WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

«Е.А. Николайчик РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА курс лекций Минск 2002 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ. РЕГУЛЯЦИЯ НА УРОВНЕ ТРАНСКРИПЦИИ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Система контроля споруляции B. subtilis (которую мы еще рассмотрим более подробно позднее) является примером His-Asp-His-Asp цепочки. В этой системе несколько ГК могут быть донорами фосфата для белка Spo0F. С Asp белка Spo0F фосфат затем переносится на HPt белок Spo0B и, наконец, на Asp транскрипционного фактора Spo0А.

Множественные фосфорилируемые домены фосфотрансляционных систем создают возможность альтернативных путей передачи фосфата. В гибридной ГК ArcB любой из имеющихся His-содержащих доменов (димеризационный или же HPt) может получить фосфат от АТФ и передать его РО ArcA. Два различных варианта используются в аэробных и анаэробных условиях.

Еще более сложная организация может достигаться за счет интеграции различных сигнальных цепочек в сигнальные сети. У B. subtilis практически каждая двухкомпонентная система взаимодействует с как минимум еще одной цепочкой передачи фосфата. В качестве примера такой интеграции можно привести взаимодействие путей, контролирующих утилизацию фосфата (PhoR/PhoP), аэробного и анаэробного дыхания (ResE/ResD) и споруляцию (KinA-B/Spo0A). Дыхание и утилизация фосфата регулируются совместно – фосфо-PhoP активирует экспрессию ResD и наоборот.

Однако, когда клетка вступает на путь споруляции, и дыхание, и утилизация фосфата репрессируются, поскольку фосфо-Spo0A негативно регулирует фосфорилированные ResD и PhoP.

Регуляторные механизмы Единственной видимой причиной, по которой регуляторные системы являются двух- (и более) – компонентными является сама необходимость контроля – двухступенчатый (или еще более сложный) сигнальный путь просто напросто создает те места, в которых клетка может контролировать поток информации. Различные регуляторные механизмы накладываются поверх базовых путей передачи фосфата, позволяя оптимизировать передачу фосфата для нужд каждой конкретной системы.

Результатом работы некоторых систем является "количественный" ответ – так EnvZ-OmpR система обеспечивает различные уровни экспрессии генов поринов ompF и ompC. Другие регуляторные системы, как, например, система контроля споруляции у бацилл, дают качественный ответ типа "все или ничего". Вне зависимости от типа даваемого ответа любая система может иметь несколько уровней регуляции, зачастую с участием дополнительных белковых компонентов. Основными мишенями для такой регуляции являются активности ГК и дефосфорилирование РО.

Регуляция активности ГК.

ГК могут иметь две активности, способные контролировать уровень фосфорилирования РО:

автокиназную и РО-фосфатазную. Не все ГК имеют фосфатазную активность – для некоторых возможна только регуляция автокиназной активности. С другой стороны, во многих системах именно фосфатазная активность подвержена основной регуляции.

У типичных трансмембранных ГК сенсорные домены непосредственно связываются с лигандами либо детектируют физические стимулы. В более сложных системах детекция сигналов может происходить через взаимодействие с другими белковыми компонентами. Например, автокиназная активность ГК хемотаксиса CheA, которая образует комплекс с хеморецепторами и адаптерным белком CheW, ингибируется либо активируется сигналами, передаваемыми от хеморецепторов (путем конформационных изменений). РО-фосфатазная активность цитоплазматической ГК NtrB регулируется - 33 - дополнительным белком PII, чья способность взаимодействовать с NtrB зависит от его уридилированности, которая, в свою очередь, связана с концентрацией внутриклеточного азота.

Активность ГК может также регулироваться дополнительными доменами. Например, сенсор тургора KdpD содержит дополнительных АТФ-связывающий домен, и связывание (но не гидролиз) АТФ необходимо для проявления фосфатазной активности.

Регуляция дефосфорилирования РО Как мы уже обсуждали, многие РО имеют автофосфатазную активность, необходимую для поодержания надлежащих временных параметров системы (времени существования РО в фосфорилированном состоянии). На дефосфорилирование РО также может влиять фосфатазная активность ГК, регулируемая различными механизмами.

В дефосфорилировании некоторых РО участвуют вспомогательные белки. Система споруляции бацилл имеет набор строго регулируемых фосфатаз (RapA, RapB, RapE), которые дефосфорилируют Spo0F, и еще одну фосфатазу, которая дефосфорилирует Spo0A. В системе хемотаксиса вспомогательный белок CheZ олигомеризуется с фосфо-CheY и стимулирует его дефосфорилирование.

Фосфатазы фосфоаспартата имеют настолько высокую специфичность по отношению к белкам субстратам, что возникает вопрос – действительно ли они непосредственно катализируют гидролиз или же просто стимулируют присущую РО автофосфатазную активность.

Другие способы регуляции Некоторуе системы могут иметь дополнительные и зачастую специфические механизмы контроля.

Например, может регулироваться сам перенос фосфата. Так, у гибридной киназы VirA из A. tumefaciens карбоксиконцевой Asp-содержащий домен влияет на автокиназную активность киназного ядра путем физического взаимодействия с сайтом автофосфорилирования.

Дополнительная возможность регуляции создается в тех случаях, когда ГК фосфорилирует более одного РО. В этих случаях конкуренция за фосфат может влиять на активацию различных ветвей сигнального пути.

Наконец, еще один способ регуляции РО – контроль экспрессии его гена. Многие из двухкомпонентных систем, регулирующих транскрипцию, подвержены авторегуляции. В таких системах фосфо-РО действует как активатор или репрессор оперона, кодирующего ГК и РО.

Литература:

1. A.M. Stock, V.L. Robinson and P.N. Goudreau. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem.

2000. 69:183- 7. Хемотаксис 7.1 Устройство и принцип действия двигательного аппарата бактерий Движение бактерий мы рассмотрим на примере E. coli как наиболее изученной бактерии. Эта бактерия передвигается за счет вращения своих жгутиков, которые действуют, как винты корабля.

Каждая бактерия может иметь шесть или более "винтов", разбросанных по поверхности клетки случайным образом. Хотя каждый "винт" вращается независимо, но при вращении против часовой стрелки нити жгутиков сближаются за счет гидродинамических сил и образуют пучок, вращающийся в одну сторону позади клетки. Вращение против часовой стрелки приводит к более-менее прямолинейному поступательному движению бактерии, тогда как вращение по часовой стрелке заставляет бактерию кувыркаться на месте (Рис. 7.1). В результате при последующем переключении направления вращения жгутика бактерия начнет двигаться в случайном направлении. В однородной среде бактерия кувыркается примерно раз в секунду.

Нить жгутика является тонкой ровной трубкой, созданной из уложенных спирально молекул одного единственного белка – флагеллина. Длина жгутикового филамента варьирует и может достигать 10 длин тела бактерии. Нить жгутика прикрепляется к базальному телу при помощи полого гибкого крюка. Крюк прикреплен к оси – полой прямой трубке, составляющей основу ротора жгутика. Ось окружена тремя кольцами – двойным MS кольцом, находящимся в цитоплазматической мембране и слегка выступающим из нее, P кольцом в слое пептидогликана и L кольцом в наружной мембране.

Специфическая для компонентов жгутика система секреции III типа, располагающаяся в базальном - 34 - теле, транспортирует через мембрану белки оси, крюка и нити в правильной последовательности и в нужных количествах. Секретируемые компоненты поступают к месту сборки формирующегося жгутика через полость в его центре.

Предполагается, что белки-компоненты секреторного аппарата располагаются в основном на цитоплазматической стороне MS кольца (Рис.

7.2.).

Вращение жгутика обеспечивается молекулярным мотором, спрособным переключать направление вращения (Рис. 7.3.). Источником энергии для работы мотора служит трансмембранный протонный градиент. Моторно переключательный комплекс крепится на цитоплазматической стороне MS кольца и образует колоколообразную структуру, известную как C кольцо. Этот комплекс содержит три белка (FliG, FliM и FliN), участвующие в генерации Рис. 7.1. Движение E. coli вращательного монента и переключении направления вращения. Считается, что этот колпачок комплекс вращается вместе с MS кольцом, осью, крюком и нитью. Статор мотора сделан из двух белков, окружающих MS кольцо.

Карбоксиконцевой домен одного из этих белков, MotB, закреплен в клеточной стенке, а четыре гидрофобных спирали MotA взаимодействуют с аминоконцевой мембранной -спиралью, образую проводящий протоны канал через нить жгутика цитоплазматическую мембрану. Предполагается, что до восьми независимых комплексов Mot белков взаимодействуют с моторно-переключательным комплексом, генеруруя вращение в ответ на перемещение протонов внутрь клетки.

соединение Взаимодействие между ротором и статором обеспечивается рядом разноименно заряженных АК крюк остатков в белках FliG (ротор) и MotA (статор) центральный канал Регуляция синтеза жгутикового аппарата Более 40 генов, кодирующих белки, необходимые для биосинтеза жгутиков, ВМ L подшипник организованы в несколько оперонов. Естественно, ПГ P MotB что экспрессиия такого количества генов находится периплазма стержень базаль- под строгим контролем. Контроль в данном случае ное тело S (FliF) организован иеархически. На вершине иерархии ЦМ M (FliF) MotA находится flhDC оперон, кодирующий два белка, из цитоплазма мотор FliG пере которых собирается гетеротетрамерный активации клю FliN транскрипции генов второго "уровня". Многие C чатель FliM глобальные регуляторы, такие, например, как БАК, DnaA, связанный с нуклеоидом белок H-NS, Рис. 7.2. Строение бактериального жгутика влияют на уровень экспрессии оперона flhDC и, ВМ –внешняя мембрана ПГ – пептидогликан следовательно, на образование жгутиков.

ЦМ – цитоплазматическая мембрана L, P, S, M, Транскрипция генов первых двух уровней C – кольца базального тела жгутика (видимые в обеспечивается РНК-полимеразой с основным электронном микроскопе) сигма-фактором (RpoD). Продуктами генов второго - 35 - уровня являются белки, крюк входящие в состав филамент L и P кольца базального тела жгутика и крюка, а также регуляторные стержень белки FlgM и FliA. FliA кодирует альтернативный MS кольцо сигма-фактор 28 или F, внешняя мембрана необходимый для экспрессии генов третьего, и последнего, пептидогликан уровня, а FlgM является анти-сигма фактором, цитоплазм. мембрана ингибирующим активность FliA. Когда секреторный MotA/B статор + + H или Na аппарат (базальное тело + жгутика) и крюк собираются, C кольцо (a) секреторный аппарат FlgM экспортируется из клетки и освобождает FliA, который наконец может 45 nm активировать поздние гены жгутика.

+ 7.2 Что такое + + H+ или Na хемотаксис и как он реализован у бактерий?

Хемотаксис + – способность бактерий + – – – + – + – + + – + + – + – двигаться по направлению к аттрактантам (зачастую (b) Два возможных механизма питательным веществам) и от работы мотора репеллентов (например, токсинов). В качестве аттрактантов выступают Рис. 7.3. Работа мотора жгутика практически все сахара и аминокислоты, в качестве репеллентов - жирные кислоты, спирты и другие потенциально вредоносные вещества. Чувствительность бактерий впечатляет - они легко детектируют изменение концентрации на 0.1% при микромолярных концентрациях веществ, а диапазон детектируемых концентраций перекрывает пять порядков. Аттрактанты и репелленты детектируются за счет непосредственного взаимодействия со специфическими хеморецепторами, а не за счет каких-либо внутриклеточных эффектов детектируемого вещества. Мембранные рецепторы группируются в кластеры, как правило расположенные на полюсах клетки, однако это не может помочь бактерии уловить разницу концентраций между полюсами, поскольку она будет слишком маленькой из-за малого размера самой клетки. Вместо этого бактерии ориентируются в химических градиентах путем измерения временных изменений концентраций при движении. Обычно скорость движения эшерихии составляет 10-20 своих длин в секунду. Сравнивая текущую загруженность хеморецепторов специфическими лигандами с таковой несколько секунд назад, клетка фактически может "измерить" разницу концентраций определенного вещества на расстоянии, во много раз превышающем длину самой клетки. Такое измерение концентрации лиганда во времени возможно за счет адаптивного метилирования хеморецепторов, которое зависит от загруженности их лигандами. Задержка во времени между связыванием лиганда и метилированием рецептора представляет собой своеобразную молекулярную "память", которая и позволяет измерять изменение концентраций лиганда. Если выбранное направление движения соответствует увеличению концентрации аттрактанта (снижению концентрации репеллента), время до следующего кувыркания увеличивается. К сожалению, из-за своего малого размера клетка постоянно сбивается с "верного" пути броуновским движением и поэтому просто не может продолжительно двигаться прямо. Такой механизм поэтому только в общем обеспечивает движение - 36 - движе ние аттрактант переориентация (a) без стимула (b) со стимулом Рис. 7.4. Движение E.coli по градиенту аттрактанта за счет контроля продолжительности вращения жгутиков в одном направлении бактерии по градиенту концентрации в нужном направлении, но для бактерий является достаточно эффективным (Рис. 7.4).

Механизм, основанный на переключении направления вращения жгутиков, приводящий к прямолинейному движению, которое через варьирующие промежутки времени сменяется кувырканием на месте, не является единственным. У Rhodobacter sphaeroides вращение единственного жгутика сменяется его полной остановкой, а у Rhizobium meliloti вращение жгутика никогда не прекращается – изменяется только его скорость. Но во всех этих случаях результат работы сенсорной системы хемотаксиса один и тот же – если бактерия движется в "нужном" направлении, продолжительность такого движения увеличивается.

Сенсорный механизм хемотаксиса более сложен, чем рассмотренные нами ранее. Это объясняется прежде всего двумя причинами. Во-первых, поскольку броуновское движение может очень быстро изменить ориентацию бактериальной клетки, клетки должны обрабатывать хемотаксические сигналы очень быстро, и, действительно, от стимула до переключения "моторов" у клетки проходит не более 0. секунды. Во-вторых, для правильного сравнения пространственных градиентов клеткам необходимо такое устройство сенсорного механизма, которое "гасило" бы сенсорную стимуляцию в статических условиях, т.е. в отсутствии градиента концентрации, как бы много какого-то аттрактанта или репеллента ни присутствовало бы в среде.

7.3 Белковый аппарат хемотаксиса Три класса белков участвуют в хемотаксисе: трансмембранные рецепторы, цитоплазматические сигнальные белки и ферменты адаптивного метилирования.

Рецепторы хемотаксиса Многие бактерии детектируют хемотаксические стимулы при помощи рецепторов, известных как метилируемые белки хемотаксиса (methyl-accepting chemotaxis proteins, MCPs). Эти белки являются мембранными сенсорами, в принципе аналогичными по своей структуре EnvZ, с тем только отличием, что цитоплазматический сигнальный домен не является автокиназой. Функцию автокиназы выполняет другой белок - CheA, а сигнальные домены MCP обеспечивают взаимодействие с CheA. Еще одно отличие от типичного сенсора - по обе стороны сигнального домена располагаются сайты метилирования, необходимые для адаптации рецепторов. MCP белки состоят из ок. 550 ак, и явл.

димерами. Хорошо изучены 4 MCP из E. coli, реагирующие на серин (Tsr), аспартат и мальтозу (Tar), рибозу, глюкозу и галактозу (Trg) и дипептиды (Tap). У сальмонелл нет Tap, но есть сенсор цитрата - 37 - Tcp. Серин, аспартат и цитрат связываются непосредственно с рецепторами, тогда как сахара и дипептиды сначала связываются с соответствующими периплазматическими белками, а уже эти комплексы взаимодействуют с рецепторами. Кроме того, MCP реагируют на изменения температуры и pH, а также являются рецепторами для различных репеллентов.

Классический рецептор состоит из • аминоконцевой трансмембранной спирали, • периплазматического собственно сенсорного домена, сложенного из четырех -спиральных участков, • второй трансмембранной спирали • большого цитоплазматического сигнального и адаптационного домена.

