WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 14 |

«Учебная литература для студентов медицинских вузов Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин Биологическая химия Издание третье, переработанное и дополненное Рекомендован Управлением научных и образовательных ...»

-- [ Страница 9 ] --

Распад биогенных аминов. Накопление биогенных аминов может от рицательно сказываться на физиологическом статусе и вызывать ряд существенных нарушений функций в организме. Однако органы и ткани, как и целостный организм, располагают специальными механизмами обез вреживания биогенных аминов, которые в общем виде сводятся к окисли тельному дезаминированию этих аминов с образованием соответствующих альдегидов и освобождением аммиака:

O R-CHO + NH3 + H2O R-CH2-NH2 + H2O Ферменты, катализирующие эти реакции, получили название моноамин и диаминоксидаз. Более подробно изучен механизм окислительного дез аминирования моноаминов. Этот ферментативный процесс является не обратимым и протекает в две стадии:

R—CH2—NH2 + Е-ФАД + H2O –> R—CHO + NH3 + Е-ФАДН2 (1) Е-ФАДН2 + O2 –> Е-ФАД + Н2O2 (2) Первая (1), анаэробная, стадия характеризуется образованием альде гида, аммиака и восстановленного фермента. Последний в аэробной фазе окисляется молекулярным кислородом. Образовавшаяся перекись водорода далее распадается на воду и кислород. Моноаминоксидаза (МАО), ФАД-содержащий фермент, преимущественно локализуется в митохонд риях, играет исключительно важную роль в организме, регулируя скорость биосинтеза и распада биогенных аминов. Некоторые ингибиторы моно аминоксидазы (ипраниазид, гармин, паргилин) используются при лечении гипертонической болезни, депрессивных состояний, шизофрении и др.

Обезвреживание аммиака в организме В организме человека подвергается распаду около 70 г аминокислот в сутки, при этом в результате реакций дезаминирования и окисления биогенных аминов освобождается большое количество аммиака, явля ющегося высокотоксичным соединением. Поэтому концентрация аммиака в организме должна сохраняться на низком уровне. Действительно, уровень аммиака в крови в норме не превышает 60 мкмоль/л (это почти в 100 раз меньше концентрации глюкозы в крови). В опытах на кроликах показано, что концентрация аммиака 3 ммоль/л является летальной. Таким образом, аммиак должен подвергаться связыванию в тканях с образованием не токсичных соединений, легко выделяющихся с мочой.

Один из путей связывания и обезвреживания аммиака в организме, в частности в мозге, сетчатке, почках, печени и мышцах,– это биосинтез глутамина (и, возможно, аспарагина). Глутамин и аспарагин выделяются с мочой в небольшом количестве. Было высказано предположение, что они выполняют скорее транспортную функцию переноса аммиака в неток сичной форме. Ниже приводится химическая реакция синтеза глутамина, катализируемого глутаминсинтетазой *.

АТФ АДФ + Рi NH Глутамин Глутамат Механизм этой синтетазной реакции, подробно изученный А. Майсте ром, включает ряд стадий. Синтез глутамина в присутствии глутамин синтетазы может быть представлен в следующем виде:

а) Глу + Е + АТФ –> Е-АДФ—Глу + Рi б) Е-АДФ—Глу + NН3 –> Глн + Е-АДФ в) Е-АДФ –> Е + АДФ а + б + в: Глу + АТФ + NН3 –> Глн + АДФ + Рi.

Биосинтез аспарагина протекает несколько отлично и зависит от при роды ферментов и донора аммиака. Так, у микроорганизмов и в животных тканях открыта специфическая аммиакзависимая аспарагинсинтетаза, ко торая катализирует синтез аспарагина в две стадии:

а) Асп + Е + АТФ –> Е-аспартил~АМФ + PPi;

б) Е-аспартил~АМФ + NН3 –> Асн + Е + АМФ.

В животных тканях содержится, кроме того, глутаминзависимая аспа рагинсинтетаза, которая для синтеза во второй стадии использует амидную группу глутамина:

б) Е-аспартил~АМФ + Глн –> Асн + Е + АМФ + Глу.

Суммарная ферментативная реакция синтеза аспарагина может быть представлена в следующем виде:

Асп + АТФ + NН3 (или Глн) –> Асн + АМФ + РРi + (Глу).

* Конечные продукты обмена глутамина (гистидин, глюкозо-6-фосфат, АМФ, цАМФ и др.), как и Гли, и Ала, оказались аллостерическими ингибиторами глутаминсинтетазы.

Фермент подвергается также ковалентной модификации путем аденилирования-деаденили рования (остаток Тир), и тогда он оказывается более чувствительным к аллостерическим ингибиторам. Суммарный тормозящий эффект превышает действие одного какого-либо ингибитора. Этот тип регуляции известен как согласованное ингибирование.

Видно, что энергетически синтез аспарагина обходится организму до роже, поскольку образовавшийся РР далее распадается на ортофосфат.

i Часть аммиака легко связывается с -кетоглутаровой кислотой бла годаря обратимости глутаматдегидрогеназной реакции. Если учесть свя зывание одной молекулы аммиака при синтезе глутамина, то нетрудно видеть, что в организме имеется хорошо функционирующая система, связывающая две молекулы аммиака:

NH3 NH -Нетоглутарат Глутамат Глутамин Глутамин, кроме того, используется почками в качестве резервного источника аммиака (образуется из глутамина под действием глутаминазы), необходимого для нейтрализации кислых продуктов обмена при ацидозе и защищающего тем самым организм от потери с мочой используемых для + этих целей ионов Na.

Орнитиновый цикл мочевинообразования Основным механизмом обезвреживания аммиака в организме является биосинтез мочевины. Последняя выводится с мочой в качестве главного конечного продукта белкового, соответственно аминокислотного, обмена.

На долю мочевины приходится до 80–85% от всего азота мочи. Основным и, возможно, единственным местом синтеза мочевины является печень.

Впервые Г. Кребс и К. Гензеляйт в 1932 г. вывели уравнения реакций синтеза мочевины, которые представлены в виде цикла, получившего в литературе название орнитинового цикла мочевинообразования Кребса.

Следует указать, что в биохимии это была первая циклическая система метаболизма, описание которой почти на 5 лет опеределило открытие Г. Кребсом другого метаболического процесса – цикла трикарбоновых кислот (см. ранее). Дальнейшие исследования в основном подтвердили циклический характер биосинтеза мочевины в печени. Благодаря иссле дованиям Г. Коена, С. Ратнер и сотр. были уточнены промежуточные этапы и ферментные системы, катализирующие образование мочевины.

Таким образом, весь цикл мочевинообразования может быть пред ставлен следующим образом. На первом этапе синтезируется макроэрги ческое соединение карбамоилфосфат – метаболически активная форма аммиака, используемая в качестве исходного продукта для синтеза пи римидиновых нуклеотидов (соответственно ДНК и РНК) и аргинина (соответственно белка и мочевины):

Аргинин Пиримидины Белки Мочевина ДНК РНК Карбамоилфосфат К настоящему времени открыты три разных пути синтеза карбамоил фосфата de novo, катализируемые тремя разными ферментами. Первую необратимую реакцию катализирует регуляторный фермент – аммиакзави симая карбамоилфосфатсинтетаза (КФ 6.3.4.16):

N-ацетилглу + 2АДФ + Pi NH3 + CO2 + 2АТФ + H2O тамат Реакция требует затраты двух молекул АТФ, открыта в митохондриях клеток печени и используется преимущественно для синтеза аргинина и мочевины. В этой реакции в качестве активного стимулирующего ал лостерического эффектора действует N-ацетилглутамат.

Вторую, также необратимую, реакцию катализирует глутаминзависимая карбамоилфосфатсинтетаза (КФ 6.3.5.5):

+ L-Глу + АДФ CO2 + L-Глу-NН2 + АТФ + H2O Данная реакция открыта в цитозоле клеток животных и требует наличия ионов Mg2+. Следует указать, что благодаря включению гидролитической стадии она используется преимущественно для синтеза пиримидиновых нуклеотидов (см. далее). Фермент широко распространен в клетках жи вотных.

Третью обратимую реакцию катализирует карбаматкиназа (КФ 2.7.2.2):

NH3 + CO2 + АТФ + АДФ Реакция открыта у разных микроорганизмов и, возможно, используется скорее для ресинтеза АТФ, чем для синтеза карбамоилфосфата.

На втором этапе цикла мочевинообразования происходит конденсация карбамоилфосфата и орнитина с образованием цитруллина;

реакцию ка тализирует орнитин-карбамоилтрансфераза (КФ 2.1.3.3).

На следующей стадии цитруллин превращается в аргинин в результате двух последовательно протекающих реакций. Первая из них, энергозави симая,– это конденсация цитруллина и аспарагиновой кислоты с обра зованием аргининосукцината (эту реакцию катализирует аргининосукцинат синтетаза). Аргининосукцинат распадается в следующей реакции на ар гинин и фумарат при участии другого фермента – аргининосукцинатлиазы.

На последнем этапе аргинин расщепляется на мочевину и орнитин под действием аргиназы.

Необходимо подчеркнуть, что аргиназа содержится в печени тех жи вотных, которые экскретируют с мочой мочевину как основной и конечный продукт азотистого обмена. В печени птиц, например, аргиназа отсутствует, поскольку птицы вместо мочевины выделяют мочевую кислоту. Орни тиновый цикл мочевинообразования с учетом новых данных представлен на рис. 12.5.

Суммарная реакция синтеза мочевины без учета всех промежуточных продуктов может быть представлена в следующем виде:

СO2 + NH3 + ЗАТФ + 2Н2O + Аспартат –> Мочевина + 2АДФ + АМФ + + Фумарат + 2Рi + РРi.

Данная реакция сопровождается снижением свободной энергии (G0 = –40 кДж), поэтому процесс всегда протекает в направлении син теза мочевины. Следует указать, что синтез мочевины энергетически дорого обходится организму. На синтез одной молекулы мочевины требуется Pi Орнитинкарбамоил трансфераза Цитруллин Орнитин Аргининосукцинат Аспартат Аргиназа синтетаза Мочевина АТФ H2O АДФ + Pi Аргининосук Аргинин цинатлиаза Аргининосукцинат Фумарат Рис. 12.5. Орнитиновый цикл синтеза мочевины в печени.

затрата четырех высокоэнергетических фосфатных групп: две молекулы АТФ расходуются на синтез карбамоилфосфата и одна – на образование аргининоянтарной кислоты, при этом АТФ расщепляется на АМФ и РРi, который при гидролизе также образует две молекулы Рi.

Из приведенной схемы процесса мочевинообразования нетрудно видеть, что один из атомов азота мочевины имеет своим источником свободный аммиак (через карбамоилфосфат);

второй атом азота поступает из ас партата. Аммиак образуется главным образом в процессе глутаматде гидрогеназной реакции. В процессе пополнения запасов аспартата участ вуют три сопряженные реакции: сначала фумарат под действием фумаразы присоединяет воду и превращается в малат, который окисляется при участии малатдегидрогеназы с образованием оксалоацетата;

последний в реакции трансаминирования с глутаматом вновь образует аспартат.

Учитывая известные фактические данные о механизмах обезвреживания аммиака в организме, можно сделать следующее заключение. Часть ам миака используется на биосинтез аминокислот путем восстановительного аминирования -кетокислот по механизму реакции трансаминирования.

Аммиак связывается при биосинтезе глутамина и аспарагина. Некоторое количество аммиака выводится с мочой в виде аммонийных солей. В форме креатинина, который образуется из креатина и креатинфосфата, выделяется из организма значительная часть азота аминокислот. Наибольшее ко личество аммиака расходуется на синтез мочевины, которая выводится с мочой в качестве главного конечного продукта белкового обмена в организме человека и животных. Подсчитано, что в состоянии азотистого равновесия организм взрослого здорового человека потребляет и соот ветственно выделяет примерно 15 г азота в сутки;

из экскретируемого с мочой количества азота на долю мочевины приходится около 85%, креатинина – около 5%, аммонийных солей – 3%, мочевой кислоты – 1% и на другие формы – около 6%.

В процессе эволюции живые организмы выработали различные типы азотистого обмена. Это аммониотелический тип, при котором главным конечным продуктом азотистого обмена является аммиак;

он свойствен преимущественно рыбам. При уреотелическом типе обмена основным ко нечным продуктом обмена белков является мочевина;

такой тип характерен для человека и животных. Урикотелический тип характерен для птиц и рептилий;

главным конечным продуктом данного типа обмена является мочевая кислота.

Специфические пути обмена некоторых аминокислот Помимо общих путей обмена, характерных для большинства аминокислот, в настоящее время в животных тканях довольно подробно выяснены индивидуальные пути превращения почти всех аминокислот, входящих в состав белковых молекул. Некоторые из этих превращений в коли чественном отношении имеют второстепенное значение, но образующиеся из них продукты реакции могут играть важную, а иногда и решающую роль в процессах обмена веществ. Далее рассматривается выборочно обмен тех аминокислот, специфические (так называемые частные) пути превращения которых в организме человека и животных определяют во многих от ношениях его физиологическое состояние.

Обмен глицина и серина Глицин является единственной из всех входящих в состав белков амино кислот, в молекуле которой отсутствует асимметричный атом углерода.

Тем не менее метаболически он связан с химическими компонентами организма в большей степени, чем любая другая аминокислота.

Тканевые белки Глутатион Серин Муравьиная кислота Глюкоза (гликоген) Гиппуровая кислота Липиды ГЛИЦИН Креатин Гем (гемоглобин) Треонин Пурины (ДНК, РНК) H2O + СО2 + NН Желчные кислоты На схеме видно, что глицин в некоторых синтезах играет незаменимую роль, в частности в образовании белков, пуриновых нуклеотидов, гема гемоглобина, парных желчных кислот, креатина, глутатиона и др. Боль шинство этих реакций представлено в соответствующих разделах учебника.

Здесь укажем на реакции, при помощи которых осуществляются взаимо превращения глицина, серина и треонина, а также на реакции катаболизма глицина. Показано, что в реакции взаимопревращения глицина и серина участвует тетрагидрофолиевая кислота;

эту реакцию катализирует пири доксалевый фермент серин-оксиметилтрансфераза:

5 N, N -CH -ТГФK ТГФK Н2О Серин Глицин Имеются также доказательства взаимопревращения треонина и глицина в треонинальдолазной реакции:

Треонинальдолаза Треонин Глицин Основным путем катаболизма глицина 10в животных тканях, однако, считается распад его на СО2, NH3 и N5,N -метилентетрагидрофолиевую кислоту по уравнению:

+ ТГФК СO2 + NH3 + N5, N10–СН2-ТГФК Механизм этой реакции, недавно раскрытый К. Тада, включает участие митохондриальной глицинрасщепляющей ферментной системы, отличной от глицинсинтазы и состоящей из 4 белков: Р-белка, содержащего пиридоксальфосфат (глициндекарбоксилаза);

Н-белка, содержащего липое вую кислоту;

Т-белка, требующего присутствия ТГФК, и L-белка, назван ного липамиддегидрогеназой:

–H O +H O СO + Н2O –Н О ТГФК N5, N10–СН2-ТГФК + NH3 + + + НАД НАДН + Н Биологический смысл данного пути катаболизма глицина состоит, вероятнее всего, в образовании активного одноуглеродного фрагмента (N5, N10—СН2—ТГФК), используемого в уникальных реакциях синтеза ме тионина, пуриновых нуклеотидов, тимидиловой кислоты и др. Получены доказательства, что наследственная некетогенная глицинемия (повышение уровня глицина в крови) обусловлена недостаточностью Р- или Т-белка глицинрасщепляющей ферментной системы печени или мозга и что каждый из этих белков контролируется отдельным геном.

Серин легко превращается в пируват под действием сериндегидратазы.

В связи с этим в тканях имеются условия для превращения глицина (через серин) в пируват. Этим путем осуществляется участие глицина в обмене углеводов. Важную роль играет серин в биосинтезе сложных белков – фосфопротеинов, а также фосфоглицеридов. Помимо фосфатидилсерина, углеродный скелет и азот серина используются в биосинтезе фосфатидил этаноламина и фосфатидилхолина (см. главу 11).

Ряд других эссенциальных функций глицина, в частности участие в образовании -аминолевулиновой кислоты при синтезе порфиринов (гема) и пуриновых нуклеотидов, рассматривается далее (см. главу 13).

