WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 14 |

«Учебная литература для студентов медицинских вузов Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин Биологическая химия Издание третье, переработанное и дополненное Рекомендован Управлением научных и образовательных ...»

-- [ Страница 3 ] --

А.Е. Браунштейн ПОНЯТИЕ О ФЕРМЕНТАХ Ферменты, или энзимы, представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый живыми организмами для осуществления с высокой скоростью многих тысяч взаимосвязанных хи мических реакций, включая синтез, распад и взаимопревращение огромного множества разнообразных химических соединений. Жизнь и многообразие ее проявлений – сложная совокупность химических реакций, катализируе мых специфическими ферментами. И.П. Павлов считал ферменты «возбу дителями всех химических превращений» у живых существ. Как известно, важнейшим свойством живого организма является обмен веществ, уско ряющим аппаратом, основой молекулярных механизмов интенсивности которого являются ферменты. «Вся тайна животной жизни,– писал Д.И. Менделеев,– заключается в непрерывных химических превращениях веществ, входящих в состав животных тканей».

В настоящее время теоретические и практические достижения энзимо логии используются в решении многих проблем биохимии и молекулярной биологии, включая их сравнительное и эволюционное рассмотрение. «Под знаком молекулярной энзимологии,– говорил на III Всесоюзном биохими ческом съезде (1974) А.Е. Браунштейн,– развивается и встречное течение – реконструкция или интеграция, восходящая от молекулярного яруса к выс шим уровням структурно-функциональной организации живого и про низывающая весь комплекс актуальных проблем биологии и медицины».

Ферменты обеспечивают осуществление таких важнейших процессов жизнедеятельности, как экспрессия (реализация) наследственной информа ции, биоэнергетика, синтез и распад биомолекул (обмен веществ). Изучение их способствует проникновению в суть и сокровенные тайны того зага дочного явления, которое мы называем жизнью. Этими обстоятельствами может быть объяснено пристальное внимание исследователей к проблемам структуры, функций и молекулярных механизмов действия ферментов.

От неорганических катализаторов ферменты отличаются рядом харак терных особенностей. Прежде всего ферменты чрезвычайно эффективны и проявляют в миллионы и миллиарды раз более высокую каталитическую активность в условиях умеренной температуры (температура тела), нор мального давления и в области близких к нейтральным значениям рН среды.

Ферменты отличаются высокой специфичностью действия в отношении как химической природы субстрата, так и типа реакции, т.е. каждый фермент катализирует в основном только определенную химическую реак цию. Для каждого фермента характерны специфическая последователь ность расположения аминокислотных остатков и пространственная кон формация. Существенной особенностью ферментов является также то, что их активность в клетках строго контролируется как на генетическом уровне, Бактериальное брожение Физиологическая Врожденные регуляция нарушения обмена Биохимическая Катализ эволюция Клеточный Превращение метаболизм энергии Макромо Кинетика Ферменты лекулы реакций Биосинтез Питание Фармакология Генетический аппарат Коферменты Ультраструктура мембран Рис. 4.1. Области применения ферментов в биологии и медицине (по Грину).

так и посредством определенных низкомолекулярных соединений, в част ности субстратов и продуктов реакций, катализируемых этими же фермен тами, ингибиторов и др. Таким образом, молекула фермента характе ризуется уникальностью структуры, которая и определяет уникальность ее функции.

Учение о ферментах выделено в самостоятельную науку – энзимологию.

Термин «энзим» (от греч. en zyme – в дрожжах), так же как и «фермент» (от лат. fermentatio – брожение), означает процесс, связанный с выделением газов, брожением.

В настоящее время учреждены научно-исследовательские институты по изучению ферментов, издаются специальные журналы, созываются на циональные и международные симпозиумы и конференции, посвященные проблемам энзимологии. Наука о ферментах интенсивно развивается в тес ной связи со многими науками, в частности с органической, неорганической и физической химией, физиологией, токсикологией, микробиологией, гене тикой, фармакологией и др. Таким образом, эта область знаний находится на стыке химических, биологических и медицинских наук.

Энзимология в ее современном физико-химическом и молекулярном понимании решает две главные, неразрывно связанные между собой проб лемы: определение структурной макромолекулярной организации фермен тов и изучение природы химических взаимодействий, лежащих в основе ферментативного катализа. Накопление экспериментальных данных и раз витие теоретических представлений происходят настолько быстро, что любой учебник к моменту выхода в свет уже не отражает достаточно полно современное состояние вопроса о структуре и функциях ферментов.

Важно подчеркнуть, что изучение ферментов имеет огромное значение для любой фундаментальной и прикладной области биологии, а также для многих практических отраслей химической, пищевой и фармацевтической индустрии, занятых приготовлением катализаторов, антибиотиков, вита минов и многих других биологически активных веществ, используемых в народном хозяйстве и медицине (рис. 4.1). В фармакологии действие многих лекарственных препаратов основано на определенном, хотя часто еще не выявленном, механизме взаимодействия их с ферментами. Успехи общей и молекулярной энзимологии способствуют развитию новой ее ветви – медицинской энзимологии, цели и задачи, методологические под ходы которой связаны с решением проблем энзимопатологии, энзимо диагностики и энзимотерапии (см. далее). Наука о питании базируется на точных знаниях поэтапного расщепления питательных веществ под влия нием ферментов пищеварительного аппарата, на количественный и качест венный состав которых существенное влияние оказывает характер посту пающих с пищей веществ. Многие проблемы наследственной патологии человека, развитие врожденных пороков обмена тесно связаны с дефектами или полным отсутствием синтеза специфических ферментов. Проблемы клеточного роста и развития, дифференцировки клеток высших организмов, физиологических функций (движение, перемещение в пространстве, транс порт веществ и ионов, процессы возбуждения и торможения и др.) опре деляются в большой степени работой биокатализаторов, включая их биосинтез и инактивацию. Таким образом, есть все основания для под тверждения положения, что не только современная биология, как отмечает акад. А.Е. Браунштейн, но и медицина «говорит на языке энзимологии».

КРАТКАЯ ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ УЧЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ Явления брожения и переваривания известны с незапамятных времен, однако зарождение учения о ферментах (энзимология) относится к первой половине XIX в. Первое научное представление о ферментах было дано еще в 1814 г. петербургским ученым К.С. Кирхгофом, который показал, что не только проросшие зерна ячменя, но и экстракты из солода способны осахаривать крахмал с превращением его в мальтозу. Вещество, извлекае мое из проросшего ячменя и обладающее способностью превращать крах мал в мальтозу, получило название амилазы. Ю. Либих и Ф. Велер от крыли агент, расщепляющий амигдалин, содержащийся в эфирном масле горького миндаля. Этот агент был назван эмульсином. В последующие годы были описаны другие ферменты, в частности пепсин и трипсин, вызывающие распад (гидролиз) белков в пищеварительном тракте.

Наибольшее внимание исследователей привлекали процессы окисления в организме. Уже был известен феномен химического катализа, означаю щий, что многие реакции in vitro протекают быстро и энергично в при сутствии ничтожных количеств примесей, как будто не участвующих в реак ции. Так, была установлена большая каталитическая роль ряда неорга нических веществ. Горение глюкозы на воздухе, например, протекает очень медленно, а если добавить немного солей лития (или золы, также содержа щей ничтожные количества лития), то горение идет весьма интенсивно:

С6Н12О6 + 6O2 –> 6СO2 + 6Н2O.

Известно, что в живых организмах «горение» (а точнее, окисление) углеводов также протекает быстро и до тех же конечных продуктов обмена, т.е. СО2 и Н2О, с выделением (и накоплением) энергии. Однако это «горение» происходит при относительно низкой температуре, без пламени и, что особенно интересно, в присутствии воды. Разумеется, в этих необыч ных условиях без действия ферментов, получивших наименование биоло гических катализаторов, не было бы окисления углеводов. Забегая несколько вперед, укажем, что в процессе превращения (окисления) глю козы в организме до СО2 и Н2О участвует последовательно около различных ферментов (см. главу 10).

Биологические катализаторы, т.е. ферменты, как оказалось, не вызы вают в отличие от неорганических катализаторов каких-либо побочных реакций и не участвуют в реакциях, невозможных по термодинамическим условиям;

и те, и другие катализаторы только ускоряют химические реакции, обычно протекающие очень медленно. Примером может служить реакция расщепления перекиси водорода на кислород и воду, медленно протекающая в отсутствие катализатора. При добавлении мелкораздроб ленной платины скорость этой реакции резко возрастает:

Платина 2Н2O2 (или каталаза) 2Н2O + O2.

Эта же реакция будет протекать намного быстрее в присутствии фермен та каталазы, содержащейся, в частности, в эритроцитах, причем образуются те же конечные продукты распада перекиси водорода.

Таким образом, можно считать установленным, что ферменты ката лизируют ряд химических реакций, аналогичных химическим реакциям, катализируемым неорганическими веществами. Более того, считается ус тановленным, что любую из протекающих в живых организмах (или клетках) химическую реакцию можно в принципе осуществить вне орга низма (или вне клетки), если экспериментатору удается выделить соот ветствующий фермент (или систему ферментов), катализирующий данную реакцию, и создать оптимальные условия для его действия.

Горизонты энзимологии. В литературе появляются работы, в которых делаются попытки прогнозирования дальнейшего развития энзимологии на ближайшее десятилетие. Перечислим основные направления исследований энзимологии будущего. Во-первых, это исследования более тонких деталей молекулярного механизма и принципов действия ферментов в соответствии с законами классической органической химии и квантовой механики, а также разработка на этой основе теории ферментативного катализа.

Во-вторых, это изучение ферментов на более высоких уровнях (надмоле кулярном и клеточном) структурной организации живых систем, причем не столько отдельных ферментов, сколько ферментных комплексов в сложных системах. В-третьих, исследование механизмов регуляции активности и синтеза ферментов и вклада химической модификации в действие фермен тов. В-четвертых, будут развиваться исследования в области создания искусственных низкомолекулярных ферментов – синзимов (синтетические аналоги ферментов), наделенных аналогично нативным ферментам высокой специфичностью действия и каталитической активностью, но лишенных побочных антигенных свойств. В-пятых, исследования в области инже нерной энзимологии (белковая инженерия), создание «гибридных» ката лизаторов, сочетающих свойства ферментов, антител и рецепторов, а также создание биотехнологических реакторов с участием индивидуальных фер ментов или полиферментных комплексов, обеспечивающих получение и производство наиболее ценных материалов и средств для народного хо зяйства и медицины. Наконец, исследования в области медицинской эн зимологии, основной целью которых является выяснение молекулярных основ наследственных и соматических болезней человека, в основе развития которых лежат дефекты синтеза ферментов или нарушения регуляции активности ферментов.

ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ФЕРМЕНТОВ В настоящее время получены неопровержимые экспериментальные дока зательства белковой природы ферментов *.

Трудно сейчас представить, что не только Р. Вильштеттер еще в 1926 г.

отрицал принадлежность ферментов к белкам или к какому-либо извест ному классу органических веществ, но и совсем недавно высказывались сомнения на этот счет. Поводом для сомнений являлись опыты, в которых хотя и были получены ферментативно активные растворы, но белок не мог быть обнаружен при помощи качественных цветных реакций. Объясняется это тем, что концентрация фермента даже при высокой удельной актив ности оказывалась ниже пороговой чувствительности химического теста на белок.

О белковой природе ферментов свидетельствует факт инактивирования (потеря активности) ферментов брожения при кипячении, установленный еще Л. Пастером. При кипячении наступает необратимая денатурация белка-фермента. Фермент при этом теряет присущее ему свойство ка тализировать химическую реакцию. Точно так же белки при кипячении денатурируются и теряют свои биологические свойства (антигенные, гор мональные, каталитические). Под влиянием различных физических и хи мических факторов (воздействие УФ- и рентгеновского излучения, ультра звука, осаждение минеральными кислотами, щелочами, алкалоидными реактивами, солями тяжелых металлов и др.) происходит денатурация ферментов, так же как и белков.

Ферменты при гидролизе, как и белки, распадаются на аминокислоты, что, бесспорно, служит веским доказательством белковой природы фер ментов **.

Интересные данные, указывающие на белковую природу ферментов, были получены в лаборатории И.П. Павлова. При определении пере варивающей способности желудочного сока была обнаружена прямая зависимость между этой способностью и количеством белка в соке. В связи с этим было сделано заключение, что пепсин желудочного сока является белком.

Вескими доказательствами белковой природы фермента являются его получение в чистом виде и выделение в форме кристаллов белка. К настоя щему времени получено более 1000 кристаллических ферментов. Структура многих из них изучена детально при помощи современных методов химии белков и молекулярной физики [методами рентгеноструктурного анализа, ядерного магнитного резонанса (ЯМР), электронного парамагнитного ре зонанса (ЭПР) и др.].

Ферменты, как и все белки, обладают рядом свойств, характерных для высокомолекулярных соединений: амфотерностью (могут существовать в растворе в виде анионов, катионов и амфионов);

электрофоретической подвижностью благодаря наличию в них положительных и отрицательных зарядов, а в изоэлектрической точке не обнаруживают подвижности в электрическом поле. Ферменты неспособны к диализу через полупрони * Единственным исключением из этого положения является обнаружение у молекулы ряда предшественников РНК ферментативной активности, получившей название рибозима и ка тализирующей самосплайсинг, т.е. отщепление интронных нетранслируемых последователь ностей от предшественника РНК (см. главу 13).

** Некоторые ферменты, помимо белковой части, содержат небелковый компонент, образуя молекулу сложного белка (см. далее).

цаемые мембраны. При помощи диализа их растворы можно освободить от низкомолекулярных примесей. Как и белки, они легко осаждаются из водных растворов при низких температурах методами высаливания или осторожным добавлением ацетона, этанола и других веществ и при этом не теряют своих каталитических свойств.

Подобно белкам, ферменты имеют большую молекулярную массу – от десятков тысяч до нескольких миллионов (табл. 4.1).

