WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 11 |

«1 Молекулярная биология клетки 2 Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray, Biology Julian Lewis, Martin Raff, of the Cell Keith Roberts, James D. Watson SECOND EDITION Garland Publishing, Inc. ...»

-- [ Страница 5 ] --

Таблица 4-7. Некоторые типичные коэффициенты седиментации Частица или молекула Коэффициент седиментации, S Лизосома Вирус табачной мозаики Рибосома Молекула рибосомной РНК Молекула тРНК Молекула гемоглобина 4, Коэффициенты седиментации измеряются в секундах и задаются уравнением (dx/dt)/2 • х, где х — расстояние от центра вращения в см, (dx/dt) - скорость осаждения (седиментация) (см/с), - угловая скорость вращения ротора центрифуги в радианах в секунду (рад/с). Поскольку такие коэффициенты измеряются очень малыми числами, они обычно выражаются в единицах Сведберга (S), где 1S равен 1 х 10-13 с.

4.4.3. Для фракционирования белков можно использовать хроматографию [26] В настоящее время хроматография является одним из методов, наиболее широко используемых для фракционирования белков.

Первоначально этот метод был разработан для фракционирования низкомолекулярных соединений - Сахаров и аминокислот. Наибольшее распространение получила распределительная хроматография - метод, нашедший широкое применение для разделения небольших молекул. В общей форме этот метод состоит в следующем. Каплю образца наносят на специальную бумагу (хроматография на бумаге) или пластинку стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля (хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография). Затем такую пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта). По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они связывались сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют положение различных молекул (рис. 4-44).

Белки чаще всего разделяют методом хроматографии на колонках (колоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с различной скоростью. После того как разные белки Таблица 4-8. Основные вехи в развитии метода ультрацентрифугирования и приготовления бесклеточных экстрактов 1897 - Бюхнер (Buchner) показал, что бесклеточные экстракты дрожжей способны расщеплять сахара с образованием двуокиси углерода и этилового спирта. Так были заложены основы энзимологии 1926 - Сведберг (Svedberg) изобрел аналитическую центрифугу и использовал ее для определения молекулярной массы гемоглобина, которая оказалась равной 68000 дальтон 1935 - Пикелс и Бимс (Pickels, Beams) несколько усовершенствовали конструкцию центрифуги, что позволило использовать ее для проведения препаративных исследований 1938 - Беренс (Behrens) использовал дифференциальное центрифугирование для разделения ядер и цитоплазмы клеток печени. Этот метод был усовершенствован в 40-х и начале 50-х годов Клодом, Браше, Хогебумом (Claude, Brachet, Hageboom) и другими исследователями, что позволило использовать его для разделения органелл клетки 1949 - Сент-Дьердьи (Sent-Geogyi) показал, что изолированные миофибриллы из клеток скелетных мышц сокращаются при добавлении АТР. В 1955 г. аналогичную бесклеточную систему использовал Хофман-Берлинг (Hofmann-Berling) для изучения движения жгутика 1951 - Бракк (Brakke) использовал центрифугирование в градиенте плотности сахарозы для очистки вирусов растений 1954 - де Дюв (de Duve) выделил методом центрифугирования лизосомы, а несколько позже пероксисомы 1954 - Замечник (Samechnik) получил первую бесклеточную систему синтеза белка. За этим открытием последовало десятилетие интенсивных исследований, завершившихся расшифровкой генетического кода 1957 - Мезелсон, Сталь и Виноград (Meselson, Stahl, Vinograd) для разделения нуклеиновых кислот разработали метод центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия Рис. 4-44. Разделение низкомолекулярных соединений методом хроматографии на бумаге. Образец наносят на старт и высушивают, а затем, используя капиллярный эффект, пропускают сквозь бумагу смесь двух растворителей. Разные компоненты образца движутся по бумаге с различной скоростью, которая зависит от относительной растворимости исследуемых компонентов в растворителе, адсорбируемым бумагой сильнее.

Введение этого метода произвело революцию в биохимическом анализе в 40-х годах нашего столетия.

достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями (рис. 4-45). В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые можно делить белки согласно их заряду (ионообменная хроматография), гидрофобности (гидрофобная хроматография), размеру (хроматография гель-фильтрацией) или способности связываться различными химическими группами (аффинная хроматография).

В продаже имеется значительный выбор матриксов различных типов (рис. 4-46). Ионообменные колонки набиты маленькими шариками, заряженными положительно или отрицательно. При использовании таких колонок фракционирование белков происходит в соответствии с расположением зарядов на поверхности белковых молекул. Гидрофобные колонки наполнены шариками, из которых выступают гидрофобные цепи;

в таких колонках задерживаются белки с обнаженными гидрофобными участками. Колонки, предназначенные для гель-фильтрации, заполнены крошечными пористыми шариками;

при использовании таких колонок происходит разделение белков по размерам. Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми. Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров.

Рис. 4-45. Разделение молекул методом хроматографии на колонках. Образец наносят на верх цилиндрической стеклянной или пластиковой колонки, заполненной проницаемым матриксом (например, целлюлозой), погруженным в растворитель. Затем через колонку медленно прокачивают значительное количество растворителя, который собирают со дна колонки в отдельные пробирки. Различные компоненты образца проходят через колонку с различной скоростью, что и лежит в основе их фракционирования.

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы: диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно;

карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и рН элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель фильтрации (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 106 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого рН. Однократная хроматография на такой колонке позволяет зачастую достигнуть очень высокой степени очистки препарата.

На каждом этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более, чем в 20 раз, и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/ всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок (рис. 4-47). Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография по сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. Так, при ковалентном связывании субстрата фермента с матриксом, например, с полисахаридными шариками, фермент специфически удерживается матриксом и может быть элюирован (смыт) практически в чистом виде.

Подобным образом можно иммобилизировать короткие олигонуклеотиды ДНК определенной структуры (см. разд. 4.6.8) и использовать подобные носители для очистки ДНК-связывающих белков, опознающих данную последовательность нуклеотидов на хромосомах (см. разд. 9.1.8). С матриксом можно связать и специфические антитела;

такой носитель очень удобен для очистки белков, узнаваемых этими антителами. Аффинные колонки обладают высокой степенью специфичности;

за один цикл хроматографии можно добиться очень высокой степени очистки (1000- раз).

Разрешение обычной колоночной хроматографии ограничено негомогенностью матриксов (например, целлюлозы), что вызывает неравномерное протекание растворителя через колонку. Разработанные недавно хроматографические смолы (в основу которых обычно положен кремний) имеют форму мельчайших сфер от 3 до 10 мкм в диаметре, которые упакованы в специальный чехол и образуют гомогенную колонку.

Такие колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ) обеспечивают высокий уровень разрешения.

Поскольку частицы носителя в колонках для ВЖХ упакованы очень плотно, в отсутствие высокого давления скорость потока через них Рис. 4-47. Типичные результаты, полученные при очистке белка различными методами хроматографии. В данном случае подлежащий фракционированию клеточный экстракт сначала пропускали через колонку, заполненную ионообменной смолой (А). Затем колонку промывали и связавшиеся белки элюировали раствором, содержащим постепенно нарастающую концентрацию соли. Белки с наименьшим сродством к ионообменной смоле проходят через колонку не задерживаясь и собираются со дна колонки в первых порциях элюата. Остальные белки элюируются соответственно сродству к ионообменной смоле. Для элюирования белков, связывающихся со смолой наиболее сильно, требуется наивысшая концентрация соли. Исследуемый белок элюировался в виде узкого пика;

он был выявлен по ферментативной активности. Фракции с такой активностью собирали и наносили на вторую колонку для гель-фильтрации (Б). Фракцию все еще недостаточно очищенного белка выявляли по ферментативной активности;

активные фракции собирали и очищали до гомогенного состояния на колонке (В), содержащей иммобилизованный субстрат фермента.

незначительна. По этой причине такие колонки обычно помещают в стальные цилиндры, соединенные со сложной системой насосов и шлангов, которые обеспечивают необходимое для высокой скорости протока давление. В традиционной колоночной хроматографии скорость протекания через колонку может быть довольно низкой (примерно один объем колонки в час), таким образом, у разделяемых растворов достаточно времени для уравновешивания с внутренним содержимым крупных частиц матрикса. В условиях ВЖХ происходит быстрое уравновешивание растворов с внутренним содержимым крошечных сфер, так что растворы, обладающие различным сродством к матриксу, эффективно разделяются даже при высокой скорости потока. Таким Рис. 4-48. Детергент додецилсульфат натрия (ДСН) в ионизированной форме и восстановитель -меркаптоэтанол. Эти два реактива используются для солюбилизации белков при ДСН-электрофорезе в полиакриламидном геле.

образом, ранее для достижения плохого разделения с помощью колоночной хроматографии требовались часы, а в настоящее время благодаря ВЖХ качественное фракционирование занимает минуты. Вот почему именно этот метод чрезвычайно популярен сейчас для разделения и белков, и малых молекул.

4.4.4. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) можно определить размеры и субъединичный состав белков [27] Белки обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот. Если белковые молекулы поместить в электрическое поле, они начинают перемещаться со скоростью, которая определяется их суммарным зарядом, а также формой и размерами. Этот феномен лежит в основе электрофореза - метода разделения смесей белков в свободных водных растворах и в твердом пористом матриксе, в качестве которого можно использовать крахмал.

В середине 60-х годов был разработан модифицированный метод электрофореза - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). Этот метод был существенным шагом вперед по сравнению с обычными методами анализа белков, известными к тому времени. При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе - полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сшивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент - додецил-сульфат натрия или ДСН (SDS) (рис. 4-48).

Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развертывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. Развертываясь, отдельные белковые молекулы освобождаются из комплексов с белками или молекулами липидов и солюбилизируются в растворе детергента. В качестве восстанавливающего агента обычно добавляют меркаптоэтанол (рис. 4-48), разрушающий в белках связи S-S. Это дает возможность анализировать полипептиды, образующие мультисубъединичные молекулы.

Что же произойдет, если смесь белков, растворенных в ДСН, подвергнуть электрофорезу в блоке полиакриламидного геля. Каждая молекула белка связывает значительное количество негативно заряженных молекул детергента, общий заряд которых превосходит общий заряд белка. По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода. Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку, во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил, а также более существенному торможению. В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются, но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие белки тормозятся значительно сильнее, чем малые белки. Вследствие этого сложная смесь белков делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой. Окрасив гель красителем кумасси синим, можно выявить основные фракции полипептидов. Минорные белки идентифицируют серебрением;

минимальное количество белка, выявляемое в полосе, составляет в последнем случае 10 нг. С помощью таких гелей можно идентифицировать специфический белок, если пометить его антителами, связанными с радиоактивными изотопами, ферментами или флуоресцирующими красителями. Идентификацию часто выполняют после переноса белков из геля на лист нитроцеллюлозы (посредством «блоттинга»).

Ниже этот метод описан более подробно применительно к изучению нуклеиновых кислот (см. разд. 4.6.8). Описанный метод выявления белка назван вестерн-блоттингом.

Метод ДСН-электрофореза белков в полиакриламидном геле значительно мощнее любого другого метода фракционирования белков из известных ранее хотя бы потому, что может быть использован для выявления любого белка независимо от его растворимости в воде. С помощью этого метода можно разделить на отдельные фракции белки мембран, белковые компоненты цитоскелета и белки, входящие в состав крупных макромолекулярных агрегатов. При использовании этого метода полипептиды разделяются строго по размеру, поэтому с его помощью можно получить информацию о субъединичном составе любого комплекса и о молекулярной массе белков, образующих этот комплекс (рис. 4-49).

Фотография геля, который был использован для анализа последовательных этапов очистки белка, представлена на рис. 4-50.

4.4.5. Методом двумерного гель-электрофореза можно разделить в одном геле более 1000 белков [28] Известно, что близко расположенные полосы в геле могут перекрываться. Этот эффект препятствует выявлению большого количества белков (не больше 50) с помощью одномерных методов их разделения, Метод двумерного гель-электрофореза, в котором объединены две различные процедуры разделения, позволяет Рис. 4-49. ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле.

идентифицировать более 1000 белков. Результаты при этом получают Индивидуальные белки образуют комплекс с молекулами в виде «двумерной» белковой карты.

додецилсульфата натрия, несущими отрицательный заряд, и мигрируют При работе данным методом на первом этапе белки через пористый гель полиакриламида в виде отрицательно заряженного разделяют по их заряду. Для этого образец помещают в небольшой комплекса ДСН-белок. Поскольку скорость передвижения в этих объем раствора, содержащего неионный (незаряженный) детергент - условиях тем выше, чем меньше размеры полипептида, этот метод может меркаптоэтанол, и в качестве денатурирующего агента - мочевину. В быть использован для определения приблизительной молекулярной этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация массы полипептидной цепи, а также для изучения субъединичного всех без исключения состава белка.

Рис. 4-50. Анализ образцов белка методом электрофореза в ДСН полиакриламидном геле. На фотографии показан гель, использованный для выявления белков, присутствующих на последующих стадиях очистки фермента. Самая левая дорожка (дорожка 1) содержит сложную смесь белков исходного клеточного экстракта, каждая из последующих дорожек содержит белки, полученные после хроматографического фракционирования белковых образцов, анализированных на предыдущей дорожке (см. рис. 4-47). В лунку каждой дорожки на гель наносили одинаковое количество белка (10 мкг). Отдельные белки в норме проявляются в виде узких окрашенных полос;

полосы расширяются, если в них присутствует слишком много белка. (С любезного разрешения Tim Formosa.) Рис. 4-51. Разделение молекул белка методом изоэлектрического фокусирования. При низких значениях рН (высокое содержание ионов Н+) карбоксильные группы белков имеют тенденцию оставаться незаряженными (—СООН), а основные, азотсодержащие группы белков полностью заряжены (например, -NH3+), что обусловливает у белков суммарный положительный заряд. При высоких значениях рН карбоксильные группы заряжены отрицательно (— COO-), а основные группы имеют тенденцию оставаться незаряженными, например (NH2). В результате белки приобретают отрицательный суммарный заряд (см. рис. 2-8). При изоэлектрической точке белок незаряжен, поскольку положительный и отрицательный заряды уравновешены. Следовательно, если пробирку, содержащую раствор с фиксированным градиентом рН, подвергнуть действию сильного электрического поля, каждый вид белка будет перемещаться до тех пор, пока не образует узкой полосы в зоне рН, соответствующего изоэлектрической точке, как показано на рисунке.

