WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 11 |

«1 Молекулярная биология клетки 2 Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray, Biology Julian Lewis, Martin Raff, of the Cell Keith Roberts, James D. Watson SECOND EDITION Garland Publishing, Inc. ...»

-- [ Страница 3 ] --

3.1.1. Специфические взаимодействия макромолекулы зависят от слабых нековалентных связей [2] Макромолекулярные цепи образуются с помощью ковалентных связей, которые достаточно прочны, чтобы поддерживать последовательность субъединиц макромолекулы в течение длительного времени. Но заключенная в этой последовательности информация выражается с помощью значительно более слабых нековалентных связей. Такие слабые связи возникают между разными частями одной и той же макромолекулы и между разными макромолекулами. В совокупности эти связи определяют и пространственную структуру макромолекулярных цепей, и то, как эти структуры взаимодействуют друг с другом.

Нековалентные связи в биологических молекулах обычно подразделяют на три типа: ионные взаимодействия, водородные связи и вандерваальсовы взаимодействия. Еще одно важное слабое взаимодействие создается пространственной структурой воды, которая стремится свести вместе гидрофобные группы и тем самым ослабить их разрушительное действие на сеть водородных связей молекул воды (схема 2-1). Такое выталкивание из водного раствора иногда считают четвертым типом слабой нековалентной связи. Все эти четыре типа слабых связей представлены на схеме 3-1.

В водном растворе каждая нековалентная связь в 30-300 раз слабее, чем типичные ковалентные связи, удерживающие вместе биологические молекулы (табл. 3-2) и лишь ненамного превышает среднюю энергию столкновения молекул, обусловленную тепловым движением при 37 °С. Одна нековалентная связь в отличие от одной ковалентной слишком слаба, чтобы противостоять тепловому движению, стремящемуся раз- двинуть молекулы в разные стороны, поэтому, чтобы скрепить поверхности двух молекул требуется большое количество нековалентных связей.

Большое число нековалентных связей может образоваться между двумя поверхностями только тогда, когда большое число атомов поверхностей точно соответствуют друг другу (рис. 3-2). Именно этим объясняется специфичность биологического узнавания, которое происходит, например, между ферментом и его субстратами.

Слабые нековалентные связи определяют, как различные участки одной молекулы располагаются друг относительно друга, кроме того, они определяют, как такая макромолекула взаимодействует с другими молекулами. Однако, как можно видеть в верхней части схемы 3-1, атомы ведут себя как твердые шары определенного радиуса («вандерваальсов радиус»). Невозможность взаимного перекрывания двух атомов ограничивает число пространственных расположений атомов (или конформаций), которые возможны для каждой полипептидной цепи. В принципе длинная подвижная цепь, такая, как молекула белка, может складываться огромным числом способов, при которых каждая кон-формация будет иметь разный набор слабых взаимодействий между цепями. Однако на деле большинство клеточных белков стабильно складывается только одним способом;

в ходе эволюции была отобрана такая последовательность аминокислотных субъединиц, одна конформация которой способна образовывать значительно более благоприятные взаимодействия между цепями, чем любая другая.

3.1.2. Спираль является общим структурным элементом биологических молекул, построенных из повторяющихся субъединиц [3] Биологические структуры часто образованы путем соединения похожих друг на друга субъединиц, таких как аминокислоты или нуклеотиды, в длинную повторяющуюся цепь (разд. 2.4.5). Если все субъединицы одинаковы, то соседние субъединицы в цепи будут соединены друг с другом только одним способом: их взаимное расположение будет таково, что энергия контакта между ними окажется минимальной. Каждая субъединица при этом расположена точно так же, как соседние, так что субъединица 3 будет входить в субъединицу 2, а субъединица 2 - в субъединицу 1 и т. д. Поскольку сборка субъединиц в виде прямой линии явление очень редкое, то обычно образуется спираль - регулярная структура, напоминающая винтовую лестницу, как показано на рис. 3-3. В зависимости от направления закручивания различают спирали правые и левые (рис. 3-4). Направление спирали не изменится, если спираль перевернуть, но изменится при зеркальном отражении.

Спирали весьма распространены среди биологических структур. Спирализации подвержены и молекулы, состоящие из субъединиц, соединенных ковалентными связями (ДНК), и большие белковые молекулы с нековалентными связями (актиновые нити). Это неудивительно:

спираль возникает при простом накладывании друг на друга многих субъединиц, каждая из которых строго повторяет положение предыдущей.

3.1.3. Диффузия - первая стадия молекулярного узнавания [4] Прежде чем связаться друг с другом, две молекулы должны прийти в соприкосновение. Это достигается путем теплового движения, вызывающего случайные перемещения, или диффузию молекул. Поскольку, находясь в жидкости, молекулы быстро сталкиваются и отскакивают Схема 3-1. Основные типы слабых нековалентных связей, участвующих во взаимодействии макромолекул.

Таблица 3-2. Ковалентные и нековалентные химические связи Энергия связи, ккал/моль 1) Тип связи Длина, нм в вакууме в воде Ковалентная 0,15 90 Ионная 0,25 80 Водородная 0,30 4 Вандерваальсова 0,20 0,1 0, 1) Энергию связи можно представить как энергию, необходимую для ее разрыва. Здесь она дана в килокалориях на моль (ккал/моль). Одна килокалория - это количество энергии, необходимое для повышения температуры 1000 г воды на 1°С. Широко используется и другая единица измерения -килоджоуль (кДж), равный 0,24 ккал. Индивидуальные связи значительно варьируют по силе в зависимости от конкретных атомов в микроокружении, так что приведенные величины могут служить лишь для грубой ориентировки. Обратите внимание на то, что водная среда клетки существенно ослабляет ионные и водородные связи между неводными молекулами.

друг от друга, индивидуальная молекула движется сначала В одну сторону, затем в другую, описывая «беспорядочную траекторию» (рис. 3-5).

Среднее расстояние, пройденное такой молекулой, пропорционально квадратному корню времени. Иными словами, если перемещение некой молекулы на 1 мкм занимает в среднем 1 с, то перемещение на 2 мкм в среднем займет 4 с, а на 10 мкм - 100 с и т.д. Таким образом, диффузия - это эффективный способ перемещения молекул на ограниченные расстояния, но неэффективный для перемещения на большие расстояния.

В опытах с введением в клетки флуоресцентных красителей и других меченых молекул было установлено, что в цитоплазме малые молекулы диффундируют почти так же быстро, как в воде. Молекуле такого размера, как АТР, требуется лишь 0,2 с для диффузии в среднем на расстояние 10 мкм, что составляет диаметр небольшой клетки животного. Однако макромолекулы движутся значительно медленнее. Объясняется это не только тем, что им присуща меньшая скорость диффузии, но и тем, что их движение тормозится частыми столкновениями со многими другими макромолекулами, положение которых в цитоплазме фиксировано (рис. 3-6).

Рис. 3-2. Схема, иллюстрирующая, как макромолекулы узнают друг друга с помощью слабых взаимодействий.

Рис. 3-5. Беспорядочное движение. Молекулы в растворе движутся случайным образом из-за постоянных столкновений с другими молекулами. Благодаря этому малые молекулы диффундируют из одной части клетки в другую за удивительно короткое время - менее чем за секунду.

Рис. 3-3. Спираль образуется, когда серии субъединиц подстраиваются друг к другу регулярным образом. На переднем плане показано взаимодействие двух субъединиц, а сзади изображены спирали, получающиеся в результате этого взаимодействия. Эти спирали имеют две (А), три (Б) и шесть (В и Г) субъединиц на один оборот. В верхней части рисунка - вид спирали сверху. Обратите внимание, что спираль Г имеет более широкий шаг, чем В.

Рис. 3-6. Электронная микрофотография участка цитоплазмы животной клетки, иллюстрирующая высокую концентрацию содержащихся в ней белков. Макромолекулы в цитоплазме диффундируют относительно медленно, поскольку они взаимодействуют с другими макромолекулами;

малые молекулы Рис. 3-4. Сравнение лево- и правозакрученной спиралей. Полезно диффундируют почти столь же быстро, как в водном растворе. Клетка, вспомнить, что стандартный винт, который закручивается при представленная на этой микрофотографии, обработана по специальной вращении по часовой стрелке, является правозакрученным. Отметим, методике быстрого замораживания, позволяющей сохранить что спираль сохраняет закрученность, если ее перевернуть сверху вниз цитоплазматические структуры. (Из Р. С. Bridgman and Т. S. Reese, J.

Cell Biol. 99: 1655-1668, 1984. С разрешения Rockefeller University Press.) 3.1.4. Тепловое движение не только приводит молекулы в соприкосновение, но и отбрасывает их друг от друга [5] Две макромолекулы или одна макромолекула и одна малая молекула, сталкиваясь в результате простой диффузии, образуют комплекс.

Образование комплекса может произойти либо немедленно (в этом случае говорят, что скорость образования комплекса лимитируется диффузией), либо с некоторой задержкой, если взаимодействующие поверхности оказываются подогнанными друг к другу только после некоторой «подстройки» структуры одной или обеих молекул. В любом случае, Рис. 3-7. Принцип равновесия. Равновесие между молекулами А и Б и комплексом АБ поддерживается двумя показанными на схемах / и 2, противоположно направленными реакциями. Отношение констант скоростей ассоциации и диссоциации (3) равно константе равновесия реакции К.

Поскольку для того, чтобы прореагировать, молекулы А и Б в реакции 2 должны столкнуться, скорость этой реакции пропорциональна произведению концентраций А и Б. В результате в конечном выражении для К появляется произведение [А] • [Б] (квадратные скобки означают концентрацию). Принято, что концентрации продуктов ставятся в числитель, а концентрации реагентов - в знаменатель уравнения константы равновесия. Поэтому константа равновесия на схеме 3 относится к реакции ассоциации А + Б АБ, а величина, обратная ей, будет константой равновесия для реакции диссоциации АБ А + Б. Однако, когда мы имеем дело с простыми взаимодействиями связывания, правильнее говорить о константе сродства, или константе ассоциации, выражаемой в литрах на моль;

чем больше величина константы ассоциации (Ка), тем сильнее связывание между А и Б. Обратной к Ка является константа диссоциации, выражаемая в молях на литр;

чем меньше величина константы диссоциации Kd, тем сильнее связывание между А и Б.

Таблица 3-3. Соотношение между изменением свободной энергии и константой равновесия реакции (К) Свободная энергия [АБ] АБ – Свободная энергия А + Б = К (ккал/моль) [A][БA (л/моль) 105 -7, 104 -5, 103 -4, 102 -2, 10 -1, 1 10-1 1, 10-2 2, 10-3 4, 10-4 5, 10-5 7, Если реакция А + Б АБ достигла равновесия, то относительные количества компонентов А, Б и АБ будут зависеть от разницы в их свободной энергии, AG°. Приведенные выше значения рассчитаны для 37°С с помощью уравнения или где G0 выражена в килокалориях на моль и представляет собой изменение свободной энергии данной реакции в стандартных условиях (концентрация всех компонентов составляет 1,0 моль/л).

если две взаимодействующие молекулы достаточно сблизились, они образуют множественные слабые связи, которые сохраняются до тех пор, пока случайное тепловое движение не вызовет снова диссоциацию молекул.

В общем случае, чем сильнее связывание молекул в комплексе, тем меньше скорость диссоциации. В предельном случае, когда энергия образовавшихся связей пренебрежимо мала по сравнению с энергией теплового движения, две молекулы диссоциируют сразу же после столкновения. В другом предельном случае энергия связей столь велика, что диссоциации практически не происходит. Таким образом, величина энергии взаимодействия - полезный показатель специфичности процесса узнавания.

Чтобы разобраться, как измеряют энергию взаимодействия, рассмотрим реакцию связывания молекулы А с молекулой Б. Эта реакция будет протекать до тех пор, пока не достигнет положения равновесия, при котором скорости образующихся и диссоциирующих комплексов равны.

Используя равновесные концентрации молекул А, Б и комплекса АБ, можно определить константу равновесия К реакции (рис. 3-7). Эту константу иногда называют константой сродства и обычно используют в качестве меры силы связывания между двумя молекулами: чем сильнее связывание, тем выше значение константы сродства.

Константа равновесия реакции соединения двух молекул непосредственно связана с изменением в этой реакции стандартной свободной энергии G°. Используя соответствующее уравнение (табл. 3-3), можно вычислить G° для ряда значений К. Константы сродства реакций простого связывания в биологических системах обычно находятся в диапазоне от 103 до 1012 л/моль, что соответствует энергиям связывания от 4 до 17 ккал/моль, или возникновению в среднем от 4 до 17 водородных связей.

Самые сильные взаимодействия имеют место тогда, когда биологическая функция требует, чтобы две макромолекулы оставались тесно связанными в течение долгого времени, например, когда белок регуляторного гена связывается с ДНК, выключая ген (см. разд. 10.2.1). Самые слабые взаимодействия происходят, когда функция требует быстрого изменения в структуре комплекса, например, когда два взаимодействующих белка меняют партнеров при движениях белковой машины (см. разд. 1.3.1).

3.1.5. Атомы и молекулы находятся в постоянном движении [6] Химические реакции в клетке происходят поразительно быстро. Например, типичная молекула фермента катализирует ~ 1000 реакций в секунду, а для некоторых ферментов эта величина может достигать более 106 реакций в секунду. Поскольку для каждой реакции требуется отдельное столкновение между ферментом и молекулой субстрата, такие скорости возможны только потому, что молекулы быстро перемещаются.

Существует три типа молекулярных движений: 1) перемещение молекулы с одного места на другое (трансляционное движение), 2) быстрые колебания взад и вперед ковалентно связанных атомов друг относительно друга (вибрации) и 3) вращения. Все эти движения важны для приведения в контакт взаимодействующих молекул.

Скорости движения молекул могут быть измерены с помощью многих пектроскопических методов, которые показывают, например, что большой глобулярный белок постоянно находится в движении, вращаясь вокруг оси примерно миллион раз в секунду. Скорости диффузионных столкновений, обусловленных трансляционными движениями, пропорциональны концентрации диффузионных молекул. На- пример, если типичная внутриклеточная концентрация -1 мМ, то каждый участок белковой молекулы будет испытывать около 106 случайных столкновений в секунду с молекулами АТР;

если концентрация на порядок ниже, число столкновений упадет до 105 в секунду и т.д.

Если две молекулы столкнулись и находятся в правильной взаимной ориентации, химическая реакция между ними может произойти очень быстро. Узнав о том, как быстро движутся и реагируют молекулы, мы не должны удивляться наблюдаемой скорости ферментативного катализа.

3.1.6. Процесс молекулярного узнавания не может быть совершенно безошибочным [7] Все молекулы обладают энергией: кинетической энергией трансляционных движений, вибраций и вращений и потенциальной энергией, запасенной в электронных оболочках. Благодаря молекулярным столкновениям эта энергия случайным образом распределяется по разным атомам, так что, хотя уровень энергии большинства атомов близок к среднему, небольшая часть атомов будет обладать значительной энергией.

