WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 14 |
-- [ Страница 1 ] --

Учебная литература для студентов медицинских вузов Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин Биологическая химия Издание третье, переработанное и дополненное Рекомендован Управлением научных и образовательных

медицинских учреждений Министерства здравоохранения Российской Федерации в качестве учебника для студентов медицинских вузов Москва "Медицина" 1998 УДК 577.1(075.8) ББК 28.902 Б 48 Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф.

Б 48 Биологическая химия: Учебник.– 3-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1998.– 704 с.: ил.– (Учеб. лит. Для студентов мед. вузов). ISBN 5-225-02709-1 В третьем издании учебника (второе вышло в 1990 г.) в сжатой форме представлены новейшие сведения и факты о биогенезе главных классов органических веществ в организме человека и животных.

Приведены новые данные о химии углеводов и липидов, расширен раздел медицинской энзимологии.

В новой главе «Биомембраны и биоэнергетика» отражены совре менные представления о структуре биомембран, образовании и транс формации энергии в биосистемах.

ББК 28. Учебник ТЕМИРБОЛАТ ТЕМБОЛАТОВИЧ БЕРЕЗОВ, БОРИС ФЕДОРОВИЧ КОРОВКИН Биологическая химия Зав. редакцией Т. П. Осокина. Научный редактор С. С. Шишкин.

Редактор издательства М. Г. Фомина. Худ. ред. Т. С. Тихомирова.

Технический редактор В. И. Табенская. Корректор Л. П. Колокольцева.

ЛР № 010215 от 29.04.97. Сдано в набор 29.12.97. Подписано к печати 16.07.98. Формат бумаги 70 х 100 /16. Бумага офсетная № 1. Гарнитура таймс. Печать офсетная. Усл. печ.л. 57,20. Усл. кр.-отт. 110,50. Уч.-изд. л.

54,87. Тираж 15000 экз. Заказ № Ордена Трудового Красного Знамени издательство «Медицина» 101000, Москва, Петроверигский пер., 6/ Отпечатано в ОАО «Можайский полиграфический комбинат».

143200, г. Можайск, ул. Мира, ISBN 5-225-02709-1 © Издательство «Медицина», © Издательство «Медицина», Москва, Все права авторов защищены. Ни одна часть этого издания не может быть занесена в память компьютера либо воспроизведена любым способом без предварительного письменного разрешения издателя.

СОДЕРЖАНИЕ Предисловие к первому изданию 9 Глава 2. Химия сложных Предисловие ко второму изданию 11 белков Предисловие к третьему изданию Хромопротеины Список сокращений Гемопротеины Введение Флавопротеины Нуклеопротеины Глава 1. Химия белков 19 Липопротеины Фосфопротеины Функции белков Гликопротеины Содержание белков в органах и Металлопротеины тканях Методы выделения и очистки бел ков Гомогенизация биологического Глава 3. Химия нуклеино материала 23 вых кислот Экстракция белков Химический состав нуклеиновых Фракционирование и очистка кислот белков Структура нуклеиновых кислот Очистка белков от низкомоле Первичная структура нуклеино кулярных примесей вых кислот Определение гомогенности бел Вторичная структура нуклеино ков вых кислот Аминокислотный состав белков Третичная структура нуклеино Классификация аминокислот вых кислот Общие свойства аминокислот Физико-химические свойства бел ков Молекулярная масса белков Глава 4. Ферменты... Форма белковых молекул... Денатурация белков 47 Понятие о ферментах Изоэлектрическая и изоионная Краткая история развития учения точки белков 49 о ферментах Структурная организация белков 49 Химическая природа ферментов Первичная структура белка 52 Строение ферментов Методы определения N-кон- Активный центр ферментов цевой аминокислоты.... 53 Изоферменты Методы определения С-кон- Мультимолекулярные ферментные цевой аминокислоты.... 54 системы Вторичная структура белка 60 Механизм действия ферментов Третичная структура белка 63 Кинетика ферментативных реак Четвертичная структура белка 68 ций Классификация белков.... 71 Основные свойства ферментов Химия простых белков.... 73 Факторы, определяющие актив Природные пептиды 74 ность ферментов Влияние концентраций субстра- Витамины группы А та и фермента на скорость фер- Витамины группы D ментативной реакции.... 144 Витамины группы К Активирование и ингибирование Витамины группы Е ферментов 145 Витамины, растворимые в воде Регуляция активности ферментов 152 Витамин В Определение активности фермен- Витамин В2 тов 157 Витамин РР Внутриклеточная локализация Витамин В6 ферментов 158 Биотин (витамин Н) Классификация и номенклатура Фолиевая кислота ферментов 159 Витамин В12 Список ферментов 162 Пантотеновая кислота (витамин Применение ферментов.... 163 В3) Проблемы медицинской энзимо- Витамин С логии 165 Витамин Р Витаминоподобные вещества Парааминобензойная кислота Глава 5. Химия углеводов Витамин В15 Биологическая роль углеводов 169 Инозит (инозитол) Классификация углеводов... 170 Коэнзим Q (убихинон).... Моносахариды 170 Пирролохинолинохинон (PQQ) Основные реакции моносахари- Витамин U дов, продукты реакций и их Липоевая кислота свойства 174 Холин Олигосахариды 179 Антивитамины Полисахариды Гомополисахариды Глава 8. Гормоны.... Гетерополисахариды.... Общее понятие о гормонах... Номенклатура и классификация Глава 6. Химия липидов гормонов Биологическая роль липидов 188 Гормоны гипоталамуса.... Классификация липидов.... 188 Гормоны гипофиза Жирные кислоты 189 Вазопрессин и окситоцин... Глицериды (ацилглицеролы).. 192 Меланоцитстимулирующие гор Воска 194 моны (МСГ, меланотропины) Фосфолипиды 194 Адренокортикотропный гормон Глицерофосфолипиды.... 195 (АКТГ, кортикотропин)... Сфинголипиды (сфингофосфо- Соматотропный гормон (СТГ, липиды) 198 гормон роста, соматотропин) Гликолипиды (гликосфинголипи- Лактотропный гормон (пролак ды) 199 тин, лютеотропный гормон) Стероиды 200 Тиреотропный гормон (ТТГ, ти ротропин) Гонадотропные гормоны (го Глава 7. Витамины... надотропины) История развития витаминологии Липотропные гормоны (ЛТГ, и общие представления о витами- липотропины) нах 204 Гормоны паращитовидных желез Методы определения витаминов 207 (паратгормоны) Классификация витаминов... 208 Гормоны щитовидной железы Витамины, растворимые в жирах 210 Гормоны поджелудочной железы Инсулин 268 Эффект Пастера Глюкагон 271 Пентозофосфатный путь окисле Гормоны надпочечников.... 272 ния углеводов Гормоны мозгового вещества Регуляция метаболизма углеводов надпочечников 273 Нарушения углеводного обмена Гормоны коркового вещества надпочечников Глава 11. Метаболизм ли Химическое строение, биосин пидов тез и биологическое действие кортикостероидов Роль липидов в питании.... Половые гормоны Переваривание и всасывание липи Женские половые гормоны дов Мужские половые гормоны Жировая ткань и ее участие в об Простагландины мене липидов Гормоны вилочковой железы (ти Окисление жирных кислот... муса) Окисление ненасыщенных жир Молекулярные механизмы переда ных кислот чи гормонального сигнала... Окисление жирных кислот с не Аденилатциклазная мессенджер четным числом углеродных ато ная система мов Гуанилатциклазная мессенджер Метаболизм кетоновых тел... ная система Биосинтез насыщенных жирных Са2+ - мессенджерная система кислот Незаменимые жирные кислоты Эйкозаноиды Глава 9. Биомембраны и Биосинтез триглицеридов... биоэнергетика Метаболизм фосфолипидов... Основные принципы организации Распад и обновление фосфоли биомембран пидов Биоэнергетика Биосинтез холестерина.... Генерация свободных радикалов Регуляция липидного обмена в клетке Нарушения липидного обмена Мембранные механизмы регуля Липосомы ции метаболизма Глава 10. Метаболизм уг- Глава 12. Обмен простых леводов 319 белков Переваривание и всасывание угле- Динамическое состояние белков водов 319 организма Синтез и распад гликогена... 321 Факторы, определяющие состоя Синтез гликогена (гликогенез) 322 ние белкового обмена Распад гликогена (гликогенолиз) 324 Нормы белка в питании.... Гликолиз 327 Биологическая ценность белков Спиртовое брожение.... 334 Резервные белки Включение других углеводов в Парентеральное белковое питание процесс гликолиза 335 Переваривание белков Глюконеогенез 338 Эндопептидазы Аэробный метаболизм пирувата 343 Переваривание белков в желудке Окислительное декарбоксилиро- Переваривание белков в кишеч вание пировиноградной кислоты 344 нике Цикл трикарбоновых кислот (цикл Всасывание продуктов распада Кребса) 345 белков Превращения аминокислот под Распад пуриновых нуклеози действием микрофлоры кишеч- дов ника 426 Распад пиримидиновых нуклео Судьба всосавшихся аминокис- зидов лот 428 Обмен хромопротеинов.... Транспорт аминокислот через Биосинтез гемоглобина... клеточные мембраны.... 430 Распад гемоглобина в тканях Промежуточный обмен аминокис- (образование желчных пигмен лот в тканях 431 тов) Общие пути обмена аминокис лот Глава 14. Биосинтез белка Дезаминирование аминокис лот Трансляция и общие требования Трансаминирование амино к синтезу белка в бесклеточной кислот системе Декарбоксилирование амино Рибосомы кислот Аминоацил-тРНК-синтетазы Обезвреживание аммиака в ор Транспортные РНК ганизме Матричная РНК Орнитиновый цикл мочевино Природа генетического кода образования Этапы синтеза белка..... Специфические пути обмена не Активирование аминокислот которых аминокислот.... Процессы трансляции.... Обмен глицина и серина Транспорт синтезированных бел Обмен серосодержащих амино ков через мембраны кислот Синтез митохондриальных белков Обмен фенилаланина и тиро Постсинтетическая модификация зина белков Обмен триптофана... Регуляция синтеза белка.... Обмен аминокислот с развет Ингибиторы синтеза белка вленной цепью Обмен дикарбоновых амино кислот 459 Глава 15. Взаимосвязь про Патология азотистого обмена цессов обмена веществ в ор ганизме Глава 13. Обмен сложных Глава 16. Печень.... белков Химический состав печени... Обмен нуклеиновых кислот. Роль печени в углеводном обмене Биосинтез пуриновых нуклеоти Роль печени в липидном обмене дов Роль печени в обмене белков... Биосинтез пиримидиновых нук Детоксикация различных веществ леотидов в печени Биосинтез нуклеиновых кислот Роль печени в пигментном об Биосинтез ДНК мене Биосинтез РНК Желчь Биогенез матричных РНК Биогенез транспортных РНК Биогенез рибосомных РНК Глава 17. Кровь Синтез РНК на матрице РНК 495 Химический состав крови.... Распад нуклеиновых кислот 498 Белки плазмы крови Характеристика основных бел- Патологические компоненты ковых фракций 570 мочи Липопротеины плазмы крови 574 Мочевые камни Отдельные наиболее изучен ные и интересные в клиниче ском отношении белки плаз Глава 19. Нервная ткань мы Ферменты плазмы (сыворот- Структура нейрона ки) крови 579 Строение миелина Небелковые азотистые компо- Химический состав мозга.... ненты крови 580 Белки Безазотистые органические ком- Липиды поненты крови 582 Углеводы Электролитный состав плазмы Адениновые нуклеотиды и креа крови 582 тинфосфат Клетки крови 585 Минеральные вещества... Буферные системы крови и кислот- Особенности метаболизма нерв но-основное равновесие.... 586 ной ткани Буферные системы крови. 586 Дыхание Нарушения кислотно-основного Метаболизм углеводов.... равновесия 589 Метаболизм лабильных фосфа Дыхательная функция крови... 591 тов (макроэргов) Перенос кислорода кровью 591 Метаболизм аминокислот и бел Различные формы гипоксии 595 ков Перенос углекислого газа кровью Метаболизм липидов.... от тканей к легким 596 Химические основы возникнове Система свертывания крови... 599 ния и проведения нервных импуль Современные представления о сов свертывании крови 600 Роль медиаторов в передаче Факторы плазмы крови... 600 нервных импульсов Факторы тромбоцитов... 602 Механизмы памяти «Внешний» и «внутренний» Пептиды и болевые реакции пути свертывания крови... 603 Цереброспинальная жидкость Противосвертывающая система крови Фибринолиз Глава 20. Мышечная ткань Морфологическая организация по Глава 18. Почки и моча перечно-полосатой мышцы... Особенности строения почек... 608 Химический состав поперечно-по Механизм образования мочи 608 лосатой мышцы Роль почек в поддержании кислот- Мышечные белки но-основного равновесия.... 614 Небелковые азотистые экстрак Некоторые особенности обмена тивные вещества веществ в почечной ткани в норме Безазотистые вещества.... и при патологии 615 Некоторые особенности химическо Общие свойства и составные части го состава сердечной мышцы и мочи 616 гладкой мускулатуры..... Общие свойства мочи.... 616 Изменение химического состава Химический состав мочи... 618 мышечной ткани в онтогенезе Органические вещества мочи 619 Функциональная биохимия мышц Неорганические (минераль- Источники энергии мышечной ные) компоненты мочи... 621 деятельности Механизм мышечного сокраще- Биохимические изменения соеди ния 656 нительной ткани при старении и Биохимические изменения в мыш- некоторых патологических про цах при патологии 658 цессах Глава 21. Соединительная Глава 22. Костная ткань ткань Химический состав костной ткани Межклеточный органический мат Формирование кости рикс соединительной ткани... Факторы, оказывающие влияние Коллаген на метаболизм костной ткани Эластин Основные группы болезней кости Протеогликаны Гликозаминогликаны (муко Рекомендуемая литература полисахариды) Образование и катаболизм Предметный указатель протеогликанов ПРЕДИСЛОВИЕ К ПЕРВОМУ ИЗДАНИЮ На протяжении всей истории человечества естествоиспытатели и философы искали пути к открытию и познанию сущности и происхождения жизни.

