WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 14 |

«Учебная литература для студентов медицинских вузов Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин Биологическая химия Издание третье, переработанное и дополненное Рекомендован Управлением научных и образовательных ...»

-- [ Страница 10 ] --

Рестриктазы – ферменты ДНКазного типа действия – катализируют распад чужеродной (в основном фаговой) ДНК в строго определенных участках молекулы, имеющих структуру палиндромов. Из E. coli выделены и охарактеризованы две такие рестриктазы, обозначаемые EcoRI и EcoRII соответственно. Рестриктазы оказывают строго специфическое действие, поэтому они используются для расшифровки последовательности нуклео тидных остатков в ДНК фагов и вирусов. Кроме того, это уникальное свойство рестриктаз находит все большее практическое применение в генетической инженерии при «вырезании» определенных фрагментов ДНК и «встраивании» их в геном бактериальной ДНК (получение рекомби нантных ДНК). В результате клетке передается ряд не свойственных ей прежде наследственных признаков. Теоретическое и главным образом практическое значение подобных исследований трудно переоценить. Сви детельством огромного интереса к проблемам генетической инженерии является создание и успешное выполнение в институтах Российской АН и лабораторий ряда стран совместной комплексной программы – проекта «Рестриктазы».

Многие сотни рестриктаз выделены в очищенном состоянии и уже являются коммерческими препаратами.

Из ферментов, катализирующих гидролитический распад РНК, наиболее изучены рибонуклеазы I. Они гидролизуют фосфодиэфирные связи внутри молекулы РНК. Выделенная из поджелудочной железы многих животных РНКаза состоит из 124 аминокислотных остатков во всех случаях, хотя ферменты несколько различаются последовательностью аминокислотных остатков;

выяснена также третичная структура ряда РНКаз (см. главу 4).

Получен в гомогенном состоянии из плесневого гриба рода Aspergillus фермент гуанилрибонуклеаза, катализирующая эндонуклеолитическое рас щепление РНК.

Из ферментов, осуществляющих распад ДНК и РНК не по гидро литическому пути, следует назвать полинуклеотид-фосфорилазу и группу ДНК-гликозидаз. В настоящее время подробно изучены физико-химические свойства и биологическая роль микробной полинуклеотид-фосфорилазы в лаборатории С.С. Дебова;

в той же лаборатории фермент открыт в животных тканях.

Механизм действия фермента сводится к переносу нуклеотидных ос татков с РНК на неорганический фосфат, при этом образуется рибо нуклеотиддифосфат (РДФ):

РНК + Н РО —> (РНK) + РДФ 3 4 n– Предполагают, что in vivo фермент катализирует распад клеточных РНК, преимущественно мРНК, до нуклеозиддифосфатов, участвуя тем самым в регуляции концентрации клеточного неорганического фосфата.

Следует указать еще на одну не менее важную уникальную функцию полинуклеотид-фосфорилазы – способность фермента катализировать в опытах in vitro синтез из свободных нуклеозиддифосфатов (НДФ) поли рибонуклеотидов с заданной последовательностью. Этот фермент сыграл выдающуюся роль в расшифровке кода белкового синтеза в лабораториях лауреатов Нобелевской премии С. Очоа и М. Ниренберга (см. главу 15).

Открыта группа ДНК-гликозидаз, участвующих в реакциях отщепления модифицированных пуриновых и пиримидиновых оснований (например, урацила, образующегося при дезаминировании остатка цитозина в одной из цепей ДНК).

Таким образом, ДНК-гликозидазы выполняют важную функцию в процессах репарации (восстановление структуры) молекулы ДНК.

В результате последовательного действия разнообразных клеточных экзо- и эндонуклеаз нуклеиновые кислоты подвергаются распаду до стадии рибо- и дезоксирибонуклеозид-3'- и 5'-фосфатов. Дальнейший распад об разовавшихся продуктов связан с ферментативными превращениями моно нуклеотидов *, нуклеозидов и далее свободных азотистых оснований. На I этапе гидролиза действуют 3'- и 5'-нуклеотидазы, катализирующие гидро литический распад мононуклеотидов до свободных нуклеозидов с от щеплением неорганического фосфата соответственно от С-3' или С-5' атомов углеводного остатка. На II этапе происходит перенос остатка рибозы от нуклеозида на свободную фосфорную кислоту с образованием рибозо-1-фосфата и свободного азотистого основания.

Распад пуриновых нуклеозидов Образовавшиеся при гидролизе пуриновые нуклеозиды – аденозин и гуано зин – подвергаются ферментативному распаду в организме животных вплоть до образования конечного продукта – мочевой кислоты, которая выводится с мочой из организма. У человека, приматов, большинства животных, птиц и некоторых рептилий мочевая кислота является конечным продуктом пуринового обмена. У других рептилий и некоторых млеко питающих мочевая кислота расщепляется до аллантоина и у рыб – до аллантоиновой кислоты и мочевины. Последовательность всех этих пре вращений, катализируемых специфическими ферментами, можно предста вить в виде следующей схемы:

* АМФ может подвергаться в животных тканях обратимому дезаминированию в инозиновую кислоту.

рибоза рибоза Аденозин Гуанозин Н2O H3PO Аденозин Нуклеозидфос форилаза NH3 дезаминаза Рибозо рибоза Инозин Гуанин Н2О H3PO4 Нуклеозидфос Гуаниндез аминаза форилаза NH3.

Рибозо Н2О Н2О O Ксантиноксидаза Гипоксантин Ксантин H2O + O Ксантин Н2O2 оксидаза H2O СО2 O Аллан Уриказа тоиназа Аллантоиновая Аллантоин кислота Мочевая кислота 2Н2O Аллантоиказа Глиоксиловая Мочевина кислота Распад пиримидиновых нуклеозидов Последовательность ферментативных реакций гидролиза пиримидиновых нуклеозидов можно представить в виде схемы:

NH Н2O Цитидиндезаминаза Дезоксирибоза Рибоза Рибоза Тимидин Уридин Цитидин Н3РO Н2O Н3РO4 Н2O Уридиннук- Уридиннук Тимидинфос форилаза Уридинфосфорилаза леозидаза леозидаза 2'-Дезокси 2'-Дезок рибозо- Рибозо Рибоза сирибоза Тимин Урацил Н+ + НАДФН НАДФН + Н+ Дигидроурацилде гидрогеназа НАДФ+ НАДФ+ Дигидроурацил Дигидротимин Н2O Дигидропиримидиназа Н2O N-карбамоилпропионовая N-карбамоилизомасляная кислота кислота H2O Н2O NH3 СO СO2 NH Мочевина -Аланин -Аминоизомасляная кислота Начальные этапы реакции распада пиримидиновых нуклеотидов ка тализируются специфическими ферментами. Конечными продуктами реак ции являются СО2, NH3, мочевина, -аланин и -аминоизомасляная кис лота. Следует указать, что гидролитический путь распада пиримидинов является, очевидно, главным путем образования -аланина, который может служить источником для синтеза ансерина и карнозина (см. главу 20), а также для образования КоА. Известно, что -аланин в животных тканях подвергается дальнейшему распаду. В тканях животных открыта специ фическая аминотрансфераза, катализирующая трансаминирование между -аланином и пировиноградной кислотой. В процессе этой обратимой реакции синтезируются -аланин и формилацетат (полуальдегид малоновой кислоты):

ПВК -Аланин Формилацетат -Аланин Образовавшийся формилацетат далее подвергается окислительному декарбоксилированию с образованием углекислоты и ацетил-КоА.

ОБМЕН ХРОМОПРОТЕИНОВ Проблемы синтеза и распада хромопротеинов привлекают внимание как исследователей, так и практических врачей по двум основным причинам.

Во-первых, вследствие широкого разнообразия биологически важных функций гемоглобина, хлорофилла и цитохромов, в молекулах которых центральную роль играет ядро порфирина, обладающее способностью координационно связываться с ионами металлов (см. главу 2). Во-вторых, изменения синтеза или распада порфиринов и соответственно их комплек сов с белками приводят к нарушению жизненно важных функций и раз витию болезней у человека и животных.

В данном разделе будут рассмотрены современные представления о синтезе и распаде железопорфиринов, в частности гемоглобина – наиболее изученного хромопротеина.

В организме человека содержится около 4,5–5,0 г железа. На долю гемоглобина крови из этого количества (если принять за 100% все железо в организме) приходится 60–70%, миоглобина – 3–5%, ферритина – 20% (от 17 до 23%), трансферрина – около 0,18%, функционального железа тканей – до 5%. Содержание железа в организме регулируется главным образом интенсивностью всасывания в кишечнике поступающего с пищей железа.

Избыток его не всасывается. Потребность в железе резко возрастает при анемиях различного происхождения. Железо всасывается в кишечнике в виде неорганического двухвалентного иона Fe2+ после освобождения его из комплексов с белками. В клетках слизистой оболочки кишечника железо уже в трехвалентной форме Fe3+ соединяется с белком апоферритином с образованием стабильного комплекса ферритина. Дальнейший транспорт железа к местам кроветворения осуществляется в комплексе с 1-глобу линами сыворотки крови (комплекс получил название трансферрина) или железо соединяется с апоферритином тканей, где и депонируется в виде ферритина. При некоторых заболеваниях (например, при гемо хроматозе) избыток железа откладывается в клетках системы макро фагов в виде гемосидерина – метаболически инертного соединения желе за с белком.

Источниками железа для синтетических целей являются пищевые про дукты, а также железо, освобождающееся при постоянном распаде эритро цитов в клетках печени и селезенки (около 25 мг в сутки). Простетические группы пищевых хромопротеинов (гемоглобин, миоглобин), включая хло рофиллпротеины, не используются для синтеза железопротеинов орга низма, поскольку после переваривания небелковый компонент гем под вергается окислению в гематин, который, как и хлорофилл, не всасывается в кишечнике. Обычно эти пигменты выделяются с содержимым толстой кишки в неизмененной форме или в виде продуктов распада под действием ферментов кишечных бактерий. Следовательно, гемсодержащие соединения пищи не используются в качестве источника порфиринового ядра, а синтез сложного пиррольного комплекса в организме протекает из низкомоле кулярных предшественников de novo.

Биосинтез гемоглобина Учитывая, что белковая часть молекулы гемоглобина (глобин) синте зируется, как и все остальные белки, далее подробно рассмотрен биосинтез его простетической группы, т.е. синтез тетрапиррольного соединения – гема (см. главу 2).

К настоящему времени почти полностью выяснены основные пути образования порфиринов и протопорфиринов, являющихся непосредствен ными предшественниками гема и хлорофилла. Благодаря исследованиям Д. Шемина и др. выяснены основные пути синтеза гема. С помощью меченых предшественников было показано, что в синтезе гема в бес клеточных экстрактах эритроцитов птиц специфическое участие принимают глицин, уксусная и янтарная кислоты. Источником всех 4 атомов азота и 8 атомов углерода тетрапиррольного кольца оказался глицин, а ис точником остальных 26 из 34 атомов углерода – янтарная кислота (сук цинат), точнее ее производное сукцинил-КоА. Последовательность хими ческих реакций синтеза тетрапирролов в организме животных можно условно разделить на несколько стадий.

На I стадии, протекающей в 2 этапа, сукцинил-КоА взаимодействует с глицином и образованием -аминолевулиновой кислоты (-АЛК).

HS-KoA CO -Аминолевулинатсинтаза Глицин Сукцинил-КоА -АЛК Эту стадию катализирует специфический пиридоксальфосфатзависимый фермент -аминолевулинатсинтаза – ключевой, аллостерический фермент синтеза тетрапирролов.

Впервые эта синтаза была обнаружена в эндоплазматической сети клеток печени. Фермент индуцируется стероидами и другими факторами и ингибируется по типу обратной связи конечным продуктом биосинтеза – гемом.

На II стадии происходит конденсация 2 молекул -аминолевулиновой кислоты с образованием первого монопиррольного соединения – порфо билиногена (ПБГ).

2Н O Порфобилиногенсинтаза Порфобилиноген -АЛК -АЛК Фермент, катализирующий эту стадию,– порфобилиногенсинтаза также является регуляторным ферментом, подвергаясь ингибированию конеч ными продуктами синтеза. Предполагают, что механизм этой сложной реакции дегидратации включает образование кетиминной связи (шиффово основание) между кетогруппой одной молекулы -аминолевулиновой кислоты и -аминогруппой лизина молекулы фермента. В следующей многоступенчатой стадии, катализируемой соответствующими фермента ми, из 4 монопиррольных молекул порфобилиногена синтезируется тетра пиррольный комплекс протопорфирин IX, являющийся непосредственным предшественником гема. Некоторые этапы сложного пути синтеза окон чательно не установлены.

В заключительной стадии протопорфирин IX присоединяет молеку лу железа при участии феррохелатазы (гемсинтазы), и образуется гем.

Последний используется для биосинтеза всех гемсодержащих хромопро теинов.

Источником железа для этой реакции является ферритин, который считается резервным гемопротеином, откладывающимся в клетках кост ного мозга, печени и селезенки.

Имеются указания, что, помимо железа, в синтезе гема участвуют некоторые кофакторы, в частности витамин В12, ионы меди, хотя конкрет ная их роль не раскрыта.

Таким образом, весь путь синтеза гема может быть представлен в виде схемы, в которой даны полные и сокращенные обозначения промежуточных метаболитов и ферментов.

Глицин + Сукцинил~S-KoA -Аминолевулинат синтаза СO, KoA-SH 2 -Аминолевулиновая кислота (-АЛК) Порфобилиноген 2Н O синтаза 4 Порфобилиноген (ПБГ) УПГ-синтаза 4NH Уропорфириноген I УПГ-косинтаза Уропорфириноген III (УПГ) УПГ-декарбоксилаза 4СO Копропорфириноген III (КПГ) КПГ-декарбоксилаза 2СO КПГ-оксидаза 4Н Протопорфириноген IХ (ППГ) 6Н Протопорфирин IX 2+ Fe Феррохелатаза ГЕМ Распад гемоглобина в тканях (образование желчных пигментов) Продолжительность жизни эритроцитов составляет 120 дней, затем они разрушаются и освобождается гемоглобин. Главными органами, в которых происходят разрушение эритроцитов и распад гемоглобина, являются печень, селезенка и костный мозг, хотя в принципе оба процесса могут происходить и в клетках других органов. Распад гемоглобина в печени начинается с разрыва -метиновой связи между I и II кольцами пор фиринового кольца. Этот процесс катализируется НАДФ-содержащей ок сидазой и приводит к образованию зеленого пигмента вердоглобина (хо леглобина):

Гемоксигеназа (дециклизующая) Гем (в составе вердоглобина) Гем (в составе гемоглобина) В приведенных структурных формулах здесь и далее в желчных пиг ментах М – метильная СН3-группа, В – (—СН=СН2) – винильная группа и П – (—СН2—СН2—СООН) – остаток пропионовой кислоты.

Как видно из приведенных формул, в молекуле вердоглобина еще сохраняются атом железа и белковый компонент. Имеются эксперимен тальные доказательства, что в этом окислительном превращении гемо глобина принимают участие витамин С, ионы Fe2+ и другие кофакторы.

Дальнейший распад вердоглобина, вероятнее всего, происходит спонтанно с освобождением железа, белка-глобина и образованием одного из желчных пигментов – биливердина. Спонтанный распад сопровождается перераспре делением двойных связей и атомов водорода в пиррольных кольцах и метиновых мостиках. Образовавшийся биливердин ферментативным путем восстанавливается в печени в билирубин, являющийся основным желчным пигментом у человека и плотоядных животных:

Биливердин НАДФН + Н+ Биливердинредуктаза НАДФ+ Билирубин Основное место образования билирубина – печень, селезенка и, по видимому, эритроциты (при распаде их иногда разрывается одна из метиновых связей в протопорфирине). Образовавшийся во всех этих клет ках билирубин поступает в печень, откуда вместе с желчью попадает в желчный пузырь (см. главу 16). Билирубин, образовавшийся в клетках системы макрофагов, называется свободным, или непрямым, билирубином, поскольку вследствие плохой растворимости в воде он легко адсорбируется на белках плазмы крови и для его определения в крови необходимо предварительное осаждение белков спиртом. После этого билирубин всту пает во взаимодействие с диазореактивом Эрлиха.