Благоприятные конформации, или состояния молекул, соответствуют минимуму свободной энергии (см. разд. 2.4.1), но при сильных столкновениях возникают высокие состояния энергии. Зная температуру, можно рассчитать вероятность того, что атом или молекула окажутся в этом энергетическом состоянии (см. табл. 3-3). Вероятность высокого энергетического состояния становится меньше вероятности низкого энергетического состояния по мере того, как увеличивается разность их свободных энергий. Она, однако, обращается в нуль лишь тогда, когда эта разность значений энергий становится бесконечной.

Из-за элемента случайности при молекулярных взаимодействиях время от времени происходит небольшое число «побочных реакций».

Поэтому клетка часто ошибается. Иногда происходят даже энергетически невыгодные реакции. Например, два атома, связанные ковалентно, при особо сильном столкновении могут разъединиться. Аналогичным образом специфичность фермента в отношении субстрата не может быть абсолютной, так как способность отличить одну молекулу от другой не может быть совершенной. Ошибки могли бы быть полностью устранены лишь в том случае, если бы в клетке развились механизмы с бесконечно большой разницей энергий альтернативных состояний. Поскольку это невозможно, клетки вынуждены мириться с определенным уровнем ошибок и использовать различные репарирующие реакции, чтобы исправлять те из них, которые являются наиболее опасными.

С другой стороны, как мы уже знаем, ошибки играют важную роль в живом мире. Если бы не случайные ошибки при синтезе ДНК, вряд ли эволюция была возможной (см. разд. 3.2.4).

Заключение В последовательности субъединиц макромолекул заключена информация, і определяющая пространственную конфигурацию их поверхности. Именно она используется для узнавания друг друга разными молекулами и разными частями одной и той же молекулы посредством слабых нековалентных связей. Молекулы находятся в постоянном быстром движении;

если при соударении в результате случайной диффузии, происходит узнавание, они связываются между собой с силой, которую можно выразить с помощью константы равновесия. Поскольку узнавание может быть безошибочным лишь при увеличении энергии взаимодействия до бесконечно большой величины, живые клетки постоянно допускают ошибки. При необходимости ошибки исправляются с помощью специальных механизмов репарации.

3.2. Нуклеиновые кислоты [8] 3.2.1. Гены состоят из ДНК [9] Еще в те времена, когда человек начал сеять культурные растения и разводить домашних животных, было очевидно, что каждое зернышко или оплодотворенная яйцеклетка должны содержать скрытый план или схему развития организма. Уже в наше время возникла генетика - наука, в основу которой легли представления о генах - невидимых, содержащих информацию элементах, равномерно распределяемых между двумя дочерними клетками при каждом клеточном делении. Чтобы передать дочерним клеткам полный набор генов, перед делением клетка должна сделать копию этих генов. Гены спермия и яйцеклетки передают наследственную информацию от поколения к поколению.

В наследовании биологических признаков используются совокупности атомов, подчиняющихся физическим и химическим законам.

Другими словами, гены должны состоять из молекул. Вначале трудно было представить себе природу этих молекул. Что это за молекула, которая могла бы храниться в клетке, направлять процесс развития организма и быть в то же время способной к точной и практически неограниченной репликации?

К концу XIX столетия биологи обнаружили, что хромосомы (которые становятся различимыми в ядре в начале деления) являются носителями наследственной информации. Но данные о том, что веществом, из которого состоят гены, является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) хромосом, были получены значительно позже при изучении бактерий. В 1944 г. было установлено, что очищенная ДНК одного бактериального штамма способна передавать наследственные свойства этого штамма другому штамму, несколько отличному от первого. Это открытие оказалось слишком неожиданным и не получило широкого признания до начала 50-х годов, так как считалось, что лишь белки обладают достаточно сложной конформацией, чтобы быть носителями заключенной в генах информации. Сегодня представление о том, что именно ДНК является носителем генетической информации (хранящейся в ее длинных полинуклеотидных цепях), столь прочно вошло в биологическое мышление, что порой трудно осознать, какой огромный пробел в наших знаниях заполнило это представление.

3.2.2. Молекулы ДНК состоят из двух длинных комплементарных цепей, удерживаемых вместе благодаря спариванию оснований [10] Учитывая простое химическое строение ДНК, легко понять, почему генетики с таким трудом признали в ней носителя наследственности.

ДНК - это длинный неразветвленный полимер, состоящий всего из четырех субъединиц-дезоксирибонуклеотидов, азотистые основания которых представлены аденином (А), цитозином (С), гуанином (G) и тимином (Т). Нуклеотиды связаны между собой ковалентными фосфодиэфирными связями, соединяющими 5'-атом углерода одного остатка с 3'-атомом углерода следующего остатка (схема 2-6). Основания четырех типов «нанизаны» на сахарфосфатную цепь наподобие четырех разных типов бусинок, надетых на одну нитку.

Рис. 3-8. Короткий участок двойной спирали ДНК. Показаны четыре пары комплементарных оснований (цветные) и дезоксирибоза (серая).

Следует обратить внимание, что две цепи ДНК закручены в противоположных направлениях и что каждая пара оснований удерживается вместе либо двумя, либо тремя водородными связями (см. также схему 3-2).

Как же может длинная полинуклеотидная цепь кодировать программу развития целого организма или даже одной клетки? И как эта программа передается от одного поколения клеток к другому? Ответ заключен в пространственной структуре молекулы ДНК.

Полученные в начале 50-х годов данные рентгеноструктурного анализа ДНК указывали на то, что молекула ДНК имеет форму спирали, состоящей из двух цепей. Спиральное строение ДНК не вызвало удивления, поскольку, как мы уже убедились, спирализация - частое явление для полимеров, состоящих из регулярно ориентированных субъединиц. Всех поразил тот факт, что ДНК состоит из двух цепей. В 1953 г. была предложена модель структуры ДНК, удовлетворяющая рентгеноструктурным данным и связывающая воедино структуру и функцию ДНК (рис. 3- и схема 3-2).

Согласно этой модели, разработанной Уотсоном и Криком, все основания ДНК расположены внутри двойной спирали, а сахарофосфатный остов - снаружи. Отсюда следует, что основания одной цепи должны быть очень сильно сближены с основаниями другой цепи.

Это предположение требовало наличия специфического связывания между большим пуриновым основанием (А или G, каждое из которых имеет двойной гетероцикл) одной цепи и меньшим по размеру пиримидиновым основанием (Т или С с одинарным гетероциклом) другой цепи.

И данные ранних биохимических опытов, и выводы из построенной модели приводили к заключению, что между А и Т и между G и С (так называемые пары оснований Уотсона и Крика) происходит комплементарное спаривание. Биохимические анализы препаратов ДНК, выделенных из разных видов, показали, что, хотя нуклеотидный состав ДНК широко варьирует (например, содержание А у разных видов бактерий колеблется от 13 до 36%), наблюдается общая закономерность: количество G всегда равно количеству С и количество А-количеству Т. Построенная модель показала, что число эффективных водородных связей, которые могут образоваться между G и С или между А и Т будет в этом случае больше, чем при любой другой комбинации. Таким образом, двухспиральная модель ДНК изящно объяснила количественные биохимические результаты.

3.2.3. Структура ДНК дает ключ к пониманию механизмов наследственности [11] Биологическая информация записана в гене в такой форме, что она может точно копироваться и передаваться клеткам-потомкам.

Огромное значение расшифровки структуры ДНК состоит в том, что предложенная Уотсоном и Криком модель позволила сформулировать общие принципы важнейшего процесса передачи генетической информации. Поскольку каждая цепь содержит последовательность нуклеотидов, в точности комплементарную последовательности цепи-партнера, то на деле обе цепи несут одну и ту же генетическую информацию. Если обозначить две цепи А и А', то цепь А служит шаблоном, или матрицей, для образования новой цепи А', а цепь А' может играть ту же роль в образовании новой цепи А. Таким образом, генетическая информация может копироваться при разделении цепей А и А', что позволяет каждой из них служить матрицей для образования нового комплементарного партнера.

Уже сам по себе механизм комплементарного копирования указывает, что наследственная информация ДНК записана в линейной последовательности нуклеотидов. Каждый нуклеотид - А, G, Т или С - можно рассматривать как букву в простом четырехбуквенном алфавите, который используется для написания биологических инструкций в виде линейной «телеграфной ленты». Животные разных видов отличаются друг от друга, потому что молекулы ДНК их клеток имеют различную последовательность нуклеотидов и, следовательно, различное информационное содержание.

Число различных последовательностей ДНК, которые могут быть составлены из п нуклеотидов, равно 4n. Поэтому ДНК даже умеренной длины способна обеспечить колоссальное биологическое разнообразие, а типичная клетка животного содержит ДНК длиной около метра (3· нуклеотидов). Записанный в виде линейной последовательности один необычно маленький ген человека занял бы четверть страницы текста (рис. 3 9), а записанная в таком виде генетическая информация клетки человека представляла собой книгу в 500000 страниц!

Хотя принцип репликации генов прост и элегантен, реальный клеточный аппарат копирования сложен и включает в себя много различных белков. Основная реакция показана на рис. 3-10. Фермент ДНК-полимераза катализирует присоединение дезоксирибонуклеотида к 3' концу цепи ДНК. Каждый нуклеотид вступает в реакцию в форме дезоксирибонуклеозидтрифосфата;

высвобождение из этой активированной формы пирофосфата и его последующий гидролиз обеспечивают энергией реакцию репликации ДНК и делают ее фактически необратимой (см.

разд. 5.3).

Репликация ДНК начинается с локального разделения двух комплементарных цепей. Затем каждая цепь используется в качестве матрицы для образования новой молекулы ДНК путем последовательного присоединения дезоксирибонуклеотидов. Выбор каждого следующего нуклеотида происходит на основе его способности образовывать комплементарную пару с очередным нуклеотидом родительской матричной цепи (рис. 3-10). В результате генетическая информация полностью удваивается - в конце концов образуются две полные двойные спирали ДНК, каждая из которых идентична родительской молекуле ДНК по последовательности нуклеотидов. Поскольку две цепи родительской молекулы в конце концов оказываются в разных дочерних молекулах ДНК, механизм репликации называют «полуконсервативным» (рис. 3-11).

Рис. 3-9. Последовательность ДНК гена -глобулина человека (одной из двух субъединиц молекулы гемоглобина, переносящего кислород в крови взрослого человека). Показана только одна из двух цепей ДНК («кодирующая цепь»), вторая цепь имеет комплементарную последовательность. Последовательность следует читать слева направо, строка за строкой, как обычный текст.

3.2.4. Ошибки репликации ДНК приводят к мутациям [12] Наиболее впечатляющая особенность репликации ДНК - ее высокая точность. Для устранения неправильно расположенных нуклеотидов используется несколько «корректорских» механизмов, в результате их работы последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК копируется очень точно (одна ошибка на 109 присоединенных нуклеотидов).

Но иногда, хотя и очень редко, репликативная машина пропускает несколько оснований или вставляет несколько лишних, включает Т вместо С или А вместо G. Каждое такое изменение последовательности ДНК - генетическая ошибка, называемая мутацией. Такие ошибки будут Рис. 3-10. Основная реакция при синтезе новых молекул ДНК -это добавление дезоксирибонуклеотида к 3'-концу растущей цепи. Показано, как спаривание оснований поступающих дезоксирибонуклеотидов и исходной (матричной) цепи ДНК направляет образование дочерней цепи ДНК с комплементарной последовательностью оснований.

Рис. 3-11. Полуконсервативная репликация ДНК. В каждом цикле репликации каждая из двух цепей ДНК используется в качестве матрицы для образования новой комплементарной цепи. Поэтому на протяжении многих клеточных поколений исходные цепи сохраняют свою целостность.

воспроизводиться во всех последующих поколениях клеток, так как «плохие» последовательности ДНК копируются столь же успешно, как и «хорошие». Последствия такой ошибки могут быть существенными, поскольку даже один измененный нуклеотид способен оказать большое влияние на работу клетки, в зависимости от того, где эта мутация произошла.

В начале 40-х годов генетики окончательно доказали, что единицы последовательности, называемые генами, определяют структуру индивидуальных белков. Поэтому мутация гена, вызванная изменением последовательности его ДНК, может инактивировать ключевой белок, и клетка тогда погибнет. В результате измененная последовательность ДНК потеряется. Мутация может произойти в несущественном участке и не будет иметь эффекта;

такие мутации называют молчащими. Очень редко в результате мутации образуется ген с улучшенными или новыми полезными функциями. В этих случаях несущий мутацию организм будет иметь преимущества и мутантный ген может в конце концов путем естественного отбора заменить исходный ген в большей части популяции.

3.2.5. Последовательность нуклеотидов в гене определяет последовательность аминокислот в белке [13] Химически ДНК относительно инертна. Содержащаяся в ней информация выражается опосредованно через другие молекулы: ДНК направляет синтез специфических РНК и белковых молекул, которые и определяют химические и физические свойства клеток.

Примерно в то же время, когда биофизики с помощью дифракции рентгеновских лучей исследовали пространственную структуру ДНК, биохимики интенсивно изучали химическое строение белков. Уже было известно, что белки - это цепи аминокислот, последовательно соединенных пептидными связями;

но лишь в начале 50-х годов, когда была определена последовательность аминокислот маленького белка инсулина (рис. 3-12), было установлено, что каждый тип белка образует полипептидная цепь со строго определенной последовательностью аминокислот.

Подобно тому как для выяснения молекулярных основ генетики и наследственности решающую роль сыграла расшифровка структуры ДНК, определение последовательности инсулина имело основополагающее значение для выяснения структуры и функций белков. Если инсулин имеет определенную генетически детерминированную последовательность, то, видимо, то же относится и ко всем другим белкам. Более того, можно предположить, что свойства того или иного белка должны зависеть от той конкретной последовательности, в которой расположены в этом белке аминокислоты.

И ДНК, и белки образованы линейной последовательностью мономеров. В результате биохимического анализа белков - продуктов мутантных генов - в конце концов было показано, что последовательность двух этих полимеров колинеарна: последовательность нуклеотидов Рис. 3-12. Последовательность аминокислот инсулина крупного рогатого скота. Инсулин - маленький белок, состоящий из двух полипептидных цепей, каждая из которых обладает уникальной, генетически детерминированной последовательностью аминокислот. Для обозначения аминокислот использованы трехбуквенные символы, приведенные на схеме 2-5. Показаны дисульфидные (-S-S-) связи между остатками цистеина.

Изначально белок синтезируется как одна длинная полипептидная цепь (кодируемая одним геном), которая затем разделяется, давая две цепи (см.

рис. 3-48).

в участке ДНК, кодирующем белок, соответствует последовательности аминокислот в этом белке. Стало очевидным, что последовательность ДНК содержит закодированную информацию о белковых последовательностях. Центральной проблемой молекулярной биологии стал вопрос о том, как же клетка осуществляет такое биохимически сложное превращение, как перевод последовательности нуклеотидов ДНК в последовательность аминокислот белка.