(Aer – сенсор аэротаксиса: типичный для MCP цитоплазматический домен, но совершенно другая сенсорная часть, содержащая FAD и похожая на NifL) Цитоплазматические домены сенсоров содержат 4 или 5 остатков глутамата, доступных для метилирования.

Как внеклеточный стимул транслируется во внутриклеточный сигнал?

Две модели Принцип ножниц:

Связывание лиганда дистальными концами связанных с мембраной спиралей может индуцировать значительное перемещение трансмембранных сегментов (принцип ножниц).

Рис. 7.5. Рецептор хемотаксиса Tar В несвязанном с лигандом состоянии субъединицы рецептора предположительно взаимодействуют между собой только в области первого трансмембранного сегмента.

Связывание с лигандом вызывает сближение сенсорных периплазматических субъединиц, что передается сигнальным субъединицам и обеспечивает их взаимодействие между собой, а в таком виде они уже не могут взаимодействовать с CheA и стимулировать его автокиназную активность. Метилирование создает стерические препятствия для взаимодействия сигнальных доменов между собой, что снова позволяет им стимулировать автокиназную активность CheA.

Принцип пистона:

Сейчас все больще и болще данных накапливается в пользу другого механизма, основанного на скольжении трансмембранных Рис. 7.6. Модель трансмембранной передачи сегментов (ТМ) друг относительно друга. Самый сигнала от сенсорного к сигнальному домену аминоконцевой ТМ1 закреплен в мембране рецептора жестко, тогда как второй более подвижен, и при свявывании лиганда скользит "вниз", т.е. в - 38 - сторону цитоплазмы, что и вызывает конформационное изменение цитоплазматического сигнального домена, инактивирующее его. Вариация на эту тему – участие двух амфипатических спиралей линкерного домена в изменении конформации (Рис. 7.6).

Цитоплазматические сигнальные белки и регуляторный механизм хемотаксиса Взаимодействие между рецепторами и переключателем жгутика осуществляется четырьмя белками (Рис. 7.7):

CheA - ГК CheY - РО CheW - "адаптор" между рецептором и CheA CheZ - белок, способствующий дефосфорилированию CheY~Ф Пара белков CheA-CheY представляет Внешний сигнал собой двухкомпонентную регуляторную систему, которая несколько отличается от рассмотренных ранее "классических" O /e- транспорт?

MCP примеров. Наиболее существенным отличием является то, что CheY не является R Адаптация Aer транскрипционным фактором и, ?

соответственно, у него отсутствует ДНК B связывающий домен. ГК CheA функционирует в виде димера, с которым связываются два W W мономера CheW, и уже этот комплекс вступает A A в ассоциацию с димерным рецептором. В составе такого комплекса автокиназная P активность резко возрастает, что усиливает перенос фосфата от CheА~Ф к CheY. CheY~Ф P Y Y связывается с FliM моторно переключательного комплекса базального тела, Z что приводит к вращению жгутика по часовой стрелке. CheZ предотвращает накопление CheY~Ф, стимулируя автофосфатазную активность CheY.

При отсутствии аттрактанта C-кольцо внутренняя мембрана концентрация CheY~Ф поддерживается на уровне, способствующем вращению жгутика мотор пептидогликан преимущественно по часовой стрелке и, внешняя мембрана следовательно, отсутствию упорядоченного крюк движения бактерии. Связывание аттрактанта с рецептором индуцирует конформационное нить изменение, которое передается четез мембрану и подавляет автокиназную активность CheA.

Концентрация CheY~Ф падает, и жгутики бактерии более продолжительное время вращаются против часовой стрелки. Поэтому Рис. 7.7. Молекулярный механизм хемотаксиса клетки будут дольше двигаться прямолинейно, если они попадают в среду с более высокой концентрацией аттрактанта. Однако этот механизм не объясняет, как клетка может реагировать на постоянно возрастающую концентрацию аттрактанта. Этой цели служит сенсорная адаптация.

Метилазы хемотаксиса и сенсорная адаптация.

Адаптация сенсорного аппарата достигается путем обратимого метилирования рецепторов, в котором участвуют два белка – метилтрансфераза CheR и метилэстераза CheB. Метилирование рецепторов оказывает действие, противоположное связыванию аттрактанта. Интересно, что - 39 - метилирование стимулируется связыванием аттрактанта с рецептором и в конечном итоге нейтрализует эффект связывания аттрактанта. Однако между связыванием аттрактанта и метилированием рецептора проходит некоторое время, в течение которого бактерии движутся прямолинейно, что и составляет основу молекулярной памяти машины хемотаксиса.

CheR - метилтрансфераза, метилирующая остатки глутамата в цитоплазматических доменах MCP с постоянной скоростью, перенося метил-группу с S-аденозилметионина.

CheB является мишенью для переноса фосфата с CheA~Ф, и CheB~Ф является метилэстеразой, деметилирующей MCP.

В отсутствие стимула метилирование MCP, осуществляемое CheR, компенсируется удалением метильных групп фосфорилированным CheB, что поддерживает метилирование MCP на уровне 0.5- метильная группа на субъединицу рецептора.

Когда аттрактант связывается с рецептором и ингибирует активность CheA, концентрация CheB~Ф падает, хотя и более медленно, чем концентрация CheY~Ф, поскольку CheB~Ф не является субстратом для CheZ. Повышение степени метилирования восстанавливает способность рецептора стимулировать CheA. Однако, даже после того как базальные уровни CheY~Ф и CheB~Ф восстанавливаются, связанный с аттрактантом рецептор остается метилированным, поскольку метилированный рецептор – более плохой субстрат для метилэстеразы CheB~Ф.

Таким образом, с учетом метилирования принцип работы молекулярной машины хемотаксиса выглядит следующим образом.

• В отсутствие аттрактанта хеморецептор находится в активированном состоянии и его сигнальный домен активирует киназную активность CheA, что ведет к фосфорилированию CheY, а фосфо CheY, взаимодействуя с переключателем мотора, вызывает вращение жгутика по часовой клетке, что вызывает кувыркание бактерии на месте.

• Связывание аттрактанта инактивирует рецептор, и его сигнальный домен уже не может стимулировать киназную активность CheA, концентрация фосфо-CheY быстро падает (что стимулируется белком CheZ), направление вращения жгутика меняется и бактерия движется прямолинейно.

• Прямолинейное движение, однако, может прекратиться по двум причинам. Если бактерия начала двигаться в неблагоприятном направлении, рецептор освобождается, начинается фосфорилирование CheY, и бактерия снова кувыркается на месте. Кроме того, когда киназа CheA "выключена", одновременно с дефосфорилированием CheY~Ф происходит дефосфорилирование CheB~Ф, хотя и с меньшей скоростью (поскольку CheB~Ф не является субстратом для CheZ), что приводит к повышению степени метилирования рецептора и восстановлению его сигнальной активности.

Поскольку и CheY, и CheB являются свободными цитоплазматическими белками, степень их фосфорилирования будет зависеть от степени метилирования рецепторов и их загруженности лигандами. Это делает возможным вместо ответа "все или ничего" плавно регулировать подвижность бактерий в широком диапазоне концентраций аттрактантов и репеллентов.

Метилирование рецепторов обеспечивает простейшую молекулярную память, позволяющую бактерии контролировать "правильность" направления движения. Уровень метилирования будет высоким, если концентрация аттрактанта была высокой некоторое время назад. Когда клетка движется, она "сравнивает" сиюмоментную концентрацию аттрактанта (определяемую по степени занятости рецепторов) с концентрацией в недавнем прошлом (как зафиксировано степенью метилирования рецепторов). Если окружающие условия значительно улучшились или ухудшились, активность гистидинкиназы CheA будет соответственно снижена или повышена, изменяя продолжительность прямолинейного движения соответствующим образом.

Литература:

1. M.D. Manson, J.P. Armitage, J.A. Hoch, R.M. Macnab. Bacterial locomotion and signal transduction. J.

Bacteriol 1998. 180:1009- - 40 - 8. Утилизация азота Бактерии могут использовать множество азотсодержащих соединений в качестве источника клеточного азота - от простейших неорганических (азот, нитрат) до сложных соединений включая аминокислоты и нуклеозиды.

Аммиак является наиболее предпочтительным источником азота практически для всех бактерий.

Однако бактериям чаще приходится утилизировать альтернативные источники азота, для чего они синтезируют множество белков, необходимых для транспорта внутрь клетки и последующего метаболизма азотсодержащих соединений. Синтез, а в некоторых случаях и активность, этих белков строго контролируются в соответствии с доступностью субстратов.

Практически у всех бактерий глутамат и глутамин служат как основные доноры азота в биосинтетических реакциях. За образование этих аминокислот практически у всех бактерий отвечают два фермента. Первый, глутамин синтетаза, продуцирует глутамин из глутамата и аммиака:

NH3 + глутамат + ATP –> глутамин + ADP + Pi, тогда как второй, глутамат синтетаза, переносит аминогруппу с глутамина на 2-кетоглутарат с образованием двух молекул глутамата:

глутамин + 2-кетоглутарат + NADPH –> 2 глутамат + NADP+.

Суммарным результатом этих двух реакций является продукция глутамата из аммиака и 2 кетоглутарата. Эти реакции катализируются двумя ферментами:

Глутаминсинтетаза (GlnA). Додекамерный фермент, состоящий из 12 идентичных субъединиц размером 55 кДа. Субъединицы организованы в два шестичленных кольца, лежащих друг на друге и сдерживаемых гидрофобными взаимодействиями и водородными связями. Активность фермента регулируется путем аденилирования (которое инактивирует фермент). Аденилирование происходит в ответ на увеличение внутриклеточной концентрации аммония - чем выше его концентрация, тем больше субъединиц GlnA инактивировано. Этот процесс катализируется аденилилтрансферазой (GlnE), основной функцией которой является преодоление последствий "аммонийного шока", происходящего при попадании бактерий из бедной азотом среды в богатую. В этих условиях высокая активность глутаминсинтетазы приводит к переводу практически всего глутамата в глутамин, лишая клетку необходимой аминокислоты. Аденилилтрансфераза, быстро инактивируя глутаминсинтетазу при повышении внутриклеточной концентрации аммония, предотвращает это явление.

Глутаматсинтетаза P гетеродимер, субъединицы AT ADP которого кодируются генами gltBD. NtrB H NtrB H-P мало азота Синтез глутаматсинтетазы находится под контролем Lrp PII-UMP UT/UR PII (leucine-responsive regulatory protein), что приводит к репрессии много азота синтеза фермента в богатой среде.

NtrC NtrC NtrC D D-P D D D Биохимические и P i генетические механизмы контроля утилизации азота наиболее изучены у представителей семейства Enterobacteriaceae. У этих бактерий Активация регулона NTR система регуляции метаболизма азота (Рис. 8.1) кодируется Рис. 8.1. Регуляция азотного метаболизма белками четырьмя генами:

NtrB и NtrC glnD, кодирующим уридилтрансферазу/деуридилазу (UTase/UR), - 41 - glnB, кодирующим малый регуляторный белок PII, ntrB, кодирующим гистидинкиназу, и ntrC, кодирующим регулятор ответа - транскрипционный энхансер.

Белок NtrB (продукт гена glnL) является типичной сенсор-киназой, однако, будучи цитоплазматическим, не имеет мембранного якоря. Цитоплазматическим сигналом, детектируемым NtrB, является белок PII, который в уридилированной форме сигнализирует о недостатке, а в немодифицированной форме - об избытке азота.

При нехватке азота NtrB катализирует фосфорилирование и, следственно, активацию регулятора ответа NtrC. N-концевой домен NtrB является сенсором, взаимодействующим с белком PII, а C-концевой домен обладает автокиназной активностью, фосфорилируя аминокислотный остаток His-139. Кроме того, NtrB обладает еще и фосфатазной активностью и может дефосфорилировать NtrC, что зависит от присутствия немодифицированного PII. Именно фосфатазная, а не киназная активность подвержена регуляции в данном случае – повышение внутриклеточной концентрации глутамина ведет к усилению фосфатазной активности NtrB.

NtrC (продукт гена glnG) - димерный (как и NtrB) белок с массой субъединицы 55 кДа. Этот белок является типичным примером 54-зависимых активаторов и имеет три четко выраженных домена.

N-концевой домен является "приемником", и именно здесь распложен остаток аспартата, фосфорилируемый при взаимодействии с NtrB (Asp-54). Только фосфорилированная по Asp-54 форма белка способна активировать транскрипцию. Фосфорилирование NtrC стимулирует взаимодействие с ДНК, но не непосредственно связывание, а олигомеризацию димеров NtrC на активаторных последовательностях. Центральный домен NtrC типичен для N-зависяших активаторных белков, и именно этот домен взаимодействует с N-содержащей РНК-полимеразой (EN). Домен содержит АТФ связывающий сайт и обладает АТФазной активностью, необходимой для формирования открытого комплекса с EN. Эта АТФазная активность стимулируется связыванием с ДНК и фосфорилированием по Asp-54. Связывание NtrC с ДНК обеспечивается C-концевым доменом, который содержит типичный мотив "спираль-поворот-спираль" (такую структуру мы уже рассматривали на примере репрессора фага ). Этот мотив позволяет NtrC связываться с активаторными последовательностями - энхансерами, обычно расположенными на расстоянии около 100 н.п. перед промоторными последовательностями, с которыми связывается EN. Функцией энхансера является способствование олигомеризации димеров NtrC, необходимой для активации транскрипции. NtrC может также выступать и в роли репрессора, если сайты его связывания перекрываются с промотором.

У кишечных бактерий подвержены регуляции через NtrC многие гены - glnA ntrBC;

гены, кодирующие транспорт глутамина (glnHPQ), аргинина (argT) и гистидина (hisJQMP);

гены, необходимые для ассимиляции нитрита и нитрата (nasFEDCBA);

регуляторные гены фиксации азота nifLA у K. pneumoniae и nac у K. aerogenes.

Уридилтрансфераза (GlnD). Этот белок отвечает как за присоединение уридинмонофосфата к PII (GlnB), так и за его отсоединение. Количество внутриклеточного азота отражается на соотношении концентраций глутамина и 2-кетоглутарата (высокое при избытке и низкое при недостатке азота), что влияет на активность уридилтрансферазы. Активность этого фермента стимулируется 2-кетоглутаратом и АТФ и ингибируется глутамином. Следовательно, степень уридилирования PII (GlnB) зависит от соотношения концентраций глутамина и 2-кетоглутарата.

PII (GlnB). Тримерный белок, способный связывать АТФ, 2-кетоглутарат и глутамат. Связывание PII с NtrB стимулирует фосфатазную активность NtrB по отношению к NtrC. Для такой стимуляции NtrB необходимо связать АТФ и 2-кетоглутарат либо глутамат. В условиях азотного голодания 2 кетоглутарат индуцирует конформационное изменение PII, способствующее его уридилированию. В условиях же избытка азота уридилтрансфераза связывает глутамин, что блокирует уридилирование и, наоборот, способствует деуридилированию PII. Уридилированная форма PII неспособна связываться с NtrB. Неуридилированная форма взаимодействует не только с NtrB, но и с аденилилтрансферазой, стимулируя ее активность, что ингибирует глутаминсинтетазу.

NtrC в первую очередь активирует RpoN-зависимый промотор оперона glnALG (гены которого кодируют два регуляторных белка и глутаминсинтетазу). увеличение синтеза регуляторных белков - 42 - приводит к увеличению внутриклеточной концентрации NtrC-P, что активирует многие RpoN зависимые гены. Одним из таких генов является nac, необходимый для активации транскрипции ряда генов азотного метоболизма, имеющих 70-зависимые промоторы.

Литература:

1. M. Buck, M. A. Gallegos, D. J. Studholme, Y. Guo, And J. D. Gralla. The Bacterial Enhancer-Dependent 54 (N ) Transcription Factor. J. Bacteriol. 2000, p. 4129–4136 Vol. 182, No. 2. D.J. Studholme, M. Buck. The biology of enhancer-dependent transcriptional regulation inbacteria: insights from genome sequences. FEMS Microbiol. Lett. 186 (2000) 1- 9. Кислородный стресс и редокс контроль.