Обмен серосодержащих аминокислот В молекулах белка обнаружены три серосодержащие аминокислоты (ме тионин, цистеин и цистин), метаболически тесно связанные друг с другом.

Благодаря наличию в составе цистеина высокореактивной SH-группы в тканях легко осуществляется ферментативная окислительно-восстанови тельная реакция между цистеином и цистином *.

НАДН + Н+ НАД+ Цистеинредунтаза Цистин Цистеин Цистеин Дисульфидная связь часто образуется между двумя остатками цистеина внутри одной полипептидной цепи или между двумя полипептидными цепями, способствуя тем самым стабилизации молекулы белка. Цистеин является составной частью трипептида глутатиона, сокращенно обозна чаемого Г—SH, что подчеркивает функциональную значимость его тио группы и возможность образования дисульфидной связи окисленного глу татиона (Г—S—S—Г).

Известно, что многие ферменты содержат в активном центре SH-груп пы, абсолютно необходимые для каталитической реакции. При их окисле нии ферменты теряют свою активность. Предполагают, что одной из главных функций глутатиона является сохранение этих ферментов в ак тивной восстановленной форме. Окисленный глутатион может восстанав ливаться под действием глутатионредуктазы, используя НАДФН. Кроме того, глутатион может оказывать ингибирующее действие на некоторые белки. В частности, известная реакция инактивации инсулина под действием глутатионинсулинтрансгидрогеназы, в которой SH-глутатион является до нором водородных атомов, разрывающих дисульфидные связи между двумя полипептидными цепями молекулы инсулина. Установлена также коферментная функция глутатиона, в частности для глиоксилазы I. Ранее обсуждалось участие глутатиона в транспорте аминокислот через кле точную мембрану.

* Окисление цистеина в цистин возможно и неферментативным путем.

В процессе катаболизма сера метионина в тканях в основном переходит в серу цистеина, а взаимопревращение цистина в цистеин осуществляется легко. Поэтому проблема окисления серы всех аминокислот практически сводится к окислению цистеина. Главным путем оказался окислительный, включающий окисление цистеина в цистеинсульфиновую кислоту, транс аминирование последней с -кетоглутаратом и образование пирувата и сульфита по схеме:

Глу О Трансаминаза Цистеинди оксигеназа -Сульфи- Пируват Цистеин Цистеин нилпируват сульфинат Сульфит затем быстро окисляется в тканях и выводится с мочой в виде нетоксичных сульфатов и эфиросерных кислот. Использование цистеина и продуктов его окисления – цистеинсульфиновой и цистеиновой кислот – в образовании таурина рассмотрено ранее.

Метаболические пути превращения метионина в тканях значительно разнообразнее, чем пути превращения других серосодержащих аминокис лот;

тем не менее катаболизм метионина осуществляется через цистеин. Это превращение метионина в цистеин оказалось необратимым процессом.

Выяснилось также, что углеродный скелет цистеина происходит из другой аминокислоты, а именно серина. Фактическим донором метильных групп в реакциях трансметилирования является не свободный метионин, а так называемый активный метионин – S-аденозилметионин, который образу ется в процессе АТФ-зависимой реакции, катализируемой метионин аденозилтрансферазой.

АТФ PPi + Pi Н2О Метионин-аденозил трансфераза Метионин S-Аденозилметионин Своеобразие данной реакции заключается в том, что СН3-группа ме тионина активируется под действием положительного заряда соседнего атома серы. S-аденозилметионин участвует во всех реакциях, где метильная группа используется в биосинтетических реакциях: например, в синтезе адреналина, креатинина, тимина, фосфатидилхолина, бетаина и др. Об разовавшийся после отщепления метильной группы S-аденозилгомоцистеин подвергается гидролизу на аденозин и гомоцистеин;

последний исполь зуется в синтезе серина (это основной путь превращения) или служит акцептором метильной группы от N5—СН3—ТГФК в синтезе метионина (эту реакцию катализирует гомоцистеинметилтрансфераза), завершая, та ким образом, своеобразный цикл активирования метильной группы.

Метионин АТФ ТГФК N5–СН3-ТГФК PPi + Рi S-Аденозилметионин Гомоцистеин R Аденозин R-CH Н2О S-Аденозил гомоцистеин В качестве примера приводим схему биосинтеза креатина, в котором принимают участие три аминокислоты: аргинин, глицин и метионин.

Реакция синтеза протекает в две стадии. Первая стадия – биосинтез гуани динацетата – осуществляется в почках при участии глицин-амидинотранс феразы (КФ 2.1.4.1):

Глицинамидино трансфераза Гуанидинацетат Глицин Орнитин Аргинин Вторая стадия синтеза креатина протекает в печени при участии гуанидинацетатметилтрансферазы (КФ 2.1.1.2):

S-Аденозилметионин Гуанидинацетат Гуанидинацетат метилтрансфераза Аденозин S- Аденозилгомоцистеин Креатин АТФ Креатинфосфокиназа АДФ Гомоцистеин Pi Креатинфосфат Креатинин Креатин подвергается фосфорилированию с образованием креатин фосфата, который после дефосфорилирования (необратимая реакция) превращается в креатинин, выделяющийся с мочой.

Гомоцистеин может вновь превращаться в метионин путем мети лирования. Однако основной путь дальнейшего превращения гомоцис теина связан с его использованием в синтезе цистеина, который мо жет быть представлен в виде двух последовательных ферментативных реакций.

H2O H2O Цистеин Гомосерин Цистатионин Гомоцистеин Серин Ферменты, катализирующие синтез и распад цистатионина (циста тионин--синтаза и цистатионаза), содержат ПФ. Цистеин далее подвер гается окислению по описанному ранее пути, а гомосерин после транс аминирования с -кетоглутаратом превращается в -кетомасляную кис лоту;

последняя может также образоваться из цистатионина непосредствен но, минуя стадию гомосерина.

Обмен фенилаланина и тирозина Фенилаланин относится к незаменимым аминокислотам, поскольку ткани животных не обладают способностью синтезировать его бензольное коль цо. В то же время тирозин полностью заменим при достаточном по ступлении фенилаланина с пищей. Объясняется это тем, что основной путь превращения фенилаланина начинается с его окисления (точнее, гидрокси лирования) в тирозин (рис. 12.6). Реакция гидроксилирования катали зируется специфической фенилаланин-4-монооксигеназой, которая в ка честве кофермента содержит, как все другие гидроксилазы, тетрагидро биоптерин. Блокирование этой реакции, наблюдаемое при нарушении синтеза фенилаланин-4-монооксигеназы в печени, приводит к развитию тяжелой наследственной болезни – фенилкетонурии (фенилпировиноградная олигофрения). В процессе трансаминирования тирозин превращается в n-оксифенилпировиноградную кислоту, которая под действием специфи ческой оксидазы подвергается окислению, декарбоксилированию, гидро ксилированию и внутримолекулярному перемещению боковой цепи с об разованием гомогентизиновой кислоты;

эта реакция требует присутствия аскорбиновой кислоты, роль которой пока не выяснена. Дальнейшее превращение гомогентизиновой кислоты в малеилацетоуксусную кислоту катализируется оксидазой гомогентизиновой кислоты. Малеилацетоуксус ная кислота под действием специфической изомеразы в присутствии глу татиона превращается в фумарилацетоуксусную кислоту, подвергающуюся гидролизу с образованием фумаровой и ацетоуксусной кислот, дальнейшие превращения которых уже известны.

Катехоламины Дофамин +O +O Тирозин Диоксифенилаланин Фенилаланин (ДОФА) Трансаминирование n-Оксифенилпировино Фенилпировиноградная градная кислота Дофахром кислота СO CO2 CO Фенилуксусная Индол-5,6-хинон Гомогентизиновая кислота кислота Fe2+ Полимеризация L-глутамин Фенилацетилглутамин Меланин Малеилацетоуксусная кислота Фумаровая кислота Фумарилацетоуксусная кислота Ацетоуксусная кислота Рис. 12.6. Основные метаболические превращения фенилаланина и тирозина.

Цифры в кружках - участки блокирования реакций при фенилкетонурии (1), тирозинозе (2), альбинизме (3) и алкаптонурии (4).

Участие молекулы тирозина в биосинтезе гормонов щитовидной железы и катехоламинов подробно представлено в главе 8. Фенилаланин и тирозин являются также предшественниками меланинов. В этом важном биоло гическом процессе, обеспечивающем пигментацию кожи, глаз, волос, ак тивное участие принимает фермент тирозиназа.

Обмен триптофана Триптофан относится к незаменимым для человека и животных амино кислотам, поскольку является предшественником ряда важных биологи чески активных веществ, в частности серотонина и рибонуклеотида ни котиновой кислоты. Кроме того, один из его метаболитов, в частности индолилуксусная кислота, обладает ростстимулирующей актив ностью в отношении растений (ростовой фактор). В физиологических условиях более 95% триптофана окисляется по кинурениновому пути и не более 1% – по серотониновому (рис. 12.7). Серотонин в организме под вергается окислительному дезаминированию с образованием индолилук сусной кислоты, которая выделяется с мочой. Содержание этой кислоты в моче повышено при поражениях кишечника злокачественными карци ноидами, когда около 60% триптофана окисляется по серотониновому пути. Основной путь обмена триптофана приводит к синтезу НАД, умень шая потребность организма в витамине PP. Триптофан под действием гемсодержащего фермента триптофан-2,3-диоксигеназы в присутствии Антраниловая +O кислота Аланин Триптофан O 5-Окситриптофан Формилкинуренин Кинуренин СO O Серотонин Оксииндолилуксусная кислота Аланин Хинолиновая 2-Акролеил-3- 3-Оксиантра- 3-Оксикинуренин кислота амидофумарат ниловая кислота ФРПФ СО АТФ Глн АТФ Рибонуклеотид Рибонуклеотид Дезамидо-НАД хинолиновой никотиновой кислоты кислоты Рис. 12.7. Метаболические превращения триптофана.

молекулярного кислорода превращается в формилкинуренин, который рас падается при участии формамидазы (формилкинурениназы) на муравьиную кислоту и кинуренин;

последний окисляется в 3-оксикинуренин. Дальнейшие превращения 3-оксикинуренина связаны с пиридоксалевым ферментом кинурениназой, гидролизующей его на аланин и 3-оксиантраниловую кислоту, которая через ряд промежуточных продуктов (механизм обра зования их до конца не раскрыт) превращается в хинолиновую кислоту, т.е.

в непосредственный предшественник рибонуклеотида никотиновой кис лоты.

Обмен аминокислот с разветвленной цепью Катаболизм аминокислот с разветвленной цепью: лейцина, изолейцина и валина – преимущественно осуществляется не в печени (место распада большинства остальных аминокислот), а в мышечной и жировой тканях, в почках и ткани мозга. Сначала все три аминокислоты подвергаются трансаминированию с -кетоглутаратом под действием одного общего и специфического фермента – аминотрансферазы аминокислот с разветв ленной цепью (КФ 2.6.1.42) (не содержится в печени) с образованием соответствующих -кетокислот. Последующее окислительное декарбокси лирование -кетокислот приводит к образованию ацил-КоА-производных.

Лейцин -КГ Глу -Кетоизокапроат СO Ацил-КоА производ Изолейцин -Кето--метилва ные лериат жирных -Кетоизовалериат Валин кислот Аминотрансфераза Дегидрогеназ АМК с разветвлен- ный комплекс ной цепью -кетокислот с разветвлен ной цепью Следует отметить, что фермент, катализирующий окислительное де карбоксилирование указанных -кетокислот, высокоспецифичен (по ана логии с пируватдегидрогеназным и -кетоглутаратдегидрогеназным комп лексами) и также нуждается в присутствии всех пяти кофакторов (см. главу 10). Известно наследственное заболевание «болезнь кленового сиропа», при которой нарушено декарбоксилирование указанных -кетокислот (вслед ствие синтеза дефектного дегидрогеназного комплекса), что приводит не только к накоплению в крови аминокислот и -кетокислот, но и к их экскреции с мочой, издающей запах кленового сиропа. Болезнь встречается редко, проявляется обычно в раннем детском возрасте и приводит к нарушению функции мозга и летальному исходу, если не ограничить или полностью не исключить поступление с пищей лейцина, изолейцина и валина.

Обмен дикарбоновых аминокислот Классическими работами советских ученых А.Е. Браунштейна и С.Р. Мар дашева и американского биохимика А. Майстера доказана роль дикарбо новых аминокислот (глутаминовой и аспарагиновой кислот и их амидов – глутамина и аспарагина) в интеграции азотистого обмена в организме.

Система дикарбоновых аминокислот, к которой относят также соответст вующие -кетокислоты, теснейшим образом связана не только с азотистым метаболизмом в целом, но и с обменом липидов и углеводов. Ранее отмечалась особая роль дикарбоновых аминокислот и ферментов, ка тализирующих их превращения, в перераспределении азота в организме, дезаминировании и синтезе природных аминокислот (реакции трансде заминирования и трансреаминирования), в образовании конечных про дуктов белкового обмена – синтезе мочевины.

Основные катаболические пути превращения дикарбоновых амино кислот и их амидов могут быть представлены в виде следующих реакций:

NH Н2O NH Глутаминаза Глу-дегидрогеназа Глутамин Глутамат -Кетоглутарат Мочевина H2O Цит Орн NH Аспарагиназа Орнитиновый цикл Аспарагин Аспартат Фумарат Аспарагиновая кислота принимает непосредственное участие в орни тиновом цикле мочевинообразования, в реакциях трансаминирования и биосинтезе углеводов (гликогенная аминокислота), карнозина и ансерина, пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов (см. главу 14), а также в синтезе N-ацетиласпарагиновой кислоты в ткани мозга. Роль последней, содер жащейся в довольно высоких концентрациях в ткани мозга млекопи тающих, пока не выяснена.

Глутаминовая кислота, являющаяся гликогенной и заменимой амино кислотой для человека и животных, также включается в синтез ряда специфических метаболитов, в частности глутатиона и глутамина. Помимо участия в транспорте аммиака и регуляции кислотно-щелочного равно весия, глутамин – это незаменимый источник азота в ряде синтезов, в частности в биосинтезе пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, амино сахаров, в обезвреживании фенилуксусной кислоты (синтез фенилацетил глутамина) у человека и человекообразных обезьян, а также в синтезе Гистидин Триптофан Карбамоилфосфат ЦМФ п-Аминобензойная кислота L-глутамин -Кетоглутарамовая кислота АМФ Глюкозамин-6-фосфат ГМФ Аминокислоты Аспарагин НАД Рис. 12.8. Использование амидного азота глутамина для синтеза различных соеди нений в живых организмах.

витамина фолиевой кислоты (птероилглутаминовая кислота). На рис. 12. суммированы реакции синтеза ряда веществ, в которых амидный азот глутамина выполняет специфическую роль, незаменимую азотом других аминокислот *.

Глутамин и аспарагин оказались, кроме того, эссенциальными фак торами для роста некоторых нормальных и опухолевых клеток в культуре ткани;

они не могут быть заменены ни друг другом, ни соответствующими дикарбоновыми аминокислотами. Это свидетельствует о том, что в ус ловиях выращивания клеток в культуре ткани некоторые клетки теряют способность синтезировать эти амиды синтетазным или трансаминазным путем.

В лаборатории Майстера получены доказательства, что глутамин и аспарагин в животных тканях подвергаются сочетанному трансаминиро ванию и дезамидированию под влиянием специфических трансаминаз ами дов (глутаминтрансаминазы и аспарагинтрансаминазы) и неспецифической -амидазы:

* В указанных синтетазных реакциях участвует специфический класс ферментов - глу таминамидотрансферазы. Они содержат глутаминсвязывающий домен, содержащий консервативную АМК-последовательность и акцепторный домен с вариабельной областью для связывания второго субстрата. По своему механизму действия эти ферменты близки к глутаминазе (см. далее), однако последняя не нуждается во втором субстрате.

Н2О NH -Амидаза -Кетокис- Аспарагин L-AMK -Кетосук- Оксало лота цинамовая ацетат кислота Таким образом, в реакции переноса участвует -аминогруппа аспа рагина, а не амидная группа, как предполагали раньше;

в то же время амидная группа промежуточного соединения -кетосукцинамовой кислоты в дальнейшем освобождается в процессе гидролиза в виде аммиака.

Трансаминирование – обратимый процесс, поэтому лимитирующими фак торами в синтезе аспарагина (и глутамина) являются -амиды оксалоаце тата и -кетоглутаровой кислоты, синтез которых в животных тканях пока не доказан.

