WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 14 |

«Учебная литература для студентов медицинских вузов Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин Биологическая химия Издание третье, переработанное и дополненное Рекомендован Управлением научных и образовательных ...»

-- [ Страница 2 ] --

Дальнейшие задачи – установление последовательности расположения аминокислот в каждом из выделенных пептидов (фенилтиогидантоиновым или другими методами), сопоставление полученных данных и установление первичной структуры всей молекулы.

Возможность применения рентгеноструктурного анализа для определе ния последовательности аминокислот в белковой молекуле была рассмот рена ранее. Следует отметить совершенно новый подход к решению этой важной проблемы – определение последовательности аминокислот в белко вой молекуле с использованием данных о комплементарной нуклеотидной последовательности ДНК. Этому способствуют как методы быстрого секвенирования ДНК, так и техника изолирования и доступности самого гена *.

В настоящее время выяснение первичной структуры белков является вопросом времени и технического оснащения лабораторий. Полностью выяснена первичная структура многих природных белков и прежде всего инсулина, содержащего 51 аминокислотный остаток [Сэнджер Ф., 1954].

Более крупным белком с выясненной первичной структурой оказался иммуноглобулин, в четырех полипептидных цепях которого насчитывается 1300 аминокислотных остатков. За эту работу Дж. Эдельман и Р. Портер были удостоены Нобелевской премии (1972).

* Описана первичная структура многих белков и ферментов, в частности репликазы фага MS2 (544 аминокислотных остатка), установленная этим методическим приемом.

Цепь А Цепь В Рис. 1.14. Структура проинсулина.

Расшифрованы первичные структуры миоглобина человека (153 амино кислотных остатка), -цепи (141) и -цепи (146) гемоглобина человека, цитохрома С из сердечной мышцы человека (104), лизоцима молока человека (130), химотрипсиногена быка (245) и многих других белков, в том числе ферментов и токсинов. На рис. 1.14 представлена последовательность аминокислотных остатков проинсулина. Видно, что молекула инсулина (выделена темными кружками), состоящая из двух цепей (А – 21 и В – аминокислотных остатков), образуется из своего предшественника – про инсулина (84 аминокислотных остатка), представленного одной полипеп тидной цепью, после отщепления от него пептида, состоящего из аминокислотных остатков. Строение молекулы инсулина (51 аминокислот ный остаток) схематически можно представить следующим образом:

А-цепь (21) В-цепь (30) Между цепями А и В и внутри А-цепи инсулина образуются дисуль фидные (—S—S—) связи. Выяснена первичная структура более 18 инсули нов, выделенных из разных источников. Близкими по первичной структуре оказались инсулины из поджелудочной железы человека, свиньи и каша лота. Единственным отличием инсулина человека является нахождение треонина в положении 30 В-цепи вместо аланина.

Вторым белком, первичная структура которого расшифрована С. Му ром и У. Стейном, является рибонуклеаза (рис. 1.15) из поджелудочной железы, катализирующая расщепление РНК. Фермент состоит из аминокислотных остатков с N-концевым лизином и С-концевым валином, между остатками цистеина образуются дисульфидные (—S—S—) связи в 4 участках.

Полностью расшифрована последовательность аминокислот полипеп тидной цепи фермента лизоцима, имеющего важное защитное и медицин ское значение, так как он вызывает лизис ряда бактерий, расщепляя основное вещество их клеточной оболочки. Лизоцим белка куриного яйца содержит 129 аминокислот (рис. 1.16) с N-концевым лизином и С-концевым лейцином.

Отечественными исследователями установлена первичная структура многих белков и полипептидов, в том числе крупного белка РНК-полимера зы (в частности, последовательности ее - и 1-субъединиц, 1342 и Рис. 1.15. Первичная структура РНКазы. Цветом выделены четыре дисульфидные связи.

Рис. 1.16. Первичная структура полипептидной цепи лизоцима (схема).

аминокислотных остатков соответственно * фактора элонгации G из Е.coli (701 аминокислота) (Ю.А. Овчинников и др.), фермента аспартатамино трансферазы, состоящей из 412 аминокислотных остатков (А.Е. Браун штейн, Ю.А. Овчинников и др.), леггемоглобина, белка L25 из рибосом E.coli, нейротоксинов из яда кобры (Ю.А. Овчинников и др.), пепсиногена и пепсина (В.М. Степанов и др.), L-липотропина и лактогенного гормона быка (Н.А. Юдаев, Ю.А. Панков) и др.

Исследования первичной структуры - и -цепей гемоглобина способ ствовали выяснению структуры необычных, так называемых аномальных, гемоглобинов, встречающихся в крови больных гемоглобинопатиями.

Иногда развитие болезни, как и изменение пространственной структуры гемоглобина человека, обусловлено заменой лишь одной какой-либо аминокислоты в структуре -цепей (реже -цепей) гемоглобина (см. главу 2).

Анализ данных о первичной структуре белков позволяет сделать сле дующие общие выводы.

1. Первичная структура белков уникальна и детерминирована генети чески. Каждый индивидуальный гомогенный белок характеризуется уни кальной последовательностью аминокислот: частота замены аминокислот приводит не только к структурным перестройкам, но и к изменениям физико-химических свойств и биологических функций.

* Следует указать, что в молекуле ДНК-зависимой РНК-полимеразы содержатся, помимо указанных - и '-, также - и '-субъединицы и -фактор, первичная структура которых пока не расшифрована, хотя известно общее количество аминокислот (~5000), входящих в состав этого гигантского белка.

2. Стабильность первичной структуры обеспечивается в основном глав новалентными пептидными связями;

возможно участие небольшого числа дисульфидных связей.

3. В полипептидной цепи могут быть обнаружены разнообразные ком бинации аминокислот;

в полипептидах относительно редки повторяющиеся последовательности.

4. В некоторых ферментах, обладающих близкими каталитическими свойствами, встречаются идентичные пептидные структуры, содержащие неизменные (инвариантные) участки и вариабельные последовательности аминокислот, особенно в областях их активных центров. Этот принцип структурного подобия наиболее типичен для ряда протеолитических фер ментов: трипсина, химотрипсина и др. (см. главу 4).

5. В первичной структуре полипептидной цепи детерминированы вто ричная, третичная и четвертичная структуры белковой молекулы, опреде ляющие ее общую пространственную конформацию.

Вторичная структура белка Рентгеноструктурная кристаллография решает две главные проблемы бел ковой химии: закономерности чередования последовательности аминокис лотных остатков в полипептидной цепи и закономерности конфигурации белковой молекулы.

Первые рентгенограммы белков, полученные еще в 30-х годах У. Астбю ри, а затем Л. Полингом и Р. Кори, позволили установить наличие в белках наряду с линейной полипептидной цепью участков, определенным образом скрученных.

Под вторичной структурой белка подразумевают конфигурацию поли пептидной цепи, т. е. способ свертывания, скручивания (складывание, упа ковка) полипептидной цепи в спиральную или какую-либо другую конфор мацию. Процесс этот протекает не хаотично, а в соответствии с програм мой, заложенной в первичной структуре. Подробно изучены две основные конфигурации полипептидных цепей, отвечающих структурным требова ниям и экспериментальным данным:

-спирали и -структуры.

Благодаря исследованиям Л. Полинга * наиболее вероятным типом строения глобулярных белков принято считать -спираль (рис. 1.17). Закру чивание полипептидной цепи происходит по часовой стрелке (правый ход спирали), что обусловлено L-аминокислотным составом природных белков.

Движущей силой в возникновении -спиралей (так же как и -структур) является способность аминокислот к образованию водородных связей.

В структуре -спиралей открыт ряд закономерностей. На каждый виток (шаг) спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка. Шаг спирали (расстояние вдоль оси) равен 0,54 нм на виток, а на один аминокислотный остаток приходится 0,15 нм. Угол подъема спирали 26°, через 5 витков спирали (18 аминокислотных остатков) структурная конфигурация полипеп тидной цепи повторяется. Это означает, что период повторяемости (или идентичности) -спиральной структуры составляет 2,7 нм.

Для каждого белка характерна определенная степень спирализации его полипептидной цепи. Степень спирализации устанавливают путем измере ния удельного вращения плоскости поляризованного света. Изменение * За открытие тонкой структуры белков при помощи рентгеноструктурного анализа нативных белков и синтезированных полипептидов Л. Полинг удостоен Нобелевской премии (1954).

5-й шаг 4-й шаг 18 остатков 3-й шаг 2,7 нм 0,51 нм 2-й шаг 26° 0,54 нм 1-й шаг 3,6 остатка 0,15 нм Рис. 1.17. Структура и параметры -спирали.

последнего находится в прямой зависимости от степени спирализации белковой молекулы. Не все глобулярные белки спирализованы на всем протяжении полипептидной цепи. В молекуле белка -спиральные участки чередуются с линейными. В частности, если - и -цепи гемоглобина спирализованы, например, на 75%, то лизоцима – на 42%, а пепсина – всего на 30%.

Таким образом, стабильность вторичной структуры обеспечивается в основном водородными связями (определенный вклад вносят и главно валентные связи – пептидные и дисульфидные).

Водородная связь представляет собой слабое электростатическое притяжение (взаимодействие, связь) между одним электроотрицательным атомом (например, кислородом или азотом) и водородным атомом, кова лентно связанным со вторым электроотрицательным атомом. Типы водо родных связей представлены далее.

По современным представлениям, водородная связь включает не только электростатические силы притяжения между полярными группами (взаимо действие атомов водорода с электроотрицательными элементами: кислоро дом, азотом, хлором), но и электронные связи такого же типа, как в ряде комплексных соединений. Водородные связи, являясь нековалентными, отличаются малой прочностью. Так, если для разрыва химических меж атомных связей необходимо затратить от 84 до 8400 кДж, то для разрыва одной водородной связи требуется затратить всего лишь 6,3 кДж на 1 моль.

Поскольку в белковой молекуле число водородных связей очень велико (в образование водородных связей вовлечены все пептидные группы), они в сумме обеспечивают скручивание полипептидной цепи в спиральную структуру, сообщая ей компактность и стабильность.

Механизм возникновения водородных связей в элементарной форме может быть представлен на примере взаимодействия двух молекул воды (диполи). В диполе воды, как известно, избыток положительных зарядов приходится на атомы водорода, а избыток отрицательных – на атомы кислорода.

Благодаря особенностям строения атома водорода при достаточном сближении двух молекул воды возникает электростатическое взаимодейст вие между атомом кислорода одной молекулы и атомом водорода второй молекулы воды. Следствием этого является ослабление связи между атома ми водорода и кислорода в каждой молекуле воды и соответственно возникновение новой, непрочной связи (отмечена пунктиром) между ато мом водорода первой молекулы и атомом кислорода второй молекулы воды. Эту непрочную связь принято обозначать водородной связью.

В белковой молекуле наиболее важные водородные связи образуются между ковалентно связанным атомом водорода, несущим частичный поло жительный заряд, и отрицательно заряженным ковалентно связанным атомом кислорода. Ниже представлены примеры водородных связей в бел ковой молекуле: а) между пептидными цепями;

б) между двумя гидрок сильными группами;

в) между ионизированной СООН-группой и ОН-груп пой тирозина;

г) между ОН-группой серина и пептидной связью.

б а г в В зависимости от химической природы атома-акцептора водородные связи отличаются друг от друга степенью прочности. О количестве водо родных связей в белковой молекуле судят по данным изотопного метода, в частности по времени обмена атомов водорода, участвующих в образова нии водородной связи, на дейтерий (при обработке белка тяжелой водой D2O, в которой вместо обычного водорода содержится его тяжелый изотоп дейтерий).

Другой тип конфигурации полипептидных цепей, обнаруженный в бел ках волос, шелка, мышц и в других фибриллярных белках, получил название -структуры. В этом случае две или более линейные полипеп тидные цепи, расположенные параллельно или, чаще, антипараллельно, прочно связываются межцепочечными водородными связями между NH и СО-группами соседних цепей, образуя структуру типа складчатого слоя (рис. 1.18).

Рис. 1.18. -Структура полипеп тидных цепей.

В природе существуют белки, строение которых, однако, не соответст вует ни -, ни -структуре. Типичным примером таких белков является коллаген – фибриллярный белок, составляющий основную массу соедини тельной ткани в организме человека и животных (см. главу 21).

Методами рентгеноструктурного анализа в настоящее время доказано существование еще двух уровней структурной организации белковой моле кулы, оказавшихся промежуточными между вторичной и третичной струк турами. Это так называемые надвторичные структуры и структур ные домены.

Надвторичные структуры представляют собой агрегаты полипеп тидных цепей, обладающих собственной вторичной структурой и образую щихся в некоторых белках в результате их термодинамической или кинети ческой стабильности. Так, в глобулярных белках открыты (х)-элементы (представлены двумя параллельными -цепями, связанными сегментом х), -элементы (представлены двумя сегментами -спирали, вставленными между тремя параллельными -цепями) и др. В больших глобулярных белках иногда содержатся неодинаковые структурные домены, выполняю щие разные функции, как и однотипные домены в пределах одного моно мерного белка, образующиеся, вероятнее всего, как результат влияния генов в первом случае или дупликации генов – во втором. Домены создают ся объединением и чередованием -спиралей и -слоев, между которыми открываются более рыхлые структуры (рис. 1.19).

Домен – это компактная глобулярная структурная единица внутри полипептидной цепи. Домены могут выполнять разные функции и подвер гаться складыванию (свертыванию) в независимые компактные глобуляр ные структурные единицы, соединенные между собой гибкими участками внутри белковой молекулы. Открыто много белков (например, иммуногло булины), состоящих из разных по структуре и функциям доменов, кодируе мых разными генами.

Третичная структура белка Под третичной структурой белка подразумевают пространственную ориен тацию полипептидной спирали или способ укладки полипептидной цепи в определенном объеме. Поскольку ни первичная структура, ни типы спиралей или сочетания спиральных и линейных участков полипептидной б а -Спираль -Структура Дисульфидный мостик в г Рис. 1.19. Доменное строение глобулярных белков (по А. А. Болдыреву).

а - -субъединица гемоглобина;

б - константный домен иммуноглобулина;

в - флаводоксин;

г - лизоцим куриного яйца.

цепи не дают представления об объеме, форме полипептидной цепи, перед исследователем всегда стоит необходимость определения трехмерной или пространственной конфигурации белка. Основную роль в решении этих задач сыграл рентгеноструктурный анализ с высокой разрешающей способ ностью. Как было отмечено, метод успешно решает две главные проблемы химии белков: закономерность последовательностей аминокислотных ос татков в полипептиде и закономерность конфигурации молекулы белка.

Межатомные расстояния в молекулах органических веществ составляют 0,1–0,2 нм, а максимальная разрешающая способность современных аппа ратов равна 0,2 нм. Это не позволяет установить местоположение каждого атома, хотя вполне могут быть различимы отдельные сочетания атомов, особенно при введении в молекулу белков атомов тяжелых металлов Рис. 1.20. Модель третичной структуры молекулы миоглобина (по Дж. Кендрью).

Латинскими буквами обозначены структурные домены, красным цветом – гем.

(последние благодаря своей высокой электронной плотности используются в качестве точек отсчета при математической обработке рентгенограмм).

Первым белком, третичная структура которого была выяснена Дж. Кендрью на основании рентгеноструктурного анализа, оказался мио глобин кашалота. Это сравнительно небольшой белок с мол. м. 16700, содержащий 153 аминокислотных остатка (полностью выяснена первичная структура), представленный одной полипептидной цепью. Основная функ ция миоглобина – перенос кислорода в мышцах. Полипептидная цепь мио глобина (рис. 1.20) представлена в виде изогнутой трубки, компактно уложенной вокруг гема (небелковый компонент, содержащий железо;

см.

главу 2).

