцитов.

Аналогичные, но гораздо более совершенные и сложные цитоскелетные сети лежат в основе плазматических мембран ядерных клеток.

Такие сети, состоящие из кортикальных областей (или кортексов) цитоплазмы, содержат множество актиновых филаментов, которые, по видимому, соединены с плазматическими мембранами несколькими различными способами. В кортексе обнаружены белки, структурно гомологичные спектрину, анкирину и белку полосы 4.1, но их организация и функции до сих пор не поняты.

6.2.5. Гликофорин пронизывает липидный бислой в виде одиночной -спирали [11] Гликофорин - это один из двух главных белков, выступающих не внешней поверхности эритроцитов человека. Он оказался первым мембранным белком, для которого была определена полная аминокислотная последовательность. Гликофорин представляет собой небольшой трансмембранный гликопротеин (131 аминокислотный остаток). Большая часть массы этого белка находится на наружной поверхности мембраны, где локализован и его гидрофильный N-концевой участок. С этой областью белковой молекулы связаны 15 отдельных олигосахаридных боковых цепей, в которых в сумме содержится около 100 сахарных остатков, что составляет примерно 60% массы молекулы гликопротеина.

Фактически подавляющую часть углеводов клеточной поверхности (включая более 90% сиаловой кислоты) и, следовательно, большую часть всех отрицательных зарядов клеточной поверхности несут на себе молекулы гликофорина. Гидрофильные С-концевые хвосты этих молекул погружены в цитозоль, а гидрофобный -спиральный участок, насчитывающий приблизительно 20 аминокислотных остатков, пронизывает липидный бислой.

Несмотря на то что в клетках содержится много молекул гликофорина (более 6 х 105), их функция остается неизвестной. Более того, люди, в эритроцитах которых отсутствует большинство этих молекул, производят впечатление совершенно здоровых. Гликофорин обнаружен только в эритроцитах, однако в структурном отношении его можно отнести к общему классу мембранных гликопротеинов, пронизывающих липидный бислой в виде одиночной -спирали (см. пример 1 на рис. 6-14 и рис. 6-16). Различные рецепторы на поверхности клеток принадлежат именно к этому классу белков.

6- 6.2.6. Полоса 3 из мембраны эритроцитов человека представляет собой белок, транспортирующий анионы [13] О белке полосы 3 известно (в отличие от гликофорина), что он играет важную роль в функционировании клетки. Этот белок называется полосой 3, поскольку при электрофорезе в ПААГ в присутствии ДСН он занимает соответствующее положение относительно других белков (см.

рис. 6-24). Как и гликофорин, полоса 3 является трансмембранным белком. Однако в отличие от него этот белок имеет глобулярную конформацию, а его полипептидная цепь (длиной около 930 аминокислотных остатков) пересекает бислой по крайней мере 10 раз. Каждый эритроцит содержит около 106 молекул белка полосы 3, которые, по-видимому, образуют в мембране димеры и, возможно, тетрамеры.

Основная функция эритроцитов, как известно, заключается в переносе О2 из легких ко всем тканям и СО2 из тканей к легким. Белок полосы 3 принимает участие в этом обмене. Находясь в легких, эритроциты избавляются от СО2, аккумулированного в тканях, путем замены ионов НСО3- на С1-. В мембране есть специальный анионный транспортный белок для осуществления данного процесса. Газообмен можно заблокировать специфическим ингибитором, связывающимся с транспортным белком. При использовании ингибиторов, меченных радиоактивными изотопами, этот анионный транспортный белок был идентифицирован. Им оказался белок полосы 3. Совсем недавно процесс анионного транспорта был реконструирован in vitro с использованием очищенного белка полосы 3, встроенного в фосфолипидные пузырьки. Очень похожие анионные транспортные белки были обнаружены и во многих других ядерных клетках, где они помогают контролировать внутриклеточный рН.

Белок полосы 3 можно зарегистрировать в виде внутримембранных частиц с помощью электронной микроскопии в сочетании с замораживанием - скалыванием. В этом случае клетки замораживают в жидком азоте и полученный кусочек льда раскалывают острым ножом.

Плоскость скола обычно проходит через гидрофобную сердцевину мембранного бислоя, разделяя его на два монослоя. Затем на образовавшиеся поверхности напыляют платину и рассматривают платиновые реплики Рис. 6-27. Схема, показывающая, как с помощью электронной микроскопии образцов, приготовленных методом замораживания - скалывания, можно получить изображения внутренней гидрофобной поверхности цитоплазматической (или протоплазматической) половины бислоя (называемой Р-поверхностью) и наружной половины бислоя (называемой Е-поверхностью). После показанного здесь процесса скалывания открытые поверхности сколов оттеняют платиной и углеродом, органические вещества удаляют, а полученную платиновую реплику рассматривают в электронный микроскоп (см. также рис. 4-23).

Рис. 6-28. Электронная микрофотография скола эритроцитов человека. Обратите внимание, что плотность внутримембранных частиц на цитоплазматической (Р) поверхности выше, чем на наружной (Е). (С любезного разрешения L. Engstrom и D. Branton.) в электронный микроскоп. С помощью этой методики открываются (рис. 6-27) две различные гидрофобные внутренние поверхности:

цитоплазматической (или протоплазматической) половины бислоя (Р-поверхность) и внешней половины бислоя (Е-поверхность, от англ. external).

Мембраны человеческих эритроцитов в таких препаратах выглядят усеянными относительно гомогенными по размеру (7.5 нм в диаметре) внутримембранными частицами. Как оказалось, их больше на Р-поверхности, чем на Е-поверхности (рис. 6-28). По-видимому, это главным образом белки полосы 3, поскольку такие же частицы обнаружены при скалывании синтетических липидных бислоев, реконструированных вместе с белком полосы 3. Рис. 6-29 убеждает нас в том, что именно молекулы белка полосы 3, а не молекулы гликофорина, видны на электронных микрофотографиях мембран эритроцитов, полученных с помощью метода замораживания - скалывания. Ведь нетрудно себе представить, каким образом трансмембранный белок, такой, например, как белок полосы 3, основная масса которого расположена в пределах липидного бислоя, может осуществлять пассивный транспорт полярных молекул через неполярный бислой. Ясно, что белок полосы 3 (или его Рис. 6-29. Схема, показывающая, что может произойти с молекулами гликофорина и белка полосы 3 в мембранах эритроцитов человека во время процедуры замораживания - скалывания. При расщеплении липидного бислоя из замороженного монослоя выдергивается либо внутренняя, либо внешняя половина трансмембранного белка. Преимущественно белки остаются на той половине, с которой ассоциирована более крупная часть белковой молекулы. Поэтому молекулы белка полосы 3 обычно остаются на внутренней (Р) поверхности скола. Поскольку при этом над поверхностью скола экспонирована достаточно большая часть белка, они видны на микрофотографиях в виде внутримембранных частиц.

Молекулы гликофорина обычно остаются на внешней (Е) поверхности скола, но их экспонированных цитоплазматических хвостов не хватает для того, чтобы создать изображение каких-либо четко различимых частиц.

димер либо тетрамер) способен обеспечить трансмембранный гидрофильный проход, по которому ионы С- и HCO3- переносятся без контакта с гидрофобным окружением липидного бислоя (см. рис. 6-43, А). Маловероятно, что подобный транспорт может осуществлять молекула гликофорина, пронизывающая бислой в виде простой -спирали. Для того чтобы понять механизм функционирования мембранных транспортных белков, необходима точная информация об их трехмерной структуре в составе бислоя. Первым транспортным белком, для которого подобные детали стали известны, оказался бактериородопсин - белок, работающий как фотоактивируемый протонный (Н+ ) насос в плазматической мембране некоторых бактерий. Структура бактериородопсина аналогична структуре других мембранных белков. Этот белок заслуживает того, чтобы остановится на нем поподробнее.

6.2.7. Бактериородопсин - это протонный насос, пронизывающий бислой в виде семи -спиралей [14] «Пурпурная мембрана» бактерий Holobacterium halobium - это четко очерченный участок (пятно) неправильной формы на плазматической мембране (рис. 6-30), которая содержит молекулы одного белка - бактериородопсина, В каждой молекуле имеется одна поглощающая свет простетическая группа, или хромофор (называемый ретиналем), родственная витамину А и идентичная хромофору, обнаруженному в родопсине палочек сетчатки глаза у позвоночных (см. разд. 19.6.6). Ретиналь ковалентно связан с боковой цепью лизина в белке.

При активации одним квантом света возбужденный хромофор вызывает конформационные изменения в белке, в результате чего два протона переносятся с внутренней поверхности клетки на наружную. Вследствие такого переноса в клетке создается градиент концентрации протонов и градиент электрического потенциала, которые в свою очередь обусловливают синтез АТР с помощью второго белка клеточной плазматической мембраны.