Глутаминовая кислота является одним из немногих соединений, помимо глюкозы, которые служат энергетическим материалом для ткани мозга.

Ранее была отмечена высокая активность в ткани мозга глутаматдекар боксилазы, катализирующей превращение глутамата в -аминомасляную кислоту (ГАМК). Дальнейшее последовательное окисление ГАМК вклю чает трансаминирование с образованием полуальдегида янтарной кислоты, окисление в янтарную кислоту и, наконец, окисление через ЦТК.

В обеих реакциях (декарбоксилирование глутамата и трансаминиро вание ГАМК) участвует пиридоксальфосфат, который оказался более проч но связанным с ГАМК-трансаминазой. ГАМК оказывает тормозящий эффект на синаптическую передачу в ЦНС, поэтому судорожные явления, наблюдаемые при недостаточности витамина В6, могут быть связаны со снижением образования ГАМК в глутаматдекарбоксилазной реакции.

У животных судороги могут быть вызваны также введением изониазида, который связывает альдегидную группу кофермента или антивитаминов В6, в частности метоксипиридоксина. ГАМК – естественно встречающийся «транквилизатор», поэтому одним из путей повышения ее концентрации в ЦНС является введение веществ, оказывающих тормозящее действие на ГАМК-трансаминазу, которая эффективно устраняет ГАМК.

В последние годы у бактерий и растений (но не в животных тканях) открыт совершенно новый путь синтеза глутаминовой кислоты из -кето глутаровой кислоты и глутамина. Этот путь, получивший название глута матсинтазного цикла, включает две сопряженные с распадом АТФ не обратимые реакции, ведущие к усвоению (ассимиляции) аммиака:

а) NН3 + Глутамат + АТФ –> Глутамин + АДФ + Pi б) Глутамин + -Кетоглутарат + НАДФН + Н+ –> 2Глутамат + НАДФ+ NH3 + -Кетоглутарат + НАДФН + Н+ + АТФ –> Глутамат + НАДФ+ + АДФ + Pi Первую стадию (а) катализирует глутаминсинтетаза, которая имеется в клетках животных, вторую (б) – глутаматсинтаза, открытая только у растений, грибов и микроорганизмов. Обе стадии могут быть представлены вместе с обратимо действующей глутаматдегидрогеназной реакцией (в) в виде следующей схемы:

НАД(Ф)+ Глутамат Глутамат NН3 + АТФ АДФ + Рi Глутамин -Кетоглутарат NН3 + НАД(Ф)Н + Н+ Оказалось, что при низких концентрациях аммиака, характерных для растений и микроорганизмов, реакции протекают преимущественно по глутаматсинтазному циклу, а при высоких его концентрациях, свойствен ных тканям животных,– по глутаматдегидрогеназному пути;

в обоих слу чаях синтезируется глутамат.

В сводной схеме обобщены главные интегративные пути превращения глутамина и глутаминовой кислоты и приведены названия ферментов, катализирующих эти реакции в тканях (рис. 12.9).

С метаболизмом глутаминовой кислоты связаны также пути обмена пролина и аргинина (см. рис. 12.9), хотя следует напомнить, что аргинин относится к частично незаменимым аминокислотам организма, особенно в молодом возрасте, когда его синтез из глутамата не может обеспечить потребности быстрого роста организма. Основным путем метаболизма ЦТК -Кетоглутарамат -Кетоглутарат АМК АМК NH3 Карбамоил-Ф Кетокислоты Кетокислоты Apг Про Гис Транспорт -Аминобутират Глутамат Глутамин амидного N N-ацетил-Глу 5-Оксопролин Цис Карбамоил-Ф АМК Асн Цис-Гли Пурин [N3,9] -Глу-АМК v-Глу-цис ЦТФ Гли ГМФ НАД Фенилацетил-Глн Глюкозамин-6-Ф АМК -Глу-Цис-Гли [глутатион] Рис. 12.9. Метаболические превращения глутамата и глутамина в тканях животных (схема по Майстеру).

1 - реакции цикла лимонной кислоты;

2 - глутаматдегидрогеназа;

3 - глутаматтрансаминаза;

4 - глутаминсинтетаза;

5 - глутаминаза;

6 - глутаминтрансаминаза;

7 - карбамоилфосфатсинте таза (печень);

8 - -амидаза;

9 - -глутамилцистеинсинтетаза;

10 - глутатионсинтетаза;

11 - глутамилтрансфераза;

12 - -глутамилциклотрансфераза;

13 - 5-оксопролиназа;

14 - цистеинил глициназа;

15 - глутаматдекарбоксилаза;

16 - глутамат-N-ацетилаза;

17 - ферменты, катализи рующие распад этих аминокислот;

18 - амидотрансферазы глутамина;

19 - глутамин-фенилаце тилтрансфераза.

аргинина является путь синтеза мочевины. Более специфичен и необратим путь превращения гистидина (также частично незаменимая для животных аминокислота) в глутаминовую кислоту. В этом превращении участвуют два хорошо изученных фермента – гистидинаммиаклиаза (гистидаза), ка тализирующая внутримолекулярное дезаминирование гистидина, и урока ниназа, которая катализирует разрыв имидазольного кольца уроканиновой кислоты с образованием имидазолилпропионовой кислоты;

последняя через формиминоглутамат превращается в глутаминовую кислоту. Другие пути обмена гистидина (образование гистамина и окисление его под действием диаминоксидазы) были рассмотрены ранее.

ПАТОЛОГИЯ АЗОТИСТОГО ОБМЕНА Азотистый обмен связан преимущественно с обменом белков, структур ными единицами которых являются аминокислоты. Поэтому далее пред ставлены накопленные к настоящему времени данные о нарушениях обмена отдельных аминокислот при патологии. Повышенный интерес биохимиков, физиологов и клиницистов к проблемам патологии обмена аминокислот объясняется рядом обстоятельств. Во-первых, имеются экспериментальные доказательства и клинические наблюдения о развитии патологического синдрома, в основе которого лежат нарушения нормального пути обмена отдельных аминокислот в организме. Во-вторых, в последнее время амино кислоты и их производные нашли широкое применение в клинической практике в качестве лекарственных средств: например, метионин исполь зуется для лечения ряда болезней печени, глутаминовая кислота – некоторых поражений мозга, глутамин – кетонурии и т.д. Наконец, ряд аминокислот и продукты их декарбоксилирования (биогенные амины) оказывают регулирующее влияние на многие физиологические функции организма. Следовательно, знание закономерностей обмена отдельных аминокислот в норме и особенно при патологии представляет исклю чительный научно-теоретический и практический интерес.

О нарушении обмена аминокислот в целостном организме судят не только по количественному и качественному составу продуктов их обмена в крови и моче, но и по уровню самих свободных аминокислот в био логических жидкостях организма. Большинство тканей характеризуется своеобразным аминокислотным «спектром». В плазме крови он примерно соответствует аминокислотному составу свободных аминокислот в органах и тканях, за исключением более низкого содержания глутамата и аспартата и более высокого уровня глутамина, на долю которого приходится до 25% от общего количества аминокислот. Цереброспинальная жидкость отли чается меньшим содержанием почти всех аминокислот, кроме глутамина.

Аминокислотный состав мочи резко отличается от аминокислотного соста ва плазмы крови. Оказывается, у человека, получающего полноценное питание, аминокислотный состав мочи более или менее постоянен изо дня в день, но у разных людей с почти одинаковым аминокислотным составом плазмы состав аминокислот в моче может оказаться совершенно раз личным.

Природу нарушений процессов обмена при недостаточности какой-либо аминокислоты трудно установить экспериментально, поскольку при этом изменяется весь процесс биосинтеза белка, подчиняющийся закону «все или ничего». Специфические проявления недостаточности аминокислот могут развиваться у человека только в условиях патологии при повышенном использовании данной аминокислоты. Так, у больных с карциноидной опухолью более 60% триптофана окисляется по серотониновому пути (в норме 1%);

это, естественно, приводит к относительной недостаточности указанной аминокислоты. У больных со злокачественной меланомой ти розин и, возможно, фенилаланин расходуются преимущественно на био синтез меланина. В связи с возможностью приготовления искусственных рационов (исключение из рациона человека и животных какой-либо амино кислоты) можно описать синдром, характерный для недостаточности дан ной аминокислоты. Так, недостаток триптофана у человека ведет к умень шению массы тела, а у новорожденного даже 10-дневный дефицит трипто фана приводит к анорексии и гипопротеинемии. У крыс отмечаются выпадение зубов, шерсти, помутнение роговицы и развитие катаракты, а у цыплят – увеличение потребности в витамине PP. Недостаток лизина у человека вызывает головокружение, тошноту, повышенную чувствитель ность к шуму;

недостаток гистидина сопровождается снижением кон центрации гемоглобина. При недостаточности аргинина у крыс наблю дается атрофия семенников, а у человека – гипоспермия. Исключение из пищи метионина ведет к жировому перерождению печени и почек, обуслов ленному недостатком лабильных метильных групп, необходимых для синтеза фосфатидилхолинов.

Некоторые заменимые аминокислоты становятся незаменимыми, если они не поступают с пищей, так как клетки организма не справляются с быстрым их синтезом. По данным Р. Фишера, недостаток цистеина ведет к почти полному торможению роста in vitro даже при наличии всех остальных аминокислот в среде. Доказано, кроме того, что достаточное количество цистеина в пище значительно снижает потребности в метионине (см. табл. 12.2). Напротив, полное исключение цистеина из рациона может настолько резко повысить потребности в метионине, что обычно адекват ное питание оказывается недостаточным. Таким образом, заменимые аминокислоты могут оказаться лимитирующими факторами анаболических процессов в организме.

Одно из характерных нарушений азотистого обмена – белковая недоста точность, являющаяся следствием не только дефицита белка, но и ряда тяжелых заболеваний даже при достаточном поступлении белка с пищей.

Белковая недостаточность у человека развивается как при полном и частичном голодании, так и при приеме однообразного белкового питания, когда в диете преобладают белки растительного происхождения, био логическая ценность которых значительно ниже ценности белков животного происхождения. Результатом этих состояний являются развитие отрица тельного азотистого баланса, гипопротеинемии (снижение концентрации белков в сыворотке крови до 50–30 г/л;

в норме 65–85 г/л) и нарушения коллоидно-осмотического и водно-солевого обмена (развитие отеков). При тяжелых формах пищевых дистрофий, например при квашиоркоре – заболе вании, довольно распространенном среди детей в развивающихся странах, наблюдаются тяжелые поражения печени, остановка роста, резкое снижение сопротивляемости организма инфекциям, отечность, атония мышц. Болезнь часто заканчивается летальным исходом.

Количественному учету при белковой недостаточности в основном поддаются нарушения, связанные с обменом аминокислот. Одним из наиболее ранних нарушений азотистого обмена при белковой недоста точности является резкое снижение интенсивности процессов дезамини рования, трансаминирования и биосинтеза аминокислот, а также синтеза мочевины в печени. Оказалось, что эти нарушения обусловлены недоста точным синтезом и разрушением белковой части ферментов, катализи рующих эти реакции;

исключение составляет аргиназа, активность которой при этом почти не нарушена. Следствием указанных нарушений являются накопление значительных количеств аминокислот в крови, экскреция с мочой свободных аминокислот (до 10–20 г/сут;

в норме около 1 г/сут) и резкое снижение образования и выделения мочевины с мочой.

При белковой недостаточности, помимо нарушений общих процессов аминокислотного обмена, отмечены специфические изменения обмена от дельных аминокислот. Так, нарушения обмена триптофана выражаются как в снижении синтеза никотинамида, так и в накоплении в организме 3-оксиантраниловой и ксантуреновой кислот. Последняя, по некоторым данным, оказывает токсическое действие на -клетки панкреатических островков, являясь тем самым одним из патогенетических факторов диабета. Нарушения в обмене гистидина сводятся к снижению активности гистидин-аммиак-лиазы и гистаминазы и, напротив, к повышению ак тивности гистидиндекарбоксилазы. Все это способствует накоплению гистамина в тканях со всеми вытекающими отсюда отрицательными последствиями. При белковой недостаточности обмен метионина прак тически не нарушен. Все эти данные свидетельствуют о дискоординации ферментных систем обмена аминокислот, что в значительной степени затрудняет терапевтические подходы к устранению последствий белковой недостаточности.

Аминоацидурия. Качественный и количественный состав аминокислот мочи человека имеет прежде всего диагностическое значение, поскольку некоторые болезни человека возникают вследствие первичного нарушения обмена отдельной аминокислоты или группы аминокислот. Кроме того, для ряда органических поражений органов и тканей человека, а также аномалий обмена характерен свой аминокислотный спектр мочи. Ввиду этого, а также благодаря легкой доступности объекта исследования анализ мочи на наличие аминокислот приобретает большое клиническое значение.

На экскрецию аминокислот большое влияние оказывают возраст, характер питания, пол, гормоны и другие факторы. Установлено, что у младенцев с мочой выделяется больше аминокислот, чем у взрослых. Обычно раз личают повышенную и пониженную экскрецию аминокислот. В свою очередь гипераминоацидурия делится на почечную, связанную с приобре тенными или врожденными дефектами реабсорбции аминокислот в почках, и внепочечную, обусловленную увеличением концентрации всех или от дельных аминокислот в крови (см. главу 18).

Как известно, обратное всасывание аминокислот (реабсорбция) в почках происходит против градиента концентрации;

в своей основе этот процесс, вероятнее всего, является ферментативным, однако детально он пока не выяснен. При хронических нефритах часто с мочой выделяется больше лизина, аргинина, пролина и цитруллина, хотя их уровень в крови может оставаться в пределах нормы. При нефрозах почти всегда выделяется больше этаноламина, таурина и -аминомасляной кислоты, и эта гипер аминоацидурия считается неблагоприятным прогностическим признаком.

Значительно чаще встречаются наследственные дефекты всасывания аминокислот в почках. Одним из хорошо известных заболеваний считается цистиноз, который рядом авторов отождествляется с синдромом Абдер гальдена–Фанкони как по клиническим и биохимическим проявлениям, так и по характеру наследственной передачи болезни. Основной метаболи ческий дефект в обоих случаях связан с врожденным нарушением ре абсорбции почти всех аминокислот (за исключением циклических) в ка нальцах почек;

следствием этого являются увеличение в 5–10 раз экскреции аминокислот, в 20–30 раз – цистина и цистеина и избирательное отложение цистина в ретикулярных клетках костного мозга, селезенке, печени и клет ках роговицы глаза. Интересно, что при цистинозе образования камней почти не происходит в отличие от другого врожденного нарушения об мена – цистинурии, при которой всегда образуются цистиновые камни.

Сущность дефекта реабсорбции аминокислот при цистинозе не выяснена.

Цистинурия – довольно распространенное наследственное заболевание.

Метаболический дефект выражается в выделении с мочой в 50 раз больше нормы количества 4 аминокислот: цистина, лизина, аргинина и орнитина.

Уровень цистина в крови обычно не выше нормальных величин. Люди, страдающие цистинурией, вполне здоровы, за исключением тенденции к образованию в организме камней. Эта врожденная аномалия обмена обусловлена полным блокированием реабсорбции цистина и частичным нарушением всасывания трех других аминокислот в почках;

нарушений в промежуточном обмене этих аминокислот при этом не выявлено.

При другом наследственном пороке обмена – гепатоцеребралъной ди строфии (болезнь Вильсона), помимо генерализованной (общей) гипер аминоацидурии, отмечаются снижение концентрации медьсодержащего белка церулоплазмина в сыворотке крови и отложение меди в мозге, печени, почках. Генетический дефект связан с нарушением синтеза церулоплазмина.

Возможно образование комплексов меди с аминокислотами, которые не всасываются в канальцах. Аналогичная гипераминоацидурия наблюдается при галактоземии, синдроме Лоу и других наследственных заболеваниях.

Пониженная экскреция аминокислот описана при квашиоркоре.