В крови взрослого здорового человека содержится относительно по стоянное количество общего билирубина – от 4 до 26 мкмоль/л, в среднем 15 мкмоль/л. Около 75% этого количества приходится на долю непрямого билирубина. Повышение его концентрации в крови до 35 мкмоль/л при водит к желтухе. Более высокий уровень билирубина в крови вызывает явления тяжелого отравления. Непрямой билирубин, поступая с током крови в печень, подвергается обезвреживанию путем связывания с глюку роновой кислотой. В этом процессе принимают участие особый фермент УДФ-глюкуронилтрансфераза и УДФ-глюкуроновая кислота, являющаяся донором глюкуроновой кислоты. При этом к билирубину присоединяются 2 остатка глюкуроновой кислоты с образованием сравнительно индиф ферентного комплекса – билирубин-диглюкуронида, хорошо растворимого в воде и дающего прямую реакцию с диазореактивом. В желчи всегда присутствует прямой билирубин. В крови количество прямого и непрямого билирубина, а также соотношение между ними резко меняются при по ражениях печени, селезенки, костного мозга, болезнях крови и т.д., поэтому определение содержания обеих форм билирубина в крови имеет существен ное значение при дифференциальной диагностике различных форм желтухи.

При желчнокаменной болезни в составе желчных камней наряду с основным их компонентом – холестерином всегда обнаруживается непрямой били рубин. Вследствие плохой растворимости в воде он выпадает в осадок в желчном пузыре в виде билирубината кальция, участвующего в фор мировании камней.

Дальнейшая судьба желчных пигментов, точнее билирубина, связана с их превращениями в кишечнике под действием бактерий. Сначала глю куроновая кислота отщепляется от комплекса с билирубином и осво бодившийся билирубин подвергается восстановлению в стеркобилиноген, который выводится из кишечника. В сутки человек выделяет около 300 мг стеркобилиногена. Последний легко окисляется под действием света и воздуха в стеркобилин. Механизм бактериальных превращений билирубина до стеркобилина до конца еще не расшифрован. Имеются данные, что промежуточными продуктами восстановления являются последовательно мезобилирубин и мезобилиноген (уробилиноген). После всасывания не большая часть мезобилиногена поступает через воротную вену в печень, где подвергается разрушению с образованием моно- и дипиррольных соеди нений. Кроме того, очень небольшая часть стеркобилиногена после вса сывания через систему геморроидальных вен попадает в большой круг кровообращения, минуя печень, и в таком виде выводится с мочой.

Однако называть его уробилиногеном не совсем точно (см. главу 18).

Суточное содержание стеркобилиногена в моче составляет около 4 мг, и, пожалуй, именно стеркобилиноген является нормальной органической составной частью мочи. Если с мочой выделяется повышенное содержание уробилиногена (точнее, мезобилиногена), то это является свидетельством недостаточности функции печени, например, при печеночной или гемо литической желтухе, когда печень частично теряет способность извлекать этот пигмент из крови воротной вены. Химически уробилиноген (мезо билиноген) неидентичен стеркобилиногену (уробилиногену) мочи. Исчезно вение стеркобилиногена (уробилиногена) из мочи при наличии билирубина и биливердина является свидетельством полного прекращения поступления желчи в кишечник. Такое состояние часто наблюдается при закупорке протока желчного пузыря (желчнокаменная болезнь) или общего желчного протока (желчнокаменная болезнь, раковые поражения поджелудочной железы и др.).

Таким образом, количественный и качественный анализ желчных пиг ментов в моче может представлять большой клинический интерес.

Глава БИОСИНТЕЗ БЕЛКА Целое есть нечто большее, чем простая сумма его частей.

Платон Одной из глобальных задач современной биологии и ее новейших разделов:

молекулярной биологии, биоорганической химии, физико-химической био логии – является выяснение молекулярных основ и тонких механизмов синтеза белка, содержащего сотни, а иногда и тысячи остатков L-амино кислот. Последние располагаются, как это установлено, не хаотично, а в строго заданной последовательности, обеспечивая тем самым уни кальность структуры синтезированной белковой молекулы, наделенной уникальной функцией. Другими словами, механизм синтеза должен об ладать весьма тонкой и точной кодирующей системой, которая авто матически программирует включение каждого аминокислотного остатка в определенное место полипептидной цепи. Установлено, что кодирующая система однозначно определяет первичную структуру, в то время как вторичная и третичная структуры белковой молекулы определяются фи зико-химическими свойствами и химической структурой радикалов амино кислот в полипептиде.

Первоначально представляли, что синтез белка могут катализировать те же протеолитические ферменты, которые вызывают и его гидролиз, но путем обратимости химической реакции. Однако оказалось, что синте тические и катаболические реакции протекают не только различными путями, но даже в разных субклеточных фракциях. Не подтвердилась также гипотеза о предварительном синтезе коротких пептидов с последующим их объединением в одну полипептидную цепь. Более правильным оказалось предположение, что для синтеза белка требуются источники энергии, наличие активированных свободных аминокислот и нескольких типов клеточных нуклеиновых кислот.

В выяснение молекулярных механизмов синтеза белка определенный вклад внесли российские биохимики. Так, в лаборатории А.Е. Браунштейна было впервые указано на участие АТФ в синтезе квазипептидных связей (на примерах гиппуровой кислоты, глутамина, глутатиона и ацетанилида).

В.Н. Орехович еще в 50-е годы установил, что перенос аминоацильных или пептидильных группировок на NH2-группу аминокислот может осуществ ляться не только с амидной или пептидной, но и со сложноэфирной связи.

Как будет показано далее, именно этот механизм лежит в основе реакции транспептидирования в 50S рибосоме в стадии элонгации синтеза белка.

Значительно позже были получены доказательства, что в синтезе белка, протекающем в основном в цитоплазме, решающую роль играют нуклеи новые кислоты, в частности ДНК. После того как было установлено, что ДНК является носителем и хранителем наследственной информации, был поставлен вопрос о том, каким образом эта генетическая информация, записанная (зашифрованная) в химической структуре ДНК, трансформи Ген ДНК мРНК Ядро Рибосома тРНК Рис. 14.1. Принципиальная схе ма биосинтеза белка (по А.С. Спирину).

Белок Красные кружочки - свободные аминокислоты и их остатки в соста Цитоплазма ве полипептидной цепи.

руется в фенотипические признаки и функциональные свойства живых организмов, передающиеся по наследству. В настоящее время можно дать однозначный ответ на этот вопрос: генетическая информация програм мирует синтез специфических белков, определяющих в свою очередь спе цифичность структуры и функции клеток, органов и целостного организма (рис. 14.1). В природе, как известно, существует два типа биополимерных макромолекул: так называемые неинформативные биополимеры (они представлены повторяющимися мономерными единицами и/или разветв ленными структурами, например полисахариды, поли-АДФ-рибоза, пеп тидогликаны, гликопротеины) и информативные биополимеры, несущие первичную генетическую информацию (нуклеиновые кислоты) и вторичную генетическую, точнее фенотипическую, информацию (белки). Эти общие представления могут быть выражены следующей последовательностью событий (поток информации):

ДНК –> РНК –> Белок –> Клетка –> Организм Значительный вклад в современные представления о месте, факторах и механизме синтеза белка внесли исследования Т. Касперсона, М. Хоглан да, П. Берга, П. Замечника, С. Очоа, М. Ниренберга, Н. Горовица, Ф. Гауровица, С. Вейсса и российских биохимиков А.А. Баева, А.Н. Бело зерского, А.С. Спирина и др.

Не останавливаясь на всех исторических аспектах развития этой важ нейшей проблемы, следует напомнить, что еще в 40-х годах было уста новлено, что ДНК локализована в ядре клетки, в то время как синтез белка протекает главным образом в микросомах цитоплазмы. Первые экспе риментальные доказательства необходимости нуклеиновых кислот для синтеза белка были получены в лаборатории Т. Касперсона. Было показано также, что присутствующие в цитоплазме рибонуклеиновые кислоты контролируют синтез цитоплазматических белков. Таким образом, уже тогда вырисовывалась картина тесной связи между ДНК, локализованной в ядре *, и синтезом белка, протекающим в цитоплазме и регулирующимся рибонуклеиновыми кислотами, которые были открыты как в цитоплазме, так и в ядре. На основании этих чисто морфологических данных было сделано заключение, полностью подтвержденное в настоящее время, что биосинтез белка, хотя непосредственно и регулируется рибонуклеиновыми кислотами, опосредованно связан с контролирующим влиянием ДНК ядра и что РНК сначала синтезируется в ядре, затем поступает в цитоплазму, где выполняет роль матрицы в синтезе белка. Полученные значительно позже экспериментальные данные подтвердили гипотезу о том, что основными функциями нуклеиновых кислот являются хранение генетической инфор мации и реализация этой информации путем программированного синтеза специфических белков.

В последовательности ДНК —> РНК —> Белок недоставало сведений о том, каким образом происходят расшифровка наследственной информации и синтез специфических белков, определяющих широкое разнообразие признаков живых существ. В настоящее время выяснены основные про цессы, посредством которых осуществляется передача наследственной ин формации: репликация, т.е. синтез ДНК на матрице ДНК;

транскрип ция, т.е. синтез РНК на матрице ДНК или перевод языка и типа строения ДНК на молекулу РНК (см. ранее), и трансляция – процесс, в котором генетическая информация, содержащаяся в молекуле мРНК, направляет синтез соответствующей аминокислотной последовательности в белке.

Напомним, однако, что многие тонкие механизмы транскрипции и транс ляции окончательно еще неясны.

ТРАНСЛЯЦИЯ И ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К СИНТЕЗУ БЕЛКА В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ Непосредственное отношение к механизмам передачи наследственной ин формации, или экспрессии генов, имеет процесс трансляции, означающий перевод «четырехбуквенного языка нуклеиновых кислот на двадцатибук венную речь белков». Другими словами, трансляция сводится к синтезу белка в рибосомах. В этом процессе только последовательность рас положения нуклеотидов в мРНК определяет первичную структуру белка, т.е. строго упорядоченную последовательность расположения отдельных аминокислотных остатков в молекуле синтезируемого белка.

Остановимся на анализе тех условий, которые необходимы для осу ществления синтеза белка в бесклеточной системе. В современных пред ставлениях о синтезе белка выдающуюся роль сыграли три эксперимен тальных подхода, разработанные в начале 50-х годов. Во-первых, в клас сических исследованиях П. Замечника и сотр. при использовании меченых * Получены экспериментальные доказательства наличия ДНК также в митохондриях (около 1-2% от суммарной ДНК клеток). Она негомологична и некомплементарна ядерной ДНК. Установлено, что ДНК кодирует синтез некоторых структурных белков самих мито хондрий и особых митохондриальных РНК.

Таблица 14.1. Состав белоксинтезирующей системы у про- и эукариот в разные стадии синтеза белка Стадия Прокариоты Эукариоты 1. Активация 20 аминокислот 20 аминокислот аминокислот 20 аминоацил-тРНК-синтетаз 20 аминоацил-тРНК-синтетаз Минимум 20 тРНК Минимум 20 тРНК АТФ и Mg2+ АТФ и Mg2+ 2. Инициация мРНК мРНК Инициаторная аминоацил- Инициаторная аминоацил тРНК (N-формилметионил- тРНК (метионил-тРНК) тРНК) Инициирующий кодон в мо- Инициирующий кодон в мо лекуле мРНК (АУГ) лекуле мРНК (АУГ) 30S и 50S рибосомные 40S и 60S рибосомные субчастицы субчастицы Факторы инициации: Факторы инициации:

IF-1, IF-2 и IF-3, ГТФ и Mg2+ eIF-1, eIF-2, eIF-2A, eIF-3, eIF-4A, eIF-4B, eIF-4C, eIF-4D и кэп-узнающий фактор, ГТФ и Mg2+ 3. Элонгация Инициирующий комплекс Инициирующий комплекс (функциональная 70S рибо- (функциональная 80S рибо сома) сома) Специфические тРНК, опре- Специфические РНК, опре деляемые кодонами деляемые кодонами Факторы элонгации: Факторы элонгации:

EF-Tu, EF-Ts и EF-G, eEF-1, eEF-1 и eEF-2, ГТФ и Mg2+ ГТФ и Mg2+ 4. Терминация Терминирующие кодоны в Терминирующие кодоны в молекуле мРНК: УАА, УАГ молекуле мРНК: УАА, УАГ и УГА и УГА Факторы терминации Факторы терминации (рилизинг-факторы): (рилизинг-факторы):

RF-1, RF-2, RF-3, АТФ eRF, АТФ 5. Процессинг и Специфические ферменты и Специфические ферменты и формирование кофакторы, вызывающие ос- кофакторы, вызывающие ос третичной вобождение инициирующих вобождение инициирующих структуры остатков и сигнальных после- остатков и сигнальных после довательностей, ограничен- довательностей, ограничен ный протеолиз и химическую ный протеолиз и химическую модификацию модификацию аминокислот был впервые решен вопрос 15о месте синтеза белка;

им ока залась рибосома. При введении крысам N-аминокислот и определении радиоактивности белков в различных субклеточных фракциях печени, по лученных методом дифференциального центрифугирования через различ ные промежутки времени, было показано, что радиоактивная метка в первую очередь появляется во фракции микросом и лишь затем в других субклеточных образованиях. Во-вторых, добавление АТФ к белоксинте зирующей системе цитозоля вызывало «активирование» аминокислоты и связывание ее с термостабильной и растворимой формой РНК, впо следствии названной транспортной (тРНК), что приводило к образованию комплекса, названного позже аминоацил-тРНК. Ферменты, катализиру ющие этот процесс, сейчас называются аминоацил-тРНК-синтетазами.

В-третьих, выяснена роль самих адапторных РНК в процессе трансляции.

Дальнейшие исследования были направлены на поиск других ком понентов белоксинтезирующей системы.

Белоксинтезирующая система включает набор всех 20 амино кислот, входящих в состав белковых молекул;

минимум 20 разных тРНК, обладающих специфичностью к определенному ферменту и определенной аминокислоте;

набор минимум 20 различных ферментов – аминоацил тРНК-синтетаз, также обладающих двойной специфичностью к какой-либо определенной аминокислоте и к одной тРНК;

рибосомы (точнее, полисомы, состоящие из 4–12 монорибосом с присоединенной к ним мРНК);

АТФ и АТФ-генерирующую систему ферментов;

ГТФ, принимающий специ фическое участие в стадиях инициации и элонгации синтеза белка в рибосомах;

ионы Mg2+ в концентрации 0,005–0,008 М;

мРНК в качестве главного компонента системы, несущей информацию о структуре белка, синтезирующегося в рибосоме;

наконец, белковые факторы, участвующие в синтезе на разных уровнях трансляции. Основные компоненты белок синтезирующей системы про- и эукариотов в разные стадии синтеза белка обобщены в табл. 14.1.

Рассмотрим более подробно структуру и функцию главных компонентов белоксинтезирующей системы.

Рибосомы Как известно, живые организмы в зависимости от структуры клеток делятся на две группы – прокариоты и эукариоты. Первые не содержат ограни ченного мембраной ядра и митохондрий или хлоропластов;

они пред ставлены главным образом микроорганизмами. Клетки эукариот животных и растений, включая грибы, напротив, содержат ядра с мембранами, а также митохондрии (в ряде случаев и хлоропласты) и другие субклеточные органеллы.

Оба типа клеток имеют рибосомы, причем рибосомы эукариот (мол.