Молекулы родопсина образуют в клеточной мембране плоскую кристаллическую решетку, подобную двумерному кристаллу. Сочетание методов электронной микроскопии низкой интенсивности и малоуглового рассеяния электронов позволило определить трехмерную структуру белка и его ориентацию в мембране с разрешением 0,7 нм. Последний метод аналогичен рентгеноструктурному анализу, который используется для получения трехмерных кристаллов растворимых белков. Изучение бактериородопсина показало, что его молекула состоит из семи -спиралей (каждая из которых содержит около 25 аминокислотных остатков), плотно упакованных друг с другом (рис. 6-31). Эти спирали пересекают линейный бислой примерно под прямым углом к плоскости мембраны. Весьма возможно, что протоны проходят через мембрану при участии хромофора по сопряженной системе боковых цепей -спиралей, однако детальные механизмы этого процесса еще неизвестны.

Бактериородопсин относится к семейству мембранных белков, обладающих сходной структурой, но различными функциями. Например, рецептор света - белок родопсин - в палочках сетчатки глаза позвоночных и некоторые другие белки-рецепторы клеточной поверхности, связывающие специфические гормоны, также уложены в виде семи трансмембранных -спиралей. Эти белки функционируют скорее как переносчики сигнала, чем как транспортные белки, поскольку каждый из них в ответ на внешний сигнал активирует другой белок плазматической мембраны, который генерирует химический сигнал в цитозоле.

Для полного понимания механизмов функционирования бактериородопсина необходимо определить точное положение всех его атомов Рис. 6-30. Схематическое изображение бактерии Halobacterium halobiит, показывающее пятна пурпурной мембраны, содержащей молекулы бактериородопсина. У этих бактерий, живущих в солнечных озерах и получающих много солнечного света, в процессе эволюции появились разнообразные белки, активируемые светом, в том числе и бактериородопсин - фотоактивируемый протонный насос плазматической мембраны.

Рис. 6-31. Структура молекулы родопсина и ее расположение в липидном бислое. Полипептидная цепь пересекает бислой в виде семи -спиралей.

(По данным R. Henderson и R.N.T. Onwin, Nature, 257, 28-32, 1975.) методами рентгеноструктурного анализа кристаллов белка. Однако из-за амфипатической природы мембранных белков их чрезвычайно трудно кристаллизовать. Это удалось сделать лишь в 1985 году при изучении фотосинтезирующего реакционного центра у бактерий методами рентгеноструктурного анализа. Впервые было показано, как множество полипептидов могут ассоциировать в мембране, образуя сложную белковую машину.

6.2.8. Четыре различных полипептидных цепи в мембраносвязанном комплексе образуют фотосинтезирующий реакционный центр у бактерий [15] В гл. 3 шла речь о том, что различные полипептиды ассоциируют, образуя большие мультиферментные комплексы, которые с высокой эффективностью катализируют сложные реакции благодаря кооперативной работе субъединиц. Аналогичные комплексы белков обнаружены и в мембранах. Наиболее изучен среди них бактериальный фотосинтезирующий реакционный центр. Этот белковый комплекс находится в плазматической мембране пурпурных фотосинтезирующих бактерий Rhodopseudomonas viridis. Он использует поглощенную энергию света для создания электрона с высокой энергией, позволяющей ему пересекать мембрану быстрее чем за наносекунду. Затем электрон переходит к другим переносчикам электронов, находящимся в мембране, которые используют часть энергии, высвобождаемой в процессе электронного транспорта для синтеза АТР в цитозоле. Реакционный центр построен из четырех различных полипептидов: L, М, Н и цитохрома. Для изучения трехмерной пространственной структуры этот комплекс был солюбилизирован в растворе детергента, закристаллизован в виде комплекса белков с детергентом и изучен методом рентгеноструктурного анализа. Как оказалось, реакционный центр содержит четыре молекулы хлорофилла и восемь других коферментов, переносящих электроны. В гл. 7 мы будем говорить о том, что для понимания фотосинтеза очень важным оказалось установление точного положения каждого из коферментов в комплексе. Не менее значимым (в большой степени относящимся к теме данной главы) событием стало выяснение организации четырех белковых субъединиц в трансмембранном комплексе. Субъединицы L и М гомологичны и состоят каждая из пяти -спиралей, пронизывающих липидный бислой плазматической мембраны (рис. 6-32). Эти две субъединицы образуют гетеродимер, представляющий собой ядро реак- Рис. 6-32. Структура фотосинтезирующего реакционного центра бактерий Rhodopseudomonas viridis по данным рентгеноструктурного анализа кристаллов трансмембранного белкового комплекса. Белковый комплекс состоит из четырех субъединиц: L, М, Н и цитохрома. Субъединицы L и М образуют ядро реакционного центра. Каждая из субъединиц L и М содержит по 5 -спиралей, пересекающих бислой. Положение коферментов переносчиков электронов показано цветом. (Изображено J. Richardson по работе Deisenhafer et al. Nature. 318, 618-624, 1985.) ционного центра: 10 его -спиралей окружают переносчиков электрона. Субъединица Н имеет лишь одну трансмембранную -спираль, а остальная часть полипептидной цепи уложена в виде глобулярного домена, находящегося на цитоплазматической стороне мембраны, где он связан с L-М гетеродимером. Цитохром представляет собой периферический мембранный белок, связанный с гетеродимером L-H на внешней стороне мембраны (см. рис. 6-32).

Две «дополнительных» субъединицы (Н и цитохром) сильно увеличивают эффективность фотосинтетической реакции, катализируемой, в общем-то, гетеродимером L-М: цитохром снабжает гетеродимер электронами, а субъединица Н предположительно объединяет реакционный центр со множеством белков. Гетеродимер L-М эволюционно оказался очень консервативным белком, по-видимому, пара тесно связанных между собой белков образует ядро одного из фотосинтезирующих реакционных центров в зеленых растениях.

6- 6.2.9. Многие мембранные белки диффундируют в плоскости мембраны [16] Мембранные белки так же, как и мембранные липиды, не могут перескакивать с одной стороны бислоя на другую (такой перескок носит Рис. 6-33. Схема эксперимента, демонстрирующего перемешивание белков плазматической мембраны в клеточных гибридах мышь-человек. Белки мыши и человека первоначально располагаются на своих собственных половинах новообразованной плазматической мембраны гетерокариона, но со временем перемешиваются. Для визуализации белков использовали два вида антител, меченных разными лигандами. (В флуоресцентном микроскопе флуоресцеин имеет зеленый цвет, а родамин - красный.) (По данным L. D. Frye и М. Edidin, J. Cell. Sci., 7, 319-335, 1970, с разрешения The Company of Biologists.) название флип-флоп), но они способны вращаться вокруг оси, перпендикулярной плоскости бислоя (вращательная диффузия). К тому же многие мембранные белки могут перемещаться в плоскости мембраны (латеральная диффузия). То, что некоторые белки плазматической мембраны способны передвигаться в плоскости бислоя, было впервые прямо показано в 1970 г. с помощью экспериментов на гибридных клетках (гетерокарионах), полученных искусственным путем в результате слияния клеток мыши и человека. Для того чтобы различить белки плазматических мембран мыши и человека, были использованы две группы меченых антител. Первоначально мышиные и человеческие белки располагались только в своих областях гетерокариона. Однако примерно за полчаса оба набора белков диффундировали и распространялись по всей поверхности клетки (рис. 6-33). Еще более убедительные доказательства подвижности мембранных белков были получены благодаря открытию процесса, названного пэтчингом (см. разд. 6.5.13). Суть этого феномена заключается в следующем. Если белки клеточной поверхности «сшить» с помощью антител, они собираются в большие кластеры, образуя на поверхности клетки дискретные зоны неправильной формы (пэтчи, от англ. patch). Однако, чтобы антитела могли «сшить» мембранные белки в большие комплексы, эти белки должны свободно перемещаться в плоскости бислоя.

Скорость латеральной диффузии можно измерить с помощью метода восстановления флуоресценции после ее угашения светом (FRAP, от англ. fluorescence recovery after photobleaching.) Впервые этот метод использовали для измерения скорости диффузии индивидуальных молекул родопсина в мембранах дисков, присутствующих в палочках сетчатки глаза у позвоночных. Как мы уже говорили, родопсин имеет структуру, сходную со структурой бактериородопсина и содержит такую же хромофорную группу-ретиналь. Диффузия молекул родопсина может быть измерена следующим образом. В молекулах родопсина, находящихся на одной стороне палочки, с помощью хорошо сфокусированного луча света большой интенсивности обесцвечивают хромофор, а затем измеряют время, в течение которого обесцвеченные молекулы перемешиваются с необесцвеченными за счет диффузии (рис. 6-34), Скорость диффузии (или коэффициент диффузии, D) оказалась равной примерно 5 х 10-9 см2 с-1.

Это в 2 раза меньше коэффициента диффузии в мембране молекул фосфолипидов (см. разд. 6.1.2) и одновременно - наибольший коэффициент среди всех известных мембранных белков.