Таблица 4.1. Молекулярная масса ферментов Молекулярная Молекулярная Фермент Фермент масса масса Рибонуклеаза 13700 Лактатдегидрогеназа Цитохром с 15000 Альдолаза Трипсин 23800 Каталаза Пепсин 32100 Глутаматдегидрогеназа Гексокиназа 45000 Уреаза Щелочная фосфатаза 80000 Пируватдегидрогеназа (комплекс) Ферменты оказывают высокоспецифическое действие, что также дока зывает их белковую природу, поскольку белки в иммунологическом отно шении отличаются крайне высокой специфичностью. Наконец, прямым доказательством белковой природы ферментов является лабораторный синтез первого фермента – рибонуклеазы, осуществленный в 1969 г. в ла боратории Б. Меррифилда в Нью-Йорке *.

Этот автоматический синтез на твердой фазе состоял в последова тельном включении всех 124 аминокислотных остатков в строгом соот ветствии с последовательностью аминокислот (с первичной структурой) естественного фермента – рибонуклеазы поджелудочной железы **.

Искусственно синтезированный фермент не отличался от природной рибонуклеазы по химическим, каталитическим и иммунологическим тес там.

Принимая во внимание перечисленные обстоятельства, при получении ферментов в чистом виде и при их хранении следует учитывать одно важное свойство белков, а именно стабильность, которая определяется рядом факторов. Одним из общих правил при работе с ферментами является оптимальная температура, обычно соответствующая температуре тела, а для препаративных целей – использование температуры около 0°С.

Следует, однако, иметь в виду, что несколько ферментов, весьма чувствительных к пониженной температуре, в частности митохондриальный фермент (АТФаза), катализирующий распад АТФ, при 0°С подвергается инактивации, в то время как при комнатной температуре остается стабиль ным. Большинство ферментов сохраняет стабильность при рН 6,0–8,0, хотя имеются исключения. Для препаративных целей часто прибегают к обезво * Полную первичную структуру панкреатической рибонуклеазы расшифровали в 1955 г.

С. Мур и У. Стейн.

** Осуществлен также искусственный синтез второго фермента – лизоцима, состоящего из 118 аминокислотных остатков.

живанию фермента (удаление воды) в вакууме из замороженного раствора (метод получил название «лиофилизация»). Осаждение из раствора фер ментов спиртом или ацетоном также проводят при низкой температуре, поскольку при комнатной температуре эти процедуры приводят к почти полной потере ферментативной активности. Для стабилизации фермента часто пользуются хелатообразующими агентами: например, к ферменту добавляют этилендиаминтетраацетат (ЭДТА):

ЭДТА может связывать нежелательные примеси (следы ионов тяжелых металлов: меди, свинца, ртути и др. – в реактивах), тормозящие активность фермента. Одно из непременных условий сохранения стабильности фер ментов – хранение их в высушенном или замороженном состоянии (в усло виях холода). Многие ферменты стабильны в виде суспензии в концентри рованных растворах сульфата аммония.

СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ В природе существуют как простые, так и сложные ферменты. Первые целиком представлены полипептидными цепями и при гидролизе распа даются исключительно на аминокислоты. Такими ферментами (простые белки) являются гидролитические ферменты, в частности пепсин, трипсин, папаин, уреаза, лизоцим, рибонуклеаза, фосфатаза и др. Большинство природных ферментов относится к классу сложных белков, содержащих, помимо полипептидных цепей, какой-либо небелковый компонент (кофак тор), присутствие которого является абсолютно необходимым для ката литической активности. Кофакторы могут иметь различную химическую природу и различаться по прочности связи с полипептидной цепью. Если константа диссоциации сложного фермента настолько мала, что в растворе все полипептидные цепи оказываются связанными со своими кофакторами и не разделяются при выделении и очистке, то такой фермент получает название холофермента (холоэнзим), а кофактор – простетической группы, рассматривающейся как интегральная часть молекулы фермента.

Полипептидную часть фермента принято называть апоферментом.

В литературе до сих пор употребляются и другие наименования компо нентов сложных ферментов, в частности «фермент-протеид», «белковый компонент» (апофермент), «кофермент» (коэнзим) и «простетическая груп па». Под коферментом часто подразумевают дополнительную группу, легко отделяемую от апофермента при диссоциации. Предполагают, что простетическая группа может быть связана с белком ковалентными и неко валентными связями. Так, в молекуле ацетилкоэнзим-А-карбоксилазы ко фактор биотин ковалентно связан с апоферментом посредством амидной связи (см. главу 7). С другой стороны, химические связи между кофакто рами и пептидными цепями могут быть относительно слабыми (например, водородные связи, электростатические взаимодействия и др.). В таких случаях при выделении ферментов наблюдается полная диссоциация обеих частей, и изолированый белковый компонент оказывается лишенным фер ментативной активности, пока не будет добавлен извне недостающий кофактор. Именно к подобным изолированным низкомолекулярным орга ническим веществам применим термин «кофермент», типичными предста вителями которых являются витамины В1, В2, В6, РР, содержащие кофер менты. Известно также, что и простетические группы, и коферменты активно включаются в химические реакции, выполняя функции промежу тоных переносчиков электронов, атомов водорода или различных функцио нальных групп (например, аминных, ацетильных, карбоксильных). В подоб ных случаях кофермент рассматривают в качестве второго субстрата, или косубстрата.

Роль кофермента (Ко) в качестве переносчика, например, атомов водо рода может быть представлена в виде схемы, где SH – субстрат, КоЕ – хо лофермент, А – акцептор протона:

SH КoЕ AH S КоЕН A Субстрат подвергается окислению, отдавая электроны и протоны, а КоЕ – восстановлению, принимая электроны и протоны. В следующей полуреакции восстановленный КоЕН может отдавать электроны и протоны на какой-либо другой промежуточный переносчик электронов и протонов или на конечный акцептор (см. главу 9).

Коэнзим, кофактор, простетическая группа – двусмысленный биохими ческий жаргон. До сих пор продолжается терминологический спор, по скольку часто определения «коэнзим», «кофактор» и «простетическая груп па» рассматриваются через призму их роли в реакциях энзиматического (ферментативного) катализа. Следует, однако, считаться с тем неоспо римым фактом, что во многих случаях небелковые органические молекулы, как и ионы металлов, абсолютно необходимы белковому компоненту при выполнении определенной биологической функции, не имеющей отношения к биокатализу. Несомненно, имеют значение также тип и характер связи небелкового компонента с молекулой белка. Поэтому очевидно, что ко фактором может служить любой фактор, абсолютно необходимый для выполнения белком его каталитической или любой другой биологической роли. С другой стороны, коферментом может быть любой небелковый фактор, который непосредственно вовлечен в реакцию энзиматического катализа. Кофактор, который непосредственно не участвует в акте ката лиза, не является коэнзимом. В то же время простетическую группу (ковалентно связанный небелковый компонент, необходимый для опреде ленной функции) можно назвать коферментом, если она непосредственно участвует в энзиматической реакции. Простетическая группа, которая не вовлечена в акт катализа, но функционально является существенным как для фермента, так и для некаталитического белка, может быть названа кофактором. И наконец, кофактор и кофермент, непрочно связанные (или слабо связанные) с ферментом или белком, тем не менее не классифи цируются в качестве простетических групп.

Многие двухвалентные металлы (Mg2+, Мn2+, Са2+), как будет пока зано далее, также выполняют роль кофакторов, хотя они не относятся ни к коферментам, ни к простетическим группам. Известны примеры, когда ионы металлов прочно связаны с белковой молекулой, выполняя функции простетической группы. В частности, очищенный фермент, катализирую щий окисление аскорбиновой кислоты (витамин С) в дезоксиаскорбиновую кислоту, содержит 8 атомов меди на одну молекулу;

все они настолько прочно связаны с белковой молекулой, что даже не обмениваются с ионо обменными смолами и не отделяются методом диализа. Более того, с помощью метода электронного парамагнитного резонанса показано участие ионов меди в промежуточном переносе электронов. Интересно отметить, что свободные ионы меди также наделены каталитической активностью при окислении аскорбиновой кислоты, однако эта активность повышается во многие тысячи раз, если ионы меди соединяются с апофер ментом в единый комплекс – холофермент.

Данные о важнейших коферментах и простетических группах ферментов, включая их наименования и структуру, химическую природу витамина, входящего в их состав, и характер выполняемой биохимической функции в метаболизме, детально рассмотрены в главах 7 и 9–13.

Получены доказательства кофакторной функции в ферментативных реакциях и ряда других биологически активных соединений, не относящихся к витаминам: HS-глутатиона, АТФ, липоевой кислоты, производных ну клеозидов (уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоаденозинфосфосульфат), порфиринсодержащих веществ и др. Сюда же могут быть отнесены тРНК, которые в составе ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз принимают ак тивное участие в транспорте аминокислот в рибосоме, где осуществляется синтез белка (см. главу 14).

Следует отметить одну отличительную особенность двухкомпонентных ферментов: ни кофактор отдельно (включая большинство коферментов), ни сам по себе апофермент каталитической активностью не наделены, и только их объединение в одно целое, протекающее не хаотично, а в соответствии с программой их структурной организации, обеспечивает быстрое про текание химической реакции.

Активный центр ферментов При изучении механизма химической реакции, катализируемой фермента ми, исследователя всегда интересует не только определение промежуточных и конечных продуктов и выяснение отдельных стадий реакции, но и природа тех функциональных групп в молекуле фермента, которые обеспечивают специфичность действия фермента на данный субстрат (субстраты) и высо кую каталитическую активность. Речь идет, следовательно, о точном знании геометрии и третичной структуры фермента, а также химической природы того участка (участков) молекулы фермента, который обеспе чивает высокую скорость каталитической реакции. Участвующие в фер ментативных реакциях молекулы субстратов часто имеют небольшие раз меры по сравнению с молекулами ферментов, поэтому было высказано предположение, что при образовании фермент-субстратных комплексов в непосредственный контакт с молекулой субстрата, очевидно, вступает ограниченная часть аминокислот пептидной цепи. Отсюда возникло пред ставление об активном центре фермента. Под активным центром подразумевают уникальную комбинацию аминокислотных остатков в мо лекуле фермента, обеспечивающую непосредственное связывание ее с мо лекулой субстрата и прямое участие в акте катализа (рис. 4.2). Установлено, что у сложных ферментов в состав активного центра входят также просте тические группы.

В активном центре условно различают так называемый каталити Рис. 4.2. Активный центр фер мента (схема) (по Малеру и Кордесу).

Темные полосы - участки полипеп тидной цепи фермента;

R - амино кислотные остатки и их порядковые номера (с N-конца).

ческий центр, непосредственно вступающий в химическое взаимодейст вие с субстратом, и связывающий центр, или контактную («якор ную») площадку, которая обеспечивает специфическое сродство к субст рату и формирование его комплекса с ферментом. В свою очередь молекула субстрата также содержит функционально различные участки: например, субстраты эстераз или протеиназ – одну специфическую связь (или группу атомов), подвергающуюся атаке со стороны фермента, и один или несколь ко участков, избирательно связываемых ферментом.

Связывающий Каталити центр ческий центр Активный центр Молекула химотрипсина Получены экспериментальные доказательства наличия в активном цент ре химотрипсина двух остатков гистидина и остатка серина, схематически представленных в трехмерной структурной модели предшественника этого фермента (рис. 4.3). Выявление химической природы и вероятной топогра фии групп активного центра – проблема первостепенной важности. Она сводится к определению природы аминокислот, их последовательности и взаиморасположения в активном центре. Для идентификации так назы ваемых существенных аминокислотных остатков используют специфиче ские ингибиторы ферментов (часто это субстратподобные вещества или аналоги коферментов), методы «мягкого» (ограниченного) гидролиза в со четании с химической модификацией, включающей избирательное окисле ние, связывание, замещение остатков аминокислот и др.

При помощи методов ингибиторного анализа были предприняты по пытки установить закономерности состава и структуры активных центров у ферментов, относящихся к разным группам. В частности, при использо Рис. 4.3. Гипотетическая модель тре тичной структуры молекулы пред шественника химотрипсина (по Ней рату).

Цветом выделены остатки серина и гисти дина;

стрелкой обозначено место отщеп ления N-концевого участка полипептид ной цепи.

вании диизопропилфторфосфата (ДФФ), принадлежащего к так называе мым нервным ядам, наблюдается полное выключение активного центра холинэстеразы – фермента, катализирующего гидролиз ацетилхолина на холин и уксусную кислоту. Оказалось, что этот ингибитор имеет близкое структурное сходство с ацетилхолином и подобно ему взаимодействует с ОН-группой остатка серина в активном центре. Вызывая фосфори лирование серина в активном центре ряда других ферментов, ДФФ также инактивирует их действие:

Неактивный фермент Активный фермент ДФФ Показано, что ДФФ избирательно фосфорилирует в каждом чувстви тельном к нему ферменте только один остаток серина, наделенный функциональной активностью. Учитывая этот механизм действия ДФФ, сделаны попытки определения природы аминокислот в окружении «ка талитического» остатка серина у ряда ферментов (табл. 4.2).

Из данных табл. 4.2 видно, что ферменты, сходные по типу действия, хотя и различаются специфичностью, могут иметь почти одинаковую последовательность аминокислотных остатков в тех участках, которые примыкают к остатку серина, несущему функционально активную гидро ксильную группу. Существенное значение ОН-группы серина для акта катализа было доказано, кроме того, химическим ее блокированием или удалением, когда эстеразы полностью лишались ферментативной актив ности.

Таблица 4.2. Последовательность аминокислотных остатков, расположенных вокруг серина в молекулах ряда эстераз и протеиназ (по Малеру и Кордесу) Последовательность остатков Фермент аминокислот вокруг серина —Гли—Асп—Сер—Гли—Гли— Химотрипсин —Гли—Асп—Сер—Гли—Про—Вал— Трипсин Тромбин —Асп—Сер—Гли— Эластаза —Асп—Сер—Гли— Бутирилхолинэстераза —Гли—Глу—Сер—Ала— Ацетилхолинэстераза —Глу—Сер—Ала— Алиэстераза печени —Гли—Глу—Сер—Ала—Гли—Гли— —Тре—Асп—Сер—Ала—Сер—Ала— Щелочная фосфатаза (E. coli) —Гли—Тре—Сер—Мет—Ала— Субтилизин (В. subtilis) —Тре—Сер—Мет—Ала— Протеаза (Aspergillius orizae) Фосфоглюкомутаза —Тре—Ала—Сер—Гис—Асп— Фосфорилаза —Глн—Иле—Сер—Вал—Apг— Предполагают, что формирование активного центра фермента начи нается уже на ранних этапах синтеза белка-фермента (см. главу 14) на рибосоме, когда линейная одномерная структура пептидной цепи превра щается в трехмерное тело строго определенной конфигурации. Образо вавшийся белок приобретает информацию совершенно нового типа, а именно функциональную (в частности, каталитическую). Любые воздейст вия, приводящие к денатурации, т.е. нарушению третичной структуры, приводят к искажению или разрушению структуры активного центра и соответственно потере ферментом каталитических свойств. Если при подходящих внешних условиях удается восстановить нативную трехмерную структуру белка-фермента (ренатурировать его), то восстанавливается и его каталитическая активность. Это было показано впервые на примере рибо нуклеазы поджелудочной железы (см. рис. 1.13).