Врожденные нарушения обмена отдельных аминокислот. Пристальное внимание ученых привлекают некоторые наследственные заболевания че ловека, являющиеся следствием первичного дефекта обмена отдельных аминокислот. Возникновение и дальнейшее развитие специфического па тологического синдрома при таких заболеваниях обусловлено полным или частичным отсутствием активности определенных ферментов: организм либо теряет способность синтезировать данный фермент, либо образуется недостаточное количество его, либо синтезируется аномальный фермент, отличающийся по структуре от нативного. Следствием такого врожденного дефекта обмена является накопление в тканях нормальных промежуточных или побочных (неспецифических) продуктов обмена, оказывающих токси ческое влияние на организм и в первую очередь на ЦНС. Этим, пожалуй, объясняется тот факт, что в основном заболевают дети в раннем возрасте, у которых затем развиваются специфические расстройства психической деятельности. Весьма вероятно также, что отдельные аминокислоты и продукты их обмена в оптимальных концентрациях являются эссенциаль ными для деятельности мозга. Поэтому задача биохимиков, физиологов и клиницистов состоит в том, чтобы выяснить зависимость между раз витием патологического синдрома при врожденных «пороках» обмена и специфическими нарушениями обмена аминокислот. Приводим примеры подобных нарушений.

Фенилкетонурия (фенилпировиноградная олигофрения) развивается как результат потери способности организма синтезировать фенилаланин-4 монооксигеназу, катализирующую превращение фенилаланина в тирозин.

Характерные особенности болезни – резкое замедление умственного раз вития ребенка, а также экскреция с мочой больших количеств фенил пировиноградной кислоты (до 1–2 г/сут) и фенилацетилглутамина (до 2–3 г/сут). Решающим доказательством метаболического блока при фенил кетонурии являются данные о накоплении фенилаланина в тканях. Так, количество его в крови может достигать 600 мг/л (в норме 15 мг/л), в цереброспинальной жидкости – 80 мг/л (в норме 1,5 мг/л). Развитие бо лезни можно предотвратить, если значительно снизить прием фенилала нина с пищей с самого рождения ребенка.

Алкаптонурия характеризуется экскрецией с мочой больших количеств (до 0,5 г/сут) гомогентизиновой кислоты, окисление которой кислородом воздуха придает моче темную окраску. В далеко зашедших случаях раз виваются охроноз, наблюдаются отложение пигмента в тканях и по темнение носа, ушей и склеры. Эта болезнь известна с девнейших времен, однако только в 1962 г. были получены доказательства, что метаболический дефект при алкаптонурии связан с врожденным отсутствием в печени и почках оксидазы гомогентизиновой кислоты.

Альбинизм – врожденное отсутствие пигментов в коже, волосах и сет чатке. Метаболический дефект связан с потерей меланоцитами способности синтезировать тирозиназу – фермент, катализирующий окисление тирозина в диоксифенилаланин и диоксифенилаланинхинон, являющихся предшест венниками меланина. Предположение о блокировании процесса полиме ризации меланина при альбинизме не подтвердилось.

Болезнь Хартнупа характеризуется специфическими нарушениями об мена триптофана. Основным проявлением болезни, помимо пеллагро подобных кожных поражений, психических расстройств и атаксии, служит гипераминоацидурия. Поскольку с мочой выделяются в повышенных ко личествах индолилацетат, индолилацетилглутамин и индикан, но нормаль ное количество индолилмолочной кислоты, очевидно, метаболический блок связан с первой реакцией нормального пути обмена триптофана, и обмен преимущественно идет по пути декарбоксилирования. При другом наслед ственном пороке обмена аминокислот с разветвленной цепью – болезни кленового сиропа и при фенилкетонурии также экскретируется индолил ацетат, но в этих случаях он имеет своим источником индолилпируват, так как параллельно с мочой выделяется в больших количествах индолил молочная кислота, которая может образоваться только из фенилпирувата.

Согласно новым данным, при болезни Хартнупа метаболический дефект связан с врожденным нарушением всасывания триптофана в кишечнике и реабсорбции триптофана и продуктов его обмена в почках. Из этого следует, что по химическому составу индолилпроизводных в моче и крови можно судить о природе болезни (карциноидная опухоль, фенилкетонурия и др.) и о механизме нарушения обмена триптофана, что важно для постановки правильного диагноза и проведения адекватного лечения.

В ряде случаев вследствие блокирования действия какого-либо фермента имеет место резкое отставание умственного развития. Вопрос о том, чем обусловлено это торможение психической деятельности: токсическим действием ненормально высоких концентраций аминокислот или их ме таболитов на мозг, нарушением нормального соотношения аминокислот и, следовательно, биосинтеза белка либо вторичными нарушениями энерге тического и других видов обмена – окончательно не решен. Таким образом, идентификация химической реакции или ферментативной системы, нару шение функции которой является первопричиной развития тяжелого на следственного заболевания, в наши дни не только представляет большой теоретический интерес, но в ряде случаев играет решающую роль в диагностике и терапии этих болезней. Всегда следует учитывать, что при блокировании нормального пути обмена какой-либо аминокислоты про межуточные метаболиты, следующие за местом блокирования, становятся незаменимыми при данном заболевании.

Глава ОБМЕН СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ В данной главе будут рассмотрены современные представления о био синтезе и распаде простетических групп только двух классов сложных белков – нуклеопротеинов и хромопротеинов, белковые компоненты ко торых подвергаются превращениям, свойственным всем белкам.

ОБМЕН НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Нуклеиновые кислоты составляют существенную небелковую часть слож ного класса органических веществ, получивших название нуклеопротеинов (см. главу 2);

последние являются основой наследственного аппарата клетки хромосом. Белковые компоненты нуклеопротеинов подвергаются много образным превращениям, аналогичным метаболизму белков и продуктов их распада – аминокислот, подробно рассмотренному в главе 12. О нук леиновых кислотах, их структуре и функциях в живых организмах в последнее время накоплен огромный фактический материал, подробно рассмотренный в ряде специальных руководств и монографий. Помимо уникальной роли нуклеиновых кислот в хранении и реализации наслед ственной информации, промежуточные продукты их обмена, в частности моно-, ди- и трифосфатнуклеозиды, выполняют важные регуляторные функции, контролируя биоэнергетику клетки и скорость метаболических процессов. В то же время нуклеиновые кислоты не являются незаменимыми пищевыми факторами и не играют существенной роли в качестве энер гетического материала. Далее детально рассматриваются (помимо крат кого изложения вопросов переваривания) проблемы метаболизма нук леиновых кислот и их производных, в частности пути биосинтеза и распада пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, современные представления о биогенезе ДНК и РНК и их роли в синтезе белка.

Переваривание нуклеопротеинов и всасывание продуктов их распада осуществляются в пищеварительном тракте. Под влиянием ферментов желудка, частично соляной кислоты, нуклеопротеины пищи распадаются на полипептиды и нуклеиновые кислоты;

первые в кишечнике подвергаются гидролитическому расщеплению до свободных аминокислот. Распад нуклеиновых кислот происходит в тонкой кишке в основном гидроли тическим путем под действием ДНК- и РНКазы панкреатического сока.

Продуктами реакции при действии РНКазы являются пуриновые и пи римидиновые мононуклеотиды, смесь ди- и тринуклеотидов и резистентные к действию РНКазы олигонуклеотиды. В результате действия ДНКазы образуются в основном динуклеотиды, олигонуклеотиды и небольшое количество мононуклеотидов. Полный гидролиз нуклеиновых кислот до стадии мононуклеотидов осуществляется, очевидно, другими, менее изу ченными ферментами (фосфодиэстеразами) слизистой оболочки кишечника.

В отношении дальнейшей судьбы мононуклеотидов существует два предположения. Считают, что мононуклеотиды в кишечнике под действием неспецифических фосфатаз (кислой и щелочной), которые гидролизируют фосфоэфирную связь мононуклеотида («нуклеотидазное» действие), рас щепляются с образованием нуклеозидов и фосфорной кислоты и в таком виде всасываются. Согласно второму предположению, мононуклеотиды всасываются, а распад их происходит в клетках слизистой оболочки кишечника. Имеются также доказательства существования в стенке ки шечника нуклеотидаз, катализирующих гидролитический распад моно нуклеотидов. Дальнейший распад образовавшихся нуклеозидов осуществ ляется внутри клеток слизистой оболочки преимущественно фосфороли тическим, а не гидролитическим путем *.

Всасываются преимущественно нуклеозиды, и в таком виде часть азотистых оснований может быть использована для синтеза нуклеиновых кислот организма. Если происходит дальнейший распад нуклеозидов до свободных пуриновых и пиримидиновых оснований, то гуанин не ис пользуется для синтетических целей. Другие основания, как показывают опыты с меченными по азоту аденином и урацилом, в тканях могут включаться в состав нуклеиновых кислот. Однако экспериментальные данные свидетельствуют, что биосинтез азотистых оснований, входящих в состав нуклеиновых кислот органов и тканей, протекает преимуществен но, если не целиком, de novo из низкомолекулярных азотистых и без азотистых предшественников.

Таким образом, синтез нуклеиновых кислот, мономерными единицами которых являются мононуклеотиды, будет определяться скоростью синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов;

синтез последних в свою оче редь зависит от наличия всех составляющих из трех компонентов. Ис точником рибозы и дезоксирибозы служат продукты превращения глюкозы в пентозофосфатном цикле. Пока не получены доказательства существен ной роли пищевых пентоз в синтезе нуклеиновых кислот. Фосфорная кислота также не является лимитирующим фактором, поскольку она поступает в достаточном количестве с пищей. Следовательно, биосинтез нуклеиновых кислот начинается с синтеза азотистых оснований (точнее, мономерных молекул – мононуклеотидов).

Биосинтез пуриновых нуклеотидов Пуриновые основания, образующиеся в процессе переваривания нуклеино вых кислот в кишечнике, в дальнейшем практически не используют ся, поэтому их синтез осуществляется из низкомолекулярных предшест венников, продуктов обмена углеводов и белков. Впервые работами Дж. Бьюкенена, Дж. Гринберга экспериментально доказано включение ря 15 14 да меченых атомов, в частности N- и С-глицина, N-аспартата, N-глутамина и др., в пуриновое кольцо мочевой кислоты. Скармливая птицам эти и другие меченые соединения, Дж. Бьюкенен анализировал места включения метки в пуриновое кольцо;

полученные данные были в дальнейшем уточнены и подтверждены рядом других исследователей.

Результаты этих исследований можно представить в виде схемы:

* В животных тканях открыты специфические нуклеозидфосфорилазы, действующие на нуклеозиды.

Глицин СО N5, N10=СН–ТГФК Аспартат N10–СНО–ТГФК Амидный азот глутамина Из схемы видно, что 4-й и 5-й атомы углерода и 7-й атом азота в ядре имеют своим источником глицин. Два атома азота (N-3 и N-9) происходят из амидной группы глутамина, один атом азота (N-1) – из азота аспара гиновой кислоты;

углеродный атом (С-2) происходит 10 углерода N10-фор из мил-ТГФК, атом углерода в 8-м положении – из N5,N -метенил-ТГФК и, наконец, углерод С-6 имеет своим источником СО2.

В настоящее время благодаря исследованиям Дж. Бьюкенена, Дж. Грин берга, А. Корнберга и сотр. полностью расшифрована последовательность включения перечисленных веществ в пуриновое кольцо, установлена при рода всех промежуточных соединений и ферментных систем, катализи рующих химические реакции синтеза. Интересным оказался факт почти полного совпадения путей синтеза пуриновых оснований в печени животных и у микроорганизмов, в частности у Е. coli и Neurospora crassa. Следует, однако, отметить, что конечным результатом синтеза оказалось не сво бодное пуриновое основание, а рибонуклеотид – инозиновая кислота (ИМФ), из которой далее синтезируются АМФ и ГМФ. На схеме пред ставлена последовательность всех 11 химических реакций этого синтеза с указанием ферментных систем, коферментов, источников энергии и других известных к настоящему времени кофакторов (см. с. 472).

Как видно из приведенной схемы, синтез инозиновой кислоты на чинается с D-рибозо-5-фосфата, который, как известно, является продуктом пентозофосфатного цикла и на который переносится в необычной реакции пирофосфатная группа АТФ. Образовавшийся 5-фосфорибозил-1-пирофос фат (ФРПФ) взаимодействует с глутамином, являющимся донором NH2-группы, в результате чего образуется -5-фосфорибозил-амин, причем в процессе реакции наряду с освобождением пирофосфата и свободной глутаминовой кислоты происходит изменение его конфигурации (из - в -).

Таким образом, данная стадия становится ключевой реакцией в синтезе пуринов. На следующей стадии присоединяется вся молекула глицина к свободной NH2-группе -5-фосфорибозил-амина (реакция нуждается в доставке энергии АТФ) с образованием глицинамидрибонуклеотида. Затем, на следующей 5стадии, цепь удлиняется за счет присоединения формильной группы из N,N10-метенил-ТГФК с образованием формилглицинамид рибонуклеотида. На формильную группу последнего переносится далее амидная группа глутамина и синтезируется формилглицинамидинрибо нуклеотид (реакция также идет с потреблением энергии АТФ). На сле дующей стадии замыкается пятичленное имидазольное кольцо и образуется 5-аминоимидазолрибонуклеотид, который способен акцептировать СО с образованием рибонуклеотида 5-аминоимидазол-4-карбоновой кислоты.

Рибозо-5-фосфат 5-Фосфорибозил- 5-Фосфорибозиламин -1-пирофосфат (ФРПФ) N-формилглицин N-формилглицинамид- Глицинамидрибо амидинрибонуклеотид рибонуклеотид нуклеотид 5-Аминоимидазол- Рибонуклеотид-5-ами- 5-Аминоимидазол-4-N-сукцино рибонуклеотид ноимидазол-4-карбо- карбоксамидрибонуклеотид новой кислоты Инозиновая 5-Формамидоимидазол- 5-Аминоимидазол-4-кар кислота (ИМФ) -4-карбоксамидрибонуклеотид боксамидрибонуклеотид В последующем двухступенчатом процессе, в котором участвуют аспа рагиновая кислота и АТФ, образуется 5-аминоимидазол-4-карбоксамид рибонуклеотид и освобождается фумаровая кислота. В этих реакциях азот аспарагиновой кислоты включается в 1-е положение будущего пуринового ядра. Последний углеродный атом пиримидинового остатка кольца пурина вводится в виде формильного остатка (источник N10-формил-ТГФК), ко торый присоединяется к 5-NH2-группе. После этого отщепляется молекула воды и второе кольцо замыкается. В результате образуется первый пу риновый нуклеотид – инозиновая кислота (ИМФ), которая является пред шественником пуриновых нуклеотидов в составе нуклеиновых кислот.

АМФ и ГМФ образуются из ИМФ, причем в синтезе обоих моно нуклеотидов участвуют по два фермента, различных по своему механизму действия. Образование ГМФ из ИМФ катализируют ИМФ-дегидрогеназа и ГМФ-синтетаза, а образование АМФ из того же предшественника катализируется последовательным действием аденилосукцинатсинтетазы и аденилосукцинат-лиазы. Механизм двухэтапного синтеза АМФ и ГМФ можно представить в виде химических реакций.

НАД+ ГТФ Асп Н2О- ИМФ дегид- Инозиновая Мg2+ Аденилосунцинат синтетаза роге- нислота (ИМФ) НАДН + Н+ наза Рi + ГДФ Ксантиловая кислота АТФ Глн Мg2+ Аденилоянтарная кислота ГМФ синтетаза Аденилосук цинатлиаза Глу PPi + АМФ Фумаровая кислота ГМФ АМФ В ферментативном синтезе АМФ из ИМФ специфическое участие при нимает аспарагиновая кислота, являющаяся донором NH2-группы, и ГТФ в качестве источника энергии;

промежуточным продуктом реакции является аденилоянтарная кислота. Биосинтез ГМФ, напротив, начинается с де гидрогеназной реакции ИМФ с образованием ксантозиловой кислоты;

в аминировании последней используется только амидный азот глутамина.

Превращение АМФ и ГМФ в соответствующие нуклеозидди- и нуклео зидтрифосфаты также протекает в 2 стадии при участии специфических нуклеозидмонофосфат- и нуклеозиддифосфаткиназ *:

ГМФ + АТФ <=> ГДФ + АДФ;

ГДФ + АТФ <=> ГТФ + АДФ.

* Следует напомнить, что основным механизмом синтеза самого АТФ из АДФ и не органического фосфата в живых организмах является окислительное фосфорилирование (см.

главу 9).

Следует указать на существование в клетках весьма тонкого механизма регуляции синтеза пуриновых нуклеотидов. Синтез их тормозится ко нечными продуктами по принципу обратной связи, т.е. ингибированием первой стадии переноса аминогруппы глутамина на ФРПФ. Фермент, катализирующий эту стадию, оказался аллостерическим регуляторным ферментом. Вторая особенность механизма регуляции заключается в том, что избыток ГМФ в клетках оказывает аллостерическое торможение только на свой собственный синтез, не влияя на синтез АМФ, и, наоборот, накопление АМФ подавляет свой синтез, не ингибируя синтеза ГМФ.