На протяжении последних десятилетий в связи с повышением разрешаю щей способности рентгеноструктурного метода была расшифрована третич ная структура более 1000 белков, в том числе гемоглобина, пепсина, химотрипсина, рибонуклеазы, лизоцима, трипсина и его ингибитора, ряда фрагментов иммуноглобулинов человека, цитохрома С, карбоангидразы человека, аспартатаминотрансферазы, инсулина и др. Примеры трехмерной структуры некоторых из них представлены на рис. 1.21.

Рентгеноструктурный анализ позволяет определить конформацию и ход полипептидной цепи в пространстве, поэтому для каждого белка может быть построена объемная модель, отражающая местоположение линейных и спирализованных участков. При изучении глобулярных белков было показано, что пространственная структура белков в сильной степени зави сит от ряда факторов, в частности от ионной силы и рН раствора, температуры и т.д. Новейшие методы дифракции рентгеновских лучей а б Рис. 1.21. Пространственная конфигурация карбоксипептидазы (а) и рибонукле азы (б).

позволили расшифровать кристаллическую структуру более 100 ферментов.

Для выяснения трехмерной структуры белков в последнее время успешно применяются также методы низкотемпературной вычислительной техники, а также математические и компьютерные методы определения объемной структуры на основании данных последовательностей аминокислот.

В настоящее время получены бесспорные доказательства, что в стабили зации пространственной структуры белков, помимо ковалентных связей (пептидные и дисульфидные связи), основную роль играют так называемые нековалентные связи (рис. 1.22). К этим связям относятся водородные связи, электростатические взаимодействия заряженных групп, межмолеку лярные ван-дер-ваальсовы силы, взаимодействия неполярных боковых ра дикалов аминокислот, так называемые гидрофобные взаимодействия и т.д.

По современным представлениям, третичная структура белка после завершения его синтеза в рибосомах (см. главу 14) формируется совершенно автоматически, самопроизвольно и полностью предопределяется первичной структурой. Основной движущей силой в возникновении трехмерной струк туры является взаимодействие радикалов аминокислот с молекулами воды.

При этом неполярные гидрофобные радикалы аминокислот как бы погру жаются внутрь белковой молекулы, образуя там сухие зоны, в то время как полярные радикалы оказываются ориентированными в сторону воды.

В какой-то момент возникает термодинамически наиболее выгодная ста бильная конформация * молекулы. В такой форме белковая молекула характеризуется минимальной свободной энергией. Молекулы белков в водных растворах обычно принимают ряд стабильных конформаций, инду цируемых не только изменениями рН и температуры, но и низкомолеку лярными соединениями. Различают две основные формы конформаций:

Т-форму (от англ. tensed – напряженная) и R-форму (от англ. relaxed – рас * Конформацией принято называть пространственное расположение атомов в молекуле белка. Этот термин означает структурное состояние молекулы белка, которое может перехо дить без разрыва ковалентных связей в другое структурное состояние, вызванное, например, вращением вокруг единственной связи.

Полипептидная цепь а а в б в в г д Рис. 1.22. Типы нековалентных связей, стабилизирующих третичную структуру белка.

а - электростатическое взаимодействие;

б - водородная связь;

в - гидрофобные взаимодействия неполярных групп;

г - диполь-дипольные взаимодействия;

д - дисульфидная (ковалентная) связь.

слабленная). Между этими формами осуществляются переходы, соответст венно отражающиеся в биологических свойствах.

В процессе укладки синтезированной полипептидной цепи, получившем название фолдинга – формирование нативной пространственной струк туры, в клетках происходит отбор из множества стерически возможных состояний одной-единственной стабильной и биологически активной кон формации, определяемой, вероятнее всего, первичной структурой. Описан ряд наследственных заболеваний человека, развитие которых связывают с нарушением вследствие мутаций процесса фолдинга (пигментозы, фибро зы и др.). Поэтому в настоящее время пристальное внимание исследова телей приковано к выяснению зависимости между аминокислотной после довательностью синтезированной в клетке полипептидной цепи (первичная структура) и формированием пространственной трехмерной структуры, обеспечивающей белковой молекуле ее нативные свойства. Имеется немало экспериментальных доказательств, что этот процесс не является автомати ческим, как предполагалось ранее, и, вероятнее всего, регулируется и конт ролируется также внутриклеточными молекулярными механизмами, детали которых пока полностью не раскрыты. Из клеток выделено несколько классов белков, названных шаперонами, или белками теплового шока, которые располагаются между N-концевым сигнальным пептидом и мат ричным белком. Предполагается, что основными функциями шаперонов являются способность предотвращать образование из полипептидной цепи неспецифических (хаотичных) беспорядочных клубков, или агрегатов бел ков, и обеспечение доставки (транспорта) их к субклеточным мишеням, создавая условия для завершения свертывания белковой молекулы. Эти результаты наводят на мысль о возможности существования «второй половины генетического кода», определяя тем самым повышенный интерес исследователей к проблеме свертывания полипептидной цепи и формирова ния ее нативной пространственной конформации.

Таким образом, линейная одномерная структура полипептидной цепи (т.е. последовательность аминокислотных остатков, обусловленная кодом белкового синтеза) наделена информацией другого типа – конформацион ной, которая представляет собой образование белковой молекулы строго заданной формы с определенным пространственным расположением отдель ных ее частей. Другими словами, третичная – объемная – структура бел ковой молекулы детерминирована аминокислотной последовательностью полипептидной цепи, а более конкретно – размером, формой и полярностью радикалов аминокислотных остатков. Эти представления могут служить основой для предсказания конформации белковой молекулы на основании аминокислотной последовательности. Следует указать, однако, что до сих пор представляется интригующей загадкой механизм этой тесной и тонкой связи между аминокислотной последовательностью и трехмерной структу рой белковой молекулы. Оказывается, иногда полипептиды почти с одина ковыми последовательностями образуют разные структуры и, наоборот, полипептиды с разными последовательностями формируют одинаковую трехмерную структуру.

В свою очередь трехмерная структура белковой молекулы также содер жит информацию, но уже совершенно нового типа, а именно функциональ ную, которую акад. В.А. Энгельгардт назвал интрамолекулярной информацией. Как будет показано далее, все биологические свойства белков (каталитические, гормональные, антигенные и др.) связаны с со хранностью их третичной структуры, которую принято называть нативной конформацией. Любые воздействия (термические, физические, химические), приводящие к нарушению этой конформации молекулы (разрыв водород ных и других нековалентных связей), сопровождаются частичной или полной потерей белком его биологических свойств.

Четвертичная структура белка Под четвертичной структурой подразумевают способ укладки в простран стве отдельных полипептидных цепей, обладающих одинаковой (или раз ной) первичной, вторичной или третичной структурой, и формирование единого в структурном и функциональном отношениях макромолекулярно го образования. Многие функциональные белки состоят из нескольких полипептидных цепей, соединенных не главновалентными связями, а неко валентными (аналогичными тем, которые обеспечивают стабильность тре тичной структуры). Каждая отдельно взятая полипептидная цепь, получив шая название протомера, мономера или субъединицы, чаще всего не обладает биологической активностью. Эту способность белок приобретает при определенном способе пространственного объединения входящих в его состав протомеров, т.е. возникает новое качество, не свойственное моно мерному белку. Образовавшуюся молекулу принято называть олигоме ром (или мультимером). Олигомерные белки чаще построены из четного числа протомеров (от 2 до 4, реже от 6 до 8) с одинаковыми или разными молекулярными массами – от нескольких тысяч до сотен тысяч. В част ности, молекула гемоглобина состоит из двух одинаковых - и двух -полипептидных цепей, т.е. представляет собой тетрамер. На рис. 1. представлена структура молекулы гемоглобина, а на рис. 1.24 хорошо видно, что молекула гемоглобина содержит четыре полипептидные цепи, Рис. 1.23. Олигомерная мо лекула гемоглобина (крас ные диски – группы гема).

каждая из которых окружает группу гема – пигмента, придающего крови ее характерный красный цвет (см. главу 2).

В определенных условиях (присутствие солей, 8М мочевины или резкие изменения рН) молекула гемоглобина обратимо диссоциирует на две и две -цепи. Эта диссоциация обусловлена разрывом водородных связей.

После удаления солей или мочевины происходит автоматическая ассоциа ция исходной молекулы гемоглобина (рис. 1.25).

Классическим примером олигомерной молекулы, или надмолекулярной структуры, является вирус табачной мозаики, представляющий собой ги гантскую молекулу с мол. м. около 40•106. Он состоит из одной молекулы Рис. 1.24. Модель гемогло бина (по Перутцу).

-Цепи светлые;

-цепи темные;

группы гема красные.

Добавление Удаление мочевины мочевины Рис. 1.25. Обратимая диссоциация молекулы гемоглобина.

РНК (см. главу 3) и 2130 белковых субъединиц, масса каждой из которых составляет 17500. Длина вируса примерно 300 нм, ширина – около 17 нм.

РНК вируса имеет спиралеобразную форму. Вокруг РНК нанизаны бел ковые частицы, образующие гигантскую надмолекулярную спиральную структуру, в которой насчитывается около 130 витков (рис. 1.26). Удиви тельной особенностью вируса является то, что после разъединения соответ ствующими приемами (добавление детергента) РНК и белковых субъеди ниц и последующего их смешивания (с предварительным удалением детер гента) наблюдаются полная регенерация четвертичной структуры, восста новление всех физических параметров и биологических функций (инфектив ная способность вируса). Подобная точность процесса спонтанной само сборки вируса обеспечивается, вероятнее всего, информацией, содержащей ся в первичной структуре молекулы РНК и белковых субъединиц. Таким образом, последовательность аминокислот содержит в себе информацию, которая реализуется на всех уровнях структурной организации белков.

Многие ферменты также обладают четвертичной структурой, например фосфорилаза а, состоящая из двух идентичных субъединиц, в каждой из которых по две пептидные цепи. Вся молекула фосфорилазы а, таким образом, представляет собой тетрамер. Отдельные субъединицы чаще всего не обладают каталитической активностью;

вообще регуляторные ферменты Общая длина 130 витков Рис. 1.26. Самосборка вируса та бачной мозаики.

(см. главу 4) имеют четвертичную олигомерную структуру. Они наделены функцией обеспечения в клетке требуемых скоростей химических реакций.

Наиболее изученным олигомерным ферментом является лактатдегидро геназа (она катализирует обратимое превращение пировиноградной кисло ты в молочную), содержащая два типа полипептидных цепей: Н – сердечный тип (от англ. heart – сердце) и М – мышечный тип (от англ. muscle – мышца) – и состоящая из 4 субъединиц. Этот фермент благодаря различным сочета ниям субъединиц может существовать в 5 формах. Такие ферменты получи ли название изоферментов, или, в соответствии с новой классификацией, множественных форм ферментов (см. главу 4).

К настоящему времени субъединичная структура обнаружена у несколь ких сотен белков. Однако только для немногих белков, в том числе для молекулы гемоглобина, методом рентгеноструктурного анализа расшифро вана четвертичная структура *. Основными силами, стабилизирующими четвертичную структуру, являются нековалентные связи между контактны ми площадками протомеров, которые взаимодействуют друг с другом по типу комплементарности – универсальному принципу, свойственному живой природе. Структура белка после его синтеза в рибосоме может частично подвергаться модификации (посттрансляционный процессинг):

например, при превращении предшественников ряда ферментов или гормо нов (инсулин).

Таким образом, имеются все основания для подтверждения мнения о существовании 4 уровней структурной организации белков. Более того, каждый индивидуальный белок характеризуется уникальной структурой, обеспечивающей уникальность его функций. Поэтому выяснение структуры разнообразных белков может служить ключом к познанию природы живых систем и соответственно сущности жизни. На этом пути научного поиска могут быть решены также многие проблемы наследственных заболеваний человека, в основе которых лежат дефекты структуры и биосинтеза белков.

Некоторые исследователи склонны рассматривать, и не без основания, существование пятого уровня структурной организации белков. Речь идет о полифункциональных макромолекулярных комплексах, или ассоциатах из разных ферментов, получивших название метаболических олигомеров, или метаболонов, и катализирующих весь путь превращений субстрата (синте тазы высших жирных кислот, пируватдегидрогеназный комплекс, дыхатель ная цепь).

КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ В настоящее время еще не разработана стройная система номенклатуры и классификации белков. Традиционная классификация белков по группам, основанная, скорее, на случайных показателях (физико-химические свой ства, форма молекул, локализация и происхождение, аминокислотный состав), уже не отвечает полностью возросшему уровню знаний о их структуре и функциях. Из огромного количества природных белков струк тура и функции расшифрованы для относительно небольшого числа (не более нескольких сотен), и поэтому структура и функции белков пока не могут служить основой для их рациональной классификации. Пожалуй, только для одной группы белков, обладающих способностью катализиро * Установлена четвертичная структура ряда иммуноглобулинов, состоящих из легких и тяжелых полипептидных цепей, соединенных в отличие от других олигомерных белков дисульфидными связями.

вать химические реакции, т.е. ферментов, разработана стройная система номенклатуры и классификации, в основу которой положены типы катали зируемых химических реакций и химическая природа реагирующих веществ.

Однако полностью идентифицированные до сих пор ферменты также составляют незначительную долю белков (ферментов описано более 3000).

Тем не менее функциональный принцип, рекомендуемый некоторыми авто рами, хотя и не может служить универсальной основой для классификации всех белков, представляет определенный интерес. В соответствии с функ циональным принципом различают 12 главных классов белков: 1) катали тически активные белки (ферменты);

2) белки-гормоны (хотя есть и сте роидные гормоны);

3) белки-регуляторы активности генома;

4) защитные белки (антитела, белки свертывающей и антисвертывающей систем крови);

5) токсические белки;

6) транспортные белки;

7) мембранные белки;

8) со кратительные белки;

9) рецепторные белки;

10) белки-ингибиторы фер ментов;

11) белки вирусной оболочки;

12) белки с иными функциями.

Были предприняты также попытки классифицировать белки, исходя из особенностей вторичной и третичной структуры. В соответствии с этим различают -, -, +- и /-белки. -Белки содержат только -спирали (не менее 60%), -белки – только -структуры (не менее двух антипараллельных цепей), +-белки – те и другие структуры в пределах одной полипептид ной цепи (пример – молекулы лизоцима), а класс /-белков содержит множество - и -структур, чередующихся вдоль полипептидной цепи или домена (см. рис. 1.19). Домены создаются объединением и чередованием -спиралей и -слоев, между которыми открываются более рыхлые струк туры.

Учитывая необходимость для студента-медика основательного знаком ства с отдельными группами белков, которые могут служить предметом изучения в его будущей профессиональной деятельности (например, белки крови), приводим старую классификацию белков с краткой характеристи кой новых данных о структуре, составе и свойствах отдельных представи телей. Согласно этой классификации, обширный класс белковых веществ в зависимости от химического состава делят на простые и сложные белки *.

Простые белки построены из остатков аминокислот и при гидролизе распадаются соответственно только на свободные аминокислоты.

Сложные белки – это двухкомпонентные белки, которые состоят из какого-либо простого белка и небелкового компонента, называемого про стетической группой. При гидролизе сложных белков, помимо сво бодных аминокислот, освобождается небелковая часть или продукты ее распада.

Простые белки в свою очередь делятся на основании некоторых условно выбранных критериев на ряд подгрупп: протамины, гистоны, альбумины, глобулины, проламины, глютелины и др. Классификация сложных белков (см. главу 2) основана на химической природе входящего в их состав небелкового компонента. В соответствии с этим различают фосфопротеины (содержат фосфорную кислоту), хромопротеины (в состав их входят пиг менты), нуклеопротеины (содержат нуклеиновые кислоты), гликопротеины (содержат углеводы), липопротеины (содержат липиды) и металлопротеины (содержат металлы).

* Деление белков на простые и сложные, по всей вероятности, является условным, поскольку многие белки, традиционно рассматриваемые как простые (например, яичный альбумин), на самом деле оказываются сложными, так как содержат небелковый компонент, чаще всего углеводной или липидной природы, либо какой-либо металл (см. главу 2).