Помимо активного центра, в молекуле фермента может присутствовать также аллостерический центр (или центры) (от греч. allos – другой, иной и steros – пространственный, структурный), представляющий собой участок молекулы фермента, с которым связываются определенные, обыч но низкомолекулярные, вещества (эффекторы, или модификаторы), мо лекулы которых отличаются по структуре от субстратов. Присоединение эффектора к аллостерическому центру изменяет третичную и часто также четвертичную структуру молекулы фермента и соответственно конфигу рацию активного центра, вызывая снижение или повышение энзимати ческой активности. Ферменты, активность каталитического центра которых Рис. 4.4. Схематическое изображе ние аллостерического фермента, состоящего из двух протомеров, соединенных по типу гетерологи ческой («голова»-«хвост») ассо циации (по Кошленду).

S – субстрат;

М1 – модификатор, связы вающийся в активном центре;

М2 – мо дификатор, связывающийся в аллосте рическом центре (эффектор).

подвергается изменению под влиянием аллостерических эффекторов, свя зывающихся с аллостерическим центром, получили название аллосте рических ферментов *.

Отличительной особенностью ряда аллостерических ферментов является наличие в молекуле олигомерного фермента нескольких активных центров и нескольких аллостерических регуляторных центров, пространственно удаленных друг от друга. В аллостерическом ферменте каждый из двух симметрично построенных протомеров содержит один активный центр, связывающий субстрат S, и один аллостерический центр, связывающий эффектор М2, т.е. 2 центра в одной молекуле фермента (рис. 4.4). Получены доказательства, что для субстрата аллостерические ферменты, помимо активного центра, содержат и так называемые эффекторные центры;

при связывании с эффекторным центром субстрат не подвергается катали тическому превращению, однако он влияет на каталитическую эффектив ность активного центра. Подобные взаимодействия между центрами, свя зывающими лиганды одного типа, принято называть гомотропными взаимодействиями, а взаимодействия между центрами, связывающими лиганды разных типов, – гетеротропными взаимодействиями.

Таким образом, приведенные сведения о химической природе активного центра и аллостерических участках свидетельствуют о том, что в энзима тическом катализе, как и в реакции связывания субстрата, участвует не ограниченная и небольшая часть фермента, как предполагалось ранее, а значительно большая часть молекулы белка-фермента. Этими обстоя тельствами, вероятнее всего, можно объяснить большие размеры и объем ность трехмерной структуры молекулы фермента;

эти же обстоятельства следует учитывать в программах создания искусственных низкомолеку лярных аналогов ферментов (синзимов), обладающих свойствами на тивных ферментов (см. ранее).

ИЗОФЕРМЕНТЫ Изоферменты, или изоэнзимы,– это множественные формы фермента, ка тализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся друг от друга по физическим и химическим свойствам, в частности по сродству к субстрату, * Ряд авторов рекомендуют пользоваться термином «регуляторный центр» (ре гуляторный фермент) для ферментов, обладающих регуляторными функциями, поскольку в этом случае якобы отпадает необходимость уточнения наличия на поверхности фермента особого центра для связывания эффектора.

12,5 нм а б Рис. 4.5. Модели строения некоторых олигомерных фер ментов.

а - молекула глутаматдегидроге назы, состоящая из 6 протоме ров (общая мол. м. 336000);

б молекула РНК-полимеразы;

в половина молекулы каталазы;

в г - молекулярный комплекс пи руватдегидрогеназы.

г максимальной скорости катализируемой реакции (активности), электро форетической подвижности или регуляторным свойствам.

В живой природе имеются ферменты, молекулы которых состоят из двух и более субъединиц, обладающих одинаковой или разной первичной, вторичной или третичной структурой. Субъединицы нередко называют протомерами, а объединенную олигомерную молекулу – мультимером (рис.

4.5;

см. главу 1).

Считают, что процесс олигомеризации придает субъединицам белков повышенную стабильность и устойчивость по отношению к действию денатурирующих агентов, включая нагревание, влияние протеиназ и др.

Однако на нынешнем этапе знаний нельзя ответить однозначно на вопрос о существенности четвертичной структуры для каталитической активности ферментов, поскольку пока отсутствуют методы, позволяющие в «мягких» условиях разрушить только лишь четвертичную структуру. Применяемые обычно методы жесткой обработки (экстремальные значения рН, высокие концентрации гуанидинхлорида или мочевины) приводят к разрушению не только четвертичной структуры, но и вторичной и третичной структур стабильного олигомерного фермента, протомеры которого оказываются денатурированными и, как следствие этого, лишенными биологической активности.

Следует указать на отсутствие ковалентных, главновалентных связей между субъединицами. Связи в основном являются нековалентными, поэтому такие ферменты довольно легко диссоциируют на протомеры.

Удивительной особенностью таких ферментов является зависимость актив ности всего комплекса от способа упаковки между собой отдельных субъединиц. Если генетически различимые субъединицы могут сущест вовать более чем в одной форме, то соответственно и фермент, образо ванный из двух или нескольких типов субъединиц, сочетающихся в разных ~9, нм количественных пропорциях, может существовать в нескольких сходных, но не одинаковых формах. Подобные разновидности фермента получили название изоферментов (изоэнзимов или, реже, изозимов). В частности, если фермент состоит из 4 субъединиц двух разных типов – Н и М (сер дечный и мышечный), то активный фермент может представлять собой одну из следующих комбинаций: НННН, НННМ, ННММ, НМММ, ММММ, или Н4, Н3М, Н2М2, НМ3, М4, соответствующую изоферментам ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4 и ЛДГ5. При этом синтез Н- и М-типов осуществляется различными генами и в разных органах экспрессируется по-разному.

В одних случаях субъединицы имеют почти идентичную структуру и каждая содержит каталитически активный участок (например, -галакто зидаза, состоящая из 4 субъединиц). В других случаях субъединицы ока зываются неидентичными. Примером последних может служить трипто фансинтаза, состоящая из 2 субъединиц, каждая из которых наделена собственной (но не основной) энзиматической активностью, однако, только будучи объединенными в макромолекулярную структуру, обе субъединицы проявляют триптофансинтазную активность.

Термин «множественные формы фермента» применим к белкам, ка тализирующим одну и ту же реакцию и встречающимся в природе в орга низмах одного вида. Термин «изофермент» применим только к тем мно жественным формам ферментов, которые появляются вследствие гене тически обусловленных различий в первичной структуре белка (но не к формам, образовавшимся в результате модификации одной первичной последовательности).

Одним из наиболее изученных 4 ферментов, множественность форм которого детально изучена методом гель-электрофореза, является ЛДГ, катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в мо лочную. Пять изоферментов ЛДГ образуются из 4 субъединиц примерно одинакового размера, но двух разных типов. Поскольку Н-протомеры несут более выраженный отрицательный заряд при рН 7,0–9,0, чем М-про томеры, изофермент, состоящий из 4 субъединиц Н-типа (Н4), при электро форезе будет мигрировать с наибольшей скоростью в электрическом поле к положительному электроду (аноду). С наименьшей скоростью будет продвигаться к аноду изофермент М4, в то время как остальные изо ферменты будут занимать промежуточные позиции. Следует подчеркнуть, что изоферменты ЛДГ, обладая почти одинаковой ферментативной актив ностью, различаются некоторыми физико-химическими свойствами: мо лекулярной массой, электрофоретической подвижностью, отношением к ак ЛДГ ЛДГ Рис. 4.6. Распределение и относитель ные количества изоферментов ЛДГ в различных органах. Экстракты на ЛДГ несены на линию, отмеченную над писью «Старт». При заданных усло ЛДГ виях опыта (рН) 4 изофермента ЛДГ движутся к аноду, а один (ЛДГ5) – Старт к катоду. Красным цветом выделены ЛДГ основные изоформы ЛДГ для данно Сердце Почки Печень Мышцы го органа.

тиваторам и ингибиторам и др., однако для каждой ткани в норме характерно свое соотношение форм (изоферментный спектр) ЛДГ. Напри мер, в сердечной мышце преобладает Н4, т.е. ЛДГ1, а в скелетных мышцах и печени – М4 (ЛДГ5) (рис. 4.6). Эти обстоятельства широко используют в клинической практике, поскольку изучение появления изоферментов ЛДГ (и ряда других ферментов) в сыворотке крови может представлять интерес для дифференциальной диагностики органических и функциональных по ражений органов и тканей. По изменению содержания изоферментов в сыворотке крови можно судить как о топографии патологического процесса, так и о степени поражения органа или ткани.

МУЛЬТИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ Особую группу ферментов составляют надмолекулярные (или мульти молекулярные) ферментные комплексы, в состав которых входят не субъединицы (в каталитическом отношении однотипные протомеры), а раз ные ферменты, катализирующие последовательные ступени превращения какого-либо субстрата. Отличительными особенностями подобных муль тиферментных комплексов являются прочность ассоциации ферментов и определенная последовательность прохождения промежуточных стадий во времени, обусловленная порядком расположения каталитически актив ных (различных) белков в пространстве («путь» превращения в пространст ве и времени). Типичными примерами подобных мультиферментных комп лексов являются пируватдегидрогеназа и -кетоглутаратдегидрогеназа, ка тализирующие соответственно окислительное декарбоксилирование пиро виноградной и -кетоглутаровой кислот в животных тканях (см. главу 10), и синтетаза высших жирных кислот (см. главу 11). Молекулярные массы этих комплексов в зависимости от источника их происхождения варьируют от 2,3•106 до 10•106. Ассоциация отдельных ферментов в единый недиссо циирующий комплекс имеет определенный биологический смысл и ряд преимуществ. В частности, при этом резко сокращаются расстояния, на которые молекулы промежуточных продуктов должны перемещаться при действии изолированных ферментов. Ряд таких мультиферментных комп лексов, иногда называемых ферментными ансамблями, структурно связан с какой-либо органеллой (рибосомы, митохондрии) или с биомембраной и составляет высокоорганизованные надмолекулярные системы, обеспе чивающие жизненно важные функции, например тканевое дыхание (перенос электронов от субстратов к кислороду через систему дыхательных фер ментов).

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ Структура и функции ферментов, а также механизм их действия почти ежегодно подробно обсуждаются на многих международных симпозиумах и конгрессах. Важное место отводится рассмотрению структуры всей молекулы фермента и ее активных центров, молекулярному механизму действия различных типов ферментов, общей теории энзиматического катализа. Тем не менее до сих пор нет полной ясности по двум кардиналь ным проблемам энзимологии: чем вызваны специфичность действия и вы сокая каталитическая эффективность ферментов?

До установления химической природы ферментов гипотезы о механизме их действия опирались на исследования кинетики и модельные опыты химического гомогенного катализа. Повышение скорости химических реак ций под действием ферментов объясняли следующим: а) активированием субстрата в результате образования адсорбционных или молекулярных, обратимо диссоциирующих фермент-субстратных комплексов;

б) цепным механизмом реакций с участием радикалов или возбужденных молекул.

Оказалось, что цепные механизмы реакции не играют существенной роли в биологическом катализе. После установления химической природы фер ментов подтвердилось представление, выдвинутое более 80 лет назад В. Анри, Л. Михаэлисом и М. Ментен, о том, что при энзиматическом катализе фермент Е соединяется (в принципе обратимо) со своим субстра том S, образуя нестойкий промежуточный фермент-субстратный комплекс ES, который в конце реакции распадается с освобождением фермента и продуктов реакции Р. Благодаря высокому сродству связывания и обра зованию ES-комплекса резко возрастает число молекул субстрата, всту пающих в реакции. Эти представления легли в основу теории «ключа замка» Э. Фишера, которую иногда называют теорией «жесткой матрицы».

Таким образом, жесткая структура активного центра оказывается комп лементарной молекулярной структуре субстрата, обеспечивая тем самым высокую специфичность фермента.

Л. Михаэлис не только постулировал образование промежуточного фермент-субстратного ES-комплекса, но и рассчитал влияние концентрации субстрата на скорость реакции. В процессе реакции различают несколько стадий: присоединение молекулы субстрата к ферменту, преобразование первичного промежуточного соединения в один или несколько последова тельных (переходных) комплексов и протекающее в одну или несколько стадий отделение конечных продуктов реакции от фермента. Это можно схематически проиллюстрировать следующими примерами:

В реакциях анаболизма, например А + В —> АВ, фермент может соединяться как с одним, так и с другим субстратом или обоими субстратами:

В реакциях катаболизма, например АВ —> А + В:

а) АВ + Е –> ABE б) АВЕ –> А + BE (а + б + в): АВ + Е –> А + В + Е в) ВЕ –> В + Е На рис. 4.7 представлена схема образования промежуточного фер мент-субстратного комплекса. Если фермент в активном центре содержит кофермент, то предполагается образование тройного комплекса (рис. 4.8).

Фермент вступает во взаимодействие с субстратом на очень короткий период, поэтому долгое время не удавалось показать образование такого комплекса. Прямые доказательства существования фермент-субстратного комплекса были получены в лабораториях Д. Кейлина и Б. Чанса. В на стоящее время экспериментальные и математические методы кинетики, термодинамики и статической механики химических реакций позволяют Фермент Активный Фермент комплекс Рис. 4.7. Образование не стойкого фермент-субст ратного комплекса со Субстрат Продукты гласно теории Э. Фишера реакции «ключ-замок».

Субстрат Апофермент Кофермент Активный комплекс Рис. 4.8. Функция кофер мента (по А. Кантарову и Б. Шепартцу).

Субстрат Рис. 4.9. Образование не ковалентных связей меж ду ферментом и субстра том (схема).