Метаболизм клеток существенно различается в аэробных и анаэробных условиях. В аэробных условиях клетка может получить гораздо больше энергии, но это не дается ей бесплатно – кислород окисляет не только источники энергии, но и многие жизненно важные клеточные компоненты. Поэтому в аэробных условиях в клетке при помощи регуляторов OxyR и SoxR индуцируются белки, защищающие ее от кислорода, такие как супероксиддисмутаза и каталаза. С другой стороны, клетка вынуждена существенно перестраивать свой метаболизм если она попадает в бедные энергией анаэробные условия – теперь она уже не может себе позволить многие "роскоши". Такая метаболическая перестройка контролируется регуляторными белками – гистидиновой сенсорной киназой ArcB и регулятором транскрипции FNR. Эти два белка контролируют такие разнообразные процессы, как дыхание и фотосинтез, утилизация углерода и азота. Эти два регулятора реагируют на разные концентрации кислорода, позволяя точно подстраивать контроль различных генов к условиям полного или частичного анаэтобиоза.

Активные радикалы: их повреждающее действие и механизм инактивации Кислородный стресс вызван действием активных кислородных интермедиатов, таких как анион супероксида (O2•-), перекись водорода H2O2 и гидроксил-радикал HO•, которые способны повреждать белки, нуклеиновые кислоты и клеточные мембраны (Рис.9.1). Кроме того, повреждающее действие на клеточные структуры имеют производные этих O O PQ PQ активных соединений гипохлорная кислота (HOCl) и активные азотные интермедиаты - Ndh II азотистый оксид (NO•). пероксинитрит Ndh II (HOONO) и нитрозотиолы (RSNO). Для O O SiRase предотвращения повреждений клетка SiRase PQ PQ _ _ SH SH вынуждена постоянно синтезировать _ _ SH SH 2+ 2+ Acn[4Fe-4S] Acn[4Fe-4S] ферменты, инактивирующие активные.O H2O2 +.O- H2O2 + радикалы и устраняющие вызванные ими 2+ 2+ Fe Fe повреждения.

1+ 1+ _ _ Acn[3Fe-4S] Acn[3Fe-4S] S S H2 O H2 O _ _ S S HO.

HO.

Причина окислительного стресса.

Окислительный стресс является неизбежным побочным продуктом аэробного стиля жизни, поскольку O2•- и H2O формируются каждый раз, когда Рис.9.1. Повреждение макромолекул клетки молекулярный кислород химически окисляет активными формами кислорода переносчики электронов. Особенно активны в этом отношении восстановленные флавопротеины. У экспоненциально растущих бактерий E. coli O2•- и H2O2 образуются при автоокислении компонентов дыхательной цепи. Флавин NADH дегидрогеназы II является основным местом переноса электронов к кислороду. Фумаратредуктаза - терминальная оксидаза, индуцируемая при анаэробном росте, - очень активно взаимодействует с кислородом и, возможно, является основной причиной стресса, возникающего при переходе от анаэробных к аэробным условиям. Растущие в - 43 - аэробных условиях E. coli производят достаточно супероксиддисмутазы, чтобы поддерживать концентрацию O2•- на уровне порядка 10-10 M. Это около половины той концентрации, которая могла бы уменьшить активность жизненно важных ферментов и ингибировать рост. Концентрация H2O2 на порядок меньше ингибирующей. Таким образом, защитные системы бактериальной клетки поддерживают концентрацию активных производных кислорода на уровне, лишь слегка более низком, чем токсичный. Это активно используется растениями, животными, а иногда и другими бактериями для защиты от своих бактериальных конкурентов (или патогенов). Например, фагоциты животных используют NADPH оксидазу, NO• синтазу и миелопероксидазу для того, чтобы бомбардировать захваченные бактерии O2•-, NO•, HOCl и их производными H2O2, HOONO и RSNO Механизмы окислительных повреждений клетки.

Наиболее чувствительными к окислительным повреждениям являются различные дегидратазы, использующие железо-серные кластеры [4Fe-4S] для связывания и дегидрирования субстратов.

Окисление таких дегидратаз супероксид-ионом вызывает разрушение Fe-S кластеров и потерю активности. Кроме того, побочным продуктом такого окисления являются многочисленные ионы железа, высвобождаемые в цитоплазму, где они совместно с H2O2 катализируют окисление ДНК.

H2O2 эффективно окисляет тиолы, поэтому повреждает множество дегидрогеназ, использующих остатки цистеина в каталитическом центре. Кроме того, взаимодействие H2O2 с ионами Fe2+ дает сильнейший окислитель HO• (гидроксил), способный взаимодействовать практически со всеми биомолекулами, в первую очередь с ДНК, с чем и связана в первую очередь летальность действия H2O2.

(действие активных форм азота) Защита от окислительного стресса.

Для защиты от окислительного стресса клетка использует целый ряд антиоксидантных ферментов и систем репарации, большинство которые экспрессируется на низком базальном уровне в нормальных условиях. При воздействии супероксида и перекиси водорода экспрессия многих антиоксидантных белков индуцируется, что зависит в основном от действия двух регуляторов - SoxRS и OxyR.

SoxRS регулон SoxRS в ответ на супероксид регулирует экспрессию не менее 10 белков, включая супероксиддисмутазу (SodA), участвующую в репарации ДНК эндонуклеазу IV (Nfo) и резистентные к супероксиду изоформы фумаразы (FumC) и аконитазы (AcnA). Аконитаза конвертирует цитрат в изоцитрат в цикле Кребса. Это мономер с одним железо-серным центром, который может находиться в каталитически активной [4Fe-4S] и неактивной (например, из-за окислительного повреждения) [3Fe-4S] форме. Кроме того, SoxRS обеспечивает увеличение концентрации глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Zwf), что усиливает восстановительную силу клетки, и увеличение количества репрессора метаболизма железа Fur, что снижает поглощение железа и, следовательно, снижает выработку гидроксила.

Индукция регулона происходит в два этапа. Сначала редокс-сенсорный белок SoxR под влиянием супероксид-иона индуцирует транскрипцию soxS, а затем уже SoxS непосредственно активирует гены мишени, связываясь с их промоторными областями. Конститутивно экспрессируемый белок SoxR (Рис.

9.2) - димер, каждая из субъединиц которого содержит по одному стабильному [2Fe-2S] центру.

Окисление восстановленной формы [2Fe-2S]+ в форму [2Fe-2S]2+ приводит к активации SoxR. Какая молекула вызывает окисление SoxR, пока неясно. Возможно, это делает сам супероксид-ион.

Только окисленная форма SoxR может активировать транскрипцию soxS, однако восстановленная SoxR форма обладает той же аффинностью к ДНК. Следовательно, окисление Рис.9.2. Активация транскрипции белком SoxR регулятора должно каким-то образом изменять его взаимодействие с ДНК.

- 44 - Интересным является то, где SoxR связывается с регуляторной областью – между сайтами –10 и – промотора, что очень необычно для активатора транскрипции. Кроме того, расстояние между этими сайтами слишком большое для активного промотора – 19 н.п. Скорее всего, промоторная область soxS одновременно оказывается занятой РНК-полимеразой и SoxR, расположенными по разные стороны ДНК, а окисление SoxR каким-то образом помогает РНК-полимеразе образовать открытый комплекс на нестандартном промоторе.

Гены soxS и soxR расположены рядом друг с другом, транскрибируются в противоположные стороны, причем их промоторные области перекрываются.

OxyR регулон Другой транскрипционный фактор, OxyR, в ответ на H2O2 активирует синтез примерно 30 белков (четко показан контроль через OxyR только для 9 из них), в том числе каталазы (гидропероксидазы I, KatG), двух субъединиц алкилгидропероксид редуктазы (AhpCF), глутаредоксина (GrxA), глутатион редуктазы (GorA), Mn-супероксиддисмутазы и Fur-репрессора. Регулируемые OxyR неспецифический ДНК-связывающий белок Dps (DNA-binding protein from starved cells) и регуляторная РНК OxyS защищают от мутагенеза. Активируется также синтез ряда генов теплового шока и регулятора синтеза капсульных полисахаридов.

Ген oxyR кодирует небольшой 34 kDa белок, примадлежащий к семействы LysR-подобных регуляторов. Как и большинство регуляторов этого семейства, OxyR негативно контролирует свой собственный синтез, причем как в присутствии H2O2, так и в ее отсутствии. Такая регуляция поддерживает количество белка на постоянном уровне. OxyR также активирует транскрипцию соседнего, транскрибируемого в противоположном направлении, гена oxyS, продуктом которого является небольшая нетранслируемая РНК, влияющая на экспрессию целого ряда генов.

Тетрамер OxyR существует в двух формах - окисленной и восстановленной, но только окисленная форма активирует транскрипцию, связываясь с карбоксиконцевым доменом -субъединицы РНК полимеразы (Рис. 9.3). H2O2 непосредственно окисляет OxyR, приводя к образованию дисульфидной связи между двумя цистеиновыми остатками одной субъединицы OxyR. Образование этой дисульфидной связи вызывает конформационное изменение, которое влияет на связывание с ДНК.

Восстановление (и, следовательно, инактивация) OxyR осуществляется глутаредоксином (тиол:дисульфид оксидоредуктазой, использующей восстановленный глутатион и NADH в качестве восстановителей), а поскольку глутаредоксин, также как и глутатионредуктаза, находятся под контролем OxyR, получается, что OxyR сам активирует экспрессию Рис.9.3. Активация транскрипции белком OxyR ферментов, необходимых для его восстановления, т.е. инактивации..

Адаптация к анаэробиозу.

Основные регуляторы - FNR (fumarate and nitrate reduction) и ArcA (aerobic respiratory control) Оба белка являются транскрипционными факторами, активирующимися в анаэробных условиях и инактивирующихся при взаимодействии с кислородом. FNR детектирует кислород непосредственно через редокс-чувствительный Fe-S кластер, входящий в его структуру, тогда как активность ArcA зависит от его фосфорилирования, контролируемого мембранной гистидинкиназой ArcB. В отличие от FNR ArcB не детектирует содержание кислорода непосредственно, а реагирует на общее состояние клетки. В связи с этим два регулятора реагируют на различные концентрации кислорода и контролируют разные, но частично перекрывающиеся наборы генов. Это позволяет бактерии быстро и эффективно приспосабливаться к широкому диапазону концентраций кислорода.

FNR как сенсор кислорода FNR – глобальный регулятор, контролирующий экспрессию более 120 генов у E. coli. Белок был идентифицирован путем изоляции мутантов, неспособных восстанавливать нитрат и фумарат. Позже было показано, что белок отвечает за индукцию в анаэробных условиях таких ферментов цикла Кребса как сукцинат дегидрогеназа, фумараза, изоцитрат дегидрогеназа, участвующих в производстве энергии - 45 - путем окислительного фосфорилирования. FNR также активирует экспрессию ферментов анаэробного дыхания, которые используют альтернативные конечные акцепторы электронов, такие как DMSO, фумарат или нитрат. Помимо активации экспрессии необходимых в анаэробных условях белков FNR также репрессирует такие аэробные респираторные ферменты как цитохромоксидаза и NADH дегидрогеназа.

Интересно то, что по аминокислотной последовательности FNR похож на БАК. Mеханизм активации транскрипции обеими белками тоже одинаков - оба активируют транскрипцию, контактируя с -субъединицей РНК-полимеразы. Единственным существенным отличием FNR является дополнительный участок на амино-конце этого белка, несущий ферредоксинообразный кластер из четырех цистеиновых остатков (Cys-X3-Cys-X2-Cys-X5-Cys), что привело к предположению о детекции кислорода при помощи железо-серных кластеров.

При взаимодействии с кислородом два [4Fe-4S]2+ кластера димера FNR быстро (за пару минут) превращаются в два [2Fe-2S]2+ кластера, причем железо остается связанным с окисленным FNR, скорее всего в виде сульфида (Рис. 9.4). Если клетку быстро вернуть в анаэробные условия, [2Fe-2S]2+ центры быстро возвращаются в исходное [4Fe-4S]2+ состояние. Однако более продолжительная инкубация в присутствии кислорода ведет уже к необратимому разрушению центров [2Fe-2S]2+, давая апобелок, полностью лишенный железа. FNR активен как транскрипционный фактор только в форме гомодимера, для образования которого необходимо присутствие интактных [4Fe-4S]2+ кластеров.

Преобразование кубической структуры [4Fe-4S]2+ в плоскую [2Fe-2S]2+ при окислении белка в аэробных условиях оказывается достаточным для внесения существенных конформационных изменений, вызываэщих Рис.9.4. Репрессия транскрипции белком FNR диссоциацию димера FNR на мономеры, что предотвращает связывание белка с ДНК.

Широкий диапазон концентраций кислорода детектируется клетками E. coli.

Анаэробное дыхание у этой бактерии происходит в диапазоне концентраций кислорода 1-5 µМ (при наличии соответствующих акцепторов электронов), при более низкой концентрации бактерия переключается на брожение. Именно в этом диапазоне концентраций и происходит переход FNR из неактивной в активную форму.

ArcB реагирует на изменения концентрации кислорода на границе микроанаэробной и анаэробной зоны (5-10 µМ). Этот белок скорее всего реагирует на изменения электронтранспортной цепи (трансмембранного протонного потенциала или же степени окисления какого-то переносчика электронов). Вторым сигналом, на который может реагировать ArcB, является концентрация анаэробных метаболитов.

ArcB работает в паре с РО ArcA (Рис.

ArcB 9.5). На сегодняшний день регулон ArcA P P P P насчитывает более 30 генов, кодирующих His Asp His Asp ArcA ферменты цикла Кребса (флавопротеиновые дегидрогеназы, цитохромоксидазы и т.д.), P ATP ADP глиоксилатного шунта и деградации жирных Asp OmpR кислот. Регуляция в основном заключается в P P репрессии при анаэробиозе синтеза ферментов ArcA Asp SixA Asp CheY аэробного дыхания, хотя ArcA также активирует несколько генов в микроанаэробных условиях.

Рис.9.5. Двухкомпонентная регаляторная ArcB имеет существенное сходство с система ArcA/ArcB компонентами сенсорных систем. В его состав - 46 - входят: классический гистидинкиназный домен, центральный домен, сходный с регуляторным доменом РО, и небольшой HPt домен на карбокси-конце. Фосфат может передаваться на ArcA с любого из фосфорилириванных гистидиновых остатков в составе ArcB – и из автокиназного, и из HPt домена.

Причем имеются данные, что для реакции на анаэробные метаболиты достаточно только автокиназного домена, тогда как для "определения" состояния электронтранспортной цепи важен HPt домен.

Аэротаксис Флавопротеин AerA является мембранным рецептором, отвечающим за аэротаксис. Амино концевой домен этого белка похож на редокс-сенсоры фиксации азота у Azotobacter, а карбокси концевой - на сигнальный домен белка Tsr - серинового рецептора хемотаксиса. Для обеспечения аэротаксиса необходимо взаимодействие AerA только с CheY, CheA и CheW, таким образом, AerA - типичный сенсор хемотаксиса, детектирующий концентрацию кислорода.

В защите от активного кислорода участвуют также еще несколько белков, не контролируемых SoxRS и OxyR.

Взаимосвязь между окислительным стрессом и другими регуляторными системами.

Еще несколько транскрипционных регуляторов участвуют в контроле экспрессии антиоксидантных генов. Например, RpoS индуцируется, когда клетки подвергаются различным стрессам, включая голодание, осмотический шок, кислотный шок и стационарную фазу. Клетки, активно экспрессирующие RpoS, устойчивы к целому ряду стрессовых воздействий, включая высокие концентрации перекиси водорода. RpoS контролирует экспрессию целого ряда антиоксидантных генов, включая katE, xthA и sodC. Члены OxyR- регулона katG, gorA и dps также подвержены регуляции через RpoS.