3.2.6. С последовательностей ДНК снимаются РНК-копии для синтеза белка [14] При синтезе белка определенные участки ДНК, называемые генами, копируются в виде другого полинуклеотида - рибонуклеиновой кислоты, или РНК, - отличающегося от ДНК как по химическому составу, так и по выполняемой функции. Подобно ДНК, РНК образована линейной последовательностью нуклеотидов, но имеет два небольших химических отличия: 1) вместо дезоксирибозы сахарофосфатный остов содержит сахар рибозу и 2) вместо основания тимина (Т) в РНК содержится близкородственное основание урацил (U) (см. рис. 3-6).

РНК сохраняет все информационное содержание той ДНК, копией которой она является, а также способность к спариванию комплементарных оснований. Синтез молекул РНК называется транскрипцией ДНК;

во многих отношениях он аналогичен репликации ДНК.

Одна из цепей ДНК служит матрицей, на которой испытывается способность очередных нуклеотидов к комплементарному спариванию. При хорошем соответствии с ДНК-матрицей рибонуклеотид включается в растущую цепь РНК как ковалентно связанная составная часть. Таким способом цепь РНК удлиняется последовательным добавлением одного нуклеотида.

Транскрипция отличается от репликации ДНК рядом особенностей. Во-первых, РНК-продукт не остается комплементарно связанным с ДНК-матрицей. Как только синтез копии РНК завершен, исходная двойная спираль ДНК восстанавливается, а молекула РНК освобождается. Таким образом, молекулы РНК одноцепочечные. Более того, молекулы РНК короче ДНК, так как являются копиями участков ДНК ограниченной длины, достаточной для кодирования одного или нескольких белков (рис. 3-13). РНК-транскрипты, направляющие синтез Рис. 3-13. Передача информации от ДНК к белку осуществляется с помощью РНК-посредника, называемого мРНК. У прокариотических клеток этот процесс проще, чем у эукариотических. У эукариот кодирующие участки ДНК-экзоны (выделены цветом) разделены некодирующими участками (интронами). Показано, что для образования мРНК интроны должны удаляться.

белковых молекул, называются информационными (матричными) РНК (мРНК);

другие РНК-транскрипты используются как транспортные РНК (тРНК) (см. разд. 3.2.10), образуют компоненты рибосом (рибосомные, рРНК, см. разд. 3.2.10) или более мелкие нуклеопротеиновые частицы. Количество молекул РНК, копируемых с определенного участка ДНК, контролируется регуляторними белками, которые связываются со специфическими участками ДНК, закрывая кодирующие последовательности гена (см. разд. 10.2.1). В любой клетке в любой момент времени некоторые гены используются для синтеза РНК в очень больших количествах, тогда как другие гены не транскрибируются совсем. Для некоторых активных генов в каждом клеточном поколении один и тот же участок ДНК может транскрибироваться тысячи раз. Поскольку каждая молекула РНК может транслироваться во многие тысячи копий, то информация, содержащаяся в маленьком участке ДНК, может направлять синтез миллионов копий специфического белка. Например, белок фиброин - основной компонент шелка: один ген фиброина в каждой клетке шелкоотделительной железы производит 104 копий мРНК, на каждой из которых синтезируется 105 молекул фиброина, что за 4 сут дает 109 молекул фиброина на клетку.

3.2.7. Молекулы РНК эукариотических клеток подвергаются сплайсингу, чтобы убрать интронные последовательности [15] В бактериальных клетках большинство белков кодируется одной непрерывной последовательностью ДНК, которая копируется без изменения с образованием молекулы мРНК. В 1977 г. молекулярные биологи были изумлены, обнаружив, что у большинства эукариотических генов кодирующие последовательности (названные экзонами), чередуются с некодирующими последовательностями (названными нитронами). Для производства белка весь ген, включая и интроны, и экзоны, транскрибируется в очень длинную молекулу РНК (первичный транскрипт). Перед тем как эта молекула РНК покинет ядро, комплекс ферментов, осуществляющих процессинг РНК, удаляет у нее все последовательности интронов, делая молекулу РНК значительно короче. После завершения этой стадии процессинга РНК, которая носит название сплайсинга РНК, молекула РНК выходит в цитоплазму уже как мРНК и направляет синтез определенного белка (см. рис. 3-13).

Этот кажущийся расточительным способ передачи информации развился у эукариот, видимо, потому, что он делает синтез белка значительно более гибким. Например, первичные транскрипты РНК одного и того же гена могут подвергаться сплайсингу разными способами, давая разные мРНК в зависимости от клеточного типа или стадии развития. Это позволяет производить разные белки под контролем одного и того же гена. Более того, поскольку присутствие многочисленных нитронов облегчает генетическую рекомбинацию между экзонами, такой способ устройства гена, видимо, имел огромное значение в ранней эволюционной истории, ускоряя процесс, посредством которого организмы синтезировали новые белки из частей ранее существовавших, вместо того, чтобы вырабатывать целиком новые последовательности.

Рис. 3-14. Три рамки считывания, возможные при синтезе белка. Последовательность нуклеотидов РНК считывается по порядку от 5'- к 3'-концу по три нуклеотида и таким образом переводится в последовательность аминокислот. Поэтому одна и та же последовательность РНК может в принципе в зависимости от «рамки считывания» кодировать три совершенно различные последовательности аминокислот.

3.2.8. Последовательность мРНК «считывается» группами по три нуклеотида и переводится в последовательность аминокислот [16] Правила перевода последовательности полинуклеотидов в аминокислотную последовательность белков - так называемый генетический код - были расшифрованы в начале 60-х годов. Оказалось, что последовательность нуклеотидов молекулы мРНК - посредника при передаче информации от ДНК к белку - считывается по порядку группами из трех нуклеотидов. Каждый триплет нуклеотидов, или кодон, определяет включение одной аминокислоты, и в принципе каждая молекула мРНК может быть прочитана в любой из трех рамок считывания в зависимости от того, с какого именно нуклеотида молекулы начался процесс декодирования (рис. 3-14). Почти всегда лишь одна из трех рамок считывания дает функциональный белок. Так как, за исключением начала и конца кодирующего участка, информация записана в РНК без знаков препинания, рамка считывания устанавливается при инициации трансляции и сохраняется на протяжении всего процесса.

Поскольку РНК является линейным полимером, состоящим из нуклеотидов четырех типов, то всего имеется 43 = 64 возможных триплета (напомним, что важное значение имеет последовательность нуклеотидов триплета). Учитывая, что в белках находят всего 20 различных аминокислот, можно сделать вывод, что большинство аминокислот должно кодироваться несколькими триплетами;

другими словами генетический код вырожден. Генетический код, представленный на рис. 3-15, оказался чрезвычайно консервативным в эволюции: за небольшими исключениями он остается одинаковым у таких разных организмов, как бактерии, растения и человек.

3.2.9. Соответствие между аминокислотами и триплетами нуклеотидов устанавливают молекулы тРНК [17] Кодоны мРНК узнают соответствующие аминокислоты не прямым путем - не так, как фермент узнает субстрат. При трансляции использу- Рис. 3-15. Генетический код. При синтезе белка триплеты нуклеотидов РНК (кодоны) транслируются в соответствующие им аминокислоты.

Например, кодоны GUG и GAG направляют в белок соответственно валин и глутаминовую кислоту. Обратите внимание, что кодоны с U или С во втором положении обычно кодируют более гидрофобные аминокислоты (схема 2-5).

Рис. 3-16. Фенилаланиновая тРНК дрожжей. А. Молекула изображена в форме «кленового листа», чтобы показать комплементарное спаривание (выделено серым) внутри спиральных участков молекулы. Б. Схематическое изображение реальной формы молекулы, основанное на данных рентгеноструктурного анализа. Комплементарное спаривание обозначено серыми линиями. Нуклеотиды, участвующие в некомплементарном спаривании оснований, удерживающем вместе сегменты цепи, выделены цветом, а соответствующие пары оснований пронумерованы и связаны цветными пунктирными линиями, которые соответствуют цветным линиям в А. В. Необычное взаимодействие между парами оснований. Одно основание образует водородные связи с двумя другими;

несколько таких «троек оснований» помогают свертывать эту молекулу тРНК.

ются «адапторы» - молекулы, узнающие и аминокислоту, и триплет нуклеотидных оснований. Роль адапторов выполняет набор маленьких (длиной всего около 80 нуклеотидов каждая) молекул РНК, называемых транспортными РНК (или тРНК).

Каждая молекула тРНК имеет характерную пространственную структуру, поддерживаемую теми же нековалентными взаимодействиями, которые удерживают вместе две цепи в двойной спирали ДНК. Однако в одноцепочечной молекуле тРНК комплементарное спаривание между нуклеотидными основаниями происходит в пределах одной цепи. Это приводит к тому, что молекула тРНК принимает определенную конформацию, существенную для выполнения функций адаптора. Четыре коротких сегмента молекулы образуют двухспиральную структуру, придающую молекуле вид двумерного «кленового листа». Этот кленовый лист в свою очередь упаковывается в многоскладчатую L-образную фигуру, которая скрепляется более сложными взаимодействиями на основе водородных связей (рис. 3-16). Два набора неспаренных нуклеотидных остатков по обоим концам «L» играют особенно важную роль для функционирования молекулы тРНК в биосинтезе белка: один из них образует антикодон, способный спариваться с комплементарным триплетом молекулы мРНК (кодоном);

другой, имеющий последовательность ССА на 3' конце молекулы, ковалентно связывается со специфической аминокислотой (рис. 3-16, А).

3.2.10. Считывание мРНК от одного конца до другого осуществляют рибосомы [18] Перенос информации от мРНК к белку основан на том же принципе спаривания комплементарных оснований, что и перенос генетической информации от ДНК к ДНК и от ДНК к РНК (рис. 3-17). Однако процесс правильного расположения молекул тРНК на мРНК сложен и осуществляется рибосомами, комплексами, образованными более чем 50 различными белками, связанными с несколькими молекулами РНК (рРНК), выполняющими структурную роль. Каждая рибосома работает как большая биохимическая машина, на которой молекулы тРНК выстроены так, чтобы считывать закодированные в мРНК генетические инструкции. Сначала рибосома связывается со специальным участком молекулы мРНК и таким образом определяет рамку считывания и ами- Рис. 3-17. Поток информации при синтезе белка. С участка в одной из цепей ДНК снимается комплементарная копия - матричная РНК. Затем нуклеотиды матричной РНК последовательно триплет за триплетом связывают комплементарные нуклеотиды антикодоновой петли определенных молекул тРНК. К противоположному концу каждой молекулы транспортной РНК (тРНК) прикреплена специфическая аминокислота и после спаривания эта аминокислота присоединяется к концу растущей белковой цепи. Таким образом, перевод последовательности нуклеотидов мРНК в последовательность аминокислот белка основан на комплементарном спаривании кодонов мРНК с антикодонами соответствующих молекул тРНК.

Молекулярные основы переноса информации при трансляции оказываются аналогичными таковым при репликации и транскрипции ДНК. Заметим, что и синтез, и трансляция мРНК начинаются с 5'-конца.

ноконцевую аминокислоту белка. Затем рибосома по мере передвижения по молекуле мРНК транслирует кодон за кодовом, используя молекулы тРНК для последовательного присоединения аминокислот к растущему концу полипептидной цепи (рис. 3-18). Достигнув конца кодирующей части матрицы, рибосома и новосинтезированный карбоксильный конец белка отсоединяются от 3'-конца мРНК и переходят в цитоплазму клетки.

Рибосомы работают очень эффективно: в 1 с одна бактериальная рибосома присоединяет к растущей полипептидной цепи 20 аминокислот.

Подробнее структура рибосом и механизм синтеза белка описаны в гл. 5.

3.2.11. Некоторые молекулы РНК функционируют как катализаторы [19] Когда-то молекулы РНК рассматривались как цепочка нуклеотидов с относительно неинтересными химическими свойствами. В 1981 г.

эта точка зрения была поколеблена открытием каталитической молекулы РЫК с такими изощренными химическими свойствами, которые биохимики раньше связывали только с белками. Рибосомные молекулы РНК ресничного простейшего Tetrahymena вначале были синтезированы как большая группа предшественников. Было показано, что одна из рРНК получается путем реакции сплайсинга РНК. Удивительным в этом открытии было то, что сплайсинг можно осуществить in vitro в отсутствие белка. Позже было показано, что сама интронная последовательность обладает ферментоподобной активностью и может катализировать двухступенчатую реакцию, показанную на рис. 3-19.

Рис. 3-18. Схема синтеза белка на рибосомах. Рибосомы присоединяются к стартовому сигналу вблизи 5'-конца молекулы мРНК и передвигаются к 3'-концу, синтезируя по пути белок. Часто по одной молекуле мРНК движутся одновременно несколько рибосом, синтезируя несколько идентичных полипептидных цепей;

такая структура в целом называется полирибосомой.

Рис. 3-19. Схема реакции самосплайсинга, при которой последовательность интрона катализирует собственное вырезание из молекулы рибосомной РНК у Tetrahymena. Реакция начинается с присоединения нуклеотида G к интронной последовательности, в результате чего происходит разделение цепи РНК. Затем вновь образованный 3'-конец цепи РНК подходит к другому концу и отделяет его, завершая реакцию.

В ходе дальнейших исследований было установлено, что синтезированная в пробирке интронная последовательность длиной в нуклеотидов сворачивается с образованием структуры, способной функционировать как фермент в реакциях с другими молекулами РНК.

Например, эта молекула способна связывать два специфических субстрата: нуклеотид гуанин и цепь РНК, и затем катализировать их ковалентное связывание, так что цепь РНК разрезается в специфической точке (рис. 3-20).

Рис. 3-20. Ферментоподобная реакция, катализируемая очищенной интронной последовательностью РНК у Tetrahymena. В этой реакции, которая соответствует первой стадии реакции, приведенной на рис. 3-19, и специфическая субстратная молекула РНК, и нуклеотид G тесно связываются с поверхностью каталитической молекулы РНК. Затем нуклеотид ковалентно связывается с субстратной молекулой РНК, разрезая ее в специфическом центре. Освобождение в результате этого двух цепей молекулы РНК дает возможность интронным последовательностям участвовать в дальнейших циклах реакции.

Рис. 3-21. Двумерное изображение каталитического остова интронной последовательности РНК, представленной на рис. 3-19 и рис. 3-20.

Нормальные комплементарные пары оснований выделены цветом, а более слабые взаимодействия пар оснований показаны черным. Эта молекула содержит около 240 нуклеотидов;

в нормальных условиях она свернута в плотную трехмерную структуру, но ее точная конформация неизвестна.

РНК, способные к самосплайсингу и имеющие подобную структуру, были обнаружены в митохондриях грибов и в бактериальном вирусе (бактериофаг Т4).

В этой модельной реакции, которая соответствует первому шагу реакции на рис. 3-19, та же интронная последовательность действует многократно, разрезая многие цепи РНК. Хотя обычно сплайсинг РНК проходит без автокатализа, самосплайсинг РНК, установленный у Tetrahymena, был открыт и в других типах клеток, включая грибы и бактерии. Это позволяет предположить, что такие последовательности РНК могли возникнуть до расхождения родословных эукариот и прокариот около 1,5 млрд. лет назад.