Однако многие вопросы этой вечной проблемы живого до сих пор не решены, несмотря на крупнейшие открытия таких фундаментальных естест венных наук, как математика, физика и химия. Неоспоримо положение, что для познания огромного разнообразия форм жизни и ее сущности перво степенное значение имеет определение «химической индивидуальности» живого организма. Биологическая химия достигла огромных успехов в изу чении химического состава живых организмов (включая человека) и приро ды химических процессов, происходящих как в целостном организме, так и в изолированных органах и тканях на клеточном, субклеточном и молеку лярном уровнях. Последние два-три десятилетия ознаменовались рядом выдающихся открытий в биологической химии и в некоторых ее разделах:

энзимологии, биохимической генетике, молекулярной биологии, биоэнерге тике и др., выдвинувших ее в разряд фундаментальных научных дисциплин и сделавших биохимию мощным орудием решения многих важных проблем биологии и медицины.

Дальнейшее развитие биологии и медицины почти невозможно без применения методологических принципов современной биологической хи мии. Установление способов хранения и передачи генетической информации и принципов структурной организации белков и нуклеиновых кислот, расшифровка механизмов биосинтеза этих полимерных молекул, а также молекулярных механизмов трансформации энергии в живых системах, установление роли биомембран и субклеточных структур, несомненно, способствуют более глубокому проникновению в сокровенные тайны жизни и выяснению связи между структурой индивидуальных химических компо нентов живой материи и их биологическими функциями. Овладение этими закономерностями и основополагающими принципами биологической хи мии не только способствует формированию у будущего врача диалектико материалистического понимания процессов жизни, но и дает ему новые, ранее недоступные возможности активного вмешательства в патологиче ские процессы. Этими обстоятельствами диктуется необходимость изучения биологической химии студентами медицинских институтов.

Данный учебник предназначен в первую очередь для студентов медицин ских институтов и по структуре и объему в основном соответствует программе курса биохимии, утвержденной Министерством здравоохране ния СССР. Некоторые главы его могут быть использованы студентами биологических факультетов университетов и других высших учебных заве дений, где преподается биохимия.

Главная цель учебника – дать общие представления о фундаментальных достижениях биологической химии в изучении химических основ жизни.

Поскольку в формировании физиолого-биохимического мышления будуще го врача большую роль играет знание строения (структуры) и роли химических компонентов в осуществлении физиологических функций, пер вая часть учебника посвящена рассмотрению химического состава живых организмов. В частности, даны современные представления о принципах структурной организации белков, нуклеиновых кислот и ферментов, мето дах изолирования и очистки белков, определения их первичной структуры и молекулярной массы, а также применении достижений энзимологии в медицине. Значительно большее внимание, помимо строения, уделено биологической роли витаминов, в частности коферментным функциям, а также практическому значению антивитаминов и антиметаболитов. Суще ственно расширена глава о гормонах;

включены новые разделы, касающие ся структуры и функции гормонов гипофиза, рилизинг-факторов и проста гландинов.

Учитывая накопленный опыт преподавания биологической химии в I Московском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте им. И.М. Сеченова, Военно-медицинской ордена Ленина Краснознаменной академии им. С.М. Кирова и ордена Дружбы Народов Университете дружбы народов им. П. Лумумбы, а также пожела ния многих преподавателей, авторы рассматривают структуру и функцию углеводов и липидов совместно с их обменом во второй части учебника – в разделе «Обмен веществ». Такой подход можно считать вполне оправ данным еще и потому, что студенты лучше усваивают материал при одновременном изучении химии и обмена углеводов и липидов после изучения биоэнергетических аспектов биологического окисления. Послед нему вопросу посвящена отдельная глава.

Исключительная важность раздела «Синтез белка» для понимания и объяснения многих проявлений жизни побудила авторов выделить в само стоятельную главу эту стремительно развивающуюся ветвь биохимии белка. Широко освещена биохимия ряда органов и тканей человека. Вместе с тем не дается отдельно обмен воды и минеральных веществ, поскольку многие вопросы, касающиеся значения воды и роли минеральных веществ в процессе жизнедеятельности, освещены в разделах биохимии почек и мочи, печени, крови.

В связи с возрастающим значением биохимии для практики здравоохра нения особое внимание уделено регуляции и патологии обмена углеводов, жиров, белков и аминокислот, включая наследственные дефекты обмена, а также изложению практического использования биохимических тестов для постановки диагноза заболевания, выбора метода лечения и проверки его эффективности.

Учебник иллюстрирован рисунками, схемами и таблицами, частично разработанными авторами и частично заимствованными из других источ ников, некоторые из которых были переработаны или упрощены.

За просмотр отдельных глав рукописи и ценные замечания авторы считают своим долгом принести благодарность академикам АН СССР С.Е. Северину и А.Е. Браунштейну, академикам АМН СССР В.Н. Орехо вичу и А.Н. Климову, члену-корреспонденту АМН СССР Ю.А. Панкову и профессорам Ю.Б. Филипповичу, Л.М. Гинодману и Г.С. Хачатряну.

Авторы будут весьма признательны за критические замечания, полезные советы и пожелания по содержанию данного учебника.

ПРЕДИСЛОВИЕ КО ВТОРОМУ ИЗДАНИЮ Во втором издании учебника «Биологическая химия» авторы стремились отразить почти все новейшие достижения этой весьма быстро развиваю щейся науки после выхода в свет первого издания в 1982 г. Основываясь на многочисленных пожеланиях, предложениях и критических замечаниях советских исследователей, преподавателей, студентов и иностранных кол лег, частично опубликованных в журналах «Биохимия», «Украинский био химический журнал», «Biochemical Education» (1983, 1984 гг.), благодарные авторы, солидарные в одних случаях и не согласные с рядом предложений в других, предлагают на суд научной и педагогической общественности и студентов данное издание.

В учебнике нашли отражение современные представления о структуре и функциях молекул белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов.

Разделы по химии биополимеров, как и ферментов, витаминов и гормонов, объединены по просьбе большинства рецензентов в первой части учебника.

В главах, посвященных витаминам, гормонам и ферментам, представлены новые сведения о биологической роли и механизме действия этих соедине ний. Опущены данные о первичной структуре ряда пептидных и белковых гормонов, зато приведены новейшие результаты по биогенезу простаглан динов и родственных соединений: простациклинов, тромбоксанов и лейко триенов. В главе «Ферменты» подробно рассмотрены проблемы медицин ской энзимологии, включая некоторые вопросы инженерной энзимологии.

Существенно переработаны в свете новых данных главы, посвященные обмену веществ. Учитывая все возрастающее значение биохимии для медицины, особое внимание уделено регуляции и патологии обмена углево дов, липидов, белков и аминокислот, включая наследственные нарушения обмена. Обстоятельно изложены многие вопросы, которым не всегда уделялось в курсе биологической химии (особенно в учебниках по биологи ческой химии, переведенных с английского языка) должное внимание. Это касается, в частности, особенностей химического состава и процессов метаболизма в норме и патологии таких специализированных тканей, как кровь, печень, почки, нервная, мышечная и соединительная ткани.

Авторы стремились максимально облегчить восприятие материала, ориентируясь на сжатое, четкое и доступное изложение многочисленных сведений современной биологической химии и перспектив ее дальнейшего развития. Углубленному изучению и усвоению предмета будет, очевидно, способствовать, кроме того, богатый иллюстративный материал в виде сводных таблиц, схем метаболических циклов, графиков и рисунков, боль шей частью оригинальных, составляющих единое целое с текстом.

Главы 1–6 и 11–14 написаны Т.Т. Березовым, а главы 7–10 и 15–20 – Б.Ф. Коровкиным. Критические замечания, пожелания и предложения по содержанию второго издания учебника будут встречены авторами с благо дарностью.

Т. Березов, Б. Коровкин ПРЕДИСЛОВИЕ К ТРЕТЬЕМУ ИЗДАНИЮ В последнее время получено немало дополнительных доказательств того, что биохимия является средством выражения понятий и явлений не только в области фундаментальной биологической науки, но и в области клиниче ской медицины. Биохимия, изучающая химические основы жизнедеятель ности организмов в норме и при патологии, призвана установить связь между молекулярной структурой и биологической функцией химических компонентов живой материи. Авторы не стремились, как и в двух предыду щих изданиях, охватить все разделы курса общей биохимии. Главная цель данного издания – сохранив основные разделы и понятия биохимии, пред ставить в сжатой форме новейшие сведения и факты о биогенезе главных классов органических веществ в организме человека и животных.

Принимая во внимание все возрастающий объем биохимической инфор мации, многие разделы пришлось заново написать или существенно пере работать: например, о структуре и функциях белков и нуклеиновых кислот, регуляции экспрессии генов, молекулярных механизмов биогенеза ДНК и РНК, биосинтеза белка, механизмах регуляции метаболизма и роли гормонрецепторной системы и вторичных внутриклеточных мессенджеров в передаче нервного и гуморального сигналов, механизмах ферментатив ного катализа, особенностях обмена веществ в нервной ткани (нейрохимия), печени, мышечной и соединительной тканях и др.

Представлена новая глава «Биомембраны и биоэнергетика», объединяю щая прежние две главы учебника: «Обмен веществ и энергии» и «Биологи ческое окисление».

Новые сведения о химии углеводов и липидов рассмотрены в первой, специальной, «химической» части учебника в соответствии с предложе ниями ряда коллег и рецензента.

Учитывая основополагающую роль биохимии для теории и практики медицины, особое внимание в учебнике уделено изложению как регуляции и патологии обмена веществ, так и молекулярных основ соматических и наследственных болезней человека. В главе «Ферменты» значительно расширен раздел медицинской энзимологии. Обсуждаются проблемы энзи мопатологии и применения ферментов в качестве диагностических средств и лечебных препаратов, а также в качестве инструментов при биотехноло гическом производстве лекарственных препаратов и пищевых веществ.

Главы 1–4, 7, 8 и 12–15 написаны акад. РАМН Т.Т. Березовым, главы 5, 6, 10, 11 и 16–22 – чл.-корр. РАМН Б.Ф. Коровкиным, а глава 9 написана проф. А.А. Болдыревым.

Авторы выражают глубокую признательность многим преподавателям и студентам за ценные советы и критические замечания, большая часть которых была учтена при подготовке данного издания. С благодарностью будут встречены новые предложения, пожелания и замечания.

Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ААП аланинаминопептидаза - аденозиндифосфат АДФ - антидиуретический гормон АДГ АКТГ - адренокортикотропный гормон - аланинаминотрансфераза АлАТ АМК аминокислоты - аденозинмонофосфат АМФ цАМФ - циклический аденозин-3',5'-монофосфат - ацилпереносящий белок АПБ АсАТ - аспартатаминотрансфераза - аденозинтрифосфат АТФ АТФаза - аденозинтрифосфатаза ГАМК - -аминомасляная кислота - гуанозиндифосфат ГДФ ГМФ - гуанозинмонофосфат цГМФ - циклический аденозин-3',5'-монофосфат ГТФ - гуанозинтрифосфат - дезоксирибонуклеиновая кислота ДНК ДНКаза - дезоксирибонуклеаза - дезоксирибонуклеопротеины ДНП ДОФА - диоксифенилаланин Дофамин - диоксифенилэтиламин - додецилсульфат натрия ДСН - диизопропилфторфосфат ДФФ - диэтиламиноэтил ДЭАЭ ИМФ - инозинмонофосфат КоА кофермент (коэнзим) А KoQ - кофермент (коэнзим) Q (убихинон) КОР - кислотно-основное равновесие - лактатдегидрогеназа ЛДГ ЛПВП - липопротеины высокой плотности ЛПНП - липопротеины низкой плотности ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности - моноаминоксидаза МАО Мол. масса - молекулярная масса НАД+ окисленный никотинамидадениндинуклеотид НАДН + Н+ - восстановленный никотинамидадениндинуклеотид НАДФ+ окисленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат НАДФН + Н+ - восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат ПВК - пировиноградная кислота - пиридоксальфосфат ПФ РДФ рибонуклеотиддифосфат - фосфат неорганический Pi - пирофосфат неорганический PPi РНК рибонуклеиновая кислота РНКаза - рибонуклеаза - матричная РНК мРНК - рибосомная РНК рРНК - транспортная РНК тРНК РНП - рибонуклеопротеины СДГ - сукцинатдегидрогеназа ТГФК тетрагидрофолиевая кислота ТДФ тимидиндифосфат ТМФ тимидинмонофосфат ТПФ тиаминпирофосфат ТТФ тимидинтрифосфат УДФ - уридиндифосфат УДФГ уридиндифосфатглюкоза УДФГК уридиндифосфоглюкуроновая кислота - уридинмонофосфат УМФ - уридинтрифосфат УТФ ФАД - окисленный флавинадениндинуклеотид - восстановленный флавинадениндинуклеотид ФАДН ФАФС 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат ФДНБ фтординитробензол ФМН окисленный флавинмононуклеотид ФМНН2 - восстановленный флавинмононуклеотид - 5-фосфорибозил-1-пирофосфат ФРПФ ЦДФ цитидиндифосфат ЦМФ цитидинмонофосфат - центральная нервная система ЦНС - цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса) ЦТК - цитидинтрифосфат ЦТФ - этилендиаминтетраацетат ЭДТА ВВЕДЕНИЕ Биологическая химия – это наука о молекулярной сущности жизни. Она изучает химическую природу веществ, входящих в состав живых организ мов, их превращения, а также связь этих превращений с деятельностью клеток, органов и тканей и организма в целом. Из этого определения вытекает, что биохимия занимается выяснением химических основ важней ших биологических процессов и общих путей и принципов превращений веществ и энергии, лежащих в основе разнообразных проявлений жизни.