Эту же технику использовали для изучения мембранных белков, не содержащих хромофоров. Вначале к таким белкам присоединяли флуоресцентные лиганды. Обычно для этой цели брали флуоресцентно меченные моновалентные антитела (т. е. фрагменты антител с одним участком связывания антигена и, следовательно, неспособных к сшиванию соседних молекул). Затем эти привязанные лиганды обесцвечивали лазерным лучом, после чего измеряли время, необходимое для того, чтобы мембранные белки, несущие необесцвеченные антитела, переместились путем диффузии в обесцвеченную область (рис. 6-35). Измеренные таким образом скорости диффузии различных гликопротеинов плазматической мембраны обычно оказывались по крайней мере в 5-50 раз меньше, чем у молекул родопсина. Относительно низкие скорости диффузии не являются свойством, внутренне присущим индивидуаль- Рис. 6-34. Измерение скорости латеральной диффузии молекул родопсина в мембранах дисков палочки сетчатки. Хромофоры родопсиновых молекул обесцвечиваются на одной стороне клетки;

затем измеряется скорость, с которой обесцвеченные и необесцвеченные молекулы родопсина перемешиваются при диффузии. (По данным М. Роо и R.A. Cone, Nature, 247, 438-441, 1974.) Рис. 6-35. Измерение скорости латеральной диффузии гликопротеина плазматической мембраны. А. Специфический гликопротеин метят флуоресцирующим моновалентным антителом, связывающим только этот белок. После обесцвечивания антител лазерным лучом малого сечения измеряют восстановление интенсивности флуоресценции за счет диффузии обесцвеченных молекул из, а необесцвеченных в область облучения. Б.

График, показывающий скорость восстановления флуоресценции. Чем больше коэффициент диффузии мембранного гликопротеина, тем быстрее происходит восстановление.

ным молекулам гликопротеинов, поскольку эти же молекулы гликопротеинов в реконструированных синтетических бислоях диффундируют гораздо быстрее. Истинная причина низких скоростей диффузии при измерении методом FRAP для гликопротеинов плазматической мембраны остается неясной. Одно из возможных объяснений заключается в том, что объемные полисахаридные цепи внеклеточных доменов этих молекул взаимодействуют с цепями олигосахаридов других мембранных гликопротеинов, обусловливая медленную диффузию. По крайней мере в некоторых случаях удаление углеводных цепей сильно увеличивало скорость диффузии белков.

6.2.10. Клетки могут объединять белки и липиды в специфические домены на мембране [17] Значительным шагом вперед в понимании структуры и функции мембран следует считать осознание того, что биологические мембраны - это двумерные жидкости. Однако ясно, что представление о мембране как о липидном море, в котором свободно плавают белки, оказалось сильно упрощенным. Многие клетки обладают способностью удерживать мембранные белки в специфических доменах в непрерывном липидном бислое.

Например, в эпителиальных клетках, выстилающих кишечник или почечные канальцы, некоторые ферменты плазматической мембраны и транспортные белки располагаются только на апикальной поверхности клеток, тогда как другие - только на базальной и латеральной (рис. 6-36).

Такое асимметричное распределение мембранных белков существенно для функционирования эпителия (мы обсудим это позже, см. разд. 6.4.11).

Липидный состав этих двух мембранных доменов также различен, что указывает на то, что эпителиальные клетки могут ограничивать диффузию между доменами как молекул белка, так и молекул липидов (хотя эксперименты с мечеными молекулами липидов наводят на мысль, что это справедливо лишь для липидных молекул внешнего монослоя мембраны). Такое пространственное разделение белков и липидов, по-видимому, поддерживается (по крайней мере частично) благо- Рис. 6-36. Схематическое изображение клетки эпителия, показывающее, каким образом может ограничиваться область распределения различных белков в плазматической мембране. Белки А (в апикальной мембране) и В (в базальной и латеральной мембранах) способны латерально диффундировать только в пределах соответствующих областей мембраны, а проникнуть в другие участки им мешают, вероятно, специализированные клеточные контакты, называемые плотными контактами. Липидные молекулы внешнего (нецитоплазматического) монослоя плазматической мембраны также не могут диффундировать между двумя доменами, а липиды внутреннего (цитоплазматического) монослоя могут это делать.

Рис. 6-37. Три домена плазматической мембраны сперматозоида морской свинки, выявляемые с помощью моноклональных антител. Сперматозоид показан схематически в верхней части рисунка. На каждой из трех микрофотографий (А, Б и В) иммунофлуоресцентное окрашивание клеточной поверхности различными моноклональными антителами сочетается с фазово-контрастным изображением тех же клеток. Антитела на (А) метят только верхнюю часть головки, на (Б) - только нижнюю часть головки, а на (В) - только хвост. (А и Б предоставлены D. G. Myles et al., Cell, 23, 434 439, 1981. В-предоставлена P. Primakoff и D. G. Myles, Dev. Biol., 98, 417-428, 1983.) даря барьерам, образованным межклеточными контактами особого рода - плотными контактами (см. разд. 14.1.1). Вопрос о том, почему мембранные белки, формирующие межклеточные контакты, не перемещаются латерально во взаимодействующих мембранах (см. рис. 6-38, 5), обсуждается ниже.

Мембранные домены могут поддерживаться клеткой и без межклеточных контактов. К примеру, сперматозоид животных - это отдельная клетка, состоящая из двух структурно и функционально различных частей - головки и хвоста, покрытых непрерывной плазматической мембраной.

При исследовании клеток спермы методом иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием различных антител к антигенам поверхности клетки обнаружили, что плазматическая мембрана состоит по крайней мере из трех различных доменов (рис. 6-37). В некоторых случаях антигены могут диффундировать внутри собственных обособленных доменов. Однако остается непонятным механизм того, каким образом поддерживается обособленность этих доменов.

В двух рассмотренных примерах диффузия белков и липидов ограничивалась специализированными доменами, расположенными на непрерывной плазматической мембране. У клеток есть и более сильные способы иммобилизации определенных мембранных белков. Это хорошо видно на примере пурпурных мембран Halobacterium. В данном случае молекулы бактериородопсина собраны в большие двумерные кристаллы, в которых отдельные белковые молекулы фиксированы по отношению друг к другу. Крупные агрегаты такого типа диффундируют очень медленно.

В более общем случае ограничение латеральной подвижности специфических мембранных белков связано с их взаимодействием с макромолекулярными образованиями, находящимися снаружи или внутри клеток. Мы уже говорили о том, что некоторые мембранные белки эритроцитов тесно связаны с внутренним цитоскелетом. В клетках других типов белки плазматической мембраны могут быть также связаны с цитоскелетом или внеклеточным матриксом, либо и с тем и с другим. Четыре известных способа иммобилизации специфических мембранных белков показаны на рис. 6-38.

Заключение Липидный бислой определяет основные структурные особенности биологических мембран, тогда как белки ответственны за большинство мембранных функций. Они выступают в качестве специфических рецепторов и ферментов, осуществляют транспорт через мембрану различных веществ и т. д. Большинство мембранных белков пронизывает бислой в виде одиночной -спирали;

но есть и такие, которые пересекают бислой несколько раз в виде серии -спиралей. Следующая группа белков ассоциирует с мембраной, не пересекая бислой, а прикрепляясь к той или другой стороне мембраны. Многие из этих белков связаны нековалентными взаимодействиями с трансмембранными белками, есть и такие, которые Рис. 6-38. Четыре способа ограничения латеральной подвижности белков плазматической мембраны. Белки могут ассоциировать в большие комплексы (как молекулы бактериородопсина в пурпурной мембране Halobacterium) (А), могут связываться с комплексами макромолекул снаружи (Б) или внутри клетки (В) или взаимодействовать с белками на поверхности другой клетки (Г).

имеют ковалентную связь с молекулами липидов. Большинство мембранных белков, так же как и липидов, способны свободно перемещаться в плоскости мембраны. С другой стороны, клетки могут и иммобилизовывать специфические мембранные белки, и удерживать их, как впрочем и липиды, в виде специальных доменов в непрерывном липидном бислое.

6.3. Мембранные углеводы На поверхности всех эукариотических клеток имеются углеводы. Они представлены в виде олигосахаридных и полисахаридных цепей, ковалентно присоединенных к мембранным белкам (гликопротеины) и к липидам (гликолипиды). Масса углеводов плазматической мембраны колеблется от 2 до 10% от массы мембраны. Большинство белков плазматической мембраны, выступающих на поверхности клеток, связаны с остатками Сахаров. В то же время из десяти липидных молекул в наружном монослое большинства плазматических мембран с углеводами связана менее чем одна молекула (см. разд. 6.1.6). Пятидесятикратное превышение в мембране числа липидных молекул над молекулами белка означает, что липидных молекул, связанных с углеводами в обычной (типичной) мембране больше, чем белковых. Однако такой гликопротеин как гликофорин может иметь большое количество боковых олигосахаридных цепей, а каждая молекула гликолипида - лишь одну. Кроме того, многие плазматические мембраны содержат молекулы интегральных протеогликанов. Протеогликаны состоят из длинных полисахаридных цепей, присоединенных к белковому кору, и выявляются главным образом на внешней стороне клетки как часть внеклеточного матрикса. Однако в некоторых случаях кор интегральных протеогликанов, по-видимому, пронизывает липидный бислой.