Аденин Гипоксантин Гуанин ФРПФ ФРПФ ФРПФ Аденозин Гуанин (гипоксантин) фосфорибозил фосфорибозил трансфераза трансфераза РРi PPi РРi АМФ ИМФ ГМФ Биосинтез пиримидиновых нуклеотидов Механизм синтеза пиримидиновых нуклеотидов почти полностью рас шифрован благодаря исследованиям П. Рейхарда. Показано, что в клетках животных и в микроорганизмах конечными продуктами синтеза также не являются свободные пиримидиновые основания и остаток рибозы при соединяется к уже сформировавшемуся пиримидиновому кольцу. Синтез начинается с элементарных уровней (СО2, NH3, аспартат), и специфическую ключевую роль выполняет оротовая кислота.

Последовательность химических реакций синтеза пиримидиновых нук леотидов, в частности УМФ, можно представить в следующем виде:

Аспартаткарбамоил Глн трансфераза Глу Карбамоилфосфат Аспартат Дигидрооротат Дигидрооротаза дегидрогеназа N- карбамоиласпартат Дигидрооротовая Оротовая кислота кислота Оротат-фосфо ОМФ-декарбоксилаза рибозилтранс фераза Уридин-5'-фосфат (УМФ) Оротидин-5'-фосфат (ОМФ) Как видно, I стадия синтеза УМФ включает катализируемое цито плазматической карбамоилфосфатсинтетазой образование карбамоилфос фата из глутамина (см. главу 12).

На II стадии карбамоилфосфат реагирует с аспартатом, в результате чего образуется N-карбамоиласпарагиновая кислота. Последняя подвер гается циклизации (под действием дигидрооротазы) с отщеплением мо лекулы воды, при этом образуется дигидрооротовая кислота, которая, подвергаясь дегидрированию, превращается в оротовую кислоту. В этой реакции участвует специфический НАД-содержащий фермент дигидро оротатдегидрогеназа. Оротовая кислота обратимо реагирует с ФРПФ, являющимся донатором рибозо-фосфата, с образованием оротидин-5'-фос фата (ОМФ). Декарбоксилирование последнего приводит к образованию первого пиримидинового нуклеотида – уридин-5-фосфата (УМФ).

Превращение УМФ в УДФ и УТФ осуществляется, как и пуриновых нуклеотидов, путем фосфотрансферазных реакций:

УМФ + АТФ <=> УДФ + АДФ;

УДФ + АТФ <=> УТФ + АДФ.

Биосинтез цитидиловых нуклеотидов. Предшественником цитидиловых нуклеотидов является УТФ, который превращается в ЦТФ:

Мg2+ УТФ + Глн + АТФ ЦТФ + Глу + АДФ + Рi.

ЦТФ-синтетаза У прокариот в этой реакции используется преимущественно свободный аммиак, в то время как в клетках животных ЦТФ-синтетаза катализирует включение амидной группы глутамина в 4-е положение пиримидинового кольца УТФ. Следует отметить, что образующийся ЦТФ служит от рицательным эффектором регуляторного аллостерического фермента ас партаткарбамоилтрансферазы, ингибируя по типу обратной связи началь ную стадию биосинтеза пиридиновых нуклеотидов. АТФ предотвращает это ингибирование.

Биосинтез тимидиловых нуклеотидов. Тимидиловые нуклеотиды входят в состав ДНК, содержащей дезоксирибозу. Поэтому сначала рассмотрим механизмы синтеза дезоксирибонуклеотидов. При помощи метода меченых атомов было показано, что этот синтез начинается не со свободной дезоксирибозы, а путем прямого восстановления рибонуклеотидов у 2'-го атома углерода. При инкубации меченых предшественников (рибонуклео тидов) в бесклеточной системе бактерий метку обнаружили в составе дезоксирибонуклеотидов. По данным П. Рейхарда, у Е. coli все 4 рибо нуклеозиддифосфата восстанавливаются в соответствующие дезоксиана логи: dАДФ, dГДФ, dЦДФ, dУДФ – при участии сложной ферментной системы, состоящей по меньшей мере из четырех разных ферментов.

Химический смысл превращения рибонуклеотидов в дезоксирибо нуклеотиды сводится к элементарному акту – восстановлению рибозы в 2-дезоксирибозу, требующему наличия двух атомов водорода. Непосред ственным источником последних оказался восстановленный термостабиль ный белок тиоредоксин, содержащий две свободные SH-группы на аминокислотных остатков. Тиоредоксин легко окисляется, превращаясь в дисульфидную S-S-форму. Для его восстановления в системе имеется специфический ФАД-содержащий фермент тиоредоксинредуктаза (мол.

масса 68000), требующая наличия восстановленного НАДФН. Обозначив условно рибонуклеозиддифосфат РДФ, образование дезоксирибонуклео тидов можно представить следующим образом:

Тиоредоксин-(SН)2 + РДФ –> Тиоредоксин-S2 + dРДФ Рибонуклеозиддифосфатредуктаза Тиоредоксин-S2 + НАДФН + Н+ –> Тиоредоксин-(SН)2 + НАДФ+ Тиоредоксинредуктаза Обе стадии могут быть представлены в виде схемы:

Рибонуклеозиддифосфат РДФ dPДФ редуктаза Тиоредоксин Тиоредоксин Тиоредоксин редуктаза + + НАДФ НАДФН+ Н Для синтеза тимидиловых нуклеотидов, помимо дезоксирибозы, тре буется также метилированное производное урацила – тимин. Оказалось, что в клетках имеется особый фермент тимидилатсинтаза, катализирующая метилирование не свободного урацила, а dУМФ;

реакция протекает по уравнению:

+ НАДФ ТГФК + НАДФН + Н N5,N10—CН2—ТГФК ДГФК Тимидилатсинтаза dТМФ dУМФ Донором метильной группы в тимидилатсинтазной реакции является N5,N10-метилен-ТГФК, которая одновременно отдает и водородный про тон, поэтому одним из конечных продуктов реакции является не тетра гидро-, а дигидрофолиевая кислота (ДГФК). Последняя вновь восста навливается до ТГФК под действием НАДФН-зависимой дигидрофолат редуктазы. Из образовавшегося ТМФ путем фосфотрансферазных реакций образуются dТДФ и dTТФ.

Регенерация N5,N10–СН2–ТГФК, собственно ее биосинтез, пред ставляет определенный интерес. Оказалось, что этот синтез требует участия аминокислоты серина (донатор метильной группы) и пиридоксальфосфат содержащего фермента сериноксиметилтрансферазы в соответствии с урав нением:

CH2(OH)—CH(NH2)—COOH CH2(NH2)—COOH Глицин Серин N5,N10—CH2—TГФK ТГФК Сериноксиметилтрансфераза Синтез всех остальных дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов, непо средственно участвующих в синтезе ДНК, также осуществляется путем фосфорилирования дезоксирибонуклеозид-5'-дифосфатов в присутствии АТФ:

АТФ + dАДФ –> АДФ + dATФ;

АТФ + dЦДФ –> АДФ + dЦТФ;

АТФ + dГДФ –> АДФ + dГТФ;

АТФ + dТДФ –> АДФ + dТТФ.

Далее на двух схемах суммированы данные о взаимопревращениях пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, а также о связи их с синтезом нуклеиновых кислот. Как видно из схем, в образовании пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов специфическое участие принимает ФРПФ, являющийся донором фосфорибозильного остатка в биосинтезе как оро тидин-5'-фосфата, так и ИМФ;

последние считаются ключевыми субстра тами в синтезе нуклеиновых кислот в клетках.

Фумарат Аденилоянтарная АМФ dAMФ кислота Acп АДФ dАДФ ИМФ НАД+ АТФ dАТФ НАДН+Н+ Глн Глу Ксантиловая ГМФ dГМФ кислота 5-Фосфорибозил dГДФ ГДФ -1-пирофосфат ТТФ dГТФ ГТФ Оротовая ТДФ кислота ТМФ dУТФ УТФ ЦТФ dЦТФ РРi dУМФ УДФ dУДФ dЦДФ ЦДФ Оротидин-5-фосфат ЦМФ dЦМФ УМФ ФРПФ + Глн Карбамоилфосфат + Асп Гли ТГФК N-карбамоиласпартат СО2 Глн Оротовая кислота Асп N10-CHO—ТГФК ИМФ УМФ ГМФ УДФ АМФ УМФ АТФ УТФ УТФ АДФ ГТФ ЦТФ ГДФ ЦТФ ЦМФ ЦДФ dТМФ dАДФ dГДФ dTДФ РНК dЦДФ dАТФ dГТФ dТТФ dЦТФ ДНК Биосинтез нуклеиновых кислот Проблема биосинтеза нуклеиновых кислот является предметом присталь ного внимания многих исследователей и целых научных коллективов.

Следует прежде всего отметить исключительную трудность решения этой важнейшей проблемы, связанную с неполными представлениями о природе белковых факторов и механизмах регуляции синтеза нуклеиновых кислот.

До сих пор не раскрыты в деталях молекулярные механизмы передачи генетической информации, закодированной в нуклеотидной последователь ности ДНК. Различают три основных этапа реализации генетической информации. На первом этапе – этапе репликации происходит обра зование дочерних молекул ДНК, первичная структура которых идентична родительской ДНК (копирование ДНК). Репликация ДНК является клю чевой функцией делящейся клетки и частью таких биологических процессов, как рекомбинация, транспозиция и репарация. На втором этапе, названном транскрипцией, генетическая информация, записанная в первичной структуре ДНК, переписывается в нуклеотидную последовательность РНК (синтез молекулы РНК на матрице ДНК). На третьем этапе – этапе трансляции генетическая информация, содержащаяся уже в нуклеотидной последовательности молекулы РНК, переводится в аминокислотную по следовательность белка. Далее представлены основные итоги исследований и наши представления о биосинтезе полимерных молекул ДНК, РНК и белка, полученные к середине 1996 г.

Биосинтез ДНК Прежде чем изложить современные представления о механизме биосинтеза ДНК, следует представить сведения о синтезе этого соединения в бес клеточной системе, которыми располагает биохимия. Известно, что для любого синтеза полимерной органической молекулы, осуществляемого in vitro или in vivo, требуется энергия. Источником энергии в реакциях полимеризации мононуклеотидов является энергия, освобождаемая всеми четырьмя типами дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, участвующих в син тезе ДНК. Образующийся пирофосфат под действием пирофосфатазы также расщепляется на две молекулы ортофосфата, давая дополнительную энергию для биосинтеза ДНК.

Помимо энергии, биогенез ДНК требует наличия специфических фер ментов, катализирующих отдельные этапы синтеза, и множества белковых факторов, абсолютно необходимых для регулирования процесса репли кации и проявления каталитической активности ферментов.

Ферментные системы синтеза ДНК у про- и эукариот до конца не выяснены. По имеющимся данным, в репликации ДНК, включающей узнавание точки начала процесса, расплетение родительских цепей ДНК в репликационной вилке, инициацию биосинтеза дочерних цепей и даль нейшую их элонгацию и, наконец, окончание (терминация) процесса, участвует более 40 ферментов и белковых факторов, объединенных в единую ДНК-репликазную систему, называемую реплисомой.

После открытия в 1958 г. А. Корнбергом у Е. coli фермента, катали зирующего биосинтез ДНК и названного ДНК-полимеразой I, в течение почти 10 лет считалось, что этот фермент является единственной по лимеразой, принимающей участие в репликации ДНК in vitro *. Однако позже был открыт мутант Е. coli, лишенный ДНК-полимеразы I, но спо собный синтезировать ДНК с нормальной скоростью. Оказалось, что для репликации ДНК Е. coli необходимо участие нескольких ферментов.

ДНК-полимераза I не наделена способностью инициировать синтез цепей ДНК de novo. Одним из хорошо изученных ферментов, участвующих в стадии инициации репликации ДНК, является специфическая клеточная РНК-полимераза, названная праймазой, которая катализирует синтез короткого олигорибонуклеотида (от 10 до 60 нуклеотидов), т.е. праймера, с которого затем начинается синтез ДНК. Праймазы различаются как по структуре, так и по специфичности действия. Получены новые данные о существенной роли праймасомы в каталитическом действии фермента.

Праймасома представлена ансамблем из 7 различных субъединиц, вклю чающих около 20 полипептидов общей мол. массой 70000. При помощи белка n' праймасома подвергается быстрому перемещению к отстающей цепи ДНК за счет энергии, генерируемой АТФазной активностью белка n'.

В состав праймасомы входит также комплекс белков dna В и dna С, который вблизи репликационной вилки периодически участвует в фор мировании специфической вторичной структуры ДНК, подходящей для узнавания праймазой.

Основным ферментом, катализирующим биосинтез новообразованной ДНК (точнее, стадию элонгации репликации ДНК), является ДНК-поли мераза III, представляющая собой мультимерный комплекс собственно ДНК-полимеразы (мол. масса около 900000) и ряда других белков.

ДНК-полимераза III из Е. coli состоит минимум из 10 субъединиц. Одна из них – -субъединица получена в кристаллическом виде, и выяснена ее тре тичная структура. Имеются доказательства, что в димерной форме * За выдающийся вклад в решение проблем биосинтеза ДНК и РНК А. Корнберг и С. Очоа были удостоены Нобелевской премии в 1959 г.

ДНК-полимераза III катализирует сопряженный синтез ведущей (лиди рующей) и отстающей цепей ДНК при репликации (см. далее). Более точно выяснена также роль ДНК-полимеразы I: она катализирует отщепление затравочного олигорибонуклеотидного праймера и заполнение образу ющихся после этого пробелов (ниш) дезоксирибонуклеотидами. Известно, что ДНК-полимеразы II из Е. coli (мол. масса 88000) выполняет «ре монтные» функции, исправляя повреждения цепей ДНК. Укажем также, что ДНК-полимераза I в качестве матрицы использует одноцепочечные участ ки, в то время как ДНК-полимераза III – двухцепочечные ДНК, в которых имеются короткие одноцепочечные последовательности.

Важную функцию соединения двух цепей ДНК или замыкания двух концов одной цепи ДНК в процессе репликации либо репарации ДНК выполняет особый фермент – ДНК-лигаза, катализирующая за счет энер гии АТФ образование фосфодиэфирной связи между 3'-ОН-группой де зоксирибозы одной цепи и 5'-фосфатной группой другой цепи ДНК.

Функцию раскручивания (расплетения) двойной спирали ДНК в репли кационной вилке, происходящего за счет энергии гидролиза АТФ, вы полняет специфический rep-белок, названный хеликазой (мол. масса 300000). Образовавшиеся на определенное время одноцепочечные участки ДНК служат в качестве матрицы при репликации и стабилизируются при помощи особых белков, связывающихся с одноцепочечной ДНК (ДНК связывающие белки) и препятствующих обратному комплементарному взаимодействию цепей ДНК (мол. масса 75600). В связи с этим их иногда называют дестабилизирующими двойную спираль белками. Имеются, кро ме того, особые ферменты топоизомеразы (у прокариот одна из них названа ДНК-гиразой), которые играют особую роль в сверхспирализации, обеспечивая как репликацию, так и транскрипцию ДНК. Эти ферменты наделены способностью не только создавать супервитки, но и уничтожать суперспирализацию путем сшивания образующихся разрывов или раз резания ДНК. Наконец, открыты специальные ферменты, «редактиру ющие» ДНК, т.е. осуществляющие вырезание и удаление ошибочно вклю ченных нуклеотидов или репарирующие повреждения ДНК, вызванные физическими или химическими факторами (рентгеновское излучение, УФ лучи, химический мутагенез и др.).

Из клеток животных выделено несколько ДНК-полимераз, и в разных лабораториях они получили различные наименования.