Таким образом, главной задачей биохимии является установление связи между молекулярной структурой и биологической функцией химических компонентов живых организмов.

В зависимости от объекта исследования биохимию условно подразде ляют на биохимию человека и животных, биохимию растений и биохимию микроорганизмов. Несмотря на биохимическое единство всего живого, существуют и коренные различия как химического состава, так и обмена веществ в животных и растительных организмах. Обмен веществ, или метаболизм,– это совокупность всех химических реакций, протекающих в организме и направленных на сохранение и самовоспроизведение живых систем. Известно, что растения строят сложные органические вещества (углеводы, жиры, белки) из таких простых, как вода, углекислый газ и минеральные вещества, причем энергия, необходимая для этой синтетиче ской деятельности, образуется за счет поглощения солнечных лучей в про цессе фотосинтеза. Животные организмы, напротив, нуждаются в пище, состоящей не только из воды и минеральных компонентов, но содержащей сложные вещества органической природы: белки, жиры, углеводы. У живот ных проявления жизнедеятельности и синтез веществ, входящих в состав тела, обеспечиваются за счет химической энергии, освобождающейся при распаде (окислении) сложных органических соединений.

Растения, не использующие для своей жизнедеятельности вещества органической природы, называются аутотрофными организмами;

живот ные являются гетеротрофными организмами. Среди микроорганизмов встречаются как аутотрофы, так и гетеротрофы. Кроме того, для микро организмов характерным признаком считается наличие специфических хи мических веществ и реакций, не встречающихся в клетках животных и растений.

Современная биохимия как самостоятельная наука сложилась на рубеже XIX и XX вв. До этого времени вопросы, рассматриваемые биохимией, входили в органическую химию и физиологию. Накопление фактического материала о составе наиболее сложных природных соединений началось с развитием в Европе в средние века алхимии. Однако фактические данные, полученные алхимиками, трудно отделить от неправильных обобщений и представлений, господствовавших в науке в то время. В XVI–XVII вв.

воззрения алхимиков получили дальнейшее развитие в трудах ятрохимиков (от греч. iatros – врач). Одним из виднейших представителей ятрохимии был немецкий врач и естествоиспытатель Т. Парацельс, который выдвинул весьма прогрессивное положение о тесной связи химии с медициной. Он считал, что в основе жизнедеятельности человека лежат химические процес сы и причинной основой любого заболевания является нарушение «хода» химических процессов в организме. В связи с этим, по мнению Т. Парацель са, для лечения следует использовать химические средства. К данному периоду относится и смелая для того времени идея И. Ван-Гельмонта о наличии в «соках» живого тела особых веществ – «ферментов», участ вующих в разнообразных химических превращениях.

В целом познание закономерностей химических и ферментативных процессов, лежащих в основе жизнедеятельности, оказалось для ятрохи миков непосильной задачей. Это объясняется прежде всего отсутствием в то время знаний основных законов физики и химии, неразработанностью методов элементарного анализа органических соединений. Кроме того, ятрохимики, так же как и алхимики, по своему мировоззрению были метафизиками и придерживались виталистических взглядов.

В XVII–XVIII вв. широкое признание среди ученых получила теория горючего начала – флогистона, сформулированная немецким химиком и врачом Г. Шталем. Несмотря на ошибочность основных положений, теория флогистона (объяснявшая процессы горения выделением из горящего тела особого невесомого вещества) сыграла в истории науки положительную роль, так как способствовала развитию экспериментального направления в химии. Опровержение этой теории связано с работами М. В. Ломоносова и А. Лавуазье, открывших в науке основные законы сохранения энергии и вещества, справедливые и для биологических объектов. Кроме того, А. Лавуазье показал, что при дыхании, как и при горении органических веществ, поглощается кислород и выделяется углекислый газ.

С середины XVIII в. начинается период открытия и выделения большо го числа новых органических веществ растительного и животного проис хождения. Крупным событием второй половины XVIII в. стали иссле дования Л. Спалланцани по физиологии пищеварения, которые положили начало изучению ферментов пищеварительных соков. Русский химик К.С. Кирхгоф в 1814 г. описал ферментативный процесс осахаривания крахмала под влиянием вытяжки из проросших семян ячменя. К середине XIX в. были найдены и другие ферменты: амилаза слюны, пепсин желудоч ного сока, трипсин сока поджелудочной железы. Й. Берцелиус ввел в химию понятие о катализе и катализаторах, к числу последних были отнесены все известные в то время ферменты. В 1839 г. Ю. Либих выяснил, что в состав пищи входят белки, жиры и углеводы, являющиеся главными составными частями животных и растительных организмов.

Сокрушительный удар по витализму был впервые нанесен работами Ф. Вёлера, которому в 1828 г. удалось получить химическим путем мочеви ну - один из конечных продуктов азотистого обмена у человека и животных.

В письме к своему учителю Й. Берцелиусу Ф. Вёлер писал: «Я должен Вам заявить, что могу делать мочевину, не нуждаясь при этом в почках и вообще в животных, будь это человек или собака». Вскоре последовал и ряд других блестящих работ: синтез уксусной кислоты, осуществленный А. Кольбе (1845), жиров – М. Бертло (1854), углеводов – А.М. Бутлеровым (1861). Эти работы неопровержимо продемонстрировали ошибочность и необоснованность виталистических представлений.

В борьбе с витализмом очень важную роль сыграли исследования о природе брожения. Л. Пастер ошибочно считал брожение биологическим процессом, в котором обязательно участвуют живые дрожжевые клетки.

Автором чисто химической теории брожения был Ю. Либих, однако его теория была недостаточно разработана, имела умозрительный характер и не полностью объясняла ряд экспериментально установленных фактов.

Важное значение имело получение строгих доказательств возможности брожения, не связанного с жизнедеятельностью клеток. Ясность была внесена, когда русский врач М.М. Манассеина (1871) и особенно четко немецкий ученый Э. Бухнер (1897) доказали способность бесклеточного дрожжевого сока вызывать алкогольное брожение.

Накопленные сведения о химическом составе растительных и животных организмов и химических процессах, протекающих в них, были впервые систематизированы в учебниках И. Зимона (1842) и Ю. Либиха (1847).

В России первый учебник физиологической химии был издан А.И. Ходне вым (1847).

Во второй половине XIX в. на медицинских факультетах многих русских и зарубежных университетов были учреждены специальные кафедры меди цинской, или физиологической, химии. В России первые кафедры меди цинской химии были организованы в 1863 г. в Казанском университете А.Я. Данилевским и в Московском университете А.Д. Булыгинским.

В 1892 г. начала функционировать кафедра физиологической химии в Воен но-медицинской (Медико-хирургической) академии в Петербурге. Эту ка федру возглавлял А.Я. Данилевский. Создание кафедр физиологической химии в высших учебных заведениях было обусловлено тем, что во второй половине XIX в. биологическая химия стала выделяться в самостоятельную науку, имеющую свой предмет и методы исследования.

Подлинный расцвет биологической химии относится к XX в., когда важные открытия во многих ее областях следовали одно за другим.

Биохимия открыла новые пути поиска с целью познания сущности биологи ческих процессов, помогла человеку получить множество фактов о самом себе и условиях своего существования.

Последние годы характеризуются развитием методологических принци пов и методических приемов исследования живой природы и накоплением фактических данных, позволивших изучать и объяснять метаболические процессы в биологии на молекулярном уровне.

Традиционный термин «биохимия», кажется, уже не в полной мере отражает профессиональную активность современных исследователей-био химиков. Несмотря на то что один из выдающихся биохимиков недавнего прошлого С. Очоа полагал, что молекулярная биология – это в сущ ности «биохимия без лицензии», многие в наши дни считают оба термина синонимами. Более того, созданы совместные национальные и международ ные научные общества, объединяющие биохимиков и молекулярных биоло гов. В ряде случаев кафедры называются кафедрами биохимии и молеку лярной биологии. Все это имеет не только чисто академический, но и политический смысл, препятствующий возможности организации других кафедр и имеющий бесспорные преимущества при получении грантов.

Помимо старых терминов «физиологическая химия», «физико-химическая биология», появилось много новых: в частности, «медицинская химия», изучающая химическую природу веществ, используемых с лечебной целью;

«медицинская биохимия», основной целью которой является изучение структуры и обмена индивидуальных биомолекул в норме и при болезнях человека. Имеют права «гражданства» и такие названия, как «клиническая химия», «клиническая биохимия» и «химическая патология» (или «патобио химия»), скорее всего, являющиеся синонимами и изучающие химические компоненты организма для использования их в клинической медицине.

Наконец, появился совсем новый термин «молекулярная медицина» (даже в названиях учебников), цели и задачи которой остаются неясными.

Надо ли в корне менять наши современные представления о структуре и функции биомолекул, сложившиеся в процессе изучения их в курсе биохимии и молекулярной биологии?

Наиболее важными и приоритетными фундаментальными направления ми научных исследований в биохимии и молекулярной биологии являются генетическая инженерия и биотехнология, которым придается исключитель ное значение. Усилия ученых сосредоточены на создании и производстве препаратов для медицины (гормоны, ферменты, моноклональные антитела, биоактивные пептиды, вакцины, интерферон, простагландины и др.), сель ского хозяйства (регуляторы роста растений, феромоны для борьбы с вре дителями растений), промышленности (пищевые и вкусовые добавки). Эта новая технология может решать ряд важных проблем в медицине (прена тальная диагностика болезней, генотерапия и др.).

В настоящее время перед биологической наукой поставлена задача – обеспечить преимущественное развитие научных исследований по следую щим основным направлениям: разработка методов генетической и клеточ ной инженерии, создание на их основе новых процессов для биотехноло гических производств с целью получения принципиально новых пород животных, форм растений с ценными признаками;

разработка новых методов и средств диагностики, лечения и профилактики наследственных заболеваний;

разработка научных основ инженерной энзимологии;

разра ботка и внедрение новых биокатализаторов (в том числе иммобилизован ных) и оптимизация с их помощью биотехнологических процессов получе ния химических и пищевых продуктов;

исследования структуры и функции биомолекул клетки;

изучение молекулярных и клеточных основ иммуноло гии, а также генетики микроорганизмов и вирусов, вызывающих заболева ния человека и животных, создание методов и средств диагностики, лечения и профилактики этих заболеваний;

исследования молекулярно-биологиче ских механизмов канцерогенеза, природы онкогенов и онкобелков, их роли в малигнизации клеток и создание на этой основе методов диагностики и лечения опухолевых заболеваний человека;

исследования проблем био энергетики, питания, психики и молекулярных основ памяти и деятельности мозга. Таким образом, можно наметить следующие главные направления развития исследований в области биологической химии на ближайшую и отдаленную перспективу, так называемые горизонты биохимии:

1. Дифференцировка клеток высших организмов (эукариот).

2. Организация и механизм функционирования генома.

3. Регуляция действия ферментов и теория энзиматического катализа.

4. Процессы узнавания на молекулярном уровне.

5. Молекулярные основы соматических и наследственных заболеваний человека.

6. Молекулярные основы злокачественного роста.

7. Молекулярные основы иммунитета.

8. Рациональное питание.

9. Молекулярные механизмы памяти.

10. Биосинтез белка.

11. Биологические мембраны и биоэнергетика.

Основное назначение биологической химии сводится к тому, чтобы решать на молекулярном уровне задачи фундаментальные, общебиологиче ские, включая проблему зависимости человека от экосистемы, которую необходимо не только понимать, но защищать и научиться разумно ею пользоваться.

Глава ХИМИЯ БЕЛКОВ Мир самого сложного – жизнь.

Н.Н. Семенов Живой организм характеризуется высшей степенью упорядоченности со ставляющих его ингредиентов и уникальной структурной организацией, обеспечивающей как его фенотипические признаки, так и многообразие биологических функций. В этом структурно-функциональном единстве организмов, составляющем сущность жизни, белки (белковые тела) иг рают важнейшую роль, не заменяемую другими органическими соеди нениями.

Белки – это высокомолекулярные азотсодержащие органические веще ства, молекулы которых построены из остатков аминокислот. Название «протеины» (от греч. protos – первый, важнейший), по-видимому, более точно отражает первостепенное биологическое значение этого класса ве ществ. Принятые в отечественной литературе термины «белки» и «белковые вещества» связаны с обнаружением в тканях животных и растений веществ, имеющих сходство с белком куриного яйца. В наше время, когда абсолютно достоверно установлено, что наследственная информация сосредоточена в молекуле ДНК клеток любых живых организмов, не вызывает сомнения, что только белки являются теми молекулярными инструментами, при помощи которых реализуется генетическая информация. Без белков, в част ности ферментов, ДНК не может реплицироваться, не может самовоспро изводиться, т.е. лишена способности передавать генетическую информа цию.

Живая природа характеризуется рядом свойств, отличающих ее от неживой природы, и почти все эти свойства связаны с белками. Прежде всего для живых организмов характерны широкое разнообразие белковых структур и их высокая упорядоченность;

последняя существует во времени и пространстве. Удивительная способность живых организмов к воспроиз ведению себе подобных также связана с белками. Сократимость, движение – непременные атрибуты живых систем – имеют прямое отношение к белко вым структурам мышечного аппарата. Наконец, жизнь немыслима без обмена веществ, постоянного обновления составных частей живого орга низма, т.е. без процессов анаболизма и катаболизма (этого удивительного единства противоположностей живого), в основе которых лежит деятель ность каталитически активных белков – ферментов.