полипептидных цепей;

при этом изменения заряда цепей не происходит. Диссоциированные полипептидные цепи разделяют затем методом изоэлектрического фокусирования, основанном на изменении заряда белковой молекулы при изменении рН окружающей среды. Каждый из белков может быть охарактеризован изоэлектрической точкой - значением рН, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю, и, следовательно, белок не способен перемещаться под действием электрического поля. При изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в узкой трубочке, заполненной полиакриламидным гелем, в котором с помощью специальных буферов создается градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлектрической точке и остается в ней (рис. 4-51). Так происходит разделение белков в одном направлении двумерного гель-электрофореза.

На втором этапе трубочка геля, содержащего разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом случае электрофорез ведут в присутствии ДСН и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецил-сульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходе которого каждая из полипептидных цепей мигри- Рис. 4-52. Фракционирование белков клетки Е. coli методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Каждое пятно соответствует отдельной полипептидной цепи. Сначала белки разделяли соответственно их изоэлектрическим точкам методом изоэлектрического фокусирования слева направо. Затем в присутствии ДСН их разделяли методом электрофореза сверху вниз в соответствии с молекулярной массой их субъединиц.

Отметим, что содержание разных белков в клетке неодинаково. (С любезного разрешения Patrick O'Farrell.) Таблица 4-9. Основные вехи в развитии методов хроматографии и электрофореза и в применении этих методов для разделения биологических макромолекул _ 1833 - Фарадей (Faradey) сформулировал фундаментальные законы, описывающие электрические явления в растворах 1850 - Рунге (Rounge) разделил неорганические соединения по их дифференциальной адсорбции на бумаге, предвосхитив тем самым появление методов хроматографического разделения 1906 - Цвет изобрел хроматографию на колонках. Он пропустил петролейные экстракты листьев растений через колонку с порошкообразным мелом 1933 - Тизелиус (Thiselius) использовал электрофорез для разделения белков в растворе 1942 - Мартин и Синж (Martin, Synge) изобрели распределительную хроматографию, на основе которой через два года был разработан метод хроматографии на бумаге 1946 - Стайн и Мур (Stain, Moore) впервые определили аминокислотный состав белка. Первыми в качестве наполнителя в колоночной хроматографии они использовали крахмал, а позже ионообменные смолы 1955 - Смитис (Smithies) для разделения белков с помощью электрофореза использовал крахмальный гель 1955 - Сэнгер (Sanger) завершил анализ аминокислотной последовательности бычьего инсулина. Это первый белок, у которого определена полная аминокислотная последовательность 1956 - Ингрэм (Ingram) получил первые пептидные карты («фингерпринты» - «отпечатки пальцев»), показав при этом, что различия гемоглобина больных серповидноклеточной анемией и нормального гемоглобина обусловлены заменой одной-единственной аминокислоты 1959 - Рэймонд (Raymond) ввел в лабораторную практику полиакриламидный гель, который превосходит гель из крахмала при электрофоретическом разделении белков;

в течение нескольких последующих лет Орнстайн и Дэвис (Ornstain, Davis) разработали более эффективные буферные системы, что позволило проводить разделение белков с высокой степенью разрешения 1966 - Мэйзел (Mayzel) для усовершенствования разделения белков в полиакриламидном геле предложил использовать додецилсульфат натрия (ДСН-SDS) 1975 - О'Фаррел (O'Farrell) разработал систему двумерного гель-электрофореза для анализа белковых смесей. Предложенный им метод представляет собой сочетание ДСН-электрофореза белков в полиакриламидном геле и изоэлектрического фокусирования 1984 - Шварц и Кантор (Schwartz, Cantor) разработали метод электрофореза в пульсирующем электрическом поле (пульс-электрофорез), используемый для разделения очень больших молекул ДНК рует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Так осуществляется разделение во втором направлении двумерного гель-электрофореза.

Неразделенными в результате остаются только те белки, которые неразличимы как по изоэлектрической точке, так и по молекулярной массе;

такое сочетание встречается очень редко.

Используя различные методы окрашивания белков, а в случае радиоактивно меченных белков - метод радиоавтографии (см. разд. 4.5.2), можно выявить следовые количества практически всех полипептидных цепей. За один раз методом двумерного гель-электрофореза можно разделить до 2000 отдельных полипептидных цепей;

этого достаточно, чтобы выявить большинство бактериальных белков (рис. 4-52). Разрешение этого метода настолько велико, что позволяет разделить два практически идентичных белка, отличающихся одной заряженной аминокислотой.

Таблица 4-9 знакомит нас с основными этапами развития методов хроматографии и электрофореза.

Рис. 4-53. Получение пептидной карты («фингерпринта» или «отпечатков пальцев») белков. В данном случае белок расщепляли трипсином и получили смесь мелких фрагментов полипептидов. Эту смесь фракционировали в двух направлениях: электрофорезом и распределительной хроматографией. Полученная картина пятен характеризует данный белок.

4.4.6. Избирательное расщепление белка приводит к образованию характерного набора пептидных фрагментов [29] Молекулярная масса и изоэлектрическая точка - характерные параметры белка. Однако в основе точной идентификации белковой молекулы лежит определение аминокислотной последовательности. Уже на первом этапе этого процесса, включающего расщепление белка на мелкие фрагменты, можно получить значительную информацию о данном белке. В настоящее время в продаже имеются протеолитические ферменты и химические реактивы, расщепляющие белки по определенным аминокислотным остаткам (табл. 4-10). Так, фермент трипсин отщепляет остатки лизина и аргинина со стороны карбоксильных групп;

химический реактив бромистый циан расщепляет пептидные связи, расположенные после остатков метионина. Поскольку такие специфические ферменты и реактивы расщепляют в белковой молекуле ограниченное количество связей, при их воздействии образуется смесь больших пептидов. Разделив эту смесь методом электрофореза или хроматографии, можно получить пептидную карту, характеризующую исследуемый белок. Такие пептидные карты называют иногда «фингерпринтами» (отпечатками пальцев) белка (рис. 4-53).

Таблица 4-10. Некоторые реактивы, используемые для расщепления пептидных связей в белках Аминокислота 1 Аминокислота Фермент Трипсин Лизин или аргинин Любая Химотрипсин Фенилаланин, триптофан или тирозин » V8-Протеаза Глутаминовая кислота » Химический реактив Бромистый циан Метионин » 2-Нитро-5-тиоцианобензоат Любая Цистеин Указана специфичность в отношении аминокислот с каждой стороны от расщепляемой связи. После расщепления высвобождается карбоксильная группа по аминокислоте 1;

эта аминокислота расположена слева от пептидной связи при нормальном написании (см. схему 2-5).

Этот метод был разработан в 1956 г. для сравнения нормального гемоглобина с мутантной формой того же белка, обнаруживаемой в крови больных серповидноклеточной анемией. Оказалось, что мутантный белок отличается от нормального по одной-единственной аминокислоте.

Так впервые было доказано, что мутация может привести к замене в белке только одной аминокислоты.

4.4.7. С помощью автоматических приборов можно анализировать короткие аминокислотные последовательности [30] Осуществив расщепление белка на мелкие фрагменты, приступают к следующему этапу - определяют последовательность аминокислот в каждом из выделенных пептидных фрагментов. Для этого проводят серию химических реакций, которые впервые были предложены в 1967 году.

Сперва пептид обрабатывают каким-либо реактивом, взаимодействующим только со свободной аминогруппой на его N-конце. Далее этот реактив активируют, воздействуя на него слабой кислотой. Теперь он специфически расщепляет пептидную связь, соединяющую N-концевую аминокислоту с пептидной цепью;

высвобождающуяся при этом аминокислоту идентифицируют методом хроматографии. Оставшийся пептид укорачивается в результате на одну аминокислоту. Его также подвергают реакциям, проводимым в той же последовательности, - и так, пока в пептиде не будет определена каждая аминокислота.

Циклический характер этих реакций дает возможность автоматизировать весь процесс. В настоящее время выпускаются приборы (аминокислотные секвенаторы), производящие автоматическое определение последовательности аминокислот в пептидных фрагментах. На последнем этапе анализа последовательности аминокислот, полученные для пептидных фрагментов, располагают в том же порядке, как они были расположены в интактной цепи. Для этого сравнивают последовательности наборов перекрывающихся фрагментов, полученных при расщеплении одного и того же белка различными протеолитическими ферментами.

Усовершенствование техники секвенирования белка значительно повысило его скорость и чувствительность, позволяя анализировать минимальные количества образца. Например, в настоящее время последовательность из нескольких десятков аминокислот можно выяснить, имея в распоряжении всего несколько микрограммов белка - количество, извлекаемое из одной полосы ДСН-полиакриламидного геля. Это оказалось крайне важно для изучения многих минорных белков клетки, например, рецепторов стероидных или полипептидных гормонов. В настоящее время достаточно определить в белке 20 аминокислот, чтобы сконструировать ДНК-зонд, используемый для клонирования соответствующего гена (см.

разд. 5.6.5). После выделения гена оставшаяся невыясненной часть аминокислотной последовательности белка может быть реконструирована по нуклеотидной последовательности согласно генетическому коду. Это можно считать значительным достижением, поскольку даже с полной автоматизацией определение полной первичной последовательности белка остается крайне сложной задачей. Так, например, если белок состоит из 100 аминокислот, их последовательность, если очень напряженно трудиться, можно установить за месяц. Но с удлинением цепи аминокислот сложности нарастают очень быстро, что не позволяет превратить процесс определения аминокислотной последовательности в рутинную методику.

Учитывая то обстоятельство, что секвенирование ДНК - процедура более легкая и занимает меньше времени (см. ниже), в настоящее время последовательность аминокислот в большинстве белков, как правило, определяют по нуклеотидной последовательности соответствующих генов.

Заключение Клеточные популяции можно анализировать биохимически, разрушая клетки и анализируя их содержимое с помощью ультрацентрифугирования. Дальнейшее фракционирование позволяет создать функциональные бесклеточные системы;

такие системы необходимы для определения молекулярных деталей сложных клеточных процессов. Например, с помощью этого метода в недавнее время были исследованы синтез белка, репликация ДНК, сплайсинг РНК и различные типы внутриклеточного транспорта.

Мажорные белки растворимых клеточных экстрактов можно очищать с помощью колоночной хроматографии;

в зависимости от типа матрикса в колонках биологически активные белки можно разделять по их молекулярной массе, гидрофобности, характерному заряду либо сродству с иными молекулами. В ходе очистки, как правило, образец пропускают через несколько колонок - обогащенные фракции, полученные Таблица 4-11. Использование некоторых радиоактивных изотопов в биологических исследованиях Изотоп Период полураспада 1) Р 14 сут I 8,1 сут S 87 сут С 5570 лет Са 164 сут Н 12,3 года 1) Изотопы расположены в порядке уменьшения энергии испускаемых ими электронов. 131I испускает также -лучи. Период полураспада - время, в течение которого распадается 50% атомов данного изотопа.

с одной колонки, наносят на следующую. После очистки белка до гомогенного состояния проводят тщательное определение его биологической активности. Можно определить также небольшой фрагмент аминокислотной последовательности белка и клонировать его ген;

оставшуюся часть аминокислотной последовательности реконструируют по последовательности нуклеотидов в гене.

Даже если количество белка очень невелико, его молекулярную массу и субъединичный состав можно определить, используя ДСН электрофорез в ПААГ. В случае двумерного электрофореза белки разделяют на отдельные фракции изоэлектрическим фокусированием в одном направлении, после чего следует ДСН-электрофорез во втором направлении. Этот метод может быть использован для разделения тех белков, которые в норме считаются нерастворимыми.

4.5. Изучение клеточных макромолекул с помощью антител и радиоактивных изотопов Для изучения клеточных макромолекул можно использовать практически все свойства молекул - физические, химические и биологические. При биологическом исследовании молекулы внутри клеток выявляют обычно по оптическим свойствам (в чистом виде или в комплексе с красителями), а также по биохимической активности. Здесь мы рассмотрим два метода определения молекул внутри клеток: один из них включает использование радиоактивных изотопов, а другой - использование антител. Оба метода весьма эффективны для выявления определенных молекул в сложных смесях. Потенциально эти методы очень чувствительны и при оптимальных условиях дают возможность обнаруживать в образце молекулы, общее количество которых меньше 1000.

4.5.1. Методы выявления радиоактивных атомов отличаются высокой чувствительностью [31] Большинство известных природных элементов представляют собой смесь изотопов, различающихся массой атомного ядра, но имеющих, тем не менее, одинаковый набор электронов, а, следовательно, одинаковые химические свойства. Ядра радиоактивных изотопов, или радиоизотопов, нестабильны и подвергаются спонтанному распаду, образуя различные атомы. При распаде ядра испускаются заряженные частицы (например, электроны) или излучение (например, гамма-лучи).

Вследствие своей нестабильности в природе радиоизотопы встречаются редко, но в ядерных реакторах, где стабильные атомы подвергаются бомбардировке частицами высокой энергии, их образуется чрезвычайно много (табл. 4-11). В настоящее время многие биологические молекулы стали доступны в форме, содержащей радиоактивные атомы. Для регистрации излучения, испускаемого радиоактивными изотопами, используют различные подходы. Электроны (-частицы) можно определять по ионизации газа, которую они вызывают в счетчике Гейгера, или в сцинтилляционном счетчике по маленьким вспышкам света в сцинтилляционной жидкости. С помощью этих методов в биологическом образце можно выявить содержание определенного радиоактивного изотопа. Наличие радиоактивных изотопов в образце регистрируют и методом радиоавтографии (по их действию на зерна серебра в фотоэмульсии). Данный метод характеризуется очень высокой чувствительностью, и в благоприятных условиях с его помощью можно зарегистрировать практически каждый распад, т. е. может быть учтен практически каждый радиоактивный атом.

4.5.2. Радиоактивные изотопы используют для изучения перемещения молекул в клетках и в целом организме [32] Один из первых примеров использования феномена радиоактивности в биологических исследованиях - изучение превращения углерода в процессе фотосинтеза. Одноклеточные зеленые водоросли поместили в атмосферу, содержащую радиоактивно меченный СО2 (14СО2), и облучали в разные промежутки времени солнечным светом. Затем радиоактивное содержимое водорослей фракционировали с помощью хроматографии на бумаге. Небольшие молекулы, содержащие атомы 14С, происходящие из молекул СО2, выявляли на хроматограмме, помещая поверх высушенной бумажной хроматограммы лист фотопленки. Таким образом было идентифицировано большинство основных компонентов, образующихся в процессе фотосинтеза Сахаров из СО2.