К настоящему времени у эукариот, как и у бактерий (см. ранее), открыто несколько ДНК-полимераз. В репликации ДНК эукариот участвуют два главных типа полимераз – и. Показано, что ДНК полимераза состоит из 4 субъединиц и является идентичной по структуре и свойствам во всех клетках млекопитающих, причем одна из субъединиц оказалась наделенной праймазной активностью. Самая крупная субъединица ДНК-полимеразы а (мол. масса 180000) катализирует реак цию полимеризации, преимущественно синтез отстающей цепи ДНК, яв ляясь составной частью праймасомы. ДНК-полимераза состоит из 2 субъединиц и преимущественно катализирует синтез ведущей цепи ДНК (см. далее). Открыта также ДНК-полимераза, которая в ряде случаев заменяет -фермент, в частности при репарации ДНК (исправление на рушений ДНК, вызванных ошибками репликации или повреждающими агентами). Следует отметить, что в эукариотических клетках открыты два белковых фактора репликации, обозначаемых RFA и RFC. Фактор репли кации А выполняет функцию белка – связывание одноцепочечной ДНК (наподобие белковых факторов связывания разъединенных цепей ДНК при репликации у Е. coli), фактор С – функцию стабилизатора всего реплика ционного комплекса.

В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наслед ственных и соматических болезней) широкое применение получили эндо нуклеазы рестриктазы, катализирующие расщепление молекулы двух цепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4–7-членные последова тельности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фраг менты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (ре комбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции (например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса гепатита В, СПИДа и др.).

Общий механизм синтеза ДНК. Основываясь на данных о двухспираль ной антипараллельной структуре, химическом составе ДНК (см. главу 3) и значении «активированной» формы энергии для биосинтеза полимерных молекул, А. Корнберг еще в 1955 г. указал на возможность синтеза ДНК энзиматическим путем в бесклеточной системе в присутствии изолиро ванной из Е. coli ДНК-полимеразы и предшественников дезоксирибонук леозидтрифосфатов. Реакция, практически осуществленная в 1967 г., сво дится к синтезу новой молекулы ДНК:

dАМФ n n1 dАТФ Д dГМФ n n2 dГTФ Mg2+;

ДНК-матрица + (n1 + n2 + n3 + n4)РРi Н ДНК-полимераза dЦMФ n n3 dЦТФ К dTMФ n n4 dТТФ Химический смысл полимеризации состоит в том, что свободная 3'-гидроксильная группа матрицы атакует -фосфатную группу соответ ствующего присоединяемого нуклеозидтрифосфата (определяется природой азотистого основания затравки), при этом происходят отщепление остатка пирофосфата и образование фосфодиэфирной связи. Далее свободный 3'-гидроксил вновь присоединенного нуклеотида атакует -фосфатную группу следующего нуклеозидтрифосфата, и таким путем продолжается процесс полимеризации, идущий в направлении 5'–>3', антипараллельно матрице, оканчивающейся 5'-фосфатом:

+ PPi ДНК-полимераза Реакция требует присутствия одноцепочечной ДНК или в крайнем случае небольшого полидезоксирибонуклеотида. В деталях выяснено зна чение предобразованной ДНК в механизмах действия ДНК-полимераз:

ДНК служит не только затравкой, но и матрицей, на которой фермент комплементарно и антипараллельно синтезирует дочернюю цепь ДНК. Это можно представить в виде схемы:

dТТФ А Т А dЦТФ Г Ц Г ДНК-полимераза + 4PPi Т dАТФ Т А dГТФ Г Ц Ц Были предприняты другие подходы к выяснению механизма поли меразной реакции. В лаборатории А. Корнберга был открыт фаг (Х174, содержащий одноцепочечную кольцевую ДНК. Эту молекулу использовали в качестве матрицы в ДНК-полимеразной реакции и получили биоло гически активную ДНК фага, использовав фермент ДНК-лигазу, обла дающую способностью катализировать соединение (сшивку) концов раз рывов в молекуле ДНК. Было показано, что в процессе репликации одноцепочечная ДНК фага (Х174 проходит стадию образования двухцепо чечной кольцевой ДНК. Применив ряд остроумных подходов, А. Корнберг и сотр. в опытах in vitro создали искусственную молекулу фага Х174, обладающую способностью поражать (инфицировать) Е. coli, вызывая ли зис бактерии. Последовательность событий может быть представлена на схеме, где исходная молекула кольцевой ДНК фага Х174 обозначена плюсом (+), а вновь синтезируемая молекула – минусом (–) (рис. 13.1).

М. Мезельсон и Ф. Сталь показали полуконсервативный механизм реп ликации ДНК, включающий образование дочерних молекул ДНК, в каждой из которых сохраняется лишь одна родительская цепь (рис. 13.2;

13.3).

Сложность процесса репликации ДНК объясняется тем, что обе цепи реплицируются одновременно, хотя имеют разное направление (5'–>3' и 3'–>5');

кроме того, рост дочерних цепей также должен происходить в противоположных направлениях. Элонгация каждой дочерней цепи может осуществляться только в направлении 5'–>3'. Р. Оказаки высказал пред положение, подтвержденное экспериментальными данными, что синтез одной из дочерних цепей осуществляется непрерывно в одном направлении, в то время как синтез другой дочерней цепи происходит прерывисто, путем соединения коротких фрагментов (в честь автора названы фрагментами Оказаки), в свою очередь синтезирующихся в противоположном направ лении (рис. 13.4).

Как видно, синтез ведущей цепи ДНК идет всегда в направлении 5'–>3', соответствующем направлению движения репликационной вилки. Сохраняя правило синтеза дочерних молекул ДНК 5'–>3', синтез на второй цепи родительской ДНК идет в направлении, противоположном движению репликационной вилки. В зависимости от типа клетки фрагменты Оказаки Кольцевая одноцепочечная ДНК фага Х ДНК-полимераза ДНК-полимераза Образование Использование незамкнутой новой молекулы комплементарной ДНК в качестве ДНК матрицы ДНК-лигаза ДНК-лигаза Замыкание Замыкание кольца цепи Эндонуклеаза Эндонуклеаза Разрыв в исходной Разрыв цепи ДНК в (–) цепи нагревание нагревание Денатурация Денатурация (–) цепи исходной (+) ДНК Новая синтетическая кольцевая ДНК, Синтезированная идентичная исходной молекула ДНК ДНК фага Х Рис. 13.1. Роль ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы в синтезе кольцевой одноцепочеч ной ДНК фага Х174.

имеют разные размеры – от нескольких сот до нескольких тысяч нуклеоти дов (150–200 у эукариот и 1000–2000 у бактерий).

Получены доказательства, что образование каждого фрагмента Оказаки требует наличия короткого затравочного комплементарного праймера – участка РНК, синтез которого катализируется праймазой. Затем при учас тии ДНК-полимеразы III синтезируются длинные участки ДНК. РНК затравки далее вырезаются при участии ДНК-полимеразы I, а свободные места их (бреши) замещаются (достраиваются) комплементарными дез оксирибонуклеотидами под действием той же ДНК-полимеразы I;

наконец, сшивание разъединенных участков отстающей цепи осуществляется при помощи ДНК-лигаз. Подобный механизм челночного синтеза ДНК легко объясняет фактические данные о накоплении коротких фрагментов ДНК у Е. coli во время репликации ДНК.

Особенности репликации ДНК у эукариот. Репликация ДНК у эукариот, по существу аналогичная репликации ДНК у прокариот, имеет ряд особенностей. Например, вместо одной точки репликации в ДНК эукариот имеются специфические точки «начала», так называемые автономно реплицирующие последовательности (около 300 нуклеотидных пар);

в дрожжевой клетке таких элементов около 400. Кроме того, скорость движения репликационной вилки у эукариот (примерно 50 нуклеотидов Рис. 13.2. Полуконсерватив ная репликация ДНК in vitro.

Каждая из двух цепей родитель ской ДНК служит матрицей для синтеза дочерних молекул ДНК.

1 - родительская молекула;

2 дочерние молекулы (первая гене рация);

3 - дочерние молекулы (вторая генерация).

ДНК-гираза Праймасома ДНК-хеликаза rер-белок Комплекс белков dnaB и dnaC ДНК-связывающие белки Фрагменты Праймаза Оказаки Праймер ДНК-полимераза III Ведущая цепь Удаление праймера ДНК-лигаза ЦНК-полимераза I Отстающая цепь Рис. 13.3. Основные этапы репликации ДНК (схема).

Лидирующая цепь Родительская ДНК Фрагменты Направление движения Оказаки репликационной вилки Отстающая цепь Рис. 13.4. Схематическое изображение непрерывного и прерывистого синтеза цепей ДНК при репликации.

в секунду) почти в 10 раз ниже, чем у E. coli. Для репликации ДНК генома человека из одной-единственной точки с подобной скоростью потребо валось бы более 500 ч;

вместо этого репликация генома человека проис ходит в обоих направлениях и одновременно из множества точек (мно жество «начал» репликации), вовлекая от 30000 до 330000 пар оснований.

Репликация продолжается до тех пор, пока не будут синтезированы две дочерние молекулы ДНК, в каждой из которых содержится одна ро дительская цепь (см. рис. 13.4). Таким образом, множественность точек «начала» репликации ДНК, вероятнее всего, является общим правилом для всех клеток эукариот.

Как было указано, инициация биосинтеза дочерних цепей ДНК требует предварительного синтеза на матрице ДНК необычного затравочного олигорибонуклеотида, названного праймером, со свободной гидроксильной группой у С-3' рибозы. Этот короткий олигорибонуклеотид синтезируется комплементарно на матрице ДНК при участии особого фермента – прай мазы, наделенной РНК-полимеразной активностью.

Матричная цепь ДНК Направление синтеза Праймер (олигорибо нуклеотид) Предполагают, что именно с этой точки концевого 3'-гидроксила рибозы праймера начинается истинный синтез лидирующей дочерней цепи ДНК, комплементарной родительской. Синтез начинается с реакции между 3'-ОН-группой концевого рибонуклеотида праймера и -фосфатной группой первого дезоксирибонуклеотидтрифосфата в строгом соответствии с комплементарностью родительской цепи ДНК, при этом освобождается пирофосфат. В дальнейшем этот фрагмент РНК, комплементарно при соединенный к новообразованной цепи ДНК, разрушается под действием ДНК-полимеразы I, и возникшая брешь застраивается олигодезоксирибо нуклеотидом при помощи той же ДНК-полимеразы I. Вполне допустимо предположение, что синтез праймера из олигорибонуклеотида имеет глу бокий биологический смысл, поскольку в этом случае могут устраняться ошибки, неизбежно возникающие при инициации репликации ДНК.

Этапы биосинтеза ДНК. Предложен ряд моделей механизма биосинтеза ДНК с участием указанных ранее ферментов и белковых факторов, однако детали некоторых этапов этого синтеза еще не выяснены. Основываясь главным образом на данных, полученных в опытах in vitro, предполагают, что условно механизм синтеза ДНК у Е. coli может быть подразделен на три этапа;

инициацию, т.е. начало, элонгацию, т.е. продолжение, и терми нацию, т.е. завершение (прекращение) синтеза. Каждый из этих этапов требует участия специфических ферментов и белковых факторов.

Этап I – инициация биосинтеза ДНК – является началом синтеза до черних нуклеотидных цепей;

в инициации участвует минимум восемь хорошо изученных и разных ферментов и белков. Первая фаза – это, как указано ранее, ферментативный биосинтез на матрице ДНК необычного затравочного олигорибонуклеотида (праймера) со свободной гидроксиль ной группой у С-3' рибозы. При инициации к цепям ДНК последовательно присоединяются ДНК-раскручивающие и ДНК-связывающие белки, а за тем комплексы ДНК-полимераз и праймаз (см. рис. 13.3). Инициация представляется единственной стадией репликации ДНК, которая весьма тонко и точно регулируется, однако детальные механизмы ее до сих пор не раскрыты и в настоящее время интенсивно исследуются.

Этап II – элонгация синтеза ДНК – включает два кажущихся оди наковыми, но резко различающихся по механизму синтеза лидирующей и отстающей цепей на обеих материнских цепях ДНК. Синтез лидирующей цепи начинается с синтеза праймера (при участии праймазы) у точки начала репликации, затем к праймеру присоединяются дезоксирибонуклеотиды под действием ДНК-полимеразы III;

далее синтез протекает непрерывно, следуя шагу репликационной вилки. Синтез отстающей цепи, напротив, протекает в направлении, обратном движению репликационной вилки и начинается фрагментарно. Фрагменты всякий раз синтезируются раздельно, начиная с синтеза праймера, который может переноситься с готового фрагмента при помощи одного из белковых факторов репликации в точку старта био синтеза последующего фрагмента противоположно направлению синтеза фрагментов. Элонгация завершается отделением олигорибонуклеотидных праймеров, объединением отдельных фрагментов ДНК при помощи ДНК-лигаз и формированием дочерней цепи ДНК. Нельзя исключить, однако, возможности сопряженного и согласованного механизма синтеза лидирующей и отстающей цепей ДНК при участии полимераз и всего комплекса праймасом.

Этап III – терминация синтеза ДНК – наступает, скорее всего, когда исчерпана ДНК-матрица и трансферазные реакции прекращаются. Точ ность репликации ДНК чрезвычайно высока, возможна одна ошибка на 1010 трансферазных реакций, однако подобная ошибка обычно легко исправляется за счет процессов репарации.

Синтез ДНК на матрице РНК. Выдающимся достижением биохимии нуклеиновых кислот является открытие в составе онковирусов (вирус Раушера и саркомы Рауса) фермента обратной транскриптазы, или ревертазы (РНК-зависимая ДНК-полимераза), катализирующего био синтез молекулы ДНК на матрице РНК. Накоплены данные о том, что многие РНК-содержащие онкогенные вирусы, получившие наименование онкорнавирусов, содержат ревертазу в составе покровных белков. Фермент открыт также во многих клетках прокариотов и эукариотов, в частности в лейкозных клетках, пролиферирующих тканях, включая эмбриональные 2+ ткани. Ревертаза онкорнавирусов содержит ионы Zn и активируется 2+ 2+ катионами Мn и Mg. Предполагают, что синтез ДНК на матрице РНК происходит в 3 этапа. На I этапе фермент ревертаза синтезирует на матрице вирусной РНК комплементарную цепь ДНК, что приводит к формиро ванию гибридной молекулы. Второй этап – разрушение исходной вирусной РНК из комплекса гибридной молекулы под действием РНКазы. Наконец, на III этапе на матрице цепи ДНК комплементарно синтезируются новые цепи ДНК. Ревертазной активностью обладают и ДНК-полимеразы: на пример, фермент из Е. coli способен катализировать синтез ДНК на матрице рРНК.

Открытие обратной транскриптазы имеет большое значение не только для выяснения закономерностей процесса малигнизации, но и для всей науки о живом, поскольку указывает на возможность передачи наслед ственной информации от РНК на ДНК, не подчиняясь основному постулату (поток информации идет только в одном направлении):

ДНК –> РНК –> Белок.

В настоящее время можно дополнить эту основную схему передачи генетической информации в живой клетке и представить ее в более полной форме:

Транскрипция Трансляция РНК Белок ДНК Обратная транскрипция Репликация Репликация На схеме стрелки вокруг ДНК и РНК указывают на возможность молекул копировать самих себя в живых системах при участии соот ветствующих ферментов. Как знать, не станем ли мы свидетелями откры тия принципиальной возможности поворота стрелки и на следующей стадии – от белка на РНК, что могло происходить на Земле при зарождении первичных живых существ?

Биосинтез РНК Поток генетической информации называется экспрессией генов. Он вклю чает процесс транскрипции – биосинтез матричных РНК (как и других типов клеточных РНК) на молекуле ДНК, и процесс трансляции – биосинтез белка на мРНК, т.е. генетическая информация ДНК реализуется путем програм мированного через мРНК синтеза белков, определяющих в конечном счете фенотипические признаки живых организмов. Подсчитано, что около 90–95% ДНК E. coli экспрессируется в мРНК, хотя большая часть послед ней не кодирует синтеза белка;

небольшая часть ДНК кодирует синтез двух других клеточных РНК, т.е. рРНК и тРНК. Транскрипция, несмотря на кажущуюся схожесть с репликацией, в частности химическим механизмом, направлением синтеза и использованием матрицы, отличается рядом осо бенностей: не требует синтеза праймера, использует не всю молекулу ДНК, а только ее отдельные короткие сегменты (отдельные гены или группы генов) и, наконец, требует наличия только одной из цепей ДНК в качестве матрицы, которая полностью сохраняется (при репликации ДНК она сохраняется наполовину). Геном каждой клетки человека состоит из 3,5• пар оснований;

они могут обеспечить кодирование более 1,5•106 пар генов.

Однако имеющиеся данные о количестве и разнообразии белков в ор ганизме человека (около 100000) свидетельствуют о том, что значительная часть генома человека не транскрибируется и соответственно не пере водится на аминокислотную последовательность белков. Известно также, что определенная часть нетранслируемого генома человека выполняет регуляторную функцию в процессе экспрессии генов. В молекуле ДНК различают, кроме уникальных неповторяющихся последовательностей, со держащих кодирующие гены, также множество повторяющихся после довательностей (повторы), биологический смысл которых до сих пор неясен (см. далее).