Таким образом, белки (белковые вещества) составляют основу и струк туры, и функции живых организмов. По образному выражению одного из основоположников молекулярной биологии Ф. Крика, белки важны прежде всего потому, что они могут выполнять самые разнообразные функции, причем с необыкновенной легкостью и изяществом. Подсчитано, что в природе примерно 1010–1012 различных белков, обеспечивающих суще ствование около 106 видов живых организмов различной сложности орга низации начиная от вирусов и кончая человеком. Из этого огромного количества природных белков известны точное строение и структура ничтожно малой части (см. далее). Каждый организм характеризуется уникальным набором белков. Фенотипические признаки и многообразие функций обусловлены специфичностью объединения этих белков, во многих случаях в виде над- и мультимолекулярных структур, в свою очередь определяющих ультраструктуру клеток и их органелл.

В клетке Е.coli содержится около 3000 различных белков, а в организме человека насчитывается более 100000 разнообразных белков. Самое удиви тельное, что все природные белки состоят из небольшого числа сравни тельно простых структурных блоков, представленных мономерными моле кулами – аминокислотами, связанными друг с другом в полипептидные цепи. Природные белки построены из 20 различных аминокислот. Эти аминокислоты могут объединяться в самой разной последовательности, поэтому они могут образовывать громадное количество разнообразных белков. Число изомеров, которое можно получить при всевозможных перестановках указанного числа аминокислот в полипептиде, исчисляется огромными величинами. Так, если из 2 аминокислот возможно образование только двух изомеров, то уже из 4 аминокислот теоретически возможно образование 24 изомеров, а из 20 аминокислот – 2,4•1018 разнообразных белков.

Нетрудно предвидеть, что при увеличении числа повторяющихся амино кислотных остатков в белковой молекуле число возможных изомеров возрастает до астрономических величин. Ясно, что природа не может позволить случайных сочетаний аминокислотных последовательностей и для каждого вида характерен свой специфический набор белков, определя емый, как теперь известно, наследственной информацией, закодированной в молекуле ДНК живых организмов. Именно информация, содержащаяся в линейной последовательности нуклеотидов ДНК, определяет линейную последовательность остатков аминокислот в полипептидной цепи синтези руемого белка. Образовавшаяся линейная полипептидная цепь сама теперь оказывается наделенной функциональной информацией, в соответствии с которой она самопроизвольно преобразуется в определенную стабильную трехмерную структуру. Таким образом, лабильная полипептидная цепь складывается, скручивается в пространственную структуру белковой моле кулы, причем не хаотично, а в строгом соответствии с информацией, содержащейся в последовательности аминокислотных остатков. Учитывая ведущую роль белков в живой природе и тот факт, что белки, составляя почти половину сухой массы живого организма, наделены удивительным разнообразием функций, изучение курса биохимии в медицинских высших учебных заведениях обычно начинают с этого класса органических веществ.

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ Белки выполняют множество самых разнообразных функций, характерных для живых организмов, с некоторыми из которых мы познакомимся более подробно при дальнейшем изучении курса. Ниже рассматриваются главные и в некотором смысле уникальные биологические функции белков, несвой ственные или лишь частично присущие другим классам биополимеров.

Каталитическая функция. К 1995 г. было идентифицировано более 3400 ферментов. Большинство известных в настоящее время ферментов, называемых биологическими катализаторами, является белками. Эта функ ция белков, хотя и не оказалась уникальной, определяет скорость химиче ских реакций в биологических системах *.

Транспортная функция. Дыхательная функция крови, в частности перенос кислорода, осуществляется молекулами гемоглобина – белка эритроцитов.

В транспорте липидов принимают участие альбумины сыворотки крови.

Ряд других сывороточных белков образует комплексы с жирами, медью, железом, тироксином, витамином А и другими соединениями, обеспечивая их доставку в соответствующие органы-мишени.

Защитная функция. Основную функцию защиты в организме выполняет иммунная система, которая обеспечивает синтез специфических защитных белков-антител в ответ на поступление в организм бактерий, токсинов, вирусов или чужеродных белков. Высокая специфичность взаимодействия антител с антигенами (чужеродными веществами) по типу белок-белковое взаимодействие способствует узнаванию и нейтрализации биологического действия антигенов. Защитная функция белков проявляется и в способности ряда белков плазмы крови, в частности фибриногена, к свертыванию.

В результате свертывания фибриногена образуется сгусток крови, предохра няющий от потери крови при ранениях.

Сократительная функция. В акте мышечного сокращения и расслабления участвует множество белковых веществ. Однако главную роль в этих жизненно важных процессах играют актин и миозин – специфические белки мышечной ткани. Сократительная функция присуща не только мышечным белкам, но и белкам цитоскелета, что обеспечивает тончайшие процессы жизнедеятельности клеток (расхождение хромосом в процессе митоза).

Структурная функция. Белки, выполняющие структурную (опорную) функцию, занимают по количеству первое место среди других белков тела человека. Среди них важнейшую роль играют фибриллярные белки, в част ности коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже, эластин в сосудистой стенке и др. Большое значение имеют комплексы белков с углеводами в формировании ряда секретов: мукоидов, муцина и т.д. В комплексе с липидами (в частности, с фосфолипидами) белки участвуют в образовании биомембран клеток.

Гормональная функция. Обмен веществ в организме регулируется разно образными механизмами. В этой регуляции важное место занимают гормо ны, синтезируемые не только в железах внутренней секреции, но и во многих других клетках организма (см. далее). Ряд гормонов представлен белками или полипептидами, например гормоны гипофиза, поджелудочной железы и др. Некоторые гормоны являются производными аминокислот.

Питательная (резервная) функция. Эту функцию выполняют так назы ваемые резервные белки, являющиеся источниками питания для плода, например белки яйца (овальбумины). Основной белок молока (казеин) также выполняет главным образом питательную функцию. Ряд других белков используется в организме в качестве источника аминокислот, кото рые в свою очередь являются предшественниками биологически активных веществ, регулирующих процессы метаболизма.

Можно назвать еще некоторые другие жизненно важные функции бел ков. Это, в частности, экспрессия генетической информации, генерирование и передача нервных импульсов, способность поддерживать онкотическое * Получены экспериментальные доказательства, что, помимо белков, ферментативной, каталитической активностью наделен и ряд других макромолекул, в частности РНК (названы рибозимами) и моно- и поликлональные антитела (абзимы) – см. главу «Ферменты».

давление в клетках и крови, буферные свойства, поддерживающие физио логическое значение рН внутренней среды, и др.

Таким образом, из этого далеко не полного перечня основных функций белков видно, что указанным биополимерам принадлежит исключительная и разносторонняя роль в живом организме. Если попытаться выделить главное, решающее свойство, которое обеспечивает многогранность биоло гических функций белков, то следовало бы назвать способность белков строго избирательно, специфически соединяться с широким кругом разно образных веществ. В частности, эта высокая специфичность белков (срод ство) обеспечивает взаимодействие ферментов с субстратами, антител с антигенами, транспортных белков крови с переносимыми молекулами других веществ и т.д. Это взаимодействие основано на принципе биоспе цифического узнавания, завершающегося связыванием фермента с соответ ствующей молекулой субстрата, что содействует протеканию химической реакции. Высокой специфичностью действия наделены также белки, кото рые участвуют в таких процессах, как дифференцировка и деление клеток, развитие живых организмов, определяя их биологическую индивидуальность.

СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ Наиболее богаты белковыми веществами ткани и органы животных. Источ ником белка являются также микроорганизмы и растения. Большинство белков хорошо растворимо в воде. Некоторые органические вещества, выделенные из хряща, волос, ногтей, рогов, костной ткани и нерастворимые в воде, также были отнесены к белкам, поскольку по своему химическому составу оказались близки к белкам мышечной ткани, сыворотки крови, яйца.

В мышцах, легких, селезенке, почках на долю белков приходится более 70–80% от сухой массы, а во всем теле человека – 45% от сухой массы (табл. 1.1) *. В отличие от животных тканей в растениях содержится значительно меньше белков (табл. 1.2).

Таблица 1.1. Содержание белков в органах и тканях человека Содержание Содержание белков, % белков, % от сухой от обще- от сухой от обще Органы и ткани Органы и ткани массы го коли- массы го коли чества чества белка белка тела тела Кожа 63 11,5 Почки 72 0, Кости (твердые ткани) 20 18,7 Поджелудочная 47 0, Зубы (твердые ткани) 18 0,1 железа Поперечнополосатые 80 34,7 Пищеварительный 63 1, мышцы тракт Мозг и нервная ткань 45 2,0 Жировая ткань 14 6, Печень 57 3,6 Остальные ткани:

Сердце 60 0,7 жидкие 85 1, Легкие 82 3,7 плотные 54 14, Селезенка 84 0,2 Все тело 45 * Ряд таблиц и рисунков учебника заимствован из руководств Б.И. Збарского, И.И. Ива нова, С.Р. Мардашева (М., 1972) и Ю.Б. Филипповича (М., 1994).

Таблица 1.2. Содержание белков в органах животных и в растениях Содержание Содержание белков, % белков, % Органы животных Органы растений от массы от массы свежей ткани свежей ткани Мышцы 18-23 Семена 10- Печень 18-19 Стебли 1,5-3, Селезенка 17-18 Листья 1,2-3, Почки 16-18 Корни 0,5-3, Легкие 14-15 Фрукты 0,3-1, Мозг 7- Для изучения химического состава, строения и свойств белков их обычно выделяют или из тканей, или из культивируемых клеток, или биологических жидкостей, например сыворотки крови, молока, мышц, печени, кожи и др.

Элементный состав белков в пересчете на сухое вещество представлен 50–54% углерода, 21–23% кислорода, 6,5–7,3% водорода, 15–17% азота и до 0,5% серы. В составе некоторых белков присутствуют в небольших количествах фосфор, железо, марганец, магний, йод и др.

Таким образом, помимо углерода, кислорода и водорода, входящих в состав почти всех органических полимерных молекул, обязательным ком понентом белков является азот, в связи с чем белки принято обозначать как азотсодержащие органические вещества. Содержание азота более или менее постоянно во всех белках (в среднем 16%), поэтому иногда определяют количество белка в биологических объектах по содержанию белкового азота.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также для изучения их химического состава и структуры непре менным условием является получение белков из природных источников в химически чистом, гомогенном состоянии. Последовательность операций по выделению белков обычно состоит в следующем: измельчение биологи ческого материала (гомогенизация);

извлечение белков, точнее, перевод белков в растворенное состояние (экстракция);

выделение исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистка и получение индивидуального белка.

Белковые вещества весьма чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов (органические растворители, кислоты, щелочи). Поэтому обычные методы органической химии, приме няемые для выделения того или иного вещества из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, кристаллизация и др.), в данном случае неприемлемы.

Белки в этих условиях подвергаются денатурации, т.е. теряют некоторые существенные природные (нативные) свойства, в частности растворимость, биологическую активность. Разработаны эффективные методы выделения белков в «мягких» условиях, при низкой температуре (не выше 4°С), с применением щадящих нативную структуру химических реагентов.

Гомогенизация биологического материала Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани животных, микроорганизмы, растения) исследуемый материал тщательно измельчают до гомогенного состояния, т.е. подвергают дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной структуры. Эту процедуру, называемую гомогенизацией, проводят при помощи ножевых гомогенизаторов типа Уорринга или пестикового гомогенизатора Поттера–Эльвегейма. Для выделения ряда белков из плотных животных и растительных объектов часто используют валковые или шаровые мельницы (рис. 1.1). Успешно применяется также метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, в основе действия которого лежит разрушение клеточной оболочки, вызванное кристаллами льда. Для дезинтеграции тканей используют также ультразвук, пресс-методы (замороженный биоматериал пропускают через мельчайшие отверстия стального пресса под высоким давлением) и метод «азотной бомбы», при котором клетки (в частности, микробные) сначала насыщают азотом под высоким давлением, затем резко сбрасывают давле ние – выделяющийся газообразный азот как бы «взрывает» клетки.

Экстракция белков Современные методы измельчения тканей обычно сочетают с одновремен ной экстракцией белков из гомогенатов тканей. Большинство белков тканей хорошо растворимо в 8–10% растворах солей. При экстракции белков широко применяют различные буферные смеси с определенными значения ми рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты – вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами.

Из органических соединений, помимо давно применяемых водных раст воров глицерина, широко используют (особенно для солюбилизации) сла бые растворы сахарозы. На растворимость белков при экстракции большое влияние оказывает рН среды, поэтому в белковой химии применяют фосфатные, цитратные, боратные буферные смеси со значениями рН от кислых до слабощелочных, которые способствуют как растворению, так и стабилизации белков. Особенно широкое распространение получили трис-буферные системы, представляющие собой смеси 0,2 М раствора трис-(оксиметил)-аминометана (HOCH2)3CNH2 (сокращенно обозначают «трис») с 0,1 М раствором хлороводородной кислоты в разных соотноше ниях. Для выделения белков сыворотки крови используют способы их осаждения этанолом (см. метод Кона), ацетоном, бутанолом и их комби нации. Почти все органические растворители разрывают белок-липидные связи, способствуя лучшей экстракции белков.

Для получения из биологического материала белков в чистом, гомо генном, состоянии применяют различные детергенты, способствующие расщеплению белок-липидных комплексов и разрыву белок-белковых свя зей *. В частности, для освобождения белков (ферментов), прочно связан ных с биомембранами митохондрий или других субклеточных структур, применяют тритон Х-100, додецилсульфат натрия и дезоксихолат натрия.

СН3—(СН2)10—СН2—O—SO3Na Додецилсульфат натрия С8Н17—(С6Н4)—O—(СН2—СНОН)10Н Тритон Х- * Здесь имеется в виду разрушение так называемых слабых связей (см. далее). Пептидные и другие ковалентные связи в белковых молекулах стараются сохранять.