6- 6.3.1. Углеводы в биологических мембранах располагаются только на поверхности, не контактирующей с цитозолем [18] Как мы уже знаем, биологические мембраны чрезвычайно асимметричны: наружный и внутренний монослои различаются как по липидному составу, так и по белковому. Такая же асимметрия наблюдается и в распределении углеводов;

углеводные цепи основной массы гликолипидов, гликопротеинов и протеогликанов во внутренних и плазматических мембранах локализованы исключительно на той стороне мембраны, которая не контактирует с цитозолем. В плазматических мембранах остатки Сахаров выступают на внешнюю поверхность клетки, а во внутренних мембранах они обращены внутрь ограниченного мембраной компартмента. Существуют два различных варианта присоединения олигосахаридов к мембранным гликопротеинам: они могут быть «пришиты» N-связью к остаткам аспарагина в полипептидной цепи или О-связью к остаткам серина или треонина. N-связанные олигосахариды обычно содержат около 12 Сахаров и строятся на основе общего ядра, состоящего из остатков маннозы. О-связанные олигосахариды, как правило, короче (длиной около 4 сахарных остатков).

Одним из простейших способов демонстрации присутствия Сахаров на клеточной поверхности является использование белков, связывающих углеводы, и названных лектинами. Существует ряд белков, обладающих сайтами, узнающими и связывающими специфические последовательности сахарных остатков. Первоначально они были выделены из семян Таблица 6-2. Наиболее популярные коммерческие препараты растительных лектинов и сахара, которые ими узнаются Лектины Сахароспецифичность Конканавалин А -D-глюкоза и -D-манноза Лектин из сои -галактоза и N-ацетил-D-галактозамин Лектин из зародышей пшеницы N-ацетилглюкозамин Лектин из семян лотоса Фукоза растений. Некоторые лектины чрезвычайно токсичны и служат для отпугивания животных, которые могли бы съесть семена. Совсем недавно было показано, что лектины имеются не только у растений, но и у многих других существ, включая животных. Некоторые из них находятся на поверхности клеток, и, по-видимому, участвуют в межклеточном узнавании (см. рис. 5-42). Поскольку лектины связываются с гликопротеинами, протеогликанами и гликолипидами, находящимися на поверхности клеток, они широко используются в клеточной биологии в качестве биохимического маркера для локализации и выделения молекул плазматической мембраны, содержащих сахара. В таблице 6-2 представлены наиболее часто используемые растительные лектины и указана их специфичность по отношению к сахарам.

Термин клеточная оболочка, или гликокаликс, часто используются для обозначения обогащенной углеводами периферической зоны на Рис. 6-39. Электронная микрофотография поверхности лимфоцита, окрашенного рутениевым красным с целью получить контрастное изображение клеточной оболочки (гликокаликса). (С любезного разрешения А. М. Glauer и G. М. W. Cook.) Рис. 6-40. Схематическое изображение клеточной оболочки (гликокаликса), состоящей из боковых олигосахаридных цепей гликолипидов и интегральных мембранных гликопротеинов и полисахаридных цепей протеогликанов. В некоторых клетках присутствуют также адсорбированные гликопротеины и протеогликаны (не показаны). Обратите внимание, что все углеводы располагаются на наружной стороне мембраны. Некоторые интегральные гликопротеины и протеогликаны могут быть ковалентно связаны через специфические олигосахариды с фосфатидилинозитолом, находящимся во внешнем монослое плазматической мембраны (см. рис. 6-14.) поверхности большинства эукариотических клеток. При использовании меченых лектинов или различных красителей, например рутениевого красного, эта зона отчетливо видна на электронных микрофотографиях (рис. 6-39). Хотя углеводы главным образом присоединены к молекулам, входящим в состав плазматической мембраны, гликокаликс может также содержать гликопротеины и протеогликаны, которые секретируются клетками и затем адсорбируются на клеточной поверхности (рис. 6-40). Некоторые из этих адсорбированных макромолекул являются компонентами внеклеточного матрикса. Так что вопрос о том, где кончается плазматическая мембрана и начинается внеклеточный матрикс, можно считать чисто семантическим.

Ясно, что высокая концентрация углеводов на клеточной поверхности должна оказывать существенное влияние на многие функции плазматической мембраны. Однако природа этого влияния еще не понята. Структурная сложность некоторых олигосахаридов, а также то, что углеводы располагаются только на поверхности клетки, свидетельствуют о важной роли углеводов в процессах межклеточного узнавания и узнавания между клеткой и матриксом. Для некоторых случаев существуют веские доказательства этой роли (см. разд. 15.4.2 и 15.4.9), однако гораздо чаще такие функции углеводов клеточной поверхности однозначно доказать очень трудно.

Заключение В плазматических мембранах всех эукариотических клеток большинство белков, расположенных на поверхности клетки, а также некоторые липидные молекулы наружного липидного монослоя ковалентно связаны с олигосахаридными цепями. Некоторые плазматические мембраны содержат молекулы интегральных протеогликанов, в которых несколько полисахаридных цепей ковалентно сшиты с трансмембранным белком или связанным с липидами коровым белком. Хотя функция углеводов клеточной поверхности пока непонятна, представляется вероятным, что по крайней мере некоторые из них принимают участие в процессах межклеточного узнавания и узнавания между клеткой и матриксом.

6.4. Перенос малых молекул через мембрану [19] Поскольку внутренняя часть липидного бислоя гидрофобна, он представляет собой практически непроницаемый барьер для большинства полярных молекул. Благодаря такому барьеру предотвращается утечка водорастворимого содержимого клеток. Однако из-за наличия подобного барьера клетки оказались вынужденными создать специальные пути для переноса водорастворимых молекул через свои мембраны. Клетки должны получать необходимые питательные вещества и выделять вредные продукты метаболизма. Кроме того, клеткам надо регулировать внутриклеточные концентрации ионов, что подразумевает возможность транспорта определенных ионов в клетку или из клетки. Перенос малых водорастворимых молекул через липидный бислой осуществляется с помощью особых трансмембранных белков, каждый из которых отвечает за транспортировку определенной молекулы или группы родственных молекул. В клетках существуют также способы переноса через плазматические мембраны макромолекул, таких, как белки, и даже крупных частиц. Однако соответствующие механизмы сильно отличаются от механизмов транспорта малых молекул и потому будут обсуждаться в другом разделе (см. разд. 6.5).

Из данного раздела мы узнаем, что избирательная проницаемость Таблица 6-3. Сравнение концентраций ионов внутри и снаружи типичной животной клетки Компонент Внутриклеточная концентрация (мМ) Внеклеточная концентрация (мМ) Катионы Na+ 5-15 К+ 140 Mg2+ 0,5 1- Са2+ 10-4 1- Н+ 8 х 10-5 (10-7,1 М или рН 7,1) 4 х 10-5 (10-7,4М или рН 7,4) Анионы 1) Cl- 5-15 1) Поскольку клетки должны содержать равное число положительных и отрицательных зарядов (чтобы быть электрически нейтральными) значительный дефицит внутриклеточных анионов отражает тот факт, что большую часть клеточного содержимого составляют отрицательно заряженные молекулы (НСО3-, РО3-, белки, нуклеиновые кислоты, метаболиты, несущие фосфатные или карбоксильные группы и т.п.).

Концентрации Са2+ и Mg2+ даны для свободных ионов. В клетках имеется около 20 мМ Мд2+ и 1-2 мМ Са2+, но они в основном связаны белками и другими веществами, и в случае Са2+ хранятся внутри различных органелл.

плазматической мембраны в сочетании с активным транспортом через нее создают значительные различия в ионном составе цитозоля и внеклеточной жидкости (табл. 6-3). Это позволяет клеточным мембранам запасать потенциальную энергию в виде градиентов концентраций ионов.

Трансмембранные ионные градиенты используются для осуществления различных транспортных процессов, для передачи электрических сигналов и при синтезе АТР в митохондриях, хлоропластах и бактериях. Перед тем как приступить к обсуждению свойств транспортных белков и ионных градиентов, создаваемых некоторыми из этих белков, необходимо кое-что узнать о проницаемости синтетического липидного бислоя, не содержащего белков.