Радиоактивные молекулы можно использовать для исследования практически всех внутриклеточных процессов. Для этого обычно в ходе эксперимента в культуральную среду добавляют предшественник в радиоактивной форме: при этом радиоактивные молекулы смешиваются с присутствующими в клетках нерадиоактивными. Клетка использует оба типа молекул, поскольку они отличаются только массой атомного ядра.

Изменение локализации радиоактивных молекул в клетке или их химические превращения можно проследить во времени. Чувствительность таких экспериментов во многих случаях повышают, используя метод вытеснения метки (pulse-chase). При использовании этого метода радиоактивные вещества добавляют на очень короткое время (импульсная метка), затем их удаляют и замещают нерадиоактивными молекулами. Образцы отбирают через различные промежутки времени и в каждой такой точке определяют химическую природу и локализацию химических веществ (рис.

4-54).

Значение метода радиоактивного мечения трудно переоценить. Именно этот метод дает возможность дискриминировать химически идентичные молекулы, история которых различна - например, те молекулы, которые отличаются временем синтеза. С помощью радиоактивных методов удалось определить, что почти все молекулы живой клетки постоянно разрушаются и замещаются другими молекулами. Такие медленные обменные процессы могли бы остаться незамеченными, если бы не радиоактивные изотопы.

В настоящее время промышленность производит в радиоактивной форме практически все распространенные низкомолекулярные вещества. Независимо от степени сложности биологических молекул почти каждую из них можно пометить радиоактивной меткой. Часто получают радиоактивные молекулы, в структуру которых радиоактивные атомы введены в определенных положениях. Это делают для того, чтобы получить возможность следить за независимыми превращениями, претерпеваемыми различными частями одной молекулы в ходе биологических реакций (рис. 4-55).

Рис. 4-54. Схема, иллюстрирующая суть типичного эксперимента с вытеснением импульсной метки. Буквами А, Б, и В помечены резервуары, которые соответствуют различным компартментам клетки (выявляемым с помощью радиоавтографии или в опытах, включающих фракционирование клетки) или различным химическим соединениям (выявляемым хроматографически или с помощью каких-либо иных химических методов).

Рис. 4-55. Три радиоактивные формы АТР, имеющиеся в продаже. Радиоактивные атомы выделены цветом. Приведены обозначения, с помощью которых указывается расположение и тип радиоактивных атомов.

Одна из наиболее важных областей применения радиоактивных изотопов в биологии клетки - это определение локализации радиоактивных соединений в срезах клеток или живых тканей методом радиоавтографии. При использовании этого метода живые клетки подвергают кратковременному (импульсному) мечению с последующей инкубацией в течение различных промежутков времени в нерадиоактивной среде. Затем клетки фиксируют и обрабатывают для проведения световой или электронной микроскопии. Каждый приготовленный препарат покрывают тонким слоем фотоэмульсии и оставляют на несколько дней в темноте - время, в течение которого происходит распад радиоактивного изотопа. Затем фотоэмульсию проявляют. Местоположение радиоактивных молекул в каждой клетке можно определить по расположению темных зерен серебра. Если инкубировать клетки с радиоактивным предшественником ДНК (3 Н-тимидином), то можно увидеть, что ДНК синтезируется в ядре и там же остается. И наоборот, мечение клеток радиоактивным предшественником РНК (3Н-уридином) показывает, что РНК исходно синтезируется в ядре и затем быстро накапливается в цитоплазме клеток.

4.5.3. Для выявления и выделения специфических молекул можно использовать антитела [33] Антителами называют белки, продуцируемые позвоночными животными для защиты от инфекции (см. гл. 18). Количество различных форм Рис. 4-56. А. На электронной микрофотографии периферического участка эпителиальной клетки в культуре можно различить расположение микротрубочек и других филаментов. Б. С помощью метода непрямой иммуноцитохимии тот же участок окрашен флуоресцирующими антителами к тубулину, который является мономером микротрубочек (см. рис. 4-58). Стрелками указаны отдельные микротрубочки, хорошо различимые на обеих микрофотографиях (Osborn M., Webster R., Weber К., J. Cell Biol., 77, R27-R34, 1978, воспроизводится с разрешения Rockefeller University Press.) антител достигает миллиона;

этим антитела и отличаются от прочих белков. Каждая форма антител обладает определенными участками связывания, которые предназначены для специфического узнавания молекул, стимулировавших синтез антител. Эти молекулы называют антигенами. Высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для исследования биологии клетки.

После окрашивания антител флуоресцирующими красителями их можно использовать для определения внутриклеточной локализации специфических макромолекул с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 4-56). Мечение электроноплотными микрочастицами, например, микросферами коллоидного золота, позволяет использовать антитела для локализации клеточных антигенов при помощи электронной микроскопии (рис. 4-57). Антитела могут выступать в роли биохимических звеньев для выявления и определения количества молекул в клеточных экстрактах и идентификации специфических белков после их разделения с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. При связывании антител с инертным матриксом получают аффинные колонки, пригодные для выделения и очистки специфических молекул из грубых клеточных экстрактов.

Чувствительность антител, используемых в качестве зонда для выявления специфических макромолекул в клетках и тканях, часто увеличивают с помощью метода усиления сигнала. Например, такую маркерную молекулу как флуоресцирующий краситель можно прямо связывать с антителами и использовать для непосредственного определения антигена (первые антитела). Еще большего усиления сигнала можно добиться, применяя немеченые первые антитела и затем выявляя их с помощью меченых вторых антител, связывающихся с первыми антителами (рис. 4-58, А).

Еще одна система усиления сигнала основана на исключительно высоком сродстве биотина (низкомолекулярного растворимого витамина) к стрептавидину (бактериальному белку). При ковалентном связывании первых антител с биотипом можно прямо пометить стрептавидин маркером и использовать его вместо вторых антител. Стрептавидин также можно применять для связывания отдельных молекул антител, меченных биотином, с разветвленной сетью молекул, меченных биотином (рис. 4-58, Б). Такие сети получают вследствие модификации метода (рис. 4-58, А) за счет применения третьего слоя антител.

Рис. 4-57. Иммуноцитохимическая локализация специфических белковых молекул на электронных микрофотографиях с помощью мечения антителами, связанными с частицами коллоидного золота. Показан тонкий срез клетки, секретирующей инсулин, где молекулы инсулина помечены антиинсулиновыми антителами, связанными с мельчайшими микросферами золота (каждая в виде черной точки). Большая часть инсулина накапливается в плотном содержимом секреторных гранул;

кроме того, содержимое некоторых секреторных гранул деградирует в лизосомах. (L. Orri, Diabetology, 28, 528-546,1985.) Рис. 4-58. Применение антител для выявления определенных молекул с высокой чувствительностью. А. Иллюстрация метода непрямой иммуноцитохимии, высокая чувствительность которого определяется тем, что первое антитело (так называют молекулу антитела непосредственно связывающуюся с узнаваемой молекулой антигена) опознается многими молекулами антител второго типа. Эти вторые антитела предварительно связаны с маркерными молекулами, что и позволяет их регистрировать. В качестве маркерных молекул используют красители флуоресцеин и родамин (для флуоресцентной микроскопии), фермент щелочную пероксидазу (для электронной и светлопольной микроскопии), белок ферритин, содержащий железо, или микросферы коллоидного золота (для электронной микроскопии) и фермент щелочную фосфатазу (для биохимической детекции). Б. Модификация метода, представленного на А: вместо вторых антител используют взаимодействие биотина и стрептавидина, характеризуемое высоким сродством. Поскольку каждая из молекул стрептавидина может связать четыре молекулы биотина, она соединяет множество биотинилированных маркерных молекул поперечными сшивками с образованием громадной трехмерной сети. Внизу представлен особенно чувствительный метод «сандвича», где такие сети используются для интенсивного мечения каждой из молекул первых антител.

В наиболее чувствительных методах усиления сигнала в качестве маркерной молекулы используется фермент. Например, щелочная фосфатаза участвует в реакции образования неорганического фосфата, и поэтому связывание фермента со вторым антителом позволяет использовать чувствительный химический тест на фосфат для выявления комплекса антитело - антиген. Поскольку такая ферментная молекула вследствие своих каталитических свойств образует многие тысячи молекул продукта реакции, метод иммунодетекции с применением связанной формы фермента (Enzyme-Linked Immunoassay - ELISA) дает возможность обнаружить минимальное количество антигена. Данный метод хорошо зарекомендовал себя в клинической медицине для диагностики различных типов инфекций.

Обычно антитела извлекают из сыворотки, обогащенной антителами, которую получают путем многократного введения антигена животным (например, кролику или козе). Эта антисыворотка содержит гетерогенную смесь антител, каждый тип которых был образован определенными клетками, синтезирующими антитела (В-лимфоцитами). Различные антитела опознают различные части молекулы антигена, а также примеси в препарате антигена. Иногда специфичность антисыворотки к различным антигенам можно повысить, удалив молекулы нежелательных антител, которые связываются другими молекулами. Например, антисыворотку, полученную к белку X, можно пропустить через аффинную колонку с антигенами Y и Z и удалить таким образом все загрязняющие анти-Y и анти-Z антитела. Однако даже в этом случае сыворотка гетерогенна, что ограничивает ее применение.

4.5.4. Клеточные линии гибридом служат источником моноклональных антител [34] Проблему гетерогенности антисыворотки удалось преодолеть в 1976 г. после разработки нового метода, который произвел революцию в исследовании внутриклеточных процессов с помощью антител. Этот метод включает клонирование В-лимфоцитов, секретирующих только один определенный тип антител, что обеспечивает получение однородных антител в большом количестве. Время жизни В-лимфоцитов в культуре обычно весьма ограничено. Поэтому от иммунизированных мышей получают В-лимфоциты, секретирующие отдельные виды антител, и осуществляют их слияние с «бессмертными» клетками из опухоли В-лимфоцитарного происхождения. В результате образуется гетерогенная смесь гибридных клеток, из которых отбирают гибриды, способные размножаться в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Эти так называемые гибридомы клонируют по отдельности и получают клоны, каждый из которых является постоянным источником моноклональных антител одного типа (рис. 4-59).

Рис. 4-59. Схема получения гибридных клеток, или «гибридом», синтезирующих гомогенные моноклональные антитела против определенного антигена (X). Использованная для роста клеток селективная среда содержит ингибитор (аминоптерин), блокирующий нормальные пути биосинтеза нуклеотидов. Поэтому для синтеза нуклеиновых кислот клеткам приходится использовать обходной путь (шунт) биосинтеза. Но именно этот шунт нарушен у мутантных клеток, использованных для слияния с нормальными В-лимфоцитами. Поскольку ни одна из взятых для опыта клеточных линий в этой среде размножаться не может, в ней выживают только гибридные клетки.

Моноклональные антитела продуцируются В-лимфоцитами одного клона, т.е. клетками, ведущими свое начало от одной-единственной клетки. Поэтому все молекулы антител данного вида обладают одинаковой специфичностью связывания антигенов. Один такой участок может опознавать, например, определенную конформацию отдельной группы из 5-6 аминокислот боковой цепи белковой молекулы и такое же количество остатков Сахаров в полисахариде. Благодаря своей строгой специфичности моноклональные антитела имеют значительное преимущество по сравнению с обычной антисывороткой, которая, как правило, содержит антитела, опознающие множество различных участков-антигенов даже в сравнительно небольшой макромолекуле.

Основное преимущество метода гибридом определяется возможностью получения моноклональных антител против неочищенных молекул, содержащихся в сложной смеси в качестве минорного компонента. Это преимущество обеспечивается реальностью выбора индивидуальных гибридом, образующих антитела определенного вида, из сложной смеси различных гибридных клеток, продуцирующих множество разных антител. Таким образом в принципе можно получить моноклональные антитела против любого белка, содержащегося в клетке.

Каждый тип антител можно затем использовать в качестве специфического зонда как для локализации белков с помощью цитологических методов, так и для очистки белков. Получив белки в чистом виде, мы можем исследовать их структуру и функцию. К настоящему времени выделено не более 5% из 1000 или более различных белков, которые, судя по имеющимся данным, содержатся в типичной клетке млекопитающих. Использование моноклональных антител и технологии клонирования генов (см. ниже) снимает многие сложности в идентификации и определении новых белков и генов. Проблемой для исследователей остается определение их функций.

4.5.5. Антитела и другие макромолекулы можно инъецировать в живые клетки [35] Молекулы антител можно использовать для определения функции тех молекул, с которыми они связываются. Например, у новорожденных крыс, получивших антитела к белковому фактору, который стимулирует рост нейронов, не развиваются нервные клетки определенного типа, нуждающиеся для выживания в данном факторе роста. Подобным образом антитела, реагирующие с молекулами на поверхности некоторых типов клеток, можно использовать для уничтожения этих клеток;

специфически удаляя клетки определенного типа из смешанной клеточной популяции, можно определить важность клеток этого типа для осуществления различных биологических функций.

Поскольку плазматическая мембрана клеток непроницаема для крупных молекул, белки, расположенные внутри живых клеток, не могут взаимодействовать с антителами, добавляемыми извне. Если такие белки необходимо связать, в цитоплазму клеток эукариот можно ввести антитела и другие молекулы, инъецируя их тонкой стеклянной пипеткой через плазматическую мембрану. Прокалываемая плазматическая мембрана имеет способность «самозапаиваться» спустя некоторое время после инъекции. С помощью этого метода было установлено, что при введении в оплодотворенное яйцо морского ежа антител к миозину, его деление останавливается, хотя деление ядер происходит нормально. Отсюда следует, что миозин выполняет ключевую роль в процессах сокращения, обеспечивающих деление цитоплазмы при митозе, но не принимает участия в работе митотического веретена. Моноклональные антитела обладают высокой специфичностью, их нетрудно получить в концентрированной форме, и поэтому они особенно удобны для проведения таких исследований.

Заключение В клетке можно пометить любые молекулы: для этого в них вводят один или несколько радиоактивных атомов. Нестабильные радиоактивные атомы распадаются, испуская излучение, что позволяет прослеживать судьбу исследуемых молекул. Применение радиоизотопов в клеточной биологии ограничено двумя видами экспериментов: анализ метаболических путей по методу вытеснения метки и локализацией меченых молекул в клетке с помощью радиоавтографии. Антитела представляют собой очень удобный и чувствительный инструмент для локализации специфических биологических макромолекул. В организме позвоночных животных продуцируются миллионы различных антител, в каждом из которых имеются участки связывания, опознающие специфические группы молекул. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью практически в неограниченных количествах. В принципе можно получать моноклональные антитела против любых макромолекул в клетке и затем использовать эти антитела для локализации или очистки определенных макромолекул, а в некоторых случаях и для анализа внутриклеточных свойств этих молекул.