определить для ряда ферментативных реакций кинетические и термоди намические показатели, в частности константы диссоциации промежуточ ных фермент-субстратных комплексов, константы скорости и равновесия их образования.

В образовании фермент-субстратных комплексов участвуют водородные связи, электростатические и гидрофобные взаимодействия, а в ряде случаев также ковалентные, координационные связи (рис. 4.9). Информация о при роде связей между субстратом и связывающим участком активного центра фермента может быть получена методами ЭПР и ЯМР, а также методами УФ- и ИК-спектроскопии.

Для каталитической активности фермента существенное значение имеет пространственная структура, в которой жесткие участки -спиралей че редуются с гибкими, эластичными линейными отрезками, обеспечиваю щими динамические изменения белковой молекулы фермента. Этим изме неням придается большое значение в некоторых теориях ферментативного катализа. Так, в противоположность модели Э. Фишера «ключ-замок» Д. Кошлендом была разработана теория «индуцированного соответ ствия», допускающая высокую конформационную лабильность молекулы белка-фермента и гибкость и подвижность активного центра. Эта теория была основана на весьма убедительных экспериментах, свидетельствующих о том, что субстрат индуцирует конформационные изменения молекулы фермента таким образом, что активный центр принимает необходимую для связывания субстрата пространственную ориентацию. Иными словами, фермент только в присутствии (точнее, в момент присоединения) субстрата будет находиться в активной (напряженной) Т-форме в отличие от неактив ной R-формы (рис. 4.10). На рис. 4.10 видно, что присоединение субстрата S к ферменту Е, вызывая соответствующие изменения конформации актив ного центра, в одних случаях приводит к образованию активного комплек са, в других – неактивного комплекса вследствие нарушения пространствен ного расположения функциональных групп активного центра в проме жуточном комплексе. Получены экспериментальные доказательства нового положения о том, что постулированное Д. Кошлендом «индуцированное соответствие» субстрата и фермента создается не обязательно изменениями Рис. 4.10. Изменения структуры активного центра фермента, вызванные субстра том, согласно модели «индуцированного соответствия» Д. Кошленда.

А, В, С - функциональные группы активного центра;

1 - активный комплекс;

2 - неактивный комплекс.

Переходное состояние Е НФ Е Ф S Рис. 4.11. Энергетический механизм ферментативной и неферментативной Исходное химических реакций. состояние G S - исходный субстрат;

Р - продукт;

Е P энергия активации неферментативной НФ ре акции;

ЕФ - энергия активации фермента Конечное состояние тивной реакции;

G - стандартное изме нение свободной энергии.

Ход реакции конформации белковой молекулы, но также геометрической и электрон но-топографической перестройкой молекулы субстрата.

В каталитическом процессе существенное значение имеют точное соот ветствие между ферментом и субстратом, а также термодинамические и каталитические преимущества подобного соответствия. Гипотеза «инду цированного соответствия» предполагает существование между ферментом и субстратом не только пространственной или геометрической компле ментарности, но и электростатического соответствия, обусловленного спариванием противоположно заряженных групп субстрата и активного центра фермента. Точное соответствие обеспечивает образование эффек тивного комплекса между субстратом и ферментом.

Подобно другим катализаторам, ферменты, с термодинамической точки зрения, ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации *.

Энергией активации называется энергия, необходимая для перевода всех молекул моля вещества в активированное состояние при данной температуре. Другими словами, это энергия, необходимая для запуска химической реакции, без которой реакция не начинается несмотря на ее термодинамическую вероятность. Фермент снижает энергию активации путем увеличения числа активированных молекул, которые становятся реакционноспособными на более низком энергетическом уровне (рис. 4.11).

На рисунке видно, что ферментативная реакция имеет более низкую энергию активации. Следует отметить, что как катализируемая ферментом, так и не катализируемая им реакция независимо от ее пути имеет одина ковую величину стандартного изменения свободной энергии (G). Действуя на скорость реакции, ферменты не изменяют равновесия между прямой и обратной реакциями, как и не влияют на величину свободной энергии реакции;

они лишь ускоряют наступление равновесия химической реакции.

Зависимость между константой равновесия и изменением свободной энер гии реагирующих веществ математически принято выражать уравнением G = = –R•T•lnK, где R – газовая постоянная;

Т – абсолютная температура в Кельвинах;

lnК – натуральный логарифм константы равновесия;

G – стандартное изменение свободной энергии, Дж/моль. Из представленного уравнения вытекает, что при * Величину энергии активации обычно выражают в джоулях на моль (Дж/моль).

Свободная энергия высоком значении К величина G оказывается отрицательной. Подобные реакции сопровождаются уменьшением свободной энергии. При низком значении К вели чина G оказывается положительной. Если константа равновесия равна единице, то изменение свободной энергии будет равно нулю и реакция легкообратима.

Для измерения константы равновесия и величины свободной энергии какой-либо химической реакции, например реакции взаимопревращения глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат, катализируемой ферментом фосфоглюкомутазой, определяют количество глюкозо-6- и глюкозо-1-фосфата при достижении химического равно весия. В состоянии равновесия содержание глюкозо-6-фосфата оказывается в 19 раз больше количества глюкозо-1-фосфата. Отсюда константа равновесия К равна 19.

Подставляя эту цифру в уравнение, получаем G = –7329 Дж/моль. Это означает, что при превращении 1 моля глюкозо-1-фосфата в 1 моль глюкозо-6-фосфата при температуре 25°С происходит уменьшение свободной энергии системы на 7329 Дж.

Таким образом, в механизме ферментативного катализа ведущую роль играют промежуточные фермент-субстратные комплексы, образование ко торых определяется как тонкой трехмерной структурой активного центра, так и уникальной структурной организацией всей молекулы фермента, обеспечивающими высокую каталитическую активность и специфичность действия биокатализатора.

Кинетика ферментативных реакций Одним из характерных проявлений жизни является удивительная способ ность живых организмов кинетически регулировать химические реакции, подавляя стремление к достижению термодинамического равновесия. Фер ментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и ус ловий их взаимодействия (концентрация, рН среды, температуры, при сутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реак ции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, которая может способствовать выяснению моле кулярного механизма действия фермента.

Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к фер ментативным реакциям. Известно, что любая химическая реакция харак теризуется константой термодинамического равновесия. Она выражает состояние химического равновесия, достигаемого системой, и обозначается К. Так, для реакции:

р константа равновесия равна произведению концентраций образующихся веществ, деленному на произведение концентрации исходных веществ.

Значение константы равновесия обычно находят из соотношения констант скоростей прямой (k+1) и обратной (k ) реакций, т.е. К = k+1/k.

–1 p – В состоянии равновесия скорость прямой реакции: v+1 = k+1[А]•[B] равна скорости обратной реакции: v = k [С]•[D], т. е. v+1 = v соответст –1 –1 – венно k+1[А]•[B] = k [С]•[D], или – отсюда Максимальная скорость Vmax Рис. 4.12. Теоретический график за висимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фер мента.

а - реакция первого порядка (при [S] < К m скорость реакции пропорциональна кон центрации субстрата);

б - реакция смешан ного порядка;

в - реакция нулевого поряд ка, когда v = Vmax и скорость реакции не Концентрация субстрата [S] Km зависит от концентрации субстрата.

Таким образом, константа равновесия равна отношению констант скоростей прямой и обратной реакций. Величину, обратную константе равновесия, принято называть субстратной константой, или, в случае ферментативной реакции, константой диссоциации фермент–суб стратного комплекса, и обозначать символом KS. Так, в реакции т.е. KS равна отношению произведения концентрации фермента и субст рата к концентрации фермент-субстратного комплекса или отношению констант скоростей обратной и прямой реакций. Следует отметить, что константа KS зависит от химической природы субстрата и фермента и определяет степень их сродства. Чем ниже значение KS, тем выше сродство фермента к субстрату.

При изучении кинетики ферментативных реакций следует учитывать одну важную особенность этих реакций (не свойственную обычным хими ческим реакциям), связанную с явлением насыщения фермента суб стратом. При низкой концентрации субстрата зависимость скорости реак ции от концентрации субстрата (рис. 4.12) является почти линейной и под чиняется кинетике первого порядка. Это означает, что скорость реакции S —> Р прямо пропорциональна концентрации субстрата S и в любой момент времени t определяется следующим кинетическим уравнением:

где [S] – молярная концентрация субстрата S;

–d[S]/dt – скорость убыли субстрата;

k' – константа скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность, обратную единице времени (мин–1 или с–1).

При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна, становится постоянной и не зависящей от концентрации субстрата [S].

В этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка v = k" (при полном насыщении фермента субстратом) и целиком определяется кон центрацией фермента. Различают, кроме того, реакции второго порядка, Скорость реакци и v скорость которых пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ. В определенных условиях при нарушении пропор циональности говорят иногда о реакциях смешанного порядка (см. рис.

4.12).

Изучая явление насыщения, Л. Михаэлис и М. Ментен разработали общую теорию ферментативной кинетики. Они исходили из предположе ния, что ферментативный процесс протекает в виде следующей химической реакции:

т.е. фермент Е вступает во взаимодействие с субстратом S с образованием промежуточного комплекса ES, который далее распадается на свободный фермент и продукт реакции Р. Математическая обработка на основе закона действующих масс дала возможность вывести уравнение, названное в честь авторов уравнением Михаэлиса–Ментен, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции:

где v – наблюдаемая скорость реакции при данной концентрации субстрата [S];

KS – константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, моль/л;

Vmax – максимальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом.

Из уравнения Михаэлиса–Ментен следует, что при высокой концент рации субстрата и низком значении KS скорость реакции является макси мальной, т.е. v = Vmax (реакция нулевого порядка, см. рис. 4.12). При низкой концентрации субстрата, напротив, скорость реакции оказывается про порциональной концентрации субстрата в каждый данный момент (реакция первого порядка).

Следует указать, что уравнение Михаэлиса–Ментен в его классическом виде не учитывает влияние на скорость ферментативного процесса про дуктов реакции, например в реакции и носит несколько ограниченный характер. Поэтому были предприняты попытки усовершенствовать его. Так, было предложено уравнение Бриггса Холдейна:

где К представляет собой константу Михаэлиса, являющуюся экспе m риментально определяемой величиной. Она может быть представлена следующим уравнением:

Рис. 4.13. Кривая уравнения Михаэли са-Ментен: гиперболическая зависи мость начальных скоростей катализиру емой ферментом реакции от концентра ции субстрата.

В числителе представлены константы скоростей распада комплекса ES в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в сторону конечных продуктов реакции Е и Р). Отношение k /k представляет собой –1 + константу диссоциации ферментсубстратного комплекса KS, тогда:

Отсюда вытекает важное следствие: константа Михаэлиса всегда больше константы диссоциации фермент-субстратного комплекса KS на величину k /k.

+2 + Для определения численного значения К обычно находят ту концент m рацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции v состав ляет половину от максимальной Vmax, т.е. если v = 1/2 Vmaх. Подставляя значение v в уравнение Бриггса–Холдейна, получаем:

разделив обе части уравнения на Vmах, получим или К + [S] = 2[S], откуда K = [S].

m m Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной *.

Определение величины К имеет важное значение при выяснении меха m низма действия эффекторов на активность ферментов и т.д. Константу Михаэлиса можно вычислить по графику (рис. 4.13). Отрезок на абсциссе, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет пред ставлять собой К.

m Пользоваться графиком, построенным в прямых координатах зависи мости начальной скорости реакции v0 от начальной концентрации субстрата [S0], неудобно, поскольку максимальная скорость V является в данном max случае асимптотической величиной и определяется недостаточно точно.

* Экспериментальные значения К для большинства ферментативных реакций с участием m одного субстрата обычно в пределах 10–2–10–5 М.

Наклон Рис. 4.14. График Лайнуивера Бэрка.

Для более удобного графического представления экспериментальных данных Г. Лайнуивер и Д. Бэрк преобразовали уравнение Бриггса–Хол дейна по методу двойных обратных величин исходя из того прин ципа, что если существует равенство между двумя какими-либо величи нами, то и обратные величины также будут равны. В частности, если то или то после преобразования получаем уравнение:

которое получило название уравнения Лайнуивера–Бэрка. Это урав нение прямой линии: у = ах + b. Если теперь в соответствии с этим уравнением построить график в координатах 1/v (y) от l/[S] (x), то получим прямую линию (рис. 4.14), тангенс угла наклона который будет равен величине K /Vmax;

отрезок, отсекаемый прямой от оси ординат, пред m ставляет собой l/Vmax (обратная величина максимальной скорости). Если продолжить прямую линию за ось ординат, тогда на абсциссе отсекается отрезок, соответствующий обратной величине константы Михаэлиса – 1/К m (см. рис. 4.14). Таким образом, величину К можно вычислить из данных m наклона прямой и длины отрезка, отсекаемого от оси ординат, или из длины отрезка, отсекаемого от оси абсцисс в области отрицательных значений.

Следует подчеркнуть, что значения Vmax, как и величину К, более точно, m чем по графику, построенному в прямых координатах, можно определить по графику, построенному по методу двойных обратных величин. Поэтому данный метод нашел широкое применение в современной энзимологии.

Предложены также аналогичные графические способы определения К m и Vmax в координатах зависимости v от v/[S] и [S]/v от [S].

Следует отметить некоторые ограничения применения уравнения Ми хаэлиса–Ментен, обусловленные множественными формами ферментов и аллостерической природой фермента. В этом случае график зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата (кинетическая Рис. 4.15. Сигмоидная кинети ческая кривая насыщения суб стратом.

кривая) имеет не гиперболическую форму, а сигмоидный характер (рис.

4.15) наподобие кривой насыщения гемоглобина кислородом. Это означает, что связывание одной молекулы субстрата в одном каталитическом центре повышает связывание субстрата с другим центром, т.е. имеет место кооперативное взаимодействие, как и в случае присоединения кислорода к 4 субъединицам гемоглобина. Для оценки концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной, в условиях сигмоидного характера кинетической кривой обычно применяют преобра зованное уравнение Хилла:

где К' – константа ассоциации;

n – число субстратсвязывающих центров.

ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ К ферментам применимы три основных критерия, характерных и для неорганических катализаторов. В частности, они остаются неизмененными после реакции*, т.е. освобождаясь, могут вновь реагировать с новыми молекулами субстрата (хотя нельзя исключить побочных влияний условий среды на активность фермента). Ферменты способны оказывать действие в ничтожно малых концентрациях (например, одна молекула фермента реннина, содержащегося в слизистой оболочке желудка теленка, створажи вает около 106 молекул казеиногена молока за 10 мин при температуре 37°С). Наличие либо отсутствие фермента или любого другого катализа тора не оказывает влияния на величину константы равновесия и свободной энергии (G). Катализаторы лишь повышают скорость, с которой система приближается к термодинамическому равновесию, не сдвигая точки равно весия. Химические реакции с высокой константой равновесия и отрица тельной величиной G принято называть экзергоническими. Реакции с низкой константой равновесия и соответственно положительной величи ной G (они обычно не протекают спонтанно) называются эндерго ническими. Для начала и завершения этих реакций необходим приток * Доказано, что некоторые ферменты в процессе химической реакции подвергаются модификации и даже распаду под действием конечных продуктов реакции, а не освобождаются в неизмененном виде, как утверждал Л. Михаэлис;

типичный пример – цитохромы класса Р450.

Рис. 4.16. Зависимость скорости катализируемой ферментом реак ции от температуры.

а - повышение скорости реакции как функция температуры;

б - снижение ско рости реакции как функция денатура ции белка-фермента;

стрелка указывает оптимум температуры.

энергии извне. В живых системах экзергонические процессы обычно сопря жены с эндергоническими реакциями, обеспечивая последние необходимым количеством энергии.

Ферменты, являясь белками, обладают рядом характерных для этого класса органических соединений свойств, отличающихся от свойств неор ганических катализаторов.

Термолабильность ферментов. Скорость химических реакций зависит от температуры, поэтому катализируемые ферментами реакции также чувст вительны к изменениям температуры. Установлено, что скорость боль шинства биохимических реакций повышается в 2 раза при повышении температуры на 10°С и, наоборот, снижается в 2 раза при понижении температуры на 10°С. Этот показатель получил название температур ного коэффициента. Однако вследствие белковой природы фермента тепловая денатурация при повышении температуры будет снижать эффек тивную концентрацию фермента с соответствующим снижением скорости реакции. Так, при температуре, не превышающей 45–50°С, скорость реак ции увеличивается согласно теории химической кинетики. При температуре выше 50°С на скорость реакции большое влияние начинает оказывать тепловая денатурация белка-фермента, приводящая к полному прекра щению ферментативного процесса (рис. 4.16).

Таким образом, термолабильность, или чувствительность к повышению температуры, является одним из характерных свойств ферментов, резко отличающих их от неорганических катализаторов. В присутствии последних скорость реакции возрастает экспоненциально при повышении температуры (см. кривую «а» на рис. 4.16). При температуре 100°С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение составляет, очевидно, только один фермент мышечной ткани – миокиназа, которая выдерживает нагре вание до 100°С). Оптимальной для действия большинства ферментов теплокровных животных является температура 40°С;

в этих условиях скорость реакции оказывается максимальной вследствие увеличения кине тической энергии реагирующих молекул. При низких температурах (0°С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля. Во всех случаях имеет значение время воздействия соот ветствующей температуры. В настоящее время для пепсина, трипсина и ряда других ферментов доказано существование прямой зависимости Рис. 4.17. Зависимость скоро сти катализируемой ферментом реакции от рН (стрелка указы вает оптимум рН).

между скоростью инактивации фермента и степенью денатурации белка.

Следует отметить, что на термолабильность ферментов определенное влияние оказывает концентрация субстрата, рН среды и другие факторы.

Зависимость активности ферментов от рН среды. Ферменты обычно наиболее активны в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов, соответствующей для животных тканей в основном выработанным в про цессе эволюции физиологическим значениям рН среды 6,0–8,0. При гра фическом изображении на кривой колоколообразной формы имеется опре деленная точка, в которой фермент проявляет максимальную активность;

эту точку называют оптимумом рН среды для действия данного фермента (рис. 4.17). При определении зависимости активности фермента от концент рации водородных ионов реакцию проводят при разных значениях рН среды, обычно при оптимальной температуре и наличии достаточно высо ких (насыщающих) концентраций субстрата. В табл. 4.3 приводятся опти мальные значения рН среды для ряда ферментов.

Таблица 4.3. Оптимальные значения рН для некоторых ферментов Фермент Фермент рН рН Пепсин 1,5–2,5 Каталаза 6,8–7, Катепсин В 4,5–5,0 Уреаза 7,0–7, Амилаза из солода 4,9–5,2 Липаза 7,0–8, панкреатическая Сахараза кишечная 5,8–6,2 Трипсин 7,5–8, Амилаза слюны 6,8–7,0 Аргиназа 9,5–10, Из данных табл. 4.3 видно, что рН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений. Исключение составляют пепсин, рН-оптимум которого 2,0 (при рН 6,0 он не активен и не стабилен).

Объясняется это, во-первых, структурной организацией молекулы фермента и, во-вторых, тем, что пепсин является компонентом желудочного сока, содержащего свободную соляную кислоту, которая создает оптимальную кислую среду для действия этого фермента. С другой стороны, рН-оптимум аргиназы лежит в сильнощелочной зоне (около 10,0);

такой среды нет в клетках печени, следовательно, in vivo аргиназа функционирует, по-ви димому, не в своей оптимальной зоне рН среды.

Согласно современным представлениям, влияние изменений рН среды на молекулу фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (в частности, СООН-группы дикар боновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гисти дина, NH2-группы лизина и др.). При резких сдвигах от оптимума рН среды ферменты могут подвергаться конформационным изменениям, приводя щим к потере активности вследствие денатурации или изменения заряда молекулы фермента. При разных значениях рН среды активный центр может находиться в частично ионизированной или неионизированной форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно на формировании активного фермент-субстратного комплекса. Имеет зна чение, кроме того, состояние ионизации субстратов и кофакторов.

Специфичность ферментов. Ферменты обладают высокой специфич ностью действия. Это свойство часто существенно отличает их от неорга нических катализаторов. Так, мелкоизмельченные платина и палладий могут катализировать восстановление (с участием молекулярного водо рода) десятков тысяч химических соединений различной структуры. Высо кая специфичность ферментов обусловлена, как было отмечено, конфор мационной и электростатической комплементарностью между молекулами субстрата и фермента и уникальной структурной организацией активного центра, обеспечивающими «узнавание», высокое сродство и избиратель ность протекания одной какой-либо реакции из тысячи других химических реакций, осуществляющихся одновременно в живых клетках.

В зависимости от механизма действия различают ферменты с отно сительной (или групповой) и абсолютной специфичностью. Так, для действия некоторых гидролитических ферментов наибольшее значение имеет тип химической связи в молекуле субстрата. Например, пепсин в одинаковой степени расщепляет белки животного и растительного проис хождения, несмотря на то что эти белки существенно отличаются друг от друга как по химическому строению и аминокислотному составу, так и по физико-химическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет ни углеводы, ни жиры. Объясняется это тем, что точкой приложения, местом действия пепсина является пептидная —СО—NH-связь. Для действия липазы, ка тализирующей гидролиз жиров на глицерин и жирные кислоты, подобным местом является сложноэфирная связь. Аналогичной групповой специфич ностью обладают трипсин, химотрипсин, пептидазы, ферменты, гидроли зующие -гликозидные связи (но не -гликозидные связи, имеющиеся в целлюлозе) в полисахаридах, и др. Обычно эти ферменты участву ют в процессе пищеварения, и их групповая специфичность, вероятнее всего, имеет определенный биологический смысл. Относительной специ фичностью наделены также некоторые внутриклеточные ферменты, на пример гексокиназа, катализирующая в присутствии АТФ фосфорилиро вание почти всех гексоз, хотя одновременно в клетках имеются и спе цифические для каждой гексозы ферменты, выполняющие такое же фос форилирование (см. главу 10).

Абсолютной специфичностью действия называют способность фермента катализировать превращение только единственного субстрата. Любые из менения (модификации) в структуре субстрата делают его недоступным для действия фермента. Примерами таких ферментов могут служить аргиназа, расщепляющая в естественных условиях (в организме) аргинин, уреаза, катализирующая распад мочевины, и др.

Имеются экспериментальные доказательства существования так назы ваемой стереохимической специфичности, обусловленной сущест вованием оптически изомерных L- и D-форм или геометрических (цис и транс-) изомеров химических веществ. Так, известны оксидазы L и D-аминокислот, хотя в природных белках обнаружены только L-ами нокислоты. Каждый из видов оксидаз действует только на свой спе цифический стереоизомер *.

+1/2О L-аминокислота -Кетокислота + NH + Н О;

3 Оксидаза L-аминокислот +1/2О D-аминокислота -Кетокислота + NH + H О.

3 Оксидаза D-аминокислот Наглядным примером стереохимической специфичности является бак териальная аспартатдекарбоксилаза, катализирующая отщепление СО только от L-аспарагиновой кислоты с превращением ее в L-аланин. Сте реоспецифичность проявляют ферменты, катализирующие и синтетические реакции. Так, из аммиака и -кетоглутарата во всех живых организмах синтезируется L-изомер глутаминовой кислоты, входящей в состав при родных белков. Если какое-либо соединение существует в форме цис и транс-изомеров с различным расположением групп атомов вокруг двой ной связи, то, как правило, только один из этих геометрических изомеров может служить в качестве субстрата для действия фермента. Например, фумараза катализирует превращение только фумаровой кислоты (транс изомер), но не действует на малеиновую кислоту (цис-изомер):

Фумаровая кислота Малеиновая кислота Таким образом, благодаря высокой специфичности действия ферменты обеспечивают протекание с большой скоростью лишь определенных хи мических реакций из огромного разнообразия возможных превращений в микропространстве клеток и целостном организме, регулируя тем самым интенсивность обмена веществ.

ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ В этом разделе кратко рассмотрены общие факторы, в частности зави симость скорости ферментативной реакции от времени, влияние концент раций субстрата и фермента на скорость реакций, катализируемых фер ментами, и более подробно – вопросы об активировании и ингибировании ферментов. Ранее была отмечена существенность для активности фермен тов таких факторов, как температура, рН, т.е. факторов, которые опре деляют в оптимальных условиях сохранность пространственной конфор мации молекулы фермента, когда она приобретает максимальную ак тивность.

Как известно, скорость любой химической реакции уменьшается со * Имеется, однако, небольшая группа ферментов – рацемазы, катализирующие изменение стерической конфигурации субстрата. Так, бактериальная аланин-рацемаза обратимо превра щает как L-, так и D-аланин в оптически неактивную смесь обоих изомеров – DL-аланин (рацемат).

Рис. 4.18. Зависимость скорости ферментативной реакции от вре мени.

Время временем, однако кривая зависимости скорости ферментативных реакций от времени не имеет обычно той общей формы, которая характерна для гомогенных химических реакций (рис. 4.18). Такое снижение скорости ферментативных реакций со временем может быть обусловлено тормо зящим действием продуктов реакции, уменьшением степени насыщения фермента субстратом (поскольку по мере протекания реакции концентрация субстрата снижается) или частичной инактивацией фермента при заданных значениях температуры и рН среды. Следует учитывать, кроме того, влияние скорости обратной реакции, которая может оказаться сущест венной по мере увеличения концентрации продуктов ферментативной реак ции. Учитывая эти обстоятельства, при исследовании скорости фермента тивных реакций в тканях и биологических жидкостях обычно определяют начальную скорость реакции в условиях, когда скорость фермента тивной реакции приближается к линейной (в том числе при достаточно высокой для насыщения фермента концентрации субстрата).

Влияние концентраций субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции Из приведенного ранее материала вытекает важное заключение: одним из наиболее существенных факторов, определяющих скорость ферментатив ной реакции, является концентрация субстрата (или субстратов) и продукта (продуктов). При постоянной концентрации фермента скорость реакции постепенно увеличивается, достигая определенного максимума (см. рис.

4.12, 4.13), когда дальнейшее увеличение количества субстрата практически не оказывает влияния на скорость ферментативной реакции. В таких случаях принято считать, что субстрат находится в избытке, а фермент полностью насыщен, т.е. все молекулы фермента связаны с субстратом.

Ограничивающим скорость реакции фактором в последнем случае ста новится концентрация фермента. Именно при этих условиях определяют величину максимальной скорости (Vmax) и значения константы Михаэлиса (K ) (см. рис. 4.13;

4.14).

m Скорость любой ферментативной реакции непосредственно зависит от концентрации фермента (рис. 4.19). Существующая линейная зависимость между этими величинами, когда скорость реакции прямо пропорциональна количеству присутствующего фермента, справедлива только в определен ных условиях, например в начальный период ферментативной реакции, так как в этот период практически не происходит обратной реакции, а концент рация продукта оказывается недостаточной для обратимости реакции.

Именно в этом случае скорость реакции (точнее, начальная скорость реакции v) будет пропорциональна концентрации фермента. Как было Количеств о продукта 4х 3х 2х 1х Рис. 4.19. Зависимость скорости реакции от концентрации фермен та в присутствии насыщающих Время концентраций субстрата.

отмечено, фермент является одной из реагирующих молекул в химической реакции и при взаимодействии с субстратом образует промежуточный фермент-субстратный комплекс, который далее подвергается распаду на продукт и свободный фермент:

Если упростить это уравнение, исключив промежуточный ES-комплекс:

то в уравнениях для скоростей прямой и обратной реакций обязательным компонентом является концентрация фермента:

v+1 = k+1[E]•[S];

v+2 = k [E]•[Р].

– Однако в уравнениях для константы равновесия (K или К ) концент eq р рация фермента уже не имеет значения:

Как видно, константа равновесия (K ) ферментативной реакции не р зависит от концентрации фермента. Определяя скорость и направление химической реакции, фермент тем не менее не оказывает влияния на конечные (равновесные) концентрации реагирующих молекул и продуктов, определяющих величину константы равновесия.