6.4.1. Липидные бислои, не содержащие белков, непроницаемы для ионов, но свободно пропускают воду [19] В принципе любая молекула за достаточно длительное время пройдет за счет диффузии через лишенный белков липидный бислой по градиенту концентрации. Однако скорости, с которыми различные молекулы диффундируют через такой бислой, очень сильно варьируют в зависимости главным образом от размера молекулы и ее относительной растворимости в жирах. В общем случае, чем меньше молекула и чем более она «жирорастворима» (т. е. более гидрофобна, или неполярна), тем быстрее она будет диффундировать через бислой. Малые неполярные молекулы, такие, как О2, легко растворяются в липидных бислоях и вследствие этого быстро диффундируют через них. Незаряженные полярные молекулы также диффундируют с большой скоростью, если они достаточно малы. Например, СО2 (44 Да), этанол (46 Да) и мочевина (60 Да) проходят через бислой быстро, глицерол (92 Да) - медленнее, а глюкоза (180 Да) едва ли вообще способна пройти сквозь бислой (рис. 6-41). Весьма важно то, что вода (18 Да) диффундирует через липидный бислой очень быстро, несмотря на то что молекулы воды относительно нерастворимы в жирах. Это обусловлено тем, что ее молекулы малы и незаряжены.

Рис. 6-41. Относительная проницаемость синтетического липидного бислоя для различных классов молекул. Чем меньше молекула и, что более важно, чем меньше она образует водородных связей, тем быстрее она диффундирует через мембрану.

Рис. 6-42. Коэффициенты проницаемости (см/с) синтетического липидного бислоя для различных молекул. Скорость потока растворенных молекул через бислой прямо пропорциональна разнице концентраций вещества на двух сторонах мембраны. Умножив разность концентраций (моль/см3) на коэффициент проницаемости (см/с), получают поток растворенного вещества в молях за секунду через квадратный сантиметр мембраны. Например, разность концентраций триптофана 10-4 моль/см3 (10-4/ 10-3 л = 0,1 М) будет обеспечивать поток 10-4 моль/см3 х 10-7 см/с = 10-11 моль/с через 1 см мембраны, или 6 х 104 молекул/с через 1 мкм2 мембраны.

Напротив, для всех заряженных молекул (ионов) независимо от их размеров липидные бислой оказываются в значительной степени непроницаемыми: заряд и высокая степень гидратации таких молекул препятствуют их проникновению через углеводородный участок бислоя. Вот почему искусственные бислой в 109 раз более проницаемы для воды, чем даже для таких небольших ионов, как Na+ или К+ (рис. 6-42).

6- 6.4.2. Мембранные транспортные белки могут работать как переносчики или каналы [19] Клеточные мембраны, так же как и искусственные липидные бислои, способны пропускать воду и неполярные молекулы за счет простой физической диффузии. Однако клеточные мембраны проницаемы и для различных полярных молекул, таких, как сахара, аминокислоты, нуклеотиды и многие другие метаболиты, которые проходят через синтетические бислои чрезвычайно медленно. За перенос подобных растворенных веществ через клеточные мембраны ответственны специфические белки, называемые мембранными транспортными белками. Они обнаруживаются во всех типах биологических мембран и могут сильно отличаться друг от друга. Каждый конкретный белок предназначен для определенного класса молекул (например, неорганических ионов, Сахаров или аминокислот), а нередко лишь какой-то разновидности молекул из этих классов. Специфичность транспортных белков была впервые показана, когда обнаружилось, что мутации в одном-единственном гене приводят к исчезновению у бактерий способности транспортировать определенные сахара через плазматическую мембрану. Аналогичные мутации теперь известны и у людей, страдающих различными наследственными болезнями, при которых нарушается транспорт тех или иных веществ в почках или кишечнике. Например, у индивидуумов с наследственной болезнью цистинурией отсутствует способность транспортировать определенные аминокислоты (включая цистин - связанный дисульфидной связью димер цистеина) из мочи или кишечника в кровь. В результате происходит накопление цистина в моче, что приводит к образованию цистиновых «камней» в почках.

Все мембранные транспортные белки, изученные настолько детально, что их расположение в мембране точно установлено, оказались трансмембранными белками, полипептидная цепь которых пересекает липидный бислой несколько раз. Эти белки обеспечивают перенос специфических веществ через мембрану без непосредственного контакта с гидрофобной внутренностью липидного бислоя, формируя в нем сквозные проходы.

Существуют два основных класса мембранных транспортных белков: белки-переносчики и каналообразующие белки. Белки переносчики (называемые также переносчиками или транспортерами) связывают молекулу переносимого вещества, что приводит к их конформационным изменениям и как результат к переносу этой молекулы через мембрану. Напротив, каналообразующие белки (или белки-каналы) формируют заполненные водой поры, пронизывающие липидный бислой. Когда эти поры открыты, молекулы специфических веществ (обычно неорганические ионы подходящего размера и заряда) проходят сквозь них и, следовательно, через мембрану (рис. 6-43).

Рис. 6-43. Упрощенное схематическое изображение двух классов мембранных транспортных белков. А. Белок-переносчик может попеременно существовать в двух конформациях, так что участок связывания определенного вещества последовательно доступен то с одной, то с другой стороны бислоя. Б. Каналообразующий белок формирует в липидном бислое заполненные водой поры, через которые могут диффундировать специфические ионы.

6.4.3. Активный транспорт осуществляется белками-переносчиками, связанными с источником энергии [21] Все каналообразующие белки и многие белки-переносчики позволяют растворенным веществам проходить через мембраны только пассивно («с горки»). Этот процесс называется пассивным транспортом (или облегченной диффузией). Если молекула транспортируемого вещества не имеет заряда, то направление пассивного транспорта определяется только разностью концентраций этого вещества по обеим сторонам мембраны (градиентом концентрации). Однако если молекула заряжена, то на ее транспорт влияют как градиент концентрации, так и разница электрических потенциалов на сторонах мембраны (мембранный потенциал). Вместе концентрационный и электрический градиенты составляют электрохимический градиент. Фактически в любой плазматической мембране есть градиент электрического поля. При этом внутренняя сторона мембраны обычно заряжена отрицательно по отношению к наружной (см. разд. 6.4.15). Такой потенциал облегчает проникновение в клетку положительно заряженных ионов, но препятствует прохождению внутрь ионов, заряженных отрицательно.

Клеткам также необходимы транспортные белки, активно перекачивающие определенные растворенные вещества против их электрохимических градиентов («в горку»). Этот процесс, известный под названием активного транспорта, всегда осуществляется белками переносчиками. Как будет рассмотрено ниже, при активном транспорте перекачивающая активность переносчиков является направленной, поскольку она тесно связана с источником метаболической энергии, таким, как гидролиз АТР или градиент ионов. Таким образом, транспорт, осуществляемый белками-переносчиками, может быть как активным, так и пассивным, в то время как транспорт через каналы является всегда пассивным (рис. 6-44).

Рис. 6-44. Схематическое изображение пассивного транспорта молекул по электрохимическому градиенту и активного транспорта против.

Простая диффузия и пассивный транспорт, осуществляемый транспортными белками (облегченная диффузия) протекают самопроизвольно. Для активного транспорта необходимо использовать метаболическую энергию. Только неполярные и маленькие незаряженные полярные молекулы могут проходить через липидный бислой путем простой диффузии. Перенос других полярных молекул осуществляется со значительными скоростями белками-переносчиками или каналообразующими белками.

Рис. 6-45. Кинетика простой диффузии и кинетика диффузии при участии белка-переносчика. В первом случае скорость всегда пропорциональна концентрации транспортируемого вещества, а во втором скорость достигает максимального значения Vmах при насыщении белков-переносчиков.

Концентрация, при которой скорость составляет половину максимального значения, принимается равной константе связывания Км молекул транспортируемого вещества данным переносчиком (аналогично Км для системы фермент-субстрат).

6- 6.4.4. Белки-переносчики действуют как связанные с мембраной ферменты [19] Процесс, с помощью которого белки-переносчики специфически связывают и транспортируют растворенные молекулы через липидный бислой, напоминает ферментативную реакцию, а транспортные белки выступают как особые, связанные с мембраной, ферменты. В белках переносчиках всех типов имеются участки связывания для транспортируемой молекулы (субстрата). Когда белок насыщен (т. е. когда все участки связывания заняты), скорость транспорта максимальна. Эта скорость, обозначаемая Vmax, является характеристикой данного белка-переносчика.

Кроме того, каждый белок-переносчик имеет характерную для него константу связывания Км, равную концентрации транспортируемого вещества, при которой скорость транспорта составляет половину ее максимальной величины (рис. 6-45). Связывание растворенного вещества может быть специфически блокировано как конкурентными ингибиторами (конкурирующими за тот же участок связывания), так и неконкурентными ингибиторами (связывающимися где-нибудь в другом месте и специфически влияющими на структуру переносчика). Однако в данном случае аналогия с реакцией фермент-субстрат неполная, поскольку транспортируемые вещества обычно не модифицируются ковалентнo белками переносчиками.

