WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 13 |

«СПРАВОЧНИК Лабораторные методы исследования в клинике Под редакцией профессора В.В.Меньшикова МОСКВА „МЕДИЦИНА" 1987 ББК 53.4 М51 УДК 61б-074/-078:061.6 В. В. МЕНЬШИКОВ, Л. Н. ДЕЛЕКТОРСКАЯ, Р. П. ...»

-- [ Страница 6 ] --

методы определения длительности кровотечения Пр и м е ч а н и я. 1. Описаны варианты и резистентности капилляров, а также методы теста без прогревания мочки уха и с глубиной определения количества тромбоцитов и их прокола от 3 до 4 мм. 2. За рубежом распростра функциональных активностей (адгезивно-секре- нен также метод Айви, при котором опреде торно-агрегационной, коагуляционной и ретрак- ляется длительность кровотечения из надрезов тильной). кожи ладонной поверхности предплечья в усло виях повышенного венозного давления.

Ли т е р а т у р а. Балуда В. П., Баркаган 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные 4.3.1. Время кровотечения методы исследования системы гемостаза.— Томск, 1980, с. 65—66;

Caen J., Larrieu M. 1., Общий принцип широко применяемых мето Samama M. L hemostase. Methodes d'explora дов заключается в измерении длительности tion et diagnostic pratique.— Paris, 1968, p. 44— кровотечения из ранки на коже мочки уха, 47;

Markwardt F. Therapie der Blutstiilungs мякоти ногтевой фаланги пальца руки или верх storungen. 2. Auflage.— Leipzig: Johann Ambro ней трети ладонной поверхности предплечья, sius Barth, 1976, S. 38—39.

наносимой автоматическим ланцетом, обычным плоским ланцетом или скарификатором. Описа ны варианты теста, при проведении которых 4.3.2. Резистентность (ломкость) учитывается не только длительность кровотече капилляров ния, но и объем теряемой крови. Ориентиро вочно он может быть оценен по количеству и виличине пятен крови на фильтровальной бума- Тест, как правило, выполняется вне лабора ге, которой промокают выступающие капли тории, но имеет важное значение для диагности крови. ки тромбоцитарно-сосудистых нарушений. Обычно Метод Дьюка (модифицированный). Пр ин- применяются различные варианты манжеточной цип. Определяется длительность кровотечения (турникетной) пробы, заключающейся в опреде из поверхностных микрососудов мочки уха после лении образования точечных кровоизлияний на нарушения их целостности с помощью плоского коже в области кратковременного повышения ланцета или скарификатора. венозного давления, или варианты баночной Р е а к т и в ы. 96 % раствор этанола (этило- пробы, которая основана на подсчете числа вый спирт) или эфир. петехий на коже в зоне локально создаваемого Об о р у д о в а ние. 1. Плоский ланцет или отрицательного давления.

скарификатор с ограничителем глубины разреза. Манжеточная проба Румпеля — Лееде — 2. Секундомер. Кончаловского. Пр и н ц и п. Подсчитывается Ход о п р е д е л е н и я. Мочку уха согре- количество петехий на ограниченном участке вают между пальцами в течение 1 мин. Протира- кожи ладонной поверхности предплечья, обра ют спиртом (эфиром) и согревают настольной зующихся при дозированном повышении веноз лампой с рефлектором до полного высыхания ного давления.

спирта. Производят прокол мочки уха у ее Ре а к т и в ы. Не требуются.

нижненаружного края (глубиной 3,5 мм и дли- Об о р у д о в а н и е. Сфигмоманометр.

ной линейного прокола 3 мм) и немедленно Ход о пр е д е л е ния. На коже верхней включают секундомер. Выступающие капли части ладонной поверхности предплечья очерчи крови промокают каждые 30 с фильтровальной вают круг диаметром 5 см. Накладывают на бумагой, не прикасаясь к ранке и дожидаясь плечо этой же руки манжету сфигмоманометра момента, когда в течение очередных 30 с капля и поддерживают в ней в течение 5 мин давление крови уже не образуется. По окончании этих 90 мм рт. ст. Снимают манжету и через 5 мин 30 с секундомер останавливают и в последую- после восстановления кровообращения в руке щем их вычитают из времени, зафиксирован- подсчитывают число петехий в очерченном круге.

ного на секундомере. Для большой точности Обращают также внимание на размеры крово тест выполняют дважды (на обеих мочках) излияний.

и выводят среднее значение. Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Число пе Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: 2—5 мин техий не превышает 10, а их диаметр составляет (не более). не более 1 мм.

Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Время кро- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. При выра вотечения удлиняется при выраженных тромбо- женных тромбоцитопениях, некоторых тромбо цитопатиях и ангиопатиях количество петехий меняют, так как многие из них угнетают агре на той же площади достигает 20 и более, нередко гацию тромбоцитов (см. 4.3.5) и могут исказить регистрируются кровоизлияния диаметром более результаты.

1 мм. По д г о т о в к а к о л о н к и. Отрезок поли хлорвиниловой трубки длиной 23—25 см за Ли т е р а т у р а. Borchgrevink С. F. In:

крывают с одного конца зажимом для трубки Thrombosis and bleeding disorders. Theory and или канюлей от иглы (с расчетом, чтобы они methods.— Stuttgart: Georg Thieme Verlag, пропускали кровь, но задерживали шарики), 1971, p. 429.

а с другого конца насыпают в трубку через микроворонку 2,5 г шариков.

Ход о пр е д е л е ния. Берут пробу крови 4.3.3. Количество (подсчет) для подсчета тромбоцитов. Набирают в шприц тромбоцитов 2 мл крови, присоединяют к нему колонку со стеклянными шариками (незакрытым концом) Подсчет тромбоцитов см. в разделе 3.5.

и устанавливают шприц в инфузионный насос.

Включают насос и пропускают кровь через колонку за 1 мин. Вытекающую из колонки 4.3.4. Ретенция (адгезивность) кровь собирают в пластиковую или стеклянную тромбоцитов силиконированную пробирку, перемешивают и снова берут пробу для подсчета тромбоцитов.

Известны прямые и непрямые методы оценки Индекс ретенции (адгезивности) тромбоцитов ретенции (адгезивности) тромбоцитов. Прямые вычисляют по формуле:

заключаются в подсчете тромбоцитов, фикси рующихся на стандартной пластине (обычно Индекс ретенции (адгезивности) = стеклянной) при нанесении на нее крови или погружении ее в кровь. Непрямые методы основаны на установлении разницы между количествами тромбоцитов в венозной крови и в крови, вытекающей из ранки на коже пальца руки (или предплечья;

адгезивность тромбоци- где А — количество тромбоцитов в крови до тов in vivo), или в венозной крови до и после пропускания;

В — количество тромбоцитов в ее контакта с какой-либо поверхностью (ад- крови после пропускания через колонку.

гезивность тромбоцитов in vitro). Наибольшее Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы: 20—55 %.

распространение получили методы определения Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Уменьше ретенции (адгезивности) тромбоцитов in vitro. ние индекса ретенции (адгезивности) тромбо Метод определения ретенции тромбоцитов цитов вплоть до 0 % наблюдается при ряде на стеклянных шариках (модифицированный). врожденных тромбоцитопатий и при болезни Пр и н ц и п. Определяется количество тромбо- Виллебранда (табл. 35).

цитов, задерживаемых в колонке со стеклян- Пр и ме ч а н и я. 1. При отсутствии инфу ными шариками при пропускании через нее зионного насоса можно воспользоваться ваку со стандартной скоростью определенного объема умным насосом или компрессором. 2. Ретенция крови. тромбоцитов может быть исследована и с при Ре а к т и в ы. 1. 3,8 % раствор цитрата менением стеклоткани.

натрия. 2. 1 % раствор оксалата аммония.

Ли т е р а т у р а. Одесская Т. А., Шитико Об о р у д о в а ние. 1. Все, что необходимо ва А. С., Папаян Л. П. К методике определения для подсчета тромбоцитов в крови фазово адгезивной активности тромбоцитов in vitro.— контрастным методом (см. 3.5). 2. Инфузион Лаб. дело, 1971, № 7, с. 395—398;

Смоляниц ный насос, позволяющий опорожнять шприц кий А. Я., Детинкина Г. Н., Дынкина И. М.

на 5—10 мл со скоростью 2 мл/мин. 3. Поли Определение адгезивности (ретенции) тромбо хлорвиниловая трубка с внутренним диаметром цитов с применением стеклянных шариков.— 3—3,5 мм. 4. Полиэтиленовые (пластиковые) Лаб. дело, 1985, № 2, с. 90—94.

или стеклянные силиконированные шприцы вместимостью 5—10 мл. 5. Зажимы для поли хлорвиниловой трубки или канюли от инъекцион 4.3.5. Агрегация тромбоцитов ных игл. 6. Стеклянные шарики диаметром 0,2— 0,4 мм. Шарики диаметром 0,1 — 1 мм, выпускае мые Уфимским заводом текстильного стекло- Наиболее распространенные способы оценки волокна, просеивают через сито, задерживаю- агрегации тромбоцитов заключаются в исследо щее шарики диаметром более 0,4 мм, а затем вании скорости и степени уменьшения оптиче оказавшиеся под ситом шарики просеивают ской плотности (увеличения светопропускающей через второе сито, которое пропускает шарики способности) тромбоцитарнои плазмы при пере диаметром менее 0,2 мм. Оставшиеся на втором мешивании с индукторами агрегации (при сите шарики требуемого диаметра промывают изучении спонтанной агрегации они не до ацетоном и высушивают. бавляются). Образование агрегатов тромбоци Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я. тов под действием стимуляторов может быть Свежевзятая цитратная кровь. За 7—10 дней оценено также визуально или с помощью микро до обследования лекарственные препараты от- скопа.

Таблица 35. Наиболее частые формы врожденных нарушений функций тромбоцитов Агрегация под действием Ретенция АДФ, адреналина Болезнь Ретракция бычьего ристоцети тромбо колла (синдром) сгустка фибрино- на (ристо цитов первая вторая гена гена мицина) волна волна Тромбастения Нарушена Нарушена Нарушена Нарушена Нормаль- Нормаль- Нарушена Гланцманна ная ная Аспириноподоб- Нормаль- Нормаль- » » » > Нормаль ный синдром ная или ная ная нарушена Болезнь (недо- Нарушена То же » » » > » статочность) пу ла хранения » Болезнь (синд- » Нормаль- Нормаль- Нормаль- Нарушена Нарушена ром) Бернара — ная или ная или ная Сулье нарушена нарушена Болезнь (синд- » Нормаль- » » Нормаль- Нормаль- » ная ная ром) Виллебран- ная да Качественный макроскопический метод. Прин- Пр и ме ч а н и е. Макроскопическим мето цип. Определяется визуально наличие или дом может быть исследована также агрега отсутствие агрегатов тромбоцитов в пробирке, ция под действием коллагена (в конечных где исследуемая тромбоцитарная плазма пере- концентрациях 20—50 мкг/мл), ристоцетина мешивается со стимулятором агрегации. (ристомицина) и бычьего фибриногена (оба Ре а к т ив ы. 1. 3,8 % раствор цитрата в конечных концентрациях 1 —1,5 мг/мл).

натрия. 2. Раствор АДФ в изотоническом раст- В случае нарушения реакции высвобождения воре натрия хлорида или буфере Михаэлиса тромбоцитов агрегация не развивается при рН 7,35 в концентрации 20 мкг/мл. 3. 0,85 % перемешивании с коллагеном;

для болезни раствор хлорида натрия или буфер Михаэлиса Виллебранда характерен дефект ристоми рН 7,35. Веронал-ацетатный буфер Михаэлиса цин-агрегации;

болезнь Бернара — Сулье (пропись Оврена — Коллера): раствор А—ди- распознается по отсутствию одновременно этилбарбитуровокислый натрий — 7,35 г, ацетат ристомицин- и фибриноген-агрегации (см.

натрия — 4,86 г, дистиллированная вода — табл. 35).

250 мл;

буфер: раствор А — 250 мл, 4,25% Ли т е р а т у р а. Caen J., Larrieu M. 1., раствор натрия хлорида — 200 мл;

0,1 моль/л Samama M. Lhemostase. Methodes d'explora раствор НС1 — 217 мл, дистиллированная во tion et diagnostic pratique.— Paris, 1968, p. 58— да — 683 мл.

59: Human blood coagulation, haemostasis and Об о р у д о в а ни е. 1. Водяная баня на thrombosis / Ed. Biggs R. M.— Oxford, 1976, 37 °С. 2. Секундомер.

p. 738.

Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

Тромбоцитарная плазма, лучше со стандартным Количественный фотометрический метод.

содержанием тромбоцитов (250000 в 1 мкл). Пр и н ц и п. С помощью агрегометра (агре За 7—10 дней до обследования лекарственные гатометра), представляющего собой фотометр препараты отменяют, так как многие из них с присоединенным к нему самописцем, непре (дипиридамол и его производные, ацетилсали- рывно регистрируются изменения светопропускаю циловая кислота и ее производные, индомета- щей способности тромбоцитарной плазмы при цин, гироксихлорохин, фенилбутазон, сульфин- перемешивании с агрегирующими агентами.

пиразон, низкомолекулярные декстраны, три- Ре а к т ив ы. 1. Раствор АДФ в конечных циклические антидепрессанты и др.) угнетают концентрациях 10~7 —10~4 моль/л. 2. Суспензия агрегацию тромбоцитов. коллагена в конечных концентрациях 20— Ход о пр е д е л е ния. Набирают в про- 50 мкг/мл. 3. Раствор ристоцетина (ристомици бирку 0,2 мл плазмы и ставят ее в водяную на) в конечных концентрациях 1 —1,5 мг/мл.

баню при 37 °С. Через 1 мин добавляют 0,1 мл 4. Раствор бычьего фибриногена в конечных раствора АДФ и немедленно включают секундо- концентрациях 1 —1,5 мг/мл. 5. Раствор адре мер. Покачивая или потряхивая пробирку, отме- налина (неампулированного) в конечных кон чают время образования в смеси крупных агре- центрациях 10 ~ —10 ~4 моль/л. 6. Раствор гатов тромбоцитов. тромбина в конечных концентрациях Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы. 10—60 с. 0,1—0,5 ЕД/мл. 7. Раствор арахидоновой кисло Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. При тром- ты в конечных концентрациях 0,1 — 1 ммоль/л.

бастении Гланцманна агрегация тромбоцитов Об о р у д о в а ние. Агрегометр (агрегато не наступает. метр).

Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я. цитов обследуемого и здорового человека на Тромбоцитарная и бестромбоцитарная плазмы. свертывание бестромбоцитарной нормальной В тромбоцитарной плазме подсчитывают тромбо- плазмы.

циты (см. 3.5) и разводят ее бестромбоцитарной Ли т е р а т у р а. 1. Human blood coagula плазмой до концентрации 200 000—300 000 в tion, haemostasis and thrombosis / Ed. Biggs 9 1 мкл (200 • 10 —300 • 10 /л). За 7—10 дней R. M.— Oxford, 1976, p. 745—746.

до обследования лекарственные препараты от меняют (см. макроскопический метод).

4.3.7. Ретракция сгустка крови Ход о п р е д е л е н и я. В соответствии с инструкцией.

Описаны прямые и непрямые методы оценки Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Зависят от ретракции сгустка крови. Прямые основаны на типа агрегометра, приводятся в инструкции.

Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Описы- применении специальных устройств, позво ляющих измерить величину ретрактильных сил, вается в инструкции.

В целом при анализе агрегатограмм обра- развивающихся в сгустке при его самопроиз вольном сокращении. Непрямые методы заклю щают внимание на общий характер агрегации (одноволновая, двухволновая;

полная, непол- чаются в измерении объема сыворотки, выделяе ная;

обратимая, необратимая), разницу между мой из сгустка крови при его ретракции, светопропускающей способностью плазмы до или в оценке степени уменьшения объема сгуст начала агрегации и после достижения макси- ка разведенной плазмы со стандартным содер мальной агрегации (характеризует интенсив- жанием тромбоцитов в процессе его спонтан ность агрегации), а также увеличение свето- ного сжатия. В клинике наибольшее распростра пропускающей способности плазмы за первую нение получили непрямые методы.

Качественный метод. Пр и н ц и п. Через минуту агрегации или угол наклона кривой стандартное время после инкубации пробирки на этапе бурной агрегации (характеризует с цельной нестабилизированной кровью при скорость агрегации). При применении в качестве стимулятора коллагена учитывается также дли- 37 °С оценивают визуально наличие или отсут тельность латентного периода в его действии ствие ретракции сгустков крови.

(время от момента добавления раствора кол- Р е а к т и в ы. Не требуются.

лагена к исследуемому образцу до начала Об о р у д о в а н и е. Водяная баня на 37 °С.

агрегации). Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.

Важно отметить, что появление двухволно- Цельная нестабилизированная кровь.