2 а в б Рис. 1.1. Лабораторное оборудование.

а – пестиковый ручной гомогенизатор: 1 – пестик, 2 – корпус, 3 – мотор, 4 – штатив;

механиче ский гомогенизатор (б) и шаровая мельница (в): 1 – корпус с электродвигателем и пусковым устройством, 2 – камера для измельчения материала.

Следует, однако, иметь в виду, что детергенты, вызывая разрыв белок белковых связей, разрушают олигомерную (четвертичную) структуру бел ков.

Фракционирование и очистка белков После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в раст воренное состояние, приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфаз ных системах, кристаллизацию и др.

Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в прост ранстве молекул воды. По химическим и физическим свойствам вода, входящая в состав гидратной оболочки, отличается от чистого растворите ля. В частности, температура замерзания ее составляет –40°С. В этой воде хуже растворяются сахара, соли и другие вещества. Растворы белков отли чаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факто ров, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных метал лов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок.

Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочнозе мельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимо логии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбу минов (выпадают при 100% насыщении).

На величину высаливания белков оказывают влияние не только природа и концентрация соли, но и рН среды и температура. Считают, что главную роль при этом играет валентность ионов. Действие разных ионов принято сравнивать не по молярной концентрации соли, а по так называемой ионной силе (), которая равна половине суммы произведений концент рации каждого иона (с) на квадрат его валентности (V):

Более тонкое разделение белков плазмы крови человека на фракции достигается при использовании различных концентраций этанола при низкой температуре (от –3 до –5°С) по методу Кона (рис. 1.2). В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. Указанным методом часто пользуются для получения отдельных фракций крови, используемых в качестве кровезаменителей.

Белки плазмы Ал ь бу мин ы Рис. 1.2. Диаграмма фракциониро вания белков плазмы крови чело века этанолом (по методу Кона).

В последнее время наибольшее распространение получили хроматогра фические и электрофоретические методы разделения белков.

Хроматография. Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. рус ским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбировать ся на адсорбенте, заключенном в колонке *.

В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы ад сорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-де сорбции).

Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из смеси оказалась колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различ ными ионообменными смолами и производными целллюлозы в качестве носителей. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография по сродству) – в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них. Хроматография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов.

Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов смеси (образ ца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте.

В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в стеклянную вертикальную трубку (колонку) и равномерно в ней упаковы вают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку – * Это выдающееся открытие русского ученого было достойно оценено мировой научной общественностью. Вот, например, что писал в 1948 г. швейцарский ученый П. Каррер:

«Никакое другое открытие не оказало такого огромного влияния и так не расширило возможности исследования химика-органика, как хроматографический анализ Цвета. Исследо вания в области витаминов и гормонов, каротиноидов и многочисленных других природных соединений никогда не могли бы развиться так быстро и дать такие большие результаты, если бы они не были основаны на новом методе, который позволил установить факт наличия в природе разнообразия родственных соединений».

Элюент Смесь В А и В Рис. 1.3. Абсорбционная хромато В графия (схема). Разделение двух А Аl2О разных веществ (А и В), переме А щающихся по колонке с разной скоростью.

1 - нанесение образца на колонку;

2 середина опыта;

3 - окончание опыта.

1 2 компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте. Затем при ступают к стадии освобождения – десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты (рис. 1.3). Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

Распределительная хроматография. В отличие от адсорбционной твер дая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы.

Один из типов распределительной хроматографии, как и адсорбционная, осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель. Образец растворяют в под ходящем растворителе, затем наносят на колонку;

разделяемые вещества, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной ста ционарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органического раст ворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки. Собранные при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно вещество, соединяют для выделения этого вещества в чистом виде.

Разновидностью распределительной хроматографии является хромато графия на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других веществ (рис. 1.4). В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги. Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в подходящую смесь органических растворителей (например, бутанол–уксусная кислота–вода в определенных соотношениях). При дви жении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушива ют, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют хими ческими или физико-химическими методами.

В А Б Рис. 1.4. Хроматография на бума ге (схема).

А – восходящая хроматография;

Б – ни сходящая хроматография (вид сбоку);

В – хроматограмма с разделенными и окрашенными веществами: 1 – фронт растворителя, 2 – разделенные вещест ва, 3 – место нанесения образца.

Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются поли мерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основания ми и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы. Из сильно- и слабооснов ных анионообменников чаще используют производные полистирола и цел люлозы, несущие функциональные группы:

Триметиламинополистирол Диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) Аналогичные функциональные группы содержат триэтиламиноэтил (ТЭАЭ)- и аминоэтил (АЭ)-целлюлозы.

Катионообменники представлены сульфонированными полистиролами (производные винилбензола или дивинилбензола) и карбоксиметилцеллю лозой, имеющими следующие функциональные группы:

В зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают с колонки, применяя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.

Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высоко эффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), широко используются в фармакологии (при создании и определении лекарственных веществ), в клинической биохимии (при определении биологически активных веществ в физиологических жидкостях), в биотехнологических процессах и произ водствах и других областях: они позволяют определять вещества в нано-, пико- и фемтаграммных количествах.

Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носи телем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинст вом метода является возможность одноэтапно выделить заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты. При помощи аффинной хроматографии, например, удалось сравнительно легко выделить очищен ные препараты аминоацил-тРНК-синтетаз на полиакрилгидразидагаровом геле, к которому в качестве лигандов были присоединены определенные тРНК (транспортные РНК).

Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек страна * образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нераствори мых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку. Разделение веществ этим мето дом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, дви гаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки;

небольшие молекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой:

V = V0 + K•Vi где V – объем элюирующей жидкости вещества с данным К, мл;

V0 – свобод ный объем колонки или общий объем внешнего растворителя (вне зерен геля), мл;

Vi – объем растворителя внутри геля, мл;

K – коэффициент распре деления для растворенного вещества между растворителем внутри зерен геля и окружающим растворителем. Если анализируемую пробу, содержа щую одно растворенное вещество с К = 1 и второе с К = 0, внести в колонку с сефадексом, то второе вещество появится в элюирующей жидкости сразу после выхода из колонки V0, а первое – только после выхода объема V0 + Vi.

Поскольку молекулы белков, обладающие большими молекулярной массой и размерами, не диффундируют внутрь зерен сефадекса, они первыми вымываются из колонки после выхода свободного объема колон ки V0, в то время как все остальные вещества (включая низкомолекулярные примеси) вымываются после выхода объема, равного V0 + К • Vi.

Метод нашел широкое применение в препаративной энзимологии.

С помощью сефадекса можно разделить белки с разной молекулярной массой.

Электрофорез. Метод свободного электрофореза, детально разработан ный лауреатом Нобелевской премии А. Тизелиусом, основан на различии в скорости движения (подвижности) белков в электрическом поле, которая * Декстран является полисахаридом, синтезируемым микроорганизмами. Сефадекс – коммерческий препарат, свое название получил от начальных слогов трех слов: separation (разделение), Pharmacia (наименование фармацевтической фирмы в Швеции), dextran (дек стран). Наряду с сефадексом для разделения белков и других биомолекул используют также сефарозу, сефакрил, биогели, молселект, акрилекс и др.

А Б В Г Рис. 1.5. Гель-хроматография на колонке с сефадексом (схема).

Большие светлые кружки с крести ками - зерна сефадекса;

малые чер ные и красные кружки и треуголь ники - белки с различной молеку лярной массой;

А - колонка в нача ле работы;

Б, В, Г - колонка в раз личные периоды времени. На гра фике элюции четко видно разделе мл ние белковых компонентов.

определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. В последнее время более широкое распространение получили методы зонального электрофореза белков на различных носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахма ла и полиакриламида, целлюлозе. Преимущества их по сравнению с мето дом свободного электрофореза состоят в том, что исключается размывание границы белок-растворитель в результате диффузии и конвекции, не требуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения границы, а для анализа необходимо небольшое количество белка (подробно эти методы и соответствующая аппаратура рассматриваются в практиче ских руководствах по биохимии).

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования бел ков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. discontinuous – прерывистый, перемежающийся) в полиакриламид ном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями рН и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при элект рофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле – 10, а в полиакрил амидном геле – до 18 разных белковых фракций.

Для выявления белков при электрофорезе в гелях их обрабатывают одним из следующих красителей: бромфеноловым синим, амидо черным 10В, кислотным синим 83, кумасси бриллиантовым голубым R-250 и др.

Интенсивность окраски и соответственно относительное содержание каж дой белковой фракции обычно определяют денситометрически путем пря мого сканирования на денситометре. В последние годы стали применять методы электрофореза белков с градиентом концентрации геля, что зна чительно повышает разрешающую способность, особенно при фракциони ровании белков с высокой молекулярной массой, превышающей 50000– 100000.

Весьма перспективными методами разделения белков (как и определе ния ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты метода изоэлектрического фокусирования – изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах (на колонке или в тонком слое) с градиентом рН. Точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении рН равен нулю. При использовании Концентраци я метода изоэлектрического фокусирования применяют смеси синтетических полиаминополикарбоновых кислот (амфолины) для создания градиента рН в диапазоне от 3,0 до 10,0.

В последние годы широкое распространение для фракционирования белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск электрофореза в полиакриламидном геле – методы двухмерного электрофо реза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций.

Очистка белков от низкомолекулярных примесей Применение в определенной последовательности ряда перечисленных мето дов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей. Для полного освобождения белков от низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы диализа, гельхроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. При диа лизе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомо лекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при мед ленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических белков *. Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.

Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекуляр ных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтра ции. Последняя основана на продавливании растворов белка через спе циальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.

Определение гомогенности белков На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретиче ских, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравита ционных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в виде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая * Первый кристаллический фермент уреаза был получен Д. Самнером в 1926 г.

и т.д.), то эти данные с большой долей вероятности могут свидетельство вать об однородности исследуемого белка.

В основе иммунохимического метода контроля гомогенности исследуе мого белка лежит реакция преципитации его с соответствующей антисыво роткой, полученной от иммунизированных этим белком животных. Для строгого доказательства гомогенности белка требуется одновременное использование нескольких методов.

Не потерял своего значения и метод кристаллизации белков с использо ванием сульфата аммония, а также метод определения растворимости белка. Последний, предложенный еще Д. Нортропом *, основан на правиле фаз Гиббса, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от количества вещества, находящегося в твердой фазе. Метод может быть выполнен сравнительно легко и быстро в микромасштабах. Обычно опреде ляют растворимость увеличивающегося количества исследуемого белка при постоянном количестве растворителя.

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ Несмотря на то что первая аминокислота – глицин – была выделена А. Бра конно еще в 1820 г. из кислотного гидролизата желатина, полный амино кислотный состав белков был расшифрован только к 30-м годам XX в.

Большая заслуга в этом принадлежит работам Н.Н. Любавина, который в 1871 г. установил, что под действием ферментов пищеварительных соков белки расщепляются на аминокислоты.

Были сделаны два важных вывода: 1) в состав белков входят аминокис лоты;

2) методами гидролиза может быть изучен химический, в частности амнокислотный, состав белков.

Для изучения аминокислотного состава белков пользуются сочетанием кислотного (НСl), щелочного [Ва(ОН)2] и, реже, ферментативного гидро лиза ** или одним из них. Установлено, что при гидролизе чистого белка, не содержащего примесей, освобождаются 20 различных -аминокислот. Все другие открытые в тканях животных, растений и микроорганизмов амино кислоты (более 300) существуют в природе в свободном состоянии либо в виде коротких пептидов или комплексов с другими органическими веществами.

-Аминокислоты представляют собой производные карбоновых кислот, у которых один водородный атом, у -углерода, замещен на аминогруппу (—NH2), например:

Жирная кислота -Аминокислота * В лаборатории Нортропа в 1930-1931 гг. впервые получены в химически индивидуаль ном и кристаллическом состоянии пепсин, химотрипсин и трипсин.

** При кислотном и щелочном гидролизе белков наблюдается почти полный распад триптофана и цистеина, поэтому для их определения предложены специальные методы.

Следует подчеркнуть, что все аминокислоты, входящие в состав природ ных белков, являются -аминокислотами, хотя аминогруппа в свободных аминокарбоновых кислотах может находиться, как увидим ниже, в -, -, и -положениях.

Классификация аминокислот Все встречающиеся в природе аминокислоты обладают общим свойством – амфотерностью (от греч. amphoteros – двусторонний), т.е. каждая амино кислота содержит как минимум одну кислотную и одну основную группы.

Общий тип строения -аминокислот может быть представлен в следующем виде:

Как видно из общей формулы, аминокислоты будут отличаться друг от друга химической природой радикала R, представляющего группу атомов в молекуле аминокислоты, связанную с -углеродным атомом и не участ вующую в образовании пептидной связи при синтезе белка. Почти все -амино- и -карбоксильные группы участвуют в образовании пептидных связей белковой молекулы, теряя при этом свои специфические для свобод ных аминокислот кислотно-основные свойства. Поэтому все разнообразие особенностей структуры и функции белковых молекул связано с химической природой и физико-химическими свойствами радикалов аминокислот.

Именно благодаря им белки наделены рядом уникальных функций, не свойственных другим биополимерам, и обладают химической индивидуаль ностью.

Классификация аминокислот разработана на основе химического строе ния радикалов, хотя были предложены и другие принципы. Различают ароматические и алифатические аминокислоты, а также аминокислоты, содержащие серу или гидроксильные группы. Часто классификация осно вана на природе заряда аминокислоты. Если радикал нейтральный (такие аминокислоты содержат только одну амино- и одну карбоксильную груп пы), то они называются нейтральными аминокислотами. Если аминокис лота содержит избыток амино- или карбоксильных групп, то она называ ется соответственно основной или кислой аминокислотой.

Современная рациональная классификация аминокислот основана на полярности радикалов (R-групп), т.е. способности их к взаимодействию с водой при физиологических значениях рН (близких к рН 7,0). Различают 5 классов аминокислот, содержащих следующие радикалы: 1) неполярные (гидрофобные);

2) полярные (гидрофильные);

3) ароматические (большей частью неполярные);

4) отрицательно заряженные и 5) положительно заря женные. В представленной классификации аминокислот (табл. 1.3) приведе ны наименования, сокращенные английские и русские обозначения и одно буквенные символы аминокислот, принятые в отечественной и иностранной литературе, а также значения изоэлектрической точки (рI) и молекулярной массы (М). Отдельно даются структурные формулы всех 20 аминокислот белковой молекулы.

Таблица 1.3. Классификация аминокислот, основанная на полярности радикалов Принятые сокращенные Среднее обозначения и однобук Аминокислоты М/рI содержание венные символы в белках, % англ. символ русск.

I. Неполярные R-группы Глицин Gly G Гли 75/5,97 7, Аланин Ala A Ала 89/6,02 9, Валин Val V Вал 117/5,97 6, Лейцин Leu L Лей 131/5,97 7, Изолейцин Ile I Иле 131/5,97 4, Пролин Pro P Про 115/6,10 4, II. Полярные, незаряжен ные R-группы Серин Ser S Сер 105/5, 7, Треонин Thr Т Тре 119/6,53 6, Цистеин Cys C Цис 121/5,02 2, Метионин Met M Мет 149/5,75 1, Аспарагин Asn N Асн 132/5,41 4, Глутамин Gln Глн 146/5,65 3, Q III. Ароматические R группы Фенилаланин Phe F Фен 165/5,98 3, Тирозин Tyr Y Тир 181/5,65 3, Триптофан Trp W Трп 204/5, 1, IV. Отрицательно заря женные R-группы Аспарагиновая Asp D Асп 133/2,97 5, кислота Глутаминовая Glu E Глу 147/3,22 6, кислота V. Положительно заря женные R-группы Лизин Lys К Лиз 146/9,74 7, Аргинин Arg R Арг 174/10,76 4, Гистидин His H Гис 155/7, 2, Неполярные R-группы L-аланин L-валин L-лейцин L-пролин L-изолейцин L-глицин Полярные, незаряженные R-группы L-глутамин L-серин L-цистеин L-треонин L-метионин L-аспарагин Отрицательно заряженные R-группы L-глутаминовая кислота L-аспарагиновая кислота Положительно заряженные R-группы L-гистидин L-лизин L-аргинин Ароматические R-группы L-тирозин L-фенилаланин L-триптофан Перечисленные аминокислоты присутствуют в разных количественных соотношениях и последовательностях в тысячах белков, хотя отдельные индивидуальные белки не содержат полного набора всех этих аминокислот.

Помимо наличия в большинстве природных белков 20 аминокислот, в неко торых белках обнаружены производные аминокислот *: оксипролин, окси лизин, дийодтирозин, фосфосерин и фосфотреонин (последние две амино кислоты представлены в главе 2):

Оксилизин Оксипролин 3,5-Дийодтирозин Первые две аминокислоты содержатся в белке соединительной ткани – коллагене, а дийодтирозин является основой структуры гормонов щитовид ной железы. В мышечном белке миозине обнаружен также -N-метиллизин;

в состав протромбина (белок свертывания крови) входит -карбоксиглута миновая кислота, а в глутатионпероксидазе открыт селеноцистеин, в кото ром ОН-группа серина заменена на селен (Se):

-N-метиллизин -Карбоксиглутаминовая Селеноцистеин кислота Помимо указанных, ряд -аминокислот выполняет важные функции в обмене веществ, хотя и не входит в состав белков, в частности орнитин, цитруллин, гомосерин, гомоцистеин, цистеинсульфиновая кислота, диокси фенилаланин и др.

Общие свойства аминокислот Кислотно-основные свойства. Эти свойства аминокислот определяют многие физико-химические и биологические свойства белков. На этих свойствах основаны, кроме того, почти все методы выделения и идентификации аминокислот. Аминокислоты легко растворимы в воде. Они кристалли зуются из нейтральных водных растворов в форме биполярных (амфотер ных) ионов (цвиттерионов), а не в виде недиссоциированных молекул (последнюю структуру приводят для удобства представления, однако все аминокислоты при физиологических значениях рН имеют структуру цвитте риона).

Цвиттерион * Эти аминокислоты образуются после завершения синтеза белка в рибосоме клеток в результате постсинтетической химической модификации.

При растворении в воде кристаллическая аминокислота, например аланин, может реагировать или как кислота (донатор протона):

+ NH3CH(CH3)COO– <=> H+ + NH2CH(CH3)COO–, или как основание (акцептор протона):

+ NH3CH(CH3)COO– + H+ <=>+NH3CH(CH3)COOH.

Если радикалы аминокислот нейтральные, то они почти не оказывают влияния на диссоциацию -карбоксильной группы или -аминогруппы, и величины рК (отрицательный логарифм константы диссоциации) остают ся относительно постоянными. Вследствие этого кривые диссоциации почти всех нейтральных аминокислот накладываются друг на друга и могут быть рассмотрены на примере аланина. Если к раствору аланина (например, 0,1 М) в воде постепенно прибавлять сильную кислоту (0,1 М раствор НСl) или сильную щелочь (0,1 М раствор NaOH), то получим кривую титрова ния аланина, типичную для всех нейтральных аминокислот (рис. 1.6).

Кажущиеся величины рК' для -карбоксильной группы и -аминогрупп (т.е. значения рН, при которых эти группы в среднем наполовину диссоции рованы) довольно сильно различаются, составляя pK1 = 2,34 и рК2 = 9,69.

При низком значении рН (ниже pK1') почти все молекулы аланина являются полностью протонированными и несут положительный заряд. Другими словами, при высокой концентрации водородных ионов в растворе тенден ция к диссоциации водорода из структуры аланина оказывается незначи тельной. Из кривой титрования видно, что точка перехода между ветвями кривой располагается при рН 6,02. Это означает, что при данном значении рН суммарный (или средний) электрический заряд молекулы аланина равен нулю и она не перемещается в электрическом поле ни к аноду, ни к катоду (изоэлектрическое состояние). Такое значение рН получило название изо электрической точки и обозначается pI. Изоэлектрическая точка аминокис лот, не содержащих дополнительных NH2- или СООН-групп, представляет собой среднее арифметическое между двумя значениями рК':

pl = соответственно для аланина 2,34 + 9, = 6,02.

pl = Изоэлектрическая точка ряда других аминокислот, содержащих допол нительные кислотные или основные группы (аспарагиновая и глутаминовая кислоты, лизин, аргинин, тирозин и др.), зависит, кроме того, от кислот ности или основности радикалов этих аминокислот. Для лизина, например, рI должна вычисляться из полусуммы значений рК' для - и -NН2-групп.

Таким образом, в интервале рН от 4,0 до 9,0 почти все аминокислоты существуют преимущественно в форме цвиттерионов с протонированной аминогруппой и диссоциированной карбоксильной группой. Следует отме pK2 = 9, рН pI = 6, pK1 = 2, Рис. 1.6. Кривые, полученные при титровании 0,1 М раствора алани на 0,1 М раствором НСl (а) и 0,1 М раствором NaOH (б).

а б тить, что при физиологических значениях рН тканей и крови (7,1 и 7, соответственно) аминокислоты (за ислючением гистидина) не обладают измеримой буферной емкостью. Эту способность они приобретают только при значениях рН, близких к величинам их рК (т.е. при рН 1,7–3, и 8,6–10,8).

Стереохимия аминокислот. Важнейшим свойством аминокислот, осво бождающихся в процессе гидролиза природных белков в условиях, исклю чающих рацемизацию, является их оптическая активность. Будучи раство ренными в воде (или в НСl), они способны вращать плоскость поляризо ванного луча (исключение составляет глицин). Это свойство связано с нали чием в молекуле всех природных аминокислот (за ислючением глицина) в -положении асимметрического атома углерода (т. е. атома углерода, все четыре валентные связи которого заняты различными заместителями).

Величины удельного вращения вправо или влево являются количественной характеристикой оптической активности, и для большинства аминокислот составляет от 10 до 30°. Примерно половина аминокислот белков оказалась правовращающей, их обозначают знаком «+» (Ала, Иле, Глу, Лиз и др.), а чуть меньше половины – левовращающей (Фен, Трп, Лей и др.), их обозначают знаком «–». Все эти аминокислоты принадлежат к L-ряду, а величина и знак оптического вращения зависят от природы радикалов аминокислот и значения рН раствора, в котором измеряют оптическое вращение.

Стереохимию аминокислот принято оценивать не по оптическому вра щению, а исходя из абсолютной конфигурации всех четырех замещающих групп, расположенных вокруг асимметрического атома углерода в верши нах модели тетраэдра. Абсолютную конфигурацию аминокислот принято соотносить стереохимически с соединением, произвольно взятым для срав нения, а именно с глицериновым альдегидом, также содержащим асиммет рический атом углерода. Ниже представлены L- и D-стереоизомеры глице ринового альдегида. Рядом показаны пространственные конфигурации L и D-аланина:

L-глицеральдегид D-глицеральдегид L-аланин D-аланин Все аминокислоты, образующиеся при гидролизе природных белков в условиях, исключающих рацемизацию, принадлежит к L-ряду. Таким образом, природные аминокислоты имеют пространственное расположе ние, аналогичное конфигурации L-глицеринового альдегида. Следует еще раз подчеркнуть, что символы L и D означают принадлежность данной аминокислоты по своей стереохимической конфигурации к L- или D-ряду, в то время как знак «+» или «–» указывает на направление изменения плоскости поляризации светового луча. Среди белковых аминокислот имеются две аминокислоты (треонин и изолейцин), которые содержат по два асимметрических атома углерода. Следовательно, если не в природе, то, во всяком случае, в лаборатории возможно получить четыре стереоизо мерные формы этих аминокислот *. Для треонина известны все четыре изомера. Если условно обозначить символом L выделенный из природных белков треонин, то его зеркальное отображение называют D-треонином.

Два других изомера, получивших наименование диастереоизомеров, или аллоформ, также могут иметь L- и D-формы. Структурные конфигурации всех четырех стереоизомеров треонина можно представить следующими формулами:

D-аллотреонин L-аллотреонин L-треонин D-треонин Как отмечалось, в белковой молекуле D-аминокислоты не обнаруже ны **, однако в живой природе они широко распространены.

Так, D-изомеры глутаминовой кислоты, аланина, валина, фенилаланина, лейцина и ряда других открыты в клеточной стенке бактерий;

в составе некоторых антибиотиков, в частности актиномицинов, бацитрацина, грами цидинов А и S, содержатся аминокислоты D-конфигурации.

Аминокислотный состав (качественный и количественный) многих тысяч белков, полученных из разных источников, выяснен (табл. 1.4).

При анализе данных табл. 1.4 виден ряд закономерностей. На долю дикарбоновых аминокислот и их амидов в большинстве белков приходится до 25–27% всех аминокислот. Эти же аминокислоты вместе с лейцином и лизином составляют около 50% всех аминокислот. В то же время на долю таких аминокислот, как цистеин, метионин, триптофан, гистидин, приходится не более 1,5–3,5%. В протаминах и гистонах отмечено высокое содержание основных аминокислот аргинина и лизина, соответственно 26, и 85,2% (см. «Химия простых белков»).

Химические реакции для открытия и определения аминокислот в гидроли затах белков. В курсе органической химии подробно рассмотрено множест во химических реакций, характерных для -амино- и -карбоксильных групп аминокислот (ацилирование, алкилирование, нитрование, этерификация * При чисто химическом (но не ферментативном) синтезе аминокислот в лаборатории обычно образуется оптически неактивная смесь L- и D-изомеров, обозначаемых как DL аминокислоты, или рацематы.

** D-Аминокислоты, очевидно, не играют важной физиологической роли в организме животных и человека, хотя в органах и тканях содержатся весьма активные ферменты, катализирующие их распад (см. главу 12 «Промежуточный обмен аминокислот в тканях»). L и D-аминокислоты различаются, кроме того, по вкусу: первые – горькие, вторые – сладкие.

Таблица 1.4. Аминокислотный состав некоторых природных белков, в процентах Белок Альбу -Гло Гистон мин (сы Саль- Инсу- Колла булин (печень Пепсин Казеин воротка мин лин ген (чело телен челове века) Аминокислота ка) ка) – – – Аланин 7,6 3,2 4,5 9, 1, Глицин 2,9 5,8 2,0 1,6 4,2 6,4 4,3 27, 5,5 7,2 7,7 9, Валин 3,1 7,1 7,7 3, Лейцин 0 9,2 11,0 9,3 10,4 13,2 – 9, Изолейцин 1,6 4,6 6,1 1,7 2,7 10,8 2,8 5, Пролин 5,8 3,4 10,6 5,0 2,5 15, 5,1 8, Фенилаланин 0 3,5 5,0 7,8 4,6 6,4 8,8 2, Тирозин 0 3,9 6,3 4,7 6,8 8,5 13,0 1, 0,2 2,9 2,4 0 Триптофан 0 – 1, Серин 9,1 4,1 6,3 3,3 11,4 12,2 5,2 3, Треонин 0 6,4 4,9 4,6 8,4 9,6 2,1 2, Цистеин + цистин 0 – 0,3 6, 3,1 2,1 12,5 Метионин 0 0,9 2,8 1,3 1,7 – 0, 1, Аргинин 85,2 14,8 4,1 6,2 4,8 1,0 8, 3, Гистидин 0 2,3 3,5 2,5 0,9 4,9 0, 3, Лизин 0 11,7 8,2 12,3 8,1 0,9 2,5 4, Аспарагиновая кислота 0 5,5 7,1 9,0 8,8 16,0 6,8 6, Глутаминовая кислота 0 10,3 22,4 17,0 11,8 11,9 18,6 11, Амидный азот 0 0,7 1,6 0,9 1,3 1,4 0, 1, и др.). Здесь будут рассмотрены общие цветные реакции для обнаружения индивидуальных аминокислот и аминокислот, входящих в состав белков, основанные на химической природе радикалов аминокислот (табл. 1.5).

Для открытия в биообъектах и количественного определения аминокис лот успешно применяется реакция их с нингидрином. На I стадии реакции образуется восстановленный нингидрин за счет окислительного дезами нирования аминокислот (параллельно происходит декарбоксилирование аминокислот):

+ СО2 + NH3 + Аминокислота Восстановленный Окисленный нингидрин нингидрин На II стадии образовавшийся аммиак реагирует с эквимолярными количествами окисленного и восстановленного нингидрина, образуя сине фиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570 нм) про порциональна количеству аминокислоты:

На основе нингидриновой реакции были разработаны методы количест венного определения аминокислот, в частности метод распределительной хроматографии на бумаге, впервые внедренный в 1944 г. (А. Мартин и Р. Синдж). Эта же реакция используется благодаря своей высокой чувствительности в автоматическом анализаторе аминокислот. Впервые такой прибор сконструировали Д. Шпакман, С. Мур и У. Стейн (рис. 1.7).

После разделения смеси аминокислот в колонках, заполненных специаль ными ионообменными смолами (сульфополистирольный катионит), ток элюента из колонки поступает в смеситель, туда же поступает раствор нингидрина;

интенсивность образующейся окраски автоматически измеря ется на фотоэлектроколориметре и регистрируется самописцем. Этот метод нашел широкое применение в клинической практике при исследовании крови, мочи, спинномозговой жидкости. С его помощью за 2–3 ч можно получить полную картину качественного состава аминокислот в биологи Таблица 1.5. Реакции, используемые для идентификации и полуколичественного определения аминокислот и белков Определяемая Реакция Реактивы Окраска аминокислота Миллона HgNO в азотной кислоте в при- Тирозин Красная сутствии азотистой кислоты Ксантопротеи- Кипящая концентрированная Фенилаланин, Желтая новая азотная кислота тирозин Гопкинса- Глиоксиловая кислота в кон- Триптофан Сине-фиоле Коула центрированной серной кислоте товая Эрлиха n-Диметиламинобензальдегид Триптофан Синяя в концентрированной хлорис товодородной кислоте Сакагучи -Нафтол и гипохлорит натрия Аргинин Красная Нитропрус- Нитропруссид натрия в разбав- Цистеин Красная сидная ленном растворе аммиака Салливена 1,2-Нафтохинон-4-сульфонат Цистеин » натрия и бисульфит натрия Паули Диазотированная сульфанило- Гистидин, » вая кислота в щелочном раст- тирозин воре Фолина- Фосфомолибденово-вольфра- Тирозин Синяя Чокалтеу мовая кислота 100° БУФЕР НИНГИДРИН 1 2 Рис. 1.7. Работа автоматического анализатора аминокислот (принципиальная схема по Шпакману, Муру и Стейну).

1 - смеситель;

2 - фотоэлектроколориметр;

3 - самописец.

ческих жидкостях и выявить наличие в них необычных азотсодержащих веществ, что имеет важное диагностическое и прогностическое значение.

Автоматические анализаторы аминокислот все время совершенствуют ся, повышаются чувствительность методов и скорость проведения анализа.

Так, в современных приборах высокоэффективной жидкостной хроматогра фии (ВЭЖХ) удается проводить анализ гидролизата белка за 45 мин, определяя при этом концентрацию аминокислот в пикомолях (рис. 1.8).

Смесь аминокислот может быть успешно разделена также методом электрофореза на бумаге. При рН 6,0 возможно хорошее разделение кислых и основных аминокислот с нейтральными. В этом случае отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты будут двигаться к аноду, а положитель но заряженные – к катоду. Нейтральные аминокислоты остаются на линии старта.

Для их разделения электрофорез обычно проводят при рН 1,8–2,0, когда все они мигрируют к аноду с незначительным, но уловимым различием в подвижности. После электрофореза местоположение аминокислот на электофореграмме выявляют с помощью химических реакций, а после элюции окрашенных продуктов определяют их количественно.

Рис. 1.8. ВЭЖХ аминокислот по Цеху и Вольтеру. Разделение на колонке (3 х 250 мм), наполнен ной ионообменной смолой – поли стиролдивинилбензолом. Концент рация аминокислот 500 пмоль/л, реактив для детектирования – флюорескамин, образующий с аминогруппой сильно флюоресци рующее соединение.

1 - Асп;

2 - Тре;

3 - Сер;

4 - Глу;

5 - Гли;

6 - Ала;

7 - Цис;

8 - Вал;

9 - Мет;

10 Иле;

11 - Лей;

12 - Тир;

13 - Фен;

14 Лиз;

15 - Гис;

16 - Арг. Время, мин КОЛОНКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набу ханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электри ческом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давле ние, способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм (это свойство, обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, использует ся для количественного определения белков).

Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH2- и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований.

В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положитель ный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при очистке белков методом электрофореза.

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Раст воры белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую вязкость и незначительную способность к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков связан ряд характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект используется, кроме того, в современных методах микроскопии биологи ческих объектов. Молекулы белка не способны проникать через полупрони цаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических поражениях, например, почек капсула почечного клубочка (Шумлянского Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови и по следние появляются в моче.

Молекулярная масса белков Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры белка. Такие полипептидные цепи получили название субъединиц. Их мол.

масса варьирует в широких пределах – от 6000 до 100000 и более.

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строе ние не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молеку лярной массы белков методами седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах *, в которых удается создать центробежные ускорения * Впервые ультрацентрифуга была сконструирована шведским ученым Т. Сведбергом.

Прибор был снабжен оптической приставкой, способной периодически через равные промежут ки времени фотографировать процесс осаждения (седиментации) белковых частиц.

(g), превышающие в 200000 и более раз ускорение земного притяжения.

Обычно вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации моле кул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница растворитель белок (регистрируется автоматически). Оптические свойства растворителя и белка используются при определении скорости седиментации;

последнюю выражают через константу седиментации s, которая зависит как от массы, так и от формы белковой частицы:

где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с;

– угло вая скорость ротора, рад/с;

r – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см. Константа седиментации имеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации, равная 1•10–13 с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S).

Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.

Для вычисления молекулярной массы (М), помимо константы седимен тации, необходимы дополнительные сведения о плотности растворителя и белка и другие согласно уравнению Сведберга:

где R – газовая постоянная, эрг/(моль•град);

Т – абсолютная температура (по шкале Кельвина);

s – константа седиментации;

– плотность раствори теля;

v – парциальный удельный объем молекулы белка;

D - коэффициент диффузии.

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифуги рования требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры.

Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молеку лярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как показано на рис. 1.9.

Известно, что между логарифмом молекулярной массы белка, имеюще го сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависи мость. Поэтому легко определить молекулярную массу исследуемого белка, зная его объем элюции. Второй разновидностью этого метода является тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка (в миллиметрах) мл VЭ Рис. 1.9. Измерение объема элюции (VЭ).

Концентраци я Рис. 1.10. Зависимость между длиной пробега белковых частиц при гель-хро матографии в тонком слое сефадекса Г-150 (сверхтонкого) и их молекуляр ными массами (в полулогарифмической системе координат).

1 - рибонуклеаза;

2 - химотрипсиноген;

3 яичный альбумин;

4 - сывороточный альбу мин;

5 - -глобулин;

Х - белок с неизвестной Молекулярная масса x 10– молекулярной массой.

через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от молекулярной массы белка (рис. 1.10).

Гель-хроматография, кроме простоты и быстроты, имеет дополнитель ное преимущество: не требуется выделять белок в чистом виде, так как примеси других белков не мешают определению, поскольку каждый из них проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемой молекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимо логии, когда оказывается возможным определение молекулярной массы даже очень небольшого количества фермента в присутствии других белков, не обладающих аналогичной каталитической активностью.

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков также строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвиж ностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11).

Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекуляр ной массы субъединиц белка.

Рис. 1.11. Зависимость между молеку лярной массой и относительной подвиж ностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогариф мической системе координат).

1 - сывороточный альбумин;

2 - яичный альбу мин;

3 - пепсин;

4 - химотрипсиноген;

5 - мио глобин;

6 - цитохром с;

Х - белок с неизвест Относительная подвижность ной молекулярной массой.

Длин а пробега, мм – Молекулярная масса х Недавно предложен новый масс-спектрометрический метод (так назы ваемый лазерный десорбционно-ионизационный метод), позволяющий оп ределять молекулярную массу небольших пептидов (вазопрессин, инсулин) и крупных биополимерных молекул и, кроме того, структуру биомолекул.

Форма белковых молекул О величине и форме белковых молекул раньше судили по данным ультра центрифугирования, двойного лучепреломления и диффузии. Эти данные указывали на существование в природе глобулярных (шарообразных) и фибриллярных (нитевидных) белков. В настоящее время общие представле ния о форме белковых молекул в основном подтвердились, однако только современные методы исследования позволили установить детали прост ранственной конфигурации (трехмерной структуры) белковых молекул.

Благодаря применению сканирующей микроскопии и рентгеноструктурного анализа (высокое разрешение, порядка 0,2–0,3 нм) удалось в деталях расшифровать не только полную пространственную структуру, форму, но и степень асимметрии белковых молекул во всех трех измерениях. Оказа лось, что даже глобулярные белки крови (гемоглобин, альбумины и гло булины) являются асимметричными в указанных измерениях. Следует отметить, что не только физико-химические, но и биологические свойства белков (в свободном или в связанном друг с другом или с другими биополимерами состоянии) определяются их пространственной структурой.

Денатурация белков Природные белковые тела наделены определенной, строго заданной прост ранственной конфигурацией и обладают рядом характерных физико-хими ческих и биологических свойств при физиологических значениях темпера туры и рН среды. Под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства. Таким образом, под денатурацией следует понимать нарушение общего плана уникальной структуры нативной молекулы белка, преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характер ных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическая активность и т.д.). Большинство белков денатурирует при нагревании их растворов выше 50–60°С.

Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых раство ров, увеличению количества свободных функциональных SH-групп и изме нению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной). При денатурации белка, вызванной 8М мочевиной или другим агентом, разрушаются в основном нековалентные связи (в частно сти, гидрофобные взаимодействия и водородные связи). Дисульфидные связи в присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разры ваются, в то время как пептидные связи самого остова полипептидной цепи не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры (рис. 1.12).

При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирую щих агентов возможна ренатурация белка с полным восстановлением а в б Рис. 1.12. Денатурация бел ковой молекулы (схема).

а - исходное состояние;

б - начи нающееся обратимое нарушение молекулярной структуры;

в - не обратимое развертывание поли а пептидной цепи.

б Рис. 1.13. Денатурация и ре натурация рибонуклеазы (по Анфинсену).

а - развертывание (мочевина + меркаптоэтанол);

б - повторное свертывание.

исходной трехмерной структуры и нативных свойств его молекулы (рис. 1.13), включая биологическую активность. Таким образом, при дена турации белковая молекула полностью теряет биологические свойства, демонстрируя тем самым тесную связь между структурой и функцией. Для практических целей иногда используют процесс денатурации в «мягких» условиях, например при получении ферментов или других биологически активных белковых препаратов в условиях низких температур в присутст вии солей и при соответствующем значении рН *. При лиофилизации белков (высушивание в вакууме путем возгонки влаги из замороженного состояния) для предотвращения денатурации часто пользуются химически ми веществами (простые сахара, глицерин, органические анионы).

* Процесс денатурации используется в медицинской практике: при отравлениях сулемой или другими солями тяжелых металлов пострадавшему в качестве «противоядия» дают молоко или раствор яичного белка.

Изоэлектрическая и изоионная точки белков В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотер ными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом поле. Зная аминокислотный состав белка, можно приближенно определить изоэлектрическую точку (pI);

pI является характерной константой белков.

Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пре делах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует о частичном преобладании кислых аминокислот. Однако в природе имеются белки, у которых значения изоэлектрических точек лежат в крайних значениях рН среды. В частности, величина рI пепсина (фермент желудочного сока) равна 1, а сальмина (основной белок из молоки семги) – почти 12.

В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени зависит от присутствия в растворе ионов солей;

в то же время на ее величину не влияет концентрация белка.

В химии белков существует понятие «изоионная точка белка». Раствор белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов, кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов, образующихся при диссоциации воды. Для освобождения белка от посто ронних ионов обычно его раствор пропускают через колонку, наполненную смесью анионо- и катионообменников. Изоионной точкой данного белка принято называть значение рН изоионного раствора этого белка:

где [Р] – молярная концентрация белка;

Z – средний заряд молекулы. Со гласно этому уравнению, изоионная точка белка зависит от его концент рации. Очевидно, поэтому белок, за исключением случая, когда рI равно 7, не может быть одновременно изоэлектрическим и изоионным.

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ Выяснение структурной организации белков считается одной из главных проблем современной биохимии. Оно имеет важное научно-практическое значение для понимания огромного разнообразия функций белков, выпол няемых ими в живых организмах. Белковые молекулы представляют собой продукт полимеризации 20 различных мономерных молекул (аминокислот), соединенных не хаотично, а в строгом соответствии с кодом белкового синтеза (см. главу 14). Вопрос о том, каким образом соединяются между собой многие десятки и сотни аминокислот в белковой молекуле, был предметом пристального внимания многих лабораторий мира, занимав шихся химией белка.

Впервые А.Я. Данилевский (1888), изучая биуретовую реакцию, высказал предположение о существовании во всех белковых веществах одинаковых групп атомов и связей, аналогичных биурету NH2—СО—NH—СО—NH2.