В последнее время были открыты некоторые другие семейства каталитических РНК. Например, большинство тРНК изначально синтезировались как предшественники РНК, затем было показано, что одна молекула РНК играет основную каталитическую роль в РНК-белковом комплексе, распознавая эти предшественники и разрезая их в специфических точках. Катализирующая последовательность РНК играет также важную роль в жизненном цикле многих растительных вирусов, подобная последовательность обнаружена в РНК лягушки, хотя ее роль в данном случае не доказана. Более примечательно то, что обнаружение катализа на основе РНК дает теперь основания подозревать, что рибосомы обладают более широкими функциями, чем предполагалось. Весьма вероятно, что рибосомные белки играют второстепенную роль по сравнению с рибосомными РНК, которые составляют более половины массы рибосомы.

Каким образом молекулы РНК могут действовать наподобие ферментов? Пример тРНК показывает, что молекулы РНК могут складываться высокоспецифичным образом. Предложенная двумерная структура остова интронной последовательности Tetrahymena, способной к самосплайсингу, представлена на рис. 3-21. Взаимодействия между разными участками этой молекулы РНК (аналогичные необычным водородным связям в молекулах тРНК - см. рис. 3-16) ответственны за ее дальнейшее сворачивание с образованием сложной трехмерной поверхности с каталитическими свойствами. Необычное взаимное расположение атомов может деформировать ковалентные связи и, следовательно, придавать отдельным атомам в свернутой цепи РНК необычную реакционноспособность.

Как указывалось в гл. 1, открытие каталитических молекул РНК в корне изменило наши представления о происхождении первых живых клеток (см. разд. 1.З.4.).

Заключение Генетическая информация записана в линейной последовательности нуклеотидов ДНК. Каждая молекула ДНК состоит из двух комплементарных полинуклеотидных цепей, удерживаемых вместе водородными связями, образующими GC- и АТ-пары оснований. Репликация ДНК, обеспечивающая удвоение генетической информации, происходит путем образования новой комплементарной цепи на каждой из исходных цепей.

Экспрессия генетической информации, заключенной в ДНК, осуществляется путем трансляции линейной последовательности нуклеотидов в колинеарную последовательность аминокислот белка. Сначала ограниченный участок ДНК копируется на комплементарную цепь РНК. Этот первичный транскрипт РНК подвергается сплайсингу для удаления интронных последовательностей и превращается в молекулу мРНК. В конце концов мРНК транслируется с образованием белка путем сложного набора реакций, происходящих в рибосоме. Вначале аминокислоты, используемые для синтеза белка, прикрепляются к семейству молекул тРНК, каждая из которых путем комплементарного спаривания оснований узнает набор из трех нуклеотидов мРНК. Последовательность нуклеотидов мРНК считывается с одного конца к другому триплетами нуклеотидов в соответствии с универсальным генетическим кодом.

Другие молекулы РНК в клетках используются как ферментоподобные катализаторы. Эти молекулы РНК сворачиваются с образованием такой структуры, в которой некоторые нуклеотиды поверхности могут стать необычно активными.

3.3. Структура белка [20] Клетки в значительной степени состоят из белков, на долю которых приходится более половины их сухого вещества (см. табл. 3-1). Белки определяют структуру и форму клетки;

кроме того, они служат инструментами молекулярного узнавания и катализа. ДНК, хотя и содержит всю необходимую для построения клетки информацию, оказывает незначительное прямое воздействие на клеточные процессы. Например, ген гемоглобина сам не переносит кислород: это свойство белка, кодируемого им. Используя компьютерную терминологию, можно сказать, что ДНК и мРНК представляют собой «программное обеспечение» - инструкции, полученные клеткой от родительской клетки. Белки и молекулы каталитических РНК составляют «аппаратное обеспечение» - физические механизмы, осуществляющие хранящуюся в памяти программу.

ДНК и РНК представляют собой цепи, построенные из нуклеотидов, химически очень похожих друг на друга. Напротив, молекулы белков собраны из 20 очень разных аминокислот, каждая из которых обладает ярко выраженной химической индивидуальностью. Это разнообразие лежит в основе необычайной универсальности химических свойств различных белков, и, по-видимому, эволюция выбрала именно белки, а не молекулы РНК в качестве катализаторов большинства реакций в клетке.

3.3.1. Форма белковой молекулы определяется ее аминокислотной последовательностью [21] В длинной полипептидной цепи возможно свободное вращение атомов вокруг многих связей, что делает остов белковой молекулы очень гибким. Поэтому любая белковая молекула в принципе может принимать почти бесконечно большое число различных форм {конформаций).

Однако большинство полипептидных цепей существуют лишь в одной из Рис. 3-22. Схематически показано, как белок свертывается в глобулу. Полярные боковые группы аминокислот стремятся расположиться на наружной поверхности белка, где они могут взаимодействовать с водой. Неполярные боковые группы аминокислот расположены внутри, где образуют «спрятанное» от воды гидрофобное «ядро».

этих конформаций, определяемой последовательностью аминокислот. Это обусловлено тем, что боковые группы аминокислот взаимодействуют друг с другом и с водой с образованием слабых нековалентных связей (см. схему 3-1). В этом случае соответствующие боковые группы оказываются в ключевых местах цепи, между ними образуются сильные связи, что делает определенную конформацию очень стабильной.

Полипептидная цепь большинства белков самопроизвольно сворачивается с образованием правильной конформаций. При обработке определенными агентами белок можно развернуть, или денатурировать;

при прекращении действия денатурирующего агента белок обычно самопроизвольно возвращается к исходной конформаций. Это указывает на то, что вся необходимая информация для определения формы белка содержится в самой последовательности аминокислот.

Одним из важнейших факторов, направляющих свертывание полипептидной цепи, является расположение полярных и неполярных боковых групп. Многочисленные гидрофобные боковые группы стремятся собраться внутри белковой молекулы, что позволяет им избежать контакта с водным окружением (точно так же сливаются механически диспергированные в воде капельки масла). В то же время все полярные группы стремятся, наоборот, расположиться на поверхности молекулы белка, где они могут взаимодействовать с водой и другими полярными группами (рис. 3-22). Именно таким путем происходит спаривание почти всех полярных групп, оказывающихся внутри белковой глобулы. Таким образом, водородные связи играют главную роль во взаимодействии разных участков одной полипептидной цепи в свернутой молекуле белка;

кроме того, они имеют исключительно важное значение для многих взаимодействий, происходящих на поверхности белковых молекул (рис. 3-23).

Секретируемые белки, или белки клеточной поверхности, часто образуют дополнительные ковалентные связи между разными участками одной и той же полипептидной цепи. Например, образование дисуль- Рис. 3-23. Водородные связи (выделены цветом), которые могут образовываться между аминокислотами в белках. Пептидные связи обозначены серым.

Рис. 3-24. Образование ковалентной дисульфидной связи между соседними остатками цистеина белка.

фидных связей (называемых также —S—S-мостиками) между двумя SH-группами цистеина, оказавшимися по соседству в свернутой полипептидной цепи, стабилизирует пространственную структуру внеклеточных белков (рис. 3-24). Для правильного свертывания белков эти связи не нужны, поскольку оно происходит нормально в присутствии восстанавливающих агентов, препятствующих образованию —S—S-мостиков. В самом деле, —S—S-мостики образуются редко (если образуются вообще) у белковых молекул в цитозоле, где высока концентрация агентов, восстанавливающих SH-группы и разрушающих такие мостики (см. разд. 8.6.11).

Общий результат всех индивидуальных взаимодействий аминокислот состоит в том, что большинство молекул белка спонтанно принимает характерную для них конформацию: обычно компактную глобулярную, но изредка и вытянутую фибриллярную. Сердцевина глобулы образована плотно упакованными, почти как в кристалле, гидрофобными боковыми группами, а полярные боковые группы формируют сложную и нерегулярную наружную поверхность. Специфичность связывания белка с малыми молекулами и другими макромолекулярными поверхностями определяется расположением и химическими свойствами различных атомов на этой сложной поверхности (см. ниже). С химической точки зрения белки - наиболее сложные из известных молекул.

3.3.2. Одни и те же способы укладки цепи постоянно повторяются в разных белках [22] Хотя аминокислотная последовательность полипептидной цепи и содержит всю необходимую для ее свертывания информацию, мы до сих пор не знаем, как эту информацию прочесть, чтобы по последовательности детально предсказать пространственную структуру белка. В результате нативную конформацию белка можно определить лишь с помощью очень трудоемкого метода рентгеноструктурного анализа белковых кристаллов. Этим методом к настоящему времени полностью проанализировано более 100 белков. Специфическая конформация каждого из них столь сложна, что для ее детального описания потребовалась бы целая глава.

При сравнении пространственной структуры различных белков выяснилось, что, хотя конформация каждого белка уникальна, несколько способов укладки цепи постоянно повторяются в отдельных частях макромолекул. Особенно часто встречаются два способа укладки, поскольку они обусловлены регулярным образованием водородных связей между самими пептидными группами, а не уникальными взаимодействиями боковых цепей. Оба способа были правильно предсказаны Рис. 3-25. -Слой - это обычная структура участков глобулярных белков. Сверху показан включающий 115 аминокислот домен молекулы иммуноглобулина. Он состоит из двух - слоев, уложенных наподобие сандвича, один из которых выделен цветом. Внизу более детально изображен совершенный антипараллельный -слой. Обратите внимание на то, что каждая пептидная группа образует водородные связи с соседними пептидными группами. -Слои, встречающиеся в глобулярных белках, обычно несколько менее регулярны, чем показанная здесь структура;

часто - слои оказываются слабо скрученными (см. рис. 3-27).

в 1951 г. с помощью моделей, основанных на результатах рентгеноструктурного анализа шелка и волос. Сейчас эти периодические структуры называют -кладчатым слоем и -спиралью. В -складчатой конформации находится белок шелка фиброин, -спираль обнаружена в -кератине - белке кожи и ее производных (волосах, ногтях и перьях).

Структура -складчатого слоя составляет существенную часть сердцевины (core) большинства (хотя и не всех) глобулярных белков.

На рис. 3-25 для примера показана часть молекулы антитела;

антипараллельный - слой этой молекулы образован в результате многократного изгибания полипептидной цепи на 180°, так что направление каждого прямого участка цепи противоположно направлению ближайших соседних участков. Такая структура обладает высокой прочностью, обусловленной образованием водородных связей между пептидными группами соседних участков цепи. Поэтому антипараллельный -слой часто служит каркасом, на котором собирается глобулярный белок.

-Спираль образуется при закручивании полипептидной цепи вокруг себя с образованием жесткого цилиндра, в котором каждая пептидная группа связывается водородными связями с ближайшими пептидными группами цепи. Многие глобулярные белки содержат короткие участки таких -спиралей (рис. 3-26);

участки трансмембранного белка, который проходит сквозь липидный бислой, также почти всегда являются -спиралями в силу сжатия, испытываемого им со стороны гидрофобного липидного окружения (см. разд. 6.2.1). В водной среде изолированная -спираль обычно неустойчива. Однако две одинаковые -спирали, имеющие повторяющиеся участки неполярных групп цепей, могут последовательно обвиваться вокруг друг друга с образованием чрезвычайно устойчивой структуры. Такие длинные стержневидные структуры обнаружены во многих фибриллярных белках, в частности во внутри- Рис. 3-26. -Спираль - еще одна общая структура, обычно образующаяся в отдельных участках полипептидной цепи белков. А. Показана переносящая кислород молекула миоглобина (длиной 153 аминокислоты);

один из -спиральиых участков выделен цветом. Б. Детальное изображение совершенной -спирали. Как и в -слое, каждая пептидная группа связана с соседними пептидными группами водородными связями.

В. Атомы в аминокислотном остатке. Заметим, что в Б боковые группы аминокислот для упрощения опущены (они расположены на наружной поверхности спирали. В В они обозначены как R на атоме -углерода каждой аминокислоты (см. также рис. 3-27).

Рис. 3-27. Пространственные модели -спирали и -СЛОЯ. Слева структуры показаны без боковых групп аминокислот, справа - с боковыми группами. А. -Спираль (часть структуры миоглобина). Б. Участок -СЛОЯ (часть структуры домена иммуноглобулина). На фотографиях слева каждая поверхность цепи представлена только одним черным атомом (группы R на рис. 3-25 и рис. 3-26);

вся поверхность цепи показана справа. (С любезного разрешения Richard J. Feldmann.) клеточных волокнах -кератина, обусловливающих прочность кожи. Пространственные модели -спирали и -складчатого слоя белков с боковыми группами и без них представлены на рис. 3-27.

3.3.3. Молекулы белков характеризуются чрезвычайным разнообразием [23] Различия в природе боковых групп аминокислот обусловливает замечательное разнообразие возможных типов пространственной структуры белков. Рассмотрим в качестве примера крайних случаев два типа белков, секретируемых клетками соединительной ткани, - коллаген и эластин, которые относятся к белкам внеклеточного матрикса. В коллагене три отдельные полипептидные цепи, богатые пролином и содержащие в каждом третьем положении глицин, закручены одна вокруг другой и образуют тройную спираль (см. разд. 14.2.6). Эти молекулы коллагена в свою очередь упаковываются в волокна, в которых соседние молекулы скреплены ковалентными сшивками между соседними лизиновыми остатками. В результате формируются волокна, способные выдерживать исключительно большую нагрузку (рис. 3-28).

Другой предельный случай - эластин, в котором относительно рыхлые и неструктурированные полипептидные цепи образуют благодаря ковалентным сшивкам резиноподобную эластичную сеть, которая дает возможность таким тканям, как артерии и легкие, деформироваться и растягиваться, не причиняя себе вреда. Как показано на рис. 3-29, эластичность обусловлена способностью индивидуальных молекул обратимо разворачиваться под действием растягивающего усилия.

Рис. 3-28. Молекула коллагена - это тройная спираль, образованная тремя вытянутыми белковыми цепями. Множество сшитых вместе стержнеобразных молекул коллагена образует прочные нерастяжимые коллагеновые фибриллы (вверху), которые обладают прочностью на растяжение, сравнимой с прочностью стали.

Рис. 3-29. Эластин состоит из полипептидных цепей, образующих благодаря поперечным сшивкам, растяжимые волокна. При растяжении каждая молекула эластина разворачивается, приобретая более протяженную конформацию. Разительный контраст между физическими свойствами эластина и коллагена обусловлен большими различиями в их аминокислотных последовательностях.

Рис. 3-30. Возможные размеры и форма молекулы белка из 300 аминокислот. Конкретная структура определяется последовательностью аминокислот (D. Е. Metzler, Biochemistry, New York;

Academic Press, 1977;

печатается с изменениями).

Примечательно, что одна и та же химическая структура - аминокислотная цепь - может приобретать самую различную конформацию.

Назовем, например, резиноподобный эластин, похожий на стальной трос коллаген, разнообразные глобулярные белки - ферменты, очень различающиеся по форме своей каталитической поверхности. На рис. 3-30 показано, сколь различную форму может в принципе принимать полипептидная цепь длиной в 300 аминокислот. Реальная конформация, как мы уже отметили, полностью зависит от последовательности аминокислот.