Некоторые транспортные белки просто переносят какое-либо растворенное вещество с одной стороны мембраны на другую. Такой простой перенос называется унипортом. Другие белки функционируют как котранспортные системы, в которых перенос одного растворенного вещества зависит от одновременного или последовательного переноса другого вещества либо в том же направлении (симпорт), либо в противоположном (антипорт) (рис. 6-46). Например, большинство животных клеток поглощают глюкозу из внеклеточной жидкости, где ее концентрация относительно высока, путем пассивного транспорта, осуществляемого специфическими переносчиками глюкозы, работающими как унипорты. Напротив, клетки кишечника и почек поглощают глюкозу из люменального пространства кишечника и почечных канальцев, где концентрация этого сахара мала. В данном случае имеет место симпорт глюкозы и ионов Na+, внеклеточная концентрация которых очень высока.

Как уже обсуждалось раньше, переносчик анионов (белок полосы 3) в эритроцитах человека работает по механизму антипорта при обмене Сl- на НСО3-.

Молекулярный механизм работы белков-переносчиков пока неизвестен. Предполагается, что они переносят растворенные вещества через бислой, претерпевая обратимые конформационные изменения, которые Рис. 6-46. Схема работы белков-переносчиков, функционирующих по принципу унипорта, симпорта и антипорта.

Рис. 6-47. Гипотетическая модель, показывающая как конформационные изменения в белке-переносчике могли бы обеспечить облегченную диффузию растворенного вещества А. Белок-переносчик может существовать в двух конформационных состояниях: в состоянии «понг» участки связывания для А открыты с наружной стороны бислоя;

в состоянии «пинг» те же участки оказываются открытыми с другой стороны. Переход между двумя состояниями осуществляется случайным образом и полностью обратим. Поэтому при более высокой концентрации А с наружной стороны бислоя с белком-переносчиком будет связываться большее число молекул А в состоянии «понг», что приведет к транспорту вещества А по градиенту его концентрации.

позволяют им попеременно экспонировать участки связывания растворенных веществ то с одной, то с другой стороны. Схематическая модель того, как мог бы осуществляться этот процесс показана на рис. 6-47. Теперь мы знаем, что переносчики представляют собой трансмембранные белки, цепь которых пересекает бислой несколько раз. Маловероятно, что такие белки беспрестанно перескакивают в мембране из одного монослоя в другой или перемещаются взад-вперед через липидный бислой, как это предполагали раньше.

Далее мы убедимся в том, что сравнительно небольшая модификация модели, изображенной на рис. 6-47, позволяет связать белок переносчик с источником энергии, например гидролизом АТР (см. рис. 6-49). Замечательным примером белка-переносчика, использующего энергию гидролиза АТР для перекачки ионов, служит (Na+ + К + )-насос, играющий решающую роль в образовании мембранного потенциала на плазматических мембранах животных клеток.

6- 6.4.5. (Na+ + К+)-насос плазматической мембраны - это АТРаза [22] Концентрация К+ внутри клетки, как правило, в 10-20 раз выше, чем снаружи. Для ионов Na+ - картина прямо противоположная (см. табл.

6-3). Такая разница в концентрациях ионов обеспечивается работой (Na+ + К+ )-насоса, обнаруженного в плазматических мембранах практически всех животных клеток. Этот насос работает по принципу антипорта, активно перекачивая Na+ из клеток, а К+ внутрь клеток против их крутых электрохимических градиентов. Ниже будет показано, что градиент Na+, создаваемый насосом, регулирует объем клеток за счет осмотических эффектов. Он также используется для осуществления транспорта Сахаров и аминокислот в клетку. Почти треть всей энергии, необходимой для жизнедеятельности животной клетки, тратится именно на работу этого насоса. В электрически активных нервных клетках при распространении потенциала действия происходит многократное накапливание небольших порций Na+ и потери небольших количеств К+ (см. ниже). При этом на восстановление уходит около 2/3 энергии, необходимой клетке.

Значительный шаг вперед в понимании молекулярного механизма работы натриево-калиевого насоса был сделан в 1957 г., когда обнаружилось, что для оптимальной активности фермента, гидролизующего АТР до ADP и фосфата, требуется Na+ и К+. Кроме того, было показано, что известный ингибитор (Na+ + К+)-насоса уабаин ингибирует также и АТРазу. Таким образом, была установлена связь между (Na+ + К+ )-АТРазой и натриево-калиевым насосом. Однако главное доказательство того, что именно гидролиз АТР обеспечивает насос Рис. 6-48. (Na+ + К+ )-АТРаза активно качает Na+ наружу, а К+ внутрь клетки против их электрохимических градиентов. При гидролизе внутри клетки каждой молекулы АТР три иона Na+ выкачиваются из клетки и два иона К+ накачиваются в клетку. Специфический ингибитор насоса уабаин и ионы К+ конкурируют за общий участок на внеклеточной стороне АТРазы.

необходимой для работы энергией, было получено при изучении замкнутых теней эритроцитов. В этих опытах можно было варьировать концентрации ионов с каждой стороны мембраны и наблюдать, как эти изменения влияют на транспорт ионов и гидролиз АТР. Было обнаружено, что 1) транспорт ионов натрия и калия и гидролиз АТР тесно связаны между собой, так что ни один из этих процессов не может осуществляться без другого;

2) транспорт ионов и гидролиз АТР происходят лишь в том случае, когда N+ и АТР присутствуют внутри теней, а К+ - снаружи;

3) уабаин ингибирует АТРазу только находясь с внешней стороны теней, где он конкурирует за К+ -связывающий участок;

4) при гидролизе каждой молекулы АТР (одна молекула АТРазы может гидролизовать 100 молекул АТР за 1 с) три иона натрия выкачиваются наружу и два иона калия накачиваются внутрь (рис. 6-48).

Эти эксперименты неопровержимо доказали, что АТР поставляет энергию для перекачивания ионов натрия и калия через плазматическую мембрану;

тем не менее оставалось непонятным, как именно гидролиз АТР связан с транспортом ионов. Дальнейшие исследования показали, что концевая фосфатная группа АТР в присутствии Na+ переносится на остаток аспарагиновой кислоты в молекуле АТРазы. Связанная с АТРазой фосфатная группа затем гидролизуется в присутствии К+, и именно этот последний этап ингибируется уабаином. Na+-зависимое фосфорилирование сопряжено с изменением конформации АТРазы, что приводит к выведению натрия из клетки. Наоборот, К+-зависимое дефосфорилирование, осуществляемое вслед за этим, обусловливает транспорт ионов калия внутрь клетки и возвращение АТРазы в первоначальное состояние (рис. 6-49).

(Na+ + К+ )-насос в тенях эритроцитов можно заставить работать в противоположном направлении - для синтеза АТР. Если градиенты концентраций ионов натрия и калия в эксперименте увеличить до такой степени, что энергия их электрохимических градиентов будет выше химической энергии гидролиза АТР, то ионы будут проходить через мембрану по их электрохимическим градиентам, а АТР будет синтезироваться из ортофосфата и ADP с помощью натриево-калиевой АТРазы. Таким образом, фосфорилированная форма АТРазы (позиция 2 на рис. 6-49) может релаксироваться либо перенося фосфат на ADP (от позиции 2 к позиции 1), либо изменяя свою конформацию (от позиции 2 к позиции 3). Будет ли общее изменение свободной энергии использоваться для синтеза АТР или же для выкачивания Na+ из теней эритроцитов, зависит от относительных концентраций АТР, ADP и фосфата и от электрохимических градиентов ионов натрия и калия.

Рис. 6-49. Модель функционирования (Na+ + К+ )-АТРазы. Связывание Na+ (1) и последующее фосфорилирование (2) АТРазы со стороны цитоплазмы индуцируют в белке конформационные изменения, в результате которых Na+ переносится через мембрану и высвобождается в межклеточное пространство (3). Затем связывание К+ на внешней поверхности (4) и последующее дефосфорилирование (5) возвращают белок в первоначальную конформацию;

при этом К+ проходит через мембрану и высвобождается в цитоплазму (6). Эти конформационные изменения аналогичны переходам типа «пинг-понг», изображенным на рис. 6-47, за исключением того, что здесь конформационные переходы индуцируются Na+-зависимым фосфорилированием и К+-зависимым дефосфорилированием белка, вследствие чего он совершает полезную работу. Для простоты показано только по одному участку связывания Na+ и К+. В реальном насосе, видимо, существует три участка связывания Na+ и два - К+.

После того как (Na+ + К+ )-АТРаза была получена в чистом виде, выяснилось, что она состоит из двух субъединиц - большой (длиной около 1000 аминокислотных остатков) трансмембранной, пересекающей бислой несколько раз и обладающей каталитической активностью, и ассоциированного с ней более мелкого гликопротеина. Первая субъединица имеет участки связывания для Na+ и АТР на цитоплазматической стороне, а для К+ и уабаина на наружной. Кроме того, она обратимо фосфорилируется и дефосфорилируется. Функция гликопротеина неизвестна.

Работающий натриево-калиевый насос можно реконструировать из очищенного комплекса: АТРазу солюбилизируют в детергенте, очищают и смешивают с соответствующими фосфолипидами. После удаления детергента образуются мембранные пузырьки, которые в присутствии АТР качают Na+ и К+ в противоположных направлениях (см. рис. 6-21).