ХИМИЯ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ Протамины и гистоны. Данная группа белков отличается рядом характер ных физико-химических свойств, своеобразием аминокислотного состава и представлена в основном белками с небольшой молекулярной массой.

Протамины обладают выраженными основными свойствами, обусловлен ными наличием в их составе от 60 до 85% аргинина. Так, сальмин, выделенный из молок семги, состоит на 85% из аргинина. Высоким содержанием аргинина отличается другой хорошо изученный белок – клу пеин, выделенный из молок сельди: из 30 аминокислот в нем на долю аргинина приходится 21 остаток. Расшифрована первичная структура клу пеина. Протамины хорошо растворимы в воде, изоэлектрическая точка их водных растворов находится в щелочной среде. По современным представ лениям, протамины скорее всего являются пептидами, а не белками, поскольку их молекулярная масса не превышает 5000. Они составляют белковый компонент в структуре ряда сложных белков.

Гистоны также являются белками основного характера. В их состав входят лизин и аргинин, содержание которых, однако, не превышает 20–30%. Молекулярная масса гистонов намного больше нижнего предела молекулярной массы белков. Эти белки сосредоточены в основном в ядрах клеток в составе дезоксирибонуклеопротеинов и играют важную роль в регуляции экспрессии генов (см. главы 2 и 3).

Проламины и глютелины. Это белки растительного происхождения, отличаются своеобразием аминокислотного состава и физико-химических свойств. Они содержатся в основном в семенах злаков (пшеница, рожь, ячмень и др.), составляя основную массу клейковины. Характерной особен ностью проламинов является растворимость в 60–80% водном растворе этанола, в то время как все остальные простые белки в этих условиях обычно выпадают в осадок. Наиболее изучены оризенин (из риса), глюте нин и глиадин (из пшеницы), зеин (из кукурузы), гордеин (из ячменя) и др.

Установлено, что проламины содержат 20–25% глутаминовой кислоты и 10–15% пролина.

Альбумины и глобулины. Эти белки относятся к белкам, широко рас пространенным в органах и тканях животных. Наиболее богаты ими белки сыворотки крови, молока, яичный белок, мышцы и др. В плазме крови человека в норме содержится около 7% белков, представленных преиму щественно альбуминами и глобулинами. Альбумины и глобулины – это глобулярные белки, различающиеся по растворимости (табл. 1.6).

Необходимо отметить, что само определение «альбумины» и «глобули ны» основано на их растворимости в дистиллированной воде и полунасы Таблица 1.6. Растворимость альбуминов и глобулинов Растворитель Альбумины Глобулины Дистиллированная вода Растворимы Нерастворимы » Слабые солевые растворы NaCl Растворимы » Насыщенный раствор Na2SO4 Нерастворимы Насыщенный раствор NaCl » » » Полунасыщенный раствор (NH4)2SO4 » » Насыщенный раствор (NH4)2SO4 Нерастворимы щенном растворе (NH4)2SO4. Однако, как показывают данные табл. 1.6, глобулины растворимы только в разбавленных солевых растворах.

Различную растворимость альбуминов и глобулинов сыворотки крови раньше широко использовали в клинической практике для их фракциониро вания и количественного определения (см. главу 17).

В настоящее время качественный состав и содержание сывороточных белков определяют с помощью электрофореза на бумаге и в полиакрил амидном геле в небольшом количестве сыворотки крови. Типичная электро фореграмма белков сыворотки крови, а также соотношение отдельных фракций представлены в главе 17. Альбумины и глобулины отличаются друг от друга также по молекулярной массе – соответственно 40000– и 150000 и более.

Из сыворотки крови не только выделен альбумин в чистом виде, но и определена первичная структура его единственной полипептидной цепи (575 аминокислотных остатков). Альбумин имеет относительно низкую изоэлектрическую точку (4,7) и высокий отрицательный заряд при рН 8,6, благодаря чему он мигрирует с большой скоростью в электрическом поле к аноду. Принято считать, что примерно 75–80% осмотического давления белков сыворотки крови приходится на альбумины;

кроме того, основной функцией их считают транспорт жирных кислот. Однако точная функция альбуминов не совсем ясна. Известны случаи, когда у некоторых людей в крови фактически отсутствуют альбумины (врожденная аномалия), но они практически здоровы.

Глобулины, представленные 1-фракцией, содержатся в крови в комп лексе с билирубином и с липопротеинами высокой плотности. Глобулины, мигрирующие при электрофорезе в виде 2-фракции, содержат глобулин и неизвестный гликопротеин. -Глобулины включают ряд важных в функ циональном отношении белков, в частности трансферрин – белок, ответст венный за транспорт железа. С этой же фракцией связан церулоплазмин – белок, транспортирующий ионы меди. Отсутствие этого белка приводит к развитию гепатоцеребральной дистрофии, при которой наблюдается отравление организма ионами свободной меди. В основе болезни лежит врожденный дефицит синтеза церулоплазмина. Наконец, во фракции глобулинов содержится протромбин, являющийся предшественником тром бина – белка, ответственного за превращение фибриногена крови в фибрин при свертывании крови.

Фракция -глобулинов является наиболее гетерогенной. Известно мно жество антител, различающихся первичной структурой. Электрофоретиче ски они открываются главным образом в -глобулиновой и частично в 2-глобулиновой фракциях. Структура и функция -глобулинов более подробно рассмотрены далее (см. главу 2, «Гликопротеины»).

ПРИРОДНЫЕ ПЕПТИДЫ В последние годы значительно повысился интерес к структуре и функциям встречающихся в свободном состоянии в организме низкомолекулярных пептидов, выполняющих ряд специфических биологических функций. Ко роткие пептиды, содержащие до 10 аминокислот, принято называть олигопептидами;

в то же время полипептиды и белки считаются взаимозаменяемыми, хотя термином «полипептиды» чаще обозначают продукты с мол. м. менее 10000. В некоторых биоактивных пептидах имеются необычные аминокислоты, не встречающиеся в природных белках, или производные обычных аминокислот (гормоны, антибиотики). Мнение о том, что пептиды могут играть роль промежуточных продуктов на пути синтеза белка, не подтвердилось, поскольку, как показано в главе 14, этот процесс во всех клетках у всех живых организмов осуществляется de novo матричным путем.

Природные пептиды, наделенные биологической активностью, в зависи мости от характера действия и происхождения принято делить на 4 группы:

1) пептиды, обладающие гормональной активностью (вазопрессин, окси тоцин, кортикотропин, глюкагон, кальцитонин, меланоцитстимулирующий гормон, рилизинг-факторы гипоталамуса и др.;

см. главу 8);

2) пептиды, принимающие участие в процессе пищеварения (в частности, гастрин и секретин;

см. главу 12);

3) пептиды, источник которых – 2-глобулиновая фракция сыворотки крови (такие, как ангиотензин, брадикинин и каллидин);

4) нейропептиды.

В последнее время выяснены некоторые закономерности синтеза фи зиологически активных пептидов из биологически инертных предшествен ников – белков в результате процесса, называемого посттрансляционной модификацией (постсинтетические превращения белковой молекулы). Из вестно, например, что ангиотензины (представленные октапептидами), оказывающие выраженное сосудосуживающее действие, образуются из присутствующего в сыворотке крови неактивного белка ангиотензиногена в результате последовательного действия ряда протеолитических фермен тов (ренина и особого фермента, участвующего в превращении неактивного ангиотензина I в активный ангиотензин II).

АНГИОТЕНЗИНОГЕН (неактивный) Ренин АНГИОТЕНЗИН I (неактивный) Карбокси катепсин АНГИОТЕНЗИН II (активный) Асп-Арг-Вал-Тир-Иле-Гис-Про-Фен К группе вазоактивных (оказывающих влияние на тонус сосудов) пепти дов относятся, кроме того, широко применяемые в медицинской практике брадикинин и каллидин.

Брадикинин представляет собой нонапептид:

H–Apг–Про–Про–Гли–Фен–Сер–Про–Фен–Apг–ОН.

Каллидин представлен декапептидом, образующимся из неактивного плазменного белка кининогена, и отличается от брадикинина присутствием на N-конце еще одного аминокислотного остатка (Лиз):

Н–Лиз–Арг–Про–Про–Гли–Фен–Сер–Про–Фен–Apг–ОН.

Совсем недавно из экстрактов ткани предсердия (но не из желудочков сердца) человека и животных были выделены биологически активные пептиды, регулирующие тонус сосудистой системы и электролитный обмен.

Физиологический эффект их оказался противоположным влиянию системы ренин–ангиотензин–альдостерон. Он выражается в сосудорасширяющем действии, усилении клубочковой фильтрации и стимуляции выведения натрия и хлоридов за счет угнетения их реабсорбции в канальцах. Эти пептиды получили название атриопептидов (от лат. atrio – предсердие).

Они построены из разного числа аминокислот (от 23 до 100), но обязатель ным условием для проявления биологического эффекта является наличие в молекуле 17-членной кольцевой структуры, образующейся за счет дисуль фидной связи между остатками цистеина.

Внутриклеточным посредником действия атриопептидов оказался цик лический гуанозинмонофосфат (цГМФ), синтез которого осуществляется в результате активирования мембранного фермента гуанилатциклазы;

действие аденилатциклазы, напротив, тормозится под влиянием атриопеп тидов.

Во всех животных тканях и в некоторых растениях широко распростра нен низкомолекулярный трипептид глутатион, функции которого пока не выяснены достаточно полно, хотя он открыт сравнительно давно. Глута тион представляет собой атипичный трипептид (в котором в образовании одной из пептидных связей участвует не -карбоксильная, а -карбок сильная группа глутамата) следующего строения:

-глутамил-цистеинил глицин:

Глутатион (восстановленный) Цистеин является составной частью глутатиона, поэтому последний может находиться в восстановленной (SH) и в окисленной (S-S) формах (сокращенно обозначаются Г-SH и Г-S-S-Г), что, по-видимому, имеет отношение к биологической роли глутатиона в организме.

Интерес к природным пептидам в значительной степени обусловлен необычно высокой их биологической активностью. Они оказывают мощное фармакологическое действие на множество физиологических функций орга низма. В то же время были замечены низкая стабильность и быстрый распад их в организме при физиологических значениях рН среды. Все это способствовало развитию исследований как в области препаративного выделения природных пептидов из органов и тканей (включая получение биологически активных пептидов из предшественников методами ограни ченного протеолиза ряда хорошо известных гормонов), так и в области химического синтеза. Получение ряда биологически активных нейропепти дов из гормонов гипофиза, в частности эндорфинов и энкефалинов, наде ленных мощным обезболивающим действием (путем связывания рецепто ров определенных клеток мозга), в сотни и тысячи раз превосходящим аналгезирующий эффект морфина, описано в главе 8.

Из ткани мозга выделен также -пептид сна;

ряд других нейропептидов принимает участие в биохимических механизмах памяти, страха, обучения и т.д. Для повышения стабильности пептидов при введении в организм предприняты попытки химического синтеза пептидов, в которых один или несколько аминокислотных остатков L-ряда замещают остатками D аминокислот. Подобная замена, не вызывая снижения биоактивности, защищает пептид от воздействия протеиназ тканей, способствуя пролон гированию эффекта препарата.

Среди естественно встречающихся небольших пептидов следует указать на антибиотик грамицидин S, выделенный из Bacillus brevis и представ ляющий собой циклический декапептид:

Грамицидин S Как видно, в структуре грамицидина S имеются 2 остатка орнитина (Орн), производные аминокислоты аргинина и 2 остатка неприродных D-изомеров фенилаланина. Стрелки указывают направление синтеза от NН2-групп к СООН-группам каждого остатка, и вследствие цикличности грамицидин S не имеет конца.

Широкое применение, особенно в пищевой промышленности, в качестве заменителя сахара получил искусственный (генноинженерный синтез) ди пептид, состоящий из L-изомеров аспарагиновой кислоты и метилового эфира фенилаланина, названный аспартамом:

Аспартам Аспартам в сотни раз слаще сахара и легко распадается в организме на две свободные аминокислоты, абсолютно безвредные для организма;

по этому он рекомендован в качестве заменителя сахара больным диабетом.

Это пример пептида, наделенного огромным биологическим эффектом.

Глава ХИМИЯ СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ Сложные белки, как было отмечено, содержат два компонента – простой белок и небелковое вещество. Последнее называют простетической группой (от греч. prostheto – присоединяю). Простетические группы, как правило, прочно связаны с белковой молекулой. Далее представлены сведения о химической природе и биологической роли некоторых сложных белков.

ХРОМОПРОТЕИНЫ Хромопротеины (от греч. chroma – краска) состоят из простого белка и связанного с ним окрашенного небелкового компонента. Различают гемопротеины (содержат в качестве простетической группы железо), маг нийпорфирины и флавопротеины (содержат производные изоаллоксазина).

Хромопротеины наделены рядом уникальных биологических функций: они участвуют в таких фундаментальных процессах жизнедеятельности, как фотосинтез, дыхание клеток и целостного организма, транспорт кислорода и диоксида углерода, окислительно-восстановительные реакции, свето и цветовосприятие и др.

Таким образом, хромопротеины играют исключительно важную роль в процессах жизнедеятельности. Например, подавление дыхательной функ ции гемоглобина путем введения оксида углерода (СО) либо утилизации (потребление) кислорода в тканях путем введения синильной кислоты или ее солей (цианидов), ингибирующих ферментные системы клеточного ды хания, моментально приводит к смерти организма.

Хромопротеины являются непременными и активными участниками аккумулирования энергии, начиная от фиксации солнечной энергии в зе леных растениях и утилизации ее до превращений в организме животных и человека. Хлорофилл (магнийпорфирин) вместе с белком обеспечивает фотосинтетическую активность растений, катализируя расщепление мо лекулы воды на водород и кислород (поглощением солнечной энергии).

Гемопротеины (железопорфирины), напротив, катализируют обратную реакцию – образование молекулы воды, связанное с освобождением энер гии.

Гемопротеины К группе гемопротеинов относятся гемоглобин и его производные, миогло бин, хлорофиллсодержащие белки и ферменты (вся цитохромная система, каталаза и пероксидаза). Все они содержат в качестве небелкового компо нента структурно сходные железо- (или магний)порфирины, но различные по составу и структуре белки, обеспечивая тем самым разнообразие их биологических функций. Далее более подробно рассмотрено химическое строение гемоглобина, наиболее важного для жизнедеятельности человека и животных соединения.

Гемоглобин в качестве белкового компонента содержит глобин, а не белкового – гем. Видовые различия гемоглобина обусловлены глобином, в то время как гем одинаков у всех видов гемоглобина.

Основу структуры простетической группы большинства гемосодержа щих белков составляет порфириновое кольцо, являющееся в свою очередь производным тетрапиррольного соединения – порфирина. Последний со стоит из четырех замещенных пирролов:

Гем Протопорфирин IX (1,3,5,8-тетраметил-2,4-дивинил 6,7-Дипропионовокислый порфин) соединенных между собой метиновыми мостиками (—СН=). Незамещен ный порфирин называется порфином. В молекуле гема порфин представлен в виде протопорфирина IX, содержащего четыре метильные группы (—СН3), две винильные группы (—СН=СН2) и два остатка пропионовой кислоты. Протопорфирин, присоединяя железо, превращается в гем *.

Из формулы видно, что железо связано с двумя атомами азота мо лекулы протопорфирина ковалентно и с двумя другими – координацион ными связями, обозначенными пунктирными линиями. В зависимости от химической природы групп, находящихся в боковой цепи, порфирины классифицируют на этио-, мезо-, копро- и протопорфирины. Последние наиболее распространены в природе. Из возможных 15 изомеров про топорфиринов благодаря наличию трех разных заместителей самым рас пространенным оказался протопорфирин IX.