3.3.4. Белки имеют различные уровни пространственной организации [24] Рассматривая структуру белка, полезно различать разные уровни его пространственной организации. Аминокислотную последовательность называют первичной структурой белка. Регулярные водородные связи по всей длине непрерывной полипептидной цепи приводят к образованию -спиралей и -слоев, которые представляют собой вторичную структуру белка. Некоторые комбинации -спиралей и слоев, упакованные вместе, формируют компактно уложенные глобулярные единицы, каждая из которых носит название белкового домена.

Домены обычно состоят из отрезков полипептидной цепи, содержащих от 50 до 350 аминокислот;

по-видимому, они являются теми модульными единицами, из которых строятся белки (см. ниже). Маленькие белки могут содержать только один домен, более крупные белки состоят из нескольких доменов, связанных сравнительно открытыми участками полипептидной цепи. Наконец, отдельные полипептиды могут служить субъединицами для формирования более крупных молекул, часто называемых белковыми агрегатами, или белковыми комплексами. В таких комплексах субъединицы связаны друг с другом большим числом слабых нековалентных взаимодействий (см. разд. 3.1.1), у внеклеточных белков эти взаимодействия часто стабилизированы дисульфидными связями.

Пространственную структуру белка можно проиллюстрировать несколькими способами. Рассмотрим, например, необычно маленький белок - основной ингибитор трипсина поджелудочной железы, который содержит 58 аминокислотных остатков, упакованных в один домен. Этот белок можно представить в виде стереопары, показывающей все его неводородные атомы (рис. 3-31, А), или в виде тщательно выполненной трехмерной модели, где опущены многие детали (рис. 3-31, Б). Белок можно изобразить и более схематично, без боковых групп и атомов, чтобы сфокусировать внимание на последовательности основной полипептидной цепи (рис. 3-31, В, Г и Д). Такие схематические представления очень важны для выявления структуры белков, которые обычно крупнее, чем основной ингибитор трипсина, так как они дают возможность проследить за нерегулярным расположением полипептидной цепи внутри каждого домена (рис. 3-32).

На рис. 3-33 показано, как структура большого белка может быть сведена к разным уровням организации, каждый из которых иерархическим образом строится из предыдущих. Эти уровни возрастающей структурной организации, возможно, соответствуют стадиям свертывания новосинтезированного белка в конечную нативную структуру внутри клетки.

Рис. 3-31. Пространственная конформация малого белка основного ингибитора трипсина поджелудочной железы в пяти обычно использующихся вариантах изображения. А. Стереопара, показывающая положение всех неводородных атомов. Основная цепь выделена жирной линией, а боковые цепи - тонкими. Б. Пространственная модель, показывающая вандерваальсовы радиусы всех атомов (см. схему 3-1). В. Скелетная проволочная модель, составленная из отрезков, соединяющих все атомы -углерода вдоль полипептидного скелета. Г. Ленточная модель, которая представляет все участки регулярных водородных связей либо в виде спиралей (-спирали), либо в виде набора стрелок (-слои), указывающих на карбоксил терминальный конец цепи;

в этой модели также показаны водородные связи. Д. «Сосисочная» модель, которая демонстрирует расположение полипептидной цепи без всяких деталей. Следует иметь в виду, что сердцевина всех глобулярных белков плотно заполнена атомами, и впечатление пустого пространства вызвано только характером моделей В, Г и Д. (Б и В с любезного разрешения Richard J. Feldmann;

А и Г - с любезного разрешения Jane Richardson.) Рис. 3-32. Ленточные модели пространственной структуры некоторых белковых доменов с разной организацией. А. Цитохром b562, однодоменный белок, почти целиком состоящий из -спиралей. Б. NAD-связанный домен лактат-дегидрогеназы, состоящий из смеси -спиралей и -слоев. В.

Изменчивый домен одной легкой цепи иммуноглобулина в виде сандвича из двух -слоев. На этих рисунках -спирали и соединительные цепи окрашены, а цепи, составленные из -слоев, изображены серыми стрелками. Обратите внимание, что полипептидная цепь, как правило, пересекает домен два раза, делая резкие изгибы только на поверхности белковой молекулы. (Рисунок любезно предоставлен Jane Richardson.) Рис. 3-33. Пространственная структура белка может быть описана в терминах различных уровней свертывания, каждый из которых составлен из структур предшествующего уровня в иерархическом порядке. Такие уровни иллюстрируются на этом рисунке на примере двухдоменного бактериального белка, активирующего катаболизм. Когда большой домен связывается с циклическим AMP, в белке происходит конформационное изменение, дающее возможность малому домену связываться со специфической последовательностью ДНК. Аминокислотная последовательность определяется как первичная структура белка, а первый уровень свертывания полипептидной цепи - как его вторичная структура. Как обозначено внизу рисунка под квадратными скобками, комбинацию второго и третьего уровней свертывания, представленную здесь, обычно называют третичной структурой, а четвертый уровень (комбинация субъединиц) - четвертичной структурой белка. (С изменениями с рисунков Jane Richardson.) Рис. 3-34. Сопоставление аминокислотных последовательностей двух представителей семейства сериновых протеиназ. Показаны карбоксил терминальные участки двух белков (от 149 до 245-й аминокислоты). Одинаковые аминокислоты соединены цветными штрихами, а сериновые остатки в активных центрах в положении 195 «высвечены». В участках полипептидных цепей, выделенных цветными прямоугольниками, каждая аминокислота этих двух ферментов в трехмерной структуре занимает одинаковое положение (см. рис. 3-35). Б. Стандартные однобуквенные и трехбуквенные обозначения аминокислот. (С изменениями из J. Greer, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 77: 3393-3397, 1980.) 3.3.5. Сравнительно немногие потенциально возможные полипептидные цени могут оказаться полезными Поскольку все 20 аминокислот химически различны и каждая может в принципе занимать в полипептидной цепи любое положение, то для пептида из четырех аминокислот возможны 20202020 = 160000 различных цепей, а для полипептида из п аминокислот – 20n цепей. Таким образом, может существовать более 10390 различных белков со средней типичной длиной около 300 аминокислот.

Мы, однако, знаем, что лишь очень небольшая часть всех возможных белков примет стабильную пространственную конформацию. Все остальные должны иметь множество различных конформаций с разными химическими свойствами и приблизительно одинаковой энергией. Белки с такими изменчивыми свойствами не могут быть полезными и, следовательно, должны устраняться естественным отбором в ходе эволюции.

Удивительно точная пригнанность структуры современных белков к выполняемой ими функции обеспечивается их способностью свертываться уникальным образом. Последовательность аминокислот не только обеспечивает исключительную стабильность одной из конформаций, но и определяет необходимые для выполнения в клетке каталитической или структурной функции особенности этой конформаций и ее химические свойства. Белки строятся настолько точно, что замена даже нескольких атомов одной аминокислоты может нарушить структуру и привести к катастрофическим изменениям функции.

3.3.6. Новые белки часто возникают в результате незначительных изменений старых [25] У клетки есть генетические механизмы, обеспечивающие дупликацию, модификацию и рекомбинацию генов в процессе эволюции (см, разд. 10.5.1). Следовательно, если уже какой-нибудь белок с полезными свойствами поверхности раз возникнет, то его основная структура может затем войти в состав многих других белков. В современных организмах различные белки с родственными функциями часто имеют схожую последовательность аминокислот. Считается, что такие семейства белков возникли путем дупликации одного предкового гена и последующего накопления в эволюции мутаций, постепенно обусловивших появление родственных белков с новыми функциями.

Рис. 3-35. Сравнение пространственной структуры эластазы (А) и химотрипсина (Б). У этих эволюционно родственных протеиназ одинаковы лишь те аминокислоты, которые расположены в выделенных цветом участках полипептидной цепи. Тем не менее конформации белков очень похожи.

Обведены активные центры ферментов;

оба активных центра содержат активированный остаток серина (см. рис. 3-47). Молекула химотрипсина имеет несколько (более двух) концов цепи, поскольку она образована протеолитическим расщеплением химотрипсиногена, неактивного предшественника.

Рассмотрим семейство протеолитических (расщепляющих) ферментов, сериновые протеиназы, включающие в себя пищеварительные ферменты химотрипсин, трипсин и эластазу, а также многие из факторов свертывания - протеиназ, контролирующих процесс свертывания крови.

При сравнении любых двух ферментов этого семейства оказывается, что примерно 40% положений в полипептидной цепи занимают одни и те же аминокислоты (рис. 3-34). Еще более поразительное сходство выявляется при сравнении их конформаций, определенных методом рентгеноструктурного анализа: большинство поворотов и изгибов полипептидных цепей длиной в несколько сот аминокислот оказываются идентичными (рис. 3-35).

Тем не менее разные сериновые протеиназы имеют совершенно различные функции. Некоторые из аминокислотных замен, обусловивших различия ферментов этой группы, по-видимому, были отобраны в процессе эволюции, потому что привели к изменениям субстратной специфичности и регуляторных свойств белков, что в свою очередь породило все многообразие современных функциональных свойств. Другие аминокислотные замены могли быть «нейтральными», т. е. сохранились, потому что не повлияли ни на структуру, ни на функции белка. Поскольку мутирование - процесс случайный, должны были происходить и вредные замены, изменяющие пространственную структуру фермента достаточно сильно, чтобы его инактивировать. Эти измененные варианты были потеряны в процессе эволюции, так как производившие их индивидуальные организмы должны были оказаться в невыгодных условиях и исчезнуть в результате естественного отбора. Поэтому совершенно неудивительно, что клетки содержат целый набор структурно родственных полипептидных цепей, имеющих общих предков, но выполняющих разные функции.

3.3.7. Новые белки часто возникают в результате объединения разных полипептидных доменов [26] При возникновении в клетке ряда стабильных белковых поверхностей новые поверхности с иной специфичностью связывания могут создаваться в результате объединения двух или более индивидуальных белков путем нековалентных взаимодействий. Для клеток характерно такое объединение глобулярных белков в более крупные функциональные белковые агрегаты: молекулярная масса многих белковых агрегатов достигает 1 млн. и более, хотя молекулярная масса типичной полипептидной цепи составляет всего лишь 40000-50000 (приблизительно 300- аминокислот);

размер лишь немногих полипептидов втрое превышает эту среднюю величину.

Сходный, но другой способ образования новых белков из существующих полипептидных цепей - это слияние соответствующих последовательностей ДНК таким образом, что образуется ген, кодирующий одну большую полипептидную цепь (см. разд. 10.5.4). Считается, что белки, возникшие этим путем, в разных частях полипептидной цепи свертываются независимо в отдельные глобулярные домены. Такая «мультидоменная» структура характерна для многих белков, и, как Рис. 3-36. Общий принцип, по которому наложение двух различных белковых поверхностей в процессе эволюции, приводит к появлению белков, которые содержат новые центры связывания для других молекул. Как показано на этом рисунке, лиганд - связывающие центры часто расположены в месте соприкосновения двух белковых доменов.

Рис. 3-37. Структура гликолитического фермента глицеральдегид-3-фосфат- дегидрогеназы. Белок состоит из двух доменов (выделены разным цветом). Участки -спирали представлены в виде цилиндров, а -слоев- стрелками. Реакция, катализируемая этим ферментом, подробно приведена на рис. 2-21. Заметим, что три центра связывания субстратов расположены в зоне соприкосновения двух доменов. (С любезного разрешения Alan. J.

Wonacott.) Рис. 3-38. Пример широко распространенной в эволюции белков «перетасовки» блоков белковых последовательностей. Участки белка, обозначенные окрашенными геометрическими фигурами, являются эволюционно родственными, но не идентичными. А. Бактериальный САР-белок состоит из двух доменов;

один из них (закрашенный треугольник) связывается со специфической последовательностью ДНК, второй - связывает сАМР (см. рис. 3-33). ДНК-связывающий домен родствен ДНК-связывающим доменам многих других белков регуляторных генов, включая белки lac-репрессор и erо-репрессор. Кроме того, две копии сАРМ-связывающего домена обнаружены в эукариотических киназах, регулируемых связыванием циклических нуклеотидов. Б. Представлены два домена, состоящие примерно из 40 аминокислот, каждый из которых встречается в трех больших белках позвоночных. Например, рецептор липопротеина низкой плотности (ЛНП) - это трансмембранный белок из аминокислотных остатков, ответственный за выведение холестерола из клеток. Он содержит много доменов, имеющихся и в других белках, в частности, семь копий цистеин - богатого домена (светлые кружки), участвующих в связывании ЛНП, и три копии такого же размера (окрашенные кружки), функции которых неизвестны.

и следовало ожидать, исходя из рассмотренных выше эволюционных предпосылок, функционально важные центры связывания часто оказываются расположенными на границе разных доменов (рис. 3-36). На рис. 3-37 показана структура конкретного мультидоменного белка.

Другой путь повторного использования аминокислотной последовательности особенно распространен среди длинных фибриллярных белков, таких, как коллаген (см. рис. 3-28). В этом случае их структура формируется из многократных внутренних повторов предковой аминокислотной последовательности. Ясно, что сведение вместе аминокислотных последовательностей путем объединения ранее существовавших кодирующих последовательностей ДНК, является более эффективной стратегией для клетки, чем получать новые белковые последовательности в результате случайных мутаций ДНК.

3.3.8. Структурные гомологии могут помочь в определении функций вновь открытых белков [27] Развитие методов быстрого секвенирования молекул ДНК сделало возможным определение аминокислотных последовательностей многих белков и нуклеотидных последовательностей соответствующих генов (см. разд. 4.6.6). Постоянно пополняемая «база данных белков» обрабатывается на компьютере для поиска возможных гомологии последовательностей между вновь секвенированным белком и изученными ранее.

В настоящее время определена последовательность небольшого числа белков эукариотических организмов, при этом часто оказывается, что вновь секвенированный белок является гомологом уже известного белка в пределах какого-то участка его длины. Отсюда следует, что большинство белков, видимо, произошло от ограниченного числа предковых типов. Как и предполагалось, в последовательностях многих больших белков часто видны признаки того, что они возникли путем объединения ранее существовавших доменов в новых комбинациях, так называемого процесса «тасования доменов» (рис. 3-38).

Установление гомологии доменов также может быть полезным в другом аспекте. Определить пространственную структуру белка намного труднее, чем определить аминокислотную последовательность. Однако конфигурация домена вновь секвенированного белка может быть «отгадана», если он гомологичен домену белка, конформация которого ранее была определена методом рентгеноструктурного анализа. Часто можно с приемлемой точностью определить структуру нового белка, предполагая, что повороты и изгибы полипептидной цепи в двух белках будут одинаковыми, даже если есть отличия в аминокислотной последовательности.

Рис. 3-39. Схема образования димера из идентичных белковых субъединиц. Если центр связывания узнает сам себя, димеры будут симметричными.

Эти пары часто в дальнейшем объединяются с другими субъединицами с образованием тетрамеров и более сложных ансамблей.