вой агрегации при стимуляции АДФ и адренали- Ход о п р е д е л е н и я. ВЗ пробирки наби ном в концентрациях, вызывающих в норме рают по 1 мл исследуемой крови и помещают обратимую агрегацию (обычно 1 • 10 ~' их в водяную баню. Через 2 ч смотрят, наступила 5 • 10 моль/л), указывает на повышение ли ретракция сгустков крови.

чувствительности тромбоцитов к этим индукто- Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Сгустки рам, а развитие одноволновой неполной (а часто крови здоровых людей начинают ретрагировать и обратимой) агрегации при стимуляции ими через 30—60 мин. Результат считается положи в концентрациях 10 ~ моль/л и больше — на тельным, т. е. учитывается как «1», если ре нарушение реакции высвобождения (реакции тракция сгустка наблюдается хотя бы в одной дегрануляции, секреторной реакции) тромбоци- пробирке. При отсутствии ретракции во всех тов. пробирках проба считается отрицательной и При обследовании больных с врожденной учитывается как «О».

кровоточивостью микроциркуляторного и микро- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Отсутствие циркуляторно-гематомного типов следует иметь ретракции сгустков крови наблюдается при вы в виду дифференциально-диагностическое зна- раженных тромбоцитопениях и тромбастении.

чение сочетаний нарушений агрегации при при- Количественный метод. Пр и н ц и п. Опре менении набора стимуляторов (см. табл. 35). деляется объем сыворотки, выделяемой при ре тракции сгустка крови, по отношению к объему Л и т е р а т у р а. Баркаган 3. С. Геморраги плазмы в исследуемой крови.

ческие заболевания и синдромы.— М., 1980, Ре а к т и в ы. Не требуются.

с. 85;

Папаян А. В., Шабалов Н. П. Геморраги Об о р у д о в а н и е. 1. Водяная баня на ческие диатезы у детей. Руководство для вра 37 °С. 2. Центрифуга лабораторная. 3. Центри чей.—Л., 1982, с. 186—187;

Ingram G. I. С., фуга гематокритная. 4. Градуированная центри Brozovic M., Slater N. G. P. Bleeding disorders фужная пробирка вместимостью 5 мл с деле investigation and management.— Blackwell sci ниями по 0,1 мл.

entific publications, 1982, p. 270—276.

Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

Цельная нестабилизированная кровь.

Ход о п р е д е л е н и я. В градуированную 4.3.6. Коагуляционная (коагулянтная, центрифужную пробирку набирают 5 мл крови, прокоагулянтная) активность тромбоцитов помещают ее в водяную баню и опускают в Чаще всего определяется в тесте генерации кровь деревянную палочку. Одновременно опре тромбопластина (см. 4.4.10), но может быть деляют показатель гематокрита в исследуемой оценена и более простым методом, например крови. Через 1 ч после свертывания крови путем сравнительного исследования ускоряюще- сгусток, прикрепившийся к палочке, удаляют, го влияния активированных каолином тромбо- дав жидкой части стечь обратно в пробирку.

Измеряют объем жидкости, оставшейся в про- показатель гематокрита), деленный на бирке, центрифугируют ее при 3000 об/мин в (знаменатель в формуле представляет собой течение 5 мин и измеряют объем осевших эритро- объем плазмы в исследуемой крови).

цитов. Определяют объем сыворотки (по разни- Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: 40—95 %.

це между объемом оставшейся в пробирке жид- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Уменьше кости и объемом эритроцитов). Вычисляют ние ретракции сгустка крови наблюдается при ретракцию сгустка по формуле: выраженных тромбоцитопениях и тромбастении (вплоть до полного отсутствия — 0%).

Ли т е р а т у р а. Bowie E. J. W., Thompson J. H., Didisheim P., Owen С. A. Mayo cl i ni c где ОС — объем сыворотки;

ОК — объем крови, laboratory manual of hemostasis. — W. B. Saun (П/100) — показатель плазмокрита (100 минус ders company, 1971, p. 29—33.

4.4. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ (КОАГУЛЯЦИОННЫЙ ГЕМОСТАЗ, КОАГУЛЯЦИОННОЕ ЗВЕНО ИЛИ КОМПОНЕНТ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА) О р и е н т и р о в о ч н ы е ме т о д ы ис- пературе или в одной пробирке (они менее с л е д о в а н и я к о а г у л я ц и о н н о г о ге- точные). Усложненные заключаются в ис мо с т а з а. К числу ориентировочных (инте- следовании свертывания крови в 3—4 про гральных) относят методы, характеризующие бирках или внесении поправки на ускорение процесс гемокоагуляции в целом, его отдель- свертывания, вызываемое перемешиванием ные фазы, внешний и внутренний механизмы крови.

образования протромбиназы и группы факторов Ли т е р а т у р а. Балуда В. П., Барка свертывания крови (номенклатура, характери гаи 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные стика и формы недостаточности факторов свер методы исследования системы гемостаза.— тывания крови представлены в табл. 36).

Томск, 1980, с. 124—127.

4.4.1. Время свертывания крови 4.4.2. Время рекальцификации Унифицированный метод определения вре стабилизированной крови (плазмы) мени свертывания крови (1974). Пр и н ц и п.

Определяют время свертывания цельной неста Общеоценочной пробой на свертывание ста билизированной венозной крови при 37 °С.

билизированной крови (плазмы) является реак Ре а к т и в ы. Не требуются.

ция рекальцификации, которая заключается в Об о р у д о в а ни е. 1. Водяная баня на определении времени свертывания плазмы (ис 37 °С. 2. Секундомеры.

следования крови дают мелее воспроизводимые Ма т е р и а л и с с л е д о в а н и я. Цель результаты) после добавления к ней раствора ная нестабилизированная венозная кровь.

хлорида кальция оптимальной концентрации.

Ход о п р е д е л е н и я. Сухой иглой Унифицированный метод определения вре с широким просветом без шприца пунктируют мени рекальцификации плазмы (1974). Пр и н локтевую вену. Выпустив первые капли крови цип. Определяют время свертывания тромбо на ватный тампон, набирают по 1 мл в 2 су цитарной плазмы при добавлении оптимального хие пробирки одинакового размера. Немедлен количества хлорида кальция.

но включают секундомер и ставят пробирки в во Ре а к т ив ы. 1. 1,34% раствор оксалата дяную баню. Через 2 мин, а затем через каждые натрия или 3,8 % раствор цитрата натрия 30 с пробирки наклоняют на 45—60°, дожидаясь (см. 4.1). 2. 0,025 моль/л (0,277%) раствор момента, когда кровь свернется. Отмечают вре хлорида кальция. Растворяют 277 мг высушен мя образования сгустка крови в каждой из про ного до постоянной массы хлорида кальция бирок и вычисляют средний результат.

в 100 мл дистиллированной воды или разводят Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: 5—10 мин.

5 % раствор хлорида кальция в 18 раз дистил Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Удлинение лированной водой. Для приготовления 5 % раст времени свертывания крови до 15 мин и более вора 5,2—5,5 г прокаленного на газовой горелке наблюдается при тяжелой недостаточности фак в фарфоровом тигле хлорида кальция раство торов, участвующих во внутреннем пути образо ряют в 100 мл дистиллированной воды и с по вания протромбиназы, дефиците протромбина и мощью чувствительного ареометра определяют фибриногена, а также при наличии в крови ин отн. плотность раствора при 20 °С. Если она от гибиторов свертывания, в частности гепарина.

личается от 1,040, то, добавляя сухой хлорид Пр и м е ч а н и е. На практике применяют кальция или дистиллированную воду, доводят ее также упрощенные и усложненные варианты до этой величины. Отн. плотность 1,040 соответ теста. При упрощенных вариантах сверты- ствует 5 % раствору хлорида кальция. 3. 0,85 % вание крови определяют при комнатной тем- раствор хлорида натрия.

Продолжение табл. Об о р у д о в а ни е. 1. Водяная баня на плазмы в условиях стандартной контактной ак 37 °С. 2. Секундомеры. тивации свертывания каолином.

Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

Ли т е р а т у р а. Балуда В. П., Барка Тромбоцитарная плазма.

гаи 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные Ход о п р е д е л е н и я. В пробирку, уста методы исследования системы гемостаза.— новленную в водяной бане, наливают 0,2 мл Томск, 1980, с. 129;

Детинкина Г. Н., Дынки раствора хлорида кальция и 0,1 мл 0,85 % раст на И. М., Торик Ж- Н. Предложения по унифи вора хлорида натрия. Через 1 мин в пробирку кации методов исследования системы гемоста вводят 0,1 мл плазмы, немедленно включают се за,—Лаб. дело, 1983, № 5, с. 269—270.

кундомер и отмечают время образования сгустка.

Исследование повторяют 2—3 раза и вычисляют средний результат.

4.4.3. Активированное частичное Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: 60—120с.

(парциальное) тромбопластиновое Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Укороче время (АЧТВ) ние времени рекальцификации указывает на гиперкоагуляцию, удлинение — на гипокоагуля- Важной модификацией определения активи цию. Удлинение этого времени может быть свя- рованного времени рекальцификации плазмы зано с врожденной недостаточностью плазмен- является АЧТВ, заключающееся в исследовании ных факторов свертывания (за исключением реакции рекальцификации плазмы в условиях факторов VII и XIII), наличием в крови инги- стандартизации не только контактной, но и фос биторов свертывания крови или выраженным фолипидной активации. С этой целью к плазме дефицитом фактора 3 тромбоцитов (тромбо- наряду с контактным активатором добавляют цитопения, тромбоцитопатия с недостаточ- частичный (парциальный) тромбопластин, кото ностью фактора 3). Может быть удлинено при рый в функциональном отношении подобен тром диссеминированном внутрисосудистом сверты- боцитарному тромбопластину. В качестве за вании крови (в стадии «коагулопатии потребле- менителя тромбоцитарного тромбопластина ния»). обычно используют эритрофосфатид или кефа Пр и м е ч а н и е. В последние годы реко- лин. Чувствительность этих тестов к дефициту мендуется определять время рекальцификации плазменных факторов свертывания крови (иск лючая факторы VII и XIII) выше, но зато стан- Томск, 1980, с. 147—148, 299—300;

Детинки дартная фосфолипидная активация делает не- на Г. Н., Дыпкина И. М., Торик Ж. Н. Предло возможным выявление недостаточности коагу- жения по унификации методов исследования ляционной активности тромбоцитов.

системы гемостаза.— Лаб. дело, 1984, № Метод определения каолин-эритрофосфатид- с. 270—271.

ного времени. Пр инцип. Определяется вре мя рекальцификации бестромбоцитной плазмы 4.4.4. Протромбиновое время в условиях стандартизованной контактной (као (протромбиновый индекс) лином) и фосфолипидной (эритрофосфатидом) активации свертывания крови.

Это вариант определения времени рекальци Ре а к т ив ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат фикации плазмы с добавлением тканевого тром рия (см. 4.1). 2. 0,025 моль/л раствор хлорида 2 + бопластина. В комплекс с фактором VII и Са кальция (см. 4.4.2). 3. 0,85 % раствор хлорида он непосредственно активирует фактор X, так натрия. 4. Коалин-эритрофосфатидная смесь:

что результаты теста зависят от активности 2,5—3 % эмульсию фосфолипидов эритроцитов, фактора VII, фактора X и факторов, включаю выпускаемую Минским институтом переливания щихся в процесс свертывания крови на этапах крови под названием эритрофосфатид, разводят тромбино- и фибринообразования (факторов V, 0,85 % раствором хлорида натрия до 0,1 % II и I).

эмульсии, расфасовывают по 1 мл во флаконы На основе исследования протромбинового или ампулы, герметично закрывают и хранят при времени разработаны одностадийные методы —20 °С. Перед работой эмульсию разморажи определения факторов II, V и VII.

вают, разводят 0,85 % раствором хлорида нат Унифицированный метод определения про рия до концентрации 0,01 % и добавляют каолин тромбинового времени плазмы (1974). Пр ин (белая глина — А1 Оз-SiO -2H2O;

Курский хи 2 цип. Определяют время свертывания плазмы мико-фармацевтический завод) из расчета 5 мг при добавлении тромбопластина и хлорида каль на 1 мл эмульсии.

ция.

Об о р у д о в а ние. 1. Водяная баня на Ре а к т ив ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат 37 °С. 2. Секундомеры.

рия или 1,34 % раствор оксалата натрия Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.

(см. 4.1). 2. 0,025 моль/л раствор хлорида каль Бестромбоцитарная плазма.

ция (см. 4.4.2). 3. 1 % суспензия тромбопласти Ход о п р е д е л е н и я. В пробирку вводят на. При недостаточно активном тромбопластине 0,1 мл исследуемой плазмы и 0,1 мл каолин (удлиненное протромбиновое время плазмы кро эритрофосфатидной смеси, перемешивают со ви донора) используют 2 % суспензию.

держимое и ставят пробирку в водяную баню.

Об о р у д о в а ние. 1. Водяная баня на Через 5 мин в пробирку добавляют 0,1 мл пред 37 °С. 2. Секундомеры.

варительно прогретого при 37 °С раствора хло Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.

рида кальция и немедленно включают секундо Бестромбоцитарная плазма.

мер. Вынимая пробирку из бани каждые 1—2 с Ход о п р е д е л е н и я. В пробирку нали и слегка наклоняя ее, отмечают время образо вают 0,1 мл плазмы донора и 0,1 мл раствора вания сгустка. Исследование повторяют и вы тромбопластина и ставят пробирку в водяную числяют средний результат.

баню. Через 1 мин туда же добавляют 0,1 мл Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы: 38—55 с.

раствора хлорида кальция, немедленно вклю Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Удлинение чают секундомер и отмечают время образования АЧТВ наблюдается при врожденной недоста сгустка. Исследование повторяют и вычисляют точности факторов свертывания крови (за ис средний результат. Точно так же определяют ключением факторов VII и XIII), наличии в кро время свертывания исследуемой плазмы.

ви ингибиторов свертывания (в частности, при Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы: 12—20 с лечении гепарином), диссеминированном внут (в зависимости от активности тромбопластина).

рисосудистом свертывании крови и фибрино Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Удлинение лизе. Укорочение АЧТВ указывает на гиперкоа протромбинового времени наблюдается при гуляцию и рассматривается как фактор риска врожденной или приобретенной недостаточности тромбозов.

факторов, отражающих функционирование Пр и м е ч а н и я. 1. Вместо эритрофосфа- внешнего механизма образования протромби тида можно использовать кефалин. 2. На назы, ее действие на протромбин и последующее основе определения АЧТВ разработаны кор- образование фибрина (факторов X, VII, V, II, I).

рекционные пробы на выявление недостаточ- Обычно оно отмечается у больных, принимаю ности факторов свертывания крови XII, XI, щих оральные антикоагулянты (неодикумарин, IX и VIII, а также циркулирующих ингиби- фенилин, синкумар, омефин), при тяжелых по торов и методы количественного определе- ражениях паренхимы печени и недостаточности ния факторов свертывания XII, XI, IX и VIII.

витамина К (механическая желтуха, нарушения 3. Определение АЧТВ является распро- всасывания в кишечнике, кишечный дисбакте страненным способом контроля за лечением риоз). Терапия непрямыми антикоагулянтами гепарином. считается адекватной, если протромбиновое вре мя увеличивается примерно в 2 раза.

Ли т е р а т у р а. Балуда В. П., Барка гаи 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные Пр и м е ч а н и я. 1. Нередко применяется методы исследования системы гемостаза.— вариант, отличающийся тем, что растворы тромбопластина и хлорида кальция предвари- немедленно выдувают содержимое в пробирку тельно смешивают в соотношении 1 : 1 и к и перемешивают кровь с антикоагулянтом. Точ 0,1 мл плазмы добавляют 0,2 мл тромбопла- но так же набирают цитратную кровь еще в две стин-кальциевой смеси. 2. При лечении ора- пробирки. Каждую пробирку устанавливают по льными антикоагулянтами уменьшается ак- следовательно в водяную баню и через 1 мин тивность не только факторов X, VII и II, добавляют 0,1 мл суспензии тромбопластина и отражающаяся на протромбиновом времени, 0,1 мл раствора хлорида кальция. В момент до но и фактора IX, недостаточность ко- бавления последнего реактива включают секун торого не влияет на протромбиновое домер и отмечают время образования сгустка.

время. В связи с этим контроль за Вычисляют средний результат. Точно так же лечением антивитаминами К осуществляется берут цитратную кровь у обследуемого лица и путем сочетанного определения протромби- определяют ее протромбиновое время.

нового времени и АЧТВ (см. 4.4.3), чувстви- Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы примерно тельного к дефициту фактора IX. 3. Часто ре- те же, колеблются в зависимости от активности зультаты исследования выдают в виде про- тромбопластина.

тромбинового индекса, который представляет Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е то же.

собой выраженное в процентах отношение Ли т е р а т у р а. Балуда В. П., Бар протромбинового времени нормальной плаз- каган 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лаборатор мы к протромбиновому времени исследуемой ные методы исследования системы гемостаза.— плазмы. У здоровых людей он колеблется Томск, 1980, с. 169—170.