6.4.6. (Na+ + К+)-АТРаза необходима для поддержания осмотического равновесия и стабилизации объема клеток [23] Поскольку (Na+ + К+ )-АТРаза выкачивает три положительно заряженных иона на каждые два, накачанные внутрь клетки, она оказывается «электрогенной». Это значит, что через мембрану течет ток, создающий электрический потенциал с отрицательным значением во внутренней части клетки по отношению к ее наружной поверхности. Однако этот эффект насоса дает не более 10% вклада в мембранный потенциал. Остальные 90% потенциала создаются, как мы увидим, работой насоса косвенным образом и связаны с различной концентрацией К + по разные стороны мембраны. Повышенные концентрации калия внутри клетки Рис. 6-50. Реакция эритроцитов человека на изменение осмотических условий во внеклеточной жидкости. Вода всасывается в клетку или выходит из нее по градиенту концентрации, поскольку плазматическая мембрана хорошо проницаема для молекул воды. Этот процесс называется осмосом.

При помещении клеток в гипотонический раствор (т.е. в раствор с низкой концентрацией соли и, следовательно, с высокой концентрацией воды) молекулы воды движутся внутрь клеток, что приводит к их разбуханию и разрыву (лизису). Наоборот, при помещении клеток в гипертонический раствор они будут сморщиваться (см. также схему 2-1).

необходимы для сбалансирования большого суммарного отрицательного заряда, обусловленного клеточными фиксированными анионами - множеством отрицательно заряженных органических молекул, находящихся внутри клетки и не способных проникать через плазматическую мембрану.

(Na+ + К+ )-АТРаза играет непосредственную роль в регуляции клеточного объема. Она контролирует концентрацию растворов внутри клетки, а следовательно, и осмотические силы, приводящие к разбуханию или сжатию клетки (рис. 6-50). Как объясняется на схеме 6-1, растворы внутри клетки (включая фиксированные анионы и сопутствующие катионы, необходимые для уравновешивания их заряда) поддерживают большой осмотический градиент, насасывающий воду внутрь клетки. В животных клетках этот эффект нейтрализуется высокими концентрациями неорганических ионов (главным образом Na+ и С1-), находящихся во внеклеточной жидкости. Натриево-калиевая АТРаза поддерживает осмотическое равновесие, выкачивая втекающие по ступенчатому градиенту ионы Na+ из клетки;

Сl- удерживаются вне клетки благодаря мембранному потенциалу.

Важная роль (Na+ + К+ )-АТРазы в регуляции клеточного объема подтверждается тем фактом, что при обработке животных клеток уабаином, ингибирующим натриево-калиевую АТРазу, они разбухают и разрываются. Осмотические проблемы могут решаться в клетках и другими способами. У многих бактерий и растительных клеток плазматическая мембрана окружена полужесткой стенкой, предохраняющей клетку от разрыва. У амеб излишек воды, проникающий внутрь в результате осмоса, собирается в сократительных вакуолях, периодически выбрасывающих свое содержимое наружу (схема 6-1). Однако в большинстве животных клеток основная роль в предотвращении разрыва из-за осмотического давления принадлежит (Na++K+)-АТРазе.

6.4.7. Некоторые Са2+-насосы - это тоже мембраносвязанные АТРазы [24] Концентрация ионов Са2+ в цитозоле эукариотических клеток поддерживается на гораздо более низком уровне (~ 10-7 М) по сравнению с его концентрацией снаружи клетки (~ 10-3 М). Даже небольшой приток Са2+ извне значительно увеличивает концентрацию свободного Са2+ в цитозоле, а поток ионов кальция, устремляющийся по ступенчатому градиенту в ответ на внешние сигналы - один из способов передачи таких сигналов через плазматическую мембрану (см. разд. 12.3.7). Градиент Са2+ частично поддерживается с помощью существующих в плазматической мембране Са2+-насосов, активно выводящих кальций из клетки. Известно, что один из таких насосов является АТРазой, а другой работает как антипорт, обусловленный электрохимическим градиентом Na+ (см. ниже).

ИСТОЧНИКИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ОСМОТИЧНОСТИ Макромолекулы слабо влияют на осмотическое давление внутри клетки, поскольку каждая из них, хотя и имеет большие размеры, есть всего лишь одна молекула, и число таких молекул просто мало по сравнению с числом малых молекул. Однако большинство биологических молекул сильно заряжены, и потому они удерживают около себя множество неорганических ионов противоположного заряда.

Это большое число противоионов и вносит основной вклад во внутриклеточную осмотичность.

В результате активного транспорта и метаболических процессов клетки содержат высокие концентрации малых органических молекул, таких, как сахара, аминокислоты и нуклеотиды, для которых плазматическая мембрана является практически непроницаемой.

Поскольку большинство этих метаболитов заряжены, они также окружены противоионами. Таким образом, как сами малые метаболиты, так и их противоионы существенно влияют на осмотическое давление внутри клеток.

Осмотичность внеклеточной жидкости определяется главным образом малыми неорганическими ионами Они медленно перемещаются внутрь клетки через плазматическую мембрану. Если бы они не выкачивались обратно и если бы внутри клетки не было бы других молекул, взаимодействующих с ними, то со временем система пришла бы в равновесие с одинаковыми концентрациями ионов внутри и снаружи клетки. Однако существование заряженных макромолекул и метаболитов в клетке, окруженных облаком противоионов, приводит к усилению эффекта Доннана. Этот эффект приводит к тому, что даже при равновесии общая концентрация неорганических ионов (и соответственно их вклад в осмотичность) внутри клетки должна быть выше, чем снаружи.

ПРОБЛЕМА Если бы не существовала система осморегуляции, общая концентрация растворенных веществ внутри клетки оказалась бы больше, чем снаружи. Это означает, что концентрация воды снаружи была бы больше, чем внутри. Такая разница в концентрации воды по обеим сторонам плазматической мембраны приводила бы к постоянному притоку воды внутри клетки в результате осмоса, вызывая разрыв клетки.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ Животные клетки и бактерии контролируют осмотическое давление внутри клетки с помощью активного выкачивания неорганических ионов, таких, как Na+, так что их общая концентрация внутри клетки ниже, чем во внеклеточной жидкости.

Клетки растений ограничивают набухание благодаря их жестким стенкам и, таким образом, могут выдерживать осмотическое давление на их плазматическую мембрану: в зависимости от количества поступающей внутрь воды увеличивается и внутриклеточное давление со стороны стенки, уравновешивающее разрывающие клетку силы.

Многие простейшие избегают набухания, несмотря на осмотическое давление, благодаря способности периодически выбрасывать поступающую воду в специальных сократительных вакуолях.

Схема 6-1. Внутриклеточный водный баланс: проблема и ее решение.

Наиболее изученным из Са2+-насосов является мембраносвязанная АТРаза из саркоплазматического ретикулума мышечных клеток.

Саркоплазматический ретикулум образует сеть тонких каналов в цитоплазме мышечных клеток и служит внутриклеточным хранилищем ионов кальция. Когда потенциал действия деполяризует мембрану мышечной клетки, Са2+ высвобождается из саркоплазматического ретикулума в цитозоль, стимулируя мышцу к сокращению (см. разд. 11.1.4). Кальциевый насос отвечает за перекачивание Са2+ из цитозоля в саркоплазматический ретикулум. Подобно натриево-калиевому насосу, Са2+-насос - это АТРаза, которая фосфорилируется и дефосфорилируется в каждом цикле работы и накачивает два иона кальция внутрь саркоплазматического ретикулума в расчете на каждую гидролизованную молекулу АТР. Поскольку Са2+ -АТРаза - это преобладающий белок в мембране саркоплазматического ретикулума (она составляет около 90% всего белка данной структуры), ее довольно легко очистить. Оказалось, что молекула этого белка состоит из одной длинной полипептидной цепи (около аминокислотных остатков), пронизывающей мембрану несколько раз;

после включения в фосфолипидные пузырьки кальциевая АТРаза осуществляет сопряженный с гидролизом АТР перенос ионов Са2+. Эксперименты по клонированию и секвенированию ДНК свидетельствуют о гомологии Са2+ -АТРазы большой каталитической субъединице (Na+ + К+)-АТРазы, что говорит об эволюционном родстве этих двух ионных насосов.

В немышечных клетках органеллы эквивалентные саркоплазматическому ретикулуму также содержат Са2+ -АТРазу, выкачивающую Са2+ из цитозоля. В ответ на специфические внеклеточные сигналы этот, изолированный от клетки, Са2+ возвращается опять в цитозоль.