4.6. Технология рекомбинантных ДНК [36] Основная проблема молекулярной биологии на сегодняшний день состоит в том, чтобы разобраться в тонких механизмах клеточных процессов. Мы обсудили несколько чувствительных методов очистки, анализа белков и слежения за ними в клетках. Этот последний раздел посвящен методам изучения структуры и функции клеточных ДНК. Классический подход подразумевает использование генетических методов, позволяющих судить о функции генов, анализируя фенотипы мутантных организмов и их потомства. Этот подход по-прежнему эффективен, но в последнее время он дополнен набором методов, которые в сумме известны как «технология рекомбинантных ДНК». Эти методы существенно расширили возможности генетических исследований, поскольку с их помощью удается проводить как прямой контроль, так и детальный химический анализ генетического материала. Используя методологию рекомбинантных ДНК, удается даже минорные клеточные белки получать в больших количествах и, следовательно, проводить тонкие биохимические исследования структуры и функции белка.

4.6.1. Технология рекомбинантных ДНК революционизировала клеточную биологию [37] Еще не так давно, всего лишь в начале 70-х годов биохимики считали, что ДНК является наиболее сложным для исследования компонентом клетки. Чрезвычайно длинную, химически монотонную последовательность нуклеотидов в наследственном материале тогда можно было исследовать лишь с помощью косвенных методов - либо определяя структуру белка или РНК, либо с помощью генетического анализа. В настоящее время ситуация крайне изменилась. Если ранее анализ ДНК представлялся исследователям структуры биологических молекул крайне трудной задачей, то теперь, когда были разработаны новые методы анализа первичной структуры ДНК, такой анализ не составляет особого труда. В настоящее время можно вырезать отдельные участки ДНК, получать их практически в неограниченном количестве и определять последовательность нуклеотидов по нескольку сот нуклеотидов в день.

С помощью этих же методов можно по желанию экспериментатора изменить выделенный ген и ввести его вновь в геном культивируемых клеток или эмбрион животного (что несколько более сложно), где этот измененный ген начинает функционировать.

Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное воздействие на всю клеточную биологию, позволяя исследователям решать задачи, которые раньше казались неразрешимыми, например определять функции многих вновь открытых белков и их индивидуальных доменов, расшифровывать сложные механизмы регуляции экспрессии генов у эукариот. С помощью методов генной инженерии удалось в большом количестве получить многие белки, участвующие в регуляции клеточной пролиферации и развитии. Применение этих методов должно принести успех в крупномасштабном промышленном производстве белковых гормонов и искусственных вакцин, на получение которых ранее затрачивали очень много сил и средств.

Технология рекомбинантных ДНК включает в себя набор методов - как новых, так и заимствованных из других дисциплин, например из генетики микроорганизмов (табл. 4-12). Наиболее важные среди них это:

1) специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, что существенно ускоряет выделение и манипуляции с различными генами;

2) быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить точные границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

3) гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большой точностью и чувствительностью на основании их способности связывать комплементарные последовательности нуклеи- Таблица 4-12. Основные вехи в развитии технологии рекомбинантных ДНК 1869 - Мишер (Miesher) впервые выделил ДНК 1944 - Эвери (Avery) установил, что ДНК, а не белок, переносит генетическую информацию при трансформации бактерий 1953- Уотсон и Крик (Watson, Crick) предложили модель двойной спирали ДНК, основанную на результатах рентгеноструктурного анализа, проведенного Франклин и Уилкинсом (Franklin, Wilkins) 1961 - Мармур и Доти (Marmur, Doty) открыли явление ренатурации ДНК, установив точность и специфичность реакции гибридизации нуклеиновых кислот 1962 - Арбер (Arber) впервые получил данные о существовании ферментов рестрикции ДНК, впоследствии выделенных и использованных для определения последовательности ДНК Натансом и Смитом (Nathans, Smith) 1966 - Ниренберг, Очоа и Корана (Nirenberg, Ochoa, Khorana) расшифровали генетический код 1967 - Геллерт (Gellert) открыл ДНК- лигазу - фермент, используемый для сшивания фрагментов ДНК 1972-73 - В лабораториях Бойера, Коэна и Берга (Boyer, Cohen, Berg) и их коллег в Станфордском университете и в Калифорнийском университете в Сан-Франциско была разработана технология клонирования ДНК 1975-77 - Сэнгер и Баррел (Sanger, Barrel), а также Максам и Гилберт (Махат, Gilbert) разработали методы быстрого определения нуклеотидной последовательности 1981-82 - Пальмитер и Бринстер (Palmiter, Brinster) получили трансгенную мышь;

Спрэдлинг и Рубин (Spradling, Rubin) получили трансгенные экземпляры дрозофилы новых кислот;

4) клонирование ДНК: интересующий исследователя ДНК-фрагмент вводят в самореплицирующийся генетический элемент (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации воспроизводит этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий;

5) генетическая инженерия, посредством которой последовательности ДНК изменяют с целью создания модифицированных версий генов, которые затем вновь внедряют в клетки или организмы.

Для того чтобы разобраться в технологии рекомбинантных ДНК, необходимо очень хорошо понимать природные механизмы, используемые клетками для репликации и расшифровки ДНК. Мы поэтому отложим детальное обсуждение клонирования генов и генетической инженерии. В гл. 5 эти вопросы будут разобраны после знакомства читателей с основными генетическими механизмами.

4.6.2. Рестрицирующие нуклеазы расщепляют ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей [38] Для защиты от молекул чужеродных ДНК, способных проникнуть в клетку и вызвать ее трансформацию, многие бактерии вырабатывают ферменты рестрицирующие нуклеазы, способные разрушить чужеродную ДНК. Каждый такой фермент опознает в ДНК специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Соответствующие последовательности в геноме самих бактерий замаскированы метилированием остатков А и С, но любая чужеродная молекула ДНК, попав в клетку, немедленно опознается нуклеазой, и обе цепи ее ДНК разрезаются (рис. 4-60). Из различных видов бактерий было выделено множество рестрицирующих нуклеаз. В настоящее время различными фирмами производится более таких ферментов, большинство из которых опознает различные последовательности нуклеотидов.

Индивидуальная рестрицирующая нуклеаза способна разрезать двойную спираль ДНК любой длины с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными фрагментами (рестриктами). Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного участка генома набором рестрицирующих нуклеаз, позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других рестрикционных участков (рис. 4-61) Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке, сравнение таких карт для двух или более родственных генов позволяет приближенно оценить гомологию между ними. Отсюда следует, что можно проводить сравнение различных участков ДНК (сравнивая их рестрикционные Рис. 4-60. Последовательность нуклеотидов в ДНК, узнаваемая тремя широко используемыми рестрицирующими нуклеазами (участки узнавания).

Такие последовательности часто содержат шесть нуклеотидов и являются «палиндромными», т. е. последовательности нуклеотидов в них в обоих направлениях читаются одинаково. Две цепи ДНК разрезаются в участке узнавания или вблизи от него, причем во многих случаях разрез проходит через обе цепи не перпендикулярно, т. е. в одном месте, а наискосок, образуя в результате липкие концы, например Eco R1 или Hind III.

Рестрицирующие нуклеазы получают из различных бактерий: HpaI - из Haemophilus parainfluenzae, Eco Rl - из Escherichia coli, Hind III - из Haemophilus influenzae.

Рис. 4-61. Простой пример, иллюстрирующий взаимное расположение на двойной спирали ДНК участков узнавания для различных рестрицирующих нуклеаз (именуемых также «сайтами рестрикции»), совокупность которых образует рестрикционную карту.

Заключение: фермент А расщепляет вблизи одного из концов молекулы. Фермент Б должен расщеплять вблизи того же конца либо вблизи другого конца. Размеры фрагментов, образующихся при расщеплении 2 ферментами исключают первое предположение и позволяют установить порядок сайтов рестрикции, указанный ниже Рис. 4-62. Рестрикционная карта в кластере генов, кодирующих гемоглобин человека и различных приматов. Два окрашенных квадрата в каждой карте показывают положение участка, соответствующего гену глобина. Каждая буква указывает участок, расщепляемый различными рестрицирующими нуклеазами. Положение сайтов разреза определяли сравнением размеров фрагментов ДНК, образующихся при обработке ДНК различными рестрицирующими нуклеазами в отдельности и в различных сочетаниях. (С любезного разрешения Elisabeth Zimmer, Alan Wilson.) карты) без определения их нуклеотидной последовательности. Например, сравнение рестрикционных карт, указанных на рис. 4-62, привело к выводу, что хромосомные участки, кодирующие цепи глобина у человека, орангутана и шимпанзе, сохранились практически в неизменном виде в течение последних 5-10 млн. лет, т.е. с тех пор, как эти виды дивергировали. Рестрикционные карты также важны для клонирования ДНК и генной инженерии;

они позволяют локализовать ген на данном рестрикционном фрагменте. Объяснение этому вы найдете ниже.

4.6.3. Клонирование ДНК позволяет получать любые последовательности ДНК в большом количестве [39] Многие рестрицирующие нуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, так что на концах фрагментов образуются короткие одноцепочечные участки. Эти одноцепочечные концевые участки обладают способностью образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента, и потому их называют липкими концами (рис. 4-63). Липкие концы, образованные рестрикционными ферментами, позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК воедино при условии, что эти фрагменты образовались после действия одной и той же рестрицирующей нуклеазы (рестриктазы) (либо иной нуклеазы, которая создает такие же липкие концы). Таким образом, фрагмент ДНК любого происхождения можно встроить в очищенную ДНК автореплицирующегося генетического элемента, которым, как правило, является плазмида или бактериальный вирус. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду или вирус, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента ДНК. Исходный фрагмент может происходить прямо из геномной ДНК, или из кДНК (комплементарной ДНК), т. е. из ДНК, полученной копированием матричной РНК. Эти методы детально обсуждаются в гл. 5.

Первый этап получения клонов геномной ДНК обычно включает выделение ДНК и ее расщепление рестриктазой. При этом возникает громадное количество различных фрагментов ДНК, например, в случае Рис. 4-63. Многие виды рестрицирующих нуклеаз позволяют получать фрагменты ДНК с липкими (одноцепочечными) концами. Фрагменты ДНК, обладающие такими концами, соединяются с помощью комплементарного взаимодействия пар оснований в области липких концов, как показано на схеме. Два фрагмента ДНК, объединяющиеся здесь, были получены с помощью рестрицирующей нуклеазы Eco R1 (см. рис. 4-60).

генома млекопитающих образуется от 105 до 107 фрагментов. В процессе клонирования исследователь получает миллионы клеточных колоний (клонов), большая часть которых содержит различные фрагменты ДНК. Наиболее сложным этапом клонирования является выявление именно того клона, который содержит нужный фрагмент ДНК.

Получение клонов кДНК начинается с выделения мРНК из клеток, Эта мРНК затем используется в качестве матрицы для обратной транскриптазы, фермента, синтезируемого определенными вирусами, ДНК которых возникает в процессе копирования последовательности РНК (процесс обратный по сравнению с обычным процессом копирования, в котором РНК синтезируется с ДНК-матрицы). Фермент создает ДНК-копию (кДНК) каждой из представленных молекул РНК. Эти одноцепочечные молекулы ДНК затем превращаются в двухцепочечные (см. разд. 5.6.3). Их клонируют с помощью методов, подобных тем, что были использованы для клонирования фрагментов геномной ДНК.

Следует иметь в виду, что существует принципиальное различие между геномными и кДНК-клонами, которое объясняется, в частности, характерным для высших эукариот процессом сплайсинга (см. разд. 9.4.8). По всей вероятности, именно клоны кДНК содержат непрерывные участки нуклеотидной последовательности, кодирующей белки.

4.6.4. Метод гель-электрофореза позволяет быстро фракционировать молекулы ДНК разного размера [40] В начале 70-х годов было показано, что с помощью методов гель-электрофореза, которые оказались столь полезными для анализа белковых цепей, можно точно определить длину и чистоту молекул ДНК. Этот метод гораздо проще, чем модификация, используемая для белков;

Рис. 4-64. Гель-электрофорез является мощным методом разделения молекул ДНК по их размерам. В трех указанных примерах электрофорез проводили сверху вниз, так что более крупные молекулы ДНК находятся в верхней части геля. А. Мелкопористый полиакриламидный гель был использован для фракционирования отдельных цепей ДНК. В диапазоне размеров от 10 до нуклеотидов можно делить молекулы ДНК, отличающиеся лишь одним нуклеотидом. В этом случае на дорожки 1-4 нанесены продукты четырех независимых реакций секвенирования ДНК, где на концах цепи присутствуют дидезоксирибонуклеотиды G, А, Т и С (в скобках см. рис. 4-68);

так как в этих реакциях используют молекулы ДНК, предварительно меченные радиоизотопами, расположение этих радиоизотопов можно выявить радиоавтографически, как указано на рисунке. Б. Среднепористый агарозный гель используется для разделения двухцепочечных молекул ДНК. Этот метод наиболее удобен для разделения молекул длиной от 300 до 5000 пар нуклеотидов. Именно такую длину имеет рестрикционные фрагменты бактериофага, выявляемые по флуоресценции после окраски бромистым этидием. В. Метод пульс-электрофореза в агарозном геле использован для разделения различных хромосом дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), размеры которых варьируют от 220000 до 2500000 пар нуклеотидов. В этих гелях можно разделять молекулы длиной до 107 пар нуклеотидов. (А - с разрешения Linder Laufer, Peter Walter;

Б - с разрешения Ken Kreutzer, В - с разрешения D. Wolrath, A.W. Davies - Nucl. Acid Res., 15, 7876, 1988.) каждый нуклеотид в молекуле нуклеиновой кислоты уже обладает отрицательным зарядом, и поэтому нет необходимости добавлять отрицательно заряженный детергент ДСН, который «заставляет» белковые молекулы двигаться к положительному электроду. Были разработаны специальные полиакриламидные гели, с помощью которых удается разделить фрагменты ДНК длиной до 500 нуклеотидов, отличающиеся даже на один нуклеотид (рис. 4-64, А). К сожалению, поры в полиакриламидном геле для больших ДНК слишком малы, для их разделения по размеру были разработаны специальные гели на основе агарозы (полисахарид, выделяемый из морских водорослей) (рис. 4-64, Б). Оба этих метода разделения ДНК широко используются для аналитических и препаративных целей.