Такие сравнения белков важны еще и в том отношении, что сходные структуры часто предполагают и сходные функции. Можно избежать многолетних экспериментальных исследований, установив гомологию аминокислотной последовательности с белком, функция которого известна. Например, такие гомологии последовательностей впервые указали на то, что некоторые регуляторные гены клеточного цикла дрожжей и некоторые гены, вызывающие раковое перерождение клеток млекопитающих, кодируют протеинкиназы. Таким же способом было определено, что многие из белков, контролирующих морфогенез у плодовой мушки Drosophila, являются белками регуляторного гена, а один белок, участвующий в морфогенезе, был идентифицирован как сериновая протеиназа.

Каждый год эта база данных пополняется все новыми сведениями о белковых последовательностях, что увеличивает вероятность обнаружения полезных гомологии. Таким образом, сравнение аминокислотных последовательностей белков будет становиться все более важным инструментом клеточной биологии.

3.3.9. Белковые субъединицы способны к самосборке в большие клеточные структуры [28] Принцип, позволяющий белковым доменам ассоциировать с образованием новых центров связывания, «работает» и при сборке значительно более крупных клеточных структур. Надмолекулярные структуры, такие, как ферментные комплексы, рибосомы, белковые волокна, вирусы и мембраны, не синтезируются в виде единых гигантских молекул, связанных ковалентными взаимодействиями, а собираются в результате нековалентной агрегации макромолекулярных субъединиц.

Использование субъединиц для построения больших структур имеет несколько преимуществ: 1) для построения большой структуры из многократно повторенных субъединиц меньшего размера требуется меньше генетической информации;

2) поскольку субъединицы связаны между собой многими сравнительно слабыми связями, их сборка и диссоциация легко поддаются контролю;

3) сборка структуры из субъединиц позволяет сводить к минимуму количество ошибок, так как функционирование специального механизма корректирования в процессе сборки может устранять испорченные субъединицы.

3.3.10. Одинаковые белковые субъединицы могут взаимодействовать с образованием геометрически регулярных структур [29] При наличии в белке центра связывания, комплементарного какому-либо участку на его собственной поверхности, белок будет самопроизвольно агрегировать. В простейшем случае центр связывания узнает сам себя, и в результате образуется симметричный димер. Многие ферменты и другие белки образуют такие димеры, которые часто в свою очередь служат субъединицами для формирования более крупных агрегатов (рис. 3-39 и рис. 3-40).

Если центр связывания белка комплементарен другому участку на своей поверхности, то образуется цепь субъединиц. При некоторых взаимных ориентациях двух участков связывания цепь замкнется сама на себя и рост прекратится. В результате образуется кольцо из двух, трех, четырех или большего числа субъединиц (рис. 3-41). В более общем случае получится бесконечно длинный полимер из белковых субъединиц. При условии, что все субъединицы связаны друг с другом идентичным Рис. 3-40. Ленточная модель димеpa, образованного из двух идентичных белковых субъединиц (мономеров). Представленный белок является бактериальным белком САР, показанным ранее на рис. 3-33 и рис. 3-38, А. (С любезного разрешения Jane Richardson.) Рис. 3-41. Одинаковые субъединицы при взаимодействии друг с другом могут формировать кольца или спирали. Образование спирали было показано на рис. 3-3, образование кольца вместо спирали происходит, если субъединицы входят друг в друга, останавливая дальнейший рост цепи.

образом, субъединицы в такой цепи расположатся по спирали (см. рис. 3-3). Например, актиновая нить представляет собой спиральную структуру, собранную из одинаковых субъединиц глобулярного белка актина;

актиновые нити являются основными компонентами цитозоля большинства эукариотических клеток. Когда особенно важна механическая прочность, надмолекулярные агрегаты обычно строятся не из глобулярных, а из фибриллярных субъединиц, поскольку фибриллярные субъединицы, обвиваясь вокруг друг друга в спираль, имеют обширные области для белок белкового взаимодействия (рис. 3-42, А).

Гексагонально упакованные белковые субъединицы могут образовывать плоские слои. Иногда так агрегируют в липидных бислоях специализированные мембранные транспортные белки (см. разд. 6.2.8). При небольшом изменении геометрии субъединиц гексагональный слой превращается в полую трубку (рис. 3-42, Б). Такие цилиндрические трубки участвуют в образовании белковых оболочек некоторых удлиненных вирусов (рис. 3-43).

Образование замкнутых структур - колец, трубок или сферических частиц - дополнительно стабилизирует весь арегат;

общее число связей между белковыми субъединицами в этом случае увеличивается. Более того, поскольку такая структура формируется благодаря взаимозависимым кооперативным взаимодействиям, то сборка и разборка могут производиться относительно малыми изменениями, затрагивающими сами субъединицы. Особенно ярко это можно проиллюстрировать на примере белковых оболочек многих простых вирусов, имеющих форму полого шара. Такие оболочки часто собраны из сотен идентичных белковых субъединиц, окружающих и защищающих вирусную нуклеиновую кислоту (рис. 3-43). Структура белков оболочки должна быть особенно гибкой, так как она должна допускать различные типы межсубъединичных контактов, а также обеспечивать изменение упаковки субъединиц при выходе нуклеиновой кислоты в начале цикла размножения вируса.

Рис. 3-42. Некоторые структуры, образующиеся при самосборке белковых субъединиц. А. Три общих типа спиральных ансамблей белка. В актиновой нити содержится примерно две глобулярные белковые субъединицы на один оборот, а многие другие цитоскелетные белки содержат стержневидные участки, в которых две -спирали объединяются в структуру "coiled coil". В спирали коллагена три вытянутые белковые цепи объединяются друг с другом на большом расстоянии с образованием очень прочной стержнеобразной структуры. Б. Гексагонально упакованные глобулярные белковые субъединицы могут формировать либо плоские структуры, либо трубки.

Рис. 3-43. Структура сферического вируса. Во многих вирусах идентичные белковые субъединицы упаковываются с образованием сферической оболочки, которая заключает вирусный геном, состоящий из РНК или ДНК. По геометрическим соображениям симметричным образом могут упаковаться не более 60 субъединиц. Однако если допустимы небольшие отклонения от регулярности, то можно использовать больше субъединиц для образования более крупного капсида. Например, вирус кустистой карликовости томата (TBSV) имеет форму сферы около 33 нм в диаметре. На электронной микрофотографии (А) и на схеме (Б) можно видеть, что он состоит из более, чем 60 субъединиц. Предполагаемый способ сборки и трехмерная структура по данным рентгеноструктурного анализа этого вируса представлены на В. Вирусная частица состоит из 180 идентичных копий капсидного белка (насчитывающих по 386 аминокислот) и генома РНК, включающего 4500 нуклеотидов. Чтобы сформировать такой крупный капсид, белок должен быть способен упаковываться тремя несколько различными способами (обозначены разным цветом). (Рисунки выполнены Steve Harisson;

электронные микрофотографии - с любезного разрешения John Finch.) Рис. 3-44. Электронная микрофотография вируса табачной мозаики (ВТМ). Вирус состоит из одной длинной молекулы РНК, окруженной плотно уложенной спиралью из идентичных белковых субъединиц, образующих цилиндрическую оболочку. Очищенная РНК и белок оболочки при смешивании в пробирке самопроизвольно образуют полностью инфекционные вирусные частицы. (С любезного разрешения Robley Williams.) 3.3.11. Самособирающиеся структуры могут состоять из различных белковых субъединиц и нуклеиновых кислот [30] Многие белковые клеточные структуры, такие, как вирусы и рибосомы, построены из белковых субъединиц и молекул РНК или ДНК.

Информация о сборке таких сложных агрегатов заключена в строении самих макромолекулярных субъединиц и в соответствующих условиях изолированные субъединицы могут самопроизвольно собираться в пробирке в конечную структуру. Впервые возможность самосборки большого макромолекулярного агрегата из отдельных компонентов была обнаружена у вируса табачной мозаики (ВТМ). Этот вирус представляет собой длинный стержень, в котором белковый цилиндр окружает спиральную сердцевину из РНК (рис. 3-44 и рис. 3-45). Если очищенную вирусную РНК и белковые субъединицы смешать в растворе, они агрегируют с образованием полностью активных вирусных частиц. Процесс самосборки оказался неожиданно сложным: он сопряжен с образованием особых промежуточных структур - двойных белковых колец, присоединяющихся к растущей ободочке вируса.

Другой пример макромолекулярного арегата, структура которого после диссоциации на отдельные компоненты восстанавливается, - это рибосома бактерий. Бактериальные рибосомы состоят приблизительно из 55 различных белковых молекул и трех различных молекул РНК (см. разд.

5.1.8). Если инкубировать в пробирке в соответствующих условиях все индивидуальные компоненты, то они самопроизвольно соберутся в рибосому. Важнее всего то, что такие реконструированные рибосомы способны осуществлять биосинтез белков. Реконструкция рибосом, как и предполагалось, происходит упорядоченно: сначала к РНК присоединяются определенные белки, затем другие белки узнают образовавшийся комплекс и т.д., пока не завершится формирование полной структуры.

До сих пор неясно, каким образом осуществляется регуляция некоторых более сложных процессов самосборки. Оказалось, например, что многие клеточные структуры имеют точно определенную длину, во много раз превышающую длину всех составляющих их макромолекул. Как достигается столь точное ограничение длины, остается загадкой. На рис. 3-46 представлены три возможных механизма такого ограничения. В простейшем случае длинный каркас белка или другой макромолекулы является ограничителем, который определяет размер конечной структуры.

Именно такой механизм определяет длину частицы ВТМ, где молекула РНК служит таким стержнем. Аналогично было показано, что белковый каркас определяет длину хвостов некоторых бактериальных вирусов (рис. 3-47).

Рис. 3-45. Модель элемента структуры вируса табачной мозаики. Одноцепочечная молекула РНК из 6000 нуклеотидов упакована в белковую оболочку, состоящую из 2130 копий специального белка (каждая его молекула состоит из 158 аминокислотных остатков).

Рис. 3-46. Три возможных способа, с помощью которых большие белковые ансамбли могут поддерживать фиксированную длину: А. Объединение вдоль вытянутого каркаса из белка или другой макромолекулы, который служит в качестве «измерительного устройства»;

Б. Добавление к полимерной структуре дополнительных субъединиц сверх определенной длины требует слишком много энергии и объединение субъединиц прекращается. В. Сборка по типу нониуса. Два набора стержневидных молекул отличаются по длине от собранного комплекса и его рост прекратится, когда концы таких молекул в точности совпадут.

Рис. 3-47. Электронная микрофотография бактериофага. Конец хвостового отростка фаговой частицы прикрепляется к специфическому белку на поверхности бактериальной клетки, после чего ДНК, плотно упакованная в головке вируса, инъецируется через хвост в клетку. Хвост имеет точную длину, которая определяется при помощи механизма, показанного на рис. 3-46, А.

3.3.12. Не все клеточные структуры образуются путем самосборки [31] Некоторые клеточные структуры, удерживаемые вместе нековалентными связями, не способны к самосборке. Например, митохондрии, реснички или миофибриллы не могут самопроизвольно собираться в растворе из макромолекулярных компонентов, поскольку часть информации для их сборки заложена в специальных ферментах и других клеточных белках, выполняющих функции шаблонов и матриц, но не входящих в состав окончательной структуры. Порой даже маленькие структуры лишены некоторых необходимых для сборки компонентов. Например, при формировании некоторых бактериальных вирусов головка, построенная из одинаковых белковых субъединиц, собирается на временном каркасе, построенном из другого белка. Этого второго белка нет в окончательной вирусной частице, и, следовательно, головка не может самопроизвольно собраться в его отсутствие. Известны другие Рис. 3-48. Полипептидный гормон инсулин синтезируется в виде белка-предшественника проинсулина, который свертывается нужным образом, а затем расщепляется протеолитическим ферментом. Поэтому после восстановления дисульфидных связей инсулин не может самопроизвольно принять исходную конформацию. Вырезание части полипептидной цепи проинсулина приводит, таким образом, к потере информации, необходимой для самосборки молекулы.

примеры, когда существенной и необратимой стадией процесса сборки является протеолитическое расщепление. Именно так формируются оболочки некоторых бактериальных вирусов и даже некоторые простые белки, в том числе структурный белок коллаген и гормон инсулин (рис. 3 48). На основании этих сравнительно простых примеров можно прийти к выводу, что сборка таких сложных структур, как митохондрия или ресничка, управляется и во времени, и в пространстве другими клеточными компонентами и, кроме того, включает в себя стадии необратимого созревания, катализируемые расщепляющими ферментами.

Заключение Аминокислотная последовательность белковой молекулы определяет ее пространственную структуру. Конкретная структура полипептидной цепи стабилизируется нековалентными взаимодействиями между ее частями. Аминокислоты с гидрофобными группами стремятся сгруппироваться внутри молекулы, а возникновение локальных водородных связей между соседними пептидными группами приводит к образованию -спиралей и -слоев. Многие белки собраны, как из модулей, из небольших глобулярных образований, называемых доменами;

малые белки обычно состоят из одного домена, тогда как большие содержат несколько доменов, скрепленных вместе короткими участками полипептидной цепи. При построении новых белков домены изменяются и комбинируются с другими доменами.

Те же силы, которые определяют пространственную структуру белков, ответственны и за образование белковых агрегатов. Белки, имеющие центр связывания, комплементарный их собственной поверхности, могут образовывать димеры, замкнутые кольца, сферические частицы или спиральные полимеры. Смесь множества различных белков, содержащая иногда структурные нуклеиновые кислоты, может самопроизвольно собираться в пробирке в большие сложные структуры. Однако не все клеточные структуры способны к самопроизвольной реконструкции после диссоциации на отдельные компоненты, так как процесс сборки во многих случаях включает необратимые этапы.

3.4. Функции белков [32] Химические свойства белковых молекул практически полностью зависят от экспонированных на их поверхности аминокислотных остатков, способных образовывать разнообразные слабые связи с другими молекулами (см. разд. 3.1.1). Чтобы взаимодействие белка с другой молекулой (именуемой в дальнейшем лигандом) было эффективным, между ними должно одновременно образовываться много слабых связей.

Поэтому к белку могут прочно присоединиться лишь те лиганды, которые в точности подходят к его поверхности.

Центр связывания, т. е. участок белка, который взаимодействует с лигандом, обычно имеет вид углубления, сформированного на поверхности белковой молекулы определенным расположением аминокислот. Эти аминокислоты часто принадлежат удаленным друг от друга участкам полипептидной цепи (рис. 3-49) и составляют лишь небольшую долю всех аминокислот белка. Остальные аминокислоты необходимы для поддержания правильной формы белковой молекулы и для создания дополнительных центров связывания, играющих регуляторную роль. Значение внутренней части белка обычно ограничивается лишь тем, что она обеспечивает нужную форму поверхности и необходимую жесткость структуры.

Рис. 3-49. Водородное связывание между САР-белком и его лигандом, сАМР, выявленное с помощью рентгеноструктурного анализа комплекса.