в пределах 95—105 %. Уменьшение протром бинового индекса имеет такое же значение, 4.4.5. Время свертывания плазмы как удлинение протромбинового времени.

при активации фактора X Унифицированный метод определения про тромбинового времени разведенной плазмы Относящиеся к этой группе пробы можно (1974). Пр и н ц и п тот же. представить как еще две важные модификации Р е а к т и в ы те же и дополнительно 0,85 % определения времени рекальцификации. В од раствор хлорида натрия. ном случае к плазме перед рекальцификацией Об о р у д о в а н и е то же. добавляют только активатор фактора X, а в Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я. другом — активатор фактора X и заменитель Бестромбоцитарная исследуемая и донорская тромбоцитарного тромбопластина. Таким обра плазма. зом, в одном случае обеспечивается стандарт Ход о п р е д е л е н и я. Донорскую плазму ная активация только фактора X, а в другом — разводят 0,85 % раствором хлорида натрия в стандартная активация фактора X и стандарт соотношении 1 : 1. В пробирку набирают 0,2 мл ная фосфолипидная активация. В качестве ак раствора хлорида кальция, добавляют 0,1 мл тиватора фактора X используют яд гадюки Рас суспензии тромбопластина и ставят в водяную села (препарат стипвен) или яд отечественной баню. Через 30 с вводят туда же 0,1 мл разве- гюрзы (препарат лебетокс), а в качестве заме денной плазмы, немедленно включают секундо- нителя тромбоцитарного тромбопластина — мер и отмечают время образования сгустка. эритрофосфатид или кефалин. Сопоставление Исследование повторяют и берут средний ре- результатов этих проб между собой и с резуль зультат. Точно так же определяют протромбино- татами определения протромбинового времени вое время исследуемой плазмы. позволяет дифференцировать недостаточность Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы примерно фактора 3 тромбоцитов и дефицит плазменных те же, колеблются в зависимости от активности факторов VII и X. На основе лебетокс-эритро тромбопластина. фосфатидного (стипвен-кефалинового) времени Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е то же. разработан количественный метод определения Унифицированный метод определения про- активности фактора X.

тромбинового времени капиллярной крови Метод определения лебетокс-времени (стип (1974). Пр и н ц и п. Определяют время свер- вен-времени). Пр и н ц и п. Исследуется время тывания цитратной капиллярной крови при до- рекальцификации тромбоцитарной плазмы в ус бавлении суспензии тромбопластина и раствора ловиях стандартной активации фактора X.

хлорида кальция. Ре а к т и в ы. 1. 3,8% раствор цитрата Ре а к т ив ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат- натрия (см. 4.1). 2. 0,025 моль/л раствор хло рия (см. 4.1). 2. 0,5 % раствор хлорида каль- рида кальция (см. 4.4.2). 3. Раствор лебетокса ция. 3. 1 % или 2 % суспензия тромбопластина. или стипвена («Стаго», Франция, и др.) с актив Об о р у д о в а н и е. 1. Водяная баня на ностью 15—20 с, т. е. в условиях опыта, опи 37 °С. 2. Секундомеры. 3. Скарификаторы. 4. сываемых ниже, нормальная плазма должна Микропипетки вместимостью 0,1 мл. свернуться за 15—20 с. 4. 0,85 % раствор хло Ма т е р и а л дл я и с с л е д о в а н и я. рида натрия или буфер Михаэлиса рН 7, Цитратная исследуемая и донорская кровь. (см. 4.3.5).

Ход о п р е д е л е н и я. В микропипетку Об о р у д о в а н и е. 1. Водяная баня на набирают 0,02 мл раствора цитрата натрия. 37 °С. 2. Секундомеры.

Мякоть пальца донора протирают спиртом и Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

после его высыхания делают прокол стериль- Тромбоцитарная плазма.

ным скарификатором. Набирают в ту же микро- Ход о п р е д е л е н и я. В одну пробирку пипетку 0,08 мл свободно выступающей крови, наливают 0,1 мл исследуемой плазмы и 0,1 мл 0,85 % раствора хлорида натрия (буфера Ми- участия других факторов свертывания крови.

хаэлиса), а в другую — 0,1—0,15 мл рабочего Рептилаза в отличие от тромбина отщепляет от раствора лебетокса или стипвена и 0,1—0,15 мл молекулы фибриногена только 2 фибринопеп раствора хлорида кальция. Обе пробирки поме- тида А (тромбин высвобождает дополнительно щают в водяную баню. Через 1—2 мин из про- 2 фибринопептида В), не активирует фактор XIII бирки, содержащей смесь растворов лебетокса и и не инактивируется комплексом гепарин — анти хлорида кальция, 0,2 мл переносят в пробирку тромбин III. Обе пробы позволяют оценить ко с исследуемой плазмой. В момент добавления нечный этап свертывания крови, поскольку ре смеси включают секундомер и отмечают время зультаты зависят лишь от концентрации фибри образования сгустка. Исследование повторяют и ногена, его свойств (структуры) и наличия в вычисляют средний результат. крови ингибиторов тромбина. Важно отметить, Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 15—20 с. что гепарин не влияет на рептилазовое время, К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Удлинение поэтому гипергепаринемию легко распознать по лебетокс (стипвен)-времени наблюдается при удлинению тромбинового времени в сочетании врожденной недостаточности факторов X, V, II с нормальным рептилазовым временем. Продук и I, тяжелых поражениях паренхимы печени, ты деградации фибрина, угнетающие действие механической желтухе, нарушениях всасывания тромбина на фибриноген и замедляющие поли в кишечнике, лечении антивитаминами К, тром- меризацию фибрин-мономера, удлиняют как боцитопениях, тромбоцитопатии с недостаточ- тромбиновое, так и рептилазовое время.

ностью фактора 3 тромбоцитов, диссемини- Метод определения тромбинового времени.

рованном внутрисосудистом свертывании крови Пр и н ц и п. Определяется свертывание плаз и остром фибринолизе. Нормальное лебетокс мы при добавлении раствора тромбина со стан (стипвен)-время в сочетании с удлинением про- дартной активностью.

тромбинового времени указывает на недостаточ- Ре а к т ив ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат ность фактора VII. рия (см. 4.1). 2. Буфер Михаэлиса рН 7, Метод определения лебетокс-эритрофосфа- (см. 4.3.5). 3. Свежеприготовленный раствор тидного (лебетокс-кефалинового, стипвен-кефа- тромбина с активностью 15—18 с. Обычно 1—3 мг линового) времени. Пр и н ц и п. Исследуется сухого тромбина с помощью стеклянной палочки время рекальцификации бестромбоцитарной растворяют в 1 мл буфера Михаэлиса и полу плазмы в условиях стандартной активации фак- чают раствор, вызывающий свертывание рав тора X и стандартной фосфолипидной акти- ного объема (0,1—0,2 мл) 0,1 % раствора фиб вации. риногена или адсорбированной нормальной Р е а к т и в ы те же и еще эритрофосфатид плазмы (см. 4.4.10), разведенной в 2—2,5 раза (кефалин) с активностью 60—70 с. Рабочая буфером Михаэлиса, за 5—7 с. Непосредственно его концентрация 0,01 % (см. 4.4.3). перед работой этот раствор разводят буфером Об о р у д о в а н и е то же. Михаэлиса так, чтобы он вызвал свертывание Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я. равных объемов вышеупомянутых субстратов за Бестромбоцитная плазма. 15—18 с, и ставят в ледяную баню. Все растворы Ход о п р е д е л е н и я отличается от тромбина готовят и хранят в силиконированных предыдущего только тем, что вместо изотони- пробирках. 4. 0,1 % раствор бычьего фибрино ческого раствора хлорида натрия к плазме до- гена. Готовят на 0,85 % растворе хлорида нат бавляют эмульсию эритрофосфатида. рия или буфере Михаэлиса. При взвешивании сухого фибриногена учитывают весовое соотно Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 15—20 с.

шение свертываемого белка и буферных солей, Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е такое же, за исключением того, что недостаточность фак- указываемое в сопроводительной инструкции к тора 3 тромбоцитов не влияет на это время. Уд- препарату. Если, например, известно, что в пре линение лебетокс-времени в сочетании с нор- парате фибриногена на 1 г свертываемого белка мальным лебетокс-эритрофосфатидным време- приходится 2 г буферных солей, то в 100 мл нем свидетельствует о дефиците фактора 3 тром- изотонического раствора хлорида натрия раст воряют не 100 мг препарата, а 300 мг.

боцитов.

Об о р у д о в а ние. Водяная баня на Ли т е р а т у р а. Баркаган 3. С. Исследо 37 °С. Секундомеры.

вания системы гемостаза в клинике (методиче Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

ские указания).— Барнаул, 1975, с. 132—133;

Тромбоцитная или бестромбоцитная Caen J., Larrieu М. 1., Samama M. L'hemostase.

плазма.

Methodes d'exploration et diagnostic pratique.— Ход о п р е д е л е н и я. В пробирку нали Paris, 1968, p. 136—137.

вают 0,2 мл плазмы и ставят в водяную баню.

Через 1 мин добавляют 0,2 мл раствора тромби на, немедленно включают секундомер и отме 4.4.6. Время свертывания плазмы чают время свертывания плазмы. Опыт повто при прямой стимуляции превращения ряют и берут средний результат.

фибриногена в фибрин (тромбиновое Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы: 15—18 с.

и рептилазовое время) Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Удлинение тромбинового времени наблюдается при врож Методы основаны на способности тромбина денной недостаточности фибриногена (афиб и рептилазы (фермента змеиного яда) индуци- риногенемия, гипофибриногенемия, дисфибри ровать превращение фибриногена в фибрин без ногенемия), диссеминированном внутрисосуди стом свертывании крови, остром фибринолизе, Оборудование. Тромбоэластограф (ге тяжелых поражениях паренхимы печени и на- мокоагулограф, гемокоагулометр).

личии в крови ингибиторов тромбина. Опре- Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.

деление тромбинового времени является одним Цельная нестабилизированная кровь (в этом из распространенных методов контроля за лече- случае реактивы не требуются), цитратная нием гепарином и фибринолитиками. кровь, цитратная плазма.

Ход о п р е д е л е н и я соответствует ин Ли т е р а т у р а. Андреенко Г. В., Караба струкции (в зависимости от типа тромбоэластог сова М. А., Лютова Л. В. и др. Методы исследо рафа).

вания фибринолитической системы крови. М.:

Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Устанав Изд-во Московск. ун-та, 1981, с. 43;

Балу ливаются эмпирически для каждого прибора.

да В. П., Баркаган 3. С., Гольдберг Е. Д. и др.

К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. С по Лабораторные методы исследования системы мощью тромбоэластографа (гемокоагулографа) гемостаза.—Томск, 1980, с. 185—186, 300—301.

могут быть выявлены и количественно оценены Метод определения рептилазового времени. хронометрическая и/или структурная гипокоа П р и н ц и п. Исследуется время свертывания гуляция (замедленное свертывание и/или об плазмы при добавлении раствора рептила?,ы со разование недостаточно упругого сгустка кро стандартной активностью. ви), хронометрическая и/или структурная ги Ре а к т и в ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат- перкоагуляция (ускоренное свертывание и/или рия (см. 4.1). 2. Раствор рептилазы с актив- образование чрезмерно упругого сгустка крови), ностью 15—17 с («Стаго», Франция;

«Пента- гипоретракция и гиперретракция сгустка крови фарм», Швейцария и др.). (пониженное или повышенное напряжение рет Об о р у д о в а н и е. 1. Водяная баня на рактильных сил), а также гипофибринолиз и 37 °С. 2. Секундомеры. гинерфибринолиз (замедленное или ускоренное Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я. уменьшение упругости образовавшегося сгустка Тромбоцитная или бестромбоцитная достижения максимальных значений).

плазма.

Ход о п р е д е л е н и я. В пробирку наби- Пр и м е ч а н и е. Наряду с традицион рают 0,2 мл исследуемой плазмы и ставят в во- ным способом расшифровки тромбоэласто дяную баню. Через 1 мин добавляют 0,1 мл граммы (гемокоагулограммы), описываемым раствора рептилазы, немедленно включают се- в инструкции к прибору и основанным на кундомер и отмечают время появления сгустка.

анализе ряда графических параметров с точ Определение повторяют и вычисляют средний ки зрения их длительности или амплитуды, результат.

разработан и внедрен способ, базирующийся Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 15 — 17 с.

на оценке физической и биологической сущ К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Рептила ности явлений, регистрируемых на тромбо зовое время удлиняется при врожденной недо эластограмме (гемокоагулограмме). Этот статочности фибриногена (афибриногенемия, способ позволяет оценивать ряд параметров гипофибриногенемия, дисфибриногеиемия), дис- сгустка в конкретных физических единицах семинированном внутрисосудистом свертывании, (напряжение ретрактильных сил, плотность фибринолизе, тяжелых поражениях паренхимы сгустка, структурная вязкость сгустка и др.).

печени и наличии в крови некоторых ингибито ров свертывания. При гипергепаринемии репти Ли т е р а т у р а. Балуда В. П., Барка лазовое время не изменяется.

ган 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза.— Пр и м е ч а н и е. Действие, подобное реп Томск, 1980, с. 222—230;

Якунин Г. А. Современ тилазе, оказывает яд ямкоголовои змеи, средне ные методы анализа громбодинамограммы (ме азиатского щитомордника. Тест с этим ялом тодическое пособие). Ч. 1.- М., 1973.

проводят так же, как и пробу с рептилнзой.

Ли т е р а т у р а. Балуда В. П., Барка ган 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные 4.4.8. Электрокоагулография методы исследования системы гемостаза.- Томск, 1980, с. 186—189.

Пр и н ц и п. С помощью прибора электро коагулографа регистрируются начало свертыва ния и изменения электрического сопротивления 4.4.7. Тромбоэластография сгустка крови во времени. Метод позволяет определять образование, ретракцию и лизис Пр и н ц и п. С помощью прибора тромбо- сгустка крови.

эластографа (гемокоагулографа, гемокоагуло- Р е а к т и в ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат метра) регистрируют начало свертывания и из- рия (см. 4.1). 2. Раствор хлорида кальция (кон менения упругости сгустка крови во времени. центрация указывается в инструкции к при Метод позволяет определять образование, рет- бору).

ракцию и лизис (растворение) сгустка крови. Оборудование. Коагулограф Н-334.

Р е а к т и в ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат- Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

рия (см. 4.1). 2. Раствор хлорида кальция (кон- Цельная нестабилизированная кровь (в этом центрация указывается в инструкции к при- случае реактивы не требуются), цитратная бору). кровь, цитратная плазма.

6 п/р В. В. "Меньшикова Рис. 7. Аутокоагулограмма и ее параметры. На оси ординат — свертывающая активность гемо лизат-кальциевой смеси (ГКС) в процентах;

на оси абсцисс —- время инкубации ГКС в минутах.

А — свертывающая активность гемолизат-калышевой смеси (ГКС) на 2-й минуте инкубации;

МА — макси мальная свертывающая активность ГКС;

T1 — время достижения '/2 максимальной свертывающей актив ности ГКС;

Т2 — время достижения максимальной свертывающей активности ГКС;

Т — время от начала инкубации ГКС до момента, когда ее свертывающая активность в процессе снижения вновь достигает '/ максимальной свертывающей активности.

Ход о п р е д е л е н и я соответствует ин- зультаты регистрируются при дефиците факто ров XII, XI, X, IX, VIII, II и I, а также при из струкции.

Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Устанав- бытке быстро и медленно действующих анти тромбинов. Метод применяется главным обра ливаются эмпирически для каждого прибора.

К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. С по- зом в научных исследованиях.

мощью электрокоагулографа (коагулографа) Ли т е р а т у р а. Баркаган 3. С. Исследова могут быть выявлены и количественно оценены ние системы гемостаза в клинике (методические хронометрическая и/или структурная гипокоагу указания).—Барнаул, 1975, с. 83—87;

Сятков ляция (замедленное свертывание и/или образо ский В. А., Василенко Л. П., Применение ауто вание сгустка с недостаточно высоким электри коагуляционного теста в клинических лабора ческим сопротивлением), хронометрическая и/ торных исследованиях.— Лаб. дело, 1981, № или структурная гиперкоагуляция (ускоренное с. 459—462.

свертывание и/или образование сгустка с чрез мерно высоким электрическим сопротивлением), а также гипофибринолиз и гиперфибринолиз (замедленное или ускоренное уменьшение элект 4.4.10. Тест генерации тромбопластнна рического сопротивления образовавшегося сгуст ка крови после достижения максимальных зна Тест Биггс — Дугласа (модифицированный).

чений).