Недавно была предложена модификация гель-электрофореза в агарозном геле, названная электрофорез в пульсирующем электрическом поле или пульс-электрофорез. С ее помощью удается разделять очень большие, можно сказать громадные молекулы ДНК. Обычный гель электрофорез не позволяет разделить такие молекулы ввиду постоянства электрического поля, которое придает молекулам змеевидную конфигурацию. Обладающие такой конфигурацией молекулы движутся в гелях с постоянной скоростью вне зависимости от длины молекул. Если же направление электрического поля будет часто меняться, скорость движения молекул будет определяться их способностью переориентироваться согласно этому изменению. Такой процесс у больших молекул занимает значительно больше времени, вследствие чего они будут отставать. На гелях после пульс-электрофореза целые хромосомы бактерий или дрожжей выявляются в виде отдельных полос (рис. 4-64, В), и поэтому можно легко определить хромосомные перестройки. Более того, используя гибридизацию молекул клонированной ДНК данного геля для поиска комплементарных последовательностей в геле, удалось картировать множество генов у дрожжей (см. разд. 4.6.8).

Если не произвести мечение или окраску ДНК, полосы в агарозных или полиакриламидных гелях останутся невидимыми. Один из самых эффективных методов окраски ДНК состоит в выдерживании геля после электрофореза в растворе красителя бромистого этидия, который флуоресцирует под ультрафиолетовым светом после связывания с ДНК (рис. 4-64, Б и В). Еще более чувствительный метод детекции основан на включении радиоизотопов в молекулы ДНК до электрофореза;

для этого обычно используют 32Р, который включается в фосфаты ДНК и испускает -частицу достаточно высокой энергии, чтобы её можно было выявить с помощью метода радиоавтографии (рис. 4-64, A).

4.6.5. Очищенные молекулы ДНК можно метить радиоизотопами in vitro [41] Для мечения очищенных молекул ДНК радиоизотопами широко используются два метода. В первом случае в молекулу ДНК с помощью ДНК-полимеразы I E coli вводят радиоактивно меченные нуклеотиды (рис. 4-65, А). При этом получают радиоактивные «ДНК-зонды», используемые в реакциях гибридизации нуклеиновых кислот (см. ниже). Во втором методе фермент полинуклеотидкиназа из бактериофага используется для переноса отдельных фосфатов, меченных 32Р, с АТР на 5 '-конец каждой из цепей ДНК (рис. 4-65, Б). Поскольку каждая из цепей ДНК метится с помощью киназы только одним атомом 32 Р, молекулы ДНК обычно недостаточно радиоактивны, чтобы использоваться в качестве зондов ДНК;

однако то, что помеченными цепи ДНК оказываются только по одному концу, делает их очень удобными для секвенирования и «футпринтирования», что будет обсуждаться ниже.

4.6.6. Выделенные фрагменты ДНК можно легко секвенировать [42] В конце 70-х годов были разработаны методы для простого и быстрого определения последовательности нуклеотидов (секвенирования) любых очищенных фрагментов ДНК. Вслед за этим были определены полные последовательности нуклеотидов многих генов млекопитающих, включая гены, кодирующие гемоглобин, инсулин и цитохром с. Объем информации о последовательностях ДНК столь велик (многие миллионы нуклеотидов), что для хранения и анализа имеющихся данных необходимо использовать компьютеры. Секвенировано несколько протяженных последовательностей ДНК, содержащих более 105 пар нуклеотидов;

среди них полный геном вируса Эпштейна-Барр (вызывающего у человека инфекционный мононуклеоз), а также полный геном хлоропластов растений. В настоящее время широко используются два различных метода секвенирования ДНК;

принципы, лежащие в основе химического метода иллюстрированы рис. 4-66 и 4-67, ферментативный метод объясняется на рис. 4-68.

Эти методы настолько быстры и надежны, что, когда перед исследователем стоит задача выяснения последовательности аминокислот в белке, оказывается целесообразным провести секвенирование соответствующего гена и реконструировать последовательность аминокислот на основании генетического кода. Хотя считывание любой ДНК может происходить в принципе с шестью различными рамками считывания (по три в каждой цепи), истинную рамку считывания определяют по следующему свойству: обычно это единственная рамка считывания, в которой стоп кодоны встречаются редко (см. разд. 5.1.6). Чтобы убедиться в том, что выводя последовательность аминокислот в белке из последовательности нуклеотидов в соответствующем гене, мы не ошиблись.

Рис. 4-65. Два ферментативных метода, используемые обычно для получения радиоактивных молекул ДНК. А, ДНК-полимеразой I метят все нуклеотиды в молекуле ДНК, что позволяет получить высокорадиоактивные ДНК-зонды. Б. Полинуклеотид-киназа метит только 5'-концы ДНК.

Если мечение ДНК сочетают с обработкой рестрикционной нуклеазой, как указано на рисунке, фракция молекул ДНК, содержащих меченные по 5' концу отдельные цепи, может быть довольно легко зарегистрирована.

Рис. 4-66. Семейство меченных по 5'-концу фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции по определенному нуклеотиду (в данном случае основание А). Анализируемая цепь ДНК - продукт денатурации двухцепочечной молекулы, выделенной с помощью метода, описанного на рис. 4 65, Б. Эту цепь подвергли мягкой химической обработке, удаляющей из цепи некоторое количество одного из четырех нуклеотидов;

при этом большинство таких нуклеотидов остаются в цепи. Поскольку только фрагменты, указанные на рисунке слева, содержат 5'-конец и 32Р-фосфатную группу на ней, именно эти фрагменты регистрируются после радиоавтографии геля. Данная процедура лежит в основе химического метода секвенирования ДНК, описанного на рис. 4-67.

следует прямо секвенировать небольшой участок аминокислотной последовательности в очищенном белке.

Модификация метода секвенирования ДНК, представленная на рис. 4-66 и 4-67, может быть использована для выявления в ДНК последовательностей, опознаваемых ДНК-связывающими белками. Связывание этих белков с регуляторными участками ДНК (которые обычно локализованы вне кодирующих участков генов), по-видимому, играет важную роль в определении того - какие именно гены активны в данном типе клеток. Понимание функции этих белков чрезвычайно важно для идентификации специфических последовательностей, с которыми они связываются. Для выявления таких последовательностей обычно используют метод, именуемый ДНК-футпринтинг. Сперва очищенный фрагмент ДНК метят по одному концу 32Р и затем расщепляют с помощью нуклеазы или химического соединения, делающего случайные разрезы в двойной спирали ДНК. Фрагменты, которые образуются из меченой цепи, разделяют на геле и выявляют на радиоавтографе;

после этого сравнивают расположение полос ДНК, образуемых в присутствии и в отсутствие ДНК-связывающих белков. Если связывание произошло, нуклеотиды в сайте расщепления оказываются защищен- Рис. 4-67. Химический метод секвенирования ДНК. Процедура, описанная на рис. 4-66, выполняется одновременно для четырех одинаковых проб ДНК. При этом используют химические агенты, расщепляющие ДНК в первом случае по Т, во втором по С, в третьем по G и четвертом по А.

Полученные образцы подвергают электрофорезу на параллельных дорожках одного геля, как это указано на рис. 4-64, А. Анализируя результаты электрофореза, можно определить последовательность ДНК. Так, первая снизу полоса соответствует нуклеотиду, расположенному на 5'-конце. При этом определяют, на какой из дорожек расположена полоса, - в данном случае это Т. Для определения полной последовательности эту же процедуру выполняют на уровне второй, затем третьей полосы и так далее. В данном случае метод идеализирован;

на самом деле химическая обработка менее специфична, чем указано здесь.

Молекулы, оканчивающиеся каждым из дидезоксирибонуклеотидов, выявляют в виде окрашенных полос по соответствующим окрашенным затравкам. Таким образом можно прямо прочесть последовательность цепи комплементарной ДНК по мере прохождения детектором полос А Рис. 4-68. Метод секвенирования нуклеиновых кислот, основанный на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего цепь. Ключевым для этого метода является использование дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов, в которых дезоксирибоза-3'-ОН, представленная в нормальных нуклеотидах, в данном случае отсутствует;

внедряясь в цепь ДНК, такой модифицированный нуклеозид блокирует присоединение следующего нуклеозида. А. Синтез in vitro молекулы ДНК в присутствии затравки, а также небольшого количества одного из таких модифицированных нуклеозидов приводит к образованию «лесенки» фрагментов ДНК, представленных на рис. 4-66. Если для получения таких фрагментов применяют радиоактивную ДНК, проводят четыре различные реакции синтеза, каждая из которых использует различные нуклеозиды, терминирующие цепь, а электрофоретический анализ проводят на четырех параллельных дорожках геля, можно определить последовательность нуклеотидов в ДНК (см.

рис. 4-67, а также рис. 4-64, А). Б. Более современная модификация метода, в которой четыре набора фрагментов, меченные различным образом, автоматически анализируются по флуоресценции в процессе движения по одной дорожке геля.

Рис. 4-69. Метод футпринтирования ДНК. А. Белок плотно связывается со специфическим участком ДНК из восьми нуклеотидов и защищает его от расщепляющего агента. Если реакция выполняется без белка, связывающегося с ДНК, на геле проявится полный набор полос (не указано). Б.

Реальный футпринт, использованный для определения участка связывания для белка человека, стимулирующего транскрипцию некоторых генов эукариот. Из результатов следует, что данный сайт расположен за 60 нуклеотидов до сайта инициации синтеза РНК. В качестве расщепляющего агента использовали низкомолекулярное железосодержащее органическое вещество. Это вещество в норме расщепляет каждую из фосфодиэфирных связей практически с равной частотой. (Б - с разрешения Michelle Savadogo, Robert Roeder.) ными от действия нуклеазы. В результате меченые фрагменты, содержащие участок нуклеазы. В результате меченые фрагменты, содержащие участок связывания, отсутствуют, и на геле возникает промежуток, не содержащий фрагментов ДНК, именуемый «футпринт», или «отпечаток ноги» (рис. 4-69, А). На рис. 4-69, Б представлен футпринт белков, активируют их транскрипцию эукариот.

4.6.7. Реакция гибридизации нуклеиновых кислот - чувствительный метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов [43] Если водный раствор ДНК нагреть до 100°С и сильно защелочить (рН 13), то комплементарные пары оснований, удерживающие две цепи двойной спирали вместе, разрушатся и ДНК быстро диссоциирует на две цепи. Этот процесс, называемый денатурацией ДНК, ранее считала необратимым. Однако в 1961 году было обнаружено, что если комплементарные цепи ДНК выдержать при температуре 65 °С, они легко спариваются, восстанавливая структуру двойной спирали (процесс, получивший название ренатурации или гибридизации). Подобные процессы гибридизации могут происходить между двумя любыми одинарными цепями нуклеиновых кислот (ДНК—ДНК, РНК—РНК, ДНК—РНК;

при условии, что они содержат комплементарные последовательности нуклеотидов.

Скорость формирования двойной спирали лимитируется вероятностью столкновения двух комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот, что в свою очередь определяется их концентрацией в растворе. Скорость гибридизации может быть использована для определения концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие последовательности нуклеиновых кислот.

Для этого теста необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к той последовательности, которую нужно обнаружить. Этот фрагмент ДНК можно получить клонированием, а если последовательность короткая, ее можно синтезировать химическими методами. В любом случае фрагмент ДНК интенсивно метят 32 Р (см. рис. 4-65) с тем, чтобы можно было следить за включением этой молекулы в состав дуплексов в процессе реакции гибридизации, Одноцепочечная молекула ДНК, используемая здесь в качестве индикатора, называется ДНК зонд;

она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов.

Реакция гибридизации с использованием ДНК-зондов настолько чувствительна и избирательна, что с ее помощью можно идентифицировать последовательности, присутствующие в концентрации 1 молекула на клетку (рис. 4-70). Это позволяет определить, какое количество копий последовательности ДНК, комплементарной ДНК-зонду, присутствует в геноме клетки. Этот же метод весьма эффективен для поиска неидентичных, но родственных генов;

например, после клонирования интересующих исследователя генов мыши или курицы, их последовательности могут быть использованы для поиска соответствующих генов в геноме человека.

ДНК-зонды применяют и в реакциях гибридизации с РНК до выявления экспрессии данного гена в клетках. В этом случае ДНК-зонд, содержащий часть последовательности гена, пытаются гибридизовать с РНК, выделенной из анализируемой клетки. Если гибридизация происходит, проводят количественное определение экспрессии. Более усовершенствованные методики предполагают обработку ДНК-зонда специфическими нуклеазами для обнаружения участков, гибридизующих с клеточной РНК. Таким образом можно определить начальные и концевые участки транскриптов РНК (рис. 4-71);

этот же метод может быть полезен для выяснения точных границ участков, вырезаемых из транскриптов РНК в процессе сплайсинга РНК.

В процессе развития эмбриона происходит включение и выключение больших групп генов и этот процесс скоординирован. Гибридизация ДНК-зонда с клеточными РНК позволяет ответить на вопрос, работает или молчит определенный ген;

более того, при изменении уровня экспрессии гена можно узнать, зависит ли это изменение от контроля, Рис. 4-70. Измерение количества копий определенного гена в образце ДНК с помощью гибридизации ДНК. Одноцепочечный радиоактивный фрагмент ДНК, используемый в таких экспериментах, называют ДНК-зондом. Хромосомная ДНК в данном случае не содержит радиоактивных атомов.

Рис. 4-71. Использование гибридизации нуклеиновых кислот для определения участка клонированного фрагмента ДНК, который транскрибируется в мРНК. Данный метод предполагает обработку нуклеазой, расщепляющей цепи ДНК, не спаренные с комплементарной цепью РНК. Этот метод позволяет точно выявлять начало и конец молекулы РНК. Аналогичные процедуры эффективны и для определения расположения нитронов (некодирующих последовательностей эукариотических генов).

действующего на уровне транскрипции ДНК, сплайсинга РНК или же трансляции зрелых молекул мРНК в белок. Методы гибридизации в современной клеточной биологии используются настолько широко, что даже трудно представить, как можно было бы без них изучать структуру генов и их экспрессию.

4.6.8. Методы Нозерн- и Саузерн-блоттинга позволяют гибридизовать молекулы нуклеиновых кислот, предварительно фракционированные с помощью электрофореза [44] Для выявления молекул нуклеиновых кислот, последовательность которых комплементарна всему зонду или его участку, ДНК-зонды часто используются в сочетании с гель-электрофорезом. Множество различных молекул РНК и ДНК, содержащихся в смеси, фракционируют электрофорезом согласно размеру и после этого проводят реакцию гибридизации;

если проба метит молекулы одного или нескольких размеров, можно быть уверенным, что гибридизация достаточно специфична. В некоторых случаях очень ценной является информация даже о размере гибридизуемых молекул ДНК. Это будет проиллюстрировано следующим примером.