масса 4,2•106) значительно большего размера (23 нм в диаметре), чем рибосомы прокариот (мол. масса 2,5•106, 8 нм в диаметре). Обычно рибосомы характеризуют по скорости их седиментации в центрифужном поле, которая количественно выражается константой седиментации s в единицах Сведберга S (см. главу 1). Величина s зависит не только от размера частиц, но и от формы и плотности, так что она непропор циональна размеру. Число рибосом в микробной клетке равно примерно 104, а эукариот – около 105.

Химически рибосомы представляют собой нуклеопротеины, состоящие из РНК и белков, причем 80S рибосомы эукариот содержат примерно Эукариоты Прокариоты 80S 70S 0,01 мМ 0,01 мМ Mg2+ Мg2+ 40S 30S 50S 60S 5S рРНК 16S рРНК 5S рРНК 18S рРНК (1900 нукл.) (120 нукл.) (1540 нукл.) (120 нукл.) 23S рРНК 5,8S рРНК ~ 33 белка 21 белок (3200 нукл.) (160 нукл.) 28S рРНК 34 белка (4700 нукл.) ~ 49 белков Рис. 14.2. Компоненты рибосом прокариот и эукариот (схема).

равное их количество, а у 70S рибосом прокариот соотношение РНК и белка составляет 65% и 35% соответственно (рис. 14.2). РНК рибосом принято называть рибосомными и обозначать рРНК. Как 80S, так и 70S рибосомы состоят из двух субчастиц, которые можно увидеть под электронным микроскопом или после обработки рибосом растворами, содержащими низкие концентрации ионов Mg2+. При этих условиях рибосомы дис социируют на субчастицы;

последние могут быть отделены друг от друга методом ультрацентрифугирования. Одна из субчастиц по размерам в 2 раза превышает вторую. Так, у 70S рибосом величины s для субчастиц равны 50S и 30S, у 80S рибосом – соответственно 60S и 40S (см. рис. 14.2).

Укажем также, что у Е. coli большая и малая субчастицы содержат 34 белка и 21 белок соответственно и, кроме того, 2 молекулы рРНК с коэф фициентами седиментации 23S и 5S в большой и одну молекулу рРНК (16S) в малой субчастице. Рибосомные белки не только все выделены, но и секвенированы;

отличаются большим разнообразием молекулярной мас сы (от 6000 до 75000). Считается, что все 55 бактериальных рибосомных белков участвуют в синтезе полипептидов в качестве ферментов или структурных компонентов, но, за исключением небольшого числа, де тальная функция большинства из них не выяснена. РНК 23S и 5S содержат 3200 и 120 нуклеотидов соответственно, a 16S РНК – 1540 нуклеотидов.

Субчастицы рибосом клеток эукариот построены более сложно. В их составе четыре разные рРНК и более 70 разных белков в обеих субчастицах, при этом большая субчастица (60S) содержит три разного размера рРНК:

28S (4700 нуклеотидов), 5,8S (160 нуклеотидов) и 5S (120 нуклеотидов) – и около 49 белков. Малая субчастица (40S) содержит всего одну молекулу 18S рРНК и около 33 белков. Укажем также, что биологические функции компонентов эукариотических рибосом также связаны, вероятнее всего, с синтезом полипептидной цепи, но их конкретная роль недостаточно раскрыта.

Рибосомы представляют собой сложную молекулярную «машину» («фабрику») синтеза белка. Для выяснения тонких механизмов синтеза белка в рибосомах необходимы более точные сведения о структуре и функциях всех компонентов рибосом. В последнее время получены данные, свидетельствующие о вероятной пространственной трехмерной структуре как целых рибосом, так и их субчастиц. В частности, выяснено, что форму и размеры 30S и 40S субчастиц рибосом предопределяют не белковые молекулы этих частиц, а третичная структура входящих в их состав 16S и 18S рРНК. Более того, по данным акад. А.С. Спирина, для сохранения пространственной морфологической модели всей 30S субчастицы оказалось достаточным наличие только двух белков (из 21), содержащихся в оп ределенных топографических участках молекулы 16S рРНК.

Известно, что рРНК образуется из общего предшественника всех типов клеточных РНК, в свою очередь синтезирующегося на матрице ДНК в ядре (см. главу 13). Рибосомные белки имеют цитоплазматическое происхож дение, затем они транспортируются в ядрышки, где и происходит спон танное образование рибосомных субчастиц путем объединения белков с соответствующими рРНК. Объединенные субчастицы вместе или врозь транспортируются через поры ядерной мембраны обратно в цитоплазму, где группа рибосом вместе с мРНК образует полисомы или полирибосомы, принимающие непосредственное участие в синтезе белка.

Аминоацил-тРНК-синтетазы Экспериментально доказано существование в любых клетках живых ор ганизмов специфических ферментов, катализирующих активирование ами нокислот и связывание последних с определенными тРНК. Все эти фер менты выделены в чистом виде из Е. coli, секвенированы, и для ряда их установлена трехмерная структура.

Все они оказались чувствительными к реагентам на SH-группы и 2+ требуют присутствия ионов Mg. Ферменты обладают абсолютной спе цифичностью действия, поскольку они узнают только одну какую-либо L-аминокислоту или одну тРНК. Для тех аминокислот, для которых открыты две и более тРНК (см. далее), соответствующая аминоацил тРНК-синтетаза катализирует аминоацилирование всех этих тРНК. Это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку в дальнейшем в белковом синтезе «узнавание» аминоацил-тРНК основано не на природе амино кислоты, а на химической природе антикодона тРНК. Считается, что в молекуле каждой аминоацил-тРНК-синтетазы имеется по крайней мере 3 центра связывания: для аминокислоты, тРНК и АТФ;

ферменты весьма чувствительны также к аналогам аминокислот, которые ингибируют ак тивирование соответствующих аминокислот. Некоторые ферменты состоят из одной полипептидной цепи, другие – из двух или четырех гомологичных или гетерогенных субъединиц.

Аминоацил-тРНК-синтетазы в последнее время стали делить на 2 класса в соответствии с различиями в их первичной и третичной структурах, а также в зависимости от своеобразия механизма катализируемой реакции.

Первый класс включает ферменты, катализирующие синтез аминоацил тРНК следующих аминокислот: Арг, Вал, Глн, Глу, Иле, Лей, Мет, Тир, Трп, Цис;

второй класс – аминокислот Ала, Асн, Асп, Гис, Гли, Лиз, Про, Сер, Тре, Фен. Оказалось, что ферменты 1-го класса обеспечивают перенос аминоацильной группы сначала ко второй 2'-ОН-группе терминального остатка адениловой кислоты, затем перемещение ее к 3'-ОН-группе (путем реакции трансэтерификации), в то время как ферменты 2-го класса ката лизируют перенос аминоацильной группы непосредственно к 3'-ОН-группе концевого аденилового нуклеотида.

Аминоацил-тРНК-синтетазы в активном центре содержат гистидин, имидазольное кольцо которого участвует в связывании АТФ посредством ионов Mg2+. Наибольшим сродством эти ферменты, как было указано, обладают к молекулам специфических тРНК, хотя конкретный механизм, посредством которого ферменты узнают подходящую РНК, пока неясен.

В то же время эти ферменты отличаются низкой молярной активностью (число оборотов не превышает нескольких сот каталитических актов в минуту).

Участок связывания аминокислот Псевдоуридиловая Петля, петля содержащая дигидроуридин Добавочная петля Пиримидин Пурин Петля, содержащая антикодон Антикодон а Псевдоуридиловая Участок петля связывания аминокислот Петля, содержащая дигидроуридин Петля, содержащая б антикодон Рис. 14.3. Структура тРНК.

а - общая структура различных тРНК;

б - пространственная структура тРНК.

Печень Дрожжи Активное состояние Неактивное состояние Рис. 14.4. Созревание валиновой тРНК (по А.А. Баеву).

Цифрами обозначены фрагменты молекулы тРНК.

Транспортные РНК В лаборатории М. Хогланда было выяснено, что при инкубации С-аминокислоты с растворимой фракцией цитоплазмы в присутствии АТФ и последующим добавлением трихлоруксусной кислоты в образовавшемся белковом осадке метка не открывается. Эти данные позволили сделать заключение, что меченая аминокислота не включается в белковую мо лекулу. Метка оказалась связанной ковалентно с РНК, содержащейся в безбелковом фильтрате. Дальнейшие исследования показали, что РНК, к которой присоединяется меченая аминокислота, имеет небольшую мо лекулярную массу и сосредоточена в растворимой фракции, поэтому ее сначала назвали растворимой, а позже адапторной, или транспортной, РНК (тРНК). На долю тРНК приходится около 10–15% от общего количества клеточной РНК. К настоящему времени открыто более 60 различных тРНК.

Для каждой аминокислоты в клетке имеется по крайней мере одна спе цифическая тРНК. (Для ряда аминокислот открыто более одной: в част ности, для серина, лейцина и аргинина – 6 разных тРНК, для аланина, треонина и глицина – по 4 разных тРНК, хотя и в этом случае каждая тРНК связана со специфической аминоацил-тРНК-синтетазой.) Молекулярная масса большинства тРНК колеблется от 24000 до 29000. Они содержат от 75 до 85 нуклеотидов, в том числе 8 и более из них являются моди фицированными основаниями. Аминокислоты присоединяются в конечном итоге к свободной 3'-ОН-группе (см. ранее о ферментах аминоацил тРНК-синтетаз 1-го класса) концевого мононуклеотида, представленного во всех тРНК АМФ (адениловая кислота), путем образования эфирной связи.

Интересно, что почти все тРНК обладают не только удивительно сходными функциями, но и очень похожей трехмерной структурой (рис. 14.3).

Установлена первичная структура почти всех 60 открытых тРНК (рис. 14.4). Знание последовательности нуклеотидов и, следовательно, состава тРНК дало в руки исследователей много ценных сведений о биологической роли отдельных компонентов тРНК. Общей для тРНК оказалась также нативная трехмерная структура, установленная методом рентгенокристаллографического анализа и названная первоначально кон формацией клеверного листа;

на самом деле эта конформация имеет перевернутую L-образную форму (см. рис. 14.3). Определение тРНК этим методом позволило выявить ряд отличительных особенностей структуры.

В молекуле тРНК открыты спирализованные участки, необычные водо родные связи и гидрофобные взаимодействия во внеспирализованных участках. Показано, что тРНК имеет псевдоуридиловую петлю, обра зованную из нуклеотидов, содержащих псевдоуридин (ТС), и дигидро уридиловую петлю. Обе петли участвуют в образовании угла буквы L. На 3'-ОН-конце располагается одинаковая для всех тРНК последовательность триплета ЦЦА-ОН, к которой присоединяется посредством эфирной связи специфическая аминокислота. Связывание в основном происходит через 3'-ОН-группу концевого аденилового нуклеотида, хотя, как было указано, получены доказательства возможности предварительного присоединения аминокислоты и через его 2'-ОН-группу.

Роль отдельных участков тРНК недостаточно раскрыта. В частности, псевдоуридиловая петля, по-видимому, обеспечивает связывание амино ацил-тРНК с рибосомой, а дигидроуридиловая петля, вероятнее всего, необходима как сайт (место) для узнавания специфическим ферментом – аминоацил-тРНК-синтетазой. Имеется, кроме того, добавочная петля, состав которой варьирует у разных типов молекул тРНК;

ее назначение неизвестно. Существенным, с полностью раскрытой функцией участком является антикодоновая петля, несущая триплет, названный антикодо ном, и расположенная на противоположной стороне от того конца, к кото рому присоединяется аминокислота. Антикодоновая петля состоит из 7 нуклеотидов: три занимают центральное положение и формируют собственный высокоспецифичный антикодон, по два нуклеотида распо ложены по обе стороны от него, включая модифицированный пурин и варьирующее основание с одной стороны и два пиримидиновых осно вания – с другой стороны. Антикодон является специфичным и компле ментарным к соответствующему кодону мРНК, причем оба они анти параллельны в своей комплементарности.

Тщательный анализ нуклеотидной последовательности разных тРНК показал, что все они содержат одинаковый 5'-концевой нуклеотид – ГМФ – со свободной 5'-фосфатной группой. Адапторная функция молекул тРНК заключается в связывании каждой молекулы тРНК со своей специфической аминокислотой. Однако, поскольку между нуклеиновой кислотой и спе цифической функциональной группой аминокислот нет соответствия и сродства, эту функцию узнавания, точнее, посредника между тРНК и аминокислотой, должна выполнять белковая молекула фермента. Взаимо действие между аминоацил-тРНК-синтетазой и тРНК принято обозначать как «вторичный генетический код», подчеркивая тем самым его ключевую роль в обеспечении точности синтеза белка, причем правила кодирования являются, вероятнее всего, более сложными, чем правила «первичного» генетического кода (см. далее).

Матричная РНК Ранее было указано на необходимость участия предобразованной молекулы РНК для правильной расстановки аминокислот в полипептидной цепи. Еще сравнительно недавно предполагали, что такой молекулой может служить рРНК. Это предположение как будто бы подкреплялось и опытами по заражению клеток Е. coli ДНК фага. Оказалось, что немедленно после заражения синтез нормальных клеточных ДНК прекращается и начинается интенсивный синтез фаговой ДНК. Более того, весь белоксинтезирующий аппарат клеток перестраивался на синтез только фаговых белков. Состав синтезированных фаговых белков отличался от состава белков бактерии.

Было высказано предположение, что при заражении фагом, очевидно, меняется последовательность оснований в РНК, однако и эта гипотеза не подтвердилась. По мнению ряда известных ученых, предобразованная РНК, необходимая для изменения типа синтезируемого белка, должна обладать высокой скоростью обновления своего состава, т.е. молекула такой РНК должна синтезироваться и распадаться с такой скоростью, чтобы обеспечить подобную скорость обновления нуклеотидного состава.

Фактически рРНК оказалась метаболически малоактивной и весьма ста бильной, поэтому становилось очевидным, что она не может служить в качестве матрицы.

В ряде лабораторий (в частности, в лаборатории С. Бреннера) были получены данные о возможности существования в клетках в соединении с рибосомами короткоживущей РНК *, названной информационной (иРНК).

Сейчас она обозначается как матричная РНК (мРНК), потому что ее роль заключается в переносе информации от ДНК в ядре (где она синтезируется под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы) до цитоплазмы, где она соединяется с рибосомами и служит матрицей, на которой осуществляется синтез белка. Эта блестящая гипотеза затем экспериментально была до казана в лаборатории М. Ниренберга. При изучении влияния различных фракций клеточной РНК на способность рибосом, выделенных из Е. coli, к синтезу белка было установлено, что некоторые из них стимулировали включение С-аминокислот в синтезируемый полипептид. Добавление синтетического полинуклеотида, в частности полиуридиловой кислоты (поли-У), в белоксинтезирующую систему приводило к включению в синтезирующуюся белковую молекулу единственной аминокислоты – фенилаланина. Поли-У вызывал синтез в бесклеточной системе необычного полипептида полифенилаланина. Таким образом, искусственно синтези рованный полирибонуклеотид, добавленный к препаратам рибосом, вклю чавшим известные к тому времени факторы белкового синтеза и источники энергии, вызывал синтез определенного, запрограммированного полипеп тида.

Эти опыты открыли возможность для экспериментальной расшифровки всего генетического кода, при помощи которого информация от РНК передается на синтезируемый белок. Последовательность нуклеотидов РНК реализуется в специфической последовательности аминокислот синтези руемой полипептидной цепи. Опыты М. Ниренберга свидетельствуют также о том, что не рибосома и не рибосомная рРНК являются матрицей, на которой синтезируются специфические белки, а эту роль выполняют поступающие извне матричные РНК. Итак, ДНК передает информацию на РНК, которая синтезируется в ядре и затем поступает в цитоплазму;

здесь РНК выполняет матричную функцию для синтеза специфической белковой молекулы. Матричная гипотеза белка, как и других полимерных молекул ДНК и РНК (см. ранее), в настоящее время получила подтверждение. Ее правомочность была доказана в экспериментах, которые обеспечивали точное воспроизведение первичной структуры полимерных молекул. Этот * Впервые на возможность существования в клетках быстро обменивающейся молекулы РНК было указано в работах А.Н. Белозерского и А.С. Спирина.