Активирование и ингибирование ферментов Скорость ферментативной реакции, как и активность фермента, в значи тельной степени определяется также присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции, а вторые тормозят эту реакцию. Активирующее влияние на скорость ферментативной реакции оказывают разнообразные вещества органической и неорганической приро ды. Так, соляная кислота активирует действие пепсина желудочного сока;

Повышени е концентраци и фермента Количеств о продукта желчные кислоты повышают активность панкреатической липазы;

неко торые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа), расти тельная протеиназа и др. в значительной степени активируются соеди нениями, содержащими свободные SH-группы (глутатион, цистеин), а ряд ферментов – также витамином С. Особенно часто активаторами выступают ионы двухвалентных и, реже, одновалентных металлов. Получены дока зательства, что около четверти всех известных ферментов для проявления полной каталитической активности нуждаются в присутствии металлов.

Многие ферменты вообще не активны в отсутствие металлов. Так, при удалении цинка угольная ангидраза (карбоангидраза), катализирующая биосинтез и распад Н2СО3, практически теряет свою ферментативную активность;

более того, цинк при этом не может быть заменен никаким другим металлом. Известны ферменты *, действие которых активируется ионами нескольких металлов;

в частности, енолаза активируется Mg2+, Mn2+, К+ (табл. 4.4).

Таблица 4.4. Ферменты, активируемые металлами Фермент Металл Фермент Металл Цитохромы Fe Амилаза Са Каталаза Fe Липаза Са Пероксидаза Fe Карбоангидраза Zn Триптофаноксидаза Fe Лактатдегидрогеназа Zn Гомогентизиказа Fe Уриказа Zn Аскорбатоксидаза Cu Карбоксипептидаза Zn Тирозиназа Cu Пируваткарбоксилаза Mg Фенолоксидаза Cu Фосфатазы Mg Ксантиноксидаза Mo Фосфоглюкокиназа Mg Нитратредуктаза Mo Аргиназа Mn Альдегидоксидаза Mo Фосфоглюкомутаза Mn Некоторые пептидазы Co Холинэстераза Mn Молекулярный механизм действия металлов в энзиматическом катализе, или роль металлов в активировании ферментами. В ряде случаев ионы металлов (Со2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+) выполняют функции простетических групп ферментов, или служат акцепторами и донаторами электронов, или выступают в качестве электрофилов либо нуклеофилов, сохраняя реактив ные группы в необходимой ориентации. В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент субстратного комплекса. Например, ионы Mg2+ через отрицательно заря женную фосфатную группу обеспечивают присоединение монофосфатных эфиров органических веществ к активному центру фосфатаз, катализирую щих гидролиз этих соединений. Иногда металл соединяется с субстратом, образуя истинный субстрат, на который действует фермент. В частности, ионы Mg2+ активируют креатинфосфокиназу благодаря образованию ис тинного субстрата – магниевой соли АТФ. Наконец, имеются эксперимен тальные доказательства прямого участия металлов (например, ионов Са2+ * Обычно трудно провести границу между металлоферментами (когда металл связан прочно с белком и незаменим) и ферментами, активируемыми металлами (последние лишь ускоряют реакцию и легко диссоциируют).

в молекуле амилазы слюны) в формировании и стабилизации активного центра и всей трехмерной структуры молекулы фермента. Следует отме тить также, что металлы нередко выступают в роли аллостерических модуляторов (эффекторов;

см. рис. 4.22). Взаимодействуя с аллостеричес ким центром, подобный металл (эффектор) способствует образованию наиболее выгодной пространственной конфигурации фермента и активного фермент-субстратного комплекса.

Анионы в физиологических концентрациях обычно неэффективны или оказывают небольшое активирующее влияние на ферменты. Исключение составляют пепсин, некоторые оксидоредуктазы, активируемые анионами, а также амилаза слюны, катализирующая гидролиз крахмала, активность которой повышается при действии ионов хлора, и аденилатциклаза, кото рая активируется анионами галогенов.

Ингибиторы ферментов обычно принято делить на два больших класса: обратимые и необратимые. Это вещества, вызывающие частичное (обратимое) или полное торможение реакций, катализируемых фермента ми. Недавно открыты антиферменты (антиэнзимы, или антизимы), представляющие собой белки (или полипептиды), действующие как инги биторы ферментов. К подобным веществам относятся, например, инги битор трипсина, обнаруженный в соевых бобах, и сывороточный анти трипсин. Недавно открыт в печени животных антифермент орнитинде карбоксилазы (см. главу 12). Антизимы, вероятнее всего, образуют трудно диссоциируемые комплексы с соответствующими ферментами, выключая их из химических реакций. Иногда ингибитор является составным компо нентом предшественника фермента, например пепсина (см. главу 12), или входит в состав сложных комплексов ферментов, например в состав протеинкиназы и протеинфосфатазы, катализирующих процессы фосфо рилирования-дефосфорилирования в живых организмах. Однако до сих пор не выяснено, являются ли подобные антиферменты истинными инги биторами или регуляторными субъединицами, в частности, какова разница в назначении регуляторной (R) субъединицы в составе протеинкиназы и ингибиторной (I) субъединицы в составе протеинфосфатазы.

Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие денатурацию белка (кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов, нагревание), приводят к необратимой инактивации фермента. Однако подобное инак тивирование относительно неспецифично, оно не связано с механизмом действия ферментов. Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на какой либо один фермент или группу родственных ферментов, вызывая обрати мое или необратимое ингибирование. Исследование этих ингибиторов имеет важное значение. Во-первых, ингибиторы могут дать ценную инфор мацию о химической природе активного центра фермента, а также о составе его функциональных групп и природе химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса. Известны вещества, вклю чая лекарственные препараты, специфически связывающие ту или иную функциональную группу в молекуле фермента, выключая ее из химической реакции. Так, йодацетат IСН2—СООН, его амид и этиловый эфир, пара хлормеркурибензоат ClHg—С6Н4—СООН и другие реагенты сравнитель но легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группами фер ментов. Если такие группы имеют существенное значение для акта ката лиза, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента:

R-SH + IСН2—СООН —> НI + R—S—CH2—COOH Действие ряда других ферментов (холинэстераза, трипсин и химотрип син) сильно тормозится некоторыми фосфорорганическими соединениями, например ДФФ, вследствие блокирования ключевой гидроксильной группы серина в активном центре (см. ранее).

Во-вторых, ингибиторы нашли широкое применение в энзимологии при исследовании природы множественных форм ферментов и изоферментов, различающихся не столько электрофоретической подвижностью, сколько различной чувствительностью к одному и тому же ингибитору.

При помощи ингибиторов, выключающих отдельные стадии многосту пенчатого метаболического процесса, могут быть точно установлены не только последовательность химических реакций, но и природа участвую щих в этих превращениях ферментов. Этим путем, применяя йодацетат, фториды и другие специфические ингибиторы, был расшифрован глико литический путь окислительно-восстановительных превращений глюкозы до стадии образования молочной кислоты в мышечной ткани, насчиты вающий 11 стадий с участием 11 ферментов и 10 промежуточных ме таболитов.

С ингибированием ферментов связан механизм действия многих токси нов и ядов на организм. Известно, что при отравлениях солями сенильной кислоты смерть наступает вследствие полного торможения и выключения дыхательных ферментов (цитохромная система) тканей, особенно клеток мозга. Токсическое влияние на организм человека и животных некоторых инсектицидов обусловлено торможением активности холинэстеразы – фер мента, играющего ключевую роль в деятельности нервной системы.

Современная, так называемая рациональная, химиотерапия (направлен ное применение лекарственных препаратов в медицине) должна основы ваться на точном знании механизма действия лекарственных средств на биосинтез ферментов, на активность уже синтезированных ферментов или на регуляцию их активности в организме. Иногда для лечения некоторых болезней используют избирательно действующие ингибиторы. Так, инги битор ряда протеиназ (трипсина, химотрипсина и калликреина) трасилол широко применяется для лечения острого панкреатита – болезни, при ко торой уровень трипсина и химотрипсина в крови резко возрастает. Знание избирательного ингибиторного действия некоторых природных и синте тических соединений (так называемых антиметаболитов) на ферменты может служить методологической основой для разработки эффективных методов синтеза химиотерапевтических препаратов. Этот путь открывает широкие возможности для направленного воздействия на синтез ферментов в организме и регуляции интенсивности метаболизма при патологии.

Типы ингибирования. Различают обратимое и необратимое ингибиро вание. Если ингибитор вызывает стойкие изменения пространственной третичной структуры молекулы фермента или модификацию функциональ ных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необрати мым. Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, под дающееся количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на кон курентное и неконкурентное в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения кон центрации субстрата.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на структуру субстрата, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Такое ингибирование основано на связывании ингибитора с субстратсвязывающим (активным) центром. Классическим примером подобного типа ингибирования является торможение сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малоновой кислотой. Этот фер мент катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты (сукцината) в фумаровую:

Блокирование реакции –2Н Фумарат Малонат Сукцинат Если в среду добавить малонат (ингибитор), то в результате структур ного сходства его с истинным субстратом сукцинатом (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) он будет взаимодействовать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако при этом полностью исключается перенос атома водорода от малоната. Структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора (малонат) все же несколько различаются. Поэтому они конкурируют за связывание с актив ным центром, и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Таким образом, ингибитор может обратимо связываться с ферментом, образуя фермент-ингибиторный комплекс. Этот тип ингиби рования иногда называют ингибированием по типу метаболического анта гонизма (рис. 4.20).

В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:

Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комп лексом ЕI, в отличие от фермент-субстратного комплекса ES не распадается с образованием продуктов реакции. Константу диссоциации комплекса EI, или ингибиторную константу Кi, можно, следуя теории Михаэлиса–Мен тен, определить как отношение констант обратной и прямой реакций:

т.е. ингибиторная константа прямо пропорциональна произведению кон центрации фермента и ингибитора и обратно пропорциональна концент рации комплекса EI.

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в ме дицинской практике. Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфа ниламидные препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью E + S ES E P P Рис. 4.20. Действие конку рентного ингибитора (схема по В.Л. Кретовичу).

Е - фермент;

S - субстрат;

Р1 и Р2 - продукты реакции;

I - инги E + l Комплекс El битор.

(неактивный) ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфани ламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензой ной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кисло ту, что ведет к торможению роста бактерий.

п-Аминобензой- Сульфаниламид ная кислота Некоторые аналоги витамина В6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипиридоксин и аминоптерин (см. главу 7), действуют как конкурент ные, так называемые коферментные, ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие интенсивно протекающие при патологии биологи ческие процессы в организме. Применение подобных аналогов в меди цинской практике (в частности, в дерматологии и онкологии) основано на конкурентном вытеснении коферментов из субстратсвязывающих центров ключевых ферментов обмена.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью дейст вия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. При мером необратимого ингибирования является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов и молекуле фермента.

Следует указать, что неконкурентное ингибирование также может быть обратимым и необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный центр. Примеры необратимого ингибирования приведены ранее. При обратимом неконкурентном ингибировании субстрат S и ингибитор I связываются с разными центрами, поэтому появляется возможность образования как комплекса EI, так и тройного комплекса EIS;

последний может распадаться с осво бождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комплекс ES.

Е + + Е S ES Р + + I I + ЕI S ESI Этот тип неконкурентного ингибирования чаще всего наблюдается у ферментов, катализирующих превращения более одного субстрата, когда связывание ингибитора не блокирует связывание субстрата с активным центром. Ингибитор при этом соединяется как со свободным ферментом, так и с ES-комплексом.

Известно, кроме того, так называемое бесконкурентное ингиби рование, когда ингибитор связывается с ферментом также в некатали тическом центре, однако не со свободным ферментом, а только с ES-комп лексом в виде тройного комплекса.

+ + Е S ES ESI l + Е Р Для выяснения вопроса о типе ингибирования пользуются уравнениями Михаэлиса-Ментен, Лайнуивера-Бэрка или другими, например уравне нием Эди-Хофсти:

v = –K (v/[S]) + V m max и соответствующими графиками в прямолинейных координатах.

При конкурентном типе ингибирования ингибитор увеличивает значение К, не оказывая влияния на максимальную скорость V (рис. 4.21). Это m max означает, что при достаточно высокой концентрации субстрата [S] ин гибитор вытесняется молекулами субстрата из комплекса EI. При некон курентном ингибировании (рис. 4.22) ингибитор снижает величину макси мальной скорости. Если при этом величина К не уменьшается, то говорят m о полностью неконкурентном ингибировании. Подобный тип ингибиро вания имеет место при образовании неактивных, труднодиссоциирующих а б Рнс. 4.21. Графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентра ции субстрата в присутствии конкурентного ингибитора.

а - в координатах v от [S];

б - в координатах 1/v от 1/[S];

V и Vi - максимальные скорости max реакции;

К и K - константа Михаэлиса соответственно в отсутствие (1) и в присутствии (2) m mi ингибитора.

б а Рис. 4.22. Графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентра ции субстрата в присутствии неконкурентного ингибитора.

Обозначения те же, что на рис. 4.21.

комплексов EI и(или) EIS. Часто, однако, наблюдается смешанный тип ингибирования, иногда называемый частично неконкурентным, или обра тимым неконкурентным ингибированием (см. ранее), при котором сни жение Vmax сочетается с одновременным увеличением значений К. Это m означает, что комплекс EI сохраняет частичную активность, т.е. способ ность к образованию промежуточного тройного комплекса EIS, в котором субстрат подвергается замедленному каталитическому превращению. В редких случаях степень торможения активности фермента может увели чиваться с повышением концентрации субстрата. Для этого типа тормо жения был предложен, как отмечено ранее, довольно неточный термин «бесконкурентное ингибирование». Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соединения ингибитора с комплексом ES с об разованием неактивного или медленно реагирующего тройного ком плекса EIS.

Таким образом, при графическом анализе скоростей ферментативных реакций как функции концентраций субстрата может быть получена ценная информация не только о кинетике ферментативных реакций, но и о мо лекулярных механизмах ферментативного катализа.

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ Одним из уникальных свойств живых организмов является удивительная их способность к сохранению сбалансированности катаболических (биодегра дативных) и анаболических (биосинтетических) процессов. При этом в клет ках одновременно совершаются процессы синтеза, распада и взаимопрев ращения сотен и тысяч разнообразных веществ, которые в свою очередь регулируются множеством механизмов, обеспечивающих постоянство внут ренней среды организма. Некоторые из этих регуляторных механизмов, среди которых важная роль принадлежит механизмам регуляции синтеза и каталитической активности ферментов, будут рассмотрены далее.

Влияние закона действия масс. В катализируемой ферментом обратимой химической реакции, например А + В <=> С + D, концентрация компонентов реакции и соответственно направление реакции будут регулироваться влия нием закона действия масс. Оно, в частности, может быть показано в обратимой реакции трансаминирования, катализируемой ферментом аланинаминотрансферазой:

Аланин + -Кетоглутарат <=> Пируват + Глутамат.

Этот тип регуляции играет, очевидно, лишь ограниченную роль, по скольку в реальных условиях реакция обычно протекает в одном направле нии, так как образовавшиеся продукты могут оказаться субстратами для действия других ферментов и выводиться из сферы реакции. В этих случаях устанавливается скорее устойчивое (стационарное) состояние, чем истинное равновесие.

Изменение количества фермента. На бактериях хорошо изучен феномен индуцированного (индуцирующего) синтеза ферментов при выращи вании их на среде, где единственным источником углерода и энергии служит тот или иной углевод, например глюкоза. Замена в среде глюкозы на лактозу (индуктор) приводит к индуцированному или адаптивному (после небольшого периода лаг-фазы) синтезу фермента галактозидазы (програм мированному лактозным геном, см. главу 13), расщепляющей лактозу на глюкозу и галактозу.

В клетках прокариот и эукариот имеются ферменты, концентрация которых не требует добавления индуктора;

это так называемые консти тутивные ферменты. Количество фермента в клетке зависит от наличия продукта реакции, катализируемой данным ферментом, причем продукт реакции вызывает торможение синтеза фермента в результате репрессии (см. далее).

В животных тканях быстрый синтез ферментов наблюдается реже.

Механизм его (индуцирующий синтез) изучен только для небольшого числа ферментов: тирозинтрансаминазы, серин- и треониндегидратазы, триптофанпирролазы и др. – в ответ на введение гормонов или прием белковой пищи. Однако при поступлении в организм некоторых ядов, канцерогенных веществ, алкалоидов, инсектицидов через несколько дней наблюдается резкое повышение активности (соответственно количества) ферментов-гидроксилаз (монооксигеназ) эндоплазматической сети клеток печени, окисляющих чужеродные вещества в нетоксичные для организма продукты. Вполне допустимо предположить, что в этих случаях имеет место синтез ферментов путем индукции (т.е. de novo). Описаны случаи, когда под действием подобных гидроксилаз чужеродные вещества превращаются в организме в более токсичные соединения. Это явление, обратное детоксикации, получило название летального синтеза.

Проферменты. Протеолитические ферменты пищеварительного тракта, а также поджелудочной железы синтезируются в неактивной форме – в виде проферментов (зимогенов). Регуляция в этих случаях сводится к пре вращению проферментов в активные ферменты под влиянием специфи ческих агентов или других ферментов – протеиназ. Так, трипсин в под желудочной железе синтезируется в форме неактивного трипсиногена.

Поступив в кишечник, он превращается в активный трипсин в результате аутокатализа или под действием других протеиназ (механизм активации подробно рассматривается в главе 12). Превращение неактивного пепси ногена в активный пепсин происходит аутокаталитически в результате специфического ограниченного протеолиза в присутствии соляной кислоты и также связано с отщеплением от профермента специфического ингибитора пептидной природы. Эти превращения зимогенов в активные ферменты связаны с конформационными изменениями молекулы фермента и форми рованием активного центра или его раскрытием (демаскирование). Синтез протеиназ в неактивной форме и ряда других неактивных белков-пред шественников имеет, очевидно, определенный биологический смысл, пре дотвращая разрушение клеток органов, в которых образуются профер менты. Примерами подобного активирования белков является активиро 2АТФ 2АДФ Е Е Киназа Фосфатаза Е Е 2Pi 2Н2O Рис. 4.23. Ковалентная модификация фермента путем фосфорилирования-дефосфо рилирования остатков серина.

2АТФ 2РРi Е Е АМФ Е Е АМФ 2АМФ 2Н2O Рис. 4.24. Нековалентная модификация фермента путем аденилирования-деадени лирования.

вание некоторых гормонов (проинсулин —> инсулин), белка соединительной ткани (растворимый проколлаген превращается в нерастворимый колла ген), белков свертывающей системы крови.

Химическая модификация фермента. Некоторые белки при формиро вании третичной структуры подвергаются постсинтетической химической модификации (см. главу 1). Оказалось, что активность ряда ключевых ферментов обмена углеводов, в частности фосфорилазы, гликогенсинтазы и др., также контролируется путем фосфорилирования и дефосфорили рования, осуществляемого специфическими ферментами – протеинкиназой и протеинфосфатазой, активность которых в свою очередь регулируется гормонами (см. главу 10). Уровень активности ключевых ферментов обмена углеводов и соответственно интенсивность и направленность самих про цессов обмена определяются соотношением фосфорилированных и де фосфорилированных форм этих ферментов.

Обычно различают обратимую ковалентную и нековалентную хими ческие модификации ферментов, осуществляемые через ОН-группы серина, реже – тирозина или за счет нековалентных взаимодействий с молекулой фермента. В первом случае активным ферментом оказывается или фосфо рилированная, или дефосфорилированная форма, как в случае с моле кулами мышечной фосфорилазы и гликогенсинтазы соответственно (см.

главу 10). В качестве примеров можно в виде схемы представить оба типа модификации, в которой символом Р обозначается остаток фосфата, Pi – неорганический фосфат (Н3РО4), РРi – неорганический пирофосфат (Н4Р2О7), АМФ – остаток адениловой кислоты (рис. 4.23;

4.24).

Химическая постсинтетическая модификация ферментов включает, кроме того, процессы ограниченного протеолиза (см. ранее), метилиро вания (см. главу 13), гликозилирования, уридилирования, аденилирования, АДФ-рибозилирования * и др., обеспечивая тем самым микроскопический * Интересно, что дифтерийный и холерный токсины наделены энзиматической актив ностью, вызывая АДФ-рибозилирование (соответственно инактивацию) ключевых клеточных ферментов или белков. Дифтерийный токсин выключает синтез белкового фактора 2 стадии элонгации синтеза белка, а холерный – специфического G-белка и как следствие вызывает массивную потерю воды.

тип регуляции активности ферментов и соответственно физиологическую скорость процессов обмена веществ.

Аллостерическая регуляция. Во многих строго биосинтетических реак циях основным типом регуляции скорости многоступенчатого фермента тивного процесса является ингибирование по принципу обратной связи. Это означает, что конечный продукт биосинтетической цепи подав ляет активность фермента, катализирующего первую стадию синтеза, которая является ключевой для данной цепи реакции. Поскольку конечный продукт структурно отличается от субстрата, он связывается с аллостери ческим (некаталитическим) центром молекулы фермента, вызывая ингиби рование всей цепи синтетической реакции.

Предположим, что в клетках осуществляется многоступенчатый био синтетический процесс, каждая стадия которого катализируется собст венным ферментом:

Е2 Е3 Е E А Б В Г Р Скорость подобной суммарной последовательности реакций в значи тельной степени определяется концентрацией конечного продукта Р, накопление которого выше допустимого уровня оказывает мощное инги бирующее действие на первую стадию процесса и соответственно на фермент E1.

Впервые существование подобного механизма контроля активности ферментов метаболитами было обнаружено у Е.coli при исследовании синтеза изолейцина и ЦТФ. Оказалось, что изолейцин, являющийся конечным продуктом синтеза, избирательно подавляет активность треонин дегидратазы, катализирующей первую стадию последовательного процесса превращения треонина в изолейцин, насчитывающего пять ферментативных реакций:

E Е2 Е3 Е4 Е L-треонин А В С D L-изолейцин.

Треонинде гидратаза Аналогично ЦТФ как конечный продукт биосинтетического пути оказы вает ингибирующий эффект на первый фермент (аспартаткарбамоилтран сферазу), регулируя тем самым свой собственный синтез (см. главу 13).

Этот тип ингибирования получил название ингибирования по принципу обратной связи, или ретроингибирования. Существование его доказано во всех живых организмах. В настоящее время он рассматривается как один из ведущих типов регуляции активности ферментов и клеточного мета болизма в целом *.

С другой стороны, в амфиболических процессах, выполняющих одно временно биосинтетические и биодеградативные функции **, доказано су * Скорость реакции (как и активность ферментов) в чисто биодеградативных (ката болических) процессах регулируется промежуточными продуктами, являющимися индикато рами энергетического состояния клетки (пуриновые нуклеотиды, пирофосфат, неорганический фосфат и др.).

** К амфиболическим процессам относят такие центральные пути обмена, как гликолиз, гликогенолиз, цикл трикарбоновых кислот, гексозомонофосфатный путь, трансаминирование аминокислот.

1 Рис. 4.25. Взаимодействие алло 4 5 стерического фермента с субст ратом и эффекторами (схема).

а - активный комплекс;

б - неактив ный комплекс;

1 - активный центр;

2 - аллостерический центр;

3 - субст рат;

4 - положительный эффектор;

5 - отрицательный эффектор.

а б ществование регуляции как по типу ретроингибирования, так и макроэрги ческими соединениями – индикаторами энергетического состояния клетки.

Для амфиболических процессов уникальным типом регуляции, свойствен ным только им, является, кроме того, активация предшественником, когда первый метаболит в многоступенчатом пути активирует фермент, катализирующий последнюю стадию. Так, доказано активирующее влияние глюкозо-6-фосфата, являющегося предшественником гликогена, на фермент гликогенсинтазу.

Подобные типы ингибирования конечным продуктом и активирования первым продуктом свойственны аллостерическим (регуляторным) фермен там, когда эффектор, модулятор, структурно отличаясь от субстрата, связывается в особом (аллостерическом) центре молекулы фермента, прост ранственно удаленном от активного центра. Следует, однако, иметь в виду, что модуляторами аллостерических ферментов могут быть как активаторы, так и ингибиторы. Часто оказывается, что сам субстрат оказывает активи рующий эффект. Ферменты, для которых и субстрат, и модулятор пред ставлены идентичными структурами, носят название гомотропных в от личие от гетеротропных ферментов, для которых модулятор имеет отличную от субстрата структуру. Взаимопревращение активного и неак тивного аллостерических ферментов в упрощенной форме, а также конфор мационные изменения, наблюдаемые при присоединении субстрата и эф фекторов, представлены на рис. 4.25. Присоединение отрицательного эф фектора к аллостерическому центру вызывает значительные изменения конфигурации активного центра молекулы фермента, в результате чего фермент теряет сродство к своему субстрату (образование неактивного комплекса).

Аллостерические взаимодействия проявляются в характере кривых за висимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата или эффектора, в частности в S-образности этих кривых (отклонение от гипер болической кривой Михаэлиса-Ментен). S-образный характер зависимости v от [S] в присутствии модулятора обусловлен эффектом кооперативности.

Это означает, что связывание одной молекулы субстрата облегчает связы вание второй молекулы в активном центре, способствуя тем самым увели чению скорости реакции. Кроме того, для аллостерических регуляторных ферментов характерна нелинейная зависимость скорости реакции от кон центрации субстрата.

Другие типы регуляции активности ферментов. Абсолютное количество присутствующего в клетке фермента регулируется временем его синтеза и распада. К регуляторным механизмам могут быть отнесены также конкуренция ферментов за общий субстрат, выключение активности одного из изоферментов (у множественных форм ферментов), влияние концентра ций кофакторов и явление компартментализации. Механизм компарт ментализации метаболических процессов играет, по-видимому, важную биологическую роль, пространственно разъединяя с помощью биомембран ферменты со своими субстратами (например, лизосомальные ферменты:

протеиназы, фосфатазы, рибонуклеазы и другие гидролитические фермен ты – с цитоплазматическими веществами, на которые они действуют). Кро ме того, облегчая независимую регуляцию, этот механизм позволяет разделить несовместимые в одном и том же месте (и, возможно, в одно и то же время) метаболические процессы. Примером последних могут быть пути синтеза высших жирных кислот, протекающие в основном в растворимой фракции цитоплазмы, и пути распада (окисления) жирных кислот, сосре доточенные в митохондриях. Необходимо указать, однако, что при ком партментализации возникает проблема транспорта как метаболитов, так и восстановительных эквивалентов через биомембраны субклеточных ор ганелл. Эту задачу решает так называемый челночный механизм, позво ляющий перевод метаболитов в формы, способные переходить через мембраны, и обеспечивающий внутриклеточный гомеостаз (см. главу 13).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким ис ключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концент рациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализи руемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции.

Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Междуна родного биохимического союза была рекомендована стандартная между народная единица (Е или U): за единицу активности любого фер мента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоля субстрата или образование 1 мик ромоля продукта в минуту (мкмоль/мин) *.

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено новое выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со ско ростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль•с–1 = 60 моль•мин–1 = 60•106 мкмоль•мин–1 = 6•107 U, или:

1 U = 1 мкмоль•мин–1 = (1/60) мкмоль•с–1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат.

Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат.

Рекомендовано, кроме того, измерять активность фермента при темпе ратуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента.

–6 – * Мкмоль, 10 моль;

единицы активности фермента выражают также в наномолях ( – моль) и пикомолях (10 моль).

Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности.

Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся пре вращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято называть числом оборотов фермента, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44000 молекул перекиси водорода *.

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ Вопрос о локализации ферментов в структурных образованиях клетки (ядро, митохондрии, лизосомы и др.) является чрезвычайно важным, особенно в препаративной энзимологии, когда перед исследователем поставлена задача изолировать и выделить фермент в чистом виде.

Сравнительно легко обнаружить локализацию фермента методами цито и гистохимии. Для этого тонкие срезы органа инкубируют с соответст вующими субстратами и после инкубации локализацию продукта реакции устанавливают добавлением подходящих реактивов до появления специ фической окраски.

В препаративной энзимологии чаще пользуются методом дифферен циального центрифугирования гомогенатов тканей (рис. 4.26). Для этого сначала разрушают клеточную структуру с помощью подходящего де зинтегратора и полученную квазиоднородную (гомогенизированную) массу подвергают дифференциальному центрифугированию при температуре 0–4°С. Обычно распределение ферментов изучают в последовательных индивидуальных фракциях, изолированных при дробном центрифугирова нии гомогенатов, в частности во фракции ядер, которую получают при низкой скорости центрифугирования, во фракции митохондрий, которая осаждается при средней скорости центрифугирования, во фракции микро сом (или рибосом), для изолирования которой требуется высокая скорость центрифугирования, и, наконец, в оставшейся прозрачной надосадочной жидкости (супернатант), представляющей собой растворимую фракцию цитоплазмы. Следует отметить, что фракция митохондрий не является гомогенной, поскольку из нее удается изолировать частицы, известные как лизосомы, размер которых занимает промежуточное место между разме рами митохондрий и микросом. В свою очередь микросомальная фракция также является гетерогенной, поскольку состоит в основном из элементов эндоплазматической сети неоднородного строения.