Пр и н ц и п. Определяется активность тромбо Лит е ра т у ра. Ватмахер У. А., Толстопя- пластина, образующегося в смеси ингредиентов, това И. А., Пьянкова Т. И. Коагулограф — но- приготовленных из исследуемой крови, и кор вый портативный прибор для исследования рекция выявленных нарушений аналогичными системы свертывания крови.— Лаб. дело, 1969, ингредиентами нормальной крови. При нормаль № 8, с. 496—499. ном содержании в крови факторов V и X, что устанавливается путем дополнительного опре деления протромбинового времени, этот тест 4.4.9. Аутокоагуляционный тест позволяет выявлять и дифференцировать недо статочность плазменных факторов VIII, IX и Исследуется динамика нарастания и после- XI + ХП, а также фактора 3 тромбоцитов.

дующего снижения тромбопластин-тромбино- Ре а к т ив ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат вой активности в испытуемой плазме при ее рия (см. 4.1). 2. 0,025 моль/л раствор хлорида рекальцификации в присутствии гемолизата эрит- кальция (см. 4.4.2). 3. 0,85 % раствор хлорида роцитов обследуемого (рис. 7). Аномальные ре- натрия. 4. Нитратная нормальная пул-плазма, субстратная. Смесь равных количеств 5—10 об- ка больного + суспензия тромбоцитов здоро разцов бестромбоцитной плазмы здоровых лю- вого;

4-й ряд (тромбоцитарный) — адсорбиро дей (готовят заранее и хранят небольшими ванная плазма здорового + сыворотка здоро порциями при —20 °С). 5. Плазменный компо- вого + суспензия тромбоцитов больного;

5-й нент здорового человека. Смешивают 3 г геля ряд (контрольный) — адсорбированная плазма гидроокиси алюминия фабричного производства здорового + сыворотка здорового + суспензия с 4 мл дистиллированной воды, а затем разводят тромбоцитов здорового.

буфером (см. 4.3.5) в соотношении 1 : 4 (разве- Т е с т и р о в а н и е всех рядов проводят дение в 5 раз). После этого к 4,5 мл цитратной одинаково, начиная с контрольного ряда. В 5— нормальной бестромбоцитной плазмы добав- 6 пробирок разливают по 0,1 мл раствора хло ляют 0,5 мл приготовленной суспензии гидро- рида кальция и устанавливают пробирки в во окиси алюминия, ставят смесь в водяную баню дяную баню. Ставят туда же пробирку с 0,6— при 37 °С и помешивают стеклянной палочкой 0,8 мл субстратной плазмы (пул-плазмы). В но в течение 3 мин. Далее смесь центрифугируют вую пробирку набирают 0,2 мл адсорбированной при 3000 об/мин в течение 5—10 мин, отсасы- нормальной плазмы, 0,2 мл нормальной сыво вают адсорбированную плазму (протромбиновое ротки и 0,2 мл нормальной суспензии тромбо время такой плазмы должно быть не менее цитов. Компоненты перемешивают, ставят про 2—2'/2 мин;

если оно короче, то процедуру ад- бирку в водяную баню, добавляют 0,2 мл раст сорбции повторяют), разливают небольшими вора хлорида кальция и немедленно включают порциями в пластиковые или стеклянные сили- секундомер. Через 2 мин 0,1 мл смеси переносят коновые пробирки, укупоривают и заморажи- в одну из пробирок, содержащую 0,1 мл раст вора хлорида кальция, и вводят туда же 0,1 мл вают при —20 °С. В адсорбированной плазме сохраняются факторы I, V, VIII, XI и XII, но прогретой субстратной плазмы. В момент добав отсутствуют факторы II, VII, IX и X. Адсорби- ления субстратной плазмы включают второй рованную плазму (алюминиевую) перед работой секундомер и отмечают время образования размораживают и разводят 0,85 % раствором сгустка. Исследование повторяют через 4;

6;

хлорида натрия в соотношении 1 : 4 (разведение 8;

10 и 12 мин инкубации смеси (результат обыч в 5 раз). 6. Сывороточный компонент здорового но регистрируется на 4-й и 6-й минуте). Подоб человека. Готовят заранее сыворотку крови здо- ным образом исследуют и все остальные ряды.

Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы. Наиболее рового человека (см. 4.1), расфасовывают ее по короткое время варьирует в пределах 7—11 с 1—2 мл и замораживают при — 20 °С. В ней и регистрируется на 4-й или 6-й минуте инку сохраняются факторы VII, IX, X, XI и XII, но бации.

отсутствуют факторы II, V и VIII. Перед работой Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Возмож нормальную сыворотку размораживают и раз ные результаты теста в зависимости от недоста водят 0,85 % раствором хлорида натрия в соот точности охватываемых им факторов (включая ношении 1 : 9 (разведение в 10 раз). 7. Тромбо формы, обусловленные появлением ингибиторов цитарный компонент здорового человека. Оса факторов) представлены в табл. 37.

док тромбоцитов, получаемый после центрифу гирования 5—6 мл тромбоцитной плазмы при Та б л и ц а 37. Результаты теста генерации 4 °С в течение 15—20 мин при 3000— тромбопластина при различных нарушениях об/мин и отсасывания бестромбоцитной плазмы, свертывания крови заливают 5—6 мл охлажденного (4 °С) 0,85 % раствора хлорида натрия, взбалтывают и цент Показания теста при различных наруше рифугируют на холоде при том же режиме. Над ниях свертывания крови осадочную жидкость отбрасывают, еще дважды повторяют процедуру отмывания тромбоцитов, дефицит факторов сле а затем к осадку тромбоцитов добавляют 0,85 % ингибито дуе раствор хлорида натрия в объеме, равном объ фактор ры факто мые ему взятой тромбоцитной плазмы, и с помощью 3 тром- ров свер ряды VIII IX XI + XII боци- тывания стеклянной палочки готовят суспензию тромбо тов цитов.

Об о р у д о в а ние. 1. Водяная баня на 37 °С. 2. Секундомеры. 1-й Нару- Нор- Нор- Нор- Наруше Ма т е р иа л для и с с л е д о в а ни я. шение ма ма ма ние 2-й Нор- Нару- » » » Плазменный, сывороточный и тромбоцитарный ма шение компоненты обследуемого (готовят так же, как 3-й Нару- » Наруше- » » соответствующие компоненты здорового чело шение ние века).

4-й Нор- Нор- Норма Нару- Норма Ход о пр е д е л е ния. Составляют сле ма ма шение дующие 5 рядов смесей: 1-й ряд (плазмен ный) — адсорбированная плазма больного + + сыворотка здорового + суспензия тромбо цитов здорового;

2-й ряд (сывороточный) — Пр и м е ч а н и е. Тест генерации тромбо адсорбированная плазма здорового + сыво- пластина чувствительнее к нарушениям ротка больного + суспензия тромбоцитов здо- тромбопластинообразования, чем АЧТВ (см.

рового;

3-й ряд (плазменно-сывороточный) — 4.4.3) и основанные на его определении кор адсорбированная плазма больного + сыворот- рекционные пробы, но и он выявляет лишь значительный дефицит факторов VIII, IX, 4.4.11. Одностадийное XI + XI I и фактора 3 тромбоцитов. При определение факторов VIII, IX, XI и XII легких формах недостаточности факторов свертывания крови решающее значение мо- Методы основаны на определении АЧТВ жет иметь их количественное определение (см. 4.4.3) разведенной исследуемой плазмы при с применением специфических «дефицитных» компенсации возможного дефицита всех фак плазм. Принимая во внимание частоту раз- торов, влияющих на этот показатель, кроме личных форм гемофилии, количественное оп- определяемого. В качестве примера описывается ределение факторов свертывания крови сле- определение активности фактора VIII (антиге дует проводить, начиная с фактора VI I I, мофильного глобулина, антигемофильного фак а затем факторов IX, XI и XII. Вопрос о тора А), поскольку дефицит этого фактора (ге количественном определении фактора X ре- мофилия А) является наиболее частой формой шаегся в зависимости от результатов опреде- наследственной коагулопатии.

ления протромбинового и лебетокс-времени Унифицированный метод определения актив (стипвен-времени) (см. 4.4.4 и 4.4.5). ности фактора VIII (1974). Пр и н ц и п. Оп ределяется АЧТВ (см. 4.4.3) исследуемой раз Ли т е р а т у р а. Балуда В. П., Барка веденной плазмы при компенсации субстратной гаи 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные плазмой возможного дефицита всех факторов, методы исследования системы гемостаза.— кроме фактора VIII.

Томск, 1980, с. 146—152.

Ре а к т и в ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат С п е ц и ф и ч е с к и е ме т о д ы ис с л е - рия (см. 4. 1). 2. 0,9% (0,85%) раствор хло д о в а н и я к о а г у л я ц и о н н о г о г емо- рида натрия. 3. Барбиталово-солевой буфер с т а з а. К числу специфических относят мето- рН 7,5: хлорид натрия — 7,3 г, диэтилбарбиту ды, характеризующие концентрацию и/или ак- ровая кислота — 2,76 г, диэтилбарбитуровокис тивность отдельных факторов свертывания кро- лый натрий — 2,06 г, бидистиллированная во ви, их ингибиторов и дериватов фибриногена.

да — до 1 л. 4. 2 % раствор двузамещенного В клинической практике эти методы применяются цитрата натрия. Растворяют 2 г двузамещенного реже (исключение составляют методы опреде- цитрата натрия в 100 мл дистиллированной воды.

ления фибриногена, некоторых его производ- 5. Взвесь каолина в эмульсии эритрофосфатида ных и фибринстабилизирующего фактора), по- (см. 4.4.3). 6. 0,033 моль/л (0,366%) раствор хло скольку для этого необходимы моноспецифиче- рида кальция. Растворяют 366 мг высушенного ские антисыворотки (для определения концен- до постоянной массы хлорида кальция в 100 мл трации специфического антигена) или плазмы дистиллированной воды или разводят 5 % раст с изолированной недостаточностью известных вор хлорида кальция (см. 4.4.2) в 13,66 раза факторов (для определения специфической коа- дистиллированной водой. 7. Цитратная нормаль гуляционной активности).

ная бестромбоцитарная пул-плазма (см. 4.4.10).

В последние годы для определения актив- Отличие заключается лишь в том, что нитратную ности отдельных факторов свертывания кропи, кровь здоровых людей центрифугируют в рефри антикоагулянтов и компонентов фибринолити- жераторной центрифуге (4°С). 8. Субстратная ческой системы начинают применять также плазма. Получают из крови больного тяжелой амидолитические методы, основанные на исполь- формой гемофилии А;

содержание фактора VIII зовании относительно специфических пептидных колеблется в пределах 1—3 %. Критерием при субстратов. Эти субстраты представляют собой годности плазмы является время ее свертывания синтетические три- или тетрапептиды, имити- в описываемых ниже условиях опыта. Оно долж рующие структуры естественных субстратов не- но быть в пределах 120—135 с. Кровь стабили которых факторов свертывания крови и плаз зируют 2 % раствором двузамещенного цитрата мина, к которым посредством амидной связи натрия в соотношении 4 : 1, центрифугируют при присоединяется индикаторное вещество, хромо- 4 °С в течение 20 мин при 2500 об/мин, отсасы ген или флюороген. Под действием соответст- вают надосадочную жидкость и подвергают ее вующих факторов индикаторное соединение от- повторному центрифугированию при тех же ус щепляется от пептида и изменяет окраску или ловиях. Бестромбоцитарную плазму отсасы флюоресценцию исследуемого образца пропор- вают, разливают по 3—4 мл в пенициллиновые ционально активности определяемого фактора.

флаконы, укупоривают их и хранят при —30 °С.

Ряд иностранных фирм выпускает субстраты и Субстратная плазма пригодна для определения целые наборы реактивов для амидолитического фактора VIII при хранении 2—3 мес.

определения плазменных факторов свертывания Об о р у д о в а н и е. 1. Рефрижераторная II, VIII, X и XII, тромбоцитарных факторов центрифуга. 2. Водяная баня на 37 °С. 3. Се 3 и 4, гепарина, антитромбина III и отдельных кундомеры.

компонентов фибринолитической системы (акти- Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

ватора плазминогена, плазминогена, плазмина, Бестромбоцитарная плазма, которую получают антиплазминов).

путем центрифугирования цитратной крови (см. 4.1) в рефрижераторной центрифуге при Ли т е р а т у р а. Бокарев И. //., Кузне- 4 °С. Во время работы взвесь каолина в эмуль цов В. А., Буторов В. Н., Семушин Б. В. сии эритрофосфатида, пул-плазму, исследуемую и субстратную плазмы сохраняют в ледяной Применение хромогенных пептидных субстратов в.лабораторной диагностике.— Лаб. дело, 1981, бане, а раствор хлорида кальция — в бане при № 8. с. 481 --485. 37 °С.

менного предшественника тромбопластина) Ход о п р е д е л е н и я. В пробирку вносят 0,1 мл взвеси каолина в эмульсии эритрофосфа- и фактора XII (фактора Хагемана, контакт тида, 0,1 мл субстратной плазмы и 0,1 мл раз- ного фактора).

веденной стандартной или исследуемой плазмы Наряду с коагуляционными (коагулологиче и ставят в водяную баню. Через 6 мин в пробирку скими) методами в литературе описаны иммуно добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция, логические и амидолитические (см. введение перемешивают содержимое и определяют время перед 4.4.11) методы определения факторов образования сгустка. Опыт повторяют еще свертывания, участвующих во внутреннем пути дважды и вычисляют средний результат.

образования протромбиназы.

Расчет концентрации (активности) фактора ведетсятю таблице или графику, которые состав ляются на основании данных, получаемых при исследовании различных разведений нормаль- 4.4.12. Одностадийное определение ной плазмы с известным содержанием (актив- фактора X (фактора Стюарта—Прауэра) ностью) фактора VI I I.

Начинают с исследования нормальной плаз- Метод Денсона. Пр и н ц и п. Определяется мы. Для этого ее разводят барбиталовым буфе лебетокс-эритрофосфатидное (лебетокс-кефали ром в соотношениях 1: 4, 1: 9, 1: 19, 1 : 39, новое, стипвен-кефалиновое) время свертыва 1 : 79, 1 : 159 и 1 : 319 (т. е. последовательно в 5;

ния исследуемой плазмы при компенсации воз 10;

20;

40;

80;

160 и 320 раз) и, как описано вы- можного дефицита всех факторов, участвующих ше, определяют время свертывания плазмы, раз- в реакции, кроме фактора X.

веденной в 10 раз. Если оно отличается от 65 с, Р е а к т и в ы те же, которые применяют то путем уменьшения или увеличения концентра- для определения лебетокс-эритрофосфатидного ции эмульсии эритрофосфатида добиваются то- времени (см. 4.4.5), и дополнительно субстрат го, чтобы оно стало равно 65 с. После этого опре- ная плазма — цитратная бестромбоцитарная деляют время свертывания во всех остальных раз- плазма больного с тяжелой недостаточностью ведениях плазмы и на основании полученных фактора свертывания X. Субстратная плазма данных строят в билогарифмическом масштабе может быть приготовлена и искусственно. Для кривую разведения, откладывая на вертикаль- этого венозную бычью кровь смешивают с реак ной оси время свертывания исследуемых образ- тивом Винтроба (получают растворением 1,2 г цов, а на горизонтальной оси — процент актив- оксалата аммония и 0,8 г оксалата калия в ногти фактора VI I I (за 100 % принимают актив- 100 мл дистиллированной воды) или 1,34 % ность фактора VIII в стандартной плазме, раз- раствором оксалата натрия в соотношении 9: 1.

веденной в 10 раз). Стабилизированную кровь центрифугируют 7 мин Затем определяют время свертывания иссле- при 1500 об/мин и 4 °С, собирают тромбоцитар дуемой плазмы, разведенной в 10 раз барбита- ную плазму и центрифугируют ее 30 мин при ловым буфером, и находят по кривой разведения 4500 об/мин и 4 "С. Полученную бедную тромбо соответствующую ему активность фактора VIII. цитами плазму с помощью воронки фильтруют Содержание фактора VIII можно рассчитать через два асбестовых фильтра: верхний, содер не только в процентах, но и в единицах актив- жащий 20 % асбеста, и нижний, содержащий ности. Для этого применяют формулу: 30 % асбеста (диаметр фильтров должен быть около 14 см). Фильтрацию ведут при комнат ной температуре со скоростью 1 капля в 1 с.

Одномоментно фильтруют 1 —1,5 л бычьей плазмы. Первые 200 мл профильтрованной плаз мы выбрасывают, остальной фильтрат собирают порциями по 50 мл. В каждой порции опреде ляют протромбиновое и лебетокс-эритрофосфа VI I I в процентах;

V— объем исследуемой тидное время. Те порции, в которых протромби плазмы.

новое время равно 120 с и более, а лебетокс За единицу активности фактора VIII при эритрофосфатидное — 80 с и более, пригодны нимают количество фактора VIII в плазме, со для употребления. В этой плазме отсутствуют держащей 100% активности фактора VI I I.