6.4.8. Мембранносвязанные ферменты, синтезирующие АТР, это транспортные АТРазы, действующие в обратном направлении [25] В плазматических мембранах бактерий, во внутренних мембранах митохондрий и тилакоидных мембранах хлоропластов обнаруживаются ферменты, очень похожие на две обсуждавшиеся выше транспортные АТРазы. Однако здесь они обычно действуют в обратном направлении. Вместо гидролиза АТР, обеспечивающего транспорт ионов, они катализируют синтез АТР из ADP и фосфата, осуществляемый благодаря наличию на этих мембранах градиента протонов. Градиент Н+ возникает на отдельных этапах транспорта электронов в процессе окислительного фосфорилирования (у аэробных бактерий и в митохондриях) или фотосинтеза (в хлоропластах), а также с помощью фотоактивируемого протонного насоса (бактериородопсина у Halobacterium). Эти ферменты, в норме синтезирующие АТР, названы АТР синтетазами. Как и транспортные АТРазы, они способны работать в обоих направлениях в зависимости от условий: либо гидролизовать АТР и качать Н+ через мембрану во внутреннее пространство, либо синтезировать АТР при прохождении потока ионов Н+ через молекулы ферментов в обратном направлении. АТР-синтетазы ответственны за продукцию практически всего АТР в большинстве клеток и более детально обсуждаются в гл. 9.

6.4.9. Активный транспорт может осуществляться с помощью ионных градиентов [26] Многие системы активного транспорта приводятся в действие за счет энергии, запасенной в ионных градиентах, а не путем прямого гидролиза АТР. Все ионы работают как парные транспортеры: одни функциони- Рис. 6-51. Принципы использования градиента Na+ для работы насоса, перекачивающего глюкозу. Насос осциллирует случайным образом между двумя состояниями: «пинг» и «понг», как на рис. 6-47. Na+ связывается одинаково хорошо с белком в любой конформации. Связывание Na+ индуцирует аллостерический переход белка в состояние с сильно увеличенным сродством к глюкозе. Поскольку концентрация Na+ вне клетки выше, чем в цитозоле, связывание глюкозы с насосом более вероятно в конформации «понг». Поэтому перенос Na+ и глюкозы в клетку (переход «понг» «пинг») происходит намного чаще, чем наоборот, т.е. осуществляется направленный перенос. Поддерживая градиент Na+ на определенном уровне (Na+ + К+ )-АТРаза косвенным образом обеспечивает такую транспортную систему энергией. Говорят, что переносчики, работающие по такому принципу, осуществляют вторичный активный транспорт, тогда как АТРаза осуществляет первичный активный транспорт.

руют по принципу симпорта, а другие - антипорта. В животных клетках котранспортируемым ионом обычно оказывается Na+. Его электрохимический градиент обеспечивает энергией активный транспорт второго вида молекул. Проникающий при этом внутрь клетки Na+ выкачивается (Na+ + К+)-АТРазой, которая, обеспечивая градиент Na+, косвенным образом осуществляет транспорт. Например, клетки кишечника и эпителиальные клетки почек содержат разнообразные симпортные системы, работающие благодаря трансмембранному градиенту Na+. Каждая система специфична для переноса внутрь клетки небольшой группы родственных Сахаров или аминокислот. В этих системах растворенные молекулы и ионы натрия связываются с различными участками на белке-переносчике;

Na+ стремится войти в клетку по своему электрохимическому градиенту и как бы «тащит» молекулы сахара или аминокис- лоты внутрь клетки за собой. Чем выше градиент Na+, тем больше скорость всасывания растворенных молекул. Наоборот, если концентрация Na+ во внеклеточной жидкости заметно уменьшается, - транспорт растворенных молекул останавливается. Гипотетическая (и довольно упрощенная) схема функционирования подобной системы симпорта изображена на рис. 6-51.

У бактерий и растений большинство систем активного транспорта, приводящихся в действие ионными градиентами, используют в качестве котранспортируемого иона Н+, а не Na+. В частности, активный транспорт большей части Сахаров и аминокислот в бактериальные клетки обусловлен градиентом Н+ через плазматическую мембрану. Наиболее хорошо изученный пример такого рода - переносчик лактозы (пермеаза).

Этот трансмембранный белок, состоящий из одной полипептидной цепи (длиной около 400 аминокислотных остатков), по-видимому, пересекает липидный бислой по крайней мере девять раз. Он осуществляет Н+-зависимый симпорт: с каждой транспортируемой в клетку молекулой лактозы переносится один протон.

6.4.10. Антипорты в плазматической мембране регулируют внутриклеточное значение рН [27] Почти все клетки позвоночных имеют в составе плазматической мембраны (Na+ + Н+ )-переносчик-обменник. Он играет ключевую роль в поддержании внутриклеточного значения рН (pHi) обычно около 7,1 — 7,2. Этот переносчик обеспечивает сопряжение выброса ионов Н+ с притоком ионов Na+ и, таким образом, удаляет избыток ионов Н+, образующийся в результате клеточных реакций окисления. Работа (Na+ + Н+) обменника регулируется значением рН: например, когда рНi в мышечных клетках цыпленка выше уровня 7,7 - обменник становится неактивным;

как только значение Phi падает - активность обменника увеличивается, достигая половины своей максимальной активности при рНi 7,4. Такая регуляция обусловлена связыванием Н+ с регуляторным участком обменника, находящимся на цитоплазматической стороне мембраны. Важность (Na++ К+)-обменника в поддержании уровня рНi была продемонстрирована экспериментами с мутантами фибробластов, не содержащими такого обменника: они очень быстро погибали при помещении их в достаточно кислые условия, хотя нормальные фибробласты в этих условиях жизнеспособны. В поддержании уровня рНi у многих ядерных клеток, по-видимому, играет важную роль и (С1- + НСО3)-обменник, сходный с белком полосы 3 из мембран эритроцитов (см. разд. 6.2.6). Подобно (Na+ + Н+)-обменнику, работа (Сl- + НСО3- )-обменника регулируется значением рНi, но противоположным образом. Его активность возрастает при повышении рНi (т. е. когда цитозоль становится слишком щелочным), увеличивая скорость выведения НСОз- из клетки в обмен на С1- и, таким образом, понижая рНi.

Существуют данные, свидетельствующие о том, что (Na+ + Н+ )-обменник может участвовать не только в поддержании рНi, но и в преобразовании внеклеточных сигналов во внутриклеточные. Например, большинство белковых факторов роста в процессе стимуляции клеточной пролиферации активируют такого рода системы антипорта, увеличивая рНi от 7,1 или 7,2 до примерно 7,3. По крайней мере в некоторых случаях они делают это косвенным образом, активируя cпецифическую протеин-киназу (протеинкиназа С - см. разд. 12.3.10), которая в свою очередь фосфорилирует обменник. Это приводит к увеличению сродства регуляторного участка, связывающего Н+, и, следовательно, обменник остается активным и при больших рН. Мутантные клетки, лишенные (Na+ + + Н+ )-обменника, или клетки, обработанные препаратом амилоридом, ингибирующим его, не способны к ответу на действие факторов роста. Все эти факты наводят на мысль, что активация обменника с последующим увеличением рНi играет важную роль в инициации клеточной пролиферации. По-видимому, сходным образом увеличение рНi при оплодотворении яиц морского ежа, вызванное активацией (Na+ + Н+)-обменника, стимулирует синтез ДНК и белка. Остается неясным, какие внутриклеточные белки ответственны за увеличение рНi в ответ на эту активацию.

6.4.11. В основе межклеточного транспорта растворенных веществ лежит асимметричное распределение белков-переносчиков в клетках эпителия [28] В плазматической мембране некоторых эпителиальных клеток, участвующих в поглощении пищи в кишечнике, белки-переносчики распределены асимметрично, способствуя, таким образом, сквозному транспорту поглощенных растворенных веществ через клетку. Как показано на рис. 6-52, белки, локализованные в плазматической мембране на апикальной (всасывающей) поверхности эпителиальной клетки, осуществляют Na+-зависимый симпорт, перенося питательные вещества внутрь клетки. В то же время Na+-независимые белки в базальной и латеральной мембранах позволяют питательным веществам выходить наружу по градиенту их концентраций. Градиент Na+ на плазматической мембране таких клеток поддерживается (Na+ + К+ )-АТРазой, находящийся в базолатеральной области. По-видимому, сходные механизмы используются эпителиальными клетками кишечника и почек для перекачивания молекул воды из одного внеклеточного пространства в другое.

Рис. 6-52. Асимметричное распределение транспортных белков в плазматической мембране клетки эпителия кишечника приводит к сквозному транспорту глюкозы из полости кишки сквозь клетку во внеклеточную жидкость (откуда она поступает в кровь). Глюкоза проникает в клетку через апикальную мембрану посредством Na+-зависимого симпорта глюкозы и выходит из клетки (по градиенту своей концентрации) путем облегченной диффузии, опосредуемой другим белком-переносчиком глюкозы, локализованном в базальном и латеральном доменах. Градиент Na+, который приводит в движение симпорт глюкозы, поддерживается (Na+ + К+ )-АТРазой, находящейся в плазматической мембране базолатерального домена;

Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |   ...   | 11 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.