Гем в виде гем-порфирина является простетической группой не только гемоглобина и его производных, но и миоглобина, каталазы, пероксидазы и цитохромов b, с и c1 (см. главу 9);

в то же время в цитохромах а и a3, входящих в состав интегрального комплекса, названного цитохромокси дазой, содержится гем а, называемый также формилпорфирином:

* Структура гема расшифрована в основном благодаря работам М.В. Ненцкого и Г. Фишера.

Гем а (формилпорфирин) Гем а вместо метильной группы содержит формильный остаток (в 8-м положении) и вместо одной винильной группы (во 2-м положении) – изопре ноидную цепь. Железо своими четырьмя связями образует комплекс с порфирином, а оставшиеся 5-я и 6-я координационные связи железа в молекулах гемоглобина и цитохромов связываются с белковыми компо нентами по-разному. В частности, в гемоглобинах (и миоглобине) благо даря 5-й координационной связи железо соединяется с атомом азота имидазольной группы гистидина белковой молекулы. Шестая координа ционная связь железа предназначена для присоединения кислорода (с образованием оксигемоглобина и оксимиоглобина) или других лигандов:

СО, цианидов и др. (рис. 2.1). В цитохромах, напротив, и 5-я, и 6-я координационные связи железа соединены с остатками гистидина и метио нина (в цитохроме с обе винильные группы соединены еще и с остатками цистеина) белковой молекулы. Этим, вероятнее всего, могут быть объясне ны функции железа в гемоглобине, валентность которого не изменяется при присоединении кислорода (в отличие от валентности железа в цитохромах):

в гемоглобине железо остается двухвалентным независимо от присоеди нения или отдачи кислорода.

Структурная организация гемоглобина (и миоглобина) была описана в главе 1. Дж. Кендрью и М. Перутц расшифровали конформацию этих молекул (Нобелевская премия 1962 г.). Дыхательная функция гемоглобина крови подробно рассматривается в курсе физиологии. Здесь следует указать на уникальную роль гемоглобина в траспорте кислорода от легких к тканям и диоксида углерода от тканей к легким. Это элементарное проявление жизни – дыхание, хотя и выглядит простым, основано на взаимодействии многих типов атомов в гигантской молекуле гемоглобина. Подсчитано, что в одном эритроците содержится около 340000000 молекул гемоглобина, каждая из которых состоит примерно из 103 атомов С, Н, О, N, S и 4 атомов железа.

Атом железа расположен в центре гема-пигмента, придающего крови характерный красный цвет. Каждая из 4 молекул гема «обернута» одной полипептидной цепью. В молекуле гемоглобина взрослого человека HbА N (имидазол) О Рис. 2.1. Координационные связи атома железа в молекуле гема. Все 4 связи с атомами азота пиррольных колец расположены в одной плоскости, 5-я и 6-я координационные связи (с атомом азота имидазольного кольца гистидина и с кис лородом соответственно) – по разные стороны перпендикулярно к этой плоскости.

(от англ. adult – взрослый) содержатся четыре полипептидные цепи, которые вместе составляют белковую часть молекулы – глобин. Две из них, на зываемые -цепями, имеют одинаковую первичную структуру и по аминокислотному остатку. Две другие, обозначаемые -цепями, также идентично построены и содержат по 146 аминокислотных остатков. Таким образом, вся молекула белковой части гемоглобина состоит из 574 амино кислот. Во многих положениях - и -цепи содержат разные аминокислот ные последовательности, хотя и имеют почти одинаковые пространствен ные структуры. Получены доказательства, что в структуре гемоглобинов более 20 видов животных 9 аминокислот в последовательности оказались одинаковыми, консервативными (инвариантными), определяющими функ ции гемоглобинов;

некоторые из них находятся вблизи гема, в составе участка связывания с кислородом, другие – в составе неполярной внутрен ней структуры глобулы.

В дополнение к основному гемоглобину HbA1 в крови взрослого человека доказано существование мигрирующего с меньшей скоростью при электрофорезе гемоглобина НbА2, также состоящего из 4 субъединиц: двух -цепей и двух -цепей. На долю НbА2 приходится около 2,5% от всего гемоглобина. Известен, кроме того, фетальный гемоглобин (гемоглобин новорожденных), обозначаемый HbF и состоящий из двух -цепей и двух -цепей. Фетальный гемоглобин отличается от HbA1 не только составом аминокислот, но и физико-химическими свойствами: спектральным пока зателем, электрофоретической подвижностью, устойчивостью к щелочной денатурации и др. Кровь новорожденного содержит до 80% HbF, но к концу 1-го года жизни он почти целиком заменяется на НbА (все же в крови взрослого человека открывается до 1,5% HbF от общего количества гемоглобина). Последовательность аминокислот в - и -цепях гемогло бинов окончательно не расшифрована.

Установление первичной структуры субъединиц молекулы гемоглобина стимулировало исследования по расшифровке структуры так называемых аномальных гемоглобинов. В крови человека в общей сложности открыто около 150 различных типов мутантных гемоглобинов. Появляются мутантные формы гемоглобинов в крови вследствие мутации генов. Обыч но мутации делят на 3 класса в соответствии с топографией измененного участка молекулы. Если замена аминокислоты происходит на поверхности молекулы гемоглобина, то это мутация первого класса;

подобные мутации обычно не сопровождаются развитием тяжелой патологии, и болезнь протекает бессимптомно;

исключение составляет серповидно-клеточная анемия. При замене аминокислоты вблизи гема нарушается связывание кислорода – это мутация второго класса, сопровождающаяся развитием болезни. И наконец, если замена происходит во внутреннем участке молекулы гемоглобина, говорят о третьем классе мутации;

подобные мутации приводят к нарушению пространственной структуры и соответст венно функции гемоглобина.

Аномальные гемоглобины, различающиеся по форме, химическому составу и величине заряда, были выделены при помощи электрофореза и хроматографии. Передающиеся по наследству изменения чаще всего являются результатом мутации единственного триплета, приводящей к за мене одной какой-либо аминокислоты в полипептидных цепях молекулы гемоглобина на другую. В большинстве случаев происходит замена кислой аминокислоты на основную или нейтральную (табл. 2.1). Поскольку это замещение осуществляется в обеих полипептидных цепях одной из пар ( или ), образовавшийся аномальный гемоглобин будет отличаться от нормального величиной заряда и соответственно электрофоретической подвижностью.

Таблица 2.1. Замены аминокислот в аномальных гемоглобинах человека Тип Состав пептидных Нормальный остаток Замена гемоглобина цепей и его положение в цепи А 2 А 2 С 22 Глу 6 в -цепи Лиз 22 Глу 23 в -цепи ?

D 22 Лей 28 в -цепи Глу D Е 22 Глу 26 в -цепи Лиз F 2 G Глу 43 в -цепи Ала GpH 22 Асп 68 в -цепи Лиз Н I Лиз 16 в -цепи Асп M Вал 67 в -цепи Глу О Глу 116 в -цепи Лиз S Глу 6 в -цепи Вал В табл. 2.1 представлены некоторые типы аномальных гемоглобинов, составы их полипептидных цепей с указанием известной или вероятной локализации замены либо в -, либо в -цепях. Замены необычной аминокислотой в аномальных гемоглобинах имеют место как в -, так и в -цепях. Исключение составляет гемоглобин Н, все 4 полипептида которого представлены -цепями, идентичными по структуре -цепям нормального гемоглобина A1.

Следует указать, что некоторые мутации, вызывающие существенное изменение структуры и соответственно функции гемоглобина, оказываются летальными, и индивидуумы с подобным гемоглобином умирают в раннем возрасте. Однако при ряде мутаций замена аминокислот не вызывает заметного изменения функции гемоглобина, в этих случаях болезнь про текает бессимптомно.

Болезни гемоглобинов (их насчитывают более 200) называют гемогло бинозами. Принято делить их на гемоглобинопатии, в основе развития которых лежит наследственное изменение структуры какой-либо цепи Рис. 2.2. Нормальные и серповидные эритроциты.

нормального гемоглобина (часто их относят также к «молекулярным болезням»), и талассемии, обусловленные наследственным нарушением синтеза какой-либо нормальной цепи гемоглобина. Различают также же лезодефицитные анемии.

Классическим примером наследственной гемоглобинопатии является серповидно-клеточная анемия, широко распространенная в странах Южной Америки, Африки и Юго-Восточной Азии. При этой патологии эритроциты в условиях низкого парциального давления кислорода прини мают форму серпа (рис. 2.2). Гемоглобин S, как показали Л. Полинг и др., отличается рядом свойств от нормального гемоглобина: в частности, после отдачи кислорода в тканях он превращается в плохо растворимую дез окси-форму и начинает выпадать в осадок в виде веретенообразных кристаллоидов, названных тактоидами. Последние деформируют клетку и приводят к массивному гемолизу. Болезнь протекает остро, и дети, гомозиготные по мутантному гену, часто умирают в раннем возрасте.

Химический дефект при серповидно-клеточной анемии был раскрыт В. Ингремом и сводится к замене единственной аминокислоты, а именно глутаминовой, в 6-м положении с N-конца на валин в -цепях молекулы гемоглобина HbS (см. табл. 2.1, рис. 2.2). Это результат мутации в молекуле ДНК, кодирующей синтез -цепи гемоглобина. Все остальные аминокис лоты располагаются в той же последовательности и в таком же количестве, как и в нормальном гемоглобине НЬА:

Одной этой замены оказалось достаточно не только для нарушения формы эритроцита, но и для развития тяжелой наследственной болез ни – серповидно-клеточной анемии.

Талассемии, строго говоря, не являются гемоглобинопатиями. Это генетически обусловленное нарушение синтеза одной из нормальных цепей гемоглобина. Если угнетается синтез -цепей, то развивается -талас семия;

при генетическом дефекте синтеза -цепей развивается -талас семия. При -талассемии в крови наряду с HbA1 появляется до 15% НЬА и резко повышается содержание HbF – до 15–60%. Болезнь характеризуется гиперплазией и разрушением костного мозга, поражением печени, селезен ки, деформацией черепа и сопровождается тяжелой гемолитической ане мией. Эритроциты при талассемии приобретают мишеневидную форму.

Механизм изменения формы эритроцитов объяснить пока не удалось.

В медицинской практике часто проводят анализ кровяных пигментов, который основан на исследовании спектроскопических свойств гема гемо глобина, точнее продуктов его окисления (хлорида гемина и гематина, образующихся соответственно при обработке гемоглобина уксусной кисло той в присутствии хлорида натрия или разведенными растворами щелочей).

При восстановлении гематина сульфитом аммония в присутствии глобина образуется производное гемоглобина – гемохромоген, в котором дена турированный глобин соединен с гемом. Полученный комплекс имеет характерный спектр поглощения. Этот метод широко применяется в судеб но-медицинской практике при исследовании кровяных пятен.

Из многообразия производных гемоглобина, представляющих несом ненный интерес для врача, следует прежде всего указать на оксигемоглобин НbО2 – соединение молекулярного кислорода с гемоглобином. Кислород присоединяется к каждому гему молекулы гемоглобина при помощи коор динационных связей железа, причем присоединение одной молекулы кисло рода к тетрамеру облегчает присоединение второй молекулы, затем третьей и т.д. Поэтому кривая насыщения гемоглобина кислородом имеет сиг моидную форму, свидетельствующую о кооперативности связывания кис лорода. Эта кооперативность обеспечивает не только связывание макси мального количества кислорода в легких, но и освобождение кислорода в периферических тканях;

этому способствует также наличие Н+ и СО в тканях с интенсивным + обменом. В свою очередь кислород ускоряет высвобождение СО2 и Н в легочной ткани. Эта аллостерическая за висимость между присоединением Н+, О2 и СО2 получила название эффекта Бора.

Помимо кислорода, гемоглобин легко соединяется с другими газами, в частности с СО, NO и др. Так, при отравлении оксидом углерода гемоглобин прочно с ним связывается с образованием карбоксигемо глобина (НbСО). При этом вследствие высокого сродства к СО гемогло бин теряет способность связывать кислород и наступает смерть от удушья, недостаточного снабжения тканей кислородом. Однако при быстром по вышении парциального давления кислорода во вдыхаемом воздухе можно добиться частичного вытеснения СО из связи с гемоглобином и пре дотвратить летальный исход.

При отравлении оксидами азота, парами нитробензола и другими соединениями часть гемоглобина окисляется в метгемоглобин (НbОН), содержащий трехвалентное железо. Метгемоглобин также теряет способ ность к переносу кислорода от легких к тканям, поэтому при метгемо глобинемии (вследствие отравления окислителями) в зависимости от сте пени отравления может наступить смерть от недостатка кислорода. Если вовремя оказать помощь, т.е. повысить парциальное давление кислорода (вдыхание чистого кислорода), то и в этом случае можно вывести больного из опасного состояния.

Следует отметить, что самым надежным методом качественного опре деления различных производных гемоглобина является исследование их спектров поглощения.

У беспозвоночных роль переносчика кислорода часто выполняют пиг менты негеминовой природы – гемэритрин и гемоцианин. Они не относятся к гемсодержащим хромопротеинам, хотя в их названиях содержится корень «гем». Эти белки, как и гемоглобин, несмотря на то что выполняют одну и ту же функцию, сильно различаются между собой по молекулярной массе и четвертичной структуре, химической природе активного центра, характеру связывания железа (гемэритрин) и меди (гемоцианин) с кислородом и др.

(табл. 2.2).

Таблица 2.2. Некоторые свойства белков-переносчиков кислорода (по Г. Эйхгорну) Свойства Гемоглобин Гемэритрин Гемоцианин Металл Fe Fe Сu Степень окисления металла II II I в дезоксигенированном белке Стехиометрия Fe:O2 2Fe:O2 2Сu:О взаимодействия с кислородом Цвет оксигенированного Красный Розово-фиоле- Синий белка товый Цвет дезоксигенированного Пурпурно- Бесцветный Бесцветный белка красный Способ связи железа или Порфириновое Радикалы ами- Радикалы ами меди с белком кольцо нокислотных нокислотных остатков остатков Молекулярная масса 65000 108000 400000 Число субъединиц 4 8 Много Трансферрины (сидерофилины) – группа сложных белков, полученных из разных источников и характеризующихся способностью специфично, проч но и обратимо связывать ионы железа Fe (III) и других переходных металлов. Наиболее подробно из этой группы белков изучен трансферрин сыворотки крови. Функция трансферрина заключается в транспорте ионов железа в ретикулоциты, в которых осуществляется биосинтез гемоглобина.

Система трансферрин–ретикулоцит считается весьма перспективной для изучения взаимодействия металла с белком и белковой молекулы с клеткой.

Флавопротеины Флавопротеины содержат прочно связанные с белком простетические груп пы, представленные изоаллоксазиновыми производными – окисленными флавинмононуклеотидом (ФМН) и флавинадениндинуклеотидом (ФАД).

Флавопротеины входят в состав оксидоредуктаз – ферментов, катализи рующих окислительно-восстановительные реакции в клетке. Некоторые Флавопротеины содержат ионы металлов. Типичными представителями флавопротеинов, содержащих также негемовое железо, являются ксантин оксидаза, альдегидоксидаза, СДГ, дигидрооротатдегидрогеназа, ацил КоА-дегидрогеназа и транспортирующий электроны флавопротеин. На долю двух последних приходится до 80% митохондриальных флавопро теинов, выполняющих важную роль в биоэнергетике клетки (см. главу 9).

Негемовое железо связывается с белковым компонентом, отличающимся от гемсодержащих хромопротеинов. Железо ковалентно связано с атомом серы остатка цистеина в белке. При кислотном гидролизе такого белка освобождается железо и H2S. Несмотря на структурные отличия от цито хромов, негемовые флавопротеины выполняют аналогичную функцию в транспорте электронов благодаря способности переходить из окисленного в восстановленное состояние.