факторы VII и X. Отобранную профильтрован Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Уменьше ную плазму расфасовывают по 3 мл, укупори ние активности фактора VIII наблюдается при вают и хранят при —20—30 °С.

его врожденном дефиците или дефекте (гемо Об о р у д о в а н и е. I. Водяная баня на филия А), диссеминированном внутрисосуди 37 "С. 2. Секундомеры.

стом свертывании крови (вследствие «потреб Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

ления») и остром фибринолизе (вследствие рас Бестромбоцитарная плазма обследуемого и нор щепления). Повышение активности фактора мальная пул-плазма (см. 4.4.10).

VIII описано при предтромботических состоя Ход о п р е д е л е н и я. Исследование про ниях и эндотелиопатиях.

водят так же, как при определении лебетокс Пр и м е ч а н и е. Подобным образом с при- эритрофосфатидного времени (см. 4.4.5). Отличие менением соответствующих «дефицитных» заключается только в том, что нормальную пул плазм может быть определена активность плазму и исследуемую плазму перед работой фактора свертывания IX (антнгемофильного разводят буфером, а перед добавлением эритро глобулина В, фактора Кристмаса), XI (плаз- фосфатида смешивают с субстратной плазмой в соотношении ! : 1 (0,1 мл плазмы обследуе- фактор V, но отсутствуют факторы II, VII и X, мого или пул-плазмы +0,1 мл субстратной разливают небольшими (1—3 мл) порциями плазмы). Испытуемую плазму перед исследо- в пенициллиновые флаконы, укупоривают их ванием разводят буфером Михаэлиса в соотно- и хранят при —20 °С. 5. Нормальная челове шении 1 : 9, а нормальную пул-плазму — в со- ческая сыворотка. В пробирки, предварительно отношениях от 1 : 9 до 1 : 999 (в 10;

20;

40;

80;

промытые смесью 4 объемов изотонического 100;

200 и 1000 раз). По данным исследования раствора хлорида и 1 объема буфера Михаэлиса различных разведений нормальной пул-плазмы (рН 7,35), набирают по 3 мл венозной крови строят в билогарифмическом масштабе кривую здорового человека. Добавляют в каждую про зависимости лебетокс-эритрофосфатидного вре- бирку по 1 капле суспензии тканевого тромбо мени свертывания нормальной пул-плазмы от пластина (см. 4.4.4), разведенной в 10 раз буфе активности фактора X (за 100 % принимают ром Михаэлиса. После свертывания крови про активность пул-плазмы, разведенной буфером в бирки ставят на 4—6 ч при 37 °С, а затем остав 10 раз). По этой кривой находят активность ляют при комнатной температуре на 18—24 ч.

фактора X в исследуемой плазме, соответствую- Далее кровь центрифугируют при 3500 об/мин щую ее лебетокс-эритрофосфатидному времени. в течение 20 мин, отсасывают сыворотку и сме К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Уменьше- шивают ее с раствором Винтроба в соотношении ние активности фактора X наблюдается при его 5: 1. Смесь инкубируют 48 ч при 4 °С, а затем врожденной недостаточности (болезнь Стюар- разливают небольшими порциями в пеницилли та— Прауэра), тяжелых поражениях паренхимы новые флаконы, укупоривают их и хранят при печени, механической желтухе, нарушениях вса- — 20°С. В приготовленной таким образом сы сывания в кишечнике, лечении антивитамина- воротке сохраняются факторы VII и X, но от ми К, внутрисосудистом свертывании и фибри- сутствуют факторы II и V. 6. Буфер Михаэлиса нолизе. рН 7,35 (см. 4.3.5).

Об о р у д о в а н и е. 1. Водяная баня на Пр и м е ч а н и е. Для определения содер 37 °С. 2. Секундомеры.

жания (активности) фактора X разработаны Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

также иммунологические и простые амидоли Тромбоцитарная плазма.

тические методы (см. введение перед 4.4.11).

Ход о п р е д е л е ни я. Исследуемую Ли т е р а т у р а. Баркаган 3. С. Исследо- плазму разводят буфером Михаэлиса в соотно вание системы гемостаза в клинике (методи- шении 1 : 9;

0,1 мл разведенной плазмы перено ческие указания) — Барнаул, 1975, с. 134—136;

сят в другую пробирку, добавляют в нее 0,1 мл субстратного реактива, состоящего из смеси ад Caen I. Larrieu M. J., Samama M. L'hemostase.

сорбированной бычьей плазмы и нормальной Methodes d'exploration et diagnostic pratique.— сыворотки в соотношении 2: 1, и ставят про Paris, 1968, p. 127-129.

бирку в водяную баню. Через 1 мин в эту про бирку вносят 0,2 мл тромбопластин-кальциевой 4.4.13. Одностадийное определение смеси и отмечают время образования сгустка.

Исследование повторяют и вычисляют средний фактора II результат. Точно так же определяют время свер Метод Сулье—Ларье. Пр и н ц и п. Опре- тывания нормальной пул-плазмы, разведенной буфером Михаэлиса в 10;

20;

40;

80;

100;

деляется протромбиновое время свертывания разведенной исследуемой плазмы при компенса- и 1000 раз. Строят кривую разведения на било ции возможного дефицита всех факторов про- гарифмической бумаге, откладывая на верти кальной оси время свертывания пробы, а на тромбинового комплекса, кроме фактора II.

горизонтальной — содержание фактора II в раз Ре а к т ив ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат веденной нормальной пул-плазме (содержание рия (см. 4. 1). 2. 0,025 моль/л раствор хлорида фактора II в пул-плазме, разведенной в 10 раз, кальция (см. 4.4.2). 3. Тромбопластин-кальцие принимают за 100 %). Зная время образования вая смесь (см. 4.4.4). 4. Адсорбированная бычья сгустка в исследуемой разведенной плазме,уста плазма. Венозную бычью кровь смешивают с навливают по кривой содержание (активность) реактивом Винтроба (см. 4.4.12) в соотношении в ней фактора II (в процентах).

9 : 1 и центрифугируют при 4500—6000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант собирают и под- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Уменьше вергают повторному центрифугированию при ние активности фактора II отмечается при его 6000 об/мин в течение 30 мин. Полученную бед- врожденной недостаточности и тех же патологи ную тромбоцитами плазму переносят в другую ческих состояниях, при которых наблюдается пробирку и добавляют к ней чистый сульфат приобретенный дефицит фактора X (см. 4.4.12).

бария из расчета 10 г на 100 мл плазмы. Смесь Пр и м е ч а н и е. Активность фактора II постоянно взбалтывают при комнатной тем может быть оценена также хромогенными ме пературе в течение 20 мин, а затем центри тодами (см. введение перед 4.4.11).

фугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин.

Собирают надосадочный слой плазмы и опреде- Ли т е р а т у р а. Баркаган Э. С. Исследо вание системы гемостаза в клинике (методи ляют в нем протромбиновое время. Если оно ческие указания).— Барнаул, 1975, с. 125—127;

составляет менее 3 мин, процедуру адсорбции повторяют, добиваясь того, чтобы протромбино- Саеп 1., Larrieu M. J., Samama M. L hemostase.

вое время адсорбированной плазмы превышало Methodes d'exploration et diagnostic pratique.— 3 мин. Готовую плазму, в которой сохраняется Paris, 1968, p. 127—129.

4.4.14. Одностадийное определение Ре а к т и в ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат рия (см. 4. 1). 2. 0,025 моль/л раствор хлорида фактора V кальция (см. 4.4.2). 3. Буфер Михаэлиса рН 7, Метод Оврена. Пр и н ц и п. Определяется (см. 4.3.5). 4. Тромбопластин и тромбопластин протромбиновое время свертывания разведен- кальциевая смесь (см. 4.4.4). 5. Субстратная ной исследуемой плазмы при компенсации воз- плазма (цитратная бестромбоцитарная плазма можного дефицита всех факторов протромбино- больного с тяжелой недостаточностью фак вого комплекса, кроме фактора V. тора VII).

Р е а к т и в ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат- Об о р у д о в а ни е. 1. Водяная баня на рия (см. 4.1). 2. 0,025 моль/л раствор хлорида 37 °С. 2. Секундомеры.

кальция (см. 4.4.2). 3. Тромбопластин-кальцие- Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.

вая смесь (см. 4.4.4). 4. Буфер Михаэлиса Тромбоцитарная плазма.

рН 7,35 (см. 4.3.5). 5. Субстратная плазма: Ход о п р е д е л е н и я. Исследование про цитратная бестромбоцитарная плазма больного водят так же, как при определении активности с тяжелой недостаточностью фактора свертыва- фактора V.

ния V. Плазма, лишенная фактора V, может Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Уменьше быть приготовлена также искусственно. Для ние содержания (активности) фактора VII на этого венозную кровь здорового человека сме- блюдается при врожденном дефиците или моле шивают с реактивом Винтроба (см. 4.4.12) в кулярном дефекте фактора VII, приеме непря соотношении 9: 1, после чего центрифугируют мых антикоагулянтов, паренхиматозных пора 20 мин при 4500—6000 об/мин. Супернатант от- жениях печени и К-витаминной недостаточности сасывают, разливают в пробирки по 3—5 мл, (механическая желтуха, кишечный дисбакте герметично закрывают последние и инкубируют риоз).

при 37 °С в течение 18—36 ч, периодически Пр и ме ч а н и е. В качестве субстратной проверяя протромбиновое время плазмы. Инку плазмы можно использовать также профиль бацию прекращают, когда оно станет равным трованную через фильтр Зейтца нормальную 60 с и более. В такой плазме сохраняются фак плазму (см. 4.4.12). В ней отсутствуют фак торы II, VII и X, но отсутствует фактор V. При торы VII и X, поэтому с применением описан готовленную субстратную плазму разливают по ного принципа можно оценить суммарную ак 1—3 мл в пенициллиновые флаконы, укупори тивность факторов VII и X. После этого сле вают их и хранят при —20 °С.

дует определить лебетокс-время испытуемой Об о р у д о в а н и е. 1. Водяная баня плазмы и таким образом отдифференциро на 37 °С. 2. Секундомеры.

вать недостаточность фактора VII (лебетокс Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.

время нормальное) от недостаточности фак Тромбоцитная плазма.

тора X (лебетокс-время удлиненное).

Ход о п р е д е л е н и я. Исследование про водят так же, как при одностадийном определе- Ли т е р а т у р а. Баркаган 3. С. Исследо нии фактора II (см. 4.4.13), но вместо субстрат- вание системы гемостаза в клинике (методи ного реактива используют субстратную плазму, ческие указания).— Барнаул, 1975, с. 130—132, лишенную фактора V. Построение калибровоч- 135;

Caen J., Larrieu М. 1., Samama M. L'hemo ной кривой и определение по ней содержания stase. Methodes d'exploration et diagnostic pra фактора V в исследуемой плазме проводят так tique.—Paris, 1968, p. 125—127, 129.

же, как при определении фактора II.

Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Снижение уровня фактора V наблюдается при наследст- 4.4.16. Методы, венном дефиците фактора V, а также при ряде характеризующие концентрацию заболеваний, сопровождающихся нарушением (активность) антикоагулянтов его синтеза (болезни печени), повышенным по треблением (внутрисосудистое свертывание кро Наибольшее значение имеют методы опреде ви) или расщеплением (активация системы фиб ления циркулирующих антикоагулянтов (см.

ринолиза).

примечание 4.4.3) и антитромбинов. Из числа быстродействующих антитромбинов наиболее Ли т е р а т у р а. Баркаган 3. С. Исследо известными являются гепарин (точнее образую вание системы гемостаза в клинике (методи щийся при его введении комплекс гепарин — ан ческие указания).— Барнаул, 1975, с. 127—130;

титромбин III) и продукты деградации фибрин Саеп 1., Larrieu М. 1., Samama M. L'hemostase.

(оген)а, а из медленно действующих — анти Methodes d'exploration et diagnostic pratique.— тромбин III. Методы определения продуктов де Paris, 1968, p. 120—122, 129.

градации фибрина рассмотрены в подразделе 4.5, а методы определения антитромбина III 4.4.15. Одностадийное определение не приводятся, так как они очень трудоемкие фактора VII (коагулологические) или требуют применения иностранных реактивов (амидолитические, Метод Оврена. Пр и н ц и п. Определяется иммунологические).

протромбиновое время разведенной исследуемой Определение концентрации гепарина в плаз плазмы при компенсации возможного дефицита ме. Пр и н ц и п. Определяют минимальную всех факторов протромбинового комплекса, концентрацию протамина сульфата, необходи кроме фактора VII. мую для нейтрализации гепарина в исследуемой плазме. Найденную концентрацию переводят в практике нередко применяются и иммунологи единицы нейтрализованного гепарина. ческие методы, в частности при подозрении на Р е а к т и в ы. I. 3,8 % раствор цитрата нат- дисфибриногенемию. С практической точки зре рия или 1,34 % раствор оксалата натрия (см. ния зачастую важно определить не только кон 4.1). 2. I % раствор протамина сульфата. центрацию свертываемого тромбином фибрино 3. Раствор тромбина с активностью 15 с (см. гена, но и концентрацию ряда высокомолекуляр 4.4.6). 4. Имидазоловый буфер рН 7,4;

раство- ных производных фибриногена (растворимого ряют 1,36 г имидазола в 100 мл бидистиллиро- фибрина, растворимых комплексов фибрин ванной воды. В другую колбу вместимостью мономера), которые не трансформируются в 100 мл набирают 25 мл приготовленного раст- фибрин при добавлении тромбина. Для их обна вора имидазола, добавляют 13,6 мл 0,1 н. НС1 ружения и определения предложены «парако и доводят дистиллированной водой общий объем агуляционные пробы», а также методы, осно до 100 мл. ванные на применении принципов гель-фильтра Об о р у д о в а н и е. 1. Водяная баня на ции и гель-электрофореза. В клинике чаще 37 °С. 2. Секундомеры. всего используются «паракоагуляционные про Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я. бы», в частности этаноловая и протаминсуль Бестромбоцитная плазма. фатная.

Ход о п р е д е л е н и я. Из 1% раствора Унифицированный гравиметрический метод протамина сульфата готовят растворы с кон- определения фибриногена (1974). Рекомендуе центрациями протамина сульфата 100;

10;

5;

2,5 мый в настоящее время вариант с использова и 1,25 мкг/мл (путем соответствующего разве- нием тромбина. II р и н ц и п. Высушивается дения буфером). Набирают в 5 пустых пробирок и взвешивается сгусток, образующийся при до по 0,1 мл плазмы. В первую пробирку добавляют бавлении к определенному объему плазмы раст 0,1 мл 100 мкг/мл раствора протамина сульфата, вора тромбина стандартной активности.

во вторую 0,1 мл 10 мкг/мл раствора про Р е а к т и в ы. 1. 1,34% раствор оксалата тамина сульфата и т. д. Последовательно поме натрия или 3,8% раствор цитрата натрия (см.

щают пробирки в водяную баню на 1 мин и оп 4.1). 2. 0,85 % раствор хлорида натрия. 3. Раст ределяют время образования сгустков при до вор тромбина в 0,85 % растворе хлорида натрия бавлении 0,1 мл раствора тромбина. Устанавли с активностью 10 с (см. 4.4.6).

вают наиболее низкую концентрацию протамина Об о р у д о в а н и е. 1. Водяная баня сульфата, которая полностью нормализует тром на 37 °С. 2. Секундомеры.

биновое время. Активность гепарина в плазме Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.

рассчитывают, исходя из того, что 1 мг прота Бестромбоцитарная плазма.

мина сульфата нейтрализует 85 ЕД гепарин;

] Ход о п р е д е л е н и я. Набирают в про (международного стандарта).

бирку 1 мл плазмы, добавляют в нее 0,2 мл Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Прини раствора тромбина и немедленно опускают в мается, что в крови здоровых людей гепарина пробирку стеклянную палочку. Включают секун нет.

домер и ставят пробирку на водяную баню.

Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Устанав Образующийся фибрин наматывают на стеклян ливается уровень гепарина в крови при его вве ную палочку, которую вынимают через 10 мин дении в больших (лечебных) дозах.

инкубации (если сгусток не извлекается, то со П р и м е ч а н и е. С применением протамина держимое пробирки вытряхивают в чашку Пет сульфата может быть определена концентра ри). Сгусток переносят на беззольный фильтр, ция гепарина и в цельной крови.

высушивают и взвешивают на торсионных весах.

Ли т р а т у р а. Howie Е. ]. W., Thomp- Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 9—15 мг.

son 1. II., nidialicim P., Owen C. A. Mayo clinic При умножении массы сухого фибрина на пере laboratory manual of hemostasis.— W. B. Saun- водной коэффициент 25 получают значение кон il ers company, 1971, p. 123—125;

Caen 1., Lur- центрации фибриногена в мг% (г/л). Норма rieit M. 1., Samama M. L'hemostase. Methodes 200—400 мг% (2—4 г/л).

i l i oi i el diagnostic pratique. Pari s, Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Уменьше 1968, p. 202-203.