Допустим, что перед исследователем стоит задача определить природу дефекта у мутантной мыши, синтезирующей аномально низкое количество альбумина (белка, который в норме секретируется в кровь клетками печени в значительных количествах). Для этого прежде всего необходимо взять образцы ткани печени у дефектных и нормальных мышей (последние служат в качестве контролей) и обработать клетки сильным детергентом для инактивации клеточных нуклеаз, которые в противном случае могут разрушить нуклеиновые кислоты. Затем отделяют РНК и ДНК от всех других компонентов клетки: присутствующие белки при этом полностью денатурируются, их удаляют последовательной экстракцией фенолом - мощным органическим растворителем. Нуклеиновые кислоты остаются в водной фазе. Чтобы их отделить от низкомолекулярных клеточных соединений, проводят осаждение спиртом. После этого ДНК отделяют от РНК, пользуясь их различной растворимостью в спиртах и обрабатывают высокоспецифическими ферментами (соответственно РНКазой или ДНКазой), чтобы освободиться от нежелательных примесей нуклеиновых кислот.

Для анализа РНК, кодирующих альбумин, с помощью ДНК-зонда используется метод Нозерн-блоттинга. На первом этапе с помощью гель-электрофореза, фракционируют интактные молекулы РНК дефектных и контрольных клеток печени и получают набор полос. Для того чтобы молекулы РНК, содержащиеся в геле, сделать более доступными ДНК-зонду, осуществляют перенос (блоттинг) фракционированных молекул РНК из геля на лист нитроцеллюлозы. На следующем этапе лист нитроцеллюлозы инкубируют с раствором, содержащим меченый ДНК-зонд. Полосы РНК, гибридизующиеся с зондом, выявляют методом радиоавтографии (рис. 4-72). Известно, что скорость движения молекул нуклеиновых кислот в геле зависит от их размера: при электрофорезе малые молекулы перемещаются быстрее, чем большие. Сравнивая Рис. 4-72. Методы «Нозерн»- и «Саузерн»-блоттинга. После электрофоретического фракционирования смеси молекул ДНК или РНК в агарозном геле проводят перенос различных фрагментов нуклеиновых кислот на лист нитроцеллюлозы или найлона («блоттинг»). Этот лист затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом в течение длительного времени в условиях, способствующих гибридизации. Затем лист тщательно промывают, так что радиоактивно меченными оказываются лишь те фрагменты, которые гибридизуются с ДНК-зондом. На радиоавтографе, полученном с листа нитроцеллюлозы, эти фрагменты выявляются в виде полос.

cкорость миграции молекул интересующего нас образца и молекул РНК известного размера (стандарты РНК), можно определить размеры каждой молекулы, связывающей зонд. При этом может оказаться, что клетки печени дефектных мышей синтезируют РНК альбумина в нормальных количествах и размер этих молекул соответствует норме. Если бы это было не так, выявлялось бы уменьшенное количество молекул РНК нормального альбумина. Возможен также вариант, когда молекулы РНК из дефектных клеток печени окажутся укороченными и вследствие этого будут перемещаться в геле быстрее, чем в норме. В этом последнем случае блот, содержащий дефектные молекулы РНК, можно подвергнуть повторной гибридизации с более чувствительными ДНК-зондами для выявления утраченных участков.

Для анализа структуры гена альбумина дефектных мышей был использован метод Саузерн-блоттинга. В данном случае вместо РНК анализируется ДНК. Изолированную ДНК сначала обрабатывают рестрицирующими нуклеазами, затем полученные фрагменты разделяют по размеру гель-электрофорезом и выявляют комплементарные ДНК-зонду альбумина с помощью переноса и гибридизации, как это описано для РНК (см. рис. 4-72). Повторяя эту процедуру с различными рестрицирующими нуклеазами, можно получить детальную рестрикционную карту генома в участке альбуминового гена (см. разд. 4.6.2). Анализируя эту карту, можно ответить на вопрос, несет ли альбуминовый ген у дефектных животных перестройки, например, делеции или инсерции коротких фрагментов ДНК.

4.6.9. Искусственные ДНК-зонды позволяют проводить дородовую диагностику наследственных болезней [45] Пока микробиологи разрабатывали методы клонирования ДНК, химики-органики усовершенствовали методы синтеза коротких фрагментов ДНК. В настоящее время это делают с помощью приборов, способных автоматически синтезировать любые последовательности из 80 нуклеотидов в течение ночи. Умение получать молекулы ДНК заданной последовательности дает возможность перестраивать гены, что является важным аспектом генной инженерии (гл. 5).

Существенной областью применения ДНК-олигонуклеотидов является дородовая (пренатальная) диагностика наследственных заболеваний. Более 500 наследственных болезней человека связаны с нарушением какого-то одного гена. В большинстве случаев эти мутации рецессивны. Это означает, что болезнь развивается, если человек получает дефектные копии гена сразу от обоих родителей. Одна из задач современной медицины состоит в том, чтобы выявлять такие аномальные эмбрионы до рождения, информировать об этом мать и дать ей возможность прекратить беременность. Например, для серповидноклеточной анемии известна точная нуклеотидная замена в мутантном гене (последовательность GAG заменена на GTG в цепи ДНК, кодирующей -цепь гемоглобина). В данном случае синтезируют два олигонуклеотида.

Один из них соответствует последовательности нормального гена в участке предполагаемых мутаций, другой несет замену, обусловливающую болезнь. В условиях когда эти последовательности достаточно коротки (примерно 20 нуклеотидов) и при температуре гибридизации, при которой стабильность сохраняют лишь точно совпадающие цепи, можно использовать радиоактивные зонды. Тест состоит в том, что из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости (ее получают в ходе процедуры, называемой амниоцентезом), выделяют ДНК и используют ее для Саузерн-блоттигна с радиоактивными ДНК-зондами. Дефектный эмбрион легко опознается, поскольку его ДНК будет гибридизоваться только с олигонуклеотидом, комплементарным мутантной последовательности ДНК. К сожалению, для большинства наследственных болезней дефект на уровне ДНК еще не расшифрован, однако круг заболеваний, для которых применяется дородовая диагностика, постоянно расширяется. Это стало возможно благодаря использованию феномена полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В данном случае с помощью гибридизации выявляют наличие или отсутствие определенных сайтов рестрикции, тесно сцепленных с дефектными генами.

4.6.10. Гибридизация позволяет выявлять и отдаленно родственные гены [46] Возникновение новых генов в ходе эволюции связано с дивергенцией и дупликацией старых генов, а также объединением участков генов в новых комбинациях. По этой причине большинство генов имеют в геноме семейства родственные последовательности, часть которых, по видимому, обладает и близкой функцией. Выделение ДНК-клона, соответствующего первому из членов такого генного семейства, - процедура весьма трудоемкая (разд. 5.6.5). Однако выделение остальных генов этого семейства упрощается, поскольку первый ген может быть использован в качестве зонда. Поскольку в родственных генах маловероятно присутствие идентичных последовательностей, гибридизацию с ДНК-зондами обычно выполняют в менее строгих условиях. Благодаря этому даже неполное соответствие последовательности зонда позволяет сформировать стабильную двойную спираль (рис. 4-73).

Хотя использование нестрогой гибридизации сопровождается повышением вероятности получения фальшивых сигналов от случайных участков гомологии коротких последовательностей в неродственных участках ДНК, такая гибридизация представляет собой одно из наиболее удачных применений технологии рекомбинантных ДНК. Например, этот Рис. 4-73. Сравнение нескольких модификаций метода гибридизации, отличающихся различной жесткостью условий. В реакции слева (жесткие условия) температура раствора поддерживается лишь на несколько градусов ниже температуры денатурации полностью комплементарной спирали ДНК (ее температуры плавления). В этих условиях спирали, совпадающие не полностью и формирующиеся при пониженной жесткости (см.

справа), оказываются нестабильными. Справа - указаны условия гибридизации, используемые для поиска родственных генов, не полностью идентичных гену А.

подход привел к выделению всего семейства ДНК-связывающих белков, которые функционируют в качестве ключевых регуляторов экспрессии генов в ходе раннего эмбрионального развития Drosophila (см. разд. 16.5.19). Этот же подход был использован для идентификации родственных этому семейству генов из других организмов, включая человека.

4.6.11. Для локализации специфических последовательностей нуклеиновых кислот в хромосомах и клетках используют гибридизацию in situ [47] Все макромолекулы клетки, и в том числе нуклеиновые кислоты, занимают в тканях и клетках строго определенное положение.

Экстрагирование этих молекул из тканей или клеток путем гомогенизации приводит к потере той части информации, которая относится к расположению нуклеиновых кислот в клетках. Поэтому были разработаны методы для локализации специфических последовательностей нуклеиновых кислот in situ - в изолированных хромосомах, в определенных типах клеток, где ДНК- и РНК-зонды используются примерно так же, как меченые антитела. Этот метод называют гибридизацией in situ. Его применяют для анализа ДНК в хромосомах и РНК в клетках.

Высокорадиоактивные зонды нуклеиновых кислот гибридизуют с хромосомами после кратковременного воздействия высоким рН с целью разделения пар оснований ДНК. Участки хромосом, связывающие радиоактивные зонды в процессе гибридизации, выявляются радиоавтографией.

Пространственное разрешение этого метода может быт повышено при использовании не радиоактивно меченных, а химически меченных зондов ДНК. Как правило, при синтезе зондов используют нуклеотиды, содержащие боковую цепь биотина, и гибридизовавшиеся пробы выявляются при окраске стрептавидином (молекулы которого расположены в виде сети) или с помощью иных маркерных молекул (рис. 4-74). Были также разработаны методы гибридизации in situ, позволяющие судить о распределении специфических молекул РНК в клетках внутри тканей, В этом случае ткани не подвергают воздействию высоких значений рН, так что хромосомная ДНК остается в двухцепочечном состоянии и не может связывать зонд. Однако если ткань подвергнуть слабой фиксации, РНК, содержащаяся в ней, при инкубации ткани с комплементарным ДНК-зондом обеспечивает возможность гибридизации. Таким способом удалось наблюдать, как реализуется дифференциальная активность генов Drosophila (рис. 4-75). Этот подход позволил существенно продвинуться в изучении молекулярных механизмов дифференцировки различных клеток эмбриона.

4.6.12. Методы рекомбинантных ДНК дают возможность изучать даже минорные белки клеток [48] До недавнего времени изучение клеточных белков было ограничено лишь мажорными фракциями, т.е. белками, содержащимися в клетках в относительно большом числе. С помощью обычных методов хроматографии и электрофореза из нескольких сот граммов клеточной массы можно получить примерно 0,1 г (100 мг) одного из мажорных белков, составляющих 1% или более от всего количества клеточных белков. Этой массы белка вполне достаточно для изучения его аминокислотной последовательности, детального анализа биологической или ферментативной (если таковая имеется) активности и получения антител, которые могут быть использованы для локализации белков в клетках. Более того, когда удается вырастить подходящие кристаллы, то с помощью рентгеноструктурного анализа можно установить трехмерную структуру молекулы.

Именно таким образом была определена структура и функция многих распространенных белков, в том числе гемоглобина, трипсина, иммуноглобулина и лизоцима.

Эукариотическая клетка содержит тысячи различных белков, но значительное большинство этих белков, и в том числе наиболее интересные, присутствуют в небольшом количестве. Некоторые из них иногда чрезвычайно трудно, если не невозможно, получить в чистом виде в количестве, превышающем несколько микрограмм. Разработка методов рекомбинантных ДНК сделала доступными любые клеточные белки (включая минорные белки) в больших количествах. Для этого клонируют ген нужного белка и затем встраивают его в специальную плазмиду, именуемую клонирующим вектором. Этот вектор сконструирован таким образом, что будучи введенным в бактерии, дрожжи или клетки млекопитающих соответствующего типа, он обеспечивает крупномасштабный синтез этого белка. Таким образом, если раньше для детальных структурных или функциональных исследований были доступны лишь немногие белки, в настоящее время практически все белки клетки могут быть предметом подобных исследований.

Рис. 4-74. Локализация гена на политенной хромосоме Drosophila с помощью гибридизации in situ с клонированным ДНК-зондом, меченным биотином. ДНК этой гигантской хромосомы частично денатурирована для гибридизации с ней зонда. После гибридизации и отмывки зонда, хромосомы обрабатывают ферментативным комплексом, в составе которого пероксидаза хрена конъюгирована со стрептавидином (см. рис. 4-58, Б). Чтобы выявить участок связывания зонда, препарат обрабатывают перекисью водорода и окрашивают;

при этом пероксидаза обнаруживается в виде темной полосы на препарате (стрелка). (С любезного разрешения Tod Leverty, Gerald Rubin.) Рис. 4-75. Радиоавтограф среза очень раннего эмбриона Drosophila, подвергнутого гибридизации in situ с использованием радиоактивного ДНК зонда, который комплементарен гену, принимающему участие в формировании сегментов ftz. Зонд гибридизуется с РНК эмбриона, и расположение зерен серебра после проявления указывает на то, что РНК, синтезируемая геном ftz, локализована в регулярных полосах, тянущихся поперек всего эмбриона. Ширина полос соответствует трем-четырем клеткам. На этих стадиях развития (клеточная бластодерма) эмбрион состоит примерно из 6000 клеток. (Из Е. Hafen, A. Kuroiwa, W. J. Gehring. Cell, 37;

833-841, 1984.) 4.6.13. Функция генов наиболее ярко проявляется в организме мутантов [49] Предположим, что кому-то удалось клонировать ген, кодирующий вновь открытый белок. Как установить внутриклеточную функцию данного белка? Задача эта весьма непроста, поскольку ни трехмерная структура белка, ни полная нуклеотидная последовательность гена этого белка не позволяют судить о его функции. Кроме того, многие белки, например, структурные белки и белки сложных мультиферментных комплексов, будучи отделены от других компонентов сложной функциональной единицы, в состав которой они входят, не проявляют своей обычной активности.