Тем самым А.Я. Данилевский первый указал на связь —NH—СО— (позднее получившую название пептидной связи) как на наиболее вероят ный способ соединения аминокислот в белковой молекуле.

Однако только Э. Фишер (1902) сформулировал полипептидную теорию строения. Согласно этой теории, белки представляют собой сложные полипептиды, в которых отдельные аминокислоты связаны друг с другом пептидными связями, возникающими при взаимодействии -карбоксильных СООН- и -NН2-групп аминокислот. На примере взаимодействия аланина и глицина образование пептидной связи и дипептида (с выделением молеку лы воды) можно представить следующим уравнением:

Н2О Аланин Глицин Аланилглицин Аналогичным способом к дипептиду могут присоединяться и другие аминокислоты с образованием три-, тетра-, пентапептида и т.д. вплоть до крупной молекулы полипептида (белка). Наименование пептидов склады вается из названия первой N-концевой аминокислоты со свободной NH2 группой (с окончанием -ил, типичным для ацилов), названий последующих аминокислот (также с окончаниями -ил) и полного названия С-концевой аминокислоты со свободной СООН-группой. Например, пентапептид из 5 аминокислот может быть обозначен полным наименованием: глицил аланил-серил-цистеинил-аланин, или сокращенно Гли–Ала–Сер–Цис–Ала *.

Образование пептидных связей, например, из трех разных аминокислот может быть представлено в виде следующей схемы:

Н2О Н2О Трипептид Пептидные связи С-концевая АМК N-концевая АМК Химический синтез полипептидов и современные физико-химические методы исследования белков полностью подтвердили существование пеп тидных связей в структуре белка. Получены следующие экспериментальные доказательства полипептидной теории строения белка.

1. В природных белках сравнительно мало титруемых свободных СООН- и NH2-групп, поскольку абсолютное их большинство находится в связанном состоянии, участвуя в образовании пептидных связей;

титрова нию доступны в основном свободные СООН- и NН2-группы у N- и С концевых аминокислот пептида.

2. В процессе кислотного или щелочного гидролиза белка образуются стехиометрические количества титруемых СООН- и NH2-групп, что свиде тельствует о распаде определенного числа пептидных связей.

* Синтез полипептидов (белков) в клетках живых организмов протекает значительно сложнее с участием нуклеиновых кислот. Этот процесс детально рассматривается в главе 14.

3. Под действием протеолитических ферментов (протеиназ) белки рас щепляются на строго определенные фрагменты, называемые пептидами, с концевыми аминокислотами, соответствующими избирательности дейст вия протеиназ. Структура некоторых таких фрагментов неполного гидроли за доказана последующим химическим их синтезом.

4. Биуретовую реакцию (сине-фиолетовое окрашивание в присутствии раствора сульфата меди в щелочной среде) дают как биурет, содержащий пептидную связь, так и белки, что также является доказательством наличия в белках аналогичных связей.

5. Анализ рентгенограмм кристаллов белков подтверждает полипептид ную структуру белков. Таким образом, рентгеноструктурный анализ при разрешении 0,15–0,2 нм позволяет не только вычислить межатомные рас стояния и размеры валентных углов между атомами С, Н, О и N, но и «увидеть» картину общего расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи и пространственную ее ориентацию (конформацию).

6. Существенным подтверждением полипептидной теории строения бел ка является возможность синтеза чисто химическими методами полипеп тидов и белков с уже известным строением: инсулина – 51 аминокислотный остаток, лизоцима – 129 аминокислотных остатков, рибонуклеазы – аминокислотных остатка *. Синтезированные белки обладали аналогичны ми природным белкам физико-химическими свойствами и биологической активностью.

Полипептидная теория строения не отрицает существования в молекуле белка и других связей, включая ковалентные (например, дисульфидные —S—S-связи) и нековалентные (например, водородные связи и др.). Они будут рассмотрены далее.

Пептидные связи играют исключительную роль как в «архитектуре», так и в функции белков. Поэтому следует указать на некоторые особенности строения полипептидной цепи. Во-первых, это своеобразие расположения атомов углерода и азота, находящихся примерно в одной плоскости, и атомов водорода и радикалов, направленных к этой плоскости под углом 109°28'. Во-вторых, это своеобразие петидной связи. Расстояние между атомами С и N в пептидной связи (равное 0,132 нм) является промежу точным между простой (ординарной) связью (связь —С—N—, равная 0,147 нм) и двойной связью (связь —C=N—, равная 0,125 нм). Это создает предпосылки для осуществления по месту двойной связи таутомерных перегруппировок и для образования енольной (лактимной) формы. Послед няя в свою очередь дает молекуле белка ряд преимуществ (повышение реакционной способности, возникновение дополнительных возможностей вращения и др.):

Лактимная (енольная) форма Лактамная (кетонная) форма * Полный синтез рибонуклеазы осуществлен одновременно и независимо друг от друга Б. Меррифилдом и Р. Хиршманом. Этот метод реализован в автоматическом синтезаторе пептидов.

Наконец, следует указать на своеобразие радикалов, которые являются полифункциональными, несущими свободные NH2-, СООН-, ОН-, SH группы и, как было указано, определяют структуру (пространственную) и многообразие функций молекул белка. Взаимодействуя с окружающими молекулами растворителя (Н2О), функциональные группы (в частности, NH2- и СООН-группы) ионизируются, что приводит к образованию анион ных и катионных центров белковой молекулы. В зависимости от соотноше ния ионов молекулы белка получают суммарный положительный (+) или отрицательный (–) заряд с определенным значением изоэлектрической точки.

Получены доказательства предположения К. Линдерстрёма-Ланга о су ществовании 4 уровней структурной организации белковой молекулы:

первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры. Техника совре менной белковой химии разработана настолько хорошо, что позволяет в принципе расшифровать структурную организацию любого белка.

Первичная структура белка К настоящему времени расшифрована первичная структура десятков тысяч разных белков, что является несомненным достижением биохимии. Однако это число ничтожно мало, если учесть, что в природе около 1012 разно образных белков. Под первичной структурой подразумевают порядок, последовательность расположения аминокислотных остатков в полипеп тидной цепи. Зная первичную структуру, местоположение каждого остатка аминокислоты, можно точно написать структурную формулу белковой молекулы, если она представлена одной полипептидной цепью. Если в состав белка входит несколько полипептидных цепей, объединенных в одну белковую молекулу посредством дисульфидных связей и нековалент ных взаимодействий, или если одна полипептидная цепь содержит внутрен ние дисульфидные связи, то задача определения первичной структуры несколько осложняется, так как необходимо предварительное разъединение этих цепей и связей. Разъединение таких полипептидных цепей производят с помощью денатурирующих агентов (растворы 8М мочевины или 6М гуанидингидрохлорида), разрывающих нековалентные связи. Дисульфид ные связи разрушают путем окисления или восстановления (надмуравьиной кислотой или -меркаптоэтанолом соответственно), при этом образуются свободные полипептиды, содержащие или остатки цистеиновой кислоты, или цистеина:

Для определения первичной структуры отдельной, химически гомоген ной полипептидной цепи в первую очередь методами гидролиза выясняют аминокислотный состав, точнее, соотношение каждой из 20 аминокислот в образце гомогенного полипептида. Затем приступают к определению химической природы концевых аминокислот полипептидной цепи, содержа щей одну свободную NH2-группу и одну свободную СООН-группу.

Методы определения N-концевой аминокислоты Для определения природы N-концевой аминокислоты предложен ряд мето дов, в частности метод Сэнджера (F. Sanger), основанный на реакции арилирования полипептида 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ), что при водит к образованию окрашенного в желтый цвет 2,4-динитрофенильного производного N-концевой аминокислоты *. Раствор полипептида обраба тывают ДНФБ, который взаимодействует со свободной NH -группой N-концевой аминокислоты пептида.

ДНФБ Полипептид (белок) Н2О Гидролиз + Свободные аминокислоты Динитрофениламинокислота После кислотного гидролиза продукта реакции – динитрофенилпептида только одна N-концевая аминокислота оказывается связанной с реактивом в виде 2,4-динитрофениламинокислоты (стабильной при гидролизе). В отли чие от других образовавшихся при гидролизе полипептида свободных аминокислот она желтого цвета. Ее идентифицируют методом хромато графии.

Для определения N-концевой аминокислоты значительно более широко применяется фенилтиогидантоиновый метод Эдмана благодаря своей высокой чувствительности и возможности многократного использо вания в одной и той же пробе. Фенилизотиоцианат реагирует со свободной -NH -группой N-концевой аминокислоты полипептида с образованием фенилтиокарбамоилпептида.

* За разработку этого метода Ф. Сэнджер удостоен Нобелевской премии (1958). В 1980 г.

он был удостоен второй раз Нобелевской премии вместе с У. Гилбертом и П. Бергом за разработку метода определения первичной структуры нуклеиновых кислот.

Фенилизотиоцианат Полипептид HCl Фенилтиогидантоиновое Полипептид, укороченный производное на одну аминокислоту N-концевой АМК Обработка продукта реакции кислотой приводит к циклизации и осво бождению фенилтиогидантоина N-концевой аминокислоты, природу кото рого устанавливают хроматографически. Укороченный на одну аминокис лоту полипептид подвергают дальнейшему анализу.

Эту процедуру ступенчатого расщепления пептида с N-конца можно повторять многократно, идентифицируя последовательно одну аминокис лоту за другой. Метод Эдмана используется в качестве химической основы для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован в специальном приборе – секвенаторе (от англ. sequence – последователь ность), работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить последовательность аминокислот с N-конца пептида до 50–60 аминокис лотных остатков.

Кроме этих реактивов, для определения чередования аминокислот ис пользуют цианат калия, 1-диметиламинонафтил-5-сульфонилхлорид – дан силхлорид и дабсилхлорид. Для этих же целей иногда применяют ферменты экзопептидазы, в частности аланин- и лейцинаминопептидазу. Эти фермен ты разрывают пептидные связи с того конца полипептида, где имеется свободная NН -группа, освобождая N-концевую аминокислоту (механизм действия экзопептидаз см. в главе 12).

Методы определения С-концевой аминокислоты Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокис лоты, природа которой может быть идентифицирована методом хромато графии.

Предложен также химический метод Акабори (S. Akabori), который основан на гидразинолизе полипептида:

Гидразин Аминоацилгидразины Аланин Гидразин, вызывая распад чувствительных к нему пептидных связей полипептида, реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С концевой аминокислоты, поскольку ее карбоксильная группа не участвует в образовании пептидной связи. При этом образуется смесь аминоацил гидразинов и свободной С-концевой аминокислоты. Последнюю после обработки всей смеси ДНФБ отделяют и идентифицируют хроматографи чески, для чего образовавшиеся динитрофенилпроизводные аминоацил гидразинов предварительно экстрагируют уксусно-этиловым эфиром.

С-концевую аминокислоту идентифицируют также путем обработки полипептида восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия.

В простейшей форме эту процедуру можно представить в следующем виде:

NaBH 6М НСl, 105°С, 24ч -Аминоспирт Свободные аминокислоты Видно, что в указанных условиях только одна, а именно С-концевая, аминокислота будет превращаться в -аминоспирт, легко идентифицируе мый методом хроматографии. Таким образом, при помощи указанных методов определяют природу N- и С-концевых аминокислот.

Следующий этап работы связан с определением чередования (последо вательности) аминокислот внутри полипептидной цепи. Для этого сначала проводят избирательный, частичный (химический и ферментативный), гид ролиз полипептидной цепи на короткие пептидные фрагменты, последова тельность аминокислот в которых может быть точно определена описан ными ранее методами.

Химические методы избирательного и неполного гидролиза основаны на применении таких химических реактивов, которые вызывают селектив ный, высокоспецифический разрыв пептидных связей, образованных опре деленными аминокислотами, оставляя незатронутыми остальные пептид ные связи. К этим избирательно гидролизующим веществам относятся цианогенбромид, CNBr (по остаткам метионина), гидроксиламин (по свя зям между остатками аспарагиновой кислоты и глицина), N-бромсукцина мид (по остаткам триптофана). Метионина в составе белков содержится обычно меньше, чем других аминокислот, поэтому обработка CNBr пред почтительнее, так как при этом образуется небольшое число пептидов, первичную структуру которых определяют с помощью рассмотренных ранее методов, всякий раз начиная с определения природы N- и С-концевых аминокислот.

Ферментативные методы гидролиза основаны на избирательности дей ствия протеолитических (вызывающих распад белков) ферментов, расщеп ляющих пептидные связи, образованные определенными аминокислотами.

В частности, пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты, трипсин – аргинина и ли зина, химотрипсин – триптофана, тирозина и фенилаланина. Ряд других ферментов, например папаин, субтилизин, проназа и другие бактериальные протеиназы, также используется для неполного гидролиза белков. В резуль тате полипептидная цепь расщепляется на мелкие пептиды, содержащие иногда всего несколько аминокислот, которые отделяют друг от друга сочетанными электрофоретическими и хроматографическими методами, получая своеобразные пептидные карты. Далее определяют чередование аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. Завершается работа воссозданием первичной структуры полной полипептидной цепи на основа нии определения последовательности аминокислот в отдельных пептидах.

Метод составления пептидных карт, получивший образное название «метод отпечатков пальцев», используется при определении сходства или различия гомологичных белков по первичной структуре. Белок инкубируют с каким-либо протеолитическим ферментом. Часто порции белка инкубиру ют как с пепсином, так и с трипсином. При этом вследствие гидролиза строго определенных пептидных связей образуется смесь коротких пепти дов, легко разделяемых с помощью хроматографии в одном направлении и электрофореза – в другом, под углом 90° от первого (пептидная карта).

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 14 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.