синтез в отличие от малоуправляемого химического синтеза отличался не только высокой скоростью и специфичностью, но и направленностью самого процесса в строгом соответствии с программой, записанной в линейной последовательности молекулы матрицы.

Природа генетического кода Проблема синтеза белка тесно связана с понятием генетического кода.

Генетическая информация, закодированная в первичной структуре ДНК, еще в ядре переводится в нуклеотидную последовательность мРНК. Вопрос о том, каким образом эта информация передается на белковую молекулу, долго не был ясен. Первые указания на существование прямой линейной зависимости между структурой гена и его продуктом – белком можно найти у Ч. Яновского. В серии изящных опытов с применением методов гене тического картирования и секвенирования он показал, что порядок из менений в структуре мутантного гена триптофансинтазы у Е. coli точно соответствует порядку изменений в аминокислотной последовательности молекулы белка-фермента.

Эукариотические клетки обладают особым механизмом точного и эф фективного перевода последовательности мРНК в соответствующую по следовательность аминокислот синтезируемого белка. Сами молекулы мРНК не имеют сродства к аминокислотам, и было высказано пред положение о том, что для перевода нуклеотидной последовательности мРНК на аминокислотную последовательность белков необходим некий посредник, названный адаптором (см. ранее). Молекула адаптора должна быть наделена способностью узнавать нуклеотидную последовательность специфической мРНК и соответствующую аминокислоту. Клетка, имеющая подобную адапторную молекулу, может встраивать каждую аминокислоту в подходящее место полипептидной цепи в строгом соответствии с нуклео тидной последовательностью мРНК. Остается, таким образом, незыб лемым положение, что сами по себе функциональные группы аминокислот не способны вступать в контакт с матрицей и информационной мРНК.

Было показано, что в нуклеотидной последовательности мРНК имеются кодовые «слова» для каждой аминокислоты – генетический код. Вероятнее всего, он заключается в определенной последовательности расположения нуклеотидов в молекуле ДНК. Вопросы о том, какие нуклеотиды от ветственны за включение определенной аминокислоты в белковую мо лекулу и какое количество нуклеотидов определяет это включение, ос тавались нерешенными до 1961 г. Теоретический разбор показал, что код не может состоять из одного нуклеотида, поскольку в этом случае только 4 аминокислоты могут кодироваться. Однако код не может быть и дуплетным, т.е. комбинация двух нуклеотидов из четырехбуквенного «ал фавита» не может охватить всех аминокислот, 2 так как подобных ком бинаций теоретически возможно только 16 (4 = 16), а в состав белка входит 20 аминокислот. Для кодирования всех аминокислот белковой молекулы был бы достаточным триплетный код, когда число возможных комбинаций составит 64 (43 = 64).

Из приведенных данных М. Ниренберга становится очевидным, что поли-У, т.е. РНК, гипотетически содержащая остатки только одного уридилового мононуклеотида, способствует синтезу белка, построенного из остатков одной аминокислоты – фенилаланина. На этом основании был сделан вывод, что кодоном для включения фенилаланина в белковую молекулу может служить триплет, состоящий из трех уридиловых нуклео тидов – УУУ. Вскоре было показано, что синтетическая матричная поли цитидиловая кислота (поли-Ц) кодирует образование полипролина, а мат ричная полиадениловая кислота (поли-А) – полилизина;

соответствующие триплеты ЦЦЦ и ААА действительно оказались триплетами (кодонами) для кодирования пролина и лизина.

В выяснении полного генетического кодового «словаря» выдающуюся роль сыграли разработанные Г. Хорана подходы к синтезу полирибо нуклеотидов (искусственных мРНК) с определенными повторяющимися триплетными последовательностями (кополимеры). Их потом использо вали в качестве матрицы в белоксинтезирующей системе. Образованные при этом полипептиды содержали равные количества аминокислот в полном соответствии с матрицей кополимера.

Вскоре в лабораториях М. Ниренберга, С. Очоа и Г. Хорана, пользуясь этими искусственно синтезированными мРНК, были представлены до казательства не только состава, но и последовательности триплетов всех кодонов, ответственных за включение каждой из 20 аминокислот в бел ковую молекулу. Приводим полный кодовый «словарь», т.е. все 64 кодона:

Второй нуклеотид кодона А У Г Ц УУУ УЦУ УАУ УГУ У Фен Тир Цис УАЦ УУЦ УЦЦ УГЦ Ц У Сер Терм УУА УЦА УАА УГА А Терм Лей УУГ УЦГ УАГ УГГ Трп Г ЦАУ У ЦУУ ЦГУ ЦЦУ Гис Ц ЦУЦ ЦЦЦ ЦАЦ ЦГЦ Лей Про Арг Ц А ЦГА ЦУА ЦЦА ЦАА Глн Г ЦУГ ЦЦГ ЦАГ ЦГГ У АЦУ ААУ АГУ АУУ Асн Сер Ц ААЦ АГЦ АУЦ Иле АЦЦ А Тре А АУА АЦА ААА АГА Лиз Арг Г АУГ Мет + Иниц АЦГ ААГ АГГ У ГЦУ ГАУ ГГУ ГУУ Асп Ц ГГЦ Вал ГАЦ ГУЦ ГЦЦ Г Гли Ала А + Иниц ГГА ГЦА ГАА ГУА Глу Г ГАГ ГГГ ГУГ ГЦГ Генетический код для аминокислот является вырожденным. Это оз начает, что значительное большинство аминокислот кодируется несколь кими кодонами. За исключением метионина и триптофана, по существу все остальные аминокислоты имеют более одного специфического кодона.

Узнавание кодона мРНК антикодоном тРНК основано не только на спаривании оснований, когда каждое основание кодона образует пару оснований с комплементарным азотистым основанием антикодона. В этом случае каждый антикодон, соответственно каждая молекула тРНК, может в принципе узнавать только один кодон мРНК. Имеются данные о том, что Трети й нуклеоти д кодон а Первы й нуклеоти д кодон а некоторые тРНК могут узнавать более одного кодона. В частности, показано, что аланиновая тРНК, выделенная из дрожжей, узнает 3 кодона:

ГЦУ, ГЦЦ и ГЦА. Как видно, различия касаются только природы 3-го нуклеотида. В связи с этим была выдвинута гипотеза «качаний», пред полагающая, что на спаривание 3-го основания, очевидно, накладываются менее строгие ограничения и что имеется неполное, неоднозначное со ответствие этого нуклеотида, являющееся, вероятнее всего, одной из причин вырожденности генетического кода. Вырожденность кода оказывается не одинаковой для разных аминокислот. Так, если для серина, аргинина и лейцина имеется по 6 кодовых «слов», то ряд других аминокислот, в частности глутаминовая кислота, гистидин и тирозин, имеют по 2 кодона, а триптофан – только 1. Вполне допустимо поэтому предположение, что последовательность первых двух нуклеотидов определяет в основном спе цифичность каждого кодона, в то время как 3-й нуклеотид, очевидно, менее существен. В последнее время появились сторонники возможности су ществования гипотезы два из трех, означающей, что код белкового синтеза, возможно, является квази- или псевдодуплетным.

Оказалось, что вырожденность генетического кода имеет несомненный биологический смысл, обеспечивая организму ряд преимуществ. В част ности, она способствует «совершенствованию» генома, так как в процессе точечной мутации, вызванной химическими или физическими факторами, возможны различные аминокислотные замены, наиболее ценные из ко торых отбираются в процессе эволюции.

Другой отличительной особенностью генетического кода является его непрерывность, отсутствие «знаков препинания», т.е. сигналов, указы вающих на конец одного кодона и начало другого. Другими словами, код является линейным, однонаправленным и непрерывающимся: АЦГУЦГАЦЦ.

Это свойство генетического кода обеспечивает синтез точной и в высшей степени упорядоченной последовательности аминокислотных остатков в молекуле белка. В противном случае последовательность нуклеотидов в кодонах будет нарушена и приведет к синтезу «бессмысленной» поли пептидной цепи с измененной структурой и непредсказуемой функцией.

Следует указать еще на одну весьма существенную особенность кода – его универсальность для всех живых организмов от Е. coli до человека. Код не подвергся существенным изменениям за миллионы лет эволюции.

Среди 64 мыслимых кодонов 61 имеет смысл, т.е. кодирует опре деленную аминокислоту. В то же время три из них, а именно УАГ, УАА, УГА, оказываются «бессмысленными»;

они были названы нонсенс-кодо нами, так как не кодируют ни одной из 20 аминокислот. Однако эти кодоны не лишены смысла, поскольку по крайней мере два из них выполняют важную функцию сигналов терминации в синтезе полипептида в рибосомах (функцию окончания, терминации синтеза).

При исследовании генетического кода в опытах in vivo также были получены доказательства универсальности кода, однако в последние годы выявлены некоторые особенности его в митохондриях животных, включая клетки человека. Генетический код цитоплазмы отличается от такового митохондрий 4 кодонами. Два кодона: АУГ, который обычно является инициаторным кодоном, кодирует также метионин в цепи, и УГА, яв ляющийся нонсенс-кодоном, кодирует в митохондриях триптофан. Кодоны АГА и АГГ являются для митохондрий скорее терминирующими, а не кодирующими аргинин. В результате для считывания генетического кода митохондрий требуется меньше разных тРНК, в то время как цито плазматическая система трансляции обладает полным набором тРНК.

ЭТАПЫ СИНТЕЗА БЕЛКА Синтез белка представляет собой циклический энергозависимый много ступенчатый процесс, в котором свободные аминокислоты полимеризуются в генетически детерминированную последовательность с образованием полипептидов. Система белкового синтеза, точнее система трансляции, которая использует генетическую информацию, транскрибированную в мРНК, включает участие множества разнообразных молекул (низкомо лекулярные вещества и макромолекулы, а также надмолекулярные струк туры). В табл. 14.1 обобщены известные к настоящему времени данные о составе белоксинтезирующей системы у про- и эукариот в каждой из 5 стадий синтеза, из которых 3 стадии (инициация, элонгация и терминация) по аналогии со стадиями синтеза полимерных молекул ДНК и РНК (см.

главу 13) считаются главными и основными, а 2 стадии (активация аминокислот и постсинтетический процессинг) рассматриваются в качестве дополнительных, вспомогательных стадий синтеза. Более 100 макромо лекул участвует в активировании аминокислот и их переносе на рибосомы (все тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы), более 60 макромолекул входит в состав 70S и 80S рибосом, и около 10 макромолекул, называемых белковыми факторами, принимающих непосредственное участие в системе трансляции. Не разбирая подробно природу других важных для синтеза факторов, рассмотрим механизм индивидуальных путей синтеза белковой молекулы в искусственной синтезирующей системе. Прежде всего при помощи изотопного метода было выяснено, что синтез белка начинается с N-конца и завершается С-концом, т.е. процесс протекает в направлении NН2 –> СООН.

Белковый синтез, или процесс трансляции, может быть условно разделен на 5 стадий, из которых две считаются подготовительными и завер шающимися, в частности активирование аминокислот и постсинтетическая модификация белковой молекулы, и 3 стадии составляют собственно трансляцию.

Активирование аминокислот Необходимым условием синтеза белка, который в конечном счете сводится к полимеризации аминокислот, является наличие в системе не свободных, а так называемых активированных аминокислот со своим внут ренним запасом энергии. Активация свободных аминокислот осуществля ется при помощи специфических ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз – в присутствии АТФ.

Этот процесс протекает в две стадии:

АТФ PPi I Аминоацил-тРНК Аминоациладенилат синтаза + тРНК II + АМФ Аминоациладенилат Аминоацил-тРНК Обе стадии катализируются одним и тем же ферментом. На I стадии аминокислота вступает в реакцию с АТФ, при этом освобождается пиро фосфат и образуется промежуточный продукт, который на II стадии реагирует с соответствующей 3'-ОН-тРНК, в результате чего образуется аминоацил-тРНК (аа-тРНК) и освобождается АМФ. Аминоацил-тРНК располагает необходимым запасом энергии и имеет следующее строение:

Необходимо еще раз подчеркнуть, что аминокислота присоединяется к свободному концевому 3'-ОН-гидроксилу (или 2'-ОН) АМФ, который вместе с двумя остатками ЦМФ образует концевой триплет ЦЦА, яв ляющийся одинаковым для всех транспортных РНК.

Процессы трансляции Многоступенчатый матричный синтез белка, или собственно трансляцию, протекающую в рибосоме, также условно делят на 3 стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация трансляции. Стадия инициации, являющаяся «точкой от счета» начала синтеза белка, требует соблюдения ряда условий, в частности наличия в системе, помимо 70S (или 80S) рибосом, инициаторной амино ацил-тРНК (аа-тРНК), инициирующих кодонов в составе мРНК и белковых факторов инициации. Экспериментально доказано, что синтез белка ини циирует единственная аминокислота – метионин. В кодовом «словаре» име ется только один кодон для метионина (АУГ), однако во всех живых организмах открыты две тРНК для метионина: одна используется при инициации синтеза белка, другая – для включения метионина во внут реннюю структуру синтезируемого полипептида в стадии элонгации (см.

далее). Соответственно эти тРНК принято обозначать тРНКфМет и тРНКМет.

Укажем также, что эукариотическая клетка не нуждается в формилировании метионина.

У прокариот синтез N-формилметионил-тРНК протекает в две стадии:

АТФ АМФ + РРi Метионил-тРНК синтетаза Метионин Метионил-тРНКфМет Данную стадию катализирует метионил-тРНК-синтетаза. Реакция нуж дается в доставке энергии гидролиза АТФ.

N10-СНО-ТГФК ДГФК Трансформилаза Метионил-тРНКфМет N-формилметионил тРНКфМет Катализирующая II стадию трансформилаза оказалась более специ фичной, чем метионил-тРНК-синтетаза: она не формилирует ни свободный метионин, ни метионин в комплексе с тРНКМет.

Таким образом, N-формилметионил-тРНК является первой аа-тРНК, которая определяет включение N-концевого остатка аминокислоты и тем самым начало трансляции. Процесс формилирования имеет важный хи мический и биологический смысл: блокируя участие NН2-группы метионина в образовании пептидной связи, он обеспечивает тем самым синтез белка в направлении NH2 –> СООН;

образовавшаяся формилметионил-тРНК, кроме того, первой связывается с определенным участком 30S субчастицы рибосомы и с мРНК.

Необходимым условием инициации, как было отмечено, является также наличие инициирующих кодонов, кодирующих формилметионин. У бак терий эту функцию выполняют триплеты АУГ и ГУГ мРНК. Однако они кодируют формилметионин (или начальный метионин в эукариотической клетке) только будучи начальными триплетами при считывании мРНК.

Если эти триплеты являются обычными, т.е. внутренними, то каждый из них кодирует свою аминокислоту: в частности, АУГ кодирует метионин, а ГУГ – валин. Ясно, что начальный, инициаторный 5'-АУГ-кодон должен чем-то отличаться от других АУГ-кодонов, возможно, структурой ок ружения триплета. Предполагают, что инициаторному 5'-АУГ-кодону у прокариот предшествует сигнальная полипуриновая (порядка от 8 до оснований) последовательность (Shine–Dalgarno sequence), которая узна ется полипиримидиновой 3'-антипараллельной последовательностью в мо лекуле 16S рРНК 30S субчастицы. Допускается, кроме того, существование определенных различий во вторичной структуре мРНК в участке ини циирующего кодона, способствующих его узнаванию.

К настоящему времени выяснена природа белковых факторов ини циации. У Е. coli (см. табл. 14.1) открыты три таких инициирующих фак тора, обозначаемых соответственно IF-1, IF-2, IF-3. Все они получены в высокоочищенном состоянии с примерными молекулярными массами 9000, 10000 и 22000 соответственно. IF-3 обеспечивает узнавание участка на молекуле мРНК, к которому присоединяется формилметионил-тРНК.