Один из подходов, которые мы уже рассматривали (см. разд. 4.5.6) состоит в том, чтобы инактивировать определенный белок с помощью специфических антител и пронаблюдать за тем, какие клетки затронуты вследствие этого. В некоторых случаях такой способ позволяет достаточно надежно определить функцию белка, однако в отношении внутриклеточных белков он не очень эффективен, поскольку микроинъецированные антитела подвергаются разведению в процессе пролиферации клеток либо разрушаются в результате внутриклеточной деградации. Более удачное решение этой проблемы возможно с помощью генетических подходов. Мутанты, у которых отсутствует один из белков или, что более удобно, синтезируется его температурочувствительная форма (инактивируемая при небольшом повышении или понижении температуры), чрезвычайно полезны, когда перед исследователем стоит вопрос о функции белка. С их помощью идентифицированы функции ферментов, участвующих в основных метаболических путях бактерий. Благодаря этому подходу были открыты многие генопродукты, отвечающие за упорядоченное развитие эмбрионов Drosophila. Как правило, этот метод используется для изучения организмов с коротким циклом репродукции, таких, как бактерии, дрожжи, круглые черви и плодовые мушки. Воздействуя на их организм веществами, вызывающими изменения в ДНК (мутагенами), можно быстро получить большое количество мутантов и выбрать среди них тех, которые несут определенный интересующий экспериментатора дефект.

Например, из популяции бактерий, подвергнутых воздействию мутагенов, были выбраны клетки, которые прекращают синтез ДНК при изменении температуры окружающей среды от 30 ° до 42 °С. Среди них было выявлено значительное число температурочувствительных мутантов, мутации в которых затрагивали бактериальные белки, участвующие в процессе репликации ДНК. Эти мутанты позже были использованы для идентификации и определения белков, необходимых для репликации ДНК.

Цикл репродукции у человека очень продолжителен. К тому же никто не станет подвергать людей целенаправленному воздействию мутагенов. Более того, следует иметь в виду, что человеческий плод, имеющий серьезные дефекты жизненно важных процессов, например репликации ДНК, погибнет задолго до рождения. Однако многие мутации могут практически не оказывать влияния на жизнеспособность - например, тканеспецифические дефекты лизосом либо рецепторов клеточной поверхности, спонтанно возникающие в человеческой популяции.

Анализ фенотипа этих больных, равно как и исследование их клеток в культуре, дают возможность уникального исследования важных клеточных функций. Хотя такие мутации крайне редки, тем не менее они эффективно выявляются, поскольку их носители обращаются за медицинской помощью.

4.6.14. Клетки и организмы, содержащие измененные гены, можно исправить [50] Получить мутантов, у которых нарушена репликация ДНК или, например, развитие глаза, в принципе довольно просто. Однако, чтобы связать этот дефект с изменением конкретного белка, могут понадобиться годы. Технология рекомбинантных ДНК дала в руки исследователей совершенно иной подход: анализ начинается с белка и завершается созданием мутантной клетки или целого организма. Поскольку такой подход по сравнению с традиционным направлением генетического анализа от гена к белку представляется обратным, его обычно называют обратной генетикой.

Обратная генетика начинается с выделения из клетки нужного белка. Используя методы, описанные в гл. 5, ген этого белка клонируют и определяют его нуклеотидную последовательность;

затем эту последовательность меняют биохимическими методами, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Затем такой ген вводят в клетку, где он может встроиться в хромосому в процессе гомологической рекомбинации и превратиться таким образом в постоянный элемент генома. Если встроенный ген экспрессируется, то несущая его клетка и все ее потомки будут синтезировать измененный белок. В том случае, когда измененный in vitro ген вводят в оплодотворенную яйцеклетку, получается многоклеточный мутантный организм. Некоторые из таких трансгенных организмов передадут этот ген своим потомкам в качестве постоянного элемента клеток зародышевой линии (рис. 4-76). Такая генетическая трансформация в настоящее время становится обычной процедурой для плодовых мушек или млекопитающих. В принципе на сегодняшний день совершенно реальна и трансформация человека, но такие эксперименты не выполняют из страха перед возможными генетическими нарушениями, которые нельзя исключить у лиц, ставших объектом таких исследований.

4.6.15. С помощью искусственных генов, кодирующих антисмысловые РНК, можно создавать специфические доминантные мутации [51] При введении мутантных генов в клетки бактерий или дрожжей, которые, как правило, гаплоидны, такие гены будут достаточно часто рекомбинировать с нормальными гомологами. В результате можно отобрать клетки, в которых мутантный ген заменил единственную копию нормального гена (рис. 4-77, А), например клетки, синтезирующие определенный белок в мутантной форме. Функции нормального белка можно определить, как правило, по фенотипу мутантных клеток. Что же касается высших эукариот, таких, как млекопитающие или плодовые мушки, пока еще не созданы методы, позволяющие легко заменять Рис. 4-76. Сравнение нормальной личинки Drosophila и двух мутантных личинок, содержащих дефектные гены ftz. Одна из дефектных ( ftz-) личинок была трансформирована после инъекции в яйцеклетку, из которой она была получена клонированной ДНК, содержащей нормальную последовательность гена ftz. Эта дополнительная последовательность ДНК встроилась в одну из хромосом мухи и затем нормально наследовалась и экспрессировалась. Ген ftz необходим для нормального развития и его добавление к дефектному геному, как следует из опыта, восстанавливает сегменты личинки, отсутствующие у организмов ftz-. Методы получения трансгенных животных обсуждаются далее (см. рис. 5-88). (С любезного разрешения Walfet Gehring.) Рис. 4-77. Ген с измененной нуклеотидной последовательностью может быть введен в хромосому организма-хозяина. У бактерий и дрожжей можно отобрать мутанты, у которых (А) в результате генетической рекомбинации измененный ген занял место нормального. В этом случае в клетках сохраняются только мутантные гены. У высших эукариот вместо замены происходит добавление гена (Б). Трансформированные клетки или организмы у них содержат помимо нормальных мутантные гены. Полагают, что у организмов, для которых характерен избыток ДНК, замены генов происходят достаточно редко, поскольку для этого необходимо, чтобы мутантный ген «нашел» среди множества других последовательностей свой нормальный гомолог и спарился с ним.

Рис. 4-78. Использование стратегии антисмысловых РНК для получения доминантных мутаций. Были сконструированы мутантные гены, синтезирующие РНК, последовательность которых комплементарна РНК, синтезируемым нормальными генами. РНК этих двух типов способны объединяться в двухцепочечные молекулы. Если синтезируется значительный избыток антисмысловых РНК, они могут гибридизоваться и таким образом инактивировать большую часть нормальных РНК, синтезируемых геном X. Полагают, что таким образом в перспективе удастся инактивировать любой ген. В настоящее время эта методика применима лишь по отношению к некоторым генам.

нормальный ген клонированным мутантным геном. Генетическая трансформация таких организмов приводит обычно к инсерции клонированного гена в случайные участки генома и при этом клетка или организм содержат мутантный ген наряду с его нормальной копией (рис. 4-77, Б).

Было бы крайне полезно создание специфических доминантных мутаций в клетках высших эукариот путем введения мутантных генов, которые бы элиминировали активность их нормальных аналогов в клетке. Для этого используют весьма хитроумный и многообещающий подход, основанный на специфичности реакций гибридизации двух комплементарных цепей ДНК. Известно, что в норме только одна из двух цепей ДНК в данном участке транскрибируется в РНК и это всегда одна и та же цепь для данного гена. Если же клонированный ген был сконструирован таким образом, что транскрибируется только противоположно направленная цепь ДНК, появляется антисмысловая РНК с последовательностью, комплементарной нормальным гранскриптам РНК. В том случае, когда такая антисмысловая РНК синтезируется в достаточно больших количествах, она будет с большой частотой гибридизоваться со «смысловой» РНК, синтезируемой нормальными генами, и ингибировать синтез соответствующего белка (рис. 4-78). И если этот белок является жизненно важным для клетки или организма, описанные здесь доминантные мутанты погибнут и исследовать функции белка будет невозможно. Чтобы этого не произошло, можно сконструировать гены, синтезирующие антисмысловую РНК по команде, например, в ответ на изменение температуры или в присутствии определенной сигнальной молекулы. Клетки или организмы, содержащие такие индуцибельные антисмысловые гены, будут лишены специфического белка в определенное время, и в этом случае можно проследить за возникающим эффектом. Конечно, этот метод технически до конца еще не проработан, однако уже сейчас ясно, что он весьма перспективен для определения функции белков высших организмов.

Заключение Технология рекомбинантных ДНК произвела революцию в исследовании клетки. В настоящее время с помощью рестрицирующих нуклеаз можно вырезать любой участок клеточной ДНК и вставить его в самореплици- рующийся генетический элемент (плазмиду или вирус) для получения «клона геномной ДНК». С другой стороны, для получения «клона к ДНК» можно использовать ДНК-копию любой молекулы РНК. Таким образом, можно получить неограниченное количество высокоочищенной ДНК, определить ее нуклеотидную последовательность (скорость этой операции составляет сотни нуклеотидов в день), а также аминокислотную последовательность кодируемого ею белка. Методы генной инженерии позволяют синтезировать мутантные гены и вводить их в хромосомы клеток, где они в последующем превращаются в постоянный элемент генома. И если для переноса генов в качестве реципиента использовать оплодотворенное яйцо, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его своим потомкам. Для клеточной биологии исключительно важно, что описанные методы дают возможность изменять клетки строго направленным образом, что в свою очередь позволяет оценить влияние на клетку изменения структуры определенного белка.

Применение технологии рекомбинантных ДНК открывает широкие перспективы. С помощью этих методов клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих могут быть преобразованы в «фабрики» для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков или использовать их в качестве лекарственных средств. Кроме того, на технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифических ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями.

Литература Общая Cantor С. R., Schimmel P. R. Biophysical Chemistry, 3 vols. New York, W. H. Freeman, 1980 (A comprehensive account of the physical principles underlying many biochemical and biophysical techniques.) Freifelder D. Physical biochemistry, 2nd ed. New York, W. H. Freeman, 1982.

Van Holde K.E., Physical Biochemistry, 2nd ed. Englewood, NJ, Prentice-Hall, 1985.

Цитируемая 1. Bradbury S. An Introduction to the Optical Microscope. Oxford, U. K., Oxford University Press, 1984.

Fawcett D.W. A Textbook of Histology, llth ed. Philadelphia, Saunders, 1986.

2. Spencer M. Fundamentals of Light Microscopy. Cambridge, U. K., Cambridge University Press, 1982.

3. Boon M. Т., Drijver J. S. Routine Cytological Staining Methods. London, Macmillan, 1986.

4. Ploem J. S., Tanke H. J. Introduction to Fluorescence Microscopy. Royal Microscopical Society Microscopy Handbook No. 10. Oxford, U. K., Oxford Scientific Publications, 1987.

Willingham M. C., Pastan I. An Atlas of Immunofluorescence in Cultured Cells. Orlando, Fl, Academic, 1985.

5. Alien R. D. New observations of cell architecture and dynamics by video-enhanced contrast optical microscopy. Annu. Rev. Biophys. Biophys.

Chem. 14, 265-290, 1985.

6. Pease D. C., Porter K. R. Electron microscopy and ultramicrotomy. J. Cell Biol., 91, 287s-291s, 1981.

7. Wischnitzer S. Introduction to Electron Microscopy. 3rd ed. Elmsford, NY, Pergammon, 1981.

8. Everhart Т.Е., Hayes T.L. The scanning electron microscope. Sci. Am., 226(1), 54-69, 1972. Hayat M. A. Introduction to Biological Scanning Electron Microscopy. Baltimore, University Park Press, 1978.

Kessel R.G., Kargon R.H. Tissues and Organs. New Fork, W. H. Freeman, 1979.

(Атлас тканей позвоночных, исследованных с помощью сканирующего электронного микроскопа).

9. Sommerville J., Scheer U. eds. Electron Microscopy in Molecular Biology. A Practical Approach. Washington, D. C, IRL Press, 1987.

10. Heuser J. Quick-freeze, deep-etching preparation of samples for 3-D electron microscopy. Trends Biochem. Sci, 6, 64-68, 1981.

Pinto da Silva P., Branton D. Membrane splitting in freeze-etching. J. Cell Biol, 45, 598-605, 1970.

11. Chiu W. Electron microscopy of frozen, hydrated specimens. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 15, 237-257, 1986.

Unwin P. N. Т., Henderson R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Моl. Biol., 94, 425-440, 1975.

12. Glusker J.P., Trueblood K.N. Crystale Structure Analysis: A Primer. Oxford, U. K., Oxford University Press, 1985.

13. Alzari P.M., Lascombe M.B., Poljak R.J. Three-dimentional structure of antibodies. Annu. Rev. Immunol., 6, 555-580, 1980.

Kendrew J.C. The three-dimentional structure of protein molecule. Sci. Am., 205(6), 96-111, 1961. Perutz M.F. The hemoglobin molecule. Sci.

Am., 211(5), 64-76, 1964.

14. Cooke R.M., Cambell I.D. Protein structure determination by NMR. Bioessays, 8, 52-56, 1988.

Schulman R.G. NMR spectroscopy of living cells. Sci. Am., 248(1), 86-93, 1986. Wuthrich K., Wagner G. Internal dynamics of proteins. Trends Biochem. Sci., 9, 152-154, 1984.

15. Amman D. Ion Selective Microelectrodes: Principles, Design and Application. Berlin, Springer-Verlag, 1986.

Auerbach A., Sachs F. Patch clamp studies on single ionic channels. Annu Rev. Biophys. Bioeng., 13, 269-302, 1984.

16. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R. Y. A new generations of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem, 260, 3440-3450, 1985. Tsien r. Y., Poenie M. Fluorescence ratio imaging: a new window into intracellular ionic signalling. Trends Biochem. Sci., 11, 450, 1986.

17. Celis J.E., Graessmann A., Logter A. eds. Microinjection and Organdie Transplantation Techniques. London, Academic Press, 1986.

Gomperts B. D., Fernandez J. M. Techniques for membrane permeabilization. Trends Biochem. Sci., 10, 414-417, 1985.

Ostro M.J. Liposomes Sci. Am., 256(1), 102-111, 1987.

Ureta Т., Radojkovic J. Microinjected frog oocytes. Bioessays, 2, 221-225, 1985.

18. Freshney R.I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. New York, Liss, 1987.

19. Herzenberg L. A. Sweet R.G., Herzenberg L. A. Fluorescence-activated cell sorting. Sci. Am., 234(3), 108-116, 1976.

Kamarck M. E. Fluorescence-activated cell sorting of hybrid and transfected cells. Methods Enzymol, 151, 150-165, 1987.