НУКЛЕОПРОТЕИНЫ Нуклеопротеины состоят из белков и нуклеиновых кислот. Последние рассматриваются как простетические группы. В природе обнаружено 2 типа нуклеопротеинов, отличающихся друг от друга по составу, размерам и физико-химическим свойствам,– дезоксирибонуклеопротеины (ДНП) и рибонуклеопротеины (РНП). Названия нуклеопротеинов отражают только природу углеводного компонента (пентозы), входящего в состав нуклеино вых кислот. У РНП углевод представлен рибозой, у ДНП – дезоксирибозой.

Термин «нуклеопротеины» связан с названием ядра клетки, однако ДНП и РНП содержатся и в других субклеточных структурах. Следовательно, речь идет о химически индивидуальном классе органических веществ, имеющих своеобразные состав, структуру и функции независимо от лока лизации в клетке. Доказано, что ДНП преимущественно локализованы в ядре, а РНП – в цитоплазме. В то же время ДНП открыты в мито хондриях, а в ядрах и ядрышках обнаружены также высокомолекулярные РНП.

Пристальное внимание исследователей привлечено к структуре и функ ции макромолекул, включающих комплексы белков и нуклеиновых кислот.

Этот особый интерес вызван тем, что многообразие проявлений жизни непосредственно связано с этими полимерными молекулами. Биохимики имеют достаточно оснований для утверждения, что природа синтезирован ных в клетках белков зависит в первую очередь от природы ДНП, точнее ДНК, а свойства живых организмов, как и структурная организация субклеточных органелл, клеток и целостного организма, определяются свойствами синтезированных белков.

ДНК хранит наследственную информацию. Подтверждением этого слу жит явление трансформации, наблюдаемое у бактерий и открытое также в культуре клеток человека. Сущность явления заключается в превращении одного генетического типа клеток в другой путем изменения природы ДНК.

Так, удалось получить штамм капсулированных и вирулентных пневмо кокков из исходного штамма, не обладающего этими признаками, путем внесения в среду ДНК, выделенной из капсулированного (и вирулентного) штамма. С нуклеопротеинами и соответственно нуклеиновыми кислотами непосредственно связаны, кроме того, такие биологические процессы, как митоз, мейоз, эмбриональный и злокачественный рост и др.

У большинства клеток эукариот, когда ядро находится в интерфазе, из ДНК и белковых молекул образуются так называемые филаменты – нити, имеющие меняющуюся толщину (в среднем около 10 нм, реже 2 нм).

Оказывается, что толщина филаментов определяется наличием или от сутствием белков, окружающих двухспиральную структуру ДНК, а длина их – молекулярной массой ДНК. Известно, что одна хромосома содержит одну молекулу ДНК, имеющую длину несколько сантиметров. Вообще ДНП входит в состав мононуклеосом, являющихся составной частью а б Рис. 2.3. Модель вируса мозаичной болезни табака, а - спираль РНК;

б - субъединицы белка.

хромосомы. Таким образом, в состав хроматина входят молекула ДНК, пять различных классов белков – гистонов и так называемые негистоновые белки. Количество ДНК в ядре составляет до 6 пг (10–12 г) на одну клетку у животных. У E.coli содержание ДНК равно 0,01 пг.

Относительно белкового состава ДНП известно, что все 5 классов гистонов различаются по размерам, аминокислотному составу и величине заряда (всегда положительный). Так, выделяют гистоны, богатые лизином (H1), молекулярная масса которых составляет в среднем 20000, и богатые аргинином с мол. массой до 15000. Они обозначаются следующими символами:

H1 – богатые лизином, Н2А – богатые аргинином и лизином, Н2В – умеренно богатые аргинином и лизином, Н3 – богатые аргинином, Н4 – богатые глицином и аргинином.

Природа негистоновых белков пока не достаточно выяснена. Негисто новые белки в настоящее время интенсивно изучаются. В их состав входят сложные белки, ферменты, а также регуляторные белки. По своим свойст вам последние отличаются от гистонов и представлены кислыми белками.

В различных нуклеопротеинах количество нуклеиновой кислоты колеблет ся от 40 до 65% (например, в рибосомах про- и эукариот). В вирусных нуклеопротеинах количество нуклеиновых кислот не превышает 2–5% от общей массы. Так, у вируса табачной мозаики (ВТМ) на долю РНК *, прав да, с огромной молекулярной массой – около 2000000, приходится всего около 2%. Остальная часть этой гигантской вирусной частицы приходится на долю однотипных белковых субъединиц (рис. 2.3). Ионная связь между РНК и белковыми молекулами ВТМ весьма непрочная и легко разрывается даже в «мягких» условиях, что позволяет отделить РНК от белка. Интерес но, что после удаления разрывающего ионную связь агента при смешивании этих продуктов происходят полная регенерация исходного ВТМ, восстанов ление всех его физических параметров и биологических свойств, включая способность поражать зеленый лист. Это явление самосборки, впервые открытое у ВТМ, в дальнейшем было обнаружено также у бактериофагов, представленных нуклеопротеинами. Акад. А.С. Спирин и одновременно М. Номура разделили 70S рибосомы (рибонуклеопротеины) на их состав * Растительные вирусы чаще всего содержат РНК, а вирусы, поражающие клетки животных, содержат как РНК (вирус саркомы Рауса и др.), так и ДНК (вирус папилломы).

Бактериофаги также содержат РНК или ДНК в комплексе с белками.

ляющие и разработали условия для самосборки полноценных функциони рующих рибосом. В основе этого удивительного явления самосборки лежит, по-видимому, программа, содержащаяся в первичной структуре как белка, так и нуклеиновой кислоты и определяющая, какое количество белковых молекул и в какой последовательности должно присоединиться к единственной молекуле РНК (в случае ВТМ) или к 3 молекулам РНК (в рибосомах), чтобы обеспечить высокую точность реконструкции надмо лекулярных структур.

В настоящее время и ядерный хроматин (ДНП), и рибосомы, и вирусные нуклеопротеиды обычно рассматривают именно как надмолекулярные комплексы или структуры, а отнесение этих образований в раздел «Слож ные белки» – в значительной степени дань традиции.

ЛИПОПРОТЕИНЫ В последние годы достигнут определенный прогресс в выяснении хими ческой природы и структуры липопротеинов (ЛП). Этот класс сложных белков состоит из белка и простетической группы, представленной каким либо липидом. В частности, в составе липопротеинов открыты нейтральные жиры, свободные жирные кислоты, фосфолипиды, холестериды. Липо протеины широко распространены в природе: в растениях, тканях живот ных и у микроорганизмов – и выполняют разнообразные биологические функции. Они входят в состав клеточной мембраны и внутриклеточных биомембран ядра, митохондрий, микросом (структурированные липопро теины), а также присутствуют в свободном состоянии (главным образом в плазме крови). К липопротеинам относятся, кроме того, тромбопласти ческий белок ткани легких, липовителлин желтка куриного яйца, некоторые фосфолипиды молока и т.д. Установлено, что липопротеины участвуют в структурной, комплексной организации миелиновых оболочек, нервной ткани, хлоропластов, фоторецепторной и электронно-транспортной систем, палочек и колбочек сетчатки и др.

Большинство ЛП синтезируется в печени или в слизистой оболочке кишечника. Они содержат гидрофобное липидное ядро, окруженное поляр ными липидами и оболочкой из белков, получивших название апобелки.

Различают 8 типов апобелков: апо-AI, АII, В, CI, СII, CIII, D и Е. Обычно ЛП содержат до 5% углеводов (глюкоза, галактоза, гексозамины, фукоза, сиаловая кислота), поэтому некоторые из них являются и гликопротеинами.

Липопротеины сыворотки крови подразделяют на отдельные классы в зависимости от электрофоретической подвижности (с белками крови) и от плотности при ультрацентрифугировании. Различают ЛП низкой плот ности (ЛПНП), очень низкой плотности (ЛПОНП), высокой плотности (ЛПВП), очень высокой плотности (ЛПОВП) и ЛП промежуточной плот ности (ЛППП) (табл. 2.3).

Функции и значение отдельных классов ЛП в развитии артерио- и атеро склероза подробно рассматриваются в главе 17.

Механизм связывания белкового компонента с липидами. Имеются дан ные, что в образовании липопротеинов участвуют нековалентные силы различной природы, определяемые наличием или отсутствием у липидного компонента ионизированных групп атомов. Если в образовании липопро теина участвуют фосфолипиды, то между ними и белковой молекулой возникает ионный тип связи (рис. 2.4).

Доказано также существование гидрофобных взаимодействий между неполярными группами липидного компонента (например, радикалы Таблица 2.3. Классификация и основные свойства ЛП сыворотки крови человека Фракция Содержание, Электрофоре- Липидный ком при ультра- Плотность, Процент миллиграм тическая понент (высокое центрифуги- г/см3 белка мов на 100 мл фракция содержание) ровании плазмы Хиломикроны – < 0,96 1–2 10–50 Свободные жирные кислоты Пре--ЛП ЛПОНП 0,96–1,006 7 150–250 То же 2-1ЛП ЛППП 1,006–1,019 11 50–100 Эфиры холесте рина -ЛП ЛПНП 1,019–1,063 21–23 315–385 То же 1–ЛП ЛПВП 1,063–1,200 35–50 270–380 Фосфолипиды ?

1–ЛП ЛПОВП1 > 1,210 65 Свободные жирные кислоты ?

Альбумин ЛПОВП2 > 1,210 97 То же жирных кислот) и белковой молекулы. Чаще в липопротеинах действуют комбинированно разные нековалентные силы, способствуя образованию в высшей степени упорядоченной двойной белково-липидной структуры биомембран.

ФОСФОПРОТЕИНЫ К белкам этого класса относятся казеиноген молока, в котором содержание фосфорной кислоты достигает 1%;

вителлин, вителлинин и фосвитин, выделенные из желтка куриного яйца;

овальбумин, открытый в белке куриного яйца;

ихтулин, содержащийся в икре рыб, и др. Большое коли чество фосфопротеинов содержится в клетках ЦНС. Фосфопротеины зани мают особое положение в биохимии фосфорсодержащих соединений не только в результате своеобразия структурной организации, но и вследствие широкого диапазона функций в метаболизме. Характерной особенностью структуры фосфопротеинов является то, что фосфорная кислота оказы вается связанной сложноэфирной связью с белковой молекулой через -Спираль Фосфолипиды в белке Рис. 2.4. Ионный тип связи между белками и фосфолипидами.

гидроксильные группы -оксиаминокислот, главным образом серина и в меньшей степени треонина. На одну молекулу белка обычно приходится 2–4 остатка фосфата.

Н2О Серин Фосфосерин Новые данные свидетельствуют о том, что в клетках фосфопротеины синтезируются в результате посттрансляционной модификации, подвер гаясь фосфорилированию при участии протеинкиназ. Этот процесс под робно рассматривается в главе 14. Здесь лишь укажем на существенную роль специфической протеинкиназы, катализирующей фосфорилирование ОН-группы тирозина, в биосинтезе онкобелков. Таким образом, уровень фосфопротеинов в клетке зависит в значительной степени от регулирую щего действия ферментов, катализирующих фосфорилирование (протеин киназы) и дефосфорилирование (протеинфосфатазы). Следует отметить, что фосфопротеины содержат органически связанный, лабильный фосфат, аб солютно необходимый для выполнения клеткой ряда биологических функ ций. Кроме того, они являются ценным источником энергетического и пластического материала в процессе эмбриогенеза и дальнейшего постна тального роста и развития организма.

Особо следует отметить, что некоторые ключевые ферменты, регули рующие процессы внутриклеточного обмена веществ, также существуют как в фосфорилированной, так и в дефосфорилированной форме. Этим подчеркивается значение фосфорилирования–дефосфорилирования в про цессах химической модификации макромолекул, участвующих в интеграль ных процессах метаболизма.

ГЛИКОПРОТЕИНЫ Гликопротеины – сложные белки, содержащие, помимо простого белка или пептида, группу гетероолигосахаридов. В настоящее время их принято называть гликоконъюгатами. В состав гликоконъюгата входит угле водный компонент (гликановая фракция), ковалентно связанный с неугле водной частью (агликановая фракция), представленной белком, пептидом, аминокислотой или липидом.

Повышенный интерес к науке об углеводах – гликобиологии – в на стоящее время объясняется открытием существенной роли изменений струк туры гликоконъюгатов в развитии таких болезней, как рак, иммунодефицит человека, ревматоидные артриты, астма и др. Оказалось, что нарушение реакции гликозилирования (см. главу 14) двух главных классов глико конъюгатов (гликопротеинов и ганглиозидов) приводит или к накоплению предшественников этих веществ, или к синтезу «укороченных» сахарных цепей гликоконъюгатов. Более того, установлено, что во взаимодействии между некоторыми вирусами и клетками-мишенями главную роль играют углеводные компоненты. В частности, гликопротеин gp120 вируса иммуно дефицита человека (содержит большой процент углевода) имеет высокое сродство к гликопротеину CD4 Т-лимфоцита. В этом взаимодействии, узнавании, являющемся высокоспецифичным, гликозилированные фрагмен ты, вероятнее всего, играют важную патогенетическую роль. Известно также, что при ревматоидных артритах часто синтезируются аномальные антитела (аномальные иммуноглобулины – все гликопротеины) с необы чайно короткими сахарными цепями, что вызывает стимуляцию иммунной системы против самого организма. Из этих примеров видно, что, помимо гликобиологии, наступило время признания и таких наук, как гликопа тология и гликотерапия.

Помимо гликопротеинов, различают также протеогликаны, состоя щие из белка и гликозаминогликанов (прежнее название мукополиса хариды);

последние состоят из цепей сложных углеводов: аминосахаров, уроновых кислот, серной кислоты и отдельных моносахаридов. Типичными гликозаминогликанами являются гиалуроновая кислота, хондроитинсерная кислота и гепарин, химический состав, структура и функция которых подробно рассматриваются в главе 21.

К типичным гликопротеинам относят большинство белковых гормонов, секретируемые в жидкие среды организма вещества, мембранные сложные белки, все антитела (иммуноглобулины), белки плазмы крови, молока, овальбумин, интерфероны, факторы комплемента, группы крови, рецеп торные белки и др. Из этого далеко не полного перечня гликопротеинов видно, что все они выполняют специфические функции: обеспечивают клеточную адгезию, молекулярное и клеточное узнавание, антигенную активность опухолевых клеток, оказывают защитное и гормональное, а также антивирусное действие.

Химический состав гликопротеинов более или менее установлен, струк тура определена только у ряда из них. К полипептиду присоединяются гетероолигосахаридные цепи, содержащие от 2 до 10, реже 15 мономерных остатков гексоз (галактоза и манноза, реже глюкоза), пентоз (ксилоза, арабиноза) и конечный углевод, чаще всего представленный N-ацетилга лактозамином, L-фукозой или сиаловой кислотой;

в отличие от про теогликанов гликопротеины не содержат уроновых кислот и серной кислоты.

N-ацетилгалактозамин L-фукоза Сиаловая кислота (6-дезоксигалактоза) (N-ацетилнейраминовая кислота) Типы связей между углеводными компонентами и белками определены только у ряда гликопротеинов, аминокислотный состав и структура кото рых известны (иммуноглобулины, гормоны);

они включают О-гликозидные связи (с ОН-группами серина, треонина и оксилизина), N-гликозидные связи (с амидными группами аспарагина, реже глутамина или -NH2-группами лизина и аргинина) и эфирные гликозидные связи со свободными СООН-группами глутаминовой и аспарагиновой кислот.

Синтез гликопротеинов осуществляется в рибосомах эндоплазматиче ского ретикулума (в цистронах), затем присоединяются сахарные цепи (постсинтетическое гликозилирование), и далее белок транспортируется до биомембран клетки и включается в состав мембранных белков или секре тируется.

Углеводные компоненты соединены ковалентно с азотом аспарагина молекулы белка. Однако предварительно олигосахаридная часть соединяет ся с липидным переносчиком – долихолфосфатом (липид, содержащий от 15 до 20 изопреновых остатков) и переносится на полипептидную цепь в эндоплазматическом ретикулуме, при этом транспортер освобождается:

Долихолфосфат (n = 15–30) Синтезированные гликопротеины далее переносятся в аппарат Гольджи, где осуществляются окончательное гликозилирование и сортировка по назначению.