Анаэробные регуляторы FNR и ArcAB также модулируют экспрессию генов sodA, sodC, acnA и fumC. Кроме того, два гомолога белка SoxS, MarA и Rob, регулируют экспрессию практически всех генов регулона SoxRS. Наконец, экспрессия одного транскрипционного фактора, Fur, контролируется как SoxRS, так и OxyR.

Литература:

1. G. Storz, J.A. Imlay. Oxidative stress. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:188– 2. C.E. Bauer, S. Elsen, T.H. Bird. Mechanisms for redox control of gene expression. Annu. Rev. Microbiol.

1999. 53:495- Подробная информация об основных регуляторах – SoxRS, FNR, OxyR, ArcB и других 3. G. Sawers. The aerobic/anaerobic interface. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:181– Акцент на адаптацию к анаэробным и микроаэробным условиям. Роль FNR и ArcB.

10. Деление бактериальной клетки и его регуляция 10.1. Аппарат деления клетки Escherichia coli Образование клеточной перегородки (септы) катализируется рядом жизненно важных белков, которые путем самосборки образуют кольцевую структуру (септосома или дивисома) в месте будущего деления. Сборка этой структуры происходит последовательно и инициируется белком FtsZ – структурным и функциональным аналогом эукариотических тубулинов.

Важным моментом деления является выбор правильной позиции для сборки септосомы Ингибитор клеточного деления MinCD блокирует сборку септосомы, а другой белок, MinE, образует кольцо в середине клетки, которое защищает будущий сайт деления от действия ингибитора.

Деление тесно координировано с другими клеточными процессами, прежде всего с репликацией хромосомы, однако механизмы, управляющие такой координацией, исследованы недостаточно. В последнее время много внимания уделяется двум специальным случаям клеточного деления, связанным с дифференциацией клеток, - полярному делению при спорообразовании (у B. subtilis) и делению у Caulobacter crescentus (которое всегда приводит к образованию двух морфологически различающихся клеток). У C. crescentus показано существование белка (CtrA), контролирующего как репликацию - 47 - хромосомы, так и транскрипцию ключевого гена деления, FtsZ, и, таким образом, обеспечивающего необходимую координацию двух процессов.

Если смотреть на бактерию под микроскопом, легко сделать наблюдение, что бактериальная жизнь является по существу постоянным процессом роста, который в некоторый момент приводит к делению клетки. Чтобы делиться успешно, бактерия должна удвоить свою массу, дуплицировать хромосому и построить особую структуру, разделяющую две дочерних клетки - септу. Хотя главный процесс деления, цитокинез, может происходить более-менее одинаково у всех бактерий, детали деления в целом изменяются значительно в зависимости от формы бактерии и состава ее клеточной стенки. Объект этого исследования, Escherichia coli, является грамотрицательной бактерией, которая интенсивно изучалась генетически и биохимически и является, вероятно, организмом, о котором мы знаем больше, чем о любом другом представителе живого мира Земли. Форма этой бактерии определена жестким слоем пептидогликана или муреина, расположенного между внешней и внутренней клеточными мембранами. Пептидогликан - огромная молекула, образующая подобную мешку, но достаточно жесткую структуру, которая в сочетании с высоким внутренним осмотическим давлением действует как экзоскелет, определяющий постоянную форму клетки и ее механическую прочность в разнообразии окружающих сред с различной осмолярностью. Пептидогликан - уникальный полимер, составленный из цепей гликана, поперечно сшитых короткими пептидными мостикми. Присутствие такой жесткой структуры накладывает отпечаток на всю физиологию этой бактерии, и, в частности, на процесс деления, который и является предметом этогй диссертации. Муреиновый саккулюс должен быть дублирован каждый клеточный цикл, причем таким способом, который гарантирует постоянную целостность этой структуры, являющейся абсолютно необходимой для поддержания формы и жизнеспособности клетки. Эта цель достигается при помощи сложного комплекса белков, включающего муреинсинтетазы, литические ферменты и множество белков, специфических для деления, но не связанных непосредственно с метаболизмом муреина. Экспрессия этих белков подвержена сложной системе регуляции, управляющей присутствием нужных количеств нужных белков в нужных местах и в нужное время и координацией клеточного деления с репликацией хромосомы и клеточным ростом.

10.1.1. Структура муреина.

Гликанoвые цепи муреина сложены из повторяющихся субъединиц, состоящих из двух аминосахаров, N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) и N-ацетилмурамовой кислоты (MurNAc), связанных 1,4 гликозидными связями (Рис. 10.1). Длина этих цепей значительно варьирует со средним числом дисахаридных субъединиц. Цепи гликана перекрестно сшиты короткими пептидными мостами.

Пентапептид L-Ala-D-Glu-DAP-D-Ala-D-Ala (DAP - meso-диаминопимелиновая кислота) присоединен к лактатной группе MurNAc через амидную связь с остатком L-аланина. Присутствие двуосновной кислоты (DAP в E. coli) необходимо для формирования перекрестных сшивок между соседними цепями гликана. Кросс-сшивка осуществляется транспептидазой, которая отщепляет концевой D-аланин и образует пептидную связь между остающимся D-аланином и свободной амино группой DAP из пентапептида, связанного с другой цепью гликана. Формирование пептидного моста все еще оставляет свободную амино группу в одном из остатков DAP, что делает возможным присоединение дополнительной цепи гликана. Такие связи, соединяющее три цепи гликана, обнаруживаются приблизительно в 5 % случаев. В зрелом пептидогликане один или оба остающихся D-аланиновых остатка удаляются из пептидных мостиков карбоксипептидазами. Пептидные цепи располагаются по спирали вокруг гликановых цепей под углами приблизительно в 90° друг к другу. Если муреин однослоен, как в E.coli, пептидные мосты могли бы поэтому соединять каждый второй остаток MurNAc в соседних цепях гликана. Реальная степень поперечных сшивок близка к ожидаемой по крайней мере в некоторых условиях. Такое строение молекулы приводит к созданию прочной ковалентно связанной сетчатой структуры, фактически одной огромной молекулы, в которую заключена большая часть бактериальной клетки. Такая структура позволяет муреиновому саккулюсу противостоять внутреннему давлению в несколько атмосфер. И именно комбинация высокого внутреннего давления с жестким муреиновым "мешок" определяет фиксированную форму бактериальной клетки. Очевидно, что такая структура обеспечивает бактерии много преимуществ, но также создает и несколько проблем, наиболее важной из которого является рост жесткого саккулюса - он должен расти и делиться таким способом, - 48 - NAM NAG NAM NAG Muramidase Muramidase CH CH OH C O OH C O CH NH CH2 NH O O HO HO O O O O O O O O O CH2 HC CH3 NH CH HC CH3 NH CO OH CO OH CO CO CH3 CH L-Ala D-Glu NH CH3 CH m-DAP OH C O OH C O D-Ala Carboxy CH2 NH CH NH peptidase D-Ala O O HO HO O O O O O O O O O CH CH 2 HC CH3 NH HC CH3 NH CO OH CO OH CO CO CH CH 3 L-Ala Endopeptidase D-Glu NH m-DAP D-Ala Рис.10.1. Структура пептидогликана чтобы целостность всей структуры экзоскелета, противостоящей внутреннему осмотическому давлению, никогда не нарушалась.

10.1.2. Модели элонгации и деления муреинового саккулюса.

Другим возможным путем вставки нового материала в саккулюс была бы стратегия "присоединяй, а затем разрывай", используемая грамположительными бактериями, где новые слои муреина добавляются в ненапряженном состоянии ниже внешних слоев, несущих механическое напряжение. Эти новые цепи вводятся в действие медленно, по мере деградации внешних слоев гидролазами. Подобная форма роста саккулюса предложена для E. coli в другой модели. Эта модель постулирует, что новый материал должен быть присоединен к существующему слою муреина прежде, чем любые ковалентные связи могут быть расщеплены. Гипотеза объясняет роль тримерных поперечных сшивок и фактически полагается на их существование. Тримерные сшивки, как полагают, являются сайтами присоединения нового добавляемого материала. Самый маленький такой сайт - одиночная цепь гликана, но минимальная структура нового муреина, добавленного к этому сайту, должна по структурным причинам состоять из трех цепей. Чтобы объяснить экспериментально наблюдаемую вставку одиничных цепей гликана, постулируется существование "праймерной" цепи, синтезируемой монофункциональной трансгликозилазой. Никакое доказательство для существования таких "праймерных" цепей не доступно, но фермент, способный к созданию таких цепей, монофункциональная гликозилтрансфераза, известен. Предполагается, что триплет цепей гликана формируется путем синтеза двух новых цепей, сопряженного с их одновременным «пришиванием» к праймерной цепи. Этот триплет затем присоединяется к свободным амино группам DAP из пептидных мостиков с обеих сторон цепи-мишени в существующем муреине. Цепь-мишень затем удаляется, и три новых цепи выдвигаются в плоскость муреина внутренним давлением (Рис. 10.2).

Минорная модификация состава мультиферментного комплекса могла бы быть достаточна для обеспечения синтеза муреина в течение клеточного деления - PBP3 использовался бы вместо PBP2 и, возможно, монофункциональная трансгликозилаза была бы добавлена. В этом случае триплеты муреина могли бы синтезироваться за один шаг, так как, вопреки тому, что наблюдается при элонгации, при - 49 - (a) (b) Docking str and LT EP(AM) Ala-Glu-A2pm Ala-A2pm-Glu-Ala Stress-bear ing la ye r Ala-Glu-A2pm-Ala A2pm-Glu-Ala Ala Ala -A2pm TP Ala Glu Ala Ala -A2pm Glu Ala Ala Glu A2pm Ala Murein tr iplet TP/TG Ala Ala-A2pm-Glu-Ala Glu A2pm Ala Ala-Glu-A 2pm-Ala TG Рис.10.2. Элонгация пептидогликана делении несколько новых цепей муреина вставляются рядом. Небольшая задержка удаления старой цепи вела бы к инвагинации муреина в результате добавления следующего триплета муреина до того, как старая цепь педед предыдущим триплетом будет удалена.

10.1.3. Гены клеточного деления.

Определение специфического гена клеточного деления может быть несколько затруднено.

Клеточное деление, конечно, не возможно без многих из генов, описанных выше, и мутации в многих из их летальны, но термин "ген клеточного деления" обычно используется, когда мутация непосредственно ведет к видимому дефекту в делении без других непосредственных эффектов на клеточный рост, формирование клеточной стенки, репликацию ДНК или сегрегацию. Обычно, блок деления не приводит к немедленному прекращению роста, и клетки продолжают удлиняться некоторое время. Это приводит к формированию длинных филаментов, поэтому большинство жизненно важных генов клеточного деления имеют аббревиатуру fts (filamentous temperature sensitive). Если говорить о гене, который является абсолютно необходимым для деления каждой бактерии, то единственный ген из известных в настоящее время соответствует этому определению - ftsZ (даже этот ген вероятно отсутствует в по крайней мере одной бактерии - недавно сиквенированный геном Chlamydia trachomatis не имеет узнаваемого гомолога ftsZ). Но ftsZ в одиночку оказывается достаточным для деления только самых простых бактерий, например M. genitalium, живущих в идеальной богатой питательными веществами окружающей среде при постоянной температуре и постоянном осмотическом давлении и следовательно не нуждающихся (и не имеющих) муреиновой клеточной стенки. Другие бактерии должны иметь дополнительные структуры, чтобы выживать в своих местообитаниях.

Рис.10.3. Молекулярная машина Одна из этих дополнительных структур - муреиновая биосинтеза пептидогликана клеточная стенка, типичная для огромного большинства - 50 - Eubacteria. Присутствие клеточной стенки немедленно создает серьезные проблемы при делении.

Жесткой и находящейся под постоянным осмотическим давлением изнутри муреиновой клеточной стенке требуется набор белков для правильного разделения пополам при делении клетки без нарушения целостности структуры, и эти белки должны действует координированно с другими белками, необходимыми для деления как такового.

ftsZ - ген клеточного деления, которому уделяется наибольшее внимание в последнее время, после обнаружения того, что его продукт образует кольцо на внутренней стороне цитоплазматической мембраны в центре клетки. Ген ftsZ, расположенный в кластере mra на 2.5 минуте хромосомной карты, кодирует наиболее многочисленный белок клеточного деления, который присутствует в количестве от 5,000 до 20,000 копий на клетку. FtsZ белок разделяет некоторое сходство последовательности с эукариотическими тубулинами,что согласуется с его слабой ГТФазной активностью. Недавнее определение кристаллических структур FtsZ и тубулина подтвердило, что трехмерные структуры этих белков очень похожи несмотря на низкий уровень сходства первичной последовательности. N-концевые ГТФ-связывающие домены этих белков являются фактически идентичными, и C-концевые домены также очень схожи, хотя гомология первичных последовательностей C-концевых доменов не детектируется. Функциональное сходство FtsZ с тубулинами подтверждается его способностью собираться in vitro в протофиламенты и мини-кольца, которые близко напоминают структуры, формирыемые тубулином. Учитывая диаметр этих протофиламентов и диаметр клетки, количество FtsZ в клетке достаточно, чтобы образовать протофиламент, окружающий клетку 20 раз. Способность FtsZ полимеризоваться (димеризоваться), была недавно демонстрирована in vivo.

В настоящее время считается, что сокращение кольца, образованного молекулами FtsZ, приводит к продвижению молекулярных машин, синтезирующих клеточную перегородку в месте деления.

Формирование этого кольца является самым ранним видимым признаком деления и может быть обнаружено очень рано в клеточном цикле. Было также показано, что кольца FtsZ могут образовываться в ftsA, ftsQ и ftsI мутантах, так же, как и в ftsW и ftsK штаммах, таким образом указывая, что продукты этих генов не требуются для сборки кольцевой структуры и скорее действуют позже в процессе деления. FtsZ может также образовывать и некольцевые структуры, например дуги в rodAsui мутанте и спирали в штамме ftsZ26. Эти структуры могут сокращаться и таким образом определять форму отклоняющейся септы. Это также косвенно предполагает, что сборка кольца FtsZ начинается на "сайте нуклеации" на внутренней мембране (возможно, другом белке клеточного деления), от которого и начинается его двунаправленная полимеризация. Другой подход, основанный на наблюдении гибридов FtsZ-GFP in vivo, также подтверждает присутствие Z-колец в живых клетках;

более того, когда гибридный белок сверхпродуцируется, наблюдаются спиральные структуры. FtsZ-GFP также иногда образует двойные кольца в клеточном центре. Делеция 67 неконсервативных C-концевых остатков FtsZ в гибридном белке предотвращает формирование Z-кольца, но не останавливает полимеризации, более того, полимеры, формирующиеся с этим делеционным вариантом (спирали и толстые листы), оказываются гораздо более устойчивыми и имеют более яркую флюоресценцию.

Гомологи FtsZ были найдены в разнообразных Eubacteria и Archaea, включая все организмы, для которых полные геномные последовательности уже определены (кроме C. trachomatis);

этот белок был найден даже в высшем растении, Arabidopsis thaliana, где он кодируется ядерным геном, но очевидно требуется для деления хлоропластов.

Свойства Z-кольца, главным образом его формирование рано в клеточном цикле, местоположение в середине клетки на будущем сайте деления, и его видимое сокращение в течение процесса деления, обеспечивают привлекательное основание для предположений, что кольцо FtsZ может быть сайтом сборки для других белков, вовлеченных в деление, а также движущей силой или, по крайней мере, ее составляющей, направляющей образование септы. Для выполнения этих двух предполагаемых функций FtsZ должен взаимодействовать по крайней мере с некоторыми из предложенных участников комплекса деления. Некоторое доказательство для такого взаимодействия появилось недавно и обсуждается позже в этой главе.