ние концентрации фибриногена наблюдается при его врожденной недостаточности (афибри 4.4.17. Методы, характеризующие ногенемия, гипофибриногенемия, некоторые дис конечный этап свертывания крови фибриногенемии), тяжелых заболеваниях пе (фибриноген и его производные, чени, диссемипированном внутрисосудистом активность фактора XI I I ) свертывании крови, остром фибринолизе. Увели чение концентрации фибриногена отмечается Определение фибриногена и его производ при инфекционных заболеваниях, хронических ных в плазме. Распространенные методы опре воспалительных процессах, злокачественных но деления фибриногена основаны на превраще вообразованиях, тромбозах и тромбоэмболиях, нии фибриногена плазмы в фибрин (посредством во время беременности, после травм, родов и рекальцификации, добавления тромбопластина операций.

и т. п.) с его последующим подсушива нием и навешиванием или растворением, окра- Ли т е р а т у р а. Балуда В. П., Барка шиванием и колориметрированием, а также на ган 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные осаждении фибриногена (путем высаливания методы исследования системы гемостаза.— или тепловой денатурации). В клинической Томск, 1980, с. 192.

Унифицированный колориметрический метод Р е а к т и в ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат определения фибриногена (1974). Пр и н ц и п. рия (см. 4.1). 2. 50% раствор этанола.

Путем добавления раствора тромбина фибрино- Об о р у д о в а н и е. Не требуется.

ген плазмы превращают в фибрин, затем его М а т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.

подвергают гидролизу и в гидролизате опреде-. Бестромбоцитарная плазма.

ляют концентрацию белка по биуретовой реак- Ход о п р е д е л е н и я. В пробирку вводят ции. 0,15 мл 50 % раствора этанола и 0,5 мл плазмы, Ре а к т и в ы. 1. 1,34% раствор оксалата пробирку встряхивают и помещают в штатив при натрия или 3,8 % раствор цитрата натрия (см. комнатной температуре. Если через 1 —10 мин в 4.1). 2. 0,85% раствор хлорида натрия. пробирке образуется гель, то проба считается 3. Раствор тромбина в 0,85 % растворе хлорида положительной («1»).

натрия с активностью 7—10 с (см. 4.4.6). Но р м а л ь н ы е п о к а з а т е л и. Помут 4. 1 н. раствор NaOH. 5. Биуретовый реактив: нение или появление небольшой зернистости к 1,5 г сульфата меди добавляют 6 г сегнетовой (отрицательный результат— «О»).

соли (КNaС Н О -4Н О) и 500 мл дистиллиро- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Положи 4 4 6 ванной воды. К этому раствору при постоянном тельная проба указывает на присутствие в плаз помешивании добавляют 300 мл 10 % раствора ме комплексов фибрин-мономера с продуктами NaOH и доводят дистиллированной водой общий расщепления фибриногена/фибрина и фибрино объем до 1 л. 6. Фибриноген бычий или челове- геном, что рассматривается как важный лабо ческий с известной концентрацией свертывае- раторный критерий диссеминированного внутри мого белка. сосудистого свертывания крови или массивного Об о р у д о в а н и е. 1. Водяная баня тромбоза, сопровождающихся активацией си на 37 "С. 2. Фотоэлектроколориметр. 3. Секундо- стемы фибринолиза. По сравнению с протамин метр. сульфатным тестом (см. далее) этот тест чувст Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я. вительнее к растворимым комплексам фибрин Бестромбоцитарная плазма. мономера.

Ход о п р е д е л е н и я. В2 пробирки (для параллельных определений) вводят по 0,2 мл Ли т е р а т у р а. Breen F. A., Tullis J. L.

плазмы, добавляют по 0,1 мл раствора тром- Ethanol gelation: a rapi d screening lest for in бина и ставят пробирки в водяную баню. Через travascul ar coagulation.— Ann. intern nied..

1 ч сгустки извлекают, трижды промывают ох- vol. 69, № 6, p. 1197—1206;

Ingram G. I. C..

лажденным 0,85 % раствором хлорида натрия и Brozovic M., Staler N. (i. P. Bleeding disorders высушивают на фильтровальной бумаге. Каж- i nvest i gat i on and management.- Bl ackwel l дый из сгустков помещают в пробирку с 1 мл sci enti fi c publ i cati on, 1982, p. 304.

раствора NaOH и ставят пробирки на 5 мин в кипящую воду. Пробы охлаждают до комнатной Протаминсульфатный тест. Пр и н ц и п.

температуры и добавляют в каждую пробирку Наблюдают за образованием геля в плазме по 1 мл биуретового реактива. Через 30 мин после добавления слабых растворов протамина пробы колориметрируют в кювете с длиной оп сульфата. Подобно 50 % раствору этанола они тического пути 10 мм при длине волны 500— вызывают высвобождение фибрин-мономера из 560 нм (зеленый светофильтр) против дистил его растворимых комплексов с последующей по лированной воды. Для определения количества лимеризацией, а также осаждение ранних про фибриногена в мг% (г/л) предварительно дуктов расщепления фибриногена/фибрина.

строят график соотношения между показаниями Ре а к т ив ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат ФЭКа и концентрациями фибриногена в раст рия (см. 4.1). 2. 0,85 % раствор хлорида нат иире. Для этого используют стандартные разве рия. 3. 1 % раствор протамина сульфата в 0,85 % дения чистого фибриногена (коагулируемого растворе хлорида натрия рН 6,0.

белка) в пределах от 50 до 1000 мг% (от 0, Об о р у д о в а н и е. Не требуется.

до 10 г/л).

Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. 200 Бестромбоцитарная плазма, полученная путем 350 мг% (2—3,5 г/л). центрифугирования нитратной крови или бога Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. См. грави- той тромбоцитами плазмы при 2000 об/мин в метрический метод. течение 30 мин.

Ход о п р е д е л е н и я. 1% раствор про Ли т е р а т у р а. Детинкина Г. Н., //ын тамина сульфата разводят последовательно кина И. М., Торик Ж- Н. Предложения по уни 0,85 % раствором хлорида натрия в 5;

10;

20;

40;

фикации методов исследования системы гемо и 80 раз;

0,2 мл каждого из приготовленных стаза.—Лаб. дело, 1984, № 4, с. 227 и № 5, растворов переносят в соответствующим обра с. 272—273.

зом помеченные 5 пробирок (в одну пробирку Этаноловый тест. Пр и н ц и п. Наблюдают один раствор) и добавляют в каждую пробирку за образованием геля в плазме после добавле- по 0,2 мл исследуемой плазмы. Пробирки остав ния 50 % раствора этанола. При наличии в плаз- ляют на 30 мин при комнатной температуре, а ме комплексов фибрин-мономера с продуктами затем исследуют их в прямом свете на темном расщепления фибриногена/фибрина и фибрино- фоне. Образование геля и фибриновых нитей геном происходит высвобождение фибрин-моно- учитывают как положительный результат мера, который затем полимеризуется с образова- («1»), а образование зерен или помутнение — нием геля. как отрицательный результат («О»).

Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Отрица- Ход о п р е д е л е н и я. К 0,2 мл исследуе тельный результат во всех разведениях прота- мой плазмы добавляют 0,1 мл раствора моно мина сульфата. йодуксусной кислоты и 0,4 мл раствора хлорида Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Образо- кальция. Перемешивают содержимое пробирки вание геля или нитей фибрина хотя бы в одном встряхиванием и оставляют на 20 мин при ком из разведений протамина сульфата рассматри- натной температуре. К образовавшемуся сгустку вается как указание на повышение уровня раст- добавляют 2 мл раствора кислой щавелево воримых комплексов фибрин-мономера и/или кислой мочевины и определяют с помощью се ранних продуктов деградации фибрина. Это на- кундомера время полного растворения фибри блюдается при остром внутрисосудистом сверты- нового сгустка при постоянном встряхивании.

вании крови и массивных тромбозах. Выпадение Исследование проводят дважды и вычисляют положительного результата только в первых средний результат. Точно так же определяют 1—2 пробирках более характерно для увеличе- время растворения фибриновых сгустков здоро ния концентрации растворимых комплексов фиб- вого человека.

рин-мономеров, а положительный результат в Активность фактора XIII в исследуемой пробирках всего ряда более характерен для по- плазме определяют по формуле: активность фак вышения уровня ранних продуктов расщепления тора XIII =А/В-100 %, где А — время лизиса фибриногена/фибрина. сгустка исследуемой плазмы;

В — время лизиса сгустка нормальной плазмы.

Ли т е р а т у р а. Niewiarowski S., Gu Но р ма л ь н ые в е л и ч и ны: 70±15 с, rewich V. Labaratory i denti fi cation of intrava что принимается за 100 %.

scular coagulation: the SDPS test for the detec Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Уменьше tion of f i br i n monomer and fibri n degradation ние активности фибринстабилизирующего фак products.— J. Lab. clin med., 1971, vol. 77, тора наблюдается при его врожденной недо p. 665—676.

статочности или в связи «с потреблением» при массивном внутрисосудистом свертывании Унифицированный ускоренный метод опреде- крови.

ления фактора XIII (1974). Пр и н ц и п. Опре Пр и м е ч а н и я. При нарушении первой деляется время растворения сгустка плазмы в фазы свертывания крови (гемофилия) для растворе мочевины после инкубации плазмы с образования сгустка необходимо добавить, монойодуксусной кислотой, блокирующей актив кроме хлористого кальция, 0,1 мл раствора ность фактора XI I I, и рекальцификации.

тромбина с активностью 10—20 с. 2. Тяже Р е а к т и в ы. 1. 1,34% раствор оксалата лая недостаточность фактора XIII (менее натрия или 3,8 % раствор цитрата натрия 1 % от нормы) может быть распознана по (см. 4.1). 2. 0,5% раствор монойодуксусной растворению сгустка исследуемой плазмы кислоты: растворяют 0,5 г монойодуксусной кис в 1 % растворе монохлоруксусной кислоты лоты (СH IСООН) в 100 мл бидистиллирован или 30 % растворе мочевины в течение 1 ч ной воды. При работе с реактивом необходимо (сгустки нормальной плазмы при этом не соблюдать осторожность, так как это летучее, растворяются).

раздражающее и аллергизирующее вещество.

3. 0,025 моль/л раствор хлорида кальция. Ли т е р а т у р а. Балуда В. П., Барка 4. 0,12 % раствор кислой щавелевокислой мо- гаи 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные чевины. методы исследования системы гемостаза.— Об о р у д о в а ние. Секундомер. Томск, 1980, с. 196—198;

Caen J., Larrieu M. J..

Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я. Samama M. L'hemostase. Mehodes d'exploration Тромбоцитарная плазма. et diagnostic pratique.— Paris, 1968, p. 192—193.

4.5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ КРОВИ (ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО ЗВЕНА ИЛИ КОМПОНЕНТА СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА) Известны общеоценочные методы и методы ворения) сгустков исследуемой крови (цельной, определения отдельных компонентов фибрино- разведенной) или эуглобулиновой фракции литической системы: плазмина — фермента, плазмы, на оценке степени лизиса сгустков ис расщепляющего фибрин, а при некоторых усло- следуемой разведенной плазмы за стандартное виях также фибриноген и другие факторы свер- время или на исследовании интенсивности ли тывания крови, плазминогена — неактивного зиса стандартных сгустков (пленок, пластин) предшественника плазмина, активаторов плаз- фибрина под действием исследуемой плазмы или миногена, ингибиторов активации плазминогена ее эуглобулиновой фракции. Отдельные компо и ингибиторов плазмина. Общеоценочные методы ненты системы фибринолиза могут быть изу основаны на измерении времени лизиса (раст- чены с применением тех же подходов, но после предварительной обработки исследуемого мате- осуществляется путем наложения манжеты риала (инкубации с плазмином, стрептокина- сфигмоманометра на плечо и поддержания зой, проактиватором) или стандартных пластин в ней минимального артериального давления фибрина (прогревания), тромбоэластографиче- (обычно 80 мм рт. ст.) в течение 10—20 мин.

скими, казеинолитическими. амидолитическими Вторую пробу крови берут из локтевой вены (см. введение перед 4.4.11), иммунологически- руки, на которую наложена манжета, не ми, иммунохимическими и некоторыми другими посредственно перед ее снятием. Время ли методами. зиса эуглобулиновых сгустков после веноз О фибринолитической активности крови ного стаза укорачивается в норме в 1,5— можно судить также по содержанию в ней про- раза в зависимости от длительности стаза.

дуктов деградации фибриногена/фибрина Ли т е р а т у р а. Андреенко Г. В., Кара (ПДФ). Повышение уровня ПДФ рассматри басова М. А., Лютова Л. В. и др. Методы иссле вается как один из основных лабораторных дования фибринолитической системы крови.— признаков гиперфибринолиза. Наибольшее кли М.: Изд-во Московск. ун-та, 1981, с. 40—42.

ническое значение имеют общеоценочные ме тоды, методы фибриновых пластин и методы определения в крови ПДФ.

4.5.2. Методы, основанные на применении фибриновых пластин 4.5.1. Время лизиса Эти методы используются для исследования эуглобулиновых сгустков активности отдельных компонентов системы фибринолиза. Наибольшее их число может быть Унифицированный метод (1974). Пр и н определено путем одновременного изучения ли цип. Измеряется время спонтанного лизиса зиса стандартных непрогретых и прогретых сгустка, получаемого из эуглобулиновой фрак фибриновых пластин под действием плазмы и ее ции бестромбоцитной плазмы при добавлении эуглобулиновой фракции, подвергавшихся и не к ней раствора хлорида кальция.

подвергавшихся обработке стрептокиназой.

Р е а к т и в ы. 1. 1,34% раствор оксалата Определение активности плазмина и актива натрия или 3,8 % раствор цитрата натрия тора плазминогена но Аструпу и соавт. П р и н (см. 4.1.). 2. 1 % раствор уксусной кислоты.

ц и п. Измеряется зона (площадь) лизиса стан 3. Боратный буфер рН 9,0;

растворяют 1 г буры дартного слоя фибрина (фибриновой пластины) (Na B O - 10Н О) и 9 г NaCI в 1 л дистиллиро 2 4 7 2 на месте нанесения плазмы и/или ее эуглобу ванной воды. 4. 0,025 моль/л раствор хлорида линовой фракции.

кальция (см. 4.4.2). 5. Дистиллированная вода.

Ре а к т ив ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат Об о р у д о в а ни е. Водяная баня на 37°С.

рия (см. 4.1). 2. 0,85 % раствор хлорида натрия.

Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.

3. 0,3 % раствор бычьего фибриногена в 0,85 % Бестромбоцитная плазма.

растворе хлорида натрия (см. 4.4.6). 4. Раствор Ход о п р е д е л е н и я. В пробирку нали тромбина в 0,85 % растворе хлорида натрия с вают 8 мл дистиллированной воды, 0,15 мл активностью 8—10 с (см. 4.4.6).

уксусной кислоты и 0,5 мл исследуемой плазмы.

Об о р у д о в а н и е. 1. Столик с уровнем.

Перемешивают содержимое и ставят в холодиль 2. Чашки Петри.

ник (4 °С) на 30 мин. Смесь центрифугируют Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.

в течение 5 мин при 1500 об/мин, сливают над Бестромбоцитная плазма и/или ее эуглобули осадочную жидкость и удаляют остатки жид новая фракция (см. 4.5.1).

кости опрокидыванием пробирки на фильтро Пр и г о т о в л е н и е ф и б р и н о в о й вальную бумагу. Вводят в пробирку 0,5 мл п л а с т и н ы. Наливают в пробирку или кол боратного буфера и, осторожно помешивая бочку 9 мл 0,85 % раствора хлорида натрия, палочкой, растворяют осадок эуглобулинов. Две взвешивают нужное количество фибриногена, пробы по 0,2 мл переносят в 2 другие пробирки, высыпают его в пробирку (колбочку) с 0,85 % ставят их в водяную баню и добавляют в каж раствором хлорида натрия и ставят пробирку дую пробирку по 0,2 мл раствора хлорида каль на 1 ч в термостат при 37 °С. Периодически про ция. Через несколько минут в пробирках обра бирку достают из термостата и осторожно вст зуются сгустки, и с этого момента начинают от ряхивают, добиваясь полного растворения фиб счет времени растворения сгустков. В ответе риногена. После этого в пробирку с раствором приводят средний результат.

фибриногена добавляют 0,2 мл раствора тром бина и быстро выливают содержимое в чашку Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 3—5 ч.

Петри, установленную на ровной горизонталь Кл и н и ч е с к о е з на ч е ни е. Укороче ной поверхности. Под действием тромбина фиб ние времени растворения сгустков указывает на риноген превращается в фибрин и застывает повышение фибринолитической активности, уд тонким слоем. Через 1 —1'/2 ч после образова линение — на снижение.

ния фибрина пластины пригодны для работы.