Показано, что две идентичные субъединицы димера объединяются с образованием центра связывания (см. также рис. 3-40). (С любезного разрешения Tom Steitz.) 3.4.1. Конформация белка определяет его химические свойства [19, 33] Соседние аминокислотные остатки поверхности белковой молекулы часто взаимодействуют таким образом, что меняется реакционноспособность боковых групп определенных аминокислот. Такие взаимодействия можно подразделить на несколько типов.

Во-первых, соседние части полипептидной цепи могут взаимодействовать таким образом, что доступ молекул воды к другим участкам поверхности белка будет ограничен. Поскольку молекулы воды стремятся к формированию водородных связей, они должны конкурировать с лигандами за предназначенные для последних боковые группы аминокислот на поверхности белка. Поэтому прочность водородных связей (и ионных взаимодействий) между белком и лигандом значительно больше в том случае, если удалось исключить молекулы воды. На первый взгляд трудно представить себе механизм, способный ограничить доступ к белковой поверхности столь маленькой молекулы, как молекула воды, и не повлиять при этом на связывание самого лиганда. Но молекулы воды благодаря сильной тенденции к образованию водородных связей формируют большие молекулярные сети | (схема 2-1) и индивидуальной молекуле часто бывает энергетически Рис. 3-50. Необычайно реакционно-способная аминокислота в активном центре фермента. Здесь для примера показана «система переноса заряда», обнаруженная у химотрипсина, эластазы и других сериновых протеиназ (см. рис. 3-35). Участок цепи, содержащий аспарагиновую кислоту, индуцирует гистидин к захвату протона у серина 195;

это активирует серин к образованию ковалентной связи с субстратом фермента и гидролизу пептидной связи, как показано на рис. 3-53.

невыгодно отрываться от такой сети, чтобы проникнуть в углубление белковой поверхности.

Во-вторых, образование кластера из соседних полярных аминокислот изменяет реакционноспособность их боковых групп. Например, полипептидная цепь может свернуться так, что сблизит ряд отрицательно заряженных аминокислот, несмотря на их взаимное отталкивание. Когда это происходит, резко возрастает сродство каждой из боковых групп к положительно заряженному иону. Боковые группы некоторых аминокислот могут также образовывать водородные связи и таким путем активировать обычно неактивные боковые группы (например, —СН2ОН-группу серина, рис. 3-50). Активированные боковые группы могут вступать в реакции, приводящие к образованию или разрыву определенных ковалентных связей.

Таким образом, поверхность каждой белковой молекулы имеет уникальные химические свойства, зависящие не только от природы аминокислот, расположенных на поверхности, но и от точной взаимной ориентации этих аминокислот. Поэтому даже незначительные изменения конформации белковой молекулы могут привести к резкому изменению ее химических свойств.

В тех случаях, когда химические свойства боковых групп аминокислот не могут обеспечить решение конкретной каталитической задачи, белки прибегают к помощи специальных небелковых молекул. Такие лиганды часто служат в ферментативных реакциях коферментами и могут быть столь прочно связаны с белком, что фактически являются его частью. В качестве примера можно назвать: содержащие железо гемы в молекуле гемоглобина и цитохромов;

тиаминпирофосфат в ферментах, участвующих в переносе альдегидной группы;

биотин в ферментах, участвующих в переносе карбоксильной группы (см. разд. 2.4.3). В процессе эволюции каждый фермент был отобран по определенной химической активности, которую он проявляет в комплексе Рис. 3-51. Коферменты, такие, как выделенный здесь серым цветом тиаминпирофосфат, представляют собой небольшие молекулы, которые связываются с поверхностью фермента, обусловливая тем самым способность катализировать определенные реакции. Активность тиаминпирофосфата зависит от «кислого» атома углерода, который с легкостью обменивает связанный с ним атом водорода на атом углерода молекулы субстрата. Другие части молекулы тиаминпирофосфата, видимо, служат «ручками», за которые фермент удерживает кофермент в правильном положении.

с белком. Коферментами часто служат очень сложные органические молекулы, химические свойства которых в комплексе с белком не всегда понятны в деталях. Кроме реакционноспособного центра в состав коферментов нередко входят остатки, связывающие их с соответствующими белками (рис. 3-51). На рис. 3-52, А показаны объемные модели двух ферментов, связанных со своими коферментами.

3.4.2. Связывание субстрата - первая стадия ферментативного катализа [34] Одна из важнейших функций белков состоит в специфическом катализе химических реакций. Лигандом в этом случае служит молекула субстрата, связывание которой ферментом - необходимая предпосылка химической реакции (рис. 3-52, Б). Ферменты способны очень сильно ускорять химические реакции - значительно сильнее, чем любые искусственные катализаторы. Столь высокую эффективность можно приписать нескольким факторам. Во-первых, ферменты увеличивают локальную концентрацию молекул субстрата в каталитическом центре и удерживают соответствующие атомы в ориентации, необходимой для последующей реакции. Но наиболее важное значение имеет тот факт, что часть энергии связывания непосредственно используется для катализа. Дело в том, что молекулы субстрата, перед тем как превратиться в продукты реакции, проходят через ряд промежуточных форм с измененной геометрией и измененным электронным распределением. Свободная энергия всех этих промежуточных форм и особенно наименее стабильных переходных состояний существенно снижена, если молекула связана с поверхностью фермента. Обычно ферменты имеют значительно большее сродство к нестабильным переходным состояниям субстратов, чем к их стабильным формам. Используя энергию связывания, ферменты помогают субстратам принять определенное переходное состояние и таким образом значительно ускоряют одну определенную реакцию.

Некоторые ферменты ковалентно взаимодействуют с одним из своих субстратов. При этом субстрат связывается с аминокислотой или с молекулой кофермента. Такие ферментативные реакции часто происходят в несколько стадий так, что один субстрат захватывается центром связывания и ковалентно связывается, а затем реагирует на поверхности фермента со вторым субстратом (рис. 3-53). К концу каждого реакционного цикла свободный фермент восстанавливается.

Рис. 3-52. Компьютерные модели. А. Цитохром с с его простетической группой - гемом. Б. Лизоцим яичного белка со связанным олигосахаридом. В обоих случаях связанный лиганд показан в цвете. (С любезного разрешения Richard J. Feldmann.) Рис. 3-53. Некоторые ферменты образуют временную ковалентную связь со своими субстратами. В приведенном здесь примере карбоксильная группа разорвавшейся полипептидной цепи образует ковалентную связь с активированным сериновым остатком протеиназы. После диссоциации несвязанной части полипептида происходит вторая (не показанная здесь) стадия реакции: молекула воды гидролизует вновь образованную ковалентную связь и освобождает оставшуюся часть полипептидной цепи, давая возможность серину в положении 195 вступать в следующую стадию реакции (см. также рис. 3-50).

Способ действия ферментов накладывает ограничение на количество молекул субстрата, которое может быть «обработано» одной молекулой фермента в единицу времени. При увеличении концентрации субстрата скорость образования продукта сначала тоже увеличивается до максимальной величины (рис. 3-54). В этой точке достигается насыщение молекул фермента субстратом, и теперь скорость реакции (обозначаемая Vmax) зависит только от того, сколь быстро фермент может обработать одну молекулу субстрата. Отношение этой скорости к концентрации фермента, называют числом оборотов, которое для многих ферментов составляет около 1000 молекул субстрата в секунду, но в исключительных случаях может достигать значения 106 и более.

Другой часто используемой для характеристики ферментов кинетический параметр - это их константа Михаэлиса Км, определяемая как концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной (рис. 3-54). Низкое значение Кч свидетельствует о том, что фермент достигает максимальной скорости катализа при низкой концентрации субстрата и обычно соответствует очень прочному связыванию субстрата ферментом.

3.4.3. Ферменты ускоряют реакции, но не смещают химического равновесия Сколь бы хитро не был устроен фермент, он не может сделать катализируемую им реакцию более энергетически выгодной. Он не может изменить разницы свободной энергии между начальным субстратом и конечным продуктом реакции. Как и уже обсуждавшееся простое связывание, каждая химическая реакция имеет положение равновесия, при котором скорости прямой и обратной реакций равны и, следовательно, не происходит дальнейшего изменения концентраций (см. рис. 3-7). Если фермент ускоряет прямую реакцию А + Б АБ в 108 раз, то и обратную реакцию АБ А + Б он должен ускорить в 108 раз. Отношение скоростей прямой и обратной реакций зависит только от концентраций А, Б и АБ.

Положение равновесия остается в точности тем же вне зависимости от того, катализирует фермент реакцию или нет.

Рис. 3-54. При увеличении концентрации субстрата скорость ферментативной реакции V увеличивается до тех пор, пока не достигнет максимального значения Vmax. Происходит это при такой концентрации субстрата, при которой уже не остается незанятых молекул фермента, и скорость реакции лимитируется скоростью каталитического процесса на поверхности фермента. Для большинства ферментов концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной Км, отражает прочность связывания субстрата с ферментом. Большие значения Км соответствуют слабому связыванию, и наоборот.

3.4.4. Многие ферменты заставляют реакции протекать преимущественно в одном направлении, сопрягая их с гидролизом АТР [35].

Живая клетка представляет собой далекую от равновесия химическую систему: продукт каждого фермента обычно быстро расходуется, так как используется в качестве субстрата другим ферментом данного метаболического пути. Еще более важно, что многие из уже описанных в гл.

2 ферментативных реакций сопряжены с расщеплением АТР на ADP и неорганический фосфат (см. разд. 2.4.2). Чтобы это оказалось, возможным, пул АТР в свою очередь должен поддерживаться на уровне, далеком от равновесия, так чтобы отношение концентрации АТР к концентрации продуктов его гидролиза было высоким. Таким образом, пул АТР служит «аккумулятором», поддерживающим постоянный перенос в клетке энергии и атомов по метаболическим путям, определяемым наличными ферментами. Приближение живой системы к химическому равновесию равнозначно ее распаду и смерти.

3.4.5. Мультиферментные комплексы повышают скорость клеточного метаболизма [36] Способность ферментов ускорять химические реакции является решающей для поддержания жизни. В самом деле, клетка должна сопротивляться неизбежному процессу распада, что приводит ее в состояние, далекое от химического равновесия. Если бы скорость ключевых реакций не была выше скорости их обратных реакций, клетка быстро бы погибла. Представление о скорости метаболизма можно получить на основании того факта, что пул АТР типичной клетки млекопитающего за 1-2 мин полностью обновляется (т.е. все молекулы расщепляются и заменяются вновь синтезированными). Значит, за одну секунду каждая клетка использует 107 молекул АТР, а весь человеческий организм, таким образом, перерабатывает около грамма АТР в минуту.

Такая высокая скорость клеточных реакций обеспечивается эффективностью ферментных катализаторов. Эффективность многих ключевых ферментов столь высока, что ее дальнейшее увеличение бессмысленно, поскольку катализируемые этими ферментами реакции лимитирует скорость столкновений фермента с субстратами: другими словами, скорость реакций лимитируется диффузией.

Если реакция лимитируется диффузией, то ее скорость будет зависеть от концентрации фермента и субстрата. Поэтому для очень большой скорости ряда последовательных реакций необходимо, чтобы каждый промежуточный продукт и все ферменты присутствовали в высоких концентрациях. Но огромное количество одновременно протекающих в клетке различных реакций накладывает ограничение на достижимые концентрации реагентов. На деле большинство метаболитов присутствует в микромолярных концентрациях (10-6 М), а клеточная концентрация большинства ферментов значительно меньше. Как же в таком случае возможно поддерживать очень высокие скорости метаболизма?

Ответ кроется в пространственной организации клеточных компонентов. Скорость реакций можно повысить, не увеличивая концентрации субстратов, если собрать различные участвующие в последовательных реакциях ферменты в большой мультиферментный комплекс. При таком способе организации продукт фермента А переходит непосредственно к ферменту Б и т. д. до конечного продукта, причем лимитирующая стадия диффузии отсутствует даже при очень низких внутриклеточных концентрациях промежуточных соединений. Подобные ферментные комплексы встречаются очень часто. Структура одного из них - пи- Рис. 3-55. Большое увеличение концентрации взаимодействующих молекул может быть достигнуто заключением их в ограниченный мембраной компартмент в эукариотической клетке.

руват-дегидрогеназы - была показана на рис. 2-40. Эти комплексы вовлечены почти во все аспекты метаболизма, включая центральные генетические процессы синтеза ДНК, РНК и белка. На самом деле возможно, что какое-то незначительное число ферментов эукариотических клеток свободно диффундируют в растворе, однако большинство из них, по-видимому, смогло развить центры связывания, которые концентрируют их с другими ферментами сходных функций в определенных участках клетки, повышая таким образом скорость и эффективность катализируемых ими реакций.

Клетки имеют и другой способ увеличения скорости метаболических реакций, связанный с внутриклеточными мембранами.

3.4.6. Внутриклеточные мембраны ускоряют реакции, лимитируемые диффузией [37] Обширная сеть внутриклеточных мембран эукариотических клеток по крайней мере двумя способами ускоряет реакции, скорость которых в отсутствие мембран зависела бы от скорости диффузии. Во-первых, мембраны способны изолировать ряд субстратов и действующие на них ферменты в одном компартменте, например, в эндоплазматическом ретикулуме или ядре. Если принять, что каждый такой компартмент занимает около 10% объема клетки, то концентрация реагентов в компартменте может быть в 10 раз выше, чем в такой же клетке без компартментализации (рис. 3-55).

Второй способ, которым мембраны могут увеличить скорость реакции, состоит в том, чтобы ограничить диффузию реагентов только двумя измерениями поверхности самой мембраны. Ферменты и их субстраты, ограниченные двумя измерениями, будут соударяться друг с другом значительно чаще, чем при трехмерной диффузии, даже несмотря на то что скорость диффузии молекул на мембране примерно в 100 раз ниже, чем в водном растворе (рис. 3-56). Такой процесс, видимо, используется в случае ферментов и субстратов, участвующих в синтезе липидных молекул;

в этом случае субстраты растворены непосредственно в липидном бислое. Возможно, он также используется для ускорения многих других реакций, в которых участвуют связанные с мембранами ферменты.

Было обнаружено, что подобный механизм «плененной диффузии» увеличивает скорость нахождения некоторыми регуляторными белками геноспецифических последовательностей ДНК, с которыми они связываются, непосредственно на хромосоме. Такие белки имеют слабое сродство ко всем участкам ДНК. Они постоянно наталкиваются на хромосому, «скользят» по ней и таким способом сканируют всю длину ДНК до обнаружения своих специфических центров связывания.

Рис. 3-56. Скорости реакции возрастают, когда из-за наличия мембран трехмерная диффузия заменяется двумерной. Здесь показан результат серии теоретических расчетов. А. При диффузии в отсутствие мембран средней молекуле понадобится около 30 мин, чтобы найти любую единичную «мишень» внутри сферической частицы диаметром 10 мкм. Б. Если мишень фиксирована на мембране, то время диффузии значительно уменьшается. Средней молекуле требуется около 1 с, чтобы попасть на большую внутреннюю мембрану и около 2 мин, чтобы найти на мембране мишень. В. Если уменьшить площадь внутренней мембраны в 10 раз, то молекуле потребуется 10 с, чтобы попасть на мембрану, но поиск мишени теперь займет приблизительно в 10 раз меньше времени, чем в случае Б. Таким образом, эффективность соударений в случае В почти в 100 раз выше, чем в А.