Ген ftsA, расположенный перед ftsZ, кодирует 46 kDa белок, присутствующий в количестве приблизительно 150 молекул на клетку. Правильное отношение FtsA к FtsZ (1:100) является необходимым для успешного деления. Цитоплазматическая форма FtsA может фосфорилироваться и в фосфорилированном состоянии является способной к связыванию АТФ, тогда как в нефосфорилируемой форме белок связывается с клеточной мембраной. Белок - член большого - 51 - семейства АТФ-связывающих белков, которые включают актины и белки теплового шока (HSP70), и было предположено, что белок имеет трехмерную структуру, типичную для представителей этого семейства. Однако мутации по основаниям, которые, как предполагается, являются необходимыми для функции АТФазы, так же, как и по фосфорилируемым остаткам, не изменяет способность белка комплементировать известные температурочувствительные мутации ftsA. Недавно было показано с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии и GFP гибридов, что FtsA следует непосредственно за FtsZ во время деления - кольцо визуализируется в середине клетки, немного позже чем кольцо FtsZ, и эти структуры ведут себя точно тем же самым способом в различных мутантах, которые имеют некольцевые FtsZ структуры (спирали или дуги). FtsA, вероятно, включается в формирующуюся структуру септы немедленно после того, как образуется кольцо FtsZ. Это утверждение основано на факте, что кольца FtsZ могут образовывать в мутантах FtsA, но не наоборот. Еще одно доказательство в пользу этого - то, что гибридный белок FtsA-GFP, обычно локализующийся в центре клеток, образует спиральные структуры (такие же, как и у FtsZ-GFP гибридов), когда концентрация FtsZ увеличена. Также, часть гибридного белка FtsA-GFP оказывалась ассоциированной с мембраной, что подтверждает существование двух субпопуляций FtsA, локализованных в цитоплазме или клеточной мембране согласно состоянию их фосфорилирования.

ftsQ находится перед геном ftsA. Его продукт - 31 kDa белок цитоплазматической мембраны с единственной N-концевой трансмембранной -спиралью. Большая часть белка расположена в периплазме. FtsQ белок, по оценкам, присутствует в количестве от 50 до 100 копий на клетку. Мутанты этого гена дают филаменты без признаков сокращений, но сокращения становятся видны, если ввести вторую мутацию в гене rodA, что свидетельствует в пользу действия FtsQ после FtsZ.

Цитоплазматический и трансмембранный домен FtsQ не являются специфическими для его функции и могут быть заменены мембранным якорем от другого белка. Периплазматический домен - единственная часть белка, требующаяся для септальной локализации и достаточная для комплементации ftsQ1ts мутанта. Правильная локализация FtsQ зависит от цитоплазматических белков FtsZ и FtsA, но не от периплазматических FtsL или FtsI. Это свидетельствует в пользу того, что FtsQ действует на промежуточной стадии образования септы и вероятно взаимодействует с периплазматическим белком, отличным от FtsL и FtsI, для достижения правильной локализации во время деления.

ftsW расположен между murD и murG в генном кластере mra. Мутанты ftsW филаментируют без видимых сокращений даже когда объединены со сферическими мутациями, что предполлагает раннюю роль в клеточном делении. Высокая гидрофобность и гомология с RodA предполагают локализацию белка во внутренней мембране. Было предложено, что белок FtsW взаимодействовует с PBP3, но нет никакого прямого доказательства этого взаимодействия. Ранний блок деления в мутантах ftsW может быть обусловлен стабилизацией кольца FtsZ, поскольку кольцо отсутствует у 50 % филаментов в штамме, полностью лишенном FtsW, и число колец уменьшено у оставшихся 50 %.

ftsN ген, расположенный на 88.5 минуте, кодирует 36 kDa белок с трансмембранным сегментом около N-конца, коротким N-концевым цитоплазматическим и большим периплазматическим доменами.

Белок присутствует в количестве приблизительно 50 молекул на клетку. Цитоплазматический домен белка оказывается абсолютно необязательным, и трансмембранный сегмент может быть заменен трансмембранным доменом MalG или даже отрезаемой сигнальной последовательностью белка MalE, из чего следует, что только периплазматическая часть белка определяет его специфическую функцию. С другой стороны, перемещение белка в периплазму абсолютно необходимо для его нормального функционирования. Ген был первоначально изолирован как мультикопийный супрессор ftsA12 мутации, а затем была показана его способность супрессировать ftsI23 и ftsQ1 мутации, две мутации ftsW и ftsK. Так как истощение клеточного запаса FtsN ведет к филаментации (длинные несегментированные филаменты), он считается жизненно необходимым белком клеточного деления. Мутантный фенотип, количество белка и его местоположение вели к предложению, что FtsN функционирует вместе с FtsQ, FtsI и FtsL в 'стехиометрическом комплексе' на сайте формирования септы.

ftsL (mraR) находится близко к самому началу генного кластера mra. Его продукт - 13.6 kDa белoк цитоплазматической мембраны с одним пронизывающим мембрану доменом и большeй частью белка, расположенной в периплазме. Белок присутствует в количестве от 30 до 40 копий на клетку, и мутация ведет к продукции несегментированных филаментов. Белок содержит лейциновую застежку, которая - 52 - может быть жизненно важна для его функции, возможно управляя его димеризацией. FtsL - мембранный белок с маленькими цитоплазматическими и трансмембранными доменами и большим периплазматическим доменом. В отличие от некоторых других белков деления, и цитоплазматические, и пронизывающие мембрану домены оказывались специфичными и жизненно важными для правильного функционирования этого белка. Недавняя работа продемонстрировала, что, подобно нескольким другим белкам клеточного деления, FtsL образует кольцевную структуру в центре клетки довольно поздно в процессе деления. Эта локализация зависит от функции FtsZ, FtsA и FtsQ, но не FtsI.

С другой стороны, локализация FtsQ, FtsA и FtsZ не требует FtsL.

zipA ген был обнаружен недавно при помощи процедуры аффинного блоттинга, в течение поиска белков, специфично взаимодействующих с FtsZ. Ген оказался жизненно важным. Его инсерционная инактивация в присутствии комплементирующей термочувствительной плазмиды дает длинные несегментированные филаменты при непермиссивной температуре. Интересно, что сверхэкспрессия ZipA также блокировала клеточное деление, но этот блок может быть полностью преодолен путем увеличения количества FtsZ, что также свидетельствует в пользу возможности взаимодействия между этими двумя белками. Кроме того, гибриды ZipA::GFP локализовались в кольцевной структуре в середине клеток в 91 % случаев, иногда будучи видимыми даже в очень молодых клетках. Это напоминает поведение FtsZ колец, описанных. ZipA - белок с предсказанным молекулярным весом kDa, который мигрирует как 50 kDa на гелях SDS-PAGE. Самый N-конец белка предположительно локализуется во внутренней мембране, а остальная часть - в цитоплазме. Немедленно после пронизывающего мембрану домена есть и богатая пролином и глутамином областьразмером остатка, которая может образовывать жесткий линкер между мембранным якорем и C-концевым доменом белка. Эта структура, так же, как и местоположение белка, делает его хорошим кандидатом на роль связки между мембраной и кольцом FtsZ. Возможность прямого взаимодействия между ZipA и FtsZ поддержана присутствием мотивов в последовательности ZipA, подобных доменам связывания с микротрубочками нескольких эукариотических белков, и демонстрации стабилизации FtsZ протофиламентов in vitro при помощи ZipA. Hale и de Boer первоначально предложили возможную роль ZipA как центра нуклеации сборки кольца FtsZ (что соответствует его присутствию в количестве 1-10 % FtsZ). Это предположение, однако, может быть и неверно, так как более поздняя работа показала, что Z кольца по прежнему образуются в отсутствии ZipA, хотя количество сформированных колец и уменьшатся. Срединная локализация самого ZipA оказывалась FtsZ-, но не FtsA- или FtsI зависимой. И, в свою очередь, септальная локализация FtsA не зависела от ZipA.

ftsI находится в том же самом кластере, что и ftsQAZ, и кодирует специфическую для септы синтетазу муреина, PBP3. Белок, как оценивают, присутствует в 50-100 копиях в клетку. PBP3 - трансмембранный белок с каталитическим доменом, расположенным в периплазме. Мутанты филаментируют с сокращениями, видимыми только после введения сферической мутации. PBP3 - специфическая для деления транспептидаза. Было высказано предположение, что PBP3 требуется какой-то дополнительный белок, чтобы проявить трансгликозилазную активность, подобно PBP2 и RodA белкам. FtsW был предложен для этой функции на основе сходства последовательности между FtsW и RodA;

доказательство для этого взаимодействия, однако, отсутствует.

Белок локализуется к септе на последних стадиях деления;

часть белка также наблюдается на клеточных полюсах. Для правильной септальной локализации белка требуется его собственный трансмембранный домен, а также FtsZ, FtsA, FtsQ, и FtsL.

Ген ftsK расположен на 20 минуте хромосомы после SOS-индуцибельного промотора (dinH) и кодирует цитоплазматический мембранный белок с предсказанным размером приблизительно 147 kDa.

Белок высоко гомологичен нескольким белкам SpoIIIE грамположительных бактерий. В B. subtilis этот белок ответствечает за правильное распределение одной из сестринских хромосом в споровый компартмент, а также может быть вовлечен в завершение септы. Кроме того, C-концевая часть белка имеет существенную гомологию со множеством Tra белков плазмид Streptomyces и конъюгативного транспозона Tn916. FtsK, подобно SpoIIIE, имеет гидрофобную N-концевую область с несколькими потенциальными трансмембранными сегментами и большим цитоплазматическим доменом, содержащим нуклеотидсвязывающий мотив. Белок локализован в центре клетки во время клеточного - 53 - деления, а при помощи гибрида N-концевого мембранного домена FtsK с белком GFP было показано, что только N-концевые 15 % белка требуются для правильной локализации. Та же самая N-концевая часть достаточна для комплементации ftsK44 мутации. Изолированная первой термочувствительная мутация ftsK44 локализуется в этой части белка в одном из -спиральных трансмембранных сегментов, и это мутационное изменение фактически предотвращает правильную локализацию белка. Фенотип двойного мутанта ftsK rodA свидетельствует в пользу того, что белок действует поздно в делении. Это поддержано выбором времени локализации FtsK - FtsK-GFP гибрид локализуется на сайте деления только тогда, когда уже есть видимое сокращение. С другой стороны, данные иммунофлуоресценции указывают на то, FtsK локализуется к септе рано, что поддерживается гладким фенотипом филаментов, образуемых нулевым мутантом.

Недавние данные предлагают, что С-концевая часть белка, которая имеет самую высокую гомологию с SpoIIIE и другими белками с "ДНК-мобилизующей" функцией, действительно требуется для нормального разделения ДНК между сестринскими клетками в течение деления. Чтобы подвести итог, N-концевая часть FtsK вероятно играет некоторую роль при завершении септы, в то время как С концевой домен необходим, чтобы переместить ДНК, которая могла бы быть поймана закрывающейся септой, в правильный компартмент.

10.1.4. Сегрегация нуклеоидов.

Очевидно, клетка должна копировать свою хромосому в течение каждого клеточного цикла и гарантировать, что полученные копии окажутся в различных дочерних клетках. Поэтому деление должно быть так или иначе скоординировано с репликацией хромосомы и сегрегацией нуклеоидов.

Поскольку скорость репликации ДНК при данной температуре постоянна, клетки достигают необходимого числа полных хромосом к времени деления через контроль инициации репликации - интервалы между событиями инициации равны интервалам между делением. Это приводит к тому, что быстро растущие клетки имеют множественные хромосомы.

Разделение сестринских нуклеоидов, очевидно, является необходимой предпосылкой для деления, и похоже, что пространство, свододное от нуклеоидов, может определять расположение септы (и, в свою очередь, формирование септы ингибируется в областях, где нуклеоид присутствует). В настоящее время нет полного согласия по поводу механизмов, осуществляющих разделение нуклеоидов, но недавно было продемонстрировано, что E. coli (также как другие бактерии) имеет активный подобный митотическому аппарат сегрегации. К сожалению, не известно, какие белки вовлечены в быструю сегрегацию точек начала репликации хромосом. Два возможных кандидата на эту роль - FtsK и продукты muk генов.

mukB мутанты имеют слегка филаментирующий фенотип и существенный процент безъядерных клеток. У мутанта хорошо выражено нерегулярное разделение нуклеоидов. MukB - самый крупный из охарактеризованных прокариотических белков. Он разделяет некоторое сходство с эукариотическими миозинами и имеет доменную структуру, напоминающую об эукариотических моторных белках кинезине и миозине, что совместимо с его предложенной функцией моторного белка, перемещающиеся нуклеоиды. Эта возможность поддерживается недавней демонстрацией специфического связывания MukB с микротрубочками. В дном опероне с mukB расположены два других гена, mukE и mukF. Их инактивация также ведет к дефекту в разделении нуклеоидов и продукции безъядерных клеток.

Очищенный MukB белок имеет низкую АТФазную и ГТФазную активности. N-концевой домен MukB связывается с высокой аффинностью с FtsZ. FtsZ может стимулировать АТФазную и ГТФазную активности MukB. Эти свойства совместимы с предполагаемой функцией MukB как моторного белка, использующего FtsZ как опору для генерации силы внутри клеток E. coli. Поскольку кольцо FtsZ собирается рано, MukB мог бы использовать это как "маркер", чтобы отодвинуть нуклеоиды от сайта, где будет сформирована будущая септа. В соответствии с этим продемонстрировали двунаправленное перемещение регулятора инициации репликации SeqA. Это перемещение происходило после формирования Z-кольца и требовало присутствия MukB.

Продукт гена ftsK является другим кандидатом на участие в разделении хромосомы. Первичная структура FtsK имеет сильное сходство с белком SpoIIIE B. subtilis и множеством Tra белков конъюгативных плазмид Streptomyces, для которых участие в перемещении ДНК было продемонстрировано. Первоначальная ftsK44 мутация не влияла на сегрегацию хромосом, но, когда - 54 - экспрессия C-концевого домена была уменьшена, дефект сегрегации был действительно обнаружен.

10.1.5. Дифференциация сайтов деления: система min.

Функция генов в локусе minB должна предотвратить формирование септы в неправильном месте.

Локус состоит из трех генов, minC, minD и minE. Белки MinC и MinD действуют вместе, образуя неспецифический ингибитор формирования септы, блокирующий клеточное деление на всех доступных сайтах. Белок MinE предотвращает действие этого ингибитора на внутренних сайтах, тем не менее разрешая ему действовать на клеточных полюсах. Хотя MinC обычно нуждается в активации белком MinD, чтобы функционировать должным образом, он может также действовать вместе с другим ингибитором деления, DicB. В мутантах minB (лишенных MinC или MinD) септа может формироваться или внутри клетки или на ее полюсах, но общее количество септ то же самое, что в нормальных клетках. Каждое полярное деление потребляет "квант" "потенциала деления" и одно центральное деление утрачивается, таким образом делая клетку длиннее. Следует также заметить, что время до следующего деления обратно пропорционально длине клетки, но даже в самых длинных клетках только одна септа может формироваться одновременно.

Местоположение MinD во внутренней мембране было определено иммуноэлектронной микроскопией. Было также показано, что MinD имеет активность АТФазы in vitro.

Было показано, что, несмотря на свои маленький размер (88 AК), белок MinE имеет три отдельных домена с различными функциями. Маленький N-концевой домен необходим, чтобы противодействовать активности ингибитора деления MinCD, центральная область может быть вовлечена в димеризацию или олигомеризацию, а большая C-концевая часть определяет топологическую специфичность функции MinE, позволяя ему действовать только на внутренних сайтах деления. Недавно было показано, что MinE образует кольцевную структуру около середины молодых клеток. Формирование этого кольца требовало MinD, но было независимо от MinC и FtsZ. Таким образом, в настоящее время MinE выглядит как белок, первым появляющийся на формирующемся сайте деления, что, возможно, является необходимым для правильной локализации кольца FtsZ, хотя не для его формирования.