Пр и м е ч а н и е. Метод может применять- Их можно хранить в течение 7—10 дней при ся в качестве общеоценочного и для изуче- 4—6 °С на ровной поверхности, проложив меж ния способности фибринолитической системы ду чашкой и крышкой увлажненную водой к активации. В последнем случае опреде- фильтровальную бумагу.

ляют время лизиса эуглобулиновых сгустков А. Ход о п р е д е л е н и я с у м м а р н о й до и после венозного стаза. Венозный стаз а к т и в н о с т и п л а з ми н а и а к т ив а т о р а п л а з м и н о г с н а. На фибриновую Проба с протамина сульфатом для обна пластину наносят 0,03 мл плазмы (эуглобули- ружения ПДФ в крови. П р и н ц и п. Наблю ноиой фракции), закрывают чашку Петри крыш- дают зa образованием осадка в сыворотке крови кой, выстланной изнутри увлажненной фильтро- после добавления к ней 1 % раствора протамина вальной бумагой, и помещают чашку на 18— сульфата, обладающего способностью осаждать 24 ч в термостат при 37 °С. После чтого изме- ранние ПДФ.

ряют площадь лизиса, которая и отражает ак- Р е а к т и в ы. 1 % раствор протамина суль тивность плазмина и активатора плазминогена. фата.

Площадь лизиса обычно характеризуется произ- Об о р у д о в а н и е. 1. Водяная баня на ведением двух перпендикулярных диаметров и 37 "С. 2. Секундомер.

выражается в квадратных миллиметрах.

Б. Ход р а з д е л ь н о г о опре д е ле Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

н и я а к т и в н о с т и п л а з м и н а и а к т и - Свежая сыворотка крови (см. 4.1).

в а т о р а п л а з м и н о г е н а. Готовят одно- Ход о п р е д е л е н и я. В пробирку наби временно две фибриновые пластины, после чего рают 0,4 мл сыворотки и добавляют 0,1 мл рас одну из пластин прогревают в течение 30 мин твора протамина сульфата. Перемешивают со при 85 "С, что приводит к разрушению плач- лсржимое и ставят пробирку в водяную баню.

миногена, содержащегося в этой пластине.

Через 5 мин пробирку вынимают и читают ре Таким образом, одна из пластин лишается суб- зультат. Образование геля, нитей или хлопьев страта для действия активатора плазминогена, учитывают как положительный результат («1»), имеющегося в исследуемом материале. Затем а помутнение или зернистость — как отрица на обе пластины наносят по 0,03 мл плазмы тельный результат («О»).

(эуглобулиновойфракции) и, как описано ранее, Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Помутне определяют фибринолитическую активность ис- ние или зернистость (отрицательный резуль следуемых образцов на обеих пластинах. За ак- тат - «О»).

тивность плазмина принимается площадь лизиса К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. 11оложи на прогретой пластине, а за активность актива тельный результат («1») указывает на увеличе тора плазминогена — разность между площа ние содержания ПДФ в сыворотке, что явля дями лизиса на непрогретой и прогретой пла ется одним из лабораторных критериев патоло стинах.

гического внутрисосудистого свертывания кро Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Актив ви. Проба становится положительной при кон ность активатора плазминогена в крови состав ценграции ПДФ 0,015 г/л (15 мкг/мл) и более.

ляет 25—35 мм, а активность плазмина - 8 2.

Л и т е р а г \ р а. ГиПитов С. 3., Ворони 15 мм на И. Е., Литвинов Р. И. Два простых способа К л и н п ч с с к •.) е з и а ч с н и с. Уменьше обнаружения продуктов деградации фибрина ние зон лизиса указывает на снижение актив в кровию - Лаб. дело, 1982.,№6 с..454 - 356.

ности определяемых компонентов, а увеличе ние на повышение.

Иммунодиффузионный метод определения ПДФ. П р и н ц и н. Наблюдают за образовани Л и т е р а т у р а. Андреепко Г. В., Карабч ем дуг преципитации в агаровой пластине, на сова М. А., Лютооа Л. В. и др. Методы иссле- которую наносят на определенном расстоянии дования фибринолитической системы крови. друг от друга исследуемую и антифибриногено М.: Из-во Московск. ун-та, 1981, с. 43—45;

вую сыворотки.

Коваленко А. Н. Дополнительные возможности Р е а к т и в ы. I. Агар-агар волокнистый. 2.

метода стандартных фибриновых пластин.— Веронал-ацетатный буфер рН 8,6, ионная сила Лаб. дело, 1980, № 10, с. 615—618. 0,5 ц. В небольшом количестве доведенной до кипения дистиллированной воды растворяют 9,25 г диэтилбарбитуровой кислоты, охлаждают 4.5.3. Продукты деградации раствор, добавляют 6,5 г ацетата натрия и 1,88 г фибрина (ПДФ) NaOH и доводят дистиллированной водой общий объем до 1 л. Если рН отличается от 8,6, путем Описаны неиммунологические и иммуноло- добавления слабых (0,1 моль/л) растворов HCI гические методы определения содержания ПДФ или NaOH доводят его до этой величины. 3. Ан в сыворотке крови. Первые основаны на осаж- тифибриногеновая сыворотка. 4. Фибриноген че дении ПДФ (нагреванием, охлаждением, прота- ловека или бестромбоцитарная плазма с извест мипа сульфатом), на способности ПДФ инду- ной концентрацией антигена фибриногена.

цировать склеивание стафилококков или на Об о р у д о в а ни е. Чашки Петри и трубча антиполимеризационном и антитромбиновом тые резцы, позволяющие сделать в агаровой действии ПДФ. Иммунологические методы осно- пластине одно центральное отверстие диаметром ваны на применении антифибриногеновой сы- 8 мм и 6 периферических отверстий диаметром воротки или сыворотки, содержащей антитела 4 мм, расположенных на одинаковом расстоянии к отдельным фрагментам фибрина. Пред- от центрального отверстия и друг от друга.

ложены иммунодиффузионные, иммуноэлектро- Расстояние между центральным и периферичсг форетические, радиоиммунные и т. п. методы, а ким отверстием должно составлять не менее также методы, основанные на исследовании аг- 7 мм.

глютинации частиц латекса, гемагглютинапии и Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

торможении гемагглютинации.

Свежая сыворотка крови (см. 4. 1).

Пр и г о т о в л е н и е а г а р о в о й пла - ция антигена фибриногена, которая может быть ст и н ы. В пробирке или колбочке готовят 1,5 % определена с применением имеющейся антифиб раствор агара на веронал-ацетатном буфере риногеновой сыворотки);

К - предельное разве с добавлением мертиолата в концентрации дение исследуемой сыворотки, при котором еще 1:10000, разогревают его в бане с кипящей образуется дуга преципитации с антифибрино водой до гомогенного состояния, после чего геновой сывороткой;

С — концентрация ПДФ 10 мл расплавленного агара выливают в чашку в исследуемой сыворотке.

Петри, установленную на ровной горизонталь- Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. У здоровых ной поверхности. Когда агар станет твердым, людей ПДФ этим методом не обнаруживаются, в нем делают трубчатыми резцами отверстия так как их концентрация находится за предела (обычно в чашке Петри делают 14 отверстий: ми чувствительности метода (менее 8 мкг/мл).

2 центральных и вокруг каждого из них по 6 пе- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Увеличе ние концентрации ПДФ наблюдается при мас риферических).

Оп р е д е л е н и е ч у в с т в и т е л ь н о - сивных тромбозах или диссеминированном внут с т и а н т и ф и б р и н о г е н о в о й с ыв о - рисосудистом свертывании крови с вторичным р о т ки. Готовят 0,2 % (2 г/л) раствор очищен- гиперфибринолизом и при лечении фибриноли ного фибриногена человека в веронал-ацетатном тическими препаратами.

буфере. Разводят его веронал-ацетатным буфе Пр и м е ч а н и я. Чувствительность стан ром, готовят растворы с концентрациями фибри дартных антифибриногеновых сывороток, произ ногена 1;

0,5;

0,25;

0,125 и т.д. до 0,008 г/л водимых в ГДР и ЧССР, составляет не менее (8 мкг/мл). В центральные отверстия вносят 0,016 г/л (16 мкг/мл), что обеспечивает надеж по 0,1 мл антифибриногеновой сыворотки, а в пе ное выявление клинически значимого повыше риферические — по 0,05 мл приготовленных рас ния уровня ПДФ (>=20 мкг/мл). При отсут творов фибриногена. Агаровые пластины остав ствии стандартной антифибриногеновой сыво ляют на сутки при комнатной температуре во ротки ее можно приготовить в лаборатории, влажной камере, а затем определяют наимень пользуясь известными методическими рекомен шую концентрацию фибриногена, образующую дациями.

дугу преципитации с антифибрин9геновой сыво роткой. Эта концентрация и характеризует чув- Ли т е р а т у р а. Елизарова А. И., Федоро ствительность антифибриногеновой сыворотки.

ва 3. Д. Получение антифибриногеновых сыво Ход о п р е д е л е н и я. Исследуемую сыво- роток, применяемых для определения продуктов ротку разводят в 2;

4;

8;

16 и 32 раза. Вносят распада фибриногена и фибрина.— Лаб. дело, в центральные отверстия агаровой пластины по 1971, № 12, с. 722- 724;

Парадесва И. К..

0,1 мл антифибриногеновой сыворотки, а в пери- Жукова И. В. Количественное определение ферические — исследуемую сыворотку и ее раз- продуктов деградации фибриногена и фибрина личные разведения. Через сутки инкубации чаш- методом иммунодиффузии.— Лаб. дело, 1979, ки Петри при комнатной температуре опреде- № 10, с. 590—592;

Якунин Г. А., Смоляниц ляют наибольшее разведение сыворотки, кото- кий А. Я., Кургузое О. П., Грабский М. А.

рое еще образует дугу преципитации. Рассчи- Определение содержания антигена фибриноге тывают концентрацию ПДФ по формуле: на/фибрина в плазме и сыворотке крови методом С = А • В, где А — чувствительность антифибри- радиальной иммунодиффузии.— Лаб. дело, ногеновой сыворотки (минимальная концентра- 1982, № 7, с. 24—26.

Раз дел МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ 5.1. БЕЛКИ определении на рефрактометре коэффициентов 5.1.1. Общий белок рефракции или преломления света.

Наиболее распространены рефрактометри ческие и фотометрические биуретовые методы.

Белки относятся к высокомолекулярным Биуретовый реактив был предложен в 1848 г.

соединениям;

в их состав входит более 20 видов Однако эта реакция для определения общего а-аминокислот, соединенных между собой пеп- белка в сыворотке крови стала широко приме тидной связью (СО —NH). Различают простые няться значительно позже. В биуретовой реак и сложные белки. Простые белки состоят только ции атом меди связывает атомы азота белка из аминокислот, в сложные входят и другие с образованием цветных соединений. Первые вещества: в липопротеиды — липиды, в глико- биуретовые реактивы состояли из медного купо протеиды — углеводы, в нуклеопротеиды — нук- роса и едкого натра. Концентрация щелочи леиновые основания, в хромопротеиды — раз- может быть различной. Наибольшее распростра личные окрашенные соединения. Плазма крови нение получил биуретовый реактив Вейксель человека в норме содержит более 100 видов баума с концентрацией щелочи 0,2 моль/л.

белков. Примерно 90 % общего белка составля- Включение тартрата калия и натрия в биурето ют альбумин, иммуноглобулины, липопротеиды, вый реактив повысило его стабильность. Замена фибриноген, трансферрин;

другие белки присут- тартрата калия и натрия на динатриевую соль ствуют в плазме в небольших количествах.

ЭДТА не дает особых преимуществ по сравне Большинство специфических свойств белков нию с реактивом Вейксельбаума, так же как и зависит от химического строения и пространст- использование предложенного Kingsley трифос венной конфигурации макромолекул. Белки об- фатбиуретового реактива с заменой едкого нат ладают гидрофильными свойствами, т. е. имеют ра трифосфатом натрия. Увеличение концентра большое сродство к воде, образуя с водой кол- ции сульфата меди незначительно влияет на ре лоидные растворы, отличающиеся неустойчиво- зультаты определения белка. Биуретовая реак стью. Под влиянием разнообразных воздействий ция чувствительна к температуре. Повышение белки легко выпадают в осадок. На этом свой- температуры увеличивает скорость развития ок стве белковых растворов основаны различные раски, которая достигает максимума через осадочные пробы. Белки относятся к веществам, 5 мин. На данном принципе основано определе обладающим амфотерными свойствами, т. е. ние общего белка в сыворотке крови в поточных, содержат кислые гидроксильные группы и основ- дискретных и центрифужных автоанализаторах.

ные аминогруппы, поэтому заряд их зависит от В биуретовом методе Лоури чувствитель рН раствора, что важно учитывать при электро- ность выше за счет сочетания биуретовой реак форетическом разделении белков. В состав бел- ции с реакцией Фолина с применением реактива ков в среднем входит 16 % азота. В биологи- Фолина — Чиокольтео. В фотометрических биу ческих жидкостях определяют общий белок, ретовых методах для получения правильных группы (фракции) белков, близкие по физичес- результатов важным является выбор калибро ким и химическим свойствам, и индивидуаль- вочного материала, учитывая, что общий белок ные белки. Для определения индивидуальных состоит из индивидуальных белков различного белков наиболее чувствительны и специфичны состава. Некоторые естественные белки, напри иммунологические методы, основанные на при- мер альбумин человеческой и бычьей сывороток, менении специфических антисывороток. могут быть использованы в качестве калибро Методы определения общего белка в сыво- вочных материалов. Белки для калибровочного ротке крови основаны на различных принципах. материала должны быть хорошо охарактеризо Азотометрические — на определении содержа- ваны и иметь концентрацию не менее 70 г/л.

щегося в нем азота (первый такой метод пред- Унификация методов. Биуретовый метод оп ложен J. Kj cl dci hl в 1883 г.), весовые (гравимет- ределения общего белка в сыворотке крови был рические) на высушивании белков до постоян- утвержден в качестве унифицированного в ной массы и последующем взвешивании на ана- 1972 г. В СССР выпускается «Набор химических литических весах;

спектрофотометрические — реактивов для определения общего белка в сыво на определении поглощения при 280 нм;

фото- ротке крови по биуретовой реакции». Набор со метрические — на измерении окрашенных про- здан для унифицированного метода;

в качестве дуктов реакции;

рефрактометрические — на калибровочного материала использован ампули Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабо рованный раствор плацентарного альбумина чего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего с концентрацией 100 г/л.

Унифицированный метод по биуретовой ре- биуретового реактива;

через 30—60 мин изме акции. Пр и н ц и п. Белки реагируют в щелоч- ряют на фотометре, как в опыте, против холостой ной среде с сульфатом меди, при этом образу- пробы. По полученным данным строят калибро вочный график. Калибровочная кривая линей ются соединения, окрашенные в фиолетовый на до 100 г/л альбумина.

цвет (биуретовая реакция).

Но р ма л ь н ые в е л и ч и н ы: 65—85 г/л Ре а к т и в ы. 1. Натрия хлорид, ч. д. а. или х. ч., 154 ммоль/л (изотонический раствор): (6,5—8,5 г/100 мл).

Оц е н к а а н а л и т и ч е с к о й на д е ж 9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу н о с т и ме т од а. Метод специфичен, отлича вместимостью 1 л, растворяют в воде и доводят ется хорошей воспроизводимостью. Воспроизво до метки водой. 2. Натр едкий, ч. д. а. или х. ч., димость (V) составляет 1,5—3,5 %. На пра 0,2 моль/л: 8 г едкого натра помещают в мерную вильность метода влияет качество калибровоч колбу вместимостью 1 л, осторожно растворяют ного материала и корригирование результатов в воде и доводят до метки водой. 3. Калия йодид со значением холостой пробы на реактивы и сы ч. д. а. или х. ч., 30 ммоль/л раствор йодида воротку. Небольшое число веществ оказывает калия в 0,2 моль/л растворе едкого натра;

0,5 г интерферирующее действие в данной реакции:

йодида калия помещают в мерную колбу вмести билирубин при концентрации больше 85 мкмоль/л, мостью 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором триглицериды — больше 11,4 ммоль/л. Для уст едкого натра до метки и растворяют. Реактив ранения интерференции, вызванной липемией стабилен в течение 2 нед при хранении в посуде (присутствием хиломикронов), применяют из темного стекла. 4. Калий-натрий виннокислый экстракцию диэтиловым эфиром. Большинство 4-водный (сегнетова соль) ч. д. а. 5. Меди лекарств не вызывает интерференцию.

сульфат 5-водный ч. д. а. или х. ч. 6. Биуретовый Лит е р а т у р а. Методические указания по реактив: 4,5 г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 моль/л растворе едкого натра, прибав- применению унифицированных клинических ла бораторных методов исследований. Под ред.

ляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида калия В. В. Меньшикова.—М., 1973, с. 45—47;

и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль/л раствором едкого натра. Реактив стабилен при Weichselbaum Т. Amer. J. Clin. Pathol., 1946, хранении в посуде из темного стекла. 7. Рабочий vol. 16, p. 40.

раствор биуретового реактива: 20 мл биурето- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Изменение вого реактива смешивают с 80 мл 0,5 % раствора содержания общего белка в сыворотке крови йодида калия. Раствор стабилен. 8. Калибровоч- происходит при уменьшении процессов синтеза ный раствор альбумина (из человеческой сыво- белка, нарушении водного баланса, усиленном ротки): 100 г/л раствор альбумина в 154ммоль/л распаде и потере белка. Гипопротеинемия наб растворе хлорида натрия. людается при нефротическом синдроме, синд Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я. роме мальабсорбции (энтерит, хронический Сыворотка крови. панкреатит), экссудативной энтеропатии, забо Ход о п р е д е л е н и я. Опытная проба: леваниях кожи (ожоги, экзема), массивных кро к 0,1 мл сыворотки прибавляют 5 мл рабочего вотечениях, задержке солей и воды (хронические раствора биуретового реактива и смешивают почечные заболевания), агаммаглобулинемии, избегая образования пены. Через 30 мин (и не гипогаммаглобулинемии, неправильном пита позднее чем через 1 ч) измеряют на фотометре нии, голодании. Уменьшение содержания белка в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны в плазме крови может наступить также в резуль 500—560 им (зеленый светофильтр) против хо- тате задержки воды при сердечной декомпенса лостой пробы. Холостая проба: к 5 мл рабочего ции, заболеваниях, сопровождающихся отеками биуретового реактива прибавляют 0,1 мл или большими потерями белка с мочой, напри 154 ммоль/л раствора хлорида натрия, далее об- мер при нефритах. Нарушением синтеза белка рабатывают как опытную пробу. и уменьшением его вследствие этого в сыворотке Ра сче т ведут по калибровочному гра- крови сопровождаются раковая кахексия, дли тельные воспалительные процессы.

фику.

По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о г о Гиперпротеинемия наблюдается при плазмо г р а фи к а : из калибровочного раствора гото- цитоме, макроглобулинемии Вальденстрема, хронических воспалительных заболеваниях вят рабочие растворы как указано ниже.

(ревматоидный артрит, диффузные болезни сое динительной ткани — коллагенозы, бронхоэк Калибро- 154 ммоль/л тазы, цирроз печени), состояниях и болезнях, Концентра сопровождающихся дегидратацией (понос, рво № про- вочный ра- раствор ция альбу створ аль- хлорида бирки та, сахарный диабет).

мина, г/л бумина, мл натрия, мл При тяжелых травмах увеличение содержа ния общего белка в плазме крови может насту пить за счет потери части внутрисосудистой 1 0,2 0,8 жидкости. При острых инфекционных заболева 2 0,4 0,6 ниях к гиперпротеинемии приводит усиленный 3 0,6 0,4 синтез белков острой фазы, при хронических 4 0,8 0,2 инфекционных заболеваниях — повышение син 5 1,0 — теза иммуноглобулинов.

5.1.2. Альбумин Стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла. 6. Рабочий раствор БКЗ в ацетатном буфере: в мерную колбу вместимо Альбумин — простой белок, синтезиру ющийся и печени;

в плазме крови поддержи- стью 1 л помешают 85 мл 1,2 ммоль/л раствора БКЗ, доводят объем до метки ацетатным буфе вает коллоидно-осмотическое давление, играет ром с детергентом. Стабилен при хранении важную роль в транспорте многих веществ в холодильнике в посуде из темного стекла.

экзогенного и эндогенного происхождения.

7. Основной калибровочный раствор альбумина, Методы определения альбумина — фотомет 10 г/100 мл. Можно использовать ампулирован рические, электрофоретические, иммунологичес ный 10 % раствор альбумина плацентарного.

кие. Фотометрические методы основаны главным М а т е [) и а л д л я и с с л е д о в а н и я.

образом на взаимодействии альбумина с кра Сыворотка крови, свободная от гемолиза.

сителями. С этой целью применяют бромкрезо Ход о п р е де ле н и я. Опытная проба:

ловый зеленый (БКЗ), бромкрезоловый крас 10 мкл сыворотки крови (или 0,1 мл сыворотки, ный, метиловый оранжевый, натриевую соль разведенной в 10 раз 154 ммоль/л раствора 2-(4-оксиазобекзол)-бензойной кислоты (ОБК);

NaCl) тщательно перемешивают, избегая обра бромфеноловый голубой и др. Наиболее распро зования пены, с 4 мл рабочего раствора БКЗ странены методы с использованием в качестве в ацетатном буфере. Через 5—10 мин измеряют красителей БКЗ и ОБК. Наиболее специфичным на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при является метод с БКЗ;

при рН 7,0 альбумин длине волны 630—690 нм (красный свето обладает высокой степенью сродства к БКЗ.

фильтр) против холостой пробы на реактивы При применении ацетатного буфера окраска развивается быстро и остается стабильной в те- или на спектрофотометре при длине волны 625 нм чение 2 ч. Интенсивность образования окра- в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска стабиль на в течение 8 ч. Холостую пробу ставят так же, шенного соединения зависит от вида буфера.

При применении ацетатного и лактатного буфе- как опытную, но вместо сыворотки добавляют 0,1 мл воды.

ра достигается наибольшая чувствительность метода (соотношение объемов пробы и реак- Расчет ведут по калибровочной кривой.

По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о й тивов может составлять 1 :500). Оптимум рП к р и в о и: готовят ряд разведений основного ка ацетатного буфера равен 4,1 —4,2. Метод с БКЗ либровочного раствора, как указано ниже. Ка требует введения в реакцию детергентов для предотвращения преципитации комплекса аль- либровочные растворы обрабатывают, как опыт ные, но вместо сыворотки добавляют 10 мкл бумина с БКЗ. С этой целью используют кати калибровочного раствора. Калибровочная кри онные, анионные детергенты, чаще применяют вая линейна до концентрации альбумина 60 г/л.

неионные детергенты — твин 20, твин 80, бридж 35, тритон Х-100 и др. Метод, основанный на реакции альбумина с 2- (4-оксиазобензо. i) Основной ка- Содержание бензойной кислотой, отличается низкой чувстви Дистилли № про- либровочный альбумина в тельностью и специфичностью, а также неста рованная раствор аль- сыворотке бирки вода, мл бильностыо окраски конечного продукта реак бумина, мл крови, г/л ции.

Унификация методов. Метод определения 1 1,0 4,0 альбумина по реакции с бромкрезоловым зеле 2 1,5 3,5 ным утвержден в качестве унифицированного 3 2,0 3,0 в 1979 г.

4 2,5 2,5 Унифицированный метод по реакции с бром 5 3,0 2,0 крезоловым зеленым. П р и н ц и п. При взаимо действии альбумина с БКЗ в слабокислой среде в присутствии детергента образуется окрашен ный комплекс синего цвета.

Ре а к т ив ы. 1. Уксусная кислота, 1 моль/л:

Но р м а л |ь н ы е в е л и ч и н ы: 35—50 г/л в мерную колбу вместимостью 1 л помещают (3.5-5,0 г/100 мл).

60 мл ледяной уксусной кислоты и доводят В о с п р о и з в о д и м о с т ь. V 2—5 %.

объем водой до метки. 2. Натр едкий ч. д. а., х. ч. 1 моль/л. 3. Полиоксиэтиленлауриловый Л и т е р а т у р а. Лукичеоа Т. И., Сентебо эфир (бридж 35). 4. Ацетатный буфер, 0,05 моль/л, на Н. А. Лаб. дело. 1977, № 11, с. 675— рН 4,2 с добавлением детергента: 0,85 г бриджа 677;

1978, № 4, с. 227—233;

Slurardin V., Ney J 35 растворяют в 200 мл воды, добавляют 50 мл /.. kl i n. Cl i ei n. k l i n. Biochem., 1972, Bd 10, I моль/л раствора уксусной кислоты, 13,2-мл S. 338- 344.

I моль/л раствора едкого натра и доводят объем К л п н и ч е с к о е з н а ч е п и е. Гипераль водой до 1 л. Перемешивают, проверяют рН.

буминемия наблюдается при тех же состояниях, Реактив стабилен при хранении в холодильнике.

5. Бромкрезоловый зеленый (БКЗ) водораство- что и гиперпротеинемия. Гипоальбуминемия на римый, индикатор, ч. д. а. 1,2 ммоль/л: 0,4292 г ступает при больших потерях белка, связан ных с кровотечением при нарушении ситеза БКЗ растворяют в 200—-300 мл воды в мерной колбе емкостью 500 мл и доводят объем до метки. альбумина и увеличении процессов распада.

5.1.3. Белковые фракции в сыворотке крови получают более 20 фракций белков.

Состав фракций белков, выделяемых в био- Методом высаливания нейтральными солями логических жидкостях, в значительной степени (сульфат аммония, сульфат и фосфат натрия) зависит от применяемого метода. выделяют только 3 фракции белков плазмы:

Основные методы фракционирования белков альбумины, глобулины, фибриноген.

сыворотки крови: высаливание нейтральными Унифицированный метод электрофоретичес солями, электрофоретическое фракционирова- кого разделения на пленках из ацетата цел ние, иммунологические методы, седиментацион- люлозы. Пр и н ц и п. Коллоидные частицы бел ный способ, хроматография, гель-фильтрация, ка перемещаются в электрическом поле по осаждение этиловым спиртом при низкой темпе- стоянного тока: в щелочной среде — к аноду, ратуре. Наиболее приемлемыми и информатив- в кислой — к катоду. В щелочной среде в элект ными являются электрофоретические методы рическом поле наиболее быстро перемещаются разделения. Другие методы не получили широ- альбумины, затем щ-, «2- и у-глобулины.

кого распространения. Р е а к т и в ы. 1. 5,5-Диэтилбарбитуровой При электрофоретическом разделении через кислоты натриевая соль (мединал), фарм. 2. Ли исследуемую сыворотку, помещенную в камеру монная кислота ч. д. а., х. ч. 3. Барбитал-цит с буферным раствором, пропускают электричес- ратный (мединал-цитратный) буфер рН 8,6:

кий ток определенной силы и напряжения. В за- 7,36 г 5,5-диэтилбарбитурата натрия (медина висимости от электрического заряда и других ла), 0,3 г лимонной кислоты растворяют в 700 мл физических и химических свойств белковые воды в мерной колбе вместимостью 1 л, проверя фракции передвигаются к одному из полюсов ют рН и доводят водой до метки. 4. Бромфено (в нейтральной среде—к аноду). Количество ловый синий водорастворимый, индикатор выделенных белковых фракций зависит от при- ч. д. а. 5. Ртуть двухлористая (сулема, хлорная меняемой поддерживающей среды. В качестве ртуть) ч. д. а. 6. Уксусная кислота ледяная х. ч.

поддерживающей среды при электрофорезе при- 7. Пунцовый С. 8. Кислотный красный 2Ж.

меняют бумагу, пленки ацетат целлюлозы, гели 9. Трихлоруксусная кислота ч., 50 г/л раствор.

крахмала, полиакриламида, агара и комбиниро- 10. Растворы для окрашивания, а) Раствор ванные среды. бромфенолового синего, 0,5 г/л: 10 г двухлори Электрофорез на бумаге был введен в 50-х стой ртути и 20 мл ледяной уксусной кислоты годах. Оценка результатов производится фото- растворяют в небольшом количестве воды при метрически после элюирования отдельных фрак- нагревании на водяной бане, непрерывно поме ций белков или на денситометре. Недостатки шивая до полного растворения сулемы. Отдель метода: вследствие химической неоднородности но растворяют 0,5 г бромфенолового синего бумаги получается недостаточно четкое разделе- в воде. Оба раствора помещают в мерную колбу ние фракций;

большая длительность процессов вместимостью 1 л и доводят водой до метки, разделения, окрашивания, отмывания. б) раствор пунцового С: 0,3 г краски растворя Электрофорез на пленках из ацетата целлю- ют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной кислоты, в) Раствор кислого красного 2Ж:

лозы по сравнению с бумажным электрофорезом обладает рядом преимуществ: химическая одно- 0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора родность ацетата и одинаковый размер пор по- трихлоруксусной кислоты. 11. Отмывающий рас твор — уксусная кислота, 50 г/л раствор. 12.

зволяют увеличить четкость разделения;

время, необходимое для разделения, значительно мень- Просветляющие растворы, а) Вазелиновое мас ше, чем при электрофорезе на бумаге;

для по- ло, б) Смесь: ледяная уксусная кислота и ацетон ( 1: 1 ).

лучения четкой электрофореграммы достаточно С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е.

0,1—0,3 мкл образца;

фон, получаемый после окрашивания, легко отмывается;

абсорбция бел- 1. Прибор для электрофореза на пленках из ка пленкой минимальная. Для исследования ацетата целлюлозы. 2. Пленка из ацетата цел применяют веронал-мединаловый буфер рН 8,6, люлозы. 3. Денситометр.

веронал-ацетатный буфер рН 8,6, мединал-цит- Ход о п р е д е л е н и я. Подготовка прибо ратный буфер рН 8,6, трис-буфер. ра: прежде чем приступить к работе, необходимо Для окраски электрофореграммы приме- ознакомиться с инструкцией по эксплуатации прибора. В соответствии с инструкцией запол няют: пунцовый С, нигрозин, амидо черный, азокармин, бромфеноловый синий. Чаще других няют камеры прибора буферным раствором.

используют пунцовый С-индикатор: при рН 10,0 Следят, чтобы уровень буфера был одинаковым красный, при рН 12,5— пурпурный. При элек- в обеих камерах.

трофорезе на бумаге и пленках ацетата цел- Подготовка пленок из ацетата целлюлозы:

люлозы в сыворотке крови получают 5 фракций: смачивают пленки буферным раствором (поме альбумин — самая большая и наиболее быстро щают в буферный раствор на 5 мин). Удаляют движущаяся к аноду фракция, далее а1-глобу- избыток влаги фильтровальной бумагой. За лины, а2-глобулины, в-глобулины и у-глобули- крепляют пленку матовой стороной кверху ны — наиболее медленно движущаяся к аноду (пленки должны располагаться параллельно фракция. Метод электрофореза на пленках из друг другу и строго параллельно стенкам при ацетата целлюлозы утвержден в качестве уни- бора, не должны провисать). Закрывают каме фицированного в 1979 г. Электрофорез в гелях ру крышкой и пропускают ток напряжением (агаровом, крахмальном и др.) применяют реже.

150 В в течение 5 мин, после чего выключают При электрофорезе в полиакриламидном геле ток.

Нанесение сыворотки: на катодный край водой, б) Трис-буфер рН 8,9: трис-(оксиметил) пленки наносят 1—4 мкл сыворотки в виде узкой аминометан 60,5 г, этилендиаминтетрауксусная полоски, так, чтобы полоски не доходили до края кислота (ЭДТА) 6 г, борная кислота 4,6 г, вода пленки. до 1 л. 2. Раствор красителя. Используют раз Проведение электрофореза: включают ток личные красители — бромфеноловый синий, и проводят электрофоретическое разделение в амидо черный, азокармин Б и др.: 1 г бромфено течение 20 мин при напряжении 150 В и силе лового синего и 20 г двухлористой ртути (суле тока I мА на 1 см поперечного сечения полоски. мы) растворяют в воде, добавляют 40 г ледяной Обработка пленок из ацетата целлюлозы: уксусной кислоты и доводят водой до 2 л. Хранят выключают ток, вынимают пленки, высушивают в посуде из темного стекла. 3. Раствор для элю их вначале на воздухе в течение 5—10 мин, ирования — натр едкий, 0,03 моль/л.

затем (для фиксации) в сушильном шкафу при Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е.

100 'С в течение 10 мин. Окрашивают в течение 1. Прибор для электрофореза на бумаге. 2. Хро 15 мин одним из указанных красителей, после матографическая фильтровальная бумага марки чего пленки несколько раз отмывают от избытка «Б» (качество фильтровальной бумаги имеет красителя 50 г/л раствором уксусной кислоты до большое значение: она должна быть однородной исчезновения фона (3—4 раза). После отмывки и плотной).

пленки промокают фильтровальной бумагой и Ход о п р е д е л е н и я. Подготовка прибо высушивают на воздухе. Затем пленки просвет- ра: в камере необходимо поддерживать опреде ляют в одном из просветляющих растворов. ленную влажность воздуха, чтобы предохранить Ра с че т. Измерение проводят на денсито- фильтровальную бумагу от высыхания. Для это метре. Результаты выражают в процентах. го прибор закрывают крышкой. Буферный рас Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы зависят от твор в разных отделах камеры должен иметь вида красителя (табл. 38). одинаковый уровень, чтобы избежать перелива ния жидкости через ленту.

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 13 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.