Современные представления о механизме синтеза РНК в клетках в зна чительной степени обязаны открытию в 1960 г. в двух лабораториях США (Дж. Хервиц и С. Вейс) особого фермента – РНК-полимеразы, катализи рующей синтез РНК из свободных нуклеозидтрифосфатов. Фермент тре бует наличия ионов Mg2+ или Мn2+ и одновременного присутствия всех 4 типов рибонуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ). Самым удивительным свойством фермента оказалось то, что для включения нуклеотидов в РНК необходимо обязательное присутствие предобразо ванной ДНК-матрицы *. При тщательном изучении механизма синтеза РНК при участии РНК-полимеразы, называемой также ДНК-зависимой РНК-полимеразой (транскриптазой), было установлено, что молекула предобразованной ДНК, необходимая для реакции полимеризации, пол ностью определяет последовательность рибонуклеотидов во вновь син тезированной молекуле РНК. Другими словами, на матрице ДНК компле ментарно строится полирибонуклеотид, являющийся копией первичной структуры ДНК, с той только разницей, что вместо тимидилового нуклео тида ДНК в РНК включается уридиловый нуклеотид. Реакция синтеза РНК в общем виде может быть представлена следующим образом:

n1 АТФ АМФ n Р n2 ГТФ Мg2+;

ДНК-матрица ГМФ n Н + (n1 + n2 + n3 + n4)РРi n3 ЦТФ РНН-полимераза ЦМФ n К n4 УТФ УМФ n В синтезируемой молекуле РНК отдельные мононуклеотиды, как и в ДНК, связаны между собой 3'-5'-фосфодиэфирными мостиками. Кроме того, сам механизм действия фермента РНК-полимеразы во многом совпа дает с таковыми ДНК-полимеразы: синтез также идет в направлении 5'–>3', цепь РНК имеет полярность, противоположную цепи предобразованной ДНК. Однако выявлены и существенные различия. РНК-полимераза Е. coli предпочтительнее функционирует в присутствии нативной двухцепочечной ДНК;

в опытах in vitro обе цепи ДНК копируются РНК-полимеразой;

in vivo транскрибируется, вероятнее всего, только одна цепь ДНК. Пред полагают, что РНК-полимераза связывается с одной цепью нативной ДНК в определенной точке, вызывая расплетение биспиральной структуры на ограниченном участке, где и происходит синтез РНК. Данные свиде тельствуют, что у E. coli, скорее всего, имеется единственная ДНК-зави * Позже были открыты также ферменты (преимущественно в составе оболочек фагов и у ряда бактерий), катализирующие синтез РНК на матрице РНК.

симая РНК-полимераза, которая катализирует синтез всех типов клеточных РНК.

РНК-полимераза Е. coli изучена наиболее подробно. Это олигомерный фермент, состоящий из двух одинаковых -субъединиц (мол. масса 36000), двух разных ( и )-субъединиц (мол. масса соответственно 1 и 155000), -субъединицы (мол. масса 11000) и -субъединицы;

общая мол.

масса фермента около 390000. Считают, что функция -субъединицы (-фактор) – узнавание определенного участка на матрице ДНК, названного промотором, к которому присоединяется РНК-полимераза. В результате образуется так называемый открытый комплекс фермента с ДНК: двух цепочечная структура ДНК раскрывается («плавится»). Далее на одной из нитей ДНК, как на матрице, синтезируется мРНК;

синтез заканчивается в определенной точке в конце гена или прерывается под действием особых белков. Другим субъединицам фермента приписывают функцию инициации биосинтеза РНК (-субъединицам) и основную каталитическую функцию (связывание субстратов и элонгация синтеза) – -субъединицам. Кроме того, открыт ряд белков, принимающих участие в механизме синтеза РНК в клетке. В частности, исследуется природа репрессорных белков и белка терминатора (-фактора). Последний обладает способностью обратимо связываться с терминирующими участками ДНК (так называемые стоп сигналы транскрипции), выключая действие РНК-полимеразы. При от сутствии этого белка образуются исключительно длинные цепи РНК.

У эукариот открыты три разные РНК-полимеразы (I, II и III) с большой молекулярной массой (от 500000 до 600000), каждая из которых наделена специфической функцией. РНК-полимераза I ответственна за синтез только рибосомных РНК (рРНК), точнее одного-единственного прерибосомного РНК-транскрипта, предшественника 5,8S, 18S и 28S рРНК;

фермент свя зывается с разными промоторными участками. РНК-полимераза II – основ ной фермент, катализирующий синтез матричной РНК (мРНК). Он наделен способностью распознавать огромное множество промоторных участков, многие из которых имеют специфические ключевые последовательности, являющиеся местами (сайтами) связывания транскрипционных бел ковых факторов. РНК-полимераза III катализирует преимущественно син тез транспортных РНК (тРНК), а также 5S рРНК и ряда других низко молекулярных РНК со специфической функцией. У эукариот работу РНК полимеразы обеспечивает множество регуляторных белков (факторы транскрипции), объединенных вместе с ферментом в единый транскрип ционный комплекс. В частности, открыты транскрипционные факторы типа J, активные только в виде идентичных димеров (J1J1 или J2J2) или разных димеров (J1J2);

эти факторы кодируются отдельными генами и сами запускают работу ряда генов, регулирующих клеточное деление. В ре зультате мутации генов, кодирующих синтез транскрипционных факторов, резко повышается прочность связывания J-факторов с ДНК, что обычно приводит к нерегулируемому опухолевому росту клеток.

Биогенез матричных РНК Процесс образования молекулы мРНК на матрице ДНК – биогенез мРНК – в прокариотических клетках представляется относительно простым и вклю чает главным образом транскрипцию соответствующего гена при участии РНК-полимеразы. Во многих случаях первичным продуктом экспрессии гена является молекула мРНК, уже способная к функционированию, т.е. у прокариот транскрипция и трансляция являются сопряженными процес сами. Биосинтез тРНК у прокариот из первичного тРНК транскрипта проходит стадию процессинга аналогично синтезу мРНК и тРНК у эука риот (см. далее).

Биогенез мРНК у эукариот существенно отличается не только ме ханизмом регуляции транскрипции, но и многоступенчатостью форми рования активной молекулы. До открытия феномена сплайсинга (от англ. splicing – созревание, сращивание) мРНК было известно, что многие мРНК эукариот синтезируются в виде гигантских высокомолекулярных предшественников (пре-мРНК), которые уже в ядре подвергаются пост транскрипционному процессингу. Предполагали, что процессинг включает удаление длинных 5'- и 3'-концевых участков, которые якобы выполняют регуляторные функции. Как оказалось, ген эукариот является не непрерыв ной, а мозаичной структурой, содержащей наряду с кодирующими (экзоны) также некодирующие (интроны) последовательности. Фермент РНК-полимераза катализирует транскрипцию как экзонов (от англ. exit – выход, поскольку продукты транскрипции – участки мРНК – выходят из ядра в цитоплазму и выполняют функцию матрицы в синтезе белка), так и интронов с образованием гетерогенной ядерной РНК (гяРНК), назы ваемой также первичным транскриптом. Термин «интроны» означает вставочные, нетранслирующие последовательности нуклеотидов в ДНК эукариот. Этот термин применим и к вставочным нуклеотидным после довательностям первичного РНК-транскрипта.

С открытием интрон-экзонного строения генов, характерного для эукариотических клеток, начался новый этап исследований на пути реали зации генетической информации. Транскрипция гена, состоящего из че редующихся кодирующих и некодирующих нуклеотидных последователь ностей, обеспечивала полное его копирование и приводила к синтезу РНК-предшественника. Поэтому было высказано предположение о су ществовании между транскрипцией и трансляцией еще одного важного звена – образования пригодной для трансляции «зрелой» молекулы мРНК.

Этот этап получил название процессинга, или созревания, мРНК.

К настоящему времени считается установленным, что процессинг мРНК включает три основных процесса: 1) кэпирование – химическая моди фикация 5'-концевой последовательности мРНК;

2) сплайсинг – удаление некодирующих интронных последовательностей из мРНК и сшивание образующихся экзонов;

3) полиаденилирование – химическая модифи кация 3'-концевой последовательности мРНК (рис. 13.5).

В осуществлении каждого из указанных процесов специфическое участие принимает ряд белков и нуклеиновых кислот, хотя конкретные моле кулярные механизмы этих превращений еще не полностью раскрыты. Все три указанных процесса имеют важное значение в формировании зрелой молекулы мРНК. Однако наибольший интерес исследователи проявляют к выяснению молекулярного механизма сплайсинга, который должен обеспечить, во-первых, постепенное и высокоточное вырезание интронов из первичного транскрипта и, во-вторых, сшивание образующихся фрагмен тов – экзонов – «конец в конец». Любые отклонения или смещения границ в процессе вырезания интронов и сшивания экзонов даже на один нуклеотид могут привести не только к глубокому искажению смысла в кодирующих последовательностях, но и к нарушению передачи генетической инфор мации и развитию патологии.

Последовательность нуклеотидов в молекуле мРНК обычно начинается с пары 5'-ГУ и заканчивается парой АГ-3'. Эти последовательности, Интроны Экзоны ДНК Транскрипция 5'-Кэпирование Кэп Первичный 3'мРНК мяРНК транскрипт Расщепление 3'-Полиаденилирование Сплайсинг Кэп Поли-А Зрелая мРНК Рис. 13.5. Биогенез мРНК у эукариот.

вероятнее всего, служат сайтами (местами) узнавания для ферментов сплайсинга. Поскольку 5'-ГУ... АГ-3' последовательности не открыты в молекулах предшественников тРНК, было высказано предположение о существовании по меньшей мере двух типов ферментов сплайсинга;

одного для мРНК и другого для тРНК. Имеются, кроме того, достоверные данные о том, что интроны часто оказываются длиннее экзонов и что внутри гена на интроны приходится значительно большая часть нуклеотид ных пар. Подсчитано, например, что ген овальбумина содержит 7 интронов, в общей сложности насчитывающих 7700 пар оснований, в то время как сформировавшаяся после сплайсинга мРНК насчитывает всего 1859 ос нований. Почти во всех эукариотических клетках синтезированные на структурных генах первичные транскрипты подвергаются процессингу, прежде чем выполнят свои уникальные функции в белковом синтезе. Во многих случаях процессинг имеет место главным образом в ядре, хотя этот процесс продолжается и после транспортировки молекул РНК из ядра в цитоплазму: например, терминальные реакции полиаденилирования и метилирования остатков нуклеозидов.

Химический смысл кэпирования сводится к присоединению остатка 7-метилгуанозина посредством трифосфатной группы к 5'-концу молекулы транскрипта, метилированию 2'-ОН-группы первого и второго нуклеотидов на 5'-конце мРНК. Полиаденилирование 3'-конца первичного транскрипта включает ряд стадий и участие эндонуклеазы и полиаденилатполимеразы.

Эндонуклеаза расщепляет мРНК вблизи специфической сигнальной после довательности (5')ААУААА(3'), отличающейся высокой консерватив ностью. Полиаденилатполимераза синтезирует поли-А-конец (от 20 до нуклеотидов) начиная с точки распада.

Функции 5'-кэп и 3'-поли-А раскрыты недостаточно полно. Показано, что 5'-кэп, соединяясь со специфическим белком, принимает участие в свя зывании мРНК с рибосомой, способствуя инициации синтеза белка. До пускают, что основное назначение 5'-кэп и поли-А – защита мРНК от энзиматического распада. Известно также, что не все цитоплазматические мРНК содержат участки поли-А на 3'-концах и что в цитоплазме клеток животных происходит как присоединение, так и удаление участка поли-А из молекулы мРНК. Следует отметить, что размер молекулы цитоплазма тической мРНК даже после удаления 3'-поли-А оказывается все же намного большим, чем требуется для синтеза кодируемого белка. В частности, размер мРНК белка глобина (эритроциты кролика) составляет 550 нуклео тидов, в то же время кодирующий участок состоит из 430 нуклеотидов (размер поли-А – 40 нуклеотидов). Другой пример: размер мРНК тяжелого иммуноглобулина (из клеток миеломы мышей) составляет 1800 нуклеотид ных остатков, а кодирующая часть – 1350 нуклеотидов (размер поли А – 150–200 нуклеотидов). Интересно, что большинство указанных про цессов, если не все, могут регулироваться независимо, изменяя уровень экспрессии гена. Более того, даже после завершения формирования мРНК изменения ее стабильности могут оказывать существенное влияние на экспрессию гена.

В последние годы интенсивно исследуются структура и назначение нетранслируемых участков генов – интронов. Они различаются по числу, размерам и топографии. Показано, например, что ген сывороточного альбумина хотя и содержит всего 6 интронов, но на их долю приходится до 80% этого гена;

интроны имеют размеры от 90 до 20000 нуклеотидных пар.

Ген коллагена содержит более 50 интронов. Исключение составляют лишь гены, кодирующие гистоны, не содержащие интронных структур. Раз личают 4 класса интронов. Первый класс открыт как в ядерных, так и в митохондриальных генах, кодирующих рибосомные рРНК;

второй класс интронов открыт в первичных транскриптах митохондриальных матричных мРНК. Оказалось, что оба эти класса интронов не нуждаются ни в источнике энергии, ни в участии ферментов, но наделены способностью самосплайсинга. Третий – самый большой класс интронов обнаружен в первичных транскриптах ядерных мРНК, подвергающихся созреванию.

Сплайсинг требует наличия комплекса белков и особой группы клеточных РНК, названных малыми ядерными РНК (мяРНК). Выделено и охарак теризовано 5 групп богатых уридином мяРНК, соответственно обозна чаемых U1, U2, U4, U5 и U6, размерами от 100 до 200 нуклеотидов.

Комплексы мяРНК и белков, названные малыми ядерными нуклеопро теинами, объединяются в единую систему – сплайсосому, координиру ющую весь процесс сплайсинга. Предполагают, что мяРНК соединяются с обеими концами интрона, способствуя формированию специфической конформации, необходимой для узнавания ее участвующими в процессе ферментами, сближению двух экзонов, удалению интронов и воссоеди нению кодирующих экзонов. Четвертый класс интронов открыт в ряде тРНК. Сплайсинг этой группы интронов требует доставки энергии и присутствия эндонуклеаз и лигаз, катализирующих соответственно разрыв фосфодиэфирных связей с 5'- и 3'-концов интрона и соединяющих два экзона.

Укажем также на весьма интересные и новые данные о существовании в структуре мРНК-предшественника, помимо экзонов и интронов, особых, так называемых альтернативно сплайсируемых, последовательностей. Вы явлены примеры неоднозначного протекания сплайсинга для ряда генов.

Результат альтернативного сплайсинга – появление нескольких продуктов при экспрессии одного гена. Так, получены доказательства, что экспрессия одного и того же гена тропомиозина позволяет получить семь изоформных белков, специфичных для разных групп мышц (гладких и поперечно полосатых) или для фибробластов и миобластов. В то же время известны примеры формирования одного белкового продукта (например, олиго мерного фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) при экспрессии двух разных генов. Все эти данные свидетельствуют о том, что альтернативный сплайсинг может играть существенную роль в функционировании генома клеток высших организмов.

В нетранскрибируемых последовательностях генома перед экзон интронами открыты специфические участки, названные промоторами, а также энхансерами (повышающие уровень транскрипции) и силан серами (ослабляющие уровень транскрипции). При взаимодействии с белками они выполняют функции регуляторных сигналов при транскрип ции. Этот способ регуляции широко используется клетками эукариот как в процессах дифференцировки, так и при индукции репрессии (см. главу 14).

Нельзя не упомянуть об открытии рибозимов, т.е. молекул РНК, выступающих в качестве катализатора. Пожалуй, это единственные из известных макромолекул, которые наделены как информационной, так и каталитической функцией. Открытие каталитических РНК поколебало само понятие «фермент». Оказалось, что некоторые РНК осуществляют посттранскрипционный процессинг, катализируя самосплайсинг, т.е. участ вуют в разрезании и удалении интронов. Наделенные рядом свойств истинных и эффективных катализаторов рибозимы участвуют в двух типах реакций: в гидролизе (разрыве) фосфодиэфирной связи и в реакциях трансэтерификации. В качестве субстрата могут служить, помимо собствен ного, предшественник (про-РНК) и другие молекулы РНК. Сейчас ин тенсивно изучается третичная структура рибозимов, а первичная и вторичная структуры ряда из них уже расшифрованы. Эти исследования, несомненно, интересные сами по себе, могут пролить свет и на пути развития биоло гической эволюции.