Пока еще в точности не известно, как работают Min белки. Попытка показать прямое взаимодействие этих трех белков с их наиболее вероятной мишенью, FtsZ, оказалась неудачной;

хотя этот подход, использующий дрожжевую двухгибридную систему, легко показывает взаимодействие между членами системы Min и то, что MinE уменьшает взаимодействие между MinC и MinD. Природа топологического сигнала, узнаваемого белком MinE, также неизвестна.

10.1.6. Сборка и порядок действия белков клеточного деления на сайте деления.

Бактериальное клеточное деление, хотя и кажется простым на первый взгляд, является фактически весьма сложным процессом, в котором принимает участие много белков. Очевидно, что действие этих белков должно быть скоординировано так или иначе, и самый легкий путь, которым такая координация могла бы быть достигнута - через формирование макромолекулярного комплекса на сайте деления.

Предполагается, что эта, все еще в значительной степени гипотетическая, структура, названная дивисомой или септатором, собирается на сайте деления в самом его начале. Процесс, вероятно, начинается на сайте нуклеации, где инициируется сборка Z-кольца. Предполагается, что другие белки деления включаются в состав дивисомы после формирования Z-кольца.

Хотя генетическое доказательство в пользу возможности взаимодействия между генами клеточного деления существовало в течение некоторого времени, только прямая демонстрация белок белкового взаимодействия могла доказывать, что это взаимодействие действительно имеет место. Эти данные начали накапливаться недавно. zipA ген был фактически обнаружен через прямое связывание его продукта с FtsZ. Специфическое связывание очищенного N-концевого домена MukB с FtsZ было недавно продемонстрировано. Косвенное доказательство для FtsA-FtsZ взаимодействия обеспечивается исследованиями локализации гетерологичного FtsA в E. coli. FtsA белок из Rhizobium meliloti или Agrobacterium tumefaciens был способен локализоваться правильно в клетках E. coli, только если FtsZ белок от того же самого организма также обеспечивался. Взаимодействие между FtsZ и FtsA также наблюдалось при использовании дрожжевой двухгибридной системы. Также, косвенное доказательство существует для возможного взаимодействия FtsW с PBP3 и PBP3 и PBP1B. Взаимодействие между высокомолекулярным PBP и литическими ферментами уже было обсуждено выше.

Недавнее изучение локализации белков клеточного деления с использованием - 55 - иммунофлуоресценции и гибридов с GFP обеспечило информацию относительно локализации в середине клетки некоторых белков, что является предпосылкой для их участия в дивисоме. Локализация в сайте деления была сначала показана для FtsZ с использованием окрашивания иммунозолотом, а затем подтверждена иммунофлуоресцентной микроскопией и in vivo с использованием гибридов с GFP.

Несколько других белков деления также локализовались в септе - FtsA, FtsQ, ZipA, FtsW.

Недавние эксперименты с локализацией белков деления в нескольких fts мутантах дают ключ к порядку их привлечения в дивисому и, возможно, к последовательности их действия во время деления.

Расположение FtsA в середине клетки зависит от предшествующего формирования Z-кольца.

Перемещение FtsQ к септе требует FtsZ и FtsA, но не FtsL и FtsI. Септальная локализация FtsI оказывается зависящей от присутствия FtsZ и FtsA, так же, как FtsL и FtsQ. В то же время, сборка колец FtsZ слегка нарушена, если инактивирован PBP3, а сокращение кольца не происходит. FtsN также образует кольца в центре клетки, но требует не только FtsZ, но также и FtsA, FtsQ и FtsI для правильной локализации. Хотя фенотип первоначального ftsK мутанта и результаты, полученные с GFP гибридами предполагали позднее время действия для FtsK, иммунофлуоресцентное мечение показало, что белок локализовался к септе довольно рано;

только FtsZ и FtsA, но не FtsQ или FtsI требуются для правильной локализации.

Подводя итог, можно сказать, что доступные данные предлагают следующий порядок сборки в "дивисому" нескольких белков деления: FtsZ-FtsA-FtsQ-FtsL-FtsI. FtsN может быть включен в септу после FtsI, но мультикопийная супрессия мутаций в генах, кодирующих FtsA, FtsQ, FtsI и FtsK, может указывать более раннюю роль для белка. FtsK включается в септу после FtsA, но не известно, зависят ли более поздние белки от его локализации. ZipA и FtsA локализуются к септе после FtsZ и не требуют присутствия друг друга для этой локализации. FtsW может действовать прежде FtsZ, по крайней мере это требуется для стабилизации Z-кольца (Рис. 10.4).

FtsI - фермент, абсолютно требуемый для синтеза муреина септы, - является одним из последних белков, включаемых в дивисому. С другой стороны, сокращение Z-кольца требует активности FtsI. Это указывает, что целая структура дивисомы, возможно, должна быть собрана прежде, чем начнется синтез септы и ее сокращение. FtsI может также обеспечивать связь между периплазматическим пептидогликансинтезирующим комплексом (обсужденным выше) и белками клеточного деления. Хотя прямое взаимодействие FtsI с любым другим белком клеточного деления не было демонстрировано, косвенные доказательства таких взаимодействий свидетельствуют в пользу того, что FtsI - часть дивисомы. Поскольку непосредственное связывание FtsI с другими муреиновыми синтетазами и литическими ферментами было обнаружено, эти белки также должны входить в состав дивисомы.

Важная проблема возникает из-за того, что многие из белков клеточного деления присутствуют в количествах, намного меньших, чем FtsZ. Например, соотношение FtsA к FtsZ обычно составляет 1:100. FtsQ, FtsL (?) и FtsN (?) вероятно присутствуют в еще меньших количествах, чем FtsZ. Было предложено, что "минорные" белки образуют Рис.10.4. Сборка аппарата деления Escherichia coli комплексы друг с другом, "подсборки", которые присоединены к Z-кольцу, но расположены далеко друг от друга в начале - 56 - сокращения, сдвигаясь ближе друг к другу только в процессе сокращения. Не известно, какая сила является ответственной за сокращение кольца и прогресс деления.

Конечная стадия деления должна отличаться от сокращения, потому что дивисома должна быть демонтирована, и дочерние клетки должны разделиться, что может (или нет) требовать дополнительных белков для расщепления пептидных связей, которые вероятно скрепляют две клетки. Альтернативно, этот шаг мог быть выполнен "нормальными" литическими ферментами.

10.1.7. Регуляция клеточного деления.

Наиболее важный вопрос о регуляции клеточного деления – о правильном выборе времени сборки и точном размещении септы, - все еще остается в значительной степени без ответа. Есть, однако, некоторая информация относительно других аспектов регуляции деления - регуляция транскрипции нескольких генов деления, участие белковых регуляторов на уровне транскрипции или прямых белок белковых взаимодействий и специальный случай регуляции деления во время SOS ответа.

Транскрипционная регуляция.

Большинство генов клеточного деления расположены в большом генном кластере dcw (division and cell wall) или mra на 2 минуте хромосомы E. coli (Рис. 10.5). Несколько mur генов, вовлеченных в синтез пептидогликана, также расположены в этом кластере. Транскрипционные терминаторы не были найдены в пределах этого большого кластера из 16 генов, что вело к предположению, что весь кластер составляет один оперон. Гены в кластере обычно разделены только несколькими парами оснований, а в некоторых случаях даже перекрываются, что предполагает возможность трансляционного сопряжения.

Поскольку структура оперона обычно подразумевает какую-то координацию генной регуляции, проводились исследования регуляции транскрипции генов в этой области. Большинство генов в кластере имеет несколько промоторов, в различной степени ответственных за их транскрипцию и иногда реагирующих на различные стимулы окружающей среды.

Рис.10.5. dcw (mra) оперон генов клеточного деления и биосинтеза пептидогликана Escherichia coli - 57 - Сильный промотор расположен в самом начале кластера dcw. Этот промотор mra необходим для полной экспрессии первых девяти генов, до ftsW. Инактивация этого промотора не летальна, если первые девять генов кластера введены в клетку in trans, что указывает на присутствие дополнительных промоторов, способных к транскрипции нижележащих генов. Оказывается, однако, что транскрипция всех нижележащих генов, включая ftsZ, уменьшена, если этот (mra) промотор инактивирован.

Хотя промотор mra, вероятно, важен для нормальной транскрипции всех генов в кластере dcw, дополнительные промоторы в пределах кластера также важны и были фактически охарактеризованы первыми. Из-за очевидной значимости ftsZ в клеточном делении регуляция его транскрипции была изучена наиболее экстенсивно. Гену предшествует набор промоторов различной силы и типов, что, вероятно, отражает потребность настройки экспрессии гена в различных условиях. Первоначально основная роль в транскрипции ftsZ была приписана его двум проксимальным промоторам. Однако позже было показано, что наиболее сильный из этих "промоторов" на самом деле является сайтом процессинга для РНКазы E. Когда это было принято во внимание, оказалось, что почти половина транскриптов ftsZ происходила от двух промоторов в пределах ddlB. Однако позже было показано, что еще более сильный промотор расположен выше и две трети транскриптов начинаются перед ddlB. Это коррелирует с более ранним наблюдением, что более чем 6 т.н.п. перед ftsZ требуются для его нормальной экспрессии.

Регуляция экспрессии ftsZ с его проксимальных промоторов оказывается важной для надлежащего функционирования аппарата деления (Рис. 10.6). Вставка управляемого tac промотора непосредственно перед ftsZ вела к заметным изменениям нормального цикла деления, хотя клетки остались жизнеспособными. Это может указывать на то, что нормальный промотор ftsZ так или иначе регулирует транскрипцию гена в течение клеточного цикла (результат этой регуляции может максимизировать число жизнеспособных клеток на единицу массы). Эта возможность поддерживается колебанием количества транскрипта ftsZ в синхронизированных клетках. Также наблюдалось изменения в количестве транскрипта ftsZ, но приписывали их временному ингибированию транскрипции после репликации этой хромосомной области. Транскрипция, начинающаяся перед ftsA, показала периодичность и составляла существенную пропорцию транскриптов, захватывающих FtsZ, в то время как проксимальный промотор ftsZ транскрибировался конститутивно в течение всего клеточного цикла.

Хотя эти сообщения о колеблющихся уровнях транскрипта в течение клеточного цикла обеспечивают возможную связь между регуляцией генной экспрессии и иницииацией клеточного деления, неизвестно, как уровни транскрипта управляются, т.е. какие белки и промоторы являются ответственными за эти колебания. С другой стороны, регуляция транскрипции, начинающейся с двух промоторов, расположенных в пределах ddlB, была изучена более подробно.

sdiA ген (suppressor of division inhibition) был изолирован по его способности супрессировать действие нескольких ингибиторов деления. Будучи сверхэкспрессированым, его продукт индуцировал формирование мини-клеток и позволял мутанту ftsZ84 делиться при непермиссивной температуре. Эти эффекты наблюдались из-за того, что белок SdiA активировал транскрипцию с одного из промоторов в ddlB перед ftsQAZ и envA генами.

Значение этой активации не ясно, поскольку ген не является жизненно необходимым. Однако ген может играть роль в стационарной фазе, потому что белок имеет обширную гомологию с большим семейством LuxR-подобных транскрипционных активаторов "quorum sensing" семейства. Все известные активаторы этого семейства работают в паре с другим геном (гомологичным luxI), чьей функцией является продукция маленькой свободно Рис.10.6. Регуляция экспрессии проксимальных диффундирующей молекулы, N промоторов ftsZ у Escherichia coli ацил-гомосеринлактона, с ацил цепью, длина которой варьирует у - 58 - различных видов. Поскольку эта молекула накапливается при увеличении плотностьи клеток в популяции, luxR-подобный ген активирует транскрипцию соответствующего регулона. Интересно, что E. coli явно не имеет гомолога luxI, что поднимает вопрос: что действует как активатор SdiA? Две противоречивых работы рассматривали эту проблему. Не было найдено никакого доказательства эффекта предполагаемого автоиндуктора на регуляцию SdiA-зависимого промотора (ftsQp2).

Фактически, они наблюдали небольшое (30-35%) уменьшение транскрипции с этого промотора в течение роста в "культивированной" среде, в которой предварительно выращивались клетки E.coli. Этот эффект был меньше, чем снижение транскрипции с того же самого промотора (40-60%) в результате инсерционной инактивации гена sdiA. Вопреки этому сообщению, позднее было продемонстрировано не только увеличение транскрипции с ftsQp2 промотора в стационарной фазе, но также и активацию этого промотора автоиндукторами V. fischeri и V. harveyi, так же, как "культивированной" средой. Это свидетельствует в пользу того, что sdiA действительно действует подобно другим luxR-подобным регуляторам, хотя нативная молекула автоиндуктора в E.coli остается неизвестной.

rpoS ген, кодирующий сигма-фактор стационарной фазы, также вовлечен в регуляцию транскрипции ftsQAZ генов. В частности ftsQp1, один из нескольких промоторов, ответственных за транскрипцию ftsQAZ генов, но никакой другой промотор в ddlB-ftsZ области, зависит от RpoS.

stfZ - маленький ген, транскрибирующийся с антисмысловой цепи в 5' области ftsZ. Присутствие промоторной активности и функционального терминатора в этой области было показано, а ингибирование клеточного деления при повышенных температурах, когда эта область ДНК присутствует в множественных копиях, вело к предложению, что она действует как антисмысловая РНК, блокирующая трансляцию ftsZ подобно реликтовому фаговому гену dicF.

Посттранскрипционная регуляция.

Хотя многие, если не все, гены в кластере mra транслируются с полицистронных мРНК, относительная эффективность трансляции различных ORF изменяется значительно. Это неудивительно, поскольку продукты различных генов клеточного деления присутствуют в клетке в весьма различных количествах. FtsZ является, вероятно, наиболее распространенным (до 20,000 молекул в клетку), а FtsQ - одним из наименее распространенных. Несколько ORF в этой области не имеют хороших рибосомсвязывающих сайтов и, кроме того, несколько генов имеют отличные от ATG старт-кодоны.

Это подразумевало, что трансляция различных ORF в этой области должна демонстрировать существенные различия в эффективности, и это действительно имеет место.

Другой важный аспект посттранскрипционного контроля клеточного деления - ингибирование деления в течение SOS ответа. Повреждение ДНК в E.coli индуцирует экспрессию нескольких генов, которые исполняют две функции, важные для выживания клетки. Некоторые из индуцируемых белков вовлечены в восстановление ДНК, но функция других заключается в том, чтобы задержать клеточное деление, пока ДНК не восстановлена. SOS-индуцированый блок деления является результатом действия белка SulA.

Продукт гена sulA (sfiA) блокирует деление, предотвращая сборку Z-кольца. Использование дрожжевой двухгибридной системы показало прямое взаимодействие SulA с FtsZ. Было также показано, что SulA предотвращает полимеризацию FtsZ in vitro. Поскольку сборка кольца FtsZ - ключ к целому процессу деления, индукция SulA полностью блокирует деление. Как только SOS индукция закончена, SulA быстро деградируется протеазой Lon, и деление возобновляется.

FtsK также вовлечен в SOS ответ. Одна из предложенных функций этого белка должна гарантировать, что хромосомы не "защемляются" закрывающейся септой. Инактивация только цитоплазматической части FtsK позволяет продолжаться делению клетки, но индуцирует SOS ответ, возможно из-за последующего повреждения ДНК.

10.2. Регуляция клеточного цикла у Caulobacter crescentus.

Бактерия Caulobacter crescentus интересна в плане изучения клеточного цикла потому, что, по крайней мере на первый взгляд, клеточный цикл этой бактерии наиболее близок к эукариотическому:

имеются четко выраженные G1, S и G2 периоды ( у прокариот сложно пока говорить о М фазе);

более - 59 - того, в результате деления образуются Replication Chromosome segregation неравноценные клетки (т.е. наблюдается Cell division Flagellum некоторая дифференцировка) – одна из Asymmetric Motile Sessile Chemot actic Replication Predivisional дочерних клеток имеет жгутик и аппарат Replication bloc k initiation cell хемотаксиса, а другая неподвижна и Swarmer St alked cell cell остается прикрепленной к субстрату (Рис. 10.7).