Структура одного из нескольких гетероолигосахаридных остатков в молекуле гликопротеинов, в частности иммуноглобулинов, может быть представлена в виде следующей схемы (использованы сокращения: Глю – глюкоза, NАцГлюА – N-ацетилглюкозамин;

Гал – галактоза;

Ман – манно за;

NАцНейр – N-ацетилнейраминовая кислота):

Рассмотрим известные к настоящему времени данные о синтезе, строе нии (структуре) и свойствах ряда гликопротеинов.

Интерфероны. Интерфероны – это ингибиторы размножения многих ти пов вирусов. Открыто несколько типов интерферонов (, и ), некоторые из них получены методами генетической инженерии. Это сравнительно небольшие сложные белки с мол. массой у разных видов животных и человека от 25000 до 38000–40000). Они образуются в клетке в ответ на внедрение вирусной нуклеиновой кислоты, ограничивая вирусную агрессию (инфекцию). Известно также, что группа видоспецифических -интерфе ронов синтезируется макрофагами, в то время как -интерферон про дуцируется Т-клетками и стимулируется интерлейкином-2 (см. «Лимфо кины»). Показано также, что -интерферон в свою очередь повышает цитотоксическую активность макрофагов, Т-клеток и естественных кле ток-киллеров. Интерфероны наделены антипролиферативной активностью и считаются основными защитными белками не только против вирусной инфекции, но и при опухолевых поражениях.

Следует отметить, однако, что до сих пор не раскрыты молекулярные механизмы, при помощи которых интерфероны тормозят размножение вирусов. Известно только, что интерфероны ингибируют биосинтез всех белков (и хозяйских, и вирусных), вероятнее всего, на уровне процесса трансляции. Возможно, что интерферон индуцирует синтез особого бел ка-ингибитора, который затем связывается с рибосомами и блокирует трансляцию, или интерферон переводит один из активных эукариотических белковых факторов инициации в неактивный фактор путем фосфорилиро вания.

Иммуноглобулины. Иммуноглобулины, или антитела, также относятся к классу гликопротеинов, выполняют защитную функцию, обезвреживая поступающие в организм чужеродные вещества – антигены любой хими ческой природы. Синтезируются иммуноглобулины плазматическими клет ками, образовавшимися из лимфоцитов. Учение об иммунитете оформи лось в самостоятельную науку – иммунологию, изучающую структуру и функции антител вообще и иммуноглобулинов в частности. Мы пред ставим современные сведения о некоторых физико-химических свойствах и структуре иммуноглобулинов человека (табл. 2.4). Различают 5 классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Детально изучены структура и функция IgG.

Таблица 2.4. Свойства иммуноглобулинов человека Свойство IgG IgM IgA IgD IgE Коэффициент седимента- 6,5–7 19 7 8 8, ции, S Молекулярная масса 150000 950000 180000 175000 Углеводный состав, % 2–3 10–12 8–10 12,7 10– Концентрация в крови, 1300 140 210 0, мг% Период полужизни, дни 8–21 5,8 2,8 2– 5, Разные классы иммуноглобулинов сильно различаются не только по молекулярной массе, но и по концентрации в крови;

имеются данные, что различаются они и по биологическим свойствам.

Подробно изучена структура IgG. Он имеет Y-образную форму и тет рамерное строение;

состоит из двух идентичных легких L-цепей (от англ.

light) и двух идентичных тяжелых Н-цепей (от англ. heavy) с мол. массой 23000–24000 и 50000–70000 соответственно. Известно также, что каждая из этих цепей имеет 2 типа доменов – вариабельные (V) участки, состоящие из 108 аминокислотных остатков, и константные (С) участки, состоящие из 110 и 350 аминокислотных остатков соответственно в L- и Н-цепях (рис.

2.5).

Из других гликопротеинов, выполняющих ряд важнейших биологи ческих функций, следует отметить все белки плазмы крови (за исключением альбуминов), трансферрин, церулоплазмин, гонадотропный и фолликуло стимулирующие гормоны, некоторые ферменты, а также гликопротеины в составе слюны (муцин), хрящевой и костной тканей и яичного белка (овомукоид). Углеводные компоненты, помимо информативной функции, Рис. 2.5. Структура IgG человека. Показаны легкие (L) и тяжелые (Н) цепи, дисульфидные связи и вариабельные V (красные) и константные С (светлые) участки.

значительно повышают стабильность молекул, в состав которых они входят, к различного рода химическим, физическим воздействиям и пре дохраняют их от действия протеиназ, определяя тем самым биологическую роль гликопротеинов. Являясь составной частью клеточной мембраны, гликопротеины участвуют, кроме того, в иммунологических реакциях, ионном обмене, процессах межклеточной адгезии и т.д.

МЕТАЛЛОПРОТЕИНЫ К металлопротеинам относятся биополимеры, содержащие, помимо белка, ионы какого-либо одного металла или нескольких металлов (табл. 2.5).

К таким белкам принадлежат, например, белки, содержащие негемовое железо, а также белки, координационно связанные с атомами металлов в составе сложных белков-ферментов.

Типичными представителями первых являются железосодержащие бел ки ферритин, трансферрин и гемосидерин. Ферритин – высокомолекуляр ный водорастворимый белок с мол. массой 400000, в котором содержа ние железа составляет от 17 до 23% (в среднем 20%). Он сосредо точен главным образом в селезенке, печени, костном мозге, выполняя роль депо железа в организме. Железо в ферритине находится в окис ленной форме, в составе неорганического железосодержащего соедине ния (FeO•OH)8•(FeO•O•PO3H2), причем цепи неорганического полимера O=Fe—OH...O=Fe—ОН..., иногда содержащие фосфаты, находятся меж ду пептидными цепями белковой части (называемая апоферритином), а атомы железа координационно связываются с атомами азота пептидных групп.

Трансферрин – растворимый в воде железопротеин (мол. масса 90000), гликопротеин, обнаруживаемый главным образом в сыворотке Таблица 2.5. Металлопротеины Биологическая Металл Тип биомолекулы Лиганд функция Fe2+, Fe3+ Гемоглобин, миоглобин, Гемопорфирины, Транспорт О2, СО2, каталаза, пероксидаза, сера, изоаллокса- транспорт электронов металлофлавопротеины, зин (окислительно-восстано цитохромы, железосер- вительные реакции), ные белки, трансферрин, транспорт и депониро ферритин, нитрогеназа вание железа, восстанов ление N2 в NH Cu+, Cu2+ Цитохромоксидаза, це- Азотистые осно- Окисление, депонирова рулоплазмин и др. вания ние и транспорт меди Co2+ Витамин В12 и его ко- Коррин, бензими- Перенос СН3-группы, ферментные формы дазол, СН3-группа синтез метионина Mn2+ Аргиназа, декарбоксила- Фосфат, имидазол Декарбоксилирование, зы аминокислот, фосфо- перенос фосфатных трансферазы и др. групп Mo2+ Нитрогеназа, нитрат- Не идентифици- Связывание и активиро редуктаза, ксантинокси- рован вание N2—>NH3, окисле даза ние пуринов Zn2+,Mg2+ Карбоангидраза, пепти- Имидазол, НАД Связывание субстратов, Ca2+ дазы, фосфатазы, НАД- разрыв пептидной связи ферменты, инсулин K+, Na+, Фосфоенолпируваткар- Транспорт и осво Mg2+, боксикиназы, АТФазы бождение фосфатных Ca2+ групп крови в составе -глобулинов. Содержание железа в нем составляет 0,13%.

Предполагают, что атом железа соединяется с белком координационными связями с участием гидроксильных групп тирозина. Молекула трансфер рина содержит 2 атома железа;

трансферрин служит физиологическим переносчиком железа в организме.

Гемосидерин в отличие от ферритина и трансферрина является водонерастворимым железосодержащим белковым комплексом, состоя щим, кроме того, на 25% из нуклеотидов и углеводов. Он содержится главным образом в ретикулоэндотелиоцитах печени и селезенки. Биоло гическая роль гемосидерина изучена недостаточно.

Ко второй группе металлопротеинов относится ряд ферментов: фер менты, содержащие связанные с молекулой белка ионы металлов, опре деляющих их функцию,– металлоферменты (в процессе очистки ме таллы остаются связанными с ферментами);

ферменты, активируемые ионами металлов, менее прочно связаны с металлами, но для проявления своей активности нуждаются в добавлении в реакционную среду определен ного металла. Предполагают, что механизмы участия металла в акте катализа в обоих случаях, вероятнее всего, сходны;

ионы металла участ вуют в образовании тройного комплекса: активный центр фермента–ме талл–субстрат (Е—М—S), или М—Е—S, или Е—S—М. Есть доказа тельства, что в активном центре многих ферментов в связывании металла участвует имидазольная группа гистидина.

Глава ХИМИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В наше время трудно назвать область естествознания, которую не ин тересовала бы проблема структуры и функций нуклеиновых кислот. Не смотря на огромный прогресс, достигнутый в последние десятилетия при изучении химического состава и строения нуклеиновых кислот, много проблем предстоит еще решить для выяснения зависимости между струк турой и биологической ролью нуклеиновых кислот. Нет сомнения, что именно на этом пути научного поиска исследования нуклеиновых кислот будут сделаны открытия, имеющие огромное значение для биологии, медицины и всей науки о живом. Эпохальное открытие принципа комп лементарности нуклеиновых кислот позволило проникнуть в тайны не только тонкой структуры этих биополимеров, но и механизмов синтеза и воспроизведения биологических макромолекул. Нуклеиновые кислоты выполняют ряд важных биологических функций, не свойственных другим полимерным веществам. В частности, они обеспечивают хранение и пере дачу наследственной информации и принимают непосредственное участие в механизмах реализации этой информации путем программирования синтеза всех клеточных белков. Структурные компоненты нуклеиновых кислот выполняют, кроме того, функции кофакторов (коэнзим А, уридин дифосфатглюкоза и др.), аллостерических эффекторов, входят в состав коферментов (никотинамидадениндинуклеотид, флавинадениндинуклеотид и др.), принимая тем самым непосредственное участие в обмене веществ, а также в аккумулировании (накоплении), переносе и трасформации энер гии. Они являются предшественниками вторичных посредников (мессенд жеров) – циклических мононуклеотидов (цАМФ и цГМФ), выполняющих важную функцию в передаче внутриклеточных сигналов. Подробно ос новные функции нуклеиновых кислот рассмотрены в главе 14.

Методы выделения нуклеиновых кислот. При изучении химического состава и строения нуклеиновых кислот перед исследователем всегда стоит задача выделения их из биологических объектов. В главе 2 было указано, что нуклеиновые кислоты являются составной частью сложных белков – нуклеопротеинов, содержащихся во всех клетках животных, бактерий, вирусов, растений. Нуклеиновые кислоты обладают сильно выраженными кислыми свойствами (обусловлены остатками ортофосфорной кислоты в их составе) и при физиологических значениях рН несут отрицательный заряд.

Этим объясняется одно из важных свойств нуклеиновых кислот – способ ность к взаимодействию по типу ионной связи с основными белками (гистонами), ионами металлов (преимущественно с Mg2+), а также с по лиаминами (спермин, спермидин) и путресцином. Поэтому для выделения нуклеиновых кислот из комплексов с белками необходимо прежде всего разрушить эти сильные и многочисленные электростатические связи между положительно заряженными молекулами белков и отрицательно заряжен ными молекулами нуклеиновых кислот. Для этого измельченный путем гомогенизации биоматериал обрабатывают крепкими солевыми раство рами (10% раствор хлорида натрия) с последующим осаждением нуклеино вых кислот этанолом. В настоящее время для выделения нуклеиновых кислот в нативном состоянии пользуются более «мягким» фенольным методом, основанным на обработке нейтрального забуференного раствора нуклеопротеинов фенолом. Обычно эту процедуру проводят в присутствии веществ, вызывающих денатурацию белкового компонента, например до децилсульфата (ДСН) или салицилата натрия, затем смесь подвергают центрифугированию. При этом денатурированный белок попадает в фе нольную фазу, а нуклеиновые кислоты остаются в водной среде, из которой их осаждают на холоде добавлением 2–3 объемов этанола. Этим методом удается получить достаточно очищенные препараты нуклеиновых кислот.

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭАЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифуги рование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель электрофорез и др.

После получения нуклеиновых кислот в чистом виде их подвергают гидролизу для изучения химического состава. Для этих целей используют ферментативные методы (экзо- и эндонуклеазы), а также чисто химические методы гидролиза, в частности нагревание нуклеиновых кислот с хлорной кислотой.

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) относятся к сложным высокомолеку лярным соединениям, состоят из небольшого числа индивидуальных хи мических компонентов более простого строения. Так, при полном гидро лизе нуклеиновых кислот (нагревание в присутствии хлорной кислоты) в гидролизате обнаруживают пуриновые и пиримидиновые основания, углеводы (рибоза и дезоксирибоза) и фосфорную кислоту *:

ДНК РНК Н3РO4 Н3РO Дезоксирибоза Рибоза Аденин Аденин Гуанин Гуанин Цитозин Цитозин Тимин Урацил В молекуле ДНК углевод представлен дезоксирибозой, а в молекуле РНК – рибозой, отсюда их названия: дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и ри бонуклеиновая (РНК) кислоты. Кроме того, они содержат фосфорную кислоту, по два пуриновых и по два пиримидиновых основания;

различия только в пиримидиновых основаниях: в ДНК содержится тимин, а в РНК – урацил. В составе ДНК и РНК открыты так называемые минорные * В составе ДНК открыт также кремний в количестве 0,26–0,31%, поэтому предполагают, что он в нуклеиновых кислотах изоформен фосфору и способен включаться в полинуклсотид ную последовательность.

(экзотические) азотистые основания (строение некоторых из них приводится далее).

Углеводы (рибоза и дезоксирибоза) в молекулах ДНК и РНК находятся в -D-рибофуранозной форме:

D-рибоза -D-рибофураноза D-2-дезоксири- -D-2-дезокси боза рибофураноза В составе некоторых фаговых ДНК обнаружена молекула глюкозы, которая соединяется гликозидной связью с 5-оксиметилцитозином.

Основу структуры пуриновых и пиримидиновых оснований составляют два ароматических гетероциклических соединения – пиримидин и пурин *:

Пиримидин Пурин Молекула пурина состоит из двух конденсированных колец: пиримидина и имидазола.

В составе нуклеиновых кислот встречаются три главных пиримидиновых основания: цитозин, урацил и тимин.

Урацил Тимин Цитозин Помимо главных пиримидиновых оснований, в составе нуклеиновых кислот открыты минорные пиримидиновые основания, 5-метил- и 5-окси метилцитозин, дигидроурацил, псевдоурацил, 1-метилурацил, оротовая кислота, 5-карбоксиурацил, 4-тиоурацил и др. Забегая несколько вперед, укажем, что только для тРНК список минорных оснований приближается к 50. На долю минорных оснований приходится до 10% всех нуклеотидов тРНК, что имеет, очевидно, важный физиологический смысл (защита * Для удобства представления структурных формул азотистых оснований и углеводов в дальнейшем в структуре колец опущены атомы С и Н.

молекулы РНК от действия гидролитических ферментов). Структурные формулы ряда минорных пиримидиновых оснований представлены в форме нуклеозидов – соединений с углеводным компонентом:

Рибоза Рибоза Рибоза Рибоза Тиоуридин Псевдоуридин Риботимидин Дигидроуридин (тиопиримидин) Два пуриновых основания, постоянно встречающихся в гидролизатах нуклеиновых кислот, имеют следующее строение:

Аденин Гуанин К минорным нуклеозидам пуринового ряда, обнаруживаемым в составе ДНК и РНК, относятся инозин, N6-метиладенозин, N2-метилгуанозин, ксантин, гипоксантин, 7-метилгуанозин и др.