Данный белковый фактор первым связывается со свободной 30S суб частицей рибосомы и препятствует ассоциации 30S и 50S субчастиц в 70S рибосому без молекулы мРНК. IF-1 способствует связыванию инициатор ной формилметионил-тРНК с комплексом 30S субчастицы и мРНК. Бел ковый фактор IF-2, вероятнее всего, способствует объединению 30S и 50S субчастиц после того, как на первой субчастице уже присутствуют ини циирующие кодоны мРНК, N-формилметионил-тРНК, IF-3, IF-1 и ГТФ.

Этот белок рассматривают как фактор стабилизации всего инициаторного 70S комплекса (см. далее).

50S фМет-тРНК фМет-тРНК 50S Антикодон мРНК мРНК 30S 30S а б Рис. 14.5. Схематическое изображение взаимодействия формилметионил-тРНК и мРНК с 30S субчастицей рибосомы (а) и транслирующей (функционально активной) 70S рибосомой (б).

Аналогичные белковые факторы инициации обнаружены также в эука риотических клетках. Открыто около 10 эукариотических белковых фак торов инициации (см. табл. 14.1), их принято обозначать eIF. Все они, по-видимому, важны для инициации, однако только три из них абсолютно необходимы и существенны для белкового синтеза: eIF-2, eIF-3 и eIF-5. Они получены в чистом виде: eIF-2 состоит из -, - и -субъединиц (мол. масса 38000, 47000 и 50000 соответственно), eIF-3 (мол. масса 500000–700000) и eIF-5 (мол. масса 125000). Укажем также, что в синтезе белка их роль тождественна роли инициаторных белков у прокариот. Отличительной особенностью синтеза белка у эукариот является, кроме того, наличие среди 10 белковых факторов инициации еще одного белка, названного кэп-связы вающим. Соединяясь с 5'-участком кэп мРНК, этот белок содействует образованию комплекса между мРНК и 40S рибосомной субчастицей.

Необходимо отметить, что до сих пор не раскрыты тонкие молекулярные механизмы участия белковых факторов инициации как у про-, так и у эукариот в сложном процессе синтеза белка.

Образование инициаторного комплекса. Экспериментально до казано, что в процессе белкового синтеза наблюдаются постоянная дис социация 70S рибосом на 30S и 50S субчастицы и последующая их реассоциация. Сначала образуется инициаторный комплекс путем при соединения белковых факторов, формилметионил-тРНК и ГТФ к 30S субчастице, к которой комплементарно антикодону формилметионил-тРНК присоединяется мРНК при участии кодона АУГ (рис. 14.5).

Следует указать на особую роль формилметионил-тРНК: она помогает мРНК найти на 30S субчастице определенное местоположение, обеспе чивающее точную трансляцию информации о последовательности амино кислот в полипептидной цепи (установление рамки). Как только мРНК присоединяется к комплексу, высвобождается белковый фактор IF-3 и оставшийся комплекс легко присоединяет 50S субчастицу, образуя трансли рующую, т.е. функционально активную, 70S рибосому. В процессе этих перестроек рибосомы освобождают остальные белковые факторы ини циации и продукты гидролиза ГТФ (ГДФ и неорганический фосфат), энергия которого расходуется, по-видимому, на формирование иницииру ющего 70S комплекса рибосомы. В этом комплексе формилметионил-тРНК оказывается прикрепленной к пептидилсвязывающему центру рибосомы.

В гидролизе ГТФ принимает участие IF-2. У образовавшейся активной, полностью сформировавшейся 70S рибосомы, содержащей формилметио нил-тРНК, оказывается свободным аминоацильный центр, который может 50S Аминоациль Пептидильный ный центр центр П А Рис. 14.6. 50S субчастица рибосомы с двумя центрами связывания тРНК.

реагировать с определенной аа-тРНК, соответствующей очередному кодону мРНК. С этого момента начинается II этап синтеза белка – элонгация.

Элонгация трансляции. Процесс элонгации полипептидной цепи у Е. coli начинается с образования первой пептидной связи и непосредственно, точнее топографически, связан с большой субчастицей (50S) рибосомы, содержащей два центра для связывания тРНК: один из них называется аминоацильным (А), другой – пептидильным (П) (рис. 14.6).

В процессе элонгации у Е. coli также участвует три белковых фактора – элонгационные факторы трансляции, сокращенно обозначаемые Tu, Ts и G (см. табл. 14.1): EF-Tu (мол. масса 43000), EF-Ts (мол. масса 35000) и EF-G (мол. масса 80000). У эукариот также открыты три таких фактора, названных эукариотическими элонгационными факторами трансляции и обозначаемых соответственно eEF-1 (мол. масса 53000), eEF-1 (мол.

масса 30000) и eEF-2;

почти все они получены в чистом виде, для ряда из них установлена первичная структура.

Процесс элонгации принято делить на 3 стадии: узнавание кодона и связывание аминоацил-тРНК, образование пептидной связи и трансло кация. На I стадии в соответствии с природой кодона мРНК в свободный А-участок рибосомы доставляется аминоацил-тРНК при участии фактора элонгации Tu. Этот процесс требует затраты энергии и сопряжен с гидро лизом ГТФ и образованием прочно связанного комплекса Тu–ГТФ. Об разовавшийся комплекс подвергается диссоциации только в присутствии второго фактора элонгации Ts, при котором освободившийся фактор Tu может вновь, соединяясь с молекулой ГТФ, принять участие в доставке аа-тРНК в рибосому. Таким образом, в транслирующей 70S рибосоме в пептидильном центре располагается формилметионил-тРНК, а в А центре – аминоацил-тРНК (первая аминокислота после метионина). С этого момента начинается II стадия элонгации – образование первой пептидной связи. Для этого в рибосоме осуществляется ферментативная реакция транспептидирования между формилметионил-тРНК в П-центре и новой аа-тРНК в А-центре. В процессе этой реакции остаток формилметионина переносится на свободную NH2-группу аа-тРНК и замыкается первая пептидная связь в будущей полипептидной цепи. Параллельно из пеп тидильного центра освобождается тРНКфМет в цитозоль. Фермент, ка тализирующий реакцию транспептирования, получил название пептидил трансферазы (рис. 14.7);

он, вероятнее всего, является составной частью белков 50S субчастицы. Таким образом, в процессе транспептидазной реакции в А-центре образуется дипептидил-тРНК, а П-центр остается свободным («вакантным»).

На III стадии процесса элонгации необходимо иметь свободный амино ацильный центр для присоединения следующей аа-тРНК. Для этого благо даря процессу транслокации образовавшийся фрагмент дипептидил-тРНК переносится от аминоацильного на пептидильный центр. Достигается тРНК 50S 50S Пептидил трансфераза Рис. 14.7. Перенос фМет-тРНК между двумя центрами (П и А) на большой 50S субчастице рибосомы.

транслокация благодаря передвижению рибосомы относительно мРНК при участии фермента транслоказы (функцию ее выполняет фактор элонгации G у Е. coli и eEF-2 у эукариот) за счет использования энергии распада еще одной молекулы ГТФ. В результате транслокации дипептидил-тРНК за нимает место в пептидильном центре рибосомы, а аминоацильный центр освобождается для нового цикла узнавания и может присоединить новую следующую аа-тРНК, соответствующую кодону мРНК. В процессе транс локации рибосома перемещается вдоль мРНК по направлению к ее 3'-концу на расстояние в один кодон, т.е. точно на один триплет. На рис. 14.8 видно, что рибосома вступает в следующий цикл – происходит присоединение третьего аминокислотного остатка и т.д.

Таким образом, на стадии элонгации происходит последовательное наращивание полипептидной цепи по одной аминокислоте в строгом соответствии с последовательностью триплетов (кодонов) в молекуле мРНК.

Существенным является выяснение вопроса о количестве энергии, не обходимой для синтеза одной пептидной связи при биосинтезе белка. Как было отмечено, при активировании аминокислоты еще до стадии ини циации, т.е. при формировании аа-тРНК, расходуется энергия распада АТФ на АМФ и пирофосфат, что приблизительно эквивалентно гидролизу тРНК Аминоациль Пептидиль ный центр ный центр Пептидил трансфераза мРНК мРНК тРНК Пептидилтранс феразная реакция мРНК мРНК Рис. 14.8. Процесс элонгации полипептидной цепи (схема).

2 молекул АТФ до 2 молекул АДФ, поскольку пирофосфат подвергается распаду на 2 молекулы неорганического фосфата. Для включения амино ацил-тРНК в аминоацильный центр используется энергия гидролиза мо лекулы ГТФ на ГДФ и неорганический фосфат. Наконец, транслокация транслирующей 70S рибосомы также нуждается в энергии гидролиза еще одной молекулы ГТФ. Таким образом, энергетические потребности синтеза каждой пептидной связи эквивалентны энергии гидролиза 2 молекул АТФ и 2 молекул ГТФ (т.е. гидролиз четырех макроэргических фосфатных связей) до соответствующих нуклеозиддифосфатов. Легко представить, насколько велики энерготраты каждой клетки при синтезе не только одной молекулы белка, а множества молекул самых разнообразных белков в единицу времени.

Терминация трансляции. На IV стадии биосинтеза белка завершается синтез полипептидной цепи в 70S рибосоме при участии трех белковых факторов терминации (рилизинг-факторов). Эти белки обозначаются RF- (мол. масса 47000), RF-2 (мол. масса 35000–48000) и RF-3 (мол. масса 46000) у прокариот (см. табл. 14.1). В клетках животных открыт один единственный белок с аналогичным свойством – рилизинг-фактор R (eRF, мол. масса 56000–105000). У Е. coli RF-1 наделен свойством узнавания в молекуле мРНК терминирующих кодонов УАГ и УАА, a RF-2 – со ответственно УГА и УАА. Эукариотический рилизинг-фактор eRF узнает все три терминирующих кодона (нонсенс-кодоны) и индуцирует осво бождение синтезированного полипептида опосредованно через пептидил трансферазу. После того как терминирующий кодон мРНК занимает свое место в аминоацильном центре рибосомы, к нему присоединяется не тРНК, поскольку отсутствуют соответствующие антикодоны тРНК, узнающие этот терминальный сигнал, а один из белковых факторов терминации и блокируется далнейшая элонгация цепи. Считают, что терминирующие кодоны и белковые факторы индуцируют изменение специфичности пеп тидилтрансферазной активности таким образом, что она катализирует перенос растущей пептидной цепи, скорее, к молекуле воды, вызывая гидролиз, чем к аминогруппе аминокислоты. Следствием этого являются отделение белковой молекулы от рибосомы и освобождение молекул тРНК и мРНК (последняя подвергается распаду до свободных рибонуклеотидов).

Одновременно 70S рибосома диссоциирует на две субчастицы – 30S и 50S, которые поступают в свободный пул и могут вновь использоваться для реассоциации новой рибосомы. Схематически этот процесс представлен на рис. 14.9. ГТФ в терминации трансляции у Е. coli рассматривается в ка честве аллостерического регулятора, а у эукариотов ГТФ, вероятнее всего, распадается на ГДФ и Pi.

Н2O 50S RF + Белок RF П А + тРНК + мРНК + Продукты ГТФ 30S распада ГДФ + Pi мРНК Рис. 14.9. Процесс терминации синтеза белка (схема).

тРНК тРНК мРНК ДНК рРНК Рибосомные белки Ферменты Белковые факторы Свободные ГТФ рибосомы Рибонуклеотиды Полисома АА~ тРНК Энзиматический распад мРНК АА~АМФ PPi АТФ АА Полипептидная цепь Рис. 14.10. Схематическое изображение роли разных типов РНК в синтезе белка (по Уотсону).

50S 50S 50S 50S 50S мРНК 30S 30S 30S 30S 30S Рис. 14.11. Схематическое изображение организации бактериальной полирибосомы (полисомы) и движения рибосом вдоль мРНК.

В общей форме зависимость между репликацией ДНК, транскрипцией и трансляцией мРНК представлена на рис. 14.10. Видно, что одна мат ричная мРНК транслируется не одной рибосомой, а одновременно многими рибосомами, расположенными близко друг к другу. Подобные скопления рибосом на мРНК получили название полирибосом, или полисом (рис. 14.11). Они значительно повышают эффективность использования мРНК, т.е. ускоряют синтез белка.

Рибосомы движутся в направлении 5' –> 3' вдоль цепи мРНК, причем каждая рибосома работает самостоятельно, синтезируя отдельный белок.

Полисома, таким образом, позволяет обеспечить высокую скорость транс ляции единственной мРНК (см. рис. 14.11).

ТРАНСПОРТ СИНТЕЗИРОВАННЫХ БЕЛКОВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ Помимо использования белков для нужд самой клетки, многие так на зываемые экспортируемые (секретируемые) белки, которые функционируют вне клетки, подвергаются переносу через клеточную мембрану при помощи особых низкомолекулярных пептидов (от 15 до 30 аминокислотных остат ков), получивших название лидирующих, или сигнальных, пептидов.

Особенность их состава – преимущественное содержание гидрофобных ра дикалов, что позволяет им легко проникать через бислойную липидную мембрану или встраиваться в мембрану. Эти сигнальные последователь ности в рибосомах образуются первыми с N-конца при синтезе белка по программе сигнальных кодонов, расположенных сразу после инициатор ного кодона, и легко узнаются рецепторными участками мембраны эндо плазматической сети. При этом образуется комплекс между мРНК, ри босомой и мембранными рецепторными белками, формируя своеобразный канал в мембране, через который сигнальный пептид проникает внутрь цистерны эндоплазматического ретикулума, увлекая и протаскивая за собой синтезируемую и растущую молекулу секреторного белка. В процессе прохождения или после проникновения полипептида в цистерны N-концевая сигнальная последовательность отщепляется под действием специфической лидирующей (сигнальной) пептидазы, а зрелый белок через пластинчатый комплекс (аппарат Гольджи) покидает клетку в форме секреторного пу зырька. Следует указать на возможность активного участия в транспорте белков и других полимерных молекул через мембраны, помимо сигнальных пептидов, также особых белков – поринов, химическая природа и ме ханизм действия которых выяснены пока недостаточно.

СИНТЕЗ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ БЕЛКОВ В митохондриях клеток высших организмов (см. главу 13) содержится до 2% клеточной ДНК, отличающейся от ДНК ядра по массе и структуре.

Митохондрии имеют весь аппарат, включая рибосомы, тРНК и мРНК, необходимый для синтеза определенных белков. Синтезируемые в мито хондриях белки являются нерастворимыми белками и участвуют в ос новном в организации структуры этих же органелл, в то время как местом синтеза растворимых митохондриальных белков являются рибосомы цито плазмы, откуда они затем транспортируются в митохондрии. Рибосомы в митохондриях имеют меньший размер, чем 80S рибосомы в цитоплазме.

Интересно отметить, что в качестве инициирующей аминокислоты при синтезе белка в митохондриях эукариот может участвовать N-формил метионин, а не свободный метионин, как в цитоплазме. Это обстоятельство свидетельствует о том, что митохондриальный синтез белка по своему механизму, очевидно, близок к синтезу белка у прокариот.

ПОСТСИНТЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ На V, последней, стадии синтеза белка происходят формирование тре тичной структуры и процессинг молекулы полипептида. Синтезированная на рибосоме в строгом соответствии с генетической программой линейная одномерная полипептидная молекула уже содержит определенную инфор мацию. Такая молекула называется конформационной, т.е. она претер певает не хаотичные структурные изменения, а подвергается превращению (процессингу) в строго определенное трехмерное тело, которое само на делено информацией, но уже функциональной. Указанное положение спра ведливо для молекул белков, выполняющих в основном структурные функции, но не для биологически неактивных молекул предшественни ков белков, функциональная активность которых проявляется позже в результате разнообразных превращений, объединенных понятием «пост синтетическая, или посттрансляционная, модификация». Подоб ные модификации структуры полипептида начинаются или сразу после трансляции, или еще до окончания формирования третичной структуры белковой молекулы.