В подвижной клетке репликация ДНК и деление клетки полностью заблокированы (т.е. имеет место четко выраженная G1 фаза клеточного цикла, St alk которой не наблюдается у быстро G1 S G Cell cycle растущих энтеробактерий). Через некоторое время бактерия утрачивает Flagellum St alk Flagellar biogenesis ejection biogenesis свой единственный полярный жгутик (а Development вместе с ним и аппарат хемотаксиса) и на этом же полюсе клетки формирует Рис.10.7. Клеточный цикл Caulobacter crescentus стебелек, которым прикрепляется к субстрату. Такое морфологическое изменение совпадает с инициацией репликации ДНК (началом S фазы). Во время этой фазы прикрепленная к субстрату клетка удлиняется и формирует новый жгутик на полюсе клетки, противоположном стебельку. По завершении репликации ДНК хромосомы перемещаются к полюсам (фаза G2), за чем следует деление клетки. Таким образом, в каждом цикле деления два типа морфологически и физиологически различных типа клеток сменяют друг друга: подвижная неспособная делиться клетка и неподвижная (прикрепленная) способная к росту и делению. Очевидно, что такая четкая смена поведения клеток должна строго контролироваться, и некоторая информация об этом контроле имеется.

Центральным регулятором клеточного цикла является белок CtrA, принадлежащий к уже хорошо нам знакомому классу регуляторов ответа. Этот белок контролирует синтез жгутиков, метилирование ДНК и ее репликацию, деление клетки (Рис. 10.8).

Контроль репликации ДНК осуществляется путем ее метилирования. CtrA активирует транскрипцию гена ccrM, кодирующего ДНК-метилтрансферазу, жизненно необходимую для роста C.

crescentus. Транскрипция этого гена происходит исключительно в фазе G2 клеточного цикла, а поскольку белок CcrM очень быстро деградируется протеазой Lon, то и присутствует в значимых количествах он только в период своего активного синтеза, т. е. в фазе G2. В результате вновь реплицированные хромосомы находятся в полуметилированном состоянии значительную часть клеточного цикла (фактически всю S ClpXP фазу). А поскольку для инициации репликации ДНК должна быть в DivJ DivK ?

CtrA полностью метилированном состоянии, DivL ?

новый раунд репликации ДНК у C.

CtrA~P crescentus, в отличие от E. coli, не может P1 P CckA ctrA начаться, пока не завершится + предыдущий.

CtrA также обеспечивает временной + + + контроль за экспрессией генов ccrM fla ftsZ ftsQA клеточного деления. С одной стороны, Cori CtrA-Box CtrA репрессирует транскрипцию ftsZ в подвижных клетках, а с другой – активирует транскрипцию ftsQA оперона Рис.10.8. Основные регуляторы клеточного цикла в клетках перед самым делением. Таким Caulobacter crescentus образом CtrA обеспечивает - 60 - последовательную транскрипцию сначала ftsZ, а затем ftsQA. Такая последовательность экспрессии соответствует предполагаемому порядку сборки машины клеточного деления (дивисомы) в центре делящейся клетки.

Но наиболее важным, пожалуй, в плане контроля клеточного цикла, является негативная регуляция при помощи CtrA сильного промотора PCori, расположенного внутри точки начала репликации хромосомы (Cori). Активность этого промотора абсолютно необходима для инициации репликации ДНК. Минимальный Cori содержит 5 CtrA-боксов (сайтов связывания CtrA), два из которых перекрываются с областью PCori. Каким-то образом CtrA блокирует транскрипцию с промотора PCori, а значит, и репликацию хромосомы, во всех клетках за исключением только что сбросивших жгутик и закрепившихся на субстрате (т.е. репрессия не срабатывает как раз в тех клетках, в которых и начинается репликация ДНК).

Возможность использовать всего один регуляторный белок для регуляции совершенно разных функций на протяжении клеточного цикла достигается за счет строгого временного и пространственного контроля активности CtrA. Как и большинство других регуляторов ответа, CtrA активен только в фосфорилированном состоянии. Но в таком состоянии этот белок присутствует только в подвижных клетках и непосредственно перед делением (в G2 фазе). Это достигается путем частично перекрывающихся механизмов, контролирующих CtrA на уровне экспрессии, стабильности и фосфорилирования.

Транскрипция ctrA происходит только перед делением, после инициации репликации хромосомы.

Транскрипция происходит с двух промоторов – слабого P1, активного только в ранних "предивизионных" клетках и сильного P2, включающегося позже. CtrA регулирует оба промотора, причем первый репрессирует, а второй активирует. Таким образом, по мере накопления фосфорилированного CtrA в ранней предивизионной клетке P1 отключается, а P2, наоборот, активируется, что дает высокую концентрацию CtrA к концу S фазы. Такой простой авторегуляторный механизм создает основу для обеспечения нужных концентраций CtrA в соответствующее время. От последовательного изменения концентраций CtrA зависит, в свою очередь, последовательность экспрессии контролируемых этим регулятором генов. Так, аффинность CtrA к жгутиковому промотору fliQ в 20 раз выше, чем к промотору ccrM, поэтому fliQ, так же как и другие зависящие от CtrA жгутиковые промоторы, транскрибируется в ранней предивизионной клетке, а ccrM активируется значительно позже, когда концентрация CtrA возрастает.

Для того, чтобы "перезапустить таймер" в новом клеточном цикле, достаточно просто вовремя удалить CtrA из клетки. И такое удаление действительно имеет место – CtrA протеолитически деградируется в поздней предивизионной клетке и во время прикрепления подвижной клетки к субстрату. Удаление активного CtrA до того, как клетка вступит в S-фазу, важно не только для авторегуляции CtrA, но и для активации промотора PCori и инициации репликации. Деградация CtrA происходит под действием АТФ-зависимой протеазы ClpXP. Причем, в отличие от E. coli, инактивация этой протеазы у Caulobacter является летальной – клетка оказывается "арестованной" в фазе G клеточного цикла. Однако каким образом "включается" и "выключается" протеолиз – пока неясно.

Активность CtrA регулируется сразу через несколько путей фосфорилирования. Как известно, регуляторы ответа (к числу каковых принадлежит и CtrA) активируются путем фосфорилирования сенсорными гистидинкиназами в ответ на сигналы внешней среды. Вновь синтезированный CtrA немедленно фосфорилируется, и как минимум три гистидинкиназы (DivJ, DivL и CckA) могут участвовать в этом процессе. К сожалению, сигналы, на которые реагируют эти киназы, неизвестны.

Однако известно, что две из этих киназ, DivJ и CckA, локализуются в различных частях клетки, что свидетельствует в пользу участия пространственной информации в контроле активации CtrA. Так, CckA, типичная мембранная сенсорная киназа, распределена равномерно на протяжении большей части клеточного цикла. Однако в ранней предивизионной клетке CckA концентрируется на полюсе клетки, противоположном стебельку и остается там до момента деления. Полярная локализация абсолютно необходима для проявления киназной активности CckA и фосфорилирования CtrA. DivJ концентрируется на противоположном (стебельковом) полюсе во время перехода от G1 к S фазе. Таким образом, очевидно, что активность CtrA контролируется, по крайней мере частично, различной природой противоположных полюсов клетки. Каждый вновь сформированный при делении полюс клетки сначала "жгутиковый", а затем становится "стебельковым". Полюса фактически "маркируются" в процессе развития различными киназами, от активности которых, в свою очередь, зависит активность - 61 - CtrA.

Литература:

1. Magne sters and Urs Jenal. Regulatory circuits in Caulobacter. Current Opinion in Microbiology 2000, 3:171– 2. Christine Jacobs and Lucy Shapiro. Microbial asymmetric cell division: localization of cell fate determinants.

Current Opinion in Genetics & Development 1998, 8:386–391 (less detail but better text overall) 3. J. Lutkenhaus. The regulation of bacterial cell division: a time and place for it. Current Opinion in Microbiology 1998, 1:210– 4. J. A. Hoch. Initiation of bacterial development. Current Opinion in Microbiology 1998, 1:170– 11. Споруляция у Bacillus subtilis.

Процесс споруляции у B. subtilis проходит через серию четко выраженных морфологических стадий, и его результатом является превращение растущей клетки в двухкамерный спорангий, в котором и формируется спора. Известно более 125 генов, участвующих в этом процессе. Их транскрипция контролируется во времени и пространстве четырьмя ДНК-связывающими белками и пятью сигма факторами, а сигнал для запуска всего процесса поступает от сенсорных систем и путем переноса фосфатной группы по сложной фосфотрансляционной сети оказывается на одном ключевом регуляторе ответа, который и запускает каскадную экспрессию громоздкого аппарата споруляции.

Морфология споруляции Последовательные морфологические стадии споруляции показаны на рисунке 11.1.

Начало споруляции обнаруживается по формированию т. н. аксиального филамента, в котором две хромосомы после последнего раунда репликации вытягиваются вдоль длинной оси клетки. Затем возле одного из полюсов клетки формируется перегородка (септа), что разделяет развивающийся спорангий на два компартмента, материнскую клетку (больший) и преспору. Каждый из этих компартментов получает по копии хромосомы. На последующих стадиях споруляции преспора обволакивается материнской клеткой и в конце концов оказывается полностью внутри ее (в связи с чем и называется эндоспорой).

На последующих стадиях преспора созревает в результате сложных биосинтетических и морфогенных процессов, протекающих в обоих компартментах. Через 6- часов созревание заканчивается, и зрелая спора освобождается путем лизиса материнской клетки.

Последовательность морфологических событий разделяется на стадии, которые обозначаются римскими цифрами 0-VII. Стадия 0 соответствует клеткам, еще не ставшим на путь споруляции, стадия I - начавшим споруляцию и сформировавшим аксиальный филамент, стадии II и III соответствуют спорангиям на стадиях полярного деления и обволакивания преспоры материнской клеткой и т.д.

Рис.11.1. Стадии споруляции Bacillus subtilis Похожая схема используется для обозначения генов и оперонов, необходимых для споруляции. Так, - 62 - мутации в генах spo0 и spoIII останавливают споруляцию на стадиях 0 и III соответственно. Латинские буквы различают гены одной стадии между собой (напр., spo0A и spo0B). В оперонах дополнительные латинские буквы используются для того, чтобы различать членов оперонов между собой (напр., spoIIAA, spoIIAB и spoIIAC).

Как принимается решение о начале споруляции?

Бактерии достаточно сложно принять решение о начале споруляции, поскольку этот процесс, будучи запущенным, уже необратим. А поскольку это решение коренным образом меняет метаболизм клетки, ошибка может иметь для нее печальные последствия. Поэтому для принятия этого решения бактерия должна проанализировать множество сигналов от внешней среды от внутриклеточных метаболических систем, от клеточного цикла. Сигналы могут происходить от нехватки питательных веществ, плотности популяции, синтеза ДНК, повреждений ДНК, цикла Кребса. Все эти сигналы интегрируются на уровне одного регуляторного белка (Spo0A). Сигналы передаются на Spo0A в виде его фосфорилирования через цепь переносчиков фосфата. Spo0A принадлежит к классу регуляторов ответа из семейства двухкомпонентных регуляторных систем, которые вам уже хорошо знакомы. И той информации, ктотрой вы уже обладаете, наверное, достаточно, чтробы сделать вывод о том, что в данном случае сложно будет обойтись простой двукомпонентной системой. И действительно, основу регуляторной системы споруляции составляет сложная разветвленная фосфотрансляционная сеть. В качестве источника сигнала могут выступать несколько сенсорных белков (гистидинкиназ), сигнал от которых (фосфат) поступает на ключевой регулятор через несколько переносчиков. Такая сложная система создает много точек, в которых можно осуществлять контроль передачи сигнала, что позволяет тесно координировать многие клеточные события. Поэтому практически каждая стадия передачи сигнала по фосфотрансляционной сети в той или иной степени подвержена регуляции.

Фосфат в сигнальную фосфотрансляционную систему поступает от двух сенсорных киназ, цитоплазматической KinA и мембранной KinB, а в качестве получателей этого фосфата выступают два РО. Первый из них, Spo0F непосредственнно фосфорилируется киназами, тогда как фосфат на второй РО, Spo0A, попадает от Spo0F через переносчик Spo0B. Spo0A~Ф является транскрипционным фактором и выступает в роли репрессора либо активатора по отношению к тем генам, чьи функции являются критическими при переключении клетки с вегетативного роста на споруляцию. Один из таких генов кодирует репрессор AbrB, который предотвращает экспрессию ряда генов, необходимых при переключении на споруляцию. Накопление Spo0A~Ф в клетке снижает уровень AbrB и активирует ранние гены споруляции. Кроме того, Spo0A~Ф является непосредственным активатором генов и оперонов, таких как spoIIA и spoIIG, кодирующих сигма факторы F и Е, ответственные за локальную экспрессию генов споруляции соответственно в преспоре и материнской клетке.

Первый уровень контроля осуществляется, естественно, на уровне киназ. К сожалению, эффекторные молекулы, активирующие эти киназы, пока не известны, однако описан ингибитор киназной активности белка KinA.

Активность этого ингибитора, KipI, контролируется анти ингибитором KipA, ген Рис.11.1. Контроль инициации споруляции у Bacillus subtilis которого находится в одном опероне с kipI.

- 63 - Этот оперон реагирует на доступность глюкозы и фиксированного азота, что позволяет запускать процесс споруляции при голодании по этим компонентам питания.

Следующий уровень контроля осуществляют аспартил-фосфат фосфатазы, которые удаляют фосфат с молекул РО фосфотрансляционной цепи. Первой была обнаружена фосфатаза Spo0E, действующая непосредственно на Spo0A~Ф. К сожалению, до сих пор очень мало информации о том, как регулируется активность или синтез самой Spo0E. Несколько больше известно о фосфатазах, действующих на более ранних этапах сигнального пути. Фосфатазы RapA и RapB действуют на Spo0F~Ф. А поскольку все реакции по пути от Spo0F~Ф к Spo0A~Ф являются обратимыми, дефосфорилирование Spo0F ведет к быстрому дефосфорилированию и Spo0A.

RapA и RapB регулируются на уровне транскрипции физиологическими процессами, которые составляют альтернативу споруляции. RapA находится под контролем сигнальной системы ComP/ComA, ответственной за индукцию состояния компетентности к поглощению ДНК (физиологическое состояние, несовместимое со споруляцией). А RapB индуцируется условиями, способствующими вегетативному росту клетки, что позволяет при инициации деления или других клеточных процессов, несовместимых со споруляцией, предотвращать это переключение метаболизма путем специфического дефосфорилирования одного компонента фосфотрансляционной цепи.

Еще одна ступень контроля – регуляция регуляторов Spo0A (который тоже является регулятором).

Здесь одним из регуляторов является система контроля плотности бактериальной популяции, зависящая от пептидного феромона – продукта гена phrA. Ген этот находится в одном опероне с RapA, а его продуктом является небольшой (всего из 44 АК) белок. На амино-конце белка располагается типичная сигнальная последовательность, и белок действительно секретируется из клетки по SecA-зависимому пути. После отрезания сигнального пептида от белка остается всего 19 АК. Оказалось, что этот пептид, а точнее, только пять карбокси-концевых АК, ингибирует фосфатазную активность RapA. Для этого ингибирования необходима активная система транспорта олигопептидов в клетку Opp, компоненты которой и отрезают необходимые 5 АК с карбокси-конца 19АК пептида и транспортируют их в клетку.

Такая достаточно громоздкая система может выполнять несколько функций. Во-первых, синтез, секреция и реимпорт PhrA пептида требует времени, поэтому эта система задерживает споруляцию, когда все для нее уже готово. Во-вторых, вся эта система очень напоминает способ межклеточных коммуникаций при помощи низкомолекулярных молекул-феромонов. Поэтому еще одной возможной функцией PhrA может быть детекция плотности бактериальной популяции, во всяком случае, при высокой плотности задержка будет явно меньше.