3.4.7. Молекулы белка способны обратимо изменять свою форму [38] В общем случае естественный отбор способствовал эволюции полипептидов, которые приобретали специфические стабильные конформации. Однако некоторые белковые молекулы, возможно даже большинство из них, имеют две или более слегка различающиеся конформации и, переходя обратимо от одной к другой, могут менять свою функцию. В таком аллостерическом белке могут, например, образоваться несколько различных наборов водородных связей с примерно одинаковой энергией, причем каждый такой набор связей требует разных пространственных взаимоотношений между двумя участками полипептидной цепи. Альтернативные стабилизированные конформации, как правило, разделяются нестабильными промежуточными состояниями, так что молекула «мечется» между стабильными конформациями.

Каждая дискретная конформация аллостерического белка имеет несколько отличную от других поверхность и, следовательно, разную способность взаимодействовать с другими молекулами. Часто лишь одна из двух конформаций имеет высокое сродство к конкретному лиганду;

в этом случае наличие или отсутствие лиганда определяет принимаемую белком конформацию (рис. 3-57). В тех случаях, когда с различными участками поверхности одного белка могут связываться два различных лиганда, изменение концентрации одного из них меняет сродство белка к другому. Подобные аллостерические изменения играют ведущую роль в регуляции многих биологических процессов.

3.4.8. Аллостерические белки участвуют в регуляции метаболизма [39] Аллостерические белки участвуют в регуляции по принципу обратной связи, которая контролирует поток веществ через метаболические пути (см. разд. 2.5). Например, ферменты, действующие на ранних стадиях какого-либо метаболического пути, почти всегда являются аллостерическими белками, способными существовать в двух альтернативных конформациях. Одна из них - это активная конформация. Белок в активной конформаций связывает в активном центре субстрат и превращает его в следующий метаболит данного пути. Другая конформация - неактивная. Белок в этой конформаций прочно связывает конечный продукт того же самого пути в специальном участке поверхности (регуляторном центре). По мере накопления конечного продукта, фермент связывается и переходит в неактивную конформацию (отри- Рис. 3-57. Каждая конформация аллостерического белка может быть стабилизирована предпочтительным связыванием лиганда. Прочное связывание лиганда лишь с одной из возможных конформаций аллостерического белка переводит белок в эту конформацию. Таким образом, высокая концентрация лиганда X будет активировать представленный белок, а высокая концентрация лиганда Y инактивировать его.

Рис. 3-58. Схема, показывающая как конформация одной субъединицы влияет на конформацию соседних субъединиц в симметричном белке, состоящем из идентичных аллостерических субъединиц. Связывание одной регуляторной молекулы лиганда с одной субъединицей изменяет конформацию этой субъединицы, как показано на рис. 3-57. Поскольку такое изменение способствует возникновению тесносвязанной конформации, то связывание первой молекулы лиганда увеличивает сродство других субъединиц к связыванию того же лиганда. Таким образом, фермент может активироваться относительно малым увеличением концентрации регуляторного лиганда (см. рис. 3-59).

цательная обратная связь), которая становится стабильной, в силу того что продукт может связать фермент только в этой форме. В других случаях фермент, участвующий в метаболическом пути, активируется аллостерическим переходом, который происходит при недостатке в клетке продукта этого пути, когда фермент связывает накапливающийся лиганд. В этом случае лиганд связывается с активной формой фермента (положительная обратная связь) и такое связывание требует перехода из неактивной в активную конформацию (см. рис. 3-57). Результатом регуляции посредством положительной и отрицательной обратной связи является то, что данный продукт синтезируется в клетке лишь тогда, когда он необходим, и таким путем поддерживаются относительно постоянные концентрации всех метаболитов.

3.4.9. Аллостерические белки совершенно необходимы для клеточной сигнализации [40] Мы уже отметили, что аллостерические белки (например, те, которые участвуют в регуляции по принципу обратной связи) имеют по меньшей мере два центра связывания - один для субстрата и один или более для регуляторных лигандов. Эти центры занимают различные участки поверхности белка и узнаваемые лиганды могут быть совершенно различными. Поскольку связывание одного лиганда с соответствующим центром может повлиять на другой центр изменением конформации белка, то любой метаболический процесс в клетке может регулироваться продуктом любой другой реакции независимо от его химической природы. Например, синтез и распад гликогена в мышечных клетках регулируются + концентрацией связанного Са2 с помощью аллостерических ферментов, активность которых меняется при изменении концентрации Са2+ в цитозоле (см. разд. 12.4.4).

Аллостерические белки особенно тонко реагируют на сигналы, если, как это часто случается, они работают совместно как идентичные субъединицы в симметричном ансамбле. В таких белках изменение конформации одной субъединицы, вызванное связыванием лиганда, может помочь соседним субъединицам связать тот же самый лиганд (рис. 3-58). В результате относительно малое изменение концентрации лиганда в окружающей среде переключает переход всего ансамбля из неактивной конформации в активную или наоборот. Если лиганд связывается преимущественно с активной конформацией каждой субъединицы фермента, то это приведет к резкому увеличению ферментативной активности, поскольку концентрация лиганда падает (рис. 3-59). Структура одного хорошо изученного аллостерического фермента аспартат-транскарбамоилазы показана на рис. 3-60.

3.4.10. Белки можно заставить изменять конформацию [40, 41] Белки обеспечивают направленное течение всех происходящих в клетке процессов. Как же можно заставить молекулы самих белков двигаться упорядоченным образом? Прежде чем ответить на этот вопрос, мы должны рассмотреть, каким образом клетка контролирует изменения конформации аллостерических белков. Рассмотрим аллостерический белок, способный принимать две альтернативные конформации - неактивную низкоэнергетическую К и активную высокоэнергетическую К*, энергия которых различается на 4,3 ккал/моль (что приблизительно соответствует энергии образования на поверхности белка четырех водородных связей). При такой разнице энергий вероятность концентрации К будет в 1000 раз превышать вероятность конформации К* (табл. 3-3), и белок почти всегда будет находится в неактивной Рис. 3-59. При увеличении концентрации лиганда активность изображенного на рис. 3-58 аллостерического фермента, состоящего из нескольких субъединиц, будет выражаться «сигмоидной» кривой (цветная кривая) благодаря кооперативному связыванию молекул лиганда. Напротив, активация аллостерического фермента, состоящего из одной субъединицы, описывается кривой простого насыщения (черная кривая). Пунктирная прямая показывает максимальный уровень активности, достигаемый при очень высоких концентрациях лиганда, который будет одинаковым в обоих случаях.

конформации. Есть, однако, два способа заставить белок принять активную конформацию.

Связывание низкомолекулярного лиганда, образно выражаясь, «перетаскивает» молекулу в активную конформацию К*. Если лиганд связывается только с К*, то энергия этой конформации избирательно уменьшается, а энергия К остается неизменной. Поскольку лиганд связывается с белком достаточно слабо (большая часть энергии связывания уходит на удержание подходящей для лиганда формы белка), он с легкостью диссоциирует, и поэтому такое изменение конформации белка полностью обратимо.

Другой способ состоит в использовании дополнительной химической энергии для того, чтобы «толкнуть» белок на изменение конформации К на активную конформацию К*. В этом случае смена конформации почти необратима. Обычно происходит ковалентный перенос фосфата с молекулы АТР на остатки серина, треонина или тирозина белка с образованием ковалентной связи. Предположим, что эта реакция фосфорилирования, направляемая благоприятным гидролизом АТР в ADP создает невыгодное для конформации К отталкивание зарядов. Если это отталкивание уменьшено в активной форме К*, то переход из К в К* будет сильно облегчаться фосфорилированием (рис. 3-61). Регулируемое фосфорилирование, активирующее или подавляющее функционирование специфических белков, - обычное явление в эукариотических клетках (см.

разд. 3.2.3);

в самом деле, приблизительно одна Рис. 3-60. Фермент аспартат-транскарбамоилаза выключается в ответ на связывание цитозинтрифосфата (СТР). Ферментный комплекс состоит из шести каталитических субъединиц и шести регуляторных субъединиц. Структура его неактивной и активной форм определена методом рентгеноструктурного анализа. Каждая регуляторная субъединица может связывать одну молекулу СТР, являющегося одним из конечных продуктов реакции. Эта реакция начинается, когда фермент катализирует образование карбамоиласпартата из карбамоилфосфата и аспарагиновой кислоты. Посредством такой регуляции по типу отрицательной обратной связи фермент защищен от производства большего количества СТР, чем это необходимо клетке. (По данным К. L. Krause, К. W. Volz and W.N. Lipscomb Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1643 1647, 1985.) Рис. 3-61. Фосфорилирование с помощью АТР может активировать аллостерический белок. На этом примере неактивная конформация нефосфорилированного белка А в 1000 раз энергетически выгодней из-за разницы свободной энергии 4,3 ккал/моль (см. табл. 3-3). Когда же он фосфорилирован, активная конформация белка Б выгоднее в 100 раз (2,8 ккал/моль), поскольку фосфорилирование создает энергетически невыгодное отталкивание зарядов;

этот эффект частично снимается переходом в активную информацию К*. Следовательно, фосфорилирование «толкает» фермент в активную конформацию. В другом случае фосфорилирование может приводить к притяжению зарядов, которое сближает две удаленные части аллостерического белка.

десятая различных белков клеток млекопитающих содержит ковалентно связанный фосфат.

Иногда при добавлении ADP к таким фосфорилированным белкам in vitro наблюдается синтез АТР. Эти данные непосредственно показывают, что существенная часть энергии гидролиза АТР была запасена в напряженной конформации, принимаемой белком при его фосфорилировании. Как же, однако, происходящие с потреблением энергии изменения конформации белка вызывают движения и производят в клетке полезную работу?

3.4.11. Изменения конформации белка, происходящие с затратой энергии, могут быть использованы для выполнения полезной работы [42] Предположим, что белку необходимо «пройти» вдоль тонкой нити, например, вдоль актиновой нити или молекулы ДНК. На рис. 3- показано, как аллостерический белок может выполнить эту задачу, принимая различные конформации. Если ничто не направляет и не упорядочивает конформационные изменения, то изменения формы белка будут полностью обратимы, т. е. белок будет случайно и бесцельно блуждать вдоль нити или волокна.

Поскольку при направленном движении белка совершается работа, то по законам термодинамики на движение должна быть затрачена какая-либо энергия (в противном случае это движение можно было бы использовать для создания вечного двигателя). Поэтому, как бы мы ни модифицировали показанную на рис. 3-62 модель, например, путем введения стабилизирующих ту или иную конформацию лигандов, молекула белка не будет способна к направленному движению, если не снабдить ее источником энергии.

Необходимо каким-либо образом сделать последовательность изменений конформации белка направленной. Например, весь цикл может стать направленным, если какую-либо из стадий сделать необратимой. Один из способов достижения необратимости состоит в использовании уже описанного цикла фосфорилирования - дефосфорилирования. Но Рис. 3-62. Схематическое изображение «шагающего» аллостерического белка. Хотя три различные конформации белка позволяют ему перемещаться и назад, и вперед по волокну, с которым он связан, постоянное движение в одном направлении невозможно.

аллостерические изменения белков можно направлять и без этого, используя энергию гидролиза АТР. К примеру, в показанной на рис. 3- модифицированной схеме циклического перемещения связывание АТР заставляет белок изменить конформацию 1 на конформацию 2. Затем происходит гидролиз АТР, продуктами которого являются связанные ADP и неорганический фосфат (Рi). Этот гидролиз сопровождается переходом конформации 2 в конформацию 3. Наконец, освобождение ADP и Рi позволяет белку вернуться в конформацию 1.

Поскольку на последовательность конформационных переходов 1 2 3 1 затрачивается энергия гидролиза АТР, то весь цикл при физиологических условиях становится практически необратимым (т.е. вероятность образования АТР из ADP и Рi по пути 1 3 2 1 очень низка). Так как необратимость обеспечивает направленность цикла, то молекула белка в нашем схематическом примере будет непрерывно перемещаться вправо. Примерами белков, осуществляющих направленное движение с помощью описанного механизма, могут служить мышечный белок миозин и белок ДНК-геликаза, играющая важную роль в репликации ДНК.

Многие белковые устройства используют аналогичные механизмы для выполнения упорядоченных движений. Все эти белки способны претерпевать циклические изменения формы, сопровождающиеся гидролизом АТР. Некоторые из них по ходу цикла временно фосфорилируются, другие - нет.

3.4.12. Мембранные аллостерические белки, используя энергию АТР, могут служить молекулярными насосами [43] Аллостерические белки могут использовать энергию гидролиза АТР не только для создания механического напряжения, но и для осуществления других форм работы, таких, как перекачивание специфических ионов внутрь или наружу клетки. Например, присутствующий в + + плазматической мембране всех клеток животных аллостерический белок под названием (Na, К )-зависимая АТРаза в каждом цикле конформационных изменений, сопровождающихся АТР-зависимым фосфорилированием белка, выкачивает из клетки 3 иона Na + и накачивает в клетку 2 иона К+ (см. разд. 6.4.5). Этот насос, работающий за счет энергии АТР, потребляет более 30% энергетических потребностей большинства клеток. Постоянное выкачивание Na+ и накачивание К+ приводят к тому, что во внутриклеточной среде содержание Na+ оказывается ниже, а содержание К+ выше, чем во внеклеточной среде. Таким путем создаются противоположно направленные трансмембранные градиенты концентраций ионов К+ и Na +. Заключенная в этих и других ионных градиентах энергия в свою очередь направляет конформационные изменения множества других мембранных аллостерических белков, заставляя их выполнять полезную для клетки работу.

3.4.13. Белки могут мобилизовать энергию ионных градиентов для выполнения полезной работы [43, 44] АТР и другие нуклеозидтрифосфаты - крайне важные, но не единственные источники энергии для белков, которые могут использовать ее для совершения полезной работы. Ионный градиент по обе стороны различных клеточных мембран способен запасать и расходовать энергию подобно перепаду воды по разные стороны плотины. Например, созданный (Na+, К+ )-зависимой АТРазой большой перепад концепт- Рис. 3-63. «Шагающий» аллостерический белок, у которого переход между тремя конформациями направляется гидролизом связанной молекулы АТР. Цикл становится практически необратимым, поскольку один из таких переходов сопряжен с гидролизом АТР. С помощью повторяющихся циклов белок постоянно движется по волокну вправо.

рации Na+ с двух сторон плазматической мембраны приводит в движение другие белковые насосы, транспортирующие в клетку глюкозу или специфические аминокислоты.

Мембранные аллостерические насосы, питаемые энергией гидролиза АТР, способны работать в обратном направлении и использовать энергию ионного градиента для синтеза АТР. В самом деле, как мы увидим в гл. 7, именно такой механизм мобилизует у животных энергию градиента протонов [Н+] (направленного поперек внутренней мембраны митохондрий) для синтеза большинства молекул АТР.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 11 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.