Помимо указанного процесса протеолитического удаления сигнального пептида, во многих белках отщепляется начальный N-концевой метионин.

Оказалось, что в прокариотических клетках имеются особые ферменты, модифицирующие N-концевые остатки, в частности деформилаза, ката лизирующая отщепление формильной группы от N-концевого метионина, а также аминопептидазы, катализирующие отщепление не только N-кон цевого формилметионина (или метионина у эукариот), но, возможно, и других остатков аминокислот с N-конца пептида. Аналогичному так называемому ограниченному постсинтетическому протеолизу подвергают ся некоторые пробелки, или проферменты (например, трипсиноген, химо трипсиноген и др.), и предшественники гормонов (например, препроинсу лин, пре--липотропин и др.). В ряде случаев наблюдается и С-концевая модификация синтезированного белка.

Как известно, участок ДНК, несущий информацию о синтезе индиви дуального белка, называется геном, а участок, контролирующий синтез единственной полипептидной цепи и ответственный за него,– цистроном.

Следовательно, если белок состоит из нескольких (более одного) поли пептидов, то естественно предположить, что в синтезе такого белка должны участвовать несколько (более одного) цистронов. Это не всегда соответст вует действительности, особенно если полипептидные цепи идентичны (например, 2- и 2-цепи гемоглобина). Если, например, пептидные цепи какой-либо одной белковой молекулы являются неидентичными, то это не всегда означает, что они синтезируются как результат действия разных цистронов. Подобный белок может синтезироваться в виде единственной полипептидной цепи с последующими протеолитическими разрывами в одном или нескольких местах и отщеплением неактивных участков. Типич ным примером подобной модификации является гормон инсулин, синтези рующийся в виде единого полипептида препроинсулина, который после ферментативного гидролиза превращается сначала в неактивный предшест венник проинсулин, а затем в активный гормон инсулин, содержащий две разных размеров и последовательности полипептидные цепи (см. рис. 1.14).

Следует подчеркнуть, однако, что значительно больший удельный вес имеет посттрансляционная химическая модификация белков, затрагивающая радикалы отдельных аминокислот. Одной из таких существенных моди фикаций является ковалентное присоединение простетической группы к молекуле белка. Например, только после присоединения пи ридоксальфосфата к -аминогруппе остатка лизина белковой части – апо ферменту – образуется биологически активная трехмерная конфигурация аминотрансфераз, катализирующих реакции трансаминирования амино кислот. Некоторые белки подвергаются гликозилированию, присоединяя олигосахаридные остатки (образование гликопротеинов), и обеспечивают тем самым доставку белков к клеткам-мишеням. Широко представлены химические модификации белков в результате реакции гидроксили рования остатков пролина, лизина (при формировании молекул колла гена), реакции метилирования (остатки лизина, глутамата), ацети лирования ряда N-концевых аминокислот, реакции карбоксилиро вания остатков глутамата и аспартата ряда белков (добавление экстра карбоксильной группы). В частности, протромбин (белок свертывающей системы крови) содержит ряд -карбоксиглутаматных остатков на N-конце, в образовании которых активное участие принимает витамин К, содер жащий фермент. Предполагают, что -карбоксиглутаматные остатки при нимают участие в связывании ионов Са2+, необходимых для инициации свертывания крови.

Одной из широко распространенных химических постсинтетических модификаций является фосфорилирование остатков серина и треонина, например, в молекуле гистоновых и негистоновых белков, а также казеина молока. Фосфорилирование-дефосфорилирование ОН-группы серина аб солютно необходимо для множества ферментов, например для активности гликоген-фосфорилазы и гликоген-синтазы. Фосфорилирование некоторых остатков тирозина в молекуле белка в настоящее время рассматривается как один из возможных и специфических этапов формирования онкобелков при малигнизации нормальных клеток. Хорошо известны также реакции окисления двух остатков цистеина и образование внутри- и межцепочечных дисульфидных связей при формировании третичной структуры (фолдинг).

Этим обеспечивается не только защита от внешних денатурирующих агентов, но и образование нативной конформации и проявление био логической активности.

Менее известны реакции фарнезилирования остатков цистеина ряда белков: белка G (см. главу 8), группы белков ядерного матрикса, а также белков-онкогенов ras и протоонкогенов;

источником изопрениль ных групп является фарнезил-пирофосфат (промежуточный продукт при синтезе холестерина). Получены доказательства, что блокирование реакции фарнезилирования, вызванное специфическими препаратами (ингибитора ми), приводит к потере канцерогенной активности онкогена ras. Эти результаты могут служить основой для разработки эффективных средств борьбы с опухолевыми заболеваниями человека, основанными на инги бировании посттрансляционной модификации белков вообще или онко белков в частности.

Следует отметить, что, хотя биосинтез белка, представляющий сложный многоступенчатый процесс, подробно описан во многих обзорах и мо нографиях, наши знания о структурно-функциональных взаимоотношениях многих его этапов все еще недостаточны. Действительно, выделены и охарактеризованы рибосомы (более полно у Е. coli), состоящие из мно жества индивидуальных белков и 3 типов молекул РНК;

более того, выяснена аминокислотная последовательность всех 55 белковых молекул, первичная и вторичная структура 3 типов РНК, интенсивно изучается трехмерная структура отдельных белков рибосом прокариот. Тем не менее многие существенные детали механизма белкового синтеза неясны. На пример, недостаточно известно, какие участки или составные части рибосом ответственны за инициацию, элонгацию и терминацию белкового синтеза;

каков молекулярный механизм процессов транслокации, пептидилтранс феразной реакции;

каковы тонкие взаимодействия рибосом с белковыми факторами, мРНК, тРНК и антибиотиками. Потребуется еще немало усилий для определения полной молекулярной архитектуры рибосом и отдельных ее субчастиц, а также для выяснения и получения точных данных об их третичной структуре, форме и размерах, достаточных для раскрытия на молекулярном уровне функций рибосомы в сложном процессе синтеза белка.

Внерибосомный механизм синтеза пептидов. Накопленные данные, дей ствительно, свидетельствуют о том, что матричный механизм синтеза лежит в основе биосинтеза почти всех белков живых организмов. Тем не менее синтез ряда низкомолекулярных (коротких) пептидов в биологи ческих системах может осуществляться не только без участия нуклеиновых кислот, в частности без матричной мРНК, но даже в отсутствие рибосом.

Еще на X Международном биохимическом конгрессе в Гамбурге в 1976 г.

Ф. Липман (США) и К. Курахаси (Япония) представили экспериментальные доказательства синтеза двух природных циклических пептидных анти биотиков – грамицидина S и тироцидина как в цельных экстрактах, по лученных из Bacillus brevis, так и в изолированных из экстрактов белковых фракциях. В частности, выделенные из экстрактов В. brevis и очищенные два белковых препарата обеспечивали точность сборки циклического поли пептида – грамицидина S, состоящего из 10 аминокислотных остатков, расположенных в строгой последовательности. Очищенные белковые фрак ции (с мол. массами 100000 и 180000) требовали присутствия только свободных аминокислот, АТФ и ионов Mg2+ для синтеза этого цикли ческого декапептида (О-фенилаланилпролилвалилорнитиллейцин)2:

Показано, что именно легкая белковая фракция (мол. масса 100000) обеспечивает рацемизирование и включение D-фенилаланина в первую полипептидную цепь, а тяжелая фракция (мол. масса 180000) – включение 4 остальных L-аминокислот;

оба фермента принимают участие также и в образовании пептидных связей. Аналогично синтезируется такой же пентапептид на расположенном рядом мультиферментном комплексе, за тем оба пентапептида соединяются по типу «голова» к «хвосту» с за мыканием цепи и образованием циклического декапептида. В механизме синтеза предполагается предварительное образование аминоациладенилатов (при участии этих же ферментов), из которых остатки аминокислот затем переносятся на SH-группы обоих ферментов. При этом образуются ак тивированные промежуточные тиоэфиры, подобные тиоэфирам при синтезе высших жирных кислот (см. главу 11). В структуре первого (легкого) фермента открыт ковалентно связанный остаток фосфопантотеина, поэтому предполагают участие его тиоловой группы в переносе растущей пептидной цепи с одного участка фермента на другой. Аналогичный механизм синтеза доказан также для антибиотика тироцидина (декапептид) и для 13-членного циклического пептида – антибиотика микобациллина.

Таким образом, природа (условно в лице бактериальной клетки), оче видно, не утратила полностью существовавшего до матричного, рибо сомного, пути атавистического механизма синтеза белковых тел и поль зуется для этого весьма примитивными, но достаточно эффективными приемами.

РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКА Основным условием существования любых живых организмов является наличие тонкой, гибкой, согласованно действующей системы регуляции, в которой все элементы тесно связаны друг с другом. В белковом синтезе не только количественный и качественный состав белков, но и время синтеза имеют большое значение. От этого зависит приспособление микроорга низмов к условиям окружающей питательной среды как биологической необходимости или приспособление сложного многоклеточного организма к физиологическим потребностям при изменении внутренних и внешних условий.

Клетки живых организмов обладают способностью синтезировать ог ромное количество разнообразных белков. Однако они никогда не син тезируют все белки. Количество и разнообразие белков, в частности ферментов, определяются степенью их участия в метаболизме. Более того, интенсивность обмена регулируется скоростью синтеза белка и парал лельно контролируется аллостерическим путем (см. главу 4). Таким об разом, синтез белка регулируется внешними и внутренними факторами и условиями, которые диктуют клетке синтез такого количества белка и такого набора белков, которые необходимы для выполнения физиоло гических функций. Все это свидетельствует о весьма сложном, тонком и целесообразном механизме регуляции синтеза белка в клетке.

Общую теорию регуляции синтеза белка разработали французские ученые, лауреаты Нобелевской премии Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» или «включению» генов как функ ционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК ге нетическую информацию на синтез специфических белков. Эта теория, доказанная в опытах на бактериях, получила широкое признание, хотя в эукариотических клетках механизмы регуляции синтеза белка, вероятнее всего, являются более сложными (см. далее). У бактерий доказана индукция ферментов (синтез ферментов de novo) при добавлении в питательную среду субстратов этих ферментов. Добавление конечных продуктов реакции, образование которых катализируется этими же фер ментами, напротив, вызывает уменьшение количества синтезируемых фер ментов. Это последнее явление получило название репрессии синтеза ферментов. Оба явления – индукция и репрессия – взаимосвязаны.

Согласно теории Ф. Жакоба и Ж. Моно, в биосинтезе белка у бактерий участвуют по крайней мере 3 типа генов: структурные гены, ген-регулятор и ген-оператор. Структурные гены определяют первичную структуру син тезируемого белка. Именно эти гены в цепи ДНК являются основой для биосинтеза мРНК, которая затем поступает в рибосому и, как было указано, служит матрицей для биосинтеза белка. Регуляция синтеза белка путем индукции представлена на рис. 14.12.

Синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК непосредственно контролируется определенным участком, называемым геном-операто ром. Он служит как бы пусковым механизмом для функционирования структурных генов. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке струк турного гена или структурных генов, регулируемых им. «Считывание» генетического кода, т.е. формирование мРНК, начинается с промотора – участка ДНК, расположенного рядом с геном-оператором и являющегося точкой инициации для синтеза мРНК, и распространяется последовательно вдоль оператора и структурных генов. Синтезированную молекулу мРНК, кодирующую синтез нескольких разных белков, принято называть по лигенным (полицистронным) транскриптом. Координированный одним оператором одиночный ген или группа структурных генов образует оперон.

В свою очередь деятельность оперона находится под контролирующим влиянием другого участка цепи ДНК, получившего название гена-регу лятора. Структурные гены и ген-регулятор расположены в разных участках цепи ДНК, поэтому связь между ними, как предполагают Оперон Структурные гены ГР ГО П 2 ДНК Транскрипция Репрессор (неактивный) мРНК Полисома Репрессор Индуктор Трансляция (активный) Белки 2 Рис. 14.12. Регуляция синтеза белка путем индукции (схема).

ГР - ген-регулятор;

П - промотор;

ГО - ген-оператор.

Ф. Жакоб и Ж. Моно, осуществляется при помощи вещества-посредника, оказавшегося белком и названного репрессором. Образование репрес сора происходит в рибосомах ядра на матрице специфической мРНК, синтезированной на гене-регуляторе (рис. 14.13). Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Образование такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, следо вательно, синтеза белка, т.е. функция гена-регулятора состоит в том, чтобы через белок-репрессор прекращать (запрещать) деятельность структурных генов, синтезирующих мРНК. Репрессор, кроме того, обладает способ ностью строго специфически связываться с определенными низкомоле кулярными веществами, называемыми индукторами, или эффекто рами. Если такой индуктор соединяется с репрессором, то последний теряет способность связываться с геном-оператором, который, таким об разом, выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК. Это типичный пример отрицательной формы контроля, когда индуктор, соединяясь с белком-репрессором, вызывает изменения его тре тичной структуры настолько, что репрессор теряет способность связываться с геном-оператором. Процесс этот аналогичен взаимоотношениям алло стерического центра фермента с эффектором, под влиянием которого изменяется третичная структура фермента и он теряет способность свя зываться со своим субстратом.

Механизм описанной регуляции синтеза белка и взаимоотношения репрессора со структурными генами были доказаны в опытах с Е. coli на примере синтеза -галактозидазы (лактазы) – фермента, расщепляющего молочный сахар на глюкозу и галактозу. Дикий штамм Е. coli обычно растет на глюкозе. Если вместо глюкозы в питательную среду добавить лактозу (новый источник энергии и углерода), то штамм не будет расти, пока не будут синтезированы соответствующие ферменты (адаптивный синтез). При поступлении в клетку лактозы (индуктор) молекулы ее свя зываются с белком-репрессором и блокируют связь между репрессором и геном-оператором. Ген-оператор и структурные гены при этом начинают снова функционировать и синтезировать необходимую мРНК, которая Оперон Структурные гены ГР П ГО 1 2 Транскрипция Репрессор (активный) Репрессор Корепрессор (конечный продукт) (неактивный) Рис. 14.13. Регуляция синтеза белка путем репрессии (схема).

Обозначения те же, что на рис. 14.12.

«дает команду» рибосомам синтезировать -галактозидазу. Одновременно ген-регулятор продолжает вырабатывать репрессор, но последний бло кируется новыми молекулами лактозы, поэтому синтез фермента про должается. Как только молекулы лактозы будут полностью расщеплены, репрессор освобождается и, поступив в ДНК, связывает ген-оператор и блокирует синтез мРНК, а следовательно, синтез -галактозидазы в рибосомах.

Таким образом, биосинтез мРНК, контролирующий синтез белка в рибосомах, зависит от функционального состояния репрессора. Этот реп рессор представляет собой тетрамерный белок с общей мол. массой около 150000. Если он находится в активном состоянии, т.е. не связан с ин дуктором, то блокирует ген-оператор и синтеза мРНК не происходит. При поступлении метаболита – индуктора – в клетку его молекулы связывают репрессор, превращая его в неактивную форму (или, возможно, снижают его сродство к гену-оператору). Структурные гены выходят из-под за прещающего контроля и начинают синтезировать нужную мРНК.

Как было указано, концентрация ряда ферментов в клетках резко снижается при повышении содержания отдаленных конечных продуктов, образующихся в цепи последовательных ферментативных реакций. Такой эффект, получивший название репрессии ферментов, часто наблю дается при реакциях биосинтеза. В этих случаях молекулы репрессора, также образующиеся в рибосомах ядра по «команде» гена-регулятора, являются неактивными и сами по себе не обладают способностью по давлять деятельность гена-оператора и, следовательно, всего оперона, но приобретают такую способность после образования комплекса с конечным или одним из конечных продуктов биосинтетического процесса (см.

рис. 14.13).

Конечный продукт выступает, таким образом, в качестве корепрес сора. Имеются данные, что в качестве корепрессоров в синтезе ферментов обмена аминокислот, по-видимому, выступает не только свободная амино кислота как конечный продукт биосинтетической реакции, но и комплекс ее с тРНК – аминоацил-тРНК.