Рибоза Рибоза Рибоза N6-метиладенозин N2-метилгуанозин Инозин Одним из важных свойств свободных азотистых оснований (содержащих оксигруппы) является возможность их существования в двух таутомерных формах, в частности лактим- и лактамной формах, в зависимости от значения рН среды: при рН 7,0 они представлены в лактамной форме, при снижении величины рН – в лактимной форме. Таутомерные превращения можно представить на примере урацила.

Лактим Лактам Оказалось, что в составе природных нуклеиновых кислот все оксипроиз водные пуринов и пиримидинов находятся в лактамной форме.

О локализации и количественном содержании нуклеиновых кислот в клетках получены определенные данные. Доказано, что количественное содержание ДНК в клетках одного и того же организма отличается удивительным постоянством и исчисляется несколькими пикограммами, однако в клетках разных видов живых организмов имеются существенные количественные различия в содержании ДНК. Хорошо известно также, что ДНК преимущественно сосредоточена в ядре, а в митохондриях и хлоро пластах содержится только небольшой процент клеточной ДНК. О коли честве РНК нет точных данных, поскольку содержание ее в разных клетках в значительной степени определяется интенсивностью синтеза белка. На долю РНК приходится около 5–10% от общей массы клетки. Современная классификация различных типов клеточной РНК основывается на данных топографии, функции и молекулярной массы. Выделяют три главных вида РНК: матричную (информационную) – мРНК, которая составляет 2–3% от всей клеточной РНК;

рибосомную – рРНК, составляющую 80–85% и транс портную – тРНК, которой около 16%. Эти 3 вида различаются нуклеотид ным составом и функциями (табл. 3.1).

Таблица3.1. Свойства РНК у Е.coli (по А. Ленинджеру) Скорость Тип Молекулярная Число нуклеотид- % от общей седиментации, РНК масса ных остатков РНК ед. Сведберга (S) мРНК 6–25 250000–1000000 75–3000 тРНК 4 23000–30000 75–90 рРНК 5 ~ рРНК 16 ~ 550000 рРНК 23 ~ Матричная РНК (мРНК) синтезируется в ядре на матрице ДНК, затем поступает в рибосому, выполняя матричную функцию при синтезе белка (см. главу 14). По предположению акад. А.С. Спирина, часто мРНК при поступлении из ядра в цитоплазму образует со специфическими РНК-свя зывающими белками комплексы – так называемые информосомы, способ ные к обратимой диссоциации. Информосомы рассматриваются как транс портная форма мРНК, способствующая образованию полирибосом в цито плазме. Транспортные РНК (тРНК) имеют небольшую молекулярную массу и содержатся в растворимой фракции цитоплазмы, выполняя функ цию переноса аминокислот к месту белкового синтеза – рибосоме. Рибосом ные РНК (рРНК), как видно из данных табл. 3.1, имеют разную и значи тельно большую молекулярную массу. Они локализуются в двух суб частицах рибосом 50S и 30S у Е.coli и 60S и 40S в клетках животных (табл. 3.2).

Субчастица 60S содержит три разных рРНК (5S, 5,8S и 28S рРНК), в то время как субчастица 40S – одну молекулу 18S рPHK. Детально роль рРНК в белковом синтезе пока не выяснена (см. главы 13, 14).

Таблица 3.2. Состав рибосомных РНК эукариот Размер субчастицы, Молекулярная Размер РНК, Молекулярная ед. Сведберга (S) масса субчастицы ед. Сведберга (S) масса РНК 60 (более 50 белков) 2,7•106 5 5,8 28 1,5• 18 40 (более 30 белков) 1,3• СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Для понимания ряда особенностей структуры ДНК важное значение имели закономерности состава и количественного содержания азотистых осно ваний, установленные впервые Э. Чаргаффом. Оказалось, что азотистые основания ДНК обычно варьируют у разных видов организмов, однако почти не претерпевают изменений у одного и того же вида в процессе развития или в зависимости от изменений окружающей среды либо харак тера питания. Показано также, что ДНК, выделенная из разных тканей одного и того же вида, имеет одинаковый состав азотистых оснований.

Полученные количественные соотношения были названы правилами Чар гаффа. При анализе состава очищенной ДНК, выделенной из разных источников, были сделаны следующие выводы:

1) молярная доля пуринов * равна молярной доле пиримидинов:

А + Г А + Г = Ц + Т или = 1;

Ц + Т 2) количество аденина и цитозина равно количеству гуанина и тимина:

А + Ц А + Ц = Г + Т или = 1;

Г + Т 3) количество аденина равно количеству тимина, а количество гуанина равно количеству цитозина: А = Т и Г = Ц;

соответственно А Г = 1;

= 1;

Т Ц 4) существенным для характеристики вида (таксономическое значение) оказался так называемый коэффициент специфичности, отражающий от ношение Г + Ц А + Т * Здесь и далее пуриновые и пиримидиновые основания обозначены начальными буквами соответствующего названия.

Это отношение часто выражают в молярных процентах (Г + Ц), или процентах ГЦ-пар. Для животных и большинства растений этот коэф фициент ниже 1 (от 0,54 до 0,94), у микроорганизмов он колеблется в значительных пределах (от 0,45 до 2,57).

Данные, полученные А. Н. Белозерским и его учениками, свидетельст вуют о существовании в природе АТ-типа ДНК (у хордовых и беспозво ночных животных, высших растений, ряда бактерий, дрожжевидных орга низмов) и ГЦ-типа ДНК (у недрожжевидных грибов, актиномицетов, ряда бактерий и вирусов).

Известно, что структурными единицами нуклеиновых кислот являются мономерные молекулы – мононуклеотиды. Следовательно, нуклеиновые кислоты представляют собой полинуклеотиды. Это продукты полимериза ции мононуклеотидов, число и последовательность расположения которых в цепях ДНК и РНК определяются в строгом соответствии с программой, заложенной в молекуле матрицы (см. главу 14). Мононуклеотиды легко образуются при гидролизе ДНК и РНК в присутствии нуклеаз, состоят из трех специфических компонентов: азотистого основания, углевода и фос форной кислоты. В этой «триаде» мононуклеотида углевод занимает среднее положение. Соединения азотистого (любого) основания и углевода (рибозы или дезоксирибозы), получившие название нуклеозидов, легко образуются из мононуклеотида при гидролитическом отщеплении фос форной кислоты в присутствии щелочи или при участии специфических ферментов – нуклеотидаз.

Нуклеозиды содержат пуриновое или пиримидиновое основание, соединенное с углеводом N-гликозидной связью. В составе нуклеиновых кислот обнаруживаются только -нуклеозиды. Примером могут служить два мононуклеотида: аденозин-5'-монофосфорная кислота (АМФ) и ци тидин-5'-монофосфорная кислота (ЦМФ):

N-гликозидные связи АМФ ЦМФ R у 2' углерода представлен Н- или ОН-группой в зависимости от типа нуклеиновой кислоты – ДНК или РНК. В образовании N-гликозидной связи в пуриновых нуклеотидах принимают участие N-9 пурина и С-1' пен тозы, а в пиримидиновых нуклеотидах – N-1 пиримидина и С-1' пентозы.

Чтобы отличить углеродные атомы рибозы или дезоксирибозы от уг леродных атомов, входящих в состав пуриновых и пиримидиновых оснований, первые принято обозначать символом «штрих»: например, атомы у 3-го и 5-го углерода обозначают С-3' и С-5' или, чаще, 3' и 5'.

Следует отметить, что среди продуктов ферментативного гидролиза ДНК и РНК обнаруживаются, помимо нуклеозид-5'-монофосфатов, также нуклеозид-3'-монофосфаты. Положение фосфата определяется местом раз рыва фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами, что ука зывает на характер связи нуклеотидов через остаток фосфорной кислоты, соединяющий 3' и 5' углеродные атомы пентозы.

В табл. 3.3 приведены состав и названия (включая тривиальные), а также сокращенные обозначения нуклеозидов и нуклеотидов (для РНК они назы ваются рибонуклеотидами, а для ДНК – дезоксирибонуклеотидами).

Таблица 3.3. Состав нуклеозидов и мононуклеотидов Нуклеозиды Мононуклеотиды Сокращенное Азотистые основания (основание (нуклеозиды + Н3РО4) обозначение + углевод) Аденин Аденозин Аденозинмонофосфат АМФ Пуриновые (адениловая кислота) Гуанин Гуанозин Гуанозинмонофосфат ГМФ (гуаниловая кислота) Урацил Уридин Уридинмонофосфат УМФ (уридиловая кислота) Пиримиди Цитозин Цитидин Цитидинмонофосфат ЦМФ новые (цитидиловая кислота) Тимин Тимидин Тимидинмонофосфат ТМФ (тимидиловая кислота) Мононуклеотиды и их производные, а также динуклеотиды присутст вуют в клетках в свободном виде и играют важную роль в обмене веществ.

В частности, нуклеотидную структуру имеют многие коферменты, включая коферменты оксидоредуктаз. Мононуклеотиды, присоединяя еще один ос таток фосфата, образуют фосфоангидридную связь (наподобие связи, имеющейся в пирофосфате) и превращаются в нуклеозиддифосфаты (соответственно они обозначаются сокращенно АДФ, ГДФ, УДФ, ЦДФ и ТДФ). Последние, присоединяя еще один остаток фосфата, образуют нуклеозидтрифосфаты (соответственно обозначаются АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ и ТТФ).

Следует особо указать, что только свободные нуклеозидтрифосфаты в клетках являются предшественниками ферментативного синтеза ДНК и РНК (см. главу 13). Однако в клетках имеются свободные, также природные нуклеозидтрифосфаты, не принимающие участия в синтезе белка, но выполняющие жизненно важные функции. В частности, одной из важнейших функций нуклеозидтрифосфатов и особенно АТФ является их участие в биоэнергетике всех живых организмов (см. главу 13). Приводим схему образования молекул аденозинди- и аденозинтрифосфатов (неко торые атомы водорода, как и углерода, в пуриновом ядре и в кольце рибозы опущены):

Аденозин-5'-монофосфат (АМФ) Аденозин-5'-дифосфат (АДФ) Аденозин-5'-трифосфат (АТФ) Необходимо указать на существование в организме еще двух типов фосфорных эфиров нуклеотидов, когда фосфат связывает 2 атома кисло рода пентозного остатка в одном и том же нуклеотиде и когда фосфатный мостик объединяет два разных мононуклеотида. Примером первого типа являются циклические нуклеотиды 2',3'- и 3',5'-, т.е. два возможных класса соединений, в которых кислородные атомы у С-2' и С-3' или у С-3' и С-5' участвуют в образовании циклической структуры:

Циклический 2',3'-АМФ Циклический 3',5'-АМФ Первое из этих соединений, 2',3'-АМФ, образуется в качестве промежу точного продукта распада рибонуклеиновых кислот, в то время как цикли ческий 3',5'-АМФ (цАМФ) является естественно встречающимся рибо нуклеотидом (он образуется из АТФ в процессе реакции, катализируемой ферментом аденилатциклазой). цАМФ наделен рядом уникальных функций и высокой биологической активностью в регуляции процессов обмена, выполняя роль медиатора внеклеточных сигналов в клетках животных.

Аналогичной функцией наделены цГМФ, производные УДФ, ЦТФ и нуклеотиды в составе кофакторов и коферментов (см. главу 4).

Примером, когда одна фосфатная группа связывает два разных рибо нуклеотида, является структура гуанозилтимидинфосфата:

Это соединение хотя и не обнаружено в природе, но содержит тип связи, характерный для природных нуклеиновых кислот. Видно, что С-3' рибозы одного нуклеотида соединяется посредством фосфодиэфирной связи с С-5' рибозы второго нуклеотида.

В медицинской практике, в частности в онкологии, нашли широкое применение синтетические аналоги как азотистых оснований, так нуклео зидов и нуклеотидов. Эти аналоги, имеющие небольшие модификации в структуре основания или углевода, встраиваясь в соответствующие клеточные компоненты, оказывают заметный цитотоксический эффект.

К наиболее распространенным лекарственным препаратам – аналогам пу риновых и пиримидиновых оснований (и соответствующим нуклеотидам) относятся 5-фторурацил, 6-тио- и 6-меркаптопурин, 8-азагуанин, 6-азаури дин и 6-азацитидин, а также 5-йодпроизводное дезоксиуридина.

Помимо сокращенных названий и обозначений нуклеозидов и нуклео тидов (см. табл. 3.3), приняты буквенные обозначения нуклеозидов (и нуклеотидов): в частности, для аденозина (и АМФ) это А, для гуанозина (и ГМФ) – Г, для цитидина (и ЦМФ) – Ц, для уридина (и УМФ) – У, для тимидина (и ТМФ) – Т. Пользуясь этими символами, приведенный выше дирибонуклеозидмонофосфат можно обозначить как Г–Т. Заметим, что как по структуре, так и по свойствам Г–Т и Т–Г будут сильно отличаться друг от друга (как и в случае дипептидов).

Первичная структура нуклеиновых кислот Под первичной структурой нуклеиновых кислот понимают порядок, после довательность расположения мононуклеотидов в полинуклеотидной цепи ДНК и РНК. Такая цепь стабилизируется 3',5'-фосфодиэфирными связями.

Поскольку молекулярная масса нуклеиновых кислот колеблется в широких пределах (от 2•104 до 1010–1011), установить первичную структуру всех известных РНК и особенно ДНК весьма сложно. Тем не менее во всех нуклеиновых кислотах (точнее, в одноцепочечной нуклеиновой кислоте) имеется один и тот же тип связи – 3',5'-фосфодиэфирная связь между соседними нуклеотидами. Эту общую основу структуры можно представить следующим образом:

Основание Основание Основание Пентоза Пентоза Пентоза Установлено, что в образовании межнуклеотидной связи участвуют гидроксильные группы в 3'- и 5'-положениях остатков углевода.

К настоящему времени удалось определить первичную структуру почти всех тРНК, ряда молекул 5S рРНК, 16S рРНК E.coli, вирусных РНК, в состав которых входят сотни и тысячи нуклеотидных остатков. Ниже приводится примерная схема последовательности нуклеотидов в молекуле РНК. Все клеточные РНК в основном состоят из одноцепочечной по линуклеотидной цепи:

5'-Г–У–Г–Ц–А–А–...–У–Ц–Г–Ц–Ц–А–3' Полинуклеотидная цепь молекулы РНК имеет на одном конце почти всегда свободный монофосфорный эфир, который принято обозначать как 5'-конец;

на противоположном конце цепи такой фосфат отсутствует, а содержится нуклеотид со свободными 2'- и 3'-гидроксильными группами.

Если подвергнуть щелочному гидролизу молекулу РНК, то в качестве концевого нуклеотида будут обнаружены ЦМФ со свободным фосфатом у 5'-конца и свободный аденозин в виде свободного нуклеозида у 3'-конца полинуклеотидной цепи.

В выяснении первичной структуры РНК решающую роль сыграли методы ступенчатого гидролиза, осуществленного в основном экзонуклеа зами и заключающегося в последовательном отщеплении по одному мононуклеотиду с одного конца молекулы нуклеиновой кислоты. Ниже представлена первичная структура первой РНК, имеющей 77 нуклеотидов, для которой была расшифрована нуклеотидная последовательность в 1965 г. Р. Холли и сотр., а именно аланиновой тРНК:

В этой структуре Р – остаток фосфата, – псевдоУМФ, МеГ – метилгуа нин, ДиНУ – дигидроурацил, ДиМеГ – диметилгуанин, МеИ – метилинозин.

Следует особо указать на две существенные особенности первичной структуры всех тРНК. Первая из них заключается в том, что 5'-концом всегда является гуаниловая (редко цитидиловая) кислота, несущая свобод ный остаток фосфата у С-5'. Вторая особенность – наличие на проти воположном конце молекулы остатков трех мононуклеотидов с одинаковой последовательностью – ЦЦА, причем остаток адениловой кислоты содер жит свободную 3'-ОН-группу *.