Роль активаторов транскрипции на разных стадиях споруляции Будучи активированным путем фосфорилирования, Spo0A индуцирует транскрипцию как минимум семи генов, управляющих вступлением бактерии на путь споруляции и превращением вегетативной клетки в двухкомпатрментный спорангий. Spo0A~P активирует транскрипцию, связываясь с промоторами соответствующих генов и оперонов, контактируя с РНK-полимеразой, имеющей в своем составе основной сигма фактор A или альтернативный H. H обеспечивает транскрипцию неизвестного пока гена (или генов), контролирующего полярное деление.

После разделения клетки на две части в каждом из образовавшихся компартментов происходит активация компартмент специфического сигма-фактора - F в преспоре и E в материнской клетке. F синтезируется задолго до полярного деления, и то, что его Рис.11.2. Активация F в преспоре активность проявляется только в преспоровом компартменте, определяется регуляцией на - 64 - уровне активности белка. Эта регуляция осуществляется тремя белками, SpoIIE, SpoIIAB и SpoIIAA. Как и F, эти белки синтезируются в исходной клетке еще до ее полярного деления. SpoIIAB является анти сигма фактором, который связывается с F и ингибирует транскрипцию с его участием.

SpoIIAA - анти-анти сигма фактор, который противодействует эффекту SpoIIAB, связываясь с комплексом SpoIIAB.F и вызывая освобождение активного F. SpoIIAB является также киназой, фосфорилирующей SpoIIAA, предотвращая его связывание с собой. Таким образом, до образования септы F находится в комплексе с SpoIIAB, то есть Рис.11.3. Активация E и K в материнской клетке является инактивированным, а SpoIIAA фосфорилирован и поэтому не может освободить F. После образования перегородки в действие вступает еще один фермент, SpoIIE, являющийся фосфатазой, специфически дефосфорилирующей SpoIIAA~P. SpoIIE является интегральным мембранным белком, локализованным в перегородке между двумя компартментами.

Белок приблизительно одинаково экспонируется в обе стороны от перегородки, в связи с чем можно ожидать, что дефосфорилирование SpoIIAA~P будет идти с одинаковой скоростью в обоих компартментах. Но поскольку объем преспоры в 5-7 раз меньше объема материнской клетки, концентрация дефосфорилированого SpoIIAA в преспоре будет в несколько раз выше, следовательно, в этом компартменте F будет активирован раньше (Рис. 11.2).

Вскоре после активации F в преспоровом компартменте происходит активация другого сигма фактора, Е, но теперь уже в материнской клетке (Рис. 11.3а). Так же, как и F, Е присутствует в обоих компартментах спорангия. Этот сигма-фактор необычен тем, что синтезируется в форме неактивного предшественника, пре-Е. Синтез пре-Е начинается до полярного деления путем индукции транскрипции оперона spoIIG уже знакомым вам активатором транскрипции Spo0A~P. Собственно пре-Е кодируется вторым геном оперона, spoIIGB, а первый ген, spoIIGA, необходим для процессинга пре-Е в зрелый белок. Продукт еще одного гена, spoIIR, необходим для процессинга пре-Е, и транскрипция этого гена зависит от F. Таким образом, появление Е в материнской клетке привязано к отделению преспоры перегородкой, поскольку транскрипция зависимых от F генов происходит только в преспоровом компартменте. (SpoIIR должен активировать Е и в преспоре, но здесь Е по неизвестной причине очень быстро деградирует.) Что же контролируют два новых сигма-фактора? В Е регулон входят гены, разрушающие пептидогликан септы, отделяющей преспору от материнской клетки, а гены, контролируемые F, отвечают за обволакивание преспоры материнской клеткой. К моменту окончания поглощения преспоры материнской клеткой в преспоре начинается транскрипция нового гена, spoIIIG, кодирующего еще один сигма-фактор, G. Этот сигма-фактор активирует транскрипцию поздних генов преспоры, необходимых для завершения процесса Рис.11.4. Последовательная споруляции. Промотор, с которого считывается G, опознается активация сигма-факторов при ранним преспоровым сигма-фактором F, но для его активации споруляции необходим неизвестный пока фактор, транскрибируемый с Е промотора материнской клетки.

- 65 - (SpoVT и самые поздние преспоровые гены) Экспрессия поздних генов в материнской клетке находится под контролем сигма-фактора K (Рис.

11.3b). Как и ранний сигма-фактор материнской клетки, Е, K синтезируется в виде неактивного предшественника пре-K, который превращается в активную форму после протеолитического отщепления амино-концевой последовательности из 20 АК остатков. Протеолитическое расщепление пре-K осуществляется одним из членов Е регулона, SpoIVFA, для активации которого необходим продукт гена spoIVB, транскрибируемого с G промотора в преспоровом компартменте.

Экспрессия двух сигма-факторов в материнской клетке запускает последовательную цепь регуляторных событий, ведущую к поочередной активации и инактивации комплекса генов, результатом работы которого является синтез споровых покровов, кортекса и внешней оболочки споры (Рис 11.4).

1. R. Losick 2. M. Perego. Kinase-phosphatase competition regulates Bacillus subtilis development. Trends in Microbiology. 1998. 6:366- Хороший обзор начальных стадий регуляции споруляции с упором на роль фосфотрансляционной системы.

12. Межклеточные коммуникации. Quorum sensing Дабы преуспеть, бактерии должны быть приспособлены к выживанию и существованию в сложных микробных сообществах. Взаимодействия между микроорганизмами в таких сообществах, равно как и между патогенными микроорганизмами и их хозяевами зависят от экспрессии специфических генов, участвующих в этих взаимодействиях. Не удивительно, что бактерии выработали механизмы детекции конкурентов и растительных либо животных хозяев и системы "быстрого реагирования" на подобные контакты. Во многих случаях экспрессия определенного набора генов будет зависеть от достижения бактериальной популяцией определенной плотности. Например, путем задержки экспрессии факторов вирулентности до тех пор, пока не будет достигнута высокая плотность популяции, патогены растений могут избегать защитной реакции своих хозяев.

У животных и растений проникающие через мембрану сигнальные молекулы, такие как стероидные и брассиностероидные гормоны, метилжасминат и др., являются хорошо изученными регуляторами развития, дифференциации клеток и метаболизма в целом. В последние годы у бактерий тоже были обнаружены сигнальные молекулы такого рода - ацилированные производные гомосеринлактона (АГСЛ), участвующие в межклеточной коммуникации. Бактерии используют эти молекулы прежде всего для того, чтобы следить за плотностью своей популяции. Этот феномен получил название "Quorum sensing" (чувство кворума). Каждая клетка в популяции продуцирует низкий базальный уровень свободно диффундирующего АГСЛ за счет активности специфического фермента, АГСЛ синтетазы, как правило, члена LuxI-семейства белков. С возрастанием плотности бактериальной популяции концентрация АГСЛ также возрастает. При достаточно высокой плотности, т.е. по достижении кворума, накопленный АГСЛ взаимодействует с рецепторным белком, обычно с членом LuxR-семейства белков-регуляторов транскрипции, которые изменяют уровень экспрессии АГСЛ зависимых генов. У различных бактерий принцип действия АГСЛ-зависимой регуляции сохраняется, хотя набор регулируемых генов может быть совершенно разным. Первой (в 1970 г.) была описана АГСЛ-сенсорная система морской бактерии Vibrio fisheri, где "чувство кворума" регулирует экспрессию генов биолюминесценции (lux). У других бактерий тот же механизм регулирует экспрессию генов вирулентности (Pseudomonas aeruginosa, Erwinia carotovora), конъюгационного переноса Т-ДНК (Agrobacterium tumefaciens), подвижность (Serratia liquefaciens), продукцию антибиотиков (Erwinia carotovora) и др (Рис. 12.1).

Когда бактерии Vibrio fisheri колонизируют специальные органы некоторых видов рыб и кальмаров, они начинают светиться в результате активации lux-оперона, кодирующего фермент - - 66 - Рис.12.1 Автоиндукторы грамотрицательных бактерий люциферазу, непосредственно производящий свечение, и ряд ферментов, определяющих синтез субстрата для люциферазы - алифатического альдегида, энергия окисления которого и расходуется на свечение. Продукт гена luxI кодирует синтез АГСЛ, в данном случае N-(3-оксогексаноил)-L гомосеринлактона. Это вещество способно свободно диффундировать во внешнюю среду через бактериальные мембраны. Во время периода несимбиотической жизни Vibrio fisheri в морской воде АГСЛ в результате такой диффузии не накапливается в клетке и бактерия не тратит энергию на свечение. С другой стороны, при быстром росте в богатой среде световых органов хозяина, где плотность клеток бактерий достигает 1010 на миллилитр, АГСЛ накапливается в бактериальных клетках, приводя к индукции люциферазного оперона.

Самой по себе аккумуляции АГСЛ в клетке недостаточно для активации экспрессии люциферазных генов. Еще один ген, luxR, кодирует транскрипционный активатор, который взаимодействует с АГСЛ. Этот белок имеет два четко выраженных домена. Карбокси-концевой содержит HTH мотив, отвечающий за связывание белка с ДНК в специфических симметричных участках, называемых lux-боксами. Эти короткие (20 н.п.) последовательности были идентифицированы в промоторных областях многих генов, регулируемых АГСЛ. Амино-концевой домен LuxR взаимодействует с АГСЛ. Предполагается, что в отсутствие АГСЛ C-концевой ДНК-связывающий домен экранируется N-концевым доменом, что предотвращает связывание с ДНК. Связывание АГСЛ N концевым доменом вызывает конформационное изменение, позволяющее амино-концевому домену LuxR связаться с lux-боксами и активировать транскрипцию.

Интересно, что не все LuxR-подобные белки являются активаторами транскрипции. Белки EsaR и ExpR, продуцируемые растительными патогенами Pantoea stewartii и Erwinia carotovora, являются репрессорами. Для этих белков связывание АГСЛ снижает их аффинность к lux-боксам. Тогда как большинство LuxR-подобных активаторов связывается с lux-боксами, перекрывающимися с - областью промотора, EsaR связывается в области -10, что, естественно, предотвратит инициацию транскрипции.

Синтез АГСЛ.

АГСЛ имеют общую структуру алифатической цепочки различной длины, присоединенной через амидную связь к лактонизированному остатку гомосерина.

- 67 - Рис.12.2. Ситез АГСЛ и механизм его действия LuxI катализирует связывание S-аденозилметионина (SAM) с жирнокислотной цепочкой, синтезированной при участии ацил-ацил переносящего белка (ACP). Последующая за образованием амидной связи лактонизация S-аденозилметионина приводит к образованию кольца, освобождению АГСЛ и образованию побочного продукта - 5-метилтиоаденозина (MTA).

Регуляция синтеза экзоферментов у Erwinia Фитопатогенные бактерии Erwinia carotovora продуцируют довольно широкий спектр гидролитических ферментов, деградирующих клеточные стенки растений. К таким ферментам относятся пектатлиазы, целлюлазы, полигалактуроназы и протеазы.

Развитие этого патогена в растениях ведет к индукции этих ферментов, результатом чего является мацерация растительных тканей и развитие симптомов мягкой гнили. Продукция внеклеточных ферментов зависит от накопления N-3-оксогексаноил-L-гомосерин лактона, синтез которого детерминируется гомологами LuxI, которые у разных штаммов называются ExpI, CarI и HslI. Рядом с геном expI находится expR - гомолог luxR. Мутанты по гену expI имеют Рис.12.3. Регуляция синтеза факторов сниженную, а по гену expR - повышенную вирулентности Erwinia посредством АГСЛ продукцию экзоферментов.

- 68 - Кроме того, некоторые штаммы Erwinia carotovora продуцируют -лактамные антибиотики широкого спектра действия - карбапенемы. Синтез карбапенемов координирован с экспрессией экзоферментов и может служить для ингибирования других бактерий при конкуренции за питательные вещества, высвобождающиеся при мацерации растительных тканей. Синтез карбапенемов контролируется парой белков CarR и CarI, гомологичных, но не идентичных по своим функциям ExpR и ExpI. CarR и ExpR не взаимозаменяемы, но АГСЛ, продуцируемый CarI, идентичен таковому ExpI.

Продукция экзоферментов у Erwinia контролируется дополнительно еще несколькими регуляторными системами.

Роль АГСЛ-сигналов в экологии бактериальных популяций. Кросс-сигналы (и ингибирование антибиотиками).

Рассмотренный нами только что способ коммуникаций между бактериальными клетками за счет секретируемых небольших молекул-феромонов достаточно широко распространен в природе, но далеко не всегда молекулярные механизмы, лежащие в его основе, аналогичны только что описанным.

Например, грамположительные бактерии вместо АГСЛ используют короткие пептиды в качестве феромонов. Будучи пептидами, эти молекулы не могут свободно проникать через мембраны и поэтому активно секретируются из бактериальной клетки, используя мембранные транспортеры ABC-класса.

Пептидные сигналы, естественно, не могут также проникнуть и внутрь клетки-мишени, а посему распознаются снаружи типичной сенсор-киназой, передающей сигнал (в виде фосфогруппы) внутриклеточным регуляторам. Таким образом регулируются компетентность и споруляция у Bacillus subtilis, вирулентность у Staphylococcus aureus, конъюгация у Enterococcus faecalis и продукция микроцина у Lactobacillus sake.

Литература:

1. C. Fuqua, M.R. Parsek and E.P. Greenberg. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing. Annu. Rev. Genet. 2001. 35:439– 13. Секреция белков Около 20% всех белков, продуцируемых бактериями, локализованы вне цитоплазмы.

Секреция белков за пределы цитоплазмы является важнейшей способностью вирулентных бактерий, поскольку большинство стадий процесса инфекции представляет собой ту или иную форму взаимодействия с внешней средой, и многие белковые продукты должны либо располагаться на внешней поверхности бактерии либо секретироваться во внешнюю среду. Кроме того, секреция белков имеет важнейшее значение для биотехнологии, поскольку очистка белков из культуральной среды простого состава значительно проще, чем из клеточных лизатов, являющихся сложной смесью большого числа различных веществ. В связи с таким значением секреции этот процесс интенсивно изучается. Одним из непредвиденных результатов такого изучения стало обнаружение нескольких путей экспорта белков. Анализ родственных связей между белками, входящими в состав различных систем секреции у разных организмов позволил разбить эти системы на несколько групп, внутри которых механизм секреции идентичен или очень схож. Сейчас выделяют пять основных типа секреции, которые мы по очереди и разберем. Интересно, что компоненты секреции трех из пяти типов секреторных систем имеют значительное сходство с белками, участвующими в сборке жгутиков и ворсинок (пилей).

К сожалению, иногда в литературе по секреции не очень четко используются термины, в связи с чем не всегда понятно, о каком типе транспорта через мембраны идет речь. Поэтому здесь мы будем пользоваться следующими терминами для дифференциации основных секреторных путей по месту назначения транспортируемого белка:

• секреция – транспорт белка в окружающую среду. В случае грамотрицательных бактерий для этого белку необходимо преодолеть две мембраны – цитоплазматическую и внешнюю.

- 69 - • экспорт - выведение белка за пределы цитоплазмы. Термин используется исключительно для грамотрицательных бактерий. Результатом экспорта является транспорт белка в периплазматическое пространство.

• транслокация – доставка белка патогенными бактериями в эукариотическую клетку хозяина. В случае грамотрицательных бактерий этот тип транспорта требует преодоления уже трех мембранных барьеров – двух бактериальных и одного эукариотического.

Важной проблемой секреции является направление секретируемого белка к месту его назначения.

Секретируемые белки могут оказываться в различных местах:

• быть полностью встроенными в цитоплазматическую мембрану (интегральные мембранные белки, каковыми является большинство мембранных транспортеров);

Pages:     | 1 || 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.