В регуляции экспрессии структурных генов специфическое участие при нимает особый белок – катаболитный генактивирующий белок (от англ.

catabolite gene activation protein, сокращенно CAP). Этот белок, взаимо действующий с цАМФ, образует комплекс, способствующий прикреплению РНК-полимеразы к промоторному участку генома. В присутствии комп лекса САР-цАМФ фермент может начать транскрипцию оперона, включая структурные гены, т.е. в клетках имеется еще один, дополнительный САР-цАМФ-регулятор, действующий, скорее всего, в качестве положи тельного регулятора, поскольку его присутствие необходимо для начала экспрессии гена.

Таким образом, концепция Ф. Жакоба и Ж. Моно о механизме про явления (экспрессии) активности генов признана одним из блестящих достижений молекулярной биологии. Она явилась логическим развитием многочисленных исследований, проведенных генетиками и биохимиками в предшествующие десятилетия.

Регуляция экспрессии активности генов у эукариот осуществляется значительно более сложным путем, поскольку процессы транскрипции и трансляции разделены не только пространственно ядерной биомембра ной, но и во времени. Эта регуляция базируется как минимум на 6 уровнях сложных биологических процессов, определяющих скорость синтеза и распада генетического продукта (рис. 14.14).

Для большинства эукариотических клеток, как и клеток прокариот, стадия инициации транскрипции является основной, главной регуляторной точкой экспрессии активности генов. Тем не менее имеются существенные различия: во-первых, место процессов транскрипции (в ядре) и трансля ции (в цитоплазме);

во-вторых, активирование транскрипции у эукари от связано с множеством сложных изменений структуры хроматина в транскрибируемой области;

в-третьих, в эукариотических клетках пре валируют положительные регуляторные механизмы над отрицатель ными.

Положительная или отрицательная регуляция определяется типом бел ков, вовлеченных в механизм регуляции. Получены доказательства су ществования минимум 3 типов белков, участвующих в регуляции процесса инициации транскрипции, опосредованного через РНК-полимеразу:

специфические факторы, репрессоры и активаторы. Первые вы зывают изменение специфичности РНК-полимеразы к данному промотору или группе промоторов;

репрессоры связываются с промотором, блокируя тем самым доступ РНК-полимеразы к промотору;

активаторы, напротив, связываются вблизи промоторного участка, повышая связывание промо тора и РНК-полимеразы.

В многоклеточных организмах среднее число регуляторных сайтов для одного гена минимум равно пяти;

положительные регуляторные белки связываются со своими специфическими последовательностями в структуре ДНК (вероятнее всего, посредством водородных связей между амидной группой Глн или Асн и пуриновыми и пиримидиновыми основаниями нуклеотидов). Следует указать еще на один момент, почему эукариоти ческая клетка использует положительные механизмы регуляции экспрессии генов. Подсчитано, что в геноме человека содержится около 100000 генов, соответственно каждая клетка при отрицательном механизме регуляции могла бы синтезировать 100000 разных репрессоров, причем в достаточных количествах. При положительном механизме регуляции большинство генов в принципе неактивно, соответственно молекула РНК-полимеразы не свя зывается с промотором и клетка синтезирует ограниченный и избира тельный круг активаторных белков, необходимых для инициации транс крипции.

Структурный ген П ГО ДНК Транскрипция Первичный транскрипт Нуклеотиды Посттранскрипционный Распад мРНК процессинг мРНК Трансляция Аминокислоты БЕЛОК (неактивный) Посттрансляционный процессинг Распад белка БЕЛОК (активный) Рис. 14.14. Схематическое изображение регуляции экспрессии активности гена у эукариот.

У эукариот выделены и охарактеризованы также пять регуляторных белков, получивших название транскрипционных факторов (TF: IIА, IIВ, IID, IIЕ и IIF). Они необходимы для узнавания участка (сайта) ДНК, названного TATA (concensus последовательности, ТАТАААА). Деталь ный молекулярный механизм действия факторов транскрипции пока не раскрыт.

Более подробно в структурном и функциональном отношении у эука риот изучена группа белков, получивших название белков – актива торов транскрипции. Эти белки имеют специфические структурные домены для связывания с другими, но определенными регуляторными нуклеотидными последовательностями в молекуле ДНК. В частности, они содержат домен, специфически связывающийся с ДНК, и один или не сколько доменов, необходимых для активирования или взаимодействия с другими регуляторными белками. Среди этих белков – активаторов транскрипции имеются белки, содержащие богатые глутамином домены (до 25%) и богатые пролином домены. Следует отметить, однако, что не которые из них или почти все регуляторные белки активируют транс крипцию не прямо, а опосредованно – через промежуточные белки, назван ные коактиваторами. Происхождение и механизм действия последних также не выяснены.

Современные знания о механизмах регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном и посттрансляционном уровнях (см. рис. 14.4) были подробно рассмотрены ранее (см. главы 13 и 14).

Рассмотрим кратко вопрос о регуляции процессов дифференцировки клеток высших организмов. ДНК, присутствующая во всех соматических клетках, вероятнее всего, имеет одинаковую первичную структуру у дан ного организма и соответственно располагает информацией для синтеза любых или всех белков тела. Тем не менее клетки печени, например, синтезируют сывороточные белки, а клетки молочной железы – белки мо лока. Нет сомнения в том, что в дифференцированных клетках имеется весьма тонкий механизм контроля деятельности ДНК в разных тканях, обеспечивающий синтез многообразия белков.

Механизмы, лежащие в основе этой регуляции, пока неизвестны. Для их объяснения существует ряд гипотез. Предполагают, что контроль осу ществляется на уровне транскрипции по аналогии с индукцией ферментов у бактерий и что в этом случае в клетках животных должны функциони ровать аналогичные репрессоры. С молекулой ДНК у эукариот связаны гистоны, поэтому считается, что именно эти белки выполняют роль репрессоров. Прямых доказательств их роли в качестве репрессоров не получено, хотя, как было показано, в клетках эукариот открыт класс регуляторных белков процесса транскрипции. Высказано предположение, что в ядре синтезируется высокомолекулярная молекула мРНК, содер жащая информацию для синтеза широкого разнообразия белков, но в цитоплазму попадает только небольшая часть зрелой мРНК, а основная часть ее распадается. Неясны, однако, биологический смысл и назначение этого механизма избирательного распада и соответственно траты огромной массы молекулы мРНК.

Существует еще одно предположение, что на ДНК клетки синтези руются все мыслимые, возможные мРНК, которые поступают в цито плазму, и процесс трансляции регулируется путем специфического и из бирательного взаимодействия рибосом с определенными молекулами мРНК.

Ингибиторы синтеза белка Один из путей выяснения тонких молекулярных механизмов синтеза нуклеиновых кислот и белков в клетках – использование таких лекарст венных препаратов, которые могли бы избирательно тормозить эти про цессы у бактерий, не влияя на клетки организма человека. Некоторые препараты, действительно, оказывают такое избирательное действие, взаимодействуя с белками рибосом прокариот и выключая бактериальный синтез белка. Однако многие из них являются токсичными и для человека.

В настоящее время в медицинской практике применяются многие анти биотики, часть из которых будет рассмотрена с целью выяснения мо лекулярного механизма их действия на ключевые химические реакции синтеза белка и нуклеиновых кислот.

Один из мощных ингибиторов белкового синтеза – пуромицин. Он пред ставляет собой аналог концевого участка аминоацил-тРНК адениловой кислоты и поэтому легко взаимодействует с А-центром пептидил-тРНК с образованием пептидил-пуромицина *:

Пуромицин Пептидил-пуромицин не несет на себе триплета антикодона и поэтому тормозит элонгацию пептидной цепи, вызывая обрыв реакции, т.е. прежде временную терминацию синтеза белка. При помощи пуромицина было доказано, например, что гормональный эффект в ряде случаев зависит от синтеза белка de novo. Укажем также, что пуромицин оказывает тормо зящее действие на синтез белка как у прокариот, так и у эукариот.

Белковый синтез тормозится актиномицином D, обладающим противо опухолевым эффектом, однако вследствие высокой токсичности препарат применяется редко. Он тормозит синтез всех типов клеточной РНК, особенно мРНК. Данное свойство объясняется тормозящим влиянием актиномицина D на ДНК-зависимую РНК-полимеразу, поскольку он свя зывается с остатками дезоксигуанозина цепи ДНК, выключая матричную функцию последней;

это дает основание считать, что актиномицин D ин гибирует транскрипцию ДНК.

Другим антибиотиком, также тормозящим синтез клеточной РНК, является используемый при лечении туберкулеза рифамицин. Этот препарат тормозит ДНК-зависимую РНК-полимеразу, связываясь с ферментом.

Наиболее чувствительной к нему оказалась бактериальная РНК-полиме раза. На организм животных этот антибиотик оказывает незначительное влияние. По механизму действия он резко отличается от актиномицина D.

Следует указать, кроме того, на недавно открытое противовирусное действие рифамицина;

в частности, он успешно используется при лечении трахомы, которая вызывается ДНК-содержащим вирусом. Это дает ос нование предположить, что данный антибиотик найдет применение в клинической онкологии при лечении опухолей, вызываемых вирусами.

* Пуромицин является структурным аналогом тирозинил-тРНК. Связываясь с амино ацильным центром рибосомы, он тормозит связывание новой аа-тРНК на стадии элонгации синтеза белка.

Одним из мощных ингибиторов синтеза вирусной РНК оказался азидотимидин (3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин), синтезированный еще в 1964 г. в надежде на его противоопухолевый эффект. Было показано, что вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) содержит РНК-й геном, в составе которого имеются как стандартные гены ретровирусов, так и необычные небольшие гены со множеством функций. Последние, в частности, под вержены мутациям с высокой скоростью вследствие низкой точности репликации, вызванной свойствами обратной транскриптазы. Эта вирусная обратная транскриптаза иммунодефицита человека оказалась наделенной значительно большим сродством к азидотимидину, чем к природному дезокситимидинтрифосфату (dTТФ). Азидотимидин конкурентно тормозит связывание dTТФ, вызывая тем самым терминацию (окончание) синтеза вирусной РНК.

Азидотимидин Выяснены некоторые детали механизма действия ряда других анти биотиков, используемых при лечении тифозных инфекций. Так, хлорам феникол оказывает ингибирующее влияние на пептидилтрансферазную реакцию (на стадии элонгации) синтеза белка в 70S рибосоме бактерий;

на этот процесс в 80S рибосоме он не действует. Тормозит синтез белка в 80S рибосоме (без поражения процесса в 70S рибосоме) циклогексимид – специ фический ингибитор транслоказы.

Весьма интересен молекулярный механизм действия дифтерийного ток сина. Он оказался наделенным способностью катализировать реакцию АДФ-рибозилирования фактора элонгации эукариот (eEF-2), выключая тем самым его из участия в синтезе белка. Резистентность многих животных к дифтерийному токсину, вероятнее всего, обусловлена трудностью или полным отсутствием проникновения (транспорта) токсина через мембрану клеток.

Противотуберкулезные и антибактериальные антибиотики, в частности стрептомицин и неомицин, действуют на белоксинтезирующий аппарат чувствительных к ним штаммов бактерий. Было высказано предположение, что эти антибиотики обусловливают ошибки в трансляции мРНК, при водящие к нарушению соответствия между кодонами и включаемыми аминокислотами: например, кодон УУУ вместо фенилаланина начинает кодировать лейцин, в результате чего образуется аномальный белок, что приводит к гибели бактерий.

Широко применяемые в клинике тетрациклины также оказались ин гибиторами синтеза белка в 70S рибосоме (меньше тормозится синтез в 80S рибосоме). Они легко проникают через клеточную мембрану. Считают, что тетрациклины тормозят связывание аминоацил-тРНК с аминоацильным центром в 50S рибосоме. Возможно, что тетрациклины химически свя зываются с этим центром, выключая тем самым одну из ведущих стадий процесса трансляции.

Пенициллины не являются истинными ингибиторами синтеза белка, однако их антибактериальный эффект связан с торможением синтеза гексапептидов, входящих в состав клеточной стенки. Механизм их синтеза отличается от рибосомного механизма синтеза белка. Эритромицин и олеандомицин тормозят активность транслоказы в процессе трансляции, подобно циклогексимиду, исключительно в 80S рибосомах, т.е. тормозят синтез белка в клетках животных.

Полученные к настоящему времени данные о механизме действия антибиотиков на синтез белка с учетом стадии и топографии процесса трансляции суммированы в табл. 14.2 (по Харперу с небольшими из менениями).

Таблица 14.2. Антибиотики – ингибиторы трансляции Эукариоты Стадия трансляции Прокариоты цитоплазма митохондрия I. Инициация Ауринтрикарбоновая кислота – – + II. Элонгация ? ?

Амицетин + – ?

Анизомицин + ?

– Линкомицин + Неомицин + + + Пуромицин + + + Спарсомицин + + + Тетрациклины – + + ? ?

Фузидовая кислота + Хлорамфеникол – + + Циклогексимид – – + III. Терминация ?

Амицетин ? + ? ?

Анизомицин * ? ?

Линкомицин + Спарсомицин + + + Стрептомицин + + + Хлорамфеникол – – + Эритромицин – + + Условные обозначения: + торможение;

– отсутствие торможения;

* стимулирование;

? неизвестно.

Следует еще раз подчеркнуть, что нарушение или выпадение любого звена, участвующего в синтезе белка, почти всегда приводит к развитию патологии, причем клинические проявления болезни будут определяться природой и функцией белка, синтез которого оказывается нарушенным (структурный или функциональный белок). Иногда синтезируются так называемые аномальные белки как результат действия мутагенных фак торов и соответственно изменения генетического кода (например, гемогло бин при серповидно-клеточной анемии). Последствия этих нарушений могут выражаться в развитии самых разнообразных синдромов или за канчиваться летально.

Следует отметить, однако, что организм располагает мощными ме ханизмами защиты. Подобные изменения генетического аппарата быстро распознаются специфическими ферментами – рестриктазами, измененные последовательности вырезаются и вновь замещаются соответствующими нуклеотидами при участии полимераз и лигаз.

Глава ВЗАИМОСВЯЗЬ ПРОЦЕССОВ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ В ОРГАНИЗМЕ Живой организм и его функционирование находятся в постоянной за висимости от окружающей среды. Интенсивность обмена с внешней средой и скорость внутриклеточных процессов обмена веществ поддерживают постоянство внутренней среды и целостность организма.

Как было указано, обмен веществ в организме человека протекает не хаотично;

он интегрирован и тонко настроен. Все превращения орга нических веществ, процессы анаболизма и катаболизма тесно связаны друг с другом. В частности, процессы синтеза и распада взаимосвязаны, ко ординированы и регулируются нейрогормональными механизмами, при дающими химическим процессам нужное направление. В организме че ловека, как и в живой природе вообще, не существует самостоятельного обмена белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот. Все превращения объединены в целостный процесс метаболизма, подчиняющийся диалекти ческим закономерностям взаимозависимости и взаимообусловленности, допускающий также взаимопревращения между отдельными классами ор ганических веществ. Подобные взаимопревращения диктуются физиоло гическими потребностями организма, а также целесообразностью замены одних классов органических веществ другими в условиях блокирования какого-либо процесса при патологии.

Еще Кребс и Корнберг отмечали, что, несмотря на огромное разно образие пищевых веществ (белки, жиры, углеводы), число химических реакций, обеспечивающих их превращения (распад) и образование энергии, «удивительно мало». Эти закономерности свойственны как организму животных и человека, так и микроорганизмам и растениям.

В настоящее время экспериментально обосновано существование че тырех главных этапов распада молекул углеводов, белков и жиров, которые интегрируют образование энергии из основных пищевых источников. На I этапе полисахариды расщепляются до моносахаридов (обычно гексоз);

жиры распадаются на глицерин и высшие жирные кислоты, а белки – на составляющие их свободные аминокислоты. Следует подчеркнуть, что указанные процессы в основном являются гидролитическими, поэтому освобождающаяся в небольшом количестве энергия почти целиком ис пользуется организмами в качестве тепла.