Nolan G.P., Fiering S., Nicolas J.F., Herzenberg L.A. Fluorescence-activated cell analysis and sorting of viable mammalian cells based on beta-D-galactosidase activity after transduction of E. coli lac Z. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85, 2603-2607, 1988.

20. Harrison R.G. The outgrowth of the nerve fiber as a mode of protoplasmic movement. J. Exp. Zool., 9, 787-848, 1910.

21. Ham R.G. Clonal growth of mammalian cells in a chemically defined, synthetic medium. PNAS, 53, 288-293, 1965.

Loo D. Т., Fuquay J. /., Rawson C. L., Barnes D. W. Extended culture of mouse embryo cells without senescence: inhibition by serum. Science, 236, 200-202, 1987.

Sirabasku D.A., Pardee А. В., Saw G.H., eds. Growth of Cells in Hormonally Defined Media. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

22. Ruddle F. H., Creagan R. P. Parasexual approaches to the genetics of man. Annu. Rev. Genet., 9, 407-486, 1975.

23. Colowick S. P., Kaplin N. O., eds. Methods in Enzymology, vols. 1 -... San Diego, CA, Academic Press, 1955-1988. (Многотомное издание, содержащее общие и специальные статьи с описанием множества методов).

Cooper T.G. The Tools of Biochemistry. New York, Wiley, 1977.

Scopes R.K. Protein Purification Principles and Practice, 2nd ed. New York, Springer-Verlag, 1987.

24. Claude A. A coming age of cell. Science, 189, 433-435, 1975. de Duve C., Beaufay H. A short history of tissue fractionation. J. Cell Biol., 91, 293s-299s, 1981.

Meselson M., Stahl F. W. The replication of DNA in Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 47, 671-682, 1958. (Для демонстрации полуконсервативной репликации ДНК использовали центрифугирование в градиенте плотности).

Palade G. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science, 189, 347-358, 1975.

Sheeler P. Centrifugation in Biology and Medical Science. New York, Wiley, 1981.

25. Moore D.J., Howell K.E., Cook G.M. W., Ewans W.H. eds. Cell Free Analysis of Membrane Traffic. New York, Liss, 1986.

Nirenberg N. W., Mattaei J. H. The dependence of cell free protein synthesis in E. coli on naturally occuring or synthetic polyribonucleotides.

Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 47, 1588-1602, 1961.

Racker E. A. A New Look on Mechanisms of Bioenergetics. New York. Academic Press, 1976. (Бесклеточные системы в исследовании энергетического метаболизма).

Zamecnic P. С. An historical account of protein synthesis with current overtones – a personalized view. Cold Spring Harbor Symp. Quant.

Biol., 34, 1-16, 1969.

26. Dean P. D. G., Johnson W. S., Middle F. A. Affinity Chromatography: A Practical Approach, Arlington, VA, IRL Press, 1985.

Gilbert M. T. High Performance Liquid Chromatography. Littleton, MA, John Wright-PSG, 1987.

27. Andrews A. T. Electrophoresis, 2nd ed. Oxford, U. K., Clarendon Press, 1986.

Laemmli U. K. Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685, 1970.

28. Celis J. E., Bravo R. eds., Two - Dimentional Gel Electrophoresis of Proteins. New York, Academic Press, 1983.

O'Farrell P.H. High-resolution two-dimentional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021, 1975.

29. Cleveland D. W., Fisher S. G., Kirschner M. W., Laemmli U. K. Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulphate and analysis by gel-electrophoresis. J. Biol. Chem. 252, 1102-1106, 1977.

Ingram К М. A special chemical difference between the globins of normal human and sickle anemia hemoglobin. Nature, 178, 792-794, 1956.

30. Edman P., Begg G. A protein sequenator. Eur. J. Biochem. 1, 80-91, 1967. (Первое описание автоматизированного секвенатора).

Hewlck R. M., Hunkapiller M. W., Hood L. E., Dreyer W.J. A gas-liguid-solid phase peptide and protein seguenator. J. Biol. Chem. 256, 7990-7997, 1981.

Sanger F. The arrangement of amino acids in proteins. Adv. Protein Chem. 7, 1 -67, 1952.

Walsh K. A., Ericsson L. H. Parmelee D. C., Titani K. Advances in protein sequencing. Annu. Rev. Biochem. 50, 261-284, 1984.

31. Chase G.D., Rabinowltz J.L. Principles of Radio Isotope Methodology, 2nd ed. Minneapolis, Burgess, 1962.

Dyson N. A. An Introduction to Nuclear Physics with Applications in Medicine and Biology, Chichester, U. K., Horwood, 1981.

32. Calvin M. The path of carbon in photosynthesis. Science, 135, 879-889, 1962. (Один из первых случаев применения радиоизотопов в биологии).

Rogers A. W. Techniques of Autoradiography, 3rd ed. New York, Elsevier/North Holland, 1979.

33. Anderton B. H., Thorpe R. C. New methods of analysis of antigens and glycoproteins in complex mixtures. Immunol. Today, 2, 122-127, 1980.

Coons A.H. Histochemistry with labelled antibody. Int. Rev. Cytol. 5, 1-23, 1956.

34. Milstein C. Monoclonal antibodies. Sci. Am., 243(4), 66-74, 1980.

Yelton D. E., Schariff M. D. Monoclonal antibodies: a powerful new tool in biology and medicine. Annu. Rev. Biochem., 50, 657-680, 1981.

35. Mabuchi L, Okuno M. The effect of myosin antibody on the division of starfish blastomeres. J. Cell Biol., 74, 251-263, 1977.

Mulcahy L. S., Smith M. R., Stacey D. W. Requirement for ras proto-oncogene function during serum stimulated growth of NIH 3T3 cells.

Nature, 313, 241-243, 1985.

36. Drlica K. Understanding DNA and Gene Cloning. New York, Wiley, 1984.

Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

Watson J. D., Tooze J. The DNA Story: A Documentary History of Gene Cloning. New York, W.H. Freeman, 1981.

37. Garoff H. Using recombinant DNA techniques to study protein targeting in the eucaryotic cell. Annu. Rev. Cell. Biol., 1, 403-445, 1985.

Jackson lan J. The real reverse genetics: targeted mutagenesis in the mouse. Trends Genet., 3, 119, 1987.

Kelly J.H., Darlington G.J. Hybrid genes: molecular appoaches to the tissue-specific gene regulation. Annu. Rev. Genet., 19, 273-296, 1985.

38. Nathans D., Smith H. 0. Restriction nucleases in the analysis and reconstructuring of DNA molecules. Annu. Rev. Biochem., 44, 273-293, 1975.

Smith H. 0. Nucleotide sequence specificity of restriction endonucleases. Science, 205, 455-462, 1979.

39. Cohen S.N. The manipulation of genes. Sci. Am., 233(1), 24-33, 1975.

Maniatis T. et al. The isolation of structural genes from libraries of eucaryotic DNA. Cell, 15, 687-701, 1978.

Nooick R.P. Plasmids. Sci. Am., 243(6), 102-127, 1980.

40. Cantor C. R., Smoth C. L., Mathew M. K. Pulsed-field gel electrophoresis of very large DNA molecules. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 17, 287-304, 1988.

Maxam A. M., Gilbert W, A new method of sequencing DNA. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 560-564, 1977.

Southern E. M. Gel electrophoresis of restriction fragments. Methods Enzymol., 68, 152-176, 1979.

41. Rigby P. W., Dieckermann M., Rhodes C., Berg P. Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. J. Мої. Biol, 113, 237-251, 1977.

42. Galas D. J., Schmitz A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucl. Acid Res., 5, 3157 3170, 1978.

Gilbert W. DNA sequencing and gene structure. Science, 214, 1305-1312, 1981.

Prober J. M., et al. A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chainterminating dideoxynucleotides. Science, 238, 336-341, 1987.

Tullius T. D. Chemical "snapshots" of DNA: using the hydroxyl radical to study the structure of DNA and DNA protein complexes. Trends Biochem. Sci., 12, 297-300, 1987.

43. Berk A.J., Sharp P. A. Sizing and mapping of early adenovirus mRNAs by gel electrophoresis of SI endonuclease digested hybrids. Cell, 12, 721-732, 1977.

Hood L.E., Wilson J.H., Wood W.B. Molecular Biology of Eucaryotic Cells: A Problems Approach, pp. 56-61, 192-210, Mento Park, CA, Benjamin-Cummings, 1975.

Wetmer J. G. Hybridization and renaturation kinetics of nucleic acids. Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 5, 337-361, 1976.

44. Alwine J. C., Kemp D. J., Stark G. R. A method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzomethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 74, 5350-5354, 1977.

Southern Е. М. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Мої. Biol., 98, 503-517, 1975.

45. Itakura K., Rossi J. J., Wallace R. B. Synthesis and use of synthetic oligonucleotides. Annu. Rev. Biochem., 53, 323-356, 1984.

Ruddle F. H. A new era in mammalian gene mapping: somatic cell genetics and recombinant DNA methodologies. Nature, 294, 115-119, 1981.

White R., Lalovel J. M. Chromosome mapping with DNA markers. Sci. Am., 258(2), 40-48, 1988.

McGinnis W., Garber R.L., Wirz J., Kuroiwa A., Gehring W.J. A homologous protein-coding seguence in Drosophila homeotic genes and its conservation in other metazoans. Cell, 37, 403-408, 1984.

47. Gerhard D. S., Kawasaki E. S., Bancroft F. C., Shabo P. Localization of a unique gene by direct hybridization. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78, 3755-3759, 1981.

Huten E., Kuroiwa A., Gehring W.J. Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development. Cell, 37, 833-841, 1984.

Pardue M. L., Gall J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of the cytological preparations. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 64, 600-604, 1969.

48. Abelson J., Butz E., eds. Recombinant DNA. Science, 209, 1317-1438, 1980.

Gilbert W., Villa-Komaroff L. Useful proteins from recombinant bacteria. Sci. Am., 242(4), 74-94, 1980.

49. Lederberg J., Lederberg E. M. Replica plating and inderect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol., 63, 399-406, 1952.

Nusslein-Volhard C., Wieschaus E. Mutations affecting segment number arid polarity in Drosophila. Nature, 287, 795-801, 1980.

50. Palmiter R. D., Brinster R. L. Germ line transformation of mice. Annu. Rev. Genet., 20, 465-499, 1986.

Pellicer A., et al. Altering genotype and phenotype by DNA-mediated gene transfer. Science, 209, 1412-1422, 1980.

Rubin G. M., Spradling A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science, 218, 348-353, 1982.

Shortle D., Nathans D. Local mutagenesis: a method for generating viral mutants with base substitutions in preselected regions of the viral genome. Proc. Nat. Acad. sci. USA, 75, 2170-2174, 1978.

Struhl K. The new yeast genetics. Nature, 305, 391-397, 1983.

51. Melton D.A., Rebagliati M.R. Antisense RNA injections in fertilized eggs as a test for the function of localized mRNAs. J. Embryol. Exp.

Morphol., 97, 211-221, 1986.

Rosenberg V.B., Preiss A., Seifert E., Jackle H., Knipple D.C. Production of phenocopies by Kruppel anti-sense RNA injection into Drosophila embryos. Nature, 313, 703-706, 1985.

Weintraub H., Isant J. G., Harland R. M. Anti-sense RNA as a molecular tool for genetic analysis. Trends Genet., 1, 22-25, 1985.

II. Молекулярная организация клеток Рис. 5.1. Электронная микрофотография окаймленных ямок и пузырьков на внутренней поверхности плазматической мембраны клетки печени. (Из Hirokawa и Heuser, Cell 30: 395-406, 1982.) Рис. 5.П. Электронная микрофотография ДНК хромосомы человека. (С любезного разрешения Paulson и Laemmli.) 5. Основные генетические механизмы Способность клеток поддерживать высокую упорядоченность своей организации в хаотичной Вселенной зависит от генетической информации, которая реализуется, сохраняется, воспроизводится, а иногда и совершенствуется в четырех генетических процессах - синтезе РНК и белка, репарации ДНК, репликации ДНК и генетической рекомбинации. Эти процессы, в которых создаются и поддерживаются клеточные белки и нуклеиновые кислоты, одномерны: в каждом из них информация, заключенная в линейной последовательности нуклеотидов, используется для образования либо для изменения другой линейной последовательности нуклеотидов (молекулы ДНК или РНК) или линейной последовательности аминокислот (молекулы белка). Поэтому генетические события проще для понимания, чем большинство других клеточных процессов, связанных с выражением информации, которую несут в себе сложные трехмерные поверхности белковых молекул. Быть может, именно благодаря этой относительной простоте генетических механизмов мы знаем и понимаем их гораздо лучше, чем большую часть других событий, происходящих в клетке.

В этой главе мы рассмотрим молекулярные механизмы, обеспечивающие репарацию, репликацию и изменение клеточной ДНК. Мы увидим, что эти механизмы зависят от ферментов, расщепляющих, копирующих и рекомбинирующих нуклеотидные последовательности. Мы покажем далее, что вирусы, плазмиды и мобильные генетические элементы ведут себя в отношении этих и прочих ферментов как паразиты, не только используя их для собственной репликации, но и изменяя - посредством генетической рекомбинации - клеточный геном. Заключительная часть главы посвящена тому, как знание основных генетических механизмов реализуется практически в методиках выделения генов и генных продуктов.

Для начала, однако, мы вновь вернемся к центральной теме, уже затронутой кратко в гл. 3, а именно к механизмам синтеза РНК и белка.

5.1. Синтез РНК и белка На долю белков приходится обычно более половины сухой массы клетки и синтез их играет главную роль в таких процессах, как рост и дифференцировка клеток, поддержание их структуры и функции. Синтез белка зависит от совместного действия нескольких классов молекул РНК и ему предшествует ряд подготовительных этапов. Сначала в результате копирования ДНК, несущей информацию о синтезируемом белке, образуется молекула матричной РНК (мРНК). Одновременно в цитоплазме клетки к каждой из 20 аминокислот, из которых строится белок, присоединяется молекула специфической транспортной РНК (мРНК), а к субъединицам рибосомы, на которой происходит синтез, присоединяются некоторые вспомогательные белковые факторы. Началом синтеза белка считается тот момент, когда эти компоненты объединяются в цитоплазме, образуя функциональную рибосому. По мере того как молекула мРНК шаг за шагом продвигается сквозь рибосому, ее нуклеотидная последовательность переводится (транслируется) в соответствующую последовательность аминокислот, в результате чего создается определенная белковая цепь. Однако прежде всего необходимо ответить на вопрос о том, как образуются в клетке различные молекулы РНК.

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 11 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.