Между этими структурами в строго определенной последовательности располагаются все остальные нуклеотидные остатки, среди которых на долю минорных нуклеотидов приходится до 10%. Полинуклеотидная цепь разных типов тРНК содержит около 75 нуклеотидов.

Матричные (информационные) РНК относятся к наиболее гетероген ному классу нуклеиновых кислот, отличающихся по массе (см. табл. 3.1), структуре, размерам, стабильности и функциям. Основной функцией мРНК является перенос информации от ДНК (точнее, от гена) на белоксинте зирующую систему клетки. мРНК выполняет роль матрицы и, следо вательно, определяет первичную структуру синтезируемого белка (подроб нее см. главу 14). мРНК наделены рядом особенностей первичной струк туры;

в частности, на 5'-конце все они содержат определенную после * Другие особенности структуры тРНК рассматриваются в главе 14.

довательность рибонуклеотидов, получившую название шапочки (кэп).

Первым нуклеотидом является 7-метилгуанозинтрифосфат, который при соединяется к 5'-гидроксилу соседнего мононуклеотида, представленного 2'-О-метилпуриновым нуклеотидом. На другом 3'-конце большинства (но не всех) мРНК содержится полиадениловая последовательность (поли-А), насчитывающая от 150 до 200 нуклеотидов.

Роль «кэпирования» и «полиаденилирования» мРНК в белковом синтезе окончательно не выяснена. Предполагают, что кэп необходим для спе цифического узнавания в процессе трансляции, в то время как поли-А отводится роль фактора стабилизации всей молекулы мРНК.

В последние годы расшифрована первичная структура не только низко молекулярных 5S рРНК разных бактерий и 5,8S рРНК клеток животных, но и высокомолекулярных 16S и 18S рРНК, насчитывающих до 1200– нуклеотидных звеньев. Более того, уже выяснены нуклеотидные после довательности 23S рРНК E.coli и 25S рРНК дрожжевой клетки, а также первичные структуры высокомолекулярных (28S) рРНК клеток эукариот, насчитывающих около 4700 нуклеотидов.

В настоящее время проводятся исследования первичных структур различных молекул ДНК. Около 15 лет назад была полностью расшифро вана нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК человека (16569 пар нуклеотидов). Известны полные нуклеотидные последователь ности ДНК ряда вирусов и плазмид. Совсем недавно завершено опреде ление нуклеотидных последовательностей геномов двух прокариотических организмов (Haemophilus influenzae и Mycoplasma genitalum) и появились сообщения о расшифровке генома первого эукариотического организма – дрожжей. Близки к завершению аналогичные исследования генома E.coli и генома нематоды Caenorhabditis elegans. Исследователи активно ра ботают над полной расшифровкой генома человека.

Результаты секвенирования (определение нуклеотидной последователь ности) разных молекул ДНК накапливаются в виде компьютерных банков данных, которые уже доступны для пользователей международных компьютерных сетей (например, «Internet»). Ниже представлены три ва рианта схемы нуклеотидной последовательности ДНК:

А А А Ц Ц Ц Т Т Т В последнее время о первичной структуре ДНК (точнее, отдельных ее фрагментов) судят по ряду косвенных данных, например, по степени сплоченности нуклеотидных звеньев в молекуле ДНК (определение сводит ся в конечном счете к выяснению числа и структуры отдельных фракций нуклеотидов, так называемых изоплитов), также по кинетике реассоциации ДНК (метод позволяет выяснить наличие в молекуле повторяющихся последовательностей нуклеотидов). О первичной структуре ДНК судят, кроме того, по распределению минорных оснований (имеются данные о существовании подобной закономерности) и обнаружению в ДНК и оп ределению последовательности палиндромов («обратно бегущие» после довательности, или перевертыши), которые обнаруживаются главным об разом в местах рестрикции (см. главу 13). Большие надежды в определении первичной структуры ДНК исследователи возлагают на физические, хими ческие (синтез генов), генетические и другие методы, а также на методы выделения некоторых генов (или их фрагментов) из природных источников и синтеза генов на мРНК при участии фермента обратной транскриптазы.

Для установления первичной структуры ДНК недавно предложен экспресс метод, включающий применение двух ДНК-полимераз (из E.coli и из бактериофага Т4). Однако во всех этих случаях определяется структура небольшого участка ДНК, поэтому полная расшифровка первичной струк туры ДНК генома человека ждет своего решения.

Вторичная структура нуклеиновых кислот В соответствии с моделью Дж. Уотсона и Ф. Крика, предложенной в 1953 г.

на основании ряда аналитических данных, а также рентгеноструктурного анализа молекула ДНК состоит из двух цепей, образуя правовращающую спираль, в которую обе полинуклеотидные цепи закручены вокруг одной и той же оси. Удерживаются цепи благодаря водородным связям, обра зующимся между их азотистыми основаниями (рис. 3.1). Обе цепи поли нуклеотидов в биспиральной молекуле ДНК имеют строго определенное пространственное расположение, при котором азотистые основания нахо дятся внутри, а фосфорильные и углеводные компоненты – снаружи *.

Детальный анализ всевозможных вариантов образования водородных связей между основаниями показал, что в биспиральной молекуле ДНК основания уложены парами: пурин из одной цепи и пиримидин из другой в соответствии с правилами Чаргаффа. Поскольку ориентация оснований на плоскости не является, очевидно, произвольной, и основания в поли нуклеотидах представлены в лактамной форме, наиболее вероятными были признаны пары аденин–тимин и гуанин–цитозин. Этот способ спаривания получил в дальнейшем экспериментальное подтверждение. Избиратель ность взаимодействия пар А–Т и Г–Ц принято выражать термином «комплементарность», а соответствующие азотистые основания на зывают комплементарными. Стабильность А–Т оснований обеспе чивается двумя водородными связями, а пар Г–Ц – тремя, что в свою очередь определяется особенностями расположения функциональных групп азотистых оснований. Длина водородных связей между основаниями со ставляет около 0,3 нм. Таким образом, комплементарными оказываются не только отдельные основания, но и дезоксирибонуклеотидные цепи ДНК * За это открытие Дж. Уотсон и Ф. Крик вместе с М. Уилкинсом получили Нобелевскую премию в 1962 г.

3,4 нм 1,4 нм 2,8 нм 3,4 нм 1,3 нм 90° 70° 1,7 нм 1,8 нм 1,8 нм а в б Рис. 3.1. Схематическое изображение двойной спирали ДНК.

а - по Уотсону и Крику: с - остаток дезоксирибозы, р - остаток фосфорной кислоты;

б - А-фор ма ДНК;

в - В-форма ДНК.

в целом, способствующие образованию весьма компактной структуры и стабилизации всей молекулы *.

Обе цепи в молекуле ДНК имеют противоположную полярность. Это означает, что межнуклеотидная связь в одной цепи имеет направление 5'–>3', а в другой – 3'–>5'. Подобная направленность цепей имеет важное биологическое значение при репликации и транскрипции молекулы ДНК.

0,28 нм 0,30 нм Тимин Аденин Антипараллельные цепи 0,29 нм 0,30 нм 0,29 нм Цитозин Гуанин * Данные, полученные в последние годы, свидетельствуют, что в стабилизации биспи ральной структуры основную роль играют гидрофобные взаимодействия между компле ментарными основаниями, стыкующимися в центре двойной спирали. Водородные связи, вероятнее всего, обеспечивают специфичность спаривания оснований.

На модели ДНК (см. рис. 3.1) видно, что расстояние между витками (шаг спирали) равно 3,4 нм. На этом участке укладываются 10 нуклеотид ных остатков, размер одного нуклеотида составляет 0,34 нм;

диаметр биспиральной молекулы равен 1,8 нм.

Необходимо указать, что конфигурация двойной спирали ДНК сильно меняется в зависимости от количественного содержания воды и ионной силы окружающей среды. Методами рентгеноструктурного анализа дока зано существование по крайней мере 6 форм ДНК, названных А-, В-, С-, D-, Е- и Z-формами. Конфигурация двух из них в простейшей форме представ лена на рис. 3.1, б и в. Можно увидеть, что у А-формы наблюдается некоторое смещение пар оснований от оси молекулы к периферии, что отражается на размерах (2,8 нм – длина одного витка, в котором вместо содержится 11 мононуклеотидов;

меняется расстояние между нуклеотидами и др.). Если А- и В-формы представляют собой правозакрученную двойную спираль, то Z-форма (зигзагообразная) ДНК имеет левозакрученную кон фигурацию, в которой фосфодиэфирный остов располагается зигзагообраз но вдоль оси молекулы. Параллельно фосфодиэфирному остову в структуре А- и В-форм ДНК имеются большая и малая бороздки (желобки) – сайты, где присоединяются белки, выполняющие, очевидно, регуляторные функции при экспрессии генов. В настоящее время есть основание считать, что между А- и В-формами ДНК осуществляются взаимные переходы при изменении концентрации соли и степени гидратации. В-форма ДНК больше всего подходит к модели Уотсона и Крика. В этих переходах, которые могут быть вызваны растворителями или белками, очевидно, заключен определенный биологический смысл. Предполагают, что в А-форме ДНК выполняет роль матрицы в процессе транскрипции (синтез РНК на моле куле ДНК), а в В-форме – роль матрицы в процессе репликации (синтез ДНК на молекуле ДНК).

В структуре ДНК, как и в структуре РНК, открыты нуклеотидные последовательности, получившие название «палиндромы», или перевер нутые повторы. Они встречаются как внутри одной цепи, так и в двойной спирали. Например, как слово ротатор, которое одинаково читается как справа налево, так и обратно. Подобные обратные повторы могут служить основой для образования структуры шпилек или других вариаций с изме ненным внутрицепочечным и межцепочечным спариванием и формирова нием на отдельных участках тройной спирали. Возможно, эти палинд ромные структуры имеют определенный биологический смысл в регуляции экспрессии отдельных генов, выполняя роль сайтов для ДНК-связывающих белков. Предстоит, однако, приложить немало усилий для установления как точной структуры этих вариаций, так и для определения их функциональной роли.

Менее охарактеризована вторичная структура матричных и рибосомных РНК. Относительно вторичной структуры тРНК наиболее вероятной пред ставляется модель, предложенная Р. Холли, плоское изображение которой напоминает клеверный лист (см. рис. 14.3). В настоящее время, когда известна первичная структура большинства тРНК, последовательность всех или почти всех природных тРНК как будто бы укладывается в эту схему «клеверного листа» (см. главу 14). При сравнении этих структур выявляется ряд закономерностей, несомненно, имеющих определенный биологический смысл. Во всех тРНК есть участки, взаимодействующие с рибосомами, места для связывания с аминокислотами и ферментами, а также специфи ческая последовательность трех нуклеотидов (триплет), называемая анти кодоном, которая оказывается комплементарной тринуклеотидной после довательности мРНК (кодону), кодирующей включение в белковую моле кулу определенной аминокислоты.

Независимо от типа РНК синтезированный в клетке продукт транскрип ции (см. главу 13) всегда представлен единственной цепью, упакованной во вторичную структуру не случайно, а в соответствии с программой ДНК.

Поскольку в составе РНК имеются свободные 2'-оксигруппы рибозы, не связанные со стандартным крик-уотсоновским спариванием азотистых оснований, появляются дополнительные возможности образования вто ричной и третичной структур, содержащих выпуклости, шпильки, или крестообразные структуры. Особенности структуры тРНК имеют прямое отношение к процессу трансляции, поэтому более подробно они рассмот рены в разделе биосинтеза белка (глава 14).

Третичная структура нуклеиновых кислот Выделить нативную молекулу ДНК (рис. 3.2) из большинства источников, в частности хромосом, чрезвычайно трудно из-за высокой чувствительности молекулы ДНК к нуклеазам тканей и гидродинамической деструкции *.

Удалось выделить в интактном (неповрежденном) виде только неко торые ДНК вирусов, митохондрий и хлоропластов. Исследования этих молекул при помощи физических (в частности, кристаллографических) и физико-химических методов показали, что двойная спираль ДНК на некоторых участках может подвергаться дальнейшей спирализации с об разованием суперспирали или открытой кольцевой формы. Оказалось также, что линейная ДНК может образоваться из кольцевой формы или существовать как таковая в природе. В некоторых вирусах обнаружены, кроме того, одноцепочечные ДНК линейной и кольцевой форм (рис. 3.3).

Образование кольцевой формы молекулы ДНК у бактерий или в ми тохондриях клеток животных часто вызвано ковалентным соединением их открытых концов. Известно, что суперспиральная (суперскрученная) струк тура обеспечивает экономную упаковку огромной молекулы ДНК в хро мосоме: вместо 8 см длины, которую она могла бы иметь в вытянутой форме, в хромосоме человека молекула ДНК настолько плотно упакована, что ее длина составляет 5 нм. Обычно в ДНК встречаются положительные и отрицательные супервитки, образованные за счет скручивания по часовой (правосторонней) или против часовой стрелки двойной спирали. Образо вание подобных супервитков катализируется специфическими ферментами, получившими название топоизомераз. Подобные суперспирали соединяют ся с белками (гистонами), упакованными в бороздках, обеспечивая тем самым стабильность третичной структуры ДНК. Степень суперспираль ности (наличие супервитков) молекулы ДНК обычно устанавливают по изменению константы седиментации в определенных условиях. Суперспи рализация ДНК может быть нарушена разрывом в одной из цепей или в обеих цепях двойной спирали под действием ДНКазы или при обработке интеркалирующими соединениями. Под интеркаляцией подразумевают встраивание плоских ароматических колец между стопками пар азотистых оснований ДНК. Интеркаляция может быть вызвана антибиотиками и кра * Разработан щадящий метод выделения нативной молекулы ДНК с использованием протеиназы К и ДСН. Выделенный из клеток почек обезьяны препарат ДНК имел необычно высокую мол. массу – 2•108, однако даже в этом случае молекулярная масса на несколько порядков меньше, чем мол. масса ДНК in vivo, исчисляемая 1010–1011.

Рис. 3.3. Третичная структура ДНК (схема).

1 - линейная одноцепочечная ДНК - бак териофаг Х174 и другие вирусы;

2 - коль цевая одноцепочечная ДНК вирусов и митохондрий;

3 - кольцевая двойная спи раль ДНК.

в а б Рис. 3.4. Третичная структура РНК в растворе в зависимости от ионной силы, температуры и рН среды (схе ма) (по А.С. Спирину и Л.П. Гаври ловой).

а - компактная палочка, б - компактный Рис. 3.2. Модель молекулы ДНК.

клубок;

в - развернутая цепь.

сителями;

в интактных клетках она может быть обусловлена аромати ческими кольцами амнокислот, что имеет, очевидно, определенный биоло гический смысл в проблеме белково-нуклеинового узнавания.

Данные о структуре тРНК свидетельствуют о том, что нативные молекулы тРНК имеют примерно одинаковую третичную структуру, ко торая отличается от плоской структуры «клеверного листа» большой компактностью за счет складывания различных частей молекулы. Следует указать на существование у ряда вирусов (реовирус, вирус раневых опу холей растений и др.) природных двухцепочечных РНК, обладающих однотипной с ДНК структурой. При физиологических значениях рН среды, ионной силы и температуры создаются условия для образования в одно цепочечных матричных и рибосомных РНК множества участков с двойной спиралью («шпильки») и дальнейшего формирования комплементарных участков, определяющих в известной степени жесткость их третичной структуры (рис. 3.4). В настоящее время получены доказательства зна чимости ван-дер-ваальсовых (диполь-дипольных и лондоновских) связей между азотистыми основаниями в стабилизации общей пространственной конфигурации нуклеиновых кислот.

Глава ФЕРМЕНТЫ Современная биология говорит на языке энзимологии.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 14 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.