При помощи метода фракционирования гомогенатов органов и тканей в центрифугах было показано, что ядерная фракция печени и почек содержит незначительное число ферментов, хотя известно, что в ядрах осуществляется синтез некоторых белков. Основное место синтеза белка, как теперь установлено,– фракция рибосом цитоплазмы. Показано, кроме * Чтобы 1 атом неорганического железа, также катализирующий распад Н2О2, расщепил такое число молекул Н2О2, которое расщепляет каталаза в 1 с, потребовалось бы несколько лет. Этот пример является наглядным доказательством одного из главных свойств фермен тов – их высокой каталитической активности.

Гомогенизация в 0,25 М растворе сахарозы Измельчение Ткань Гомогенат 600 g 10 мин Ядра;

Супернатант неразрушенные клетки 10000 g 20 мин Супернатант Митохондрии 105000 g 60 мин Рис. 4.26. Дифференциаль ное центрифугирование го Микросомы Растворимая фракция могенатов ткани печени белков (схема), g - ускорение силы тяжести.

того, что ферменты гликолиза сосредоточены преимущественно в раство римой фракции цитоплазмы, в то время как цитохромоксидаза и ферменты цикла Кребса локализованы во фракции митохондрий. С митохондриями связаны также ферменты, катализирующие окислительное фосфорилиро вание и распад жирных кислот. Ферменты, катализирующие биосинтез жирных кислот, наоборот, содержатся в растворимой фракции цитоплазмы.

Для изолирования и выделения ферментов из биологических объектов в чистом (гомогенном) состоянии используют весь арсенал методов выде ления белков в индивидуальном виде (см. главу 1).

КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ Современные классификация и номенклатура ферментов были разработаны Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и ут верждены на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г.

в Москве *.

* В работе Комиссии принимали участие крупнейшие энзимологи мира, от нашей страны – акад. А.Е. Браунштейн.

Необходимость систематики номенклатуры диктовалась прежде всего стремительным ростом числа вновь открываемых ферментов, которым разные исследователи присваивали названия по своему усмотрению. Более того, одному и тому же ферменту часто давали два или несколько названий, что вносило путаницу в номенклатуру. Некоторые названия ферментов вообще не отражали тип катализируемой реакции, а при наименовании фермента исходили из названия субстрата, на который действует фермент, с добавлением окончания -аза: в частности, амилазы (ферменты, гидро лизирующие углеводы), липазы (действующие на липиды), протеиназы (гидролизирующие белки) и т.д.

До 1961 г. не было и единой классификации ферментов. Трудности заключались в том, что разные исследователи за основу классификации ферментов брали различные принципы. Комиссией были рассмотрены 3 принципа, которые могли служить основой для классификации ферментов и их обозначения. Первый принцип – химическая природа фермента, т.е.

принадлежность к флавопротеинам, пиридоксальфосфатпротеинам, гемо протеинам, металлопротеинам и т. д. Однако этот принцип не мог служить общей основой для классификации, так как только для небольшого числа ферментов известны простетические группы, доступные идентификации и прямому определению. Второй принцип – химическая природа субстрата, на который действует фермент. По этому принципу трудно классифи цировать фермент, так как в качестве субстрата могут служить разнообраз ные соединения внутри определенного класса веществ (белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты) и бесчисленное множество промежуточных продуктов обмена. В основу принятой классификации положен третий принцип – тип катализируемой реакции, который является специфич ным для действия любого фермента. Этот принцип логично использовать в качестве основы для классификации и номенклатуры ферментов.

Таким образом, тип катализируемой химической реакции в сочетании с названием субстрата (субстратов) служит основой для систематического наименования ферментов. Согласно Международной классификации, фер менты делят на шесть главных классов, в каждом из которых несколько подклассов: 1) оксидоредуктазы;

2) трансферазы;

3) гидролазы;

4) лиазы;

5) изомеразы;

6) лигазы (синтетазы) (табл. 4.5).

Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты, ката лизирующие с участием двух субстратов окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления. Систематические названия их составляют по форме «донор: акцептор оксидоредуктаза».

Например, лактат: НАД+ оксидоредуктаза для лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные дегидро геназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (электронов) непосредственно на кислород;

анаэробные дегидрогеназы, ускоряющие перенос протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но не на кислород;

цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К это му классу относят также гемсодержащие ферменты каталазу и пероксидазу, катализирующие реакции с участием перекиси водорода.

Трансферазы. К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов. Наименование их составляется по форме «донор: транспор тируемая группа – трансфераза».

Различают трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных ос татков, ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных Таблица 4.5. Международная классификация ферментов № Класс Тип катализируемой реакции 1 Оксидоредуктазы Перенос электронов и протонов 2 Трансферазы Перенос групп атомов, отличных от атомов водорода 3 Гидролазы Гидролиз различных связей (с участием молекулы воды) 4 Лиазы Образование двойных связей за счет удаления групп или добавление групп за счет разрыва двойных связей 5 Изомеразы Внутримолекулярный перенос групп с образованием изомерных форм 6 Лигазы (синтетазы) Соединение двух молекул и образование связей С—С, С—О, С—S и С—N, сопряженных с разрывом пирофосфатной связи АТФ остатков, азотистых групп, остатков фосфорной и серной кислот и др.

Например: метил- и формилтрансферазы, ацетилтрансферазы, амино трансферазы, фосфотрансферазы и др.

Гидролазы. В класс гидролаз входит большая группа ферментов, ката лизирующих расщепление внутримолекулярных связей органических ве ществ при участии молекулы воды. Наименование их составляют по форме «субстрат-гидролаза». К ним относятся: зстеразы – ферменты, катализи рующие реакции гидролиза и синтеза сложных эфиров;

гликозидазы, ускоряющие разрыв гликозидных связей;

фосфатазы и пептидгидролазы, катализирующие гидролиз фосфоангидридных и пептидных связей;

ами дазы, ускоряющие разрыв амидных связей, отличных от пептидных, и др.

Лиазы. К классу лиаз относят ферменты, катализирующие разрыв связей С—О, С—С, С—N и других, а также обратимые реакции отщепления различных групп от субстратов не гидролитическим путем. Эти реакции сопровождаются образованием двойной связи или присоединением групп к месту разрыва двойной связи. Ферменты обозначают термином «суб страт-лиазы». Например, фумарат-гидратаза (систематическое название «L-малат-гидролаза») катализирует обратимое отщепление молекулы воды от яблочной кислоты с образованием фумаровой кислоты. В эту же группу входят декарбоксилазы (карбокси-лиазы), амидин-лиазы и др.

Изомеразы. К классу изомераз относят ферменты, катализирующие взаимопревращения оптических и геометрических изомеров. Системати ческое название их составляют с учетом типа реакции: «субстрат – цис транс-изомераза». Если изомеризация включает внутримолекулярный пе ренос группы, фермент получает название «мутаза».

К этому же классу относят рацемазы и эпимеразы, действующие на амино- и оксикислоты, углеводы и их производные;

внутримолекулярные оксидоредуктазы, катализирующие взаимопревращения альдоз и кетоз;

внутримолекулярные трансферазы, переносящие ацильные, фосфорильные и другие группы, и т.д.

Лигазы (синтетазы). К классу лигаз относят ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата). Системати ческое название их составляют по форме «X : Y лигаза», где X и Y обозна чают исходные вещества. В качестве примера можно назвать L-глутамат:

аммиак лигазу (рекомендуемое сокращенное название «глутаминсинтета за»), при участии которой из глутаминовой кислоты и аммиака в при сутствии АТФ синтезируется глутамин.

СПИСОК ФЕРМЕНТОВ На основании разработанной системы, которая служит основой как для классификации, так и для нумерации (индексации) ферментов, Между народная комиссия подготовила также Классификацию ферментов (КФ) с включением списка ферментов, первоначально состоявшего к 1961 г.

примерно из 900 ферментов. В списке ферментов (см. Номенклатуру ферментов, 1978) насчитывалось уже 2142 индивидуальных фермента, к де кабрю 1995 г. их идентифицировано более 3500. В списке для каждого фермента, помимо кодового номера (шифра), приводятся систематическое (рациональное) название, рекомендуемое (рабочее) название, химическая реакция, которую катализирует данный фермент, а также примечания о специфичности действия. Номер каждому ферменту рекомендуется при сваивать по четырехзначному коду.

Таким образом, код каждого фермента содержит четыре цифры, разделенные точками, и составляется по определенному принципу. Первая цифра указывает номер одного из шести главных классов ферментов.

Вторая цифра означает подкласс, характеризующий основные виды суб стратов, участвующих в данном типе химических превращений. Например, у трансфераз вторая цифра указывает на природу той группы, которая подвергается переносу, у гидролаз – на тип гидролизуемой связи и т.д. Эти подклассы в свою очередь делятся на более частные подгруппы (подпод классы), отличающиеся природой химических соединений доноров или акцепторов, участвующих в данной подгруппе реакций. Номер (цифра) подподкласса ставят на 3-е место в шифре фермента. У гидролаз, например, эта цифра уточняет тип гидролизуемой связи, а у лиаз – тип отщепляемой группы и т.д. Первые 3 цифры кода точно определяют тип фермента.

Наконец, все ферменты, относящиеся к данному подподклассу, получают порядковый номер в алфавитном порядке, который ставят на 4-е место в шифре.

Таблица 4.6. Фрагмент из списка ферментов Рекомендуе- Примечания о спе Системати Шифр мое (рабочее) Реакция цифичности и другие ческое название название зависимости КФ 1.1.1.27 Лактатдегид- L-лактат + L-лактат: Окисляет и другие рогеназа + НАД+ = пи- НАД+-окси- оксимонокарбоно руват + НАДН2 доредуктаза вые кислоты КФ 2.6.1.5 Тирозинами- L-Тирозин + L-тирозин: 2-ок- Протеин пиридо нотрансфера- + 2-оксоглута- соглутарат ами- ксальфосфата. Фе за рат = 4-окси- нотрансфераза нилаланин может фенилпируват действовать вместо + L-глутамат тирозина Каждый фермент, характеризующийся постоянной совокупностью цифр, имеет соответствующий код, под которым он внесен в список ферментов. В качестве примера в табл. 4.6 приведены 2 фермента из списка.

Следует особо отметить, что Международную классификацию фермен тов нельзя считать абсолютно совершенной, поскольку она в некоторых отношениях не соответствует общепринятой в органической химии клас сификации химических реакций, несмотря на то что ферменты катали зируют по существу те же реакции.

ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ Обладая высокой степенью избирательности, ферменты используются жи выми организмами для осуществления с высокой скоростью огромного разнообразия химических реакций;

они сохраняют свою активность не только в микропространстве клетки, но и вне организма. Ферменты нашли широкое применение в таких отраслях промышленности, как хлебопечение, пивоварение, виноделие, чайное, кожевенное и меховое производства, сыро варение, кулинария (для обработки мяса) и т.д. В последние годы ферменты стали применять в тонкой химической индустрии для осуществления таких реакций органической химии, как окисление, восстановление, дезамини рование, декарбоксилирование, дегидратация, конденсация, а также для разделения и выделения изомеров аминокислот L-ряда (при химическом синтезе образуются рацемические смеси L- и D-изомеров), которые ис пользуют в промышленности, сельском хозяйстве, медицине. Овладение тонкими механизмами действия ферментов, несомненно, предоставит неог раниченные возможности получения в огромных количествах и с большой скоростью полезных веществ в лабораторных условиях почти со 100% выходом.

В настоящее время развивается новая отрасль науки – промышленная энзимология, являющаяся основой биотехнологии. Фермент, ковалентно присоединенный («пришитый») к любому органическому или неорганиче скому полимерному носителю (матрице), называют иммобилизован ным. Техника иммобилизации ферментов допускает решение ряда клю чевых вопросов энзимологии: обеспечение высокой специфичности действия ферментов и повышения их стабильности, простоту в обращении, воз можность повторного использования, применение их в синтетических реак циях в потоке. Применение подобной техники в промышленности получило название инженерной энзимологии. Ряд примеров свидетельствует об огромных возможностях инженерной энзимологии в различных областях промышленности, медицины, сельского хозяйства. В частности, иммоби лизованную -галактозидазу, присоединенную к магнитному стержню мешалке, используют для снижения содержания молочного сахара в мо локе, т.е. продукта, который не расщепляется в организме больного ребенка с наследственной непереносимостью лактозы. Обработанное таким образом молоко, кроме того, хранится в замороженном состоянии зна чительно дольше и не подвергается загустеванию.

Разработаны проекты получения пищевых продуктов из целлюлозы, превращения ее с помощью иммобилизованных ферментов – целлюлаз – в глюкозу, которую можно превратить в пищевой продукт – крахмал. С по мощью ферментной технологии в принципе можно также получить про дукты питания, в частности углеводы, из жидкого горючего (нефти), расщепив его до глицеральдегида, и далее при участии ферментов синте зировать из него глюкозу и крахмал. Несомненно, имеет большое будущее моделирование при помощи инженерной энзимологии процесса фотосин теза, т.е. природного процесса фиксации СО2;

помимо иммобилизации, этот жизненно важный для всего человечества процесс потребует разра ботки новых оригинальных подходов и применения ряда специфических иммобилизованных коферментов.

В качестве примера иммобилизации ферментов и использования их в промышленности приводим схему непрерывного процесса получения аминокислоты аланина и регенерации кофермента (в частности, НАД) в модельной системе. В этой системе исходный субстрат (молочная кисло та) подается при помощи насоса в камеру-реактор, содержащий иммо билизованные на декстране НАД+ и две НАД-зависимые дегидрогеназы:

лактат- и аланиндегидрогеназы;

с противоположного конца реактора про дукт реакции – аланин – удаляется с заданной скоростью методом ультра фильтрации.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 14 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.