На II этапе мономерные молекулы (гексозы, глицерин, жирные кислоты и аминокислоты) подвергаются дальнейшему распаду, в процессе которого образуются богатые энергией фосфатные соединения и ацетил КоА. В частности, при гликолизе гексозы расщепляются до пировиноград ной кислоты и далее до ацетил-КоА. Этот процесс сопровождается об разованием ограниченного числа богатых энергией фосфатных связей путем субстратного фосфорилирования. На этом этапе высшие жирные кислоты аналогично распадаются до ацетил-КоА, в то время как глицерин окисля ется по гликолитическому пути до пировиноградной кислоты и далее до ацетил-КоА. Для аминокислот ситуация на II этапе несколько отлична. При преимущественном использовании аминокислот в качестве источника энер гии (при дефиците углеводов или при сахарном диабете) некоторые из них непосредственно превращаются в метаболиты лимоннокислого цикла (глутамат, аспартат), другие – опосредованно через глутамат (пролин, гистидин, аргинин), третьи – в пируват и далее в ацетил-КоА (аланин, серин, глицин, цистеин). Наконец, ряд аминокислот, в частности лейцин, изо лейцин, расщепляется до ацетил-КоА, а из фенилаланина и тирозина, помимо ацетил-КоА, образуется оксалоацетат через фумаровую кислоту.

Как видно, II этап можно назвать этапом образования ацетил-КоА, являющегося по существу единым (общим) промежуточным продуктом катаболизма основных пищевых веществ в клетках.

На III этапе ацетил-КоА (и некоторые другие метаболиты, например -кетоглутарат, оксалоацетат) подвергаются окислению («сгоранию») в цикле ди- и трикарбоновых кислот Кребса. Окисление сопровождается образованием восстановленных форм НАДН + Н+ и ФАДН2.

На IV этапе осуществляется перенос электронов от восстановленных нуклеотидов на кислород (через дыхательную цепь). Он сопровождается образованием конечного продукта – молекулы воды. Этот транспорт электронов сопряжен с синтезом АТФ в процессе окислительного фосфо рилирования (см. главу 9).

Необходимо отметить, что, помимо взаимных переходов между раз ными классами веществ в организме, доказано существование более слож ных форм связи. В частности, интенсивность и направление любой хи мической реакции определяются ферментами, т.е. белками, которые ока зывают непосредственное влияние на обмен липидов, углеводов и нук леиновых кислот. В свою очередь синтез любого белка-фермента требует участия ДНК и всех 3 типов рибонуклеиновых кислот: тРНК, мРНК и рРНК. Если к этому добавить влияние гормонов, а также продуктов распада какого-либо одного класса веществ (например, биогенных аминов) на обмен других классов органических веществ, то становятся понятными удивительная согласованность и координированность огромного разно образия химических процессов, совершающихся в организме. Многие из этих процессов были подробно освещены при описании обмена отдельных классов веществ (см. главы 10-12). В данной главе кратко представлены примеры взаимных переходов отдельных структурных элементов белков, жиров, углеводов (рис. 15.1) и нуклеиновых кислот в процессе их превра щений и обмена.

Помимо прямых переходов метаболитов этих классов веществ друг в друга, существует тесная энергетическая связь, когда энергетические потребности могут обеспечиваться окислением какого-либо одного класса органических веществ при недостаточном поступлении с пищей других.

Важность белков (в частности, ферментов, гормонов и др.) в обмене всех типов химических соединений слишком очевидна и не требует доказа тельств. Ранее было отмечено большое значение белков и аминокислот для синтеза ряда специализированных соединений (пуриновые и пиримиди новые нуклеотиды, порфирины, биогенные амины и др.). Кетогенные аминокислоты, образующие в процессе обмена ацетоуксусную кислоту (ацетоацетил-КоА), могут непосредственно участвовать в синтезе жирных кислот и стеринов. Аналогично могут использоваться гликогенные амино кислоты через ацетил-КоА, но после предварительного превращения в пируват. Некоторые структурные компоненты специализированных липи Липиды Углеводы Жирные Глюкоза кислоты Глицерин Ацетил-КоА Пируват Ацетоацетил-КоА ЦТК Н2O СO Кетогенные Гликогенные АМК АМК Аминокислоты NН Белки Рис. 15.1. Взаимосвязь белков, жиров и углеводов.

дов, в частности фосфоглицеринов, имеют своим источником амино кислоты и их производные, например серин, этаноламин, сфингозин и холин. Необходимо подчеркнуть, что превращение углеродных скелетов кетогенных или гликогенных аминокислот в жирные кислоты является необратимым процессом, хотя нельзя исключить возможности частичного синтеза глутамата и опосредованно других аминокислот из продуктов распада жирных кислот – ацетил-КоА – через цикл трикарбоновых кислот, включающий -кетоглутарат. В то же время из глицерина нейтральных жиров через пируват полностью осуществляется синтез углеродных ске летов некоторых гликогенных аминокислот.

Продукты гидролиза пищевых и тканевых триацилглицеролов, в част ности высшие жирные кислоты, участвуют непосредственно в образовании сложных белков – липопротеинов плазмы крови. В составе липопротеинов, являющихся, таким образом, транспортной формой жирных кислот, они доставляются в органы-мишени, в которых жирные кислоты служат или источником энергии (сердечная и поперечно-полосатая мускулатура), или предшественниками синтеза тканевых триацилглицеролов с последующим их отложением в клетках ряда органов (депо липидов).

Получены доказательства синтеза глюкозы из большинства амино кислот. Для некоторых аминокислот (аланин, аспарагиновая и глутами новая кислоты) связь с глюконеогенезом является непосредственной, для других она осуществляется через побочные метаболические пути. Следует особо подчеркнуть, что три -кетокислоты (пируват, оксалоацетат и кето глутарат), образующиеся соответственно из аланина, аспартата и глу тамата, не только служат исходным материалом для синтеза глюкозы, но являются своеобразными кофакторами при распаде ацетильных остатков всех классов пищевых веществ в цикле Кребса для получения энергии.

Синтез незаменимых аминокислот из продуктов обмена углеводов и жиров в организме животных отсутствует. Клетки животных не содержат ферментных систем, катализирующих синтез углеродных скелетов этих аминокислот. В то же время организм может нормально развиваться исключительно при белковом питании, что также свидетельствует о воз можности синтеза углеводов из белков. Процесс синтеза углеводов из аминокислот получил название глюконеогенеза. Он доказан прямым путем в опытах на животных с экспериментальным диабетом: более 50% введенного белка превращается в глюкозу. Как известно, при диабете организм теряет способность утилизировать глюкозу, и энергетические потребности покрываются за счет окисления аминокислот и жирных кис лот. Доказано также, что исходными субстратами для глюконеогенеза являются те аминокислоты, распад которых сопровождается образованием прямо или опосредованно пировиноградной кислоты (например, аланин, серин, треонин и цистеин). Более того, имеются доказательства существо вания в организме своеобразного циклического процесса – глюкозо аланинового цикла, участвующего в тонкой регуляции концентрации глюкозы в крови в тех условиях, когда в период между приемами пищи организм испытывает дефицит глюкозы. Источниками пирувата при этом являются указанные аминокислоты, образующиеся в мышцах при распаде белков и поступающие в печень, в которой они подвергаются дезами нированию. Образовавшийся аммиак в печени обезвреживается, участвуя в синтезе мочевины, которая выделяется из организма. Дефицит мышечных белков затем восполняется за счет поступления аминокислот пищи.

Энергетическая ценность пищи оказывает определенное влияние на белковый обмен, контролируемый азотистым балансом. Так, если по требляемая энергия пищи ниже минимального уровня, то наблюдается увеличение экскреции азота, и, наоборот, при увеличении энергетической ценности пищи экскреция азота с мочой снижается.

Между циклом лимонной кислоты и орнитиновым циклом мочевино образования имеются сложные связи, определяющие в известной степени скорость реакций, зависимую от энергетических потребностей клетки и концентраций конечных продуктов метаболизма. Как было показано (см.

главу 12), фумаровая кислота образуется в процессе распада аргинино янтарной кислоты, синтез которой в свою очередь требует наличия амино кислоты аспартата. Образовавшаяся фумаровая кислота (из предшествен ника аминокислоты аспартата) далее вступает в цикл лимонной кислоты и под действием двух ферментов этого цикла: фумаратгидратазы и малат дегидрогеназы – превращается в оксалоацетат, который при участии спе цифической трансаминазы вновь превращается в аспартат, т.е. получается своеобразный аспартат-аргининоянтарный шунт цикла лимонной кислоты, соединенного с циклом мочевинообразования (рис. 15.2). Таким образом, при помощи этого необычного сцепленного механизма происходит пере плетение реакций обоих циклов (мочевинообразования и ди- и трикар боновых кислот). Этот механизм получил название «велосипед Кребса» (The "Krebs bicycle").

Из приведенной общей схемы (см. рис. 15.1) видно также, что имеются различные пути взаимопревращений жиров и углеводов. Практика откорма сельскохозяйственных животных давно подтвердила возможность синтеза жиров из углеводов пищи. С энергетической точки зрения, превращение углеводов в жиры следует рассматривать как накопление и депонирование энергии, хотя синтез жира сопровождается затратой энергии, которая вновь освобождается при окислении жиров в организме. Глицерин, входящий Фумарат Аргинин Малат Мочевина Аргинино Орнитин Оксало сукцинат ацетат Карбамоил Аспартат фосфат Глу Цитруллин -КГ Рис. 15.2. The "Krebs Bicycle". (Печатается с любезного разрешения д-ра David L.

Nelson и д-ра М.М. Сох, 1993.) в состав триацилглицеролов и фосфоглицеринов, может легко образоваться из промежуточных метаболитов гликолиза, в частности из глицераль дегид-3-фосфата. Следует, однако, подчеркнуть, что основным путем пре вращения углеводов в жиры является путь образования высших жирных кислот из ацетил-КоА, который образуется при окислительном декар боксилировании пирувата. Последняя реакция практически необратима, поэтому образования углеводов из высших жирных кислот почти не происходит. Таким образом, синтез углеводов из жиров в принципе может происходить только из глицерина, хотя в обычных условиях реакция протекает в обратную сторону, т.е. в сторону синтеза жиров из глицерина, образующегося при окислении углеводов. Ацетил-КоА, образующийся в процессе обмена углеводов, жиров и ряда аминокислот, служит пусковым субстратом как для синтеза жирных кислот (а следовательно, и липидов вообще), так и для цикла трикарбоновых кислот. Для окисления ацетил КоА в этом цикле требуется оксалоацетат, который является вторым ключевым субстратом в цикле Кребса. Оксалоацетат может синтезиро ваться из пировиноградной кислоты и СО2 благодаря реакции карбокси лирования или образоваться из аспарагиновой кислоты в процессе транс аминирования с -кетоглутаратом. Две молекулы ацетил-КоА, конден сируясь, образуют ацетоуксусную кислоту (ацетоацетат), которая является источником других кетоновых тел в организме, в частности -оксимасляной кислоты (-оксибутирата) и ацетона (см. главу 11). Следует подчеркнуть, что ацетоуксусная и -оксимасляная кислоты часто рассматриваются как транспортные формы активной уксусной кислоты, доставляющие ее для окисления в цикле Кребса в периферических тканях. Эти же реакции конденсации двух молекул ацетил-КоА составляют начальные этапы син теза холестерина, в свою очередь являющегося предшественником гор монов стероидной природы, витамина D3, а также желчных кислот.

Последние в виде парных желчных кислот выполняют важную функцию эмульгаторов при переваривании липидов пищи в кишечнике, а также функцию транспортеров, способствуя всасыванию высших жирных кислот.

Следует указать также на использование галактозы и частично глюкозы для биосинтеза цереброзидов и гликолипидов, выполняющих важные и специфические функции в деятельности ЦНС. В этом синтезе участвуют не свободные моносахариды, а гексозамины (галактозамин и глюкозамин), биосинтез которых в свою очередь требует доставки амидного азота глутамина, интегрируя тем самым обмен углеводов, липидов и белков.

В последние годы накоплено немало экспериментальных данных, сви детельствующих о существовании в живых организмах множества ре гулирующих механизмов, осуществляющих метаболический контроль и обеспечивающих как взаимопревращения белков, липидов и углеводов, так и интеграцию энергии. Не отрицая значение других типов регуляции метаболизма (см. главы 8, 9), следует подчеркнуть, что движущей силой во взаимопревращениях веществ и интенсивности метаболизма, вероятнее всего, является энергетическое состояние клетки, в частности уровень АТФ (точнее, отношение АМФ/АТФ). Так, при низких концентрациях АМФ и высоких концентрациях АТФ (состояние, которое принято обозначать «энергонасыщенностью») в клетках происходит резкое снижение глико литического распада глюкозы, обусловленное действием этих нуклеотидов на ключевой фермент гликолиза – фосфофруктокиназу и на фосфатазу фруктозо-6-фосфата. В результате в клетках накапливается не только фруктозо-6-фосфат, но и его предшественник – глюкозо-6-фосфат. Послед ний, являясь положительным модулятором фермента гликогенсинтазы, стимулирует синтез полисахарида – гликогена. При низких концентрациях АТФ (соответственно при высоком уровне АМФ) в клетках отмечаются стимулирование гликолиза и окисление пирувата в лимоннокислом цикле, что способствует обеспечению клеток энергией. Однако при низких кон центрациях АМФ имеет место снижение скорости цикла трикарбоновых кислот, обусловленное торможением активности изоцитратдегидрогеназы, соответственно наблюдается снижение скорости синтеза АТФ и накопление изолимонной кислоты. Последняя, как известно, повышает активность другого фермента – ацетил-КоА-карбоксилазы, которая в свою очередь катализирует I стадию превращения ацетил-КоА в жирную кислоту. Благо даря этим обстоятельствам клетка переводит образовавшуюся при глико лизе молекулу ацетил-КоА с энергетического пути на путь синтеза липидов и их отложения в депо. В то же время при восстановлении скорости утилизации АТФ, что обычно наблюдается при синтезе жирных кислот, соответствующее повышение уровня АМФ способствует снижению кон центрации лимонной кислоты и соответственно торможению синтеза липидов.

Перечисленными примерами абсолютно не исчерпывается все много образие взаимопревращений органических веществ, которые постоянно совершаются в живых организмах. Здесь приведены лишь главные, ма гистральные каналы и пути превращения общих классов веществ и указаны ключевые субстраты и ферментные системы, обеспечивающие постоянство химических компонентов и тканей и динамичность живых структур.

Таким образом, скорость распада одних питательных веществ и био синтеза других прежде всего определяется физиологическим состоянием и потребностями организма в энергии и метаболитах. Благодаря ди намичности и координации метаболической активности обеспечивается макро- и микроскопическое постоянство всех форм живого. Выяснение фундаментальных проблем структуры и функций отдельных биомолекул может служить основой для раскрытия как молекулярных механизмов химических процессов, лежащих в основе состава и функций отдельных клеток и целостного организма, так и процессов, обеспечивающих биоло гическую индивидуальность живых организмов. Любые нарушения этого динамического статуса организма сопровождаются развитием патологии, тяжесть и продолжительность которой будут определяться степенью по вреждения структуры и функций отдельных молекулярных и надмоле кулярных компонентов клеток.

Глава ПЕЧЕНЬ Важнейшее значение печени в обмене веществ в первую очередь опре деляется тем, что она является как бы большой промежуточной станцией между портальным и общим кругом кровообращения. В печень человека более 70% крови поступает через воротную вену, остальная кровь попадает через печеночную артерию. Кровь воротной вены омывает всасывающую поверхность кишечника, и в результате большая часть веществ, всасы вающихся в кишечнике, проходит через печень (кроме липидов, транспорт которых в основном осуществляется через лимфатическую систему).

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 14 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.