Для полного понимания молекулярных механизмов сложного процесса биогенеза мРНК предстоит решить множество вопросов. В частности, необходимо выделить в чистом виде и охарактеризовать белковые фак торы, принимающие участие в этой регуляторной системе. Далее следует раскрыть механизмы узнавания промотора, терминации и антитерминации, избирательного метилирования, а также тонкие молекулярные механизмы регуляции сплайсинга. Решение указанных проблем будет, несомненно, способствовать лучшему пониманию сущности механизмов регуляции экспрессии генов эукариотических клеток в норме и при патологии.

Биогенез транспортных РНК Транспортные РНК в клетке выполняют адапторную функцию при тран сляции информации мРНК в первичную структуру белка. Как было указано в главе 3, в молекуле тРНК содержится 8–10% необычных («минорных») азотистых оснований в составе нуклеотидов. Молекулы тРНК как у эукариот, так и у прокариот синтезируются в виде больших предшествен ников, часто содержащих последовательности более одной тРНК, которые затем подвергаются нуклеолитическому процессингу при участии специ фических рибонуклеаз. Гены некоторых тРНК содержат вблизи участка ДНК, ответственного за синтез антикодоновой петли, интронные после довательности (около 18 нуклеотидов). Эти участки также транскриби руются, поэтому процессинг тРНК включает, помимо удаления 18-членного рибонуклеотидного интрона, также необходимый сплайсинг антикодоновой области. Дальнейшая модификация включает присоединение триплета ЦЦА и образование акцепторного участка (на 3'-конце молекулы), к которому присоединяется аминокислота. Имеются данные, что метили рование предшественников тРНК у эукариот осуществляется в ядре, в то время как ферментативные процессы удаления интрона и присоединения триплета ЦЦА происходят, скорее всего, в цитоплазме. Помимо акцеп торного и антикодонового участков, тРНК содержит специфичные участки узнавания для ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз, а также участки для связывания с большими субчастицами рибосом (см. далее главу 14).

Биогенез рибосомных РНК У прокариот синтез 23S, 16S и 5S рРНК осуществляется из более крупного 30S предшественника, получившего название прерибосомной РНК (пре рРНК). Под действием специфических нуклеаз и метилаз из этого общего предшественника в результате процессинга сначала образуются проме жуточные рибосомные РНК, которые, подвергаясь дальнейшей нуклеазной атаке и метилированию, превращаются в зрелые молекулы (рис. 13.6).

Для ряда эукариотических клеток доказана транскрипция двух вы сокомолекулярных рРНК (18S и 28S) и одной низкомолекулярной рРНК (5,8S) из одного общего предшественника (45S);

последний представляет собой продукт генов рРНК, более тысячи копий которых содержит клетка.

Первичный транскрипт 45S рРНК высокометилирован, причем метили рованию в ядрышках подвергаются только те участки первичного транс крипта, из которых в процессе реакций процессинга образуются рРНК. Сам механизм процессинга первичного транскрипта резко отличается от про цессинга гяРНК при образовании мРНК. Образовавшаяся, например, мо лекула 28S рРНК еще в ядрышке подвергается дальнейшему метили рованию, затем она взаимодействует с синтезированными в цитоплазме рибосомными белками и формируется 60S рибосомная субчастица;

18S рРНК аналогичным способом участвуют в формировании 40S рибосомной субчастицы. Обе субчастицы стабильны в делящихся клетках и нестабильны в неделящихся клетках.

Следует указать, что синтез РНК при участии ДНК-зависимой РНК полимеразы специфически тормозится антибиотиком актиномицином D, который обладает способностью связываться водородными связями с ДНК Пре-рРНК Места эндо нуклеазной атаки Пре-23S РНК Пре-5S РНК Пре-16S РНК тРНК тРНК РНК 5S РНК 16S РНК 23S Рис. 13.6. Постсинтетическая модификация пре-рРНК прокариот (по Николову).

по месту остатков гуанина. Актиномицин D тормозит синтез РНК в ин тактных клетках. Он нашел широкое применение при определении про цессов, зависящих от транскрипции ДНК.

Синтез РНК на матрице РНК ДНК-зависимая РНК-полимераза может осуществлять транскрипцию ДНК нормальных клеток и ДНК-вирусов. Как же осуществляется синтез РНК у тех вирусов, которые в геноме вместо ДНК содержат РНК? Оказывается, в этих случаях вирусная РНК индуцирует образование в клетках хозяина (например, у Е. coli) РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая участвует в репликации вирусной РНК (отсюда второе название фермента – РНК репликаза). Фермент также используется нуклеозидтрифосфаты для син теза одноцепочечной вирусной РНК. Этот синтез должен пройти через стадию образования репликативной формы. Следовательно, на I стадии РНК-репликаза на матрице РНК-вируса специфически строит комплемен тарную, с противоположной полярностью цепь РНК. Последняя на II стадии служит матрицей для синтеза РНК, совершенно однотипной ис ходной вирусной РНК. Обе стадии катализируются одним и тем же ферментом, хотя в каждой из них участвуют различные белковые факторы.

Следует особо подчеркнуть, что, поскольку РНК-репликаза имеет от ношение только к вирусам, очевидно, на этом основании могут быть разработаны эффективные антивирусные лекарственные препараты.

Синтез РНК из нуклеозиддифосфатов. М. Грюнберг-Манаго и С. Очоа в 1955 г. в клетках Е. coli открыли особый фермент – полинуклеотид-фос форилазу. Этот фермент наделен способностью синтезировать in vitro полимерную молекулу РНК из однотипных или разных рибонуклеозид дифосфатов (НДФ). Реакция, являющаяся обратимой, протекает по урав нению:

(НМФ)n + НДФ –> (НМФ)n+1 + Н3РO4.

Рибонуклеозидтрифосфаты и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты не яв ляются субстратами фермента. Фермент не нуждается в матрице, однако для синтеза необходима затравочная цепь РНК (НМФ)n со свободной 3'-гидроксильной группой, к которой присоединяются остатки моно нуклеотидов. Образовавшаяся полимерная молекула РНК не имеет за данной специфической последовательности мононуклеотидов, но содержит 3'–>5' фосфодиэфирные связи, легко разрываемые рибонуклеазой. Отно сительно биологической роли этого фермента у бактерий предполагают, что он катализирует, скорее всего, обратную реакцию – расщепление мРНК с образованием нуклеозиддифосфатов.

Полученные в лаборатории С.С. Дебова данные свидетельствуют о более широком распространении полирибонуклеотид-фосфорилазы в жи вых организмах, чем это признавалось ранее. Фермент открыт также в клетках животных. Кроме того, получены экспериментальные дока зательства синтетической функции полинуклеотид-фосфорилазы. Вполне правомерно допущение, что этот фермент может принимать участие в синтезе коротких полирибонуклеотидов в клетках эукариот в норме и в некоторых экстремальных условиях. Кроме того, в лабораторных ус ловиях фермент может найти применение для синтеза РНК-праймеров, используемых далее при синтезе ДНК.

Проблемы генетической инженерии. Генетическая инженерия, по опре делению А.А. Баева, представляет собой систему экспериментальных приемов, позволяющих создавать в лаборатории (в пробирке) искусствен ные биологические структуры. В качестве инструментов для генно инженерных операций применяются созданные самой природой ферменты:

одни из них рассекают молекулу ДНК в строго определенных участках (рестриктазы), другие, напротив, сшивают разрозненные участки в еди ное целое (лигазы). Конечной целью генетической инженерии является получение организмов (животных и растений) с новыми наследственными свойствами с помощью лабораторных приемов. Для достижения этой пока еще отдаленной цели необходимо проведение огромной работы на уровне отдельного гена или генов. Ген, представленный определенным участком ДНК и соответствующий определенному белку, можно или выделить из другого организма, или синтезировать химическим либо биологическим путем. Впервые в 1969 г. из Е. coli был выделен участок ДНК с геном, ответственным за синтез фермента, катализирующего усвоение молочного сахара (лактозы),– так называемый лактозный оперон. Химический синтез гена аланиновой тРНК впервые осуществил Хар Гобинд Корана в 1970 г.

Состоящий из 72 нуклеотидов, этот ген, однако, лишен функциональной активности, так как в клетках тРНК синтезируется не в готовом виде, а в форме предшественника. Эти данные послужили для Кораны основой для синтеза гена-предшественника тирозиновой тРНК (из 126 нуклеоти дов), хотя сама тирозиновая тРНК состоит из 85 нуклеотидов. Ввиду громоздкости, а также недостаточной эффективности химического синтеза в последние годы все большее место занимают биологические методы синтеза генов при помощи обратной транскриптазы (ревертазы).

Для этого необходимо иметь мРНК, с помощью которой можно вос произвести соответствующий ген. Синтезированы ДНК-копии на мРНК, кодирующие синтез белка глобина (человека, кролика, мыши, голубя, утки), иммуноглобулина, белка хрусталика глаза и др. Однако на этом пути синтеза генов встречаются большие трудности, связанные с выделением из огромного разнообразия клеточных мРНК, нужной для синтеза гена.

Следующий этап генетической инженерии – перенос генов в клетку – осуществляется тремя способами: трансформацией (перенос генов посредством выделенной из клеток и освобожденной от примесей ДНК), трансдукцией (перенос генов посредством вирусов) и гибридизацией клеток, полученных из разных организмов (высших животных, микро организмов и др.) (рис. 13.7, 13.8). Заключительный этап этих экспери ментов сводится к адаптации введенного гена в организме хозяина, но он почти не зависит от искусства экспериментатора.

Исследования в области генетической инженерии могут служить основой для решения практических задач здравоохранения и сельского хозяйства.

Полученные в лаборатории искусственные гены, помимо широкого ис пользования в микробиологической и фармацевтической промышленности для приготовления кормового белка и лекарственных препаратов (инсулин, интерферон, гормон роста, гормоны щитовидной железы, стимуляторы иммунитета и др.), возможно, смогут применяться при лечении многих наследственных заболеваний (их насчитывается около 5000), генетический дефект которых точно известен пока только для небольшого числа (не более 50) болезней.

Первые попытки применения лактозного гена при галактоземии (на следственное заболевание, связанное с непереносимостью галактозы вслед ствие отсутствия фермента гексозо-1-фосфат-уридилилтрансферазы;

см.

Трансформация Трансдукция Белковая ДНК оболочка вируса ДНК вируса Ядро Вирус ДНК клетки мРНК Фермент Рис. 13.7. Схематическое изображение двух способов введения генов в клетку – трансформации и трансдукции (по А. А. Баеву).

Вирус Фаг Галактозный оперон SV Эндонуклеаза R Экзонуклеаза А Т А Концевая Т трансфераза Гибридная молекула (с 4 разрывами) ДНК-полимераза ДНК-лигаза Гибридная молекула, замкнутая в кольцо Рис. 13.8. Получение гибридной молекулы, содержащей одновременно ДНК вируса SV40, ДНК фага, и галактозный оперон (схема по А.А. Баеву).

Под действием эндонуклеазы R1 Е. coli кольцевые ДНК разрываются в одной точке, в резуль тате образуются линейные нити. Под действием другого фермента - экзонуклеазы (из фага) укорачиваются нити ДНК с противоположных концов. Далее при помощи фермента концевой трансферазы наращиваются нити ДНК, причем у одной ДНК новые концы состоят из адениловых (А), у другой - из тимидиловых (Т) остатков. При смешивании молекул концевые остатки А и Т образуют комплементарные пары, замыкая линейные молекулы в кольца.

Вначале эти кольца содержат 4 разрыва, которые затем закрываются при участии еще одного фермента - ДНК-лигазы.

главу 10) вселяют надежду на реальные практические возможности гене тической инженерии, хотя вполне обоснованы тревога и опасения, свя занные с вмешательством человека в сферу тончайших биологических процессов наследственного аппарата целостного организма. В последние годы, после бурного периода расцвета, в генетической инженерии наблю дается некоторый спад, обусловленный недостаточностью знаний о струк туре и функционировании генома клеток эукариот. Переход от иссле дований на клетках прокариот к исследованиям на клетках эукариот оказался затруднен рядом технических сложностей вследствие мозаич ности структуры генов последних. В частности, открытие эк зонов и интронов в г е н о м е, явления сплайсинга (формирование зрелой матричной РНК) указывает на необходимость соблюдения высочайшей точности процедуры вырезания необходимого гена из ДНК генома со ответствующими рестриктазами. В противном случае могут быть получены не структурные транслируемые гены, а интроны или участки экзонов, не кодирующие белок. После того как были разработаны методы искусствен ного синтеза и сшивки отдельных участков молекулы ДНК, появилась возможность конструирования и создания новых, неизвестных ранее в природе организмов с заранее заданными свойствами. Современная биотехнология явилась логическим развитием этого направления науки. Она сложилась на основе фундаментальных достижений биохимии, генетики и микробиологии, открыв широкие возможности для создания новых сортов растений, новых пород животных и т.п. Учитывая исключительную важность биотехнологии для народного хозяйства, в 1985 г. в нашей стране был создан и успешно работает межотраслевой научно-технический ком плекс (МНТК) «Биоген». Комплекс был призван обеспечить создание и организацию промышленного производства новых биологически ак тивных веществ и препаратов для медицины, ветеринарии, растениеводства на основе прогрессивных биотехнологических методов, в том числе методов клеточной и генетической инженерии.

Распад нуклеиновых кислот Полимерные молекулы нуклеиновых кислот расщепляются в тканях преимущественно гидролитическим путем при участии специфических фер ментов, относящихся к нуклеазам. Различают эндонуклеазы, разрывающие внутренние межнуклеотидные связи в молекулах ДНК и РНК, вызывающие деполимеризацию нуклеиновых кислот с образованием олигонуклеотидов, и экзонуклеазы, катализирующие гидролитическое отщепление концевых мононуклеотидов от ДНК и РНК или олигонуклеотидов. Помимо гидро литических нуклеаз, имеются ферменты, катализирующие распад нуклеино вых кислот, например, посредством трансферазной реакции. Они ката лизируют перенос остатка фосфорной кислоты от 5'-го углеродного атома рибозы одного мононуклеотида ко 2'-му углеродному атому соседнего мононуклеотида, сопровождающийся разрывом межнуклеотидной связи и образованием фосфодиэфирной связи между 2'-м и 3'-м углеродными атомами рибозы одного и того же мононуклеотида. К настоящему времени открыты группы нуклеаз, катализирующие распад ДНК и РНК.

Дезоксирибонуклеазы I катализируют разрыв внутренних фосфодиэфир ных связей в одной из двух цепей молекулы ДНК между 3'-м углеродным атомом дезоксирибозы и остатком фосфата с образованием низкомоле кулярных олигодезоксирибонуклеотидов:

ДНК + (n–1) Н2O –> n-Олигодезоксирибонуклеотиды.

Среди продуктов реакции открыты также моно- и динуклеотиды. Ти пичными представителями этих ферментов являются ДНКазы поджелу дочной железы. Одна из них (ДНКаза I) была получена в чистом виде, расшифрована последовательность всех ее 257 аминокислотных остатков.

Фермент наиболее активен при рН 6,8–8,0, активируется двухвалентными ионами Mg2+ и Мn2+ и ингибируется конечными продуктами фермен тативной реакции – олигонуклеотидами.

Дезоксирибонуклеазы II вызывают деполимеризацию молекулы ДНК в результате парных разрывов фосфодиэфирных связей обеих цепей ДНК с образованием более крупных олигодезоксирибонуклеотидов. Предста вителем их является ДНКаза II, выделенная из селезенки, имеющая мол.

массу 38000 и состоящая из 343 аминокислотных остатков. В составе этой ДНКазы открыт глюкозамин. Фермент также активируется ионами ме таллов, ингибируется анионами;

его оптимум рН между 5,5 и 5,8.

Помимо этих ферментов, открыты (преимущественно у микроорга низмов) еще экзодезоксирибонуклеазы, гидролизующие фосфодиэфирные связи молекулы ДНК с отщеплением концевых 5'-дезоксирибонуклеотидов.

Например, из E. coli выделено четыре таких фермента, обозначаемых экзодезоксирибонуклеазами I, II, III и IV.

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 14 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.