WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

Е.А. Николайчик РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА курс лекций Минск 2002 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ. РЕГУЛЯЦИЯ НА УРОВНЕ ТРАНСКРИПЦИИ

................................................ 1 1.1 ОПЕРОННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ...................................................................................... 2 lac оперон....................................................................................................................................................................... 2 1.2 КАК РАБОТАЮТ РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ?.............................................................................................................. 3 Связывание регуляторных белков с ДНК.......................................................................................................... 3 1.3 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ С РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ........................................................... 4 1.4 АРАБИНОЗНЫЙ ОПЕРОН............................................................................................................................................. 1.5 ТРИПТОФАНОВЫЙ ОПЕРОН....................................................................................................................................... Аттенуация.................................................................................................................................................................. 1.6 РЕГУЛЯЦИЯ НА СТАДИИ ТЕРМИНАЦИИ. АНТИТЕРМИНАЦИЯ.......................................................................... 2. ФОСФОТРАНСФЕРАЗНАЯ СИСТЕМА.......................................................................... Катаболитная репрессия...................................................................................................................................... bgl оперон – ФТС и антитерминация.............................................................................................................. 3. АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ СИГМА-ФАКТОРЫ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ.................................. -факторы бактериофагов. Каскадная регуляция экспрессии генов................................................ rpoS................................................................................................................................................................................. rpoE................................................................................................................................................................................ 4. ТЕПЛОВОЙ ШОК, ФОЛДИНГ И ДЕГРАДАЦИЯ БЕЛКОВ............................................ Молекулярные шапероны....................................................................................................................................... АТФ-зависимые протеазы.................................................................................................................................... 5. ХОЛОДОВОЙ ШОК......................................................................................................... 6. СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ............................................................................................... ДВУХКОМПОНЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ................................................................................................................................ СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ГИСТИДИНОВЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ.................................................................................. Каталитическое киназное ядро......................................................................................................................... HPt-домены................................................................................................................................................................. Сенсорный домен...................................................................................................................................................... Линкерный домен...................................................................................................................................................... СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ РЕГУЛЯТОРОВ ОТВЕТА...................................................................................................... Активности и структура..................................................................................................................................... Регуляторный домен............................................................................................................................................... Эффекторный домен.............................................................................................................................................. АКТИВАЦИЯ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕМ......................................................................................................................... АРХИТЕКТУРА РЕГУЛЯТОРНЫХ СИСТЕМ.................................................................................................................... Фосфотрансляционные системы...................................................................................................................... РЕГУЛЯТОРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ....................................................................................................................................... Регуляция активности ГК.................................................................................................................................... Регуляция дефосфорилирования РО................................................................................................................. Другие способы регуляции..................................................................................................................................... 7. ХЕМОТАКСИС................................................................................................................ 7.1 УСТРОЙСТВО И ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ ДВИГАТЕЛЬНОГО АППАРАТА БАКТЕРИЙ....................................... Регуляция синтеза жгутикового аппарата.................................................................................................. 7.2 ЧТО ТАКОЕ ХЕМОТАКСИС И КАК ОН РЕАЛИЗОВАН У БАКТЕРИЙ?................................................................ 7.3 БЕЛКОВЫЙ АППАРАТ ХЕМОТАКСИСА.................................................................................................................. - II - Рецепторы хемотаксиса....................................................................................................................................... Как внеклеточный стимул транслируется во внутриклеточный сигнал?...................................... Цитоплазматические сигнальные белки и регуляторный механизм хемотаксиса...................... Метилазы хемотаксиса и сенсорная адаптация........................................................................................ 8. УТИЛИЗАЦИЯ АЗОТА.................................................................................................... 9. КИСЛОРОДНЫЙ СТРЕСС И РЕДОКС КОНТРОЛЬ...................................................... АКТИВНЫЕ РАДИКАЛЫ: ИХ ПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ И МЕХАНИЗМ ИНАКТИВАЦИИ............................ Причина окислительного стресса..................................................................................................................... Механизмы окислительных повреждений клетки...................................................................................... ЗАЩИТА ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА.................................................................................................................. SoxRS регулон............................................................................................................................................................. OxyR регулон............................................................................................................................................................... АДАПТАЦИЯ К АНАЭРОБИОЗУ....................................................................................................................................... FNR как сенсор кислорода.................................................................................................................................... ArcB................................................................................................................................................................................ 10. ДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ.................................... РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА У CAULOBACTER CRESCENTUS......................................................................... 11. СПОРУЛЯЦИЯ У BACILLUS SUBTILIS......................................................................... Морфология споруляции........................................................................................................................................ Как принимается решение о начале споруляции?....................................................................................... Роль активаторов транскрипции на разных стадиях споруляции...................................................... 12. МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ КОММУНИКАЦИИ. QUORUM SENSING..................................... Синтез АГСЛ............................................................................................................................................................. Регуляция синтеза экзоферментов у Erwinia............................................................................................... Роль АГСЛ-сигналов в экологии бактериальных популяций. Кросс-сигналы (и ингибирование антибиотиками).................................................................................................................................................................. 13. СЕКРЕЦИЯ БЕЛКОВ..................................................................................................... СЕКРЕТОРНЫЙ АППАРАТ ПЕРВОГО ТИПА.................................................................................................................. СЕКРЕТОРНЫЙ АППАРАТ ВТОРОГО ТИПА (GSP)..................................................................................................... Sec система................................................................................................................................................................ Основная терминальная ветвь GSP................................................................................................................. Регуляция GSP............................................................................................................................................................ СЕКРЕТОРНЫЙ АППАРАТ III ТИПА............................................................................................................................... 1.1.Специфика аппарата секреции III типа и его компоненты.......................................................... 1.2. Субстраты аппарата секреции III типа.............................................................................................. 1.3. Организация и регуляция генов, кодирующих белки аппарата секреции III типа................. Секреторные шапероны........................................................................................................................................ СЕКРЕТОРНЫЙ АППАРАТ IV ТИПА............................................................................................................................... 14. СТРОГИЙ ОТВЕТ.......................................................................................................... 15. SOS ОТВЕТ..................................................................................................................... SOS-мутагенез........................................................................................................................................................... 16. РЕГУЛЯЦИЯ СТАБИЛЬНОСТИ МРНК........................................................................ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ РНКАЗЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ДЕГРАДАЦИИ МРНК................................................................ РНКаза Е...................................................................................................................................................................... РНКаза III.................................................................................................................................................................... - III - Полинуклеотидфосфорилаза............................................................................................................................... РНКаза II..................................................................................................................................................................... Мультибелковые комплексы деградации РНК............................................................................................. РНК-хеликазы в деградации РНК...................................................................................................................... Полиаденилирование оказывает противоположный эффект на стабильность бактериальных и эукариотических мРНК................................................................................................................ - IV - 1. Основные принципы регуляции экспрессии генетической информации.

Регуляция на уровне транскрипции Несмотря на кажущуюся простоту организации, клеткам прокариот необходимо иметь не менее, а, скорее, более сложные, чем у многих эукариот, системы контроля основных жизненных функций. И это не удивительно, если принять во внимание тот факт, что каждая клетка бактерий является полноценным организмом, полностью самодостаточным, тогда как клетки большинства многоклеточных организмов входят в состав специализированных тканей и, следовательно, выполняют только какую-то часть жизненно важных для организма функций.

Клетки микроорганизмов находятся в непосредственном контакте с окружающей средой, зачастую на наш взгляд весьма далекой от оптимальной для поддержания жизни. Условия среды не являются постоянными, следовательно, бактерии должны обладать способностью либо быть всегда готовыми ко всем подстерегающим их неожиданностям, либо “подстраиваться” к изменяющимся условиям. Иными словами, принципиально возможны две стратегии существования в изменяющихся условиях. Первая - постоянно быть во всеоружии, держа наготове все функции, которые когда-либо могут пригодиться. В таком случае значительная часть ресурсов организма большую часть времени будет расходоваться впустую на поддержание функций, не нужных в настоящий момент. Вторая стратегия - “включать” определенные функции только тогда, когда они необходимы. Как вы уже, наверное, знаете, именно такой подход используется живыми организмами в большинстве случаев. Такая стратегия, на первый взгляд, должна приводить к значительной экономии ресурсов организма. Однако при таком подходе возникает необходимость в системах детекции сигналов и регуляции метаболизма, обеспечивающих максимально быстрое “включение” соответствующих метаболических путей в ответ на изменение условий среды и их “отключение”, как только в соответствующих функциях отпадет необходимость.

Если такие системы были бы слишком сложными, организм должен был бы слишком много ресурсов расходовать на поддержание соответствующего генетического аппарата, экспрессию необходимых регуляторных белков и т.д., что свело бы на нет всю экономию.

Как видите, жизнь простых организмов не так уж и проста, и этот курс лекций как раз и пытается показать, как микроорганизмы решают свою основную проблему - регуляцию метаболизма в меняющихся условиях среды.

Поскольку основную функциональную нагрузку при взаимодействии любого организма с внешней средой несут белки (либо непосредственно, либо посредством своих ферментативных активностей), а информация о структуре и количестве белков кодируется генетическим аппаратом клетки, возможности для регуляции имеются на всем пути экспрессии кодируемой организмом информации.

Иными словами, регуляция возможна как на пути от ДНК к РНК (при транскрипции), так и от РНК к белку (при трансляции). В обоих случаях экономия ресурсов организма достигается за счет выключения очень энергоемких процессов биосинтеза макромолекул - белка либо РНК (и, следовательно, белка).

Кроме того, возможна также регуляция на уровне белков (как правило, аллостерических ферментов, меняющих свою активность при взаимодействии с низкомолекулярными веществами, напр., конечными продуктами какого-то биосинтетического пути). Здесь происходит экономия энергии при ингибировании энергоемких ферментативных реакций.

схема: уровни регуляции (действительно нужен простой рисунок):

I- дотранскрипционный (метилирование ДНК) - cell cycle;

спирализация хроматина у эукариот II – транскрипционный:

а) инициация (промоторы+регуляторные белки) б) терминация (аттенуация и антитерминация) III – посттранскрипционный:

а) стабильность мРНК (rpoS) б) инициация трансляции (cold shock) IV – посттрансляционный: регуляция метаболизма посредством белок-белковых взаимодействий и модификации белков;

аллостерическая регуляция (хемотаксис) - 1 - A priori можно предположить, что именно регуляция на стадии инициации транскрипции будет наиболее эффективной – регуляция на начальных этапах длинного пути экспрессии генетической информации явно приведет к наибольшей экономии ресурсов клетки. Наверное, именно поэтому транскрипционная регуляция является на настоящий момент наиболее изученной (хотя, скорее всего, этот уровень регуляции действительно наиболее часто используется клеткой). С нее мы и начнем.

1.1 Оперонная организация бактериальных генов Исторически сложилось так, что первые работы по регуляции метаболизма были сделаны при изучении утилизации лактозы бактериями Escherichia coli. Для описания лактозного метаболизма Жакоб и Моно в 1961 г. ввели термин "оперон". Оперон, как вы помните, представляет собой группу из двух или более структурных генов (иногда говорят и о моноцистронных, т.е. содержащих один ген, оперонах), кодирующих тесно связанные между собой функционально белки, совместно транскрибируемых и находящихся под общим контролем. Такой контроль осуществляется продуктом регуляторного гена, действие которого осуществляется через оператор находящийся в непосредственной близости к промотору. Как промотор, так и оператор являются короткими (пару десятков нуклеотидов) последовательностями ДНК, предшествующими контролируемым структурным генам.

Рассмотрим структуру абстрактного оперона подробнее. Он состоит из следующих элементов:

1. Промотор - участок ДНК, с которым происходит связывание РНК-полимеразы и который определяет точку начала транскрипции. Типичный пример - TTGACA - 17 bp - TATAAT. В зависимости от типа промотора (а точнее, от типа распознающей его сигма - субъединицы РНК полимеразы) конкретная последовательность промотора варьирует.

2. Operator - участок связывания регуляторного белка. Размер - около 20 bp. Располагается в непосредственной близости к промотору или же перекрывается с ним. В случае негативных регуляторов, или репрессоров, оператор, как правило, располагается непосредственно за промотором, или перекрывается с ним. В случае позитивных регуляторов (активаторов) оператор обычно располагается перед промотором. В любом случае связывание регуляторного белка с оператором меняет частоту инициации транскрипции. У многих (возможно, у большинства) оперонов имеется не один, а несколько сайтов связывания с регуляторными белками, которые не обязательно располагаются рядом и могут вообще находиться по разные стороны от промотора. В этих случаях термин "оператор" в классическом смысле становится неудобным, в связи с чем сейчас чаще просто говорят о сайтах связывания регуляторов.

3. Структурные гены. Кодируют белки, непосредственно производящие фенотипический эффект.

Именно для контроля их экспрессии, собственно, и существуют оперонные структуры вместе со своими регуляторами.

4. Терминатор транскрипции. Здесь заканчивается синтез мРНК.

Не входит в оперон, но является необходимой частью регуляторной системы ген-регулятор, кодирующий регуляторный белок, связывающийся с оператором. Ген-регулятор может находиться рядом с контролируемым им опероном, но часто располагается совсем в другом участке хромосомы.

Почти всегда у гена-регулятора свой промотор и терминатор.

В регуляции участвуют, как правило, и низкомолекулярные вещества-эффекторы, являющиеся либо индукторами, либо корепрессорами структурных генов.

В зависимости от влияния на их работу низкомолекулярных молекул-эффекторов различают индуцибельные и репрессибельные (-руемые) опероны. В зависимости от эффекта связывания регуляторного белка с оператором опероны могут иметь негативный или позитивный контроль. Т. о., можно выделить четыре типа оперонов:

(ТИПЫ ОПЕРОНОВ) (принципы работы в каждом случае) lac оперон lacZ - гидролиз до глю и гала lacY - галактозидпермеаза - 2 - lacA - галактозидтрансацетилаза без лактозы - следовые колич трех белков с лактозой к-во стр белков увеличивается в 1000 раз.

ген-регулятор лактозного оперона - lacI, - кодирует белок-репрессор. В активной форме это тетрамер. Клетки с инактивацией lacI конститутивны по синтезу всех трех ферментов.

Если в клетке появляется индуктор, он конкурирует с оператором за молекулы репрессора.

Связывание индуктора с репрессором освобождает оператор и позволяет РНК-полимеразе начать транскрипцию. В качестве индуктора может выступать лактоза (вернее, аллолактоза) и еще несколько сахаров и их неметаболизируемых аналогов. Даже в отсутствие индуктора базовая активность галактозидпермеазы достаточна, чтобы обеспечить транспорт индуктора в клетку.

Однако одно только снятие репрессии недостаточно для обеспечения наблюдаемого тысячекратного увеличения транскрипции генов оперона. Как оказалось, lac-оперон находится также и под влиянием позитивной регуляции. Непосредственно перед промотором lac-оперона располагается сайт связывания с активаторным белком CAP (Catabolite Activator Protein, CRP) или БАК (БРЦ).

Связывание этого белка со своим оператором приводит к усилению транскрипции оперона. CAP является апоиндуктором, и для связывания с ДНК должен образовать комплекс с цАМФ. Комплекс CAP-cAMP играет роль в явлении, называемом катаболитной репрессией или глюкозным эффектом.

Суть этого явления, которое мы будем более детально рассматривать позднее, заключается в том, что в присутствии глюкозы утилизация целого ряда источников углерода (в т.ч. и лактозы) ингибируется.

Причиной этого является снижение концентрации цАМФ, и следовательно, комплекса CAP-cAMP, активирующего транскрипцию.

Диауксия 1.2 Как работают регуляторные белки?

Связывание регуляторных белков с ДНК Чтобы понять действие регуляторного механизма, необходимо знать, как происходит взаимодействие белка-регулятора с оператором.

Вспомните структуру ДНК.

- большой и малый желобки - Атомы, лежащие вдоль краев пар оснований "смотрят" в эти желобки. Каждой паре оснований соответствует свой набор химических групп, который может узнавать белок. (это не те группы, которые участвуют в комплементарном спаривании оснований). Все ДНК-связывающие белки имеют выступы, встраивающиеся в большой (как правило) желобок и "читающие" последовательность оснований ДНК.

1. Оператор. Все о. почти симметричны (палиндромы). Разные сайты, взаимодействующие с одним и тем же белком, сходны, но не идентичны. Различия в последовательности обеспечивают различное сродство белков к различным операторным сайтам.

2. Репрессор. Репрессор обязан иметь ДНК-связывающий домен. В одном из наиболее распространенных случаев его основу составляют две -спирали, расположенные под углом друг к другу т.о., что одна из спиралей ложится в большую бороздку ДНК. Кроме того, часть белков имеет на N-конце гибкую "руку", охватывающую молекулу ДНК со стороны, противоположной узнающей спирали. Т.о., белок может прочно связаться с ДНК только в том случае, если имеется соответствие между боковыми цепями АК узнающей альфа-спирали и функциональными группами ДНК, экспонированными в большой желобок. Очень часто ДНК-связывающие белки имеют второй домен, отвечающий за димеризацию белка. При наличии таких доменов сила связывания репрессора с ДНК резко возрастает. Именно поэтому операторы имеют структуру палиндрома - с каждой половиной оператора взаимодействует одна молекула белка, причем связывание одной молекулы ускоряет - 3 - связывание второй, в результате сила связывания регуляторного белка с оператором возрастает. Такое явление называется кооперативностью. Более того, зачастую операторные сайты располагаются рядом, и тогда связывание одного димера белка может кооперативно способствовать связыванию второго димера.

Результатом кооперативного связывания является сигмоидная кривая зависимости эффективности транскрипции от концентрации репрессора (или активатора). Это обеспечивает легкость переключения регуляторной системы из одного состояния в другое.

Каков же результат связывания регуляторного белка с оператором? В случае репрессоров такое связывание либо создает стерическое затруднение для связывания РНК-полимеразы с промотором либо препятствует дальнейшему продвижению РНК-полимеразы в тех случаях, когда оператор расположен после промотора. В случае активаторов возможны несколько механизмов:

- непосредственное взаимодействие активатора с полимеразой, обеспечивающее более сильное связывание с промоторной областью;

облегчение локального расплетания ДНК в области промотора (необходимого для инициации транскрипции) либо за счет внесения изгиба в ДНК либо за счет увеличения отрицательной суперскрученности.

Тщательный анализ ряда оперонов E. coli показал, что часть белков, первоначально описанных как репрессоры, может работать и активаторами (и наоборот). Два классических примера – cI и БАК.

Различный эффект связывания одного и того же белка с промоторной областью объясняется просто.

Репрессия происходит при связывании белка там, где он может предотвратить связывание РНК-П или активатора. Для оказания же активаторного действия белок должен обладать способностью связываться с РНК-П (обычно это слабое, но специфическое связывание) и иметь сайт связывания с ДНК в непосредственной близости к промотору.

Lac репрессор тетрамер кооперативное связывание с двумя операторами 10 копий на клетку 4000 мутантов JH Miller'a Gal репрессор димер похож на LacI, но короче с С-конца (участвующего в формировании тетрамера у LacI) для репрессии необходимо связывание двух димеров Gal репрессора и гистоноподобного белка HU между ними.

Почему димер?

1.3 Взаимодействие регуляторных белков с РНК-полимеразой Бактериальные промоторы содержат специфические элементы, распознаваемые холоферментом РНК-полимеразы. Гексамеры –10 и –35 распознаются специфическими поверхностями областей 2 и 4 субъединицы РНК-полимеразы. Как правило, одних этих гексамеров оказывается недостаточно.

Расположенные выше элементы входят в контакт с карбокси-концом -субъединицы РНК-полимеразы.

Некоторые промоторы, к тому же, имеют расширенный –10 элемент, контактирующий с дополнительным районом области 2 -субъединицы РНК-полимеразы. Разные промоторы имеют различные комбинации этих элементов, и в ряде случаев узнавания этих дополнительных последовательностей оказывается достаточно для полноценного связывания РНК-полимеразы, но в большинстве случаев для нормальной инициации транскрипции необходимо присутствие активатора.

Активатор может быть необходим для начального связывания РНК-полимеразы с промотором, для ее изомеризации из закрытого в открытый комплекс, либо для освобождения промотора (начала собственно транскрипции).

Две модели были предложены для объяснения действия активаторов. В соответствии с первой из них активатор вступает в непосредственный контакт с РНК-П. Вторая модель предполагает отсутствие непосредственного контакта с РНК-П;

по этой модели активатор изменяет конформации промоторной ДНК, облегчая инициацию транскрипции. Вторая модель довольно часто привлекалась для объяснения - 4 - механизма действия БАК, но в настоящее время большинство фактов свидетельствует в пользу первой модели даже для этого белка.

В соответствии с местом контакта активатора с РНК (a) R NAP П активаторы можно подразделить на следующие группы (Рис. 1.1.) a NTD b/ b'.

Контактирующие с карбокси-концом -субъединицы a CT D РНК-П (CTD) -35 - Наиболее изученным представителем этого класса является БАК. Сайт связывания для этого белка располагается перед –35 последовательностью. Интересно, (b) что сайты связывания активаторов этого класса a NTD располагаются на различных расстояниях от промотора.

b/ b' Это объясняется структурой CTD. Эта субъединица РНК s AA a CT D полимеразы состоит из двух доменов, соединенных между собой гибким линкером. N-концевой домен контактирует с -35 - сайт связывания другими субъединицами РНК-полимеразы и поэтому активатора жестко зафиксирован, тогда как CTD достаточно подвижен и поэтому может контактировать с (c) активаторами, удаленными на различное расстояние.

a CT D a NTD b/ b' Естественно, это возможно, только если активатор контактирует с ДНК с той же стороны, что и РНК-П. s AA Region Поэтому БАК может активировать транскрипцию, связываясь с ДНК в области –61 (как у lac промотора), либо -35 - в позициях –71, -81, -91.

Какова же роль CTD в этих процессах?

Эксперименты с замещением аминокислотных остатков (d) показывают, что для активации необходима ДНК a NTD b/ b' связывающая поверхность, а также некоторые основания, s необходимые для взаимодействия с конкретным AA a CT Region D активатором. Какова же роль такого взаимодействия? В экспериментах по замещению CTD карбокси-концевым -35 - доменом репрессора фага (cI) было показано, что такая гибридная cI- субъединица способна обеспечивать Рис. 1.1. Контакты активатора активацию промотора при взаимодействии с транскрипции с РНК-полимеразой полноразмерным cI на промоторе с сайтом связывания с cI.

Поскольку структура cI совершенно отлична от таковой CTD, это свидетельствует о том, что любой дополнительный контакт с промоторной областью способен усиливать транскрипцию, не изменяя локальной структуры ДНК.

Активаторы, контактирующие с 70-субъединицей РНК-полимеразы А точнее, с ее областью 4. Наиболее изучен пример белка cI бактериофага. В качестве активатора этот белок связывается с сайтом, перекрывающимся с –35 элементом промотора PRM. В отличие от предыдущего класса активаторов позиция сайта связывания в данном случае определяется достаточно жестко (поскольку позиция 70 по отношению к промотору тоже жестко фиксирована).

Активаторы, контактирующие с другими областями РНК-полимеразы Принцип действия рассмотренных выше примеров активаторов основан на стабилизации уже существующих контактов с ДНК двух поверхностей РНК-П. Это наиболее простой путь, но имеются примеры и контактов активаторов с другими участками ( и субъединицами) РНК-П. Тот же БАК контактирует с N-концевым доменом -субъединицы в тех случаях, когда сайт связывания перекрывается с областью –35 промотора. Белок DnaA активирует промотор PR фага за счет контактов с ' субъединицей РНК-П.

Активаторы, имеющие два контакта с РНК-П.

- 5 - В тех случаях, когда активатор связывается с областью –35 промотора, CTD не может образовать контакт с ДНК в обычном месте и смещается выше. В некоторых случаях в такой позиции возможно образование дополнительного контакта CTD с активатором. Примером активатора, образующего такой двойной контакт, является FNR (активатор экспрессии фумарат редуктазы и нитрат редуктазы). В случае этого белка одна субъединица его димера контактирует с -фактором РНК-П, а другая субъединица контактирует со смещенным CTD. Таким образом, каждая субъединица FNR контактирует со своей областью РНК-П. Такая же ситуация характерна для части тех БАК-зависимых промоторов, у которых сайт связывания БАК перекрывается с областью –35. Как уже говорилось выше, в таких случаях одна субъединица БАК контактирует с N-концевым доменом -субъединицы РНК-П.

Другая же субъединица БАК может образовывать дополнительный контакт с CTD.

Активаторы, действующие путем изменения конформации промотора.

Примером такого активатора является белок MerR транспозона Tn501. Димер этого белка связывается с сайтом, расположенным между –10 и –35 областями промотора. Связывание ионов ртути вызывает конформационное изменение, заключающееся в раскручивании ДНК-мишени, что приводит к правильному расположению –10 и –35 областей промотора и соответственно позволяет связаться РНК полимеразе. Еще одним примером такого регулятора является SoxR (регулятор окислительного стесса, который мы будем рассматривать позднее). К этому же классу относятся активаторы, связывание которых с ДНК вводит в структуру последней резкий изгиб. Нет полной ясности с механизмом работы таких активаторов транскрипции. Здесь возможны два варианта – контакт с «обратной» стороной РНК П и конформационное изменение структуры ДНК.

Наконец, существуют промоторы, зависящие от двух (и более) активаторов. Такая множественная зависимость обычно привязывает активность промотора к различным физиологическим сигналам. В таких ситуациях возможны 4 механизма совместного действия двух регуляторов:

• связывание с ДНК одного активатора может зависеть от другого (и наоборот). Несмотря на простоту, примеров такого рода для прокариот не описано (описаны для эукариот);

• связывание одного активатора может приводить к перемещению другого активатора из пассивной позиции в положение, из которого он может взаимодействовать с РНК-П. Пример – БАК и MalT на malK промоторе:

- связывание БАК перемещает MalT • активаторы могут образовывать независимые контакты с РНК-П. В таких случаях один активатор связывается в районе –35 области и контактирует с, а другой – upstream, и контактирует с CTD.

• роль второго активатора может заключаться в предотвращении действия репрессора.

Promoter occlusion 1.4 Арабинозный оперон В качестве примеров систем с более сложным контролем рассмотрим ara оперон E. coli.

Рассмотренный ранее lac оперон можно считать примером “простой” регуляции. Хотя в случае lac оперона действуют два белка-регулятора, а именно осуществляющий негативный контроль репрессор LacI и активатор транскрипции БАК, действие этих белков друг от друга не зависит, и мы фактически имеем две простых регуляторных системы. В ara опероне один и тот же белок (продукт гена araC) может выполнять как репрессорную, так и активаторную функции.

Всего за утилизацию арабинозы отвечает 6 генов – пять структурных и один регуляторный (araC).

Три гена образуют оперон, araBAD, который и регулируется продуктом гена araC. Ген araC располагается перед опероном araBAD, но отделен от него 147 парами оснований и считывается в противоположном направлении. Еще два гена, araE и araF не сцеплены ни друг с другом, ни с кластером araCBAD, т.е. располагаются в совершенно другом районе хромосомы. Тем не менее, эти два гена подвержены той же системе регуляции, т.е. в их промоторной области имеются сайты связывания продукта araC. Такая организация называется регулоном. Иными словами, регулон – группа генов и (или) оперонов, как правило, необходимых для выполнения одной физиологической функции, не сцепленных между собой, но находящихся под общим контролем.

Генетическое изучение арабинозного оперона указывало на то, что ген araC должен кодировать как репрессор, так и активатор транскрипции. Оказалось, что непосредственно продукт является репрессором, но присоединение индуктора (арабинозы) не только инактивирует репрессор, но и - 6 - превращает его в индуктор. Эти две формы продукта araC называются соответственно Crep и Cind. Две формы белка C имеют разные сайты связывания в области между генами araC и araB. Кроме того, в этой же области располагается сайт связывания БАК и, конечно же, промоторы гена araC и оперона araBAD.

Эта область ДНК организована следующим образом Сайт связывания БАК располагается между двумя промоторами, причем связывание комплекса БАК-цАМФ необходимо для инициации транскрипции в обоих направлениях. Сайт связывания Crep перекрывается с промотором гена araC, поэтому связывание Crep ингибирует транскрипцию своего собственного гена. Таким образом, в отсутствие индуктора транскрипция гена araC поддерживается на очень низком базальном уровне, достаточном только для обеспечения собственной репрессии.

Появление индуктора (арабинозы) вызывает отсоединение репрессора и связывание его с активаторным сайтом, располагающимся между сайтом связывания БАК и промотором оперона araBAD. Таким образом снимается репрессия с araC и обеспечивается синтез больших количеств его продукта, который, связываясь с арабинозой, активирует транскрипцию оперона araBAD.

Т.о., в случае транскрипции “влево” мы имеем точную копию модели регуляции lac оперона.

Репрессор Crep ингибирует транскрипцию araC фактически так же, как LacI ингибирует транскрипцию lac оперона. И точно так же добавление индуктора, в данном случае арабинозы, снимает репрессию.

Также аналогично действует и активирующий комплекс БАК-цАМФ по отношению к транскрипции “влево”. Однако, в случае транскрипции “вправо” ситуация более сложная, поскольку здесь действуют уже два активаторных белка, тот же БАК-цАМФ и Cind. Сайт связывания Cind расположен таким образом, что, связавшись с ДНК, этот белок может непосредственно контактировать с РНК полимеразой, что и вызывает активацию транскрипции. Но поскольку сайт связывания Cind расположен между промотором и БАК-связывающим сайтом, комплекс БАК-цАМФ располагается слишком далеко, чтобы непосредственно контактировать с РНК-полимеразой, собирающейся читать вправо.

Как же БАК осуществляет регуляцию в данном случае? Дело в том, что пример с ara опероном не является исключением. БАК имеет два типа расположения относительно промотора. Первый – стандартный для активаторов транскрипции – прямо перед промотором (например, в положении -72... 50 у lac оперона или -50...-23 у gal оперона), что позволяет белку непосредственно контактировать с РНК-полимеразой. Но у многих промоторов сайт связывания БАК располагается значительно дальше. В случае ara оперона БАК связывается в положении -107...-78. Есть и другие опероны с удаленным расположением БАК-связывающего сайта. Вопрос о том, как действует БАК, остается открытым.

Существуют две модели. Первая объясняет действие БАК через белковые взаимодействия. В принципе, даже не очень сильное взаимодействие между двумя белками может оказаться достаточным для существенного усиления связи РНК-полимеразы с промотором. Проблемой здесь является то, что даже в случае gal и lac промоторов взаимодействие должно происходить по-разному, а в случае ara промотора должны взаимодействовать три белка. Вторая модель предполагает, что эффект БАК определяется целиком его связыванием с ДНК. В соответствии с этой моделью РНК-полимераза не может сама обеспечить первоначальное плавление ДНК в области промотора, в пользу чего говорит тот факт, что ни один из БАК-зависимых промоторов не имеет “хорошей”, то есть близкой к канонической, -35 последовательности. Экспериментально установлено, что связывание белка БАК с ДНК вносит в нее изгиб почти под прямым углом, что возможно только в случае серьезного изменения структуры ДНК в этом районе. Предполагается, что это изменение структуры облегчает плавление ДНК в промоторной области и, следовательно, инициацию транскрипции.

1.5 Триптофановый оперон репрессибельный оперон Оба оперона (lac и ara), рассмотренные нами ранее, являются индуцируемыми (индуцибельными). Как мы уже обсуждали на первой лекции, индуцируемыми обычно являются катаболитные опероны. И такой тип регуляции естественен, поскольку обеспечивает синтез ферментов, отвечающих за утилизацию какого-либо питательного субстрата только в случае наличия этого субстрата. В другой ситуации, когда клетке нужно синтезировать какое-нибудь вещество и поддерживать его концентрацию на постоянном уровне, используются репрессибельные (репрессируемые) опероны. Рассмотрим такой тип регуляции на примере триптофанового оперона.

- 7 - Триптофановый оперон состоит из 5 структурных генов, кодирующих три фермента, превращающих хоризмовую кислоту в триптофан. (Г1 с.190). Биосинтез триптофана представляет собой классический случай ретроингибирования, то есть ингибирования активности одного из первых ферментов какого-либо биосинтетического пути конечным продуктом. Но кроме участия в ретроингибировании триптофан выполняет также и функцию корепрессора, активируя белок-репрессор.

Репрессор кодируется не связанным с trp опероном геном trpR. В условиях достаточных количеств триптофана комплекс корепрессор-TrpR связывается с оператором и ингибирует транскрипцию. (пару слов о генетической номенклатуре - TrpR vs trpR). Инактивация репрессора приводит к усилению транскрипции приблизительно в 70 раз. Это относительно небольшая разница (сравните с 1000-кратной индукцией lac оперона). Но такая кажущаяся неэффективность с лихвой компенсируется дополнительными уровнями регуляции - во-первых, ретроингибированием, а во-вторых, феноменом, называемым аттенуацией.

Аттенуация.

Между промоторной областью и первым структурным геном оперона имеется достаточно протяженный участок ДНК, к тому же кодирующий небольшой пептид. Эта последовательность ДНК называется лидером, а пептид - лидерным. И, как оказалось, лидер необходим для еще одного механизма регуляции экспрессии, называемого аттенюацией. Это явление достаточно широко распространено в биосинтетических оперонах, и его сущность заключается в следующем. За лидерным пептидом располагается шпилечная структура, являющаяся терминатором, на котором в условиях избытка триптофана транскрипция оперона благополучно и заканчивается, не достигнув структурных генов. Лидерный пептид богат триптофановыми кодонами. В условиях недостатка триптофана концентрация нагруженных триптофаном аминоацил-тРНК не высока, и рибосома "притормаживает" на триптофановых кодонах, не давая возможности образоваться терминаторной шпильке. В результате транскрипция продолжается и с рамок структурных генов считывается РНК. Лидерная область, также называемая аттенюатором, занимает 162 н.п. между стартом транскрипции и первым кодоном trpE гена.

Аттенюатор является барьером для транскрипции. Активной структурой здесь выступает -независимый терминатор - короткий GC богатый палиндром, непосредственно за которым следуют остатков U (не забудьте, что сейчас мы говорим о структуре РНК). В присутствии триптофана ~90% РНК терминируется здесь (что вместе с репрессией дает приблизительно 600-кратное снижение транскрипции в присутствии триптофана).

Рассмотрим структуру аттенюатора подробнее Аттенюатор содержит RBS, за которым следует рамка считывания, способная кодировать пептид длиной 13 аминокислот. Какова функция этого пептида? В положениях 9 и 10 он содержит два триптофановых остатка. В условиях недостатка триптофана рибосомы останавливаются, достигнув триптофановых кодонов, что препятствует формированию терминаторной шпильки. Лидерная РНК может образовывать три шпильки, а поскольку их последовательность перекрывается, возможны две альтернативные структуры. В первой из них участок 1 спаривается с участком 2, а участок 3 с участком 4. Таким образом, формируется три шпильки. Если же не дать участку 1 спариться с участком 2, то участок 2 может спариться с участком 3. В таком случае участку 4 спариваться не с чем, и терминаторная шпилька не образуется.

Следующий рисунок показывает, каким образом положение рибосомы при трансляции лидерного пептида влияет на образование шпилечных структур таким образом, что терминация происходит только при наличии триптофана. Как вы знаете, у прокариот процессы транскрипции и трансляции не разобщены, то есть трансляция мРНК начинается, как только синтезированы первые несколько десятков пар оснований. Поскольку стоп-кодон лидерного пептида находится как раз между комплиментарными участками 1 и 2, рибосома, дойдя до конца лидерного пептида, экранирует большую часть участка 2, не давая формироваться полноразмерной шпильке 2-3, поэтому терминаторная шпилька формируется беспрепятственно. В случае же голодания по триптофану рибосома с пустым А-сайтом притормаживает на триптофановых кодонах в ожидании триптофановой аминоацил-тРНК, что позволяет сформироваться полноразмерной шпильке 2-3. Соответственно, терминаторная шпилька в таких условиях образоваться не может. Если же клетка голодает по одной из аминокислот, чьи остатки располагаются в начале лидерного пептида, формирование шпильки 1-2 блокирует формирование шпильки 2-3 и, следовательно, позволяет сформироваться терминаторной шпильке 3-4.

- 8 - Аттенуация - широко распространенное явление, встречающееся, как минимум, в шести оперонах биосинтеза аминокислот. В двух из них наблюдается явление мультивалентной репрессии - thr оперон дерепрессируется при голодании по thr и ile, a ilv оперон - по ile, leu и val.

Наконец, следует заметить, что формально в случае аттенуации рибосому можно считать активатором транскрипции, а аминоацил-тРНК - корепрессором.

1.6 Регуляция на стадии терминации. Антитерминация Итак, на примере аттенуации в триптофановом опероне мы только что рассмотрели регуляцию экспрессии на стадии терминации транскрипции. На первой лекции на примере лактозного оперона мы рассматривали регуляцию на стадии инициации транскрипции. При сравнении этих двух примеров может сложиться впечатление, что регуляция на стадии терминации - очень сложный процесс. Но это далеко не всегда так. Другой механизм регуляции на стадии терминации, называемый антитерминацией, устроен проще. В случае антитерминации регуляторную функцию выполняет один белок, называемый антитерминатором. Этот белок предотвращает терминацию транскрипции и позволяет считываться генам, расположенным за терминатором, выполняя, таким образом, активаторную функцию. Следует сразу заметить, что, в отличие от регуляторов транскрипции, действующих на стадии инициации, антитерминаторы не взаимодействуют с кофакторами, а либо являются активными постоянно, либо их активность модулируется фосфорилированием.

Классический пример антитерминации - регуляция жизненного цикла бактериофага. Геном фага лямбда имеет три группы генов: немедленно ранние (предранние), задержанно ранние и поздние.

Названия групп отражают последовательность "включения", то есть активации транскрипции, этих генов. Оба этапа активации зависят от действия белков-антитерминаторов pN и pQ. Давайте подробно рассмотрим действие первого из них.

На рисунке показана упрощенная схема ранней области фага. Два предранних гена, N и cro транскрибируются "влево" и "вправо" от промоторов PL и PR. В самом начале литического цикла развития бактериофага транскрипция останавливается непосредственно после генов N и cro на зависимых терминаторах tL1 и tR1. Синтезирующийся в результате предранней транскрипции белок pN позволяет РНК-полимеразе преодолевать терминаторы tL1 и tR1 и считывать располагающиеся за ними задержанно ранние гены.

Действие фактора. Терминация транскрипции при участии этого белка происходит, когда Rho, связанный с вновь образованным транскриптом, взаимодействует с РНК-полимеразой, остановившейся в области -зависимого терминатора. ДНК в области таких терминаторов, как правило, не имеет особой структуры, богата основаниями C и бедна G, первичная последовательность различных терминаторов не имеет заметного сходства. Rho обладает РНК-зависимой АТФазной активностью и способствует отсоединению РНК-полимеразы через взаимодействие с белком NusG.

Действие белка pN высоко специфично в том плане, что он обеспечивает антитерминацию только на двух фаговых терминаторах, не влияя на терминацию транскрипции бактериальных генов. В то же время, если в фаговой ДНК точно в том же месте заменить фаговый терминатор любым -зависимым бактериальным терминатором, антитерминация по-прежнему будет происходить. Следовательно, белок pN не опознает терминатор как таковой, и перед терминатором должен существовать какой-то сайт, узнаваемый этим белком. Такие участки называются nutL и nutR (от англ. N utilisation) для левого и правого терминатора соответственно. Эти участки располагаются на различных расстояниях от терминатора, в связи с чем возникает вопрос: "А как же они работают?". Когда pN узнает nut сайт, он должен подействовать на РНК-полимеразу таким образом, что она не сможет больше узнавать терминаторный сайт. Сравнение сайтов между собой показало, что они состоят из 17 н.п. палиндрома (который может образовать небольшую шпильку). Мутации в этом сайте, называемом также boxB, лишают pN способности предотвращать терминацию. Непосредственно перед этим сайтом располагается октамерная последовательность, называемая boxA, также участвующая в антитерминации.

Белок pN действует, скорее всего, опознавая шпилечную структуру, формируемую BoxB областью, непосредственно после ее синтеза РНК-полимеразой, одновременно контактируя с субъединицами полимеразы. После такого узнавания антитерминатор остается в комплексе с РНК полимеразой, фактически становясь ее субъединицей и обеспечивая изменение ее специфичности по отношению к терминаторам.

- 9 - Поиск мутантов, предотвращающих действие pN, привел к обнаружению еще нескольких белков, являющихся компонентами транскрипционного аппарата, NusA и NusB (N utilisation substance). Белок NusA фактически является субъединицей РНК-полимеразы, снижающей скорость продвижения РНК полимеразы, что облегчает терминацию, тогда как NusB как раз и является фактором, опознающим последовательность boxA. Связывание NusB с транскрипционным комплексом усиливает антитерминацию. Еще один белок, NusG, необходим для -зависимой терминации, обеспечивая взаимодействие Rho и РНК-полимеразы.

2. Фосфотрансферазная система Бактериальная фосфоенолпируват:углевод фосфотрансферазная система (фосфотрансферазная система, ФТС) - это сложная разветвленная сеть переносящих фосфат белков, основной функцией которой является поглощение определенных углеводов из внешней среды. Набор углеводов, поступающих в клетку посредством ФТС, сильно варьирует у разных видов. Механизм работы ФТС заключается в транспорте углеводов через клеточную мембрану, сопряженном с фосфорилированием углевода. Наличие соответствующего углевода в среде и его транспорт внутрь клетки ведут к значительному расходу высокоэнергетического фосфата и, соответственно, снижает концентрацию фосфорилированых промежуточных переносчиков. А эти промежуточные переносчики фосфата взаимодействуют со многими клеточными белками и изменяют их активность. Таким образом наличие или отсутствие определенных углеводов в среде через ФТС влияет на целый ряд важнейших процессов, таких, например, как хемотаксис, индукция катаболитных оперонов, метаболизм азота, компетентность и вирулентность. А поскольку некоторые бактерии, например, Treponema pallidum, имея все компоненты ФТС, не транспортируют сахара посредством ФТС, регуляторная функция ФТС не менее важна, чем транспортная.

Вне зависимости от организма и углевода ФТС катализирует следующий процесс:

Фосфоенолпируват + углевод --> пируват + углевод-P (внутриклет.) (внеклет.) (внутриклет.) (внутриклет.) Фосфорилирование углевода сопряжено с его транслокацией через мембрану, а необходимая для этого энергия обеспечивается промежуточным продуктом гликолиза - фосфоенолпируватом (ФЕП).

Свободная энергия гидролиза фосфатной группы ФЕП - около -14.7 ккал/моль (больше, чем у АТФ), а для фосфорилированного сахара - около -3 ккал/моль. На первый взгляд, ФТС слишком расточительно расходует энергию. Однако, во-первых, в процессе гликолиза из молекулы ФЕП получается только одна молекула АТФ, а, во-вторых, ФТС обеспечивает одновременно и транспорт, и фосфорилирование своих субстратов (фосфорилирование необходимо для последующего катаболизма субстрата). Для углеводов, транспортируемых не-ФТС системами, на получение фосфорилированого субстрата внутри клетки расходуется более одной молекулы АТФ (как правило, одна на транспорт и одна на фосфорилирование).

Это одна из причин, по которой ФТС системы существуют в основном у облигатно и факультативно анаэробных бактерий. Такие бактерии получают АТФ путем субстратного фосфорилирования в анаэробных условиях и, следовательно, должны очень экономно расходовать молекулы АТФ, достающиеся им с таким трудом.

- 10 - Белки ФТС традиционно разделяются на три группы - фермент I (EI), HPr (histidine protein) и фермент II (EII). EII обычно состоит из трех-четырех компонент (обозначаемых EIIA, EIIB, EIIC и EIID), которые могут быть либо субъединицами одного белка, либо отдельными белками. Фермент I и HPr - растворимые цитоплазматические белки размером соответственно 64-85 и 9-10 kDa, необходимые для фосфорилирования всех ФТС сахаров данной бактерии, в связи с чем их называют общими белками ФТС. С другой стороны, фермент II специфичен для каждого углевода, и либо является мембранным (если все компоненты его соединены в один белок), либо одна из разделенных субъединиц является мембранной. Перенос фосфата к сахару происходит от фосфоенолпирувата через EI, HPr, EIIA и EIIB.

Более подробно этот процесс на примере ФТС глюкозы у E. coli выглядит следующим образом Рис.2.1. Принцип работы ФТС глюкозы (Рис.2.1.(а)). Сначала EI димеризуется и в таком состоянии автофосфорилируется, перенося фосфат с фосфоенолпирувата на His-189. Затем EI фосфорилирует HPr по остатку His-15. Затем P-HPr фосфорилирует один из сахар специфических белков (или доменов) EIIA, опять же по гистидиновому остатку (His-90), откуда фосфат переносится на Cys-241 мембранного белка EIIBC, который уже передает фосфат на транспортируемую глюкозу с образованием глюкозо-6-фосфата. Как же происходит собственно транспорт углевода внутрь клетки? Предполагается, что процесс протекает следующим образом.

Периплазматический субстрат связывается с высокой аффинностью со своим специфическим EIIC. Домен или субъединица C фермента II является интегральным мембранным белком-переносчиком либо, по крайней мере, его субстрат-специфической частью. Этот переносчик (всегда в комплексе с EIIB) и осуществляет транспорт углевода внутрь клетки.

Если EIIB не фосфорилирован, субстрат может только очень медленно транслоцироваться через мембрану путем облегченной диффузии. Фосфорилирование IIB по Cys остатку обеспечивает быструю транслокацию субстрата на цитоплазматическую сторону (происходит облегченная диффузия за счет конформационного изменения белка).

Затем происходит фосфорилирование связанного с переносчиком субстрата и его освобождение в цитоплазму.

Ряд экспериментов показывает, что транспорт сахара через мембрану не связан особенно тесно с фосфорилированием. Субстрат может отделяться от переносчика на внутренней стороне мембраны без фосфорилирования, более того, для некоторых Грам-положительных бактерий показана возможность работы переносчика в обратном направлении, то есть для выброса углевода из клетки. Иными словами, сам транспорт через мембрану является обратимым. Все стадии передачи фосфата с одного белкового переносчика на другой происходят практически без потери энергии и, следовательно, тоже являются обратимыми. Энергия высвобождается при передаче фосфата на транспортируемый сахар непосредственно после его проникновения в цитоплазму, что делает весь процесс необратимым и "запирает" сахар внутри клетки.

Пару слов о генетике ФТС. Гены, кодирующие общие компоненты ФТС, организованы в pts оперон, а специфичные для различных сахаров компоненты ФТС, как правило, расположены в оперонах с генами соответствующих катаболических ферментов, причем основной субстрат ФТС является индуктором всего оперона.

- 11 - pts оперон состоит из трех генов, расположенных в следующем порядке: ptsH (кодирует HPr), ptsI (EI), crr (EIIAGlc). Экспрессия оперона возрастает в три раза при росте на ФТС субстратах и требует присутствия комплекса БАК-цАМФ. Анаэробный рост также усиливает экспрессию оперона в соответствии с предположением о том, что ФТС - основной механизм транспорта углеводов в условиях анаэробиоза. Оперон имеет как минимум три промотора - два (P0 и P1) расположены перед ptsH, а третий (P2) - перед crr (внутри ptsI). Перед промоторами P0 и P1 располагаются по сайту связывания БАК с высокой и низкой аффинностью соответственно. P0 является основным промотором в присутствии комплекса БАК-цАМФ, а P1 - в его отсутствии. С этих промоторов считывается один длинный транскрипт, захватывающий все три гена оперона, и один короткий, перекрывающий только ptsH. Еще один короткий транскрипт считывается с P2 и является основным для гена crr. Такая организация транскрипции оперона обеспечивает большее количество молекул EIIAGlc по сравнению с HPr и EI. Транскрипция pts оперона стимулируется нефосфорилированым EIICBGlc (c P0 промотора).

Таким образом, стимуляция транскрипции pts оперона комплексом БАК-цАМФ и EIICBGlc (?) действует в двух противоположных ситуациях - в отсутствии глюкозы в среде и в ее присутствии, результатом чего является поддержание экспрессии ФТС оперона на сходном уровне в условиях как сильной, так и слабой катаболитной репрессии.

Мутанты, дефектные по EI или HPr, не способны утилизировать ФТС сахара как источники углерода. К таким сахарам у Enterobacteriaceae относятся глюкоза, фруктоза, манноза, гекситолы, глюкозиды, N-ацетилглюкозамин, сорбоза, сахароза, трегалоза и целлобиоза. Как ни странно, такие мутанты (по общим компонентам ФТС) также не растут и на ряде не-ФТС сахаров, к каковым относятся лактоза, мальтоза, мелибиоза, глицерин, рамноза, ксилоза и интермедиаты цикла Кребса. Почему это происходит?

Простейшая модель, объясняющая фенотип ФТС мутантов по отношению к утилизации не-ФТС сахаров, заключается в следующем. Фермент IIAGlc может существовать в двух формах - фосфорилированой и нефосфорилированой. Степень фосфорилирования IIAGlc определяется балансом между фосфорилированием его P-HPr и дефосфорилированием через IICBGlc в присутствии его субстрата - глюкозы. IIAGlc и P-IIAGlc взаимодействуют с и регулируют различные белки. IIAGlc связывается с и ингибирует ряд ферментов, существенных для метаболизма углеводов, например, переносчики лактозы и мелибиозы, глицерол киназу. Прямым результатом такого взаимодействия является ингибирование транспорта и последующего метаболизма этих источников углерода. Такое явление называется исключением индуктора. Кроме того, фосфорилированый IIAGlc участвует в активации аденилатциклазы. А поскольку цАМФ необходим для экспрессии многих катаболитных генов, регуляция уровня позволяет контролировать синтез ферментов. Но если регуляторной функцией обладает всего один компонент ФТС глюкозы, IIAGlc, как другие ФТС сахара оказывают ингибирующее влияние на утилизацию не-ФТС субстратов?

В клетке, растущей на не-ФТС субстрате общие ФТС белки (EI и HPr) будут находиться преимущественно в фосфорилированом состоянии, поскольку они не смогут "сбросить" фосфат на транспортируемый сахар (Рис.2.1.(b)). Добавление ФТС субстрата приведет к "разгрузке" фосфата с общих компонентов ФТС, а поскольку реакция фосфорилирования IIAGlc белком HPr обратима, это обеспечит дефосфорилирование IIAGlc. В таких условиях поступление в клетку не-ФТС субстратов будет ингибироваться из-за исключения индуктора нефосфорилированым IIAGlc, а экспрессия катаболитных генов будет минимальной из-за низкой концентрации цАМФ, возникающей из-за отсутствия стимулирования аденилатциклазы P-IIAGlc.

Как белок EIIAGlc осуществляет свою регуляторную функцию? В зависимости от механизма действия EIIAGlc не-ФТС сахара делятся на две группы. К первой относятся лактоза, мелибиоза, мальтоза и глицерол, ко второй - ксилоза, рамноза, галактоза и интермедиаты цикла Кребса. Для сахаров первой группы EIIAGlc ингибирует и транспорт, и катаболизм. Транспорт ингибируется путем непосредственного связывания нефосфорилированого EIIAGlc с мембранным транспортером соответствующего углевода, причем только тогда, когда транспортер уже связал свой сахар. Как происходит активация аденилатциклазы - неизвестно, но сниженный уровень цАМФ в отсутствии P EIIAGlc определяет фактически полное отсутствие экспрессии генов катаболизма не-ФТС сахаров второй группы (Рис.2.2.).

- 12 - Катаболитная репрессия Таким образом, мы снова возвращаемся к явлению катаболитной репрессии, и теперь у вас должно быть четкое представление о том, чем объясняется классический феномен диауксии при росте E. coli на лактозе и глюкозе.

Однако, при общем сходстве ФТС систем у разных организмов механизмы катаболитной репрессии несколько различаются. Рассмотрим роль компонентов ФТС в этом явлении у группы Грам-положительных бактерий с низким ГЦ содержанием на примере B. subtilis (Рис.

2.3.). Центральной молекулой, отвечающей за катаболитную репрессию у этой бактерии является HPr. В отличие от энтеробактерий, HPr у B. subtilis может Рис.2.2. Катаболитная репрессия у Escherichia coli быть фосфорилирован в двух положениях - His-15 ФТС ферментом I и Ser-46 активируемой метаболитами (прежде всего, фруктозо-бис-фосфатом) АТФ-зависимой HPr-киназой (продуктом гена ptsK). Фосфорилирование по Ser-46 служит исключительно регуляторным целям. Катаболитная репрессия у этих бактерий идет двумя путями: во первых, через репрессию катаболитных генов и оперонов белком CcpA (catabolite control protein) и, во вторых, за счет отсутствия индукции катаболитных генов и оперонов, что определяется HPr путем фосфорилирования соответствующих ферментов.

CcpA ингибирует транскрипцию катаболитных генов, связываясь с операторным сайтом, который в данном случае называется cre (catabolite responsive element). CcpA принадлежит к классу LacI-подобных регуляторов транскрипции.

Операторные сайты cre располагаются в регуляторных областях многих оперонов, таких как xyl, gut (утилизация глюконата), hut (утилизация гистидина), lev (транспорт фруктозы и деградация левана) и др. Для связывания CcpA с оператором cre необходимо действие корепрессора, которым в данном случае является фосфорилированый по Ser-46 HPr.

Активная форма репрессора состоит из димера CcpA и двух молекул HPr-S46-P.

Рис.2.3. Катаболитная репрессия у Bacillus subtilis Второй механизм катаболитной репрессии у Грам-положительных бактерий определяется действием специфических для каждого сахара регуляторов. Примерами таких регуляторов являются LevR, LicT и LacT, контролирующие синтез соответственно леваназы, -глюкозидазы и -галактозидазы. Такие регуляторы действуют как активаторы транскрипции или антитерминаторы (подобно BglG у E.coli), а общим между ними является наличие регулируемого ФТС домена (PRD). Активность этих регуляторов контролируется фосфорилированием белком HPr или EII. В отсутствие глюкозы HPr-H15-P фосфорилирует один из аминокислотных остатков PRD домена, что стимулирует активацию транскрипции. Фосфорилирование HPr по Ser-46 HPr-киназой предотвращает фосфорилирование регуляторов. Таким образом создается связь между гликолитической активностью (которую детектирует HPr-киназа), степенью фосфорилирования HPr и активностью регуляторов, содержащих PRD домен.

- 13 - bgl оперон – ФТС и антитерминация.

bgl оперон E. coli (криптический) состоит из трех генов: bglG, кодирующего позитивный регулятор (антитерминатор), bglF, кодирующего ФТС транспортер -глюкозидов и bglB, кодирующий фермент, гидролизующий -глюкозиды. Контроль экспрессии оперона осуществляется ри помощи двух терминаторов – в лидерной области и между bglG и bglF. BglF фосфорилируется ФТС белками и в присутствии -глюкозидов сбрасывает фосфатную группу на эти сахара в процессе их транспорта. BglF также может выступать в роли киназы, перенося свой фосфат на BglG, и в роли фосфатазы, дефосфорилируя BglG.

Терминаторные области bgl оперона содержат по два перекрывающихся участка, способных образовывать альтернативные шпилечные структуры. Связывание BglG с первой шпилькой препятствует образованию второй, являющейся терминатором. BglG активно связывается с РНК (и выполняет антитерминаторную функцию) только в форме димера. Фосфорилирование BglG переводит его в мономерную форму и препятствует связыванию с РНК. В присутствии -глюкозидов BglF фосфорилирует их и дефосфорилирует BglG;

при отсутствии субстрата BglF фосфорилирует BglG, что блокирует антитерминацию. Этот пример показывает эффективное использование фосфорилирующей способности транспортного белка для детекции сигнала из внешней среды и трансформации его в изменение экспрессии генов через белковые взаимодействия.

sac genes of B. subtilis 3. Альтернативные сигма-факторы РНК-полимеразы Узнавание промотора у бактерий требует ассоциации кор-фермента РНК-полимеразы ('2) с сигма () субъединицей, что дает активный холофермент (Рис. 3.1). Все свободноживущие бактерии содержат множественные сигма-факторы (у некоторых бактерий описано до 10-20). К числу таковых относятся основной сигма-фактор, контролирующий гомеостатические функции, и альтернативные сигма-факторы, активируемые специфическими сигналами или стрессовыми условиями (Табл. 3.1). Как правило, только один фактор обеспечивает транскрипцию всех жизненно важных генов, обеспечивающих гомеостатические клеточные процессы (репликацию ДНК, транскрипцию, трансляцию и т.д.). Этот сигма-фактор называют основным, а все остальные – альтернативными.

Инактивация основного -фактора летальна, альтернативных, как правило, – нет. Названия сигма факторов соответствуют их молекулярной массе (например 38). Все гены, кодирующие -факторы, имеют аббревиатуру rpo (RNA polymerase), поэтому для обозначения сигма-факторов также пользуются четырехбуквенные имена (например RpoS).

Основной -фактор E. coli имеет молекулярную массу около 70 kDa и обозначается 70 или RpoD.

Альтернативный -фактор, контролирующий большинство генов азотного метаболизма, имеет Рис.3.1. Инициация транскрипции у размер 54 kDa, и соответственно обозначается 54 или прокариот RpoN. Эти два белка не похожи друг на друга ни по рервичной последовательности, ни по структуре, и - 14 - являются прототипами двух больших семейств -факторов. Все основные и большинство альтернативных -факторов принадлежат к семейству 70. Альтернативные -факторы этого семейства, в свою очередь, могут быть сгруппированы в три подсемейства, контролирующих споруляцию, подвижность и разнообразные внецитоплазматические функции (синтез секретируемых белков, транспорт железа, реакция на различные стрессовые воздействия). Представители семейства 54 также присутствуют у многих бактерий и контролируют азотный метаболизм, синтез ряда гидролаз и жгутиковых белков.

Таблица 3.1. Сигма-факторы Escherichia coli Сигма- Размер Контролируемые процессы Количество фактор белка, подконтрольных АК генов RpoD 613 большинство жизненно важных генов ~ RpoS 330 общий стресс и стационарная фаза ~ RpoH 284 тепловой шок ~ RpoF 239 жгутиковый аппарат и хемотаксис ~ RpoE 202 внецитоплазматические гены и экстремальный тепловой ~ шок FecI 173 транспорт цитрата железа и внецитоплазматические гены ~ RpoN 477 азотный метаболизм ~ Основной -фактор E. coli имеет молекулярную массу около 70 kDa и обозначается 70 или RpoD.

Альтернативный -фактор, контролирующий большинство генов азотного метаболизма, имеет размер 54 kDa, и соответственно обозначается 54 или RpoN. Эти два белка не похожи друг на друга ни по рервичной последовательности, ни по структуре, и являются прототипами двух больших семейств факторов (Рис. 3.2). Все основные и большинство альтернативных -факторов принадлежат к семейству 70. Альтернативные -факторы этого семейства, в свою очередь, могут быть сгруппированы в три подсемейства, контролирующих споруляцию, подвижность и разнообразные внецитоплазматические функции (синтез секретируемых белков, транспорт железа, реакция на различные стрессовые воздействия).

Представители семейства 54 также присутствуют у многих бактерий и контролируют азотный метаболизм, синтез ряда гидролаз и жгутиковых белков.

Последовательности промоторов, опознаваемых альтернативными сигма-факторами, существенно различаются и, как правило, не могут быть распознаны более чем одной сигма-субъединицей.

Исключение – RpoD и RpoS (схема - промоторы) Будучи глобальными регуляторами, сигма факторы, как Рис.3.2. Структурно-функциональная организация правило, не детектируют изменение сигма-факторов.

условий сами, а полагаются в этом на другие белки. Сигма-факторы обычно - 15 - являются конечным либо (реже) промежуточным звеном какого-либо регуляторного каскада. Именно поэтому сигма-факторы обычно сами подвержены регуляции, причем осуществляться она может на транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях.

-факторы бактериофагов. Каскадная регуляция экспрессии генов.

Однако исторически одними из первых были открыты альтернативные сигма-факторы, участвующие в каскадной активации генов при литическом цикле развития некоторых бактериофагов.

Классический пример - бактериофаг SPO1 B. subtilis. Литический цикл бактериофага можно разделить на три стадии. Сразу после инфекции транскрибируются ранние гены бактериофага. Они считываются с типичных бактериальных промоторов бактериальным холоферментом с основной сигма-субъединицей (55 у B. subtilis). Очередность транскрипции средних и поздних генов определяется тремя фаговыми генами, 28, 33 и 34. Продукт гена 28, обозначаемый gp28, является сигма-фактором. Замещая основной сигма-фактор, он позволяет РНК-полимеразе считывать средние гены бактериофага. Продукты средних генов 33 и 34, gp33 и gp34, замещают gp28, снова изменяя промоторную специфичность РНК полимеразы, которая становится способной считывать теперь уже только промоторы поздних фаговых генов. Таким образом, альтернативные сигма-факторы позволяют бактериофагу полностью переключить транскрипционный аппарат хозяйской клетки на считывание своих собственных генов.

rpoS У E. coli важнейшим сигма-фактором является s, продукт гена rpoS. Этот сигма-фактор наиболее близок по своей аминокислотной последовательности к основной сигме 70. Промоторы этих сигма факторов тоже очень похожи, но, несмотря на это, специфичны каждый для своего сигма-фактора in vivo. Буква S в названии s происходит от стационарной фазы роста, на протяжении которой этот фактор был впервые обнаружен. Затем присутствие этого сигма-фактора было обнаружено в других стрессовых условиях, и сейчас считается, что присутствие s является свидетельством т.н. «общего стрессового ответа». Этот ответ наблюдается, когда клетка сталкивается с рядом стрессовых ситуаций, видимым признаком чего является снижение скорости роста вплоть до вхождения в стационарную фазу.

Голодание, повышение осмолярности среды или понижение pH, неоптимальная температура – эти и другие стрессовые воздействия могут индуцировать общий стрессовый ответ. Физиологические последствия общего стрессового ответа включают устойчивость к многим стрессовым воздействиям, накопление запасных питательных веществ, изменения структуры клеточной стенки (увеличение частоты кросс-сшивок в пептидогликане) и изменение морфологии клетки (уменьшение общего размера и укорачивание клеток – они становятся почти сферическими).

Во время логарифмической фазы роста в лабораторных условиях клетки E. coli практически не содержат s, и потому мутанты по rpoS не имеют видимых дефектов. В этих условиях большинство молекул РНК-полимеразы экспрессируют гомеостатические гены и имеют в своем составе главный сигма-фактор 70 (продукт гена rpoD). Эта ситуация меняется, как только клетки подвергаются какому либо стрессу, то есть попадают в условия, не оптимальные для роста. В этих условиях s индуцируется до уровня 30% от количества 70, что приводит к появлению достаточного количества РНК полимеразы в комплексе с s и индукции большого числа (не менее 100) s-зависимых промоторов. Активируемые гены жизненно необходимы для выживания в стрессовых условиях, например, в стационарной фазе.

При адаптации к стрессовой ситуации s действует как быстро индуцируемый координатор стрессового ответа, а также как основной регулятор долговременной адаптации со сложными физиологическими последствиями. Первая функция s очевидна при быстрой, но краткосрочной индукции s при переходе клетки с утилизации глюкозы на лактозу. Как вы помните, при выращивании бактерии на смеси двух углеводов наблюдается феномен диауксии – фаза логарифмического роста, во время которой бактерии используют предпочтительный углевод, затем плато, когда происходит перестройка метаболизма и второй этап логарифмического роста. Прежде чем клетка начнет утилизацию лактозы, ФТС глюкозы должна полностью освободиться от субстрата, должен накопиться цАМФ, что и приведет к индукции lac-оперона. Как раз накопление цАМФ и зависит от s – кратковременное появление этого -фактора и активация s-зависимых генов предшествуют накоплению цАМФ и необходимы для этого.

Количество активной s субъединицы контролируется на уровне транскрипции, трансляции и путем протеолиза. Различные стрессовые условия по-разному влияют на эти уровни регуляции. Даже в - 16 - условиях быстрого роста, когда белок s не детектируется, присутствует достаточно много мРНК rpoS.

Формирование вторичной структуры этой мРНК препятствует ее трансляции. Для активации трансляции этой мРНК необходимо действие небольшого РНК-связывающего белка Hfq (HF-I). Кроме того, транскрипция rpoS в стрессовых условиях также возрастает.

Такой механизм регуляции уровня s используется в тех стрессовых условиях, которые требуют длительной адаптации. В тех же случаях, когда требуется быстрое реагирование на внезапные изменения условий, такие как внезапное голодание, сдвиг pH, повышение температуры и осмолярности среды, увеличение к-ва s происходит за счет предотвращения ее протеолиза. Протеолиз s происходит за счет протеазы ClpXP при помощи регуляторного белка RssB. Нестабильность s определяется короткой последовательностью аминокислотных остатков, которая отсутствует у 70. RssB узнает эту последовательность и выступает в роли субстрат-узнающего фактора для ClpXP протеазы. Сродство RssB к s изменяется в зависимости от его фосфорилирования/дефосфорилирования, которое каким-то образом связано со стрессовыми условиями.

Каковы же гены-мишени, активируемые s? Их более сотни, и все они в той или иной степени выполняют функцию адаптации к стрессовым условиям. В качестве примеров можно привести активацию генов клеточного деления ftsQAZ и активацию системы защиты от активного кислорода. В последнюю входят каталазы KatE, KatG и протекторный белок Dps, непосредственно защищающий ДНК от перекиси водорода.

В клетках, находящихся в стрессовых условиях, две формы РНК полимеразы, Es и E70, сосуществуют и обеспечивают экспрессию различных генов. Тем не менее, промоторные последовательности генов, контролируемых Es, очень сходны с таковыми зависящих от E70 – вплоть до того, что в экспериментах in vitro оба холофермента достаточно хорошо транскрибируют оба типа промоторов. (Хотя Es все же менее требователен к –35 последовательности) Как же тогда обеспечивается специфичность s-зависимых промоторов? Экспрессия многих генов регулона модулируется глобальными регуляторами H-NS, Lrp, cAMP-CRP, IHF и Fis. Часть из этих факторов является распространенными гистоноподобными белками с не очень ясными функциями.

Зачастую несколько белковых факторов одновременно контролируют транскрипцию с s-зависимых промоторов. Также часто встречается ситуация, когда один и тот же ген транскрибируется с двух промоторов, зависящих от разных факторов. В таких случаях транскрипция с s–зависимого промотора зачастую зависит от дополнительного белкового регулятора, тогда как транскрипция с 70 промотора конститутивна.

rpoE Итак, мы разобрали функции и принцип активации s, сигма-фактора, наиболее близкого к основному сигма-фактору 70. Другие сигма-факторы менее сходны с 70 по своей последовательности и опознают промоторы, не имеющие ничего общего со "стандартным" промотором 70.

(Таблица с последовательностями промоторов для разных сигм) Рассмотрим принцип действия другого сигма-фактора E. coli, E. Этот белок принадлежит к большому семейству ECF (extracytoplasmic factors) сигма-факторов. Свое название эти сигма-факторы получили в связи с их участием в регуляции экспрессии внецитоплазменных белков (периплазматических, внешней мембраны и секретируемых во внешнюю среду). Основная функция E - обеспечивать синтез белков, ответственных за нормальный фолдинг (сворачивание) белков внешней мембраны, но, кроме того, E усиливает транскрипцию генов теплового шока (путем активации еще oдного сигма-фактора, 32), а у патогенных бактерий родственные сигма-факторы активируют гены вирулентности.

E реагирует на белки внешней мембраны и периплазматические белки, утратившие нормальную конформацию. Но поскольку сигма-фактор, естественно, является цитоплазматическим, а сигнал для его активации находится в периплазме, должен быть какой-то переносчик сигнала между двумя клеточными компартментами. Эту функцию выполняет мембранный белок RseA. В отсутствие сигнала E инактивирован путем связывания с RseA. Эта инактивация усиливается за счет взаимодействия RseA с периплазматическим белком RseB. При нарушениях внешней мембраны, предотвращающих нормальный фолдинг ее белков, RseB связывается с неправильно свернутыми белками, освобождая RseA. Это ведет к ослабеванию связи RseA с E, а дополнительное взаимодействие неправильно - 17 - свернутых белков с RseA окончательно освобождает E, который связывается с РНК-полимеразой и активирует транскрипцию ряда генов (Рис. 3.3). В число этих генов входят:

fkpA, кодирующий периплазматический шаперон (необходимый для нормального фолдинга периплазматических белков и белков внешней мембраны);

degP - периплазматическая протеаза, деградирующая ненормальные или неправильно свернутые белки;

rpoH - сигма-фактор, активирующий транскрипцию генов теплового шока;

собственный оперон rpoE rseABC;

гены вирулентности у ряда бактерий.

Поскольку E активирует транскрипцию своего собственного оперона, первоначальная индукция по механизму положительной обратной связи резко усиливается за счет дополнительного синтеза E. А поскольку одновременно с E происходит сверхпродукция негативных регуляторов RseA и RseB, вся система быстро выключается, как только периплазма оказывается очищенной от неправильно свернутых белков.

У ряда бактерий система E была адаптирована для контроля генов вирулентности. Так, у P.

aeruginosa гомолог E (AlgU) регулирует экспрессию генов alg, кодирующих синтез мукоидной капсулы, необходимой для установления хронических инфекций.

Так же, как и у E. coli, до поступления сигнала сигма-фактор Рис.3.3. Контроль регулона RpoE.

инактивирован взаимодействием с другим белком, MucA. Сигнал для активации AlgU скорее всего продуцируется на начальных этапах инфекции, например, в виде повышенной температуры, мешающей нормальному фолдингу белков оболочки.

Белки RseA и MucA принадлежат к классу регуляторов, известных как анти-сигма факторы.

Принцип работы этих белков прост - связываясь с сигма-факторами, они препятствуют их взаимодействию с РНК-полимеразой. Кроме E регулона, анти-сигма факторы участвуют в контроле регулонов, активируемых 28 (биосинтез жгутиков) и F (ранние стадии споруляции B. subtilis).

Наиболее интересный пример действия анти-сигма факторов представляет регуляция процесса биогенеза жгутиков, хорошо изученная у Salmonella typhimutium. Синтез поздних жгутиковых генов (кодирующих флагеллин и хемотаксические функции) зависит от альтернативного сигма фактора 28.

Во время ранних стадий синтеза жгутиков 28 находится в инактивированном состоянии за счет взаимодействия с анти-сигма фактором FlgM. Как только базальное тело и крюк оказываются собранными, FlgM секретируется через жгутик, высвобождая активный 28. Высвобождение приводит к началу транскрипции поздних жгутиковых генов, одним из продуктов которых является флагеллин - белок, из субъединиц которого собрана нить жгутика. А поскольку субъединицы флагеллина экспортируются через тот же канал, что и FlgM, создается препятствие для выхода FlgM из клетки, из-за чего его уровень внутри клетки снова возрастает.

Литература:

1. D. Missiakas and S. Raina. The extracytoplasmic function sigma factors: role and regulation. Mol Microbiol 1998 28(6):1059- - 18 - 4. Тепловой шок, фолдинг и деградация белков Тепловой шок является гомеостатическим ответом клетки на индуцированное стрессовыми условиями изменение конформации белков. Этот феномен свойственен всем организмам, и его молекулярный механизм практически идентичен у бактерий, архей и эукариот (но детали рассматривать мы будем все-таки у E.

coli). При повышении температуры клетка начинает синтезировать т.н. белки теплового шока, к которым прежде всего относятся молекулярные шапероны (DnaK, GroEL) и АТФ-зависимые протеазы (Lon, ClpAP). Эти белки выполняют две основные функции - обеспечивают фолдинг (сворачивание в нативную конформацию) и деградацию поврежденных белков. Несмотря на полную противоположность этих двух функций результат их осуществления один - ликвидация поврежденных (и потенциально опасных для клетки) белков. Цитоплазматические протеазы Рис. 4.1. Шаперонин GroELS по своей структуре напоминают шапероны - древние машины для фолдинга. И те, и другие распознают экспонированные гидрофобные участки неправильно свернутых или денатурированных белков.

Молекулярные шапероны Шапероны-шаперонины: разница Эти белки обеспечивают правильный фолдинг синтезируемых белков за счет энергии гидролиза АТФ. Они особенно важны у прокариот, где фолдинг обычно не является котрансляционным. Шапероны могут также вернуть в нормальную конформацию многие денатурированные белки (накапливающиеся при многих стрессах, включая тепловой шок), а также предотвращают агрегацию олигомеров и обеспечивают их разделение. Наконец, шапероны участвуют в секреции, поддерживая секретируемые белки в развернутом состоянии.

Шапероны из семейств Hsp70 и Hsp (аббревиатура из слов heat shock protein + мол.

масса) присутствуют в цитоплазме в наибольших количествах. Гомологом Hsp60 у E. coli является GroEL, формирующий гигантский комплекс с GroES, в центральной полости которого целиком может поместиться белок размером до 55 кДа (Рис. 4.1.).

Рис. 4.2. Рабочий цикл шаперонина GroE GroES-GroEL комплекс имеет существенное сходство с эукариотической 26S - 19 - протеосомой, ответственной за деградацию меченых убихитином белков.

У E. coli гомологом Hsp70 является DnaK, который образует комплекс с кошапероном DnaJ и белком GrpE (Рис. 4.3).

E. coli также имеет дополнительные шапероны, такие как SecB, ClpB и IbpAB, взаимодействующие с белками, являющимися плохими субстратами для шаперонов Hsp70 и Hsp60 семейств.

Почему белкам нужна помощь при фолдинге?

При фолдинге белки проходят через ряд промежуточных конформаций, имеющих более высокую энергию, чем конечная конформация (Рис. 4.4). Поэтому для многих белков существуют локальные энергетические минимумы, в которых частично свернутый белок может задержаться надолго (Рис. 4.5).

Белки, требующие помощи в фолдинге, опознаются аппаратом DnaK-DnaJ-GrpE, предположительно через находящиеся в контакте с раствором гидрофобные участки.

Молекулярный шаперон затем, гидролизуя АТФ, "перетасовывает" конформацию многих Рис. 4.3. Рабочий цикл шаперона DnaK оснований, фактически разворачивая белок и позволяя ему свернуться заново. Если нативная конформация не достигается таким путем, белок переходит в ведение шаперонина GroES-GroEL.

Полость шаперонина экранирует белок от контакта с раствором и другими субъединицами, предотвращая агрегацию и позволяя белку спокойно свернуться.

Специфичность шаперонов.

Ш. взаимодействуют предпочтительно с гидрофобными АК, хотя SecB предпочитает положительно заряженные. Неправильно свернутые или денатурированные белки опознаются по гидрофобным участкам, в норме экранированным от контакта с раствором либо внутри молекулы, либо путем контакта с гидрофобной областью другого белка или с мембраной. Недавно было показано, что DnaK опознает гидрофобный участок из 4-5 оснований, одним из которых является лейцин;

такой участок должен быть фланкирован основными АК. Такие участки встречаются в среднем через каждые 36 АК, обычно в экранированных участках молекулы.

Шапероны и протеолиз.

Роль шаперонов в протеолизе была продемонстрирована при изучении мутантов GroES-GroEL и DnaK - оказалось, что некоторые из них стабилизируют аномальные белки. Затем было обнаружено, что ряд цитоплазматических протеаз - ClpAP, ClpXP, HslVU - имеют одну субъединицу с активным сайтом для протеолиза, а вторую - с АТФ-зависимой шаперонной активностью. Кроме того, другие цитоплазматические протеазы, напр. HflB (FtsH), хоть и состоящие из одной полипептидной цепи, проявляют шаперонную активность в определенных условиях. Это свидетельствует о том, что АТФ зависимость цитоплазматических протеаз может отражать шаперонную активность, денатурирующую субстрат, что делает его доступным для протеазы. (В принципе никакой энергии для самого протеолиза не нужно, т.к. расщепление пептидной связи - экзотермическая реакция.) Другая возможная функция АТФ - индукция конформационных изменений, ведущих к мультимеризации некоторых протеаз.

Например, в отсутствие гидролиза АТФ протеаза ClpAP не может сформировать своей нормальной цилиндрической структуры, без чего ее взаимодействие с субстратами невозможно.

Широкая субстратная специфичность шаперонов и, предположительно, протеаз отражает их способность узнавать в норме спрятанные гидрофобные области плохо свернутых или денатурированных белков. Такая общность узнавания создает дилемму: взаимодействие с шаперонами - 20 - ведет к ренатурации или фолдингу, а взаимодействие с протеазами ведет к деструкции. Следовательно, клетка каким-то образом должна решить, по какому пути направить каждый поврежденный белок.

Сигналы для протеолиза обычно располагаются на карбокси-конце. Как правило, это короткие последовательности из или около того неполярных оснований.

Искусственное добавление таких "ярлыков" к стабильным в норме белкам делает их субстратами для протеаз. Недавно был обнаружен еще один "ярлык" такого рода.

Когда молекула мРНК внезапно обрывается посреди кодирующей последовательности в результате деградации либо просто в результате преждевременной терминации транскрипции, рибосома оказывается в состоянии с занятым пептидил-тРНК P-сайтом и свободным от кодона (и, соответственно, аминоацил-тРНК) A-сайтом (акцепторным сайтом). В этих условиях небольшая стабильная РНК, ssrA, действует сначала как аланил-тРНК, добавляя остаток аланина к пептиду, а затем как короткая мРНК, добавляя 10 неполярных аминокислот, за кодонами которых следует стоп. В результате образуется Рис. 4.4. Модель фолдинга короткого пептида пептид, несущий на своем карбокси-конце дополнительных АК, направляющих пептид на протеолиз ( в периплазме при помощи Tsr, а в цитоплазме - HflB или ClpXP протеаз). В случае же денатурированных или агрегированных белков, не имеющих специфического "ярлыка", вопрос о том, как клетка определяет их дальнейшую судьбу, остается открытым.

АТФ-зависимые протеазы В отличие от эукариот, где множественные системы мечения белков убихитином направляют различные субстраты к единственной цитоплазматической протеазе (26S протеазе), за распознавание субстрата у прокариот отвечают сами протеазы, поэтому их в клетке, как правило, несколько (порядка шести). Энергозависимые протеазы представляют собой, как правило, крупные олигомерные комплексы. Для всех протеаз этого класса с известной структурой протеазные сайты располагаются во внутренней камере олигомера, вход в которую слишком мал для большинства нативных (свернутых) белков. Поступление субстрата внутрь такой полости обеспечивается Рис. 4.5. Изменение свободной энергии в регульторными АТФазными доменами (или процессе фолдинга субъединицами). Не удивительно, что именно АТФазные субъединицы отвечают за субстратную специфичность. Аминокислотные последовательности АТФазных субъединиц разных - 21 - протеаз имеют сходство, которое может свидетельствовать о сходстве механизмов их действия.

Поскольку распознавание субстратов осуществляется регуляторными АТФазами, свойства субстратов, приводящие к их деградации, не зависят от свойств, необходимых для разрезания пептидных связей.

Как только белок распознается и связывается регуляторным АТФазным доменом, начинается последовательная деградация полипептидной цепи с разрезами через каждые 5-10 АК.

У E.coli известны 4 АТФ-зависимые протеазы.

ClpAP ClpXP.

У этих протеаз АТФазная и протеазная активность принадлежат разным субъединицам, и неудивительно, что эти субъединицы способны действовать самостоятельно (Рис. 4.6). ClpA и ClpX могут действовать как шапероны. Гены clpX и clpP составляют оперон, clpA расположен отдельно в моноцистронном опероне. Оба оперона имеют типичные промоторы теплового шока.

ClpYQ/HslUV HflB(FtsH) Рис. 4.6. АТФ-зависимые протеазы: шаперон и Zn и АТФ-зависимая протеаза, протеаза в одной молекуле участвующая в деградации цитоплазматических и мембранных белков, включая RpoH, SecY (часть аппарата секреции). Единственная АТФ-зависимая протеаза, существенная для жизни E. coli. В опероне с RpoH-зависимым промотором.

Lon.

Деградирует белок N фага, ингибитор клеточного деления SulA, позитивный регулятор биосинтеза капсулы RcsA и др.

Кроме специфических мишеней, Lon деградирует большинство аномальных белков E. coli. Белок – гомотетрамер, имеет сайты связывания с АТФ и ДНК, причем связывание с ДНК стимулирует протеазную активность.

Транскрибируется с промотора теплового шока. В белке можно выделить два домена – собственно протеазный с карбоксильного конца с сериновым остатком в активном сайте и следующий за ним АТФазный.

Экспериментально показано, что эти два домена могут быть экспрессированы как отдельные полипептиды, смесь которых функционально соответствует интактной протеазе Lon.

Регуляция синтеза белков теплового шока.

Шапероны и клеточные протеазы входят в состав регулона 32 вместе с другими белками теплового шока (Рис. 4.7). Кроме того, в состав уже рассмотренного нами ранее Рис. 4.7. Регуляция теплового шока у Escherichia регулона E входят периплазматическая coli протеаза и шаперон. В последнее время было выяснено, что эти два регулона взаимосвязаны, - 22 - т.к. комплекс кора РНК-полимеразы с E активирует транскрипцию гена rpoH, кодирующего 32, при экстремальных температурах (напр, 50°C). Многие протеобактерии имеют гомологи RpoH, и у них механизмы регуляции теплового шока являются схожими, тогда как грамположительные бактерии выработали другие, причем достаточно разнообразные, регуляторные стратегии для конкретных генов теплового шока.

У клеток E. coli, перемещенных с 30° на 42°, уровень внутриклеточного 32 резко (хотя и ненадолго) возрастает, усиливая транскрипцию с промоторов теплового шока. Возрастание концентрации 32 является результатом стабилизации обычно весьма нестабильного 32 и активации трансляции уже существующей мРНК rpoH. Поскольку быстрая деградация 32 зависит от шаперонного комплекса DnaK-DnaJ-GrpE, стабилизация происходит из-за того, что шаперон загружается огромным количеством индуцированных стрессом неправильных белков и его уже не хватает для обработки 32. В фазе адаптации, следующей за фазой индукции, синтез HSP снижается негативной обратной связью на нескольких уровнях экспрессии (трансляционная репрессия, дестабилизация и, возможно, инактивация 32). Количество шаперона DnaK-DnaJ в клетке невелико, поэтому он является весьма чувствительным средством мониторинга стрессов. В деградации 32 наибольшую роль играет, вероятно, связанная с мембраной АТФ-зависимая протеаза HflB (FtsH). Несколько цитоплазматических протеаз (HslVU, ClpAP и Lon), в норме отвечающих за деградацию аномальных белков, также способны деградировать 32. Таким образом внутриклеточные протеазы вместе с шапероном DnaK-DnaJ способны регулировать тепловой шок, контролируя внутриклеточную концентрацию аномальных белков. Шапероны, конечно, не деградируют 32 непосредственно. Вступая в ассоциацию с РНК-полимеразой, 32 стабилизируется и становится нечувствительной к протеолизу. Роль шаперонов заключается в предотвращении связывания 32 с РНК-полимеразой, что позволяет протеазам ее деградировать.

Индукция трансляции 32 происходит независимо не только от шаперонов, но и вообще от каких бы то ни было регуляторных белков. 5' область мРНК rpoH имеет уникальную вторичную структуру, закрывающую рибосомсвязывающий сайт. Эта структура стабильна при нормальной температуре, но денатурирует при ее повышении, что освобождает последовательность Шайн-Далгарно и позволяет инициировать трансляцию.

Транскрипция rpoH может инициироваться с четырех промоторов, один из которых зависит от E, и регулируется белком DnaA и комплексом cAMP-CRP. Когда клетки E. coli подвергаются воздействию очень высоких температур, синтез почти всех белков в клетке прекращается. Исключения составляют лишь несколько белков, включая членов регулона Е (32 - один из таких белков). Другими членами этого регулона являются периплазматические протеаза DegP (HtrA) шаперон (пептидил-пролил цис транс изомераза) FkpA, которые способствуют соответственно деградации и фолдингу поврежденных белков в периплазме. Мы уже рассматривали этот регулон раньше, поэтому пару слов о его регуляции при повышенной температуре. Как уже говорилось выше, активность E контролируется парой белков, RseA и RseB. Белок цитоплазматической мембраны RseA является анти-сигма фактором и репрессирует E регулон, связываясь с E и предотвращая его взаимодействие с промоторами. Периплазматический белок RseB взаимодействует с RseA и способствует инактивации E. Когда же в периплазме накапливаются аномальные белки, RseB с ними взаимодействует, освобождая RseA, что ведет к ослаблению связи последнего с E. Кроме того, важным результатом повышения температуры является изменение свойств мембраны - она становится более лабильной (становится "жиже"), что также способствует изменению конформации RseA, ослабляющему взаимодействие с E.

Регуляция теплового шока у грамположительных бактерий.

Регуляторные стратегии у этих бактерий существенно отличаются от таковых E. coli, хотя некоторые принципы остаются. У B. subtilis гены теплового шока могут быть разделены по крайней мере на три класса.

Гены первого класса (регулон CIRCE/HrcA) кодируют синтез основных шаперонов DnaKJ-GrpE и GroEL-GroES, и их экспрессия негативно контролируется репрессором HrcA, первым геном оперона dnaK. Действие этого репрессора осуществляется через связывание с оператором - инвертированным повтором CIRCE. Контроль этого регулона осуществляется при участии шаперонов, но, в отличии от контролируемой шапероном DnaKJ-GrpE деградации 32 у E. coli, здесь регуляторную функцию выполняет GroEL-GroES. Этот шаперон необходим для фолдинга HrcA, а титрование шаперона образующимися в стрессовых условиях аномальными белками приводит к снижению активности HrcA - 23 - и усилению экспрессии оперонов groE и dnaK. Таким образом, у грамположительных бактерий GroE, а не DnaK играет основную роль в регуляции теплового шока.

Репрессор HrcA и CIRCE-элементы быки обнаружены не только у грамположительных, но и у альфа-протеобактерий, цианобактерий, хламидий и спирохет, однако их роль в регуляции теплового шока варьирует.

Кo второму классу относится большая группа (50-100) генов, позитивно контролируемых сигма фактором общего стресса B, которые кроме тепла индуцируются еще и голоданием по глюкозе или кислороду. Этот сигма-фактор регулируется сложным каскадом белок-белковых взаимодействий (включая фосфорилирование).

К третьему классу относятся все остальные гены, не имеющие общей системы регуляции.

Литература:

1. Susan Gottesman. Proteases and their targets in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 1996. 30:465– 2. Susan Gottesman. Regulation by proteolysis: developmental switches. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:142– 5. Холодовой шок Многие бактерии достаточно часто Исходное состояние: 30°C подвергаются холодовому шоку, т.е.

воздействию температуры ниже оптимальной. Энтеробактерии, например, сталкиваются с этим стрессом при Стимул: шок при 10°C экскреции из организма животного, поэтому адаптация к холодовому шоку, обеспечивающая увеличение выживаемости этих бактерий в условиях Сенсор: рибосомы пониженной температуры, представляет явное селективное преимущество.

События, происходящие в бактериальной Сигнал: ингибирование трансляции клетке при понижении температуры, в корне отличаются от происходящих при тепловом шоке, но также влияют на клетку весьма отрицательно. Понижение Регулятор: CspA температуры не оказывает серьезного воздействия на клеточные белки (хотя их свойства и меняются, денатурации, в отличие от теплового шока, не Экспрессия генов холодового шока происходит). Гораздо более сильные изменения претерпевает мембрана клетки - ее твердость увеличивается (она фактически замерзает), что затрагивает все Синтез CspA, CsdA, Rbf и др. белков холодового шока связанные с мембраной функции. Клетка борется с этим путем снижения степени насыщенности мембранных липидов.

Аттенуация холодового шока белками CspA и CspE Холодовой шок также вызывает стабилизацию вторичных структур РНК и ДНК, что ведет к снижению эффективности процессов трансляции, Возврат в исходное состояние транскрипции и репликации ДНК. Клетка преодолевает негативные последствия холодового шока путем синтеза целого ряда Рис. 5.1. Модель регуляции холодового шока белков, получивших название белков - 24 - холодового шока (cold shock proteins, Csp).

Csp E. coli можно разделить на два класса. К первому относятся белки, практически отсутствующие у этих бактерий при 37°C и очень сильно индуцируемые при понижении температуры, ко второму - белки, присутствующие в клетке и при оптимальной температуре, но индуцируемые, хотя и не столь сильно (<10) при пониженной температуре.

К первому классу относятся белки CspA (основной белок холодового шока), CspB, CspG, CsdA, RbfA, NusA и PNP. CspA, CspB, CspG и CspI, действуют как шапероны для РНК и ДНК, CsdA - связанный с рибосомами белок, обладающий "раскручивающей" активностью по отношению к РНК (хеликаза), RbfA - рибосомсвязывающий фактор, NusA участвует в терминации и антитерминации транскрипции, а PNP - рибонуклеаза.

Ко второму классу относятся рекомбиназа RecA, фактор инициации трансляции IF-2, ДНК связывающий белок нуклеоида H-NS и субъединица ДНК гиразы GyrA.

Около 10% всего белка, синтезируемого в клетке непосредственно после понижения температуры, составляет CspA, основной белок холодового шока E. coli. Эта бактерия имеет еще 8 белков, гомологичных CspA - CspB - CspI, но не все из них индуцируются холодом. Четко показана индукция для CspA, CspB, CspG и CspI. Несмотря на конститутивные промоторы, экспрессия этих белков четко контролируется. Гены этих четырех белков имеют необычно длинные высоко консервативные нетранслируемые области на своем 5' конце (5' UTR). Показано, что эта область существенна для экспрессии cspA и содержит последовательность из 11 оснований, называемую "cold box". Эта последовательность - место транскрипционной "паузы", приводящей к аттенуации транскрипции cspA.

Причем регуляторной молекулой здесь является сам CspA. РНК-полимераза каким-то образом преодолевает терминаторный сайт непосредственно после понижения температуры, что ведет к усилению транскрипции cspA. Оказалось, что антитерминаторной молекулой является сам CspA, а также CspE и CspC, причем наиболее сильным антитерминатором из этих трех белков является CspE.

(Антитерминация в данном случае происходит просто в результате дестабилизации вторичных структур, в том числе и терминаторных шпилек, Csp белками. Никакого взаимодействия с РНК полимеразой и (или) Nus белками не наблюдается.) С другой стороны, накапливающийся CspA связывается со своей собственной РНК, вызывая аттенуацию, что ведет к последующему снижению концентрации белка в фазе адаптации. Кроме того, 5' UTR область отвечает за чрезвычайную нестабильность мРНК cspA при 37°, и эта же область необходима для стабилизации мРНК при понижении температуры. Oчень сильная стабилизация мРНК cspA непосредственно после понижения температуры (время полужизни ее увеличивается с 12 секунд до 20 минут) является еще одним механизмом регуляции концентрации белка CspA. Такая стабилизация является временной и прекращается, как только клетки адаптируются к пониженной температуре. (механизм стабилизации неясен) Экспрессия CspA регулируется также на уровне трансляции. Помимо последовательности Шайн Далгарно, мРНК cspA имеет дополнительную область, комплементарную самому концу 16S рРНК, расположенную на расстоянии 14 н.п. после инициирующего кодона, так называемый "downstream box" (DB). Такая последовательность была идентифицирована также у cspB, cspG, csdA и rbfA. Оказывается, при 15° рибосомы не могут нормально инициировать трансляцию. DB последовательность усиливает инициацию трансляции за счет дополнительного связывания с 16S рРНК. Гены, имеющие DB последовательность, обходятся без дополнительных рибосомных факторов, необходимых для инициации трансляции при пониженной температуре. Неудивительно, что такими факторами являются RbfA и CsdA. Таким образом, рибосомы являются физиологическим сенсором холодового шока - при понижении температуры они становятся неспособными инициировать трансляцию всех клеточных мРНК, за исключением мРНК белков холодового шока. Однако после фазы адаптации, в течение которой синтезируются дополнительные факторы инициации RbfA и CsdA, рибосомы снова становятся в состоянии транслировать все мРНК.

Не все гомологи белка CspA индуцируются при понижении температуры. CspD сильно индуцируется в стационарной фазе и при голодании по глюкозе, причем эта индукция не зависит от RpoS. CspC и CspE экспрессируются конститутивно при 37°. Очевидно, что это семейство гомологичных генов произошло от общего предшественника, однако последующая адаптация привела к приспособлению части гомологов для выполнения специфических функций.

- 25 - Из всех белков холодового шока третичная структура известна только для CspA. Этот белок представляет собой -бочонок, состоящий из 5 антипараллельных -слоев. Белок имеет два сайта связывания с РНК. Гидрофильные взаимодействия между белком и нуклеиновой кислотой осуществляются через 7 ароматических аминокислотных остатков, расположенных на поверхности молекулы белка. Белок в целом имеет негативно заряженную поверхность с положительно заряженными сайтами связывания нуклеиновых кислот. После связывания белка с РНК нуклеиновая кислота уже не сможет образовать вторичную структуру из-за электростатического отталкивания с поверхностью белка. Такая структура CspA является идеальной для его шаперонной активности.

Литература:

1. S. Phadtare, J. Alsina and M. Inouye. Cold-shock response and cold-shock proteins. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:175– 2. W. Bae, B. Xia, M. Inouye and K. Severinov. Escherichia coli CspA-family RNA chaperones are transcription antiterminators. PNAS 2000 97(14):7784– 3. S. Phadtare and M. Inouye. Sequence-selective interactions with RNA by CspB, CspC and CspE, members of the CspA family of Escherichia coli. Molecular Microbiology (1999) 33(5), 1004- 6. Сенсорные системы Для бактерий (как, впрочем, и для любого другого организма) способность координировать экспрессию генов с изменениями условий окружающей среды дает существенное селективное преимущество. Адаптация бактерий к изменяющимся условиям среды контролируется белковыми системами передачи сигнала. Такие системы состоят из белковых модулей-доменов, собранных в несколько молекул, количество которых варьирует в зависимости от вида бактерии и конкретного фактора среды. Основными компонентами сенсорных систем являются:

сенсоры (трансмембранные или цитоплазматические), детектирующие изменения окружающих условий;

внутриклеточные посредники, получающие информацию от сенсоров и передающие ее на эффекторы;

эффекторы - непосредственные регуляторы физиологического ответа (как правило, на уровне транскрипции).

Трансмембранные рецепторы.

Что и как детектируется?

Механизм детекции сигнала не совсем ясен.

Детектируемый сигнал может быть как вне-, так и внутриклеточным. В некоторых случаях показано, что сигнал детектируется периплазматическим доменом. Так, PhoQ - регулятор экспрессии факторов вирулентности у Salmonella typhimurium, - является сенсором дивалентных катионов, которые, связываясь непосредственно с периплазматическим доменом, стабилизируют неактивную конформацию PhoQ.

Сигнал может быть внутриклеточным. Рецептор Aer, участвующий в регуляции аэротаксиса, детектирует внутриклеточный запас энергии, связываясь с FAD. Еще один пример – детекция внутриклеточной концентрации глутамина при регуляции азотного метаболизма.

В ряде случаев показано, что сенсором является трансмембранный домен. Так, Cpx-путь активирован у мутантов E. coli, лишенных фосфатидилэтаноламина - таким образом, простое нарушение мембранной структуры приводит к активации этого сигнального пути. У белка EnvZ E. coli - гистидинкиназы, участвующей в осморегуляции, периплазматический домен может быть делетирован без потери сенсорной функции.

Механизм передачи сигнала.

Многие бактериальные рецепторы имеют периплазматический домен-детектор (P) и цитоплазматический сигнальный домен (C), заякоренные в мембране двумя -спиральными - 26 - трансмембранными сегментами. Линейная структура таких белков может быть представлена как TM1– P–TM2–L–C, где L - цитоплазматический линкер Сигнальный домен либо сам является гистидинкиназой (EnvZ) либо с гистидинкиназой взаимодействует (MCP рецепторы хемотаксиса).

Механизм передачи сигнала с сенсорного на сигнальный домен неясен. Рецепторы обычно являются мембранными белками, гомодимерами. Предполагалось, что конформационные изменения, возникающие при связывании субстрата, передаются через мембрану на цитоплазматические домены рецептора, что влияет на взаимодействие сигнальных доменов между собой. Однако делеция одного из двух сигнальных доменов (равно как и удаление всех трансмембранных сегментов) у димера не лишает его активности.

Двухкомпонентные системы В конце 80-х слово "двухкомпонентные" было использовано для обозначения нового класса регуляторных систем, найденных у бактерий. На сегодняшний день описаны сотни таких систем у бактерий, архей и некоторых эукариот. Двухкомпонентные системы выступают в качестве основного механизма сопряжения реакции со стимулом, позволяющего организмам реагировать на многие изменения условий окружающей среды. Эти сигнальные системы достаточно сложны и характеризуются модульной организацией, хорошо адаптированной ко многим клеточным сигнальным путям и интегрированной с ними.

Стимул Типичная ГК ГК двухкомпонентная система ЦМ состоит из двух белков – гистидиновой протеинкиназы Автофосфорилирование (ГК), содержащей H-P H консервативный киназный домен ATP ADP и регулятора ответа (РО), содержащего консервативный Фосфатаза (ATP) регуляторный домен. Киназа Внеклеточные сигналы Дефосфорилирование детектируются ГК, что приводит РО D РО РО D D-P к изменению ее активности. Фосфорилирование Затем ГК передает фосфогруппу P i на РО (реакцию катализирует сам РО). Перенос фосфата на РО Ответ приводит к активации эффекторного домена этого белка, что и вызывает в конечном Рис. 6.1. Модель двухкомпонентной регуляторной системы итоге специфический ГК- гистидинкиназа, РО – регулятор ответа, H – консервативный физиологический ответ.

гистидиновый остаток ГК, D – консервативный остаток аспарагиновой кислоты РО В основе работы двухкомпонентной системы лежат три реакции, дающие два фосфорилированных продукта:

1. Автофосфорилирование ГК:

ГК-His + АТФ ГК-His~Ф + АДФ 2. Перенос фосфата:

ГК-His~Ф + РО-Asp ГК-His + РО-Asp~Ф 3. Дефосфорилирование:

РО-Asp~Ф + H2O РО-Asp + PI - 27 - -фосфат из АТФ сначала переносится на боковую цепь консервативного гистидинового остатка ГК (1). Затем РО катализирует перенос фосфата от фосфогистидина на аспартатный остаток своего регуляторного домена (2). Наконец, фосфат переносится от фосфоаспартата к воде в реакции гидролиза (3).

Хоть ГК и похожи по своей основной функции (фосфорилирование белков) на "классические" Ser/Thr/Tyr киназы, химизм реакции принципиально отличается – ГК образует не фосфоэфирную, а фосфоамидную связь. Реакция гидролиза фосфоамидной связи имеет гораздо большее отрицательное значение G по сравнению с гидролизом фосфоэфирной связи, поэтому равновесие р-и (1) сдвинуто в сторону нефосфорилированного белка ГК. Следовательно, только очень небольшой процент ГК существует в фосфорилированном виде => не фосфорилирование ГК как таковое, а перенос фосфата является основным в работе этого фермента. Богатая энергией связь N~P идеально подходит для передачи фосфата. Именно поэтому такая же связь используется хорошо знакомыми вам ферментами I и II ФТС, основной функцией которых является также не фосфорилирование как таковое, а передача фосфата "по цепочке" в направлении его конечного акцептора – фосфорилируемого сахара.

В молекуле РО фосфорилируется остаток аспартата. Предположительно, именно этот остаток используется, т.к. фосфорилирование его длинной ацильной цепи вызывает протяженные конформационные изменения в молекуле РО, необходимые для изменения эффекторной активности.

Еще одним важным свойством фасфоаспартата является быстрый гидролиз ацилфосфата как в кислой, так и в щелочной среде. К тому же, многие РО имеют автофосфатазную активность, еще более уменьшающую время полужизни фосфоаспартата.

Таким образом, основным результатом выбора для фосфорилирования специфических остатков в молекулах ГК и РО является высокая мобильность системы. При отсутствии стимула оба компонента будут дефосфорилированы. Детекция стимула гистидинкиназой вызовет ее фосфорилирование и очень быструю передачу фосфата молекуле регулятора ответа, что приведет к быстрому ответу бактерии на изменившиеся условия. В свою очередь, легкость дефосфорилирования молекулы РО приведет к быстрому возвращению всей регуляторной системы, а вместе с ней и метаболизма бактериальной клетки, в исходное (нефосфорилированное) состояние при исчезновении стимула, вызвавшего первоначальное фосфорилирование ГК.

Распространенность двухкомпонентных систем Двухкомпонентные сигнальные системы с участием фосфорилируемых остатков гистидина и аспартата наиболее часто встречаются у бактерий. Несмотря на обнаружение таких систем у эукариот, здесь в сигнальных цепях доминируют сигнальные каскады с переносом фосфата между остатками серина, треонина и тирозина. С друкой стороны, Ser/Thr/Tyr киназы у прокариот тоже имеются. Пока нет удовлетворительного объяснения предпочтительному использованию той или иной системы у про- и эукариот. Количество генов, кодирующих белки двухкомпонентных систем, значительно варьирует в геномах различных организмов – от 0 у Mycoplasma genitalium до 2.5% генома у Synechocystis sp. В полностью сиквенированных геномах общее количество ГК и РО следующее:

Mycoplasma genitalium – Haemophilus influenzae – Helicobacter pylori – Thermotoga maritima - Escherichia coli – Bacillus subtilis - Synechocystis sp. – --------------- Methanococcus jannaschii – Methanobacterium thermoautotrophicum - --------------- Caenorhabdis elegans – Saccharomyces cerevisiae – 4 (одна система) У эукариот пока описаны лишь единичные примеры ГК и РО, однако у некоторых организмов их число больше – так, у слизевика Dictyostelium discoideum имеется как минимум 11 ГК. Кроме того, эукариотические системы имеют ряд отличий от прокариотических. Прежде всего, гибридные ГК, - 28 - содержащие и РО домен, редки у прокариот (5 из 30 ГК у E. coli), тогда как у эукариот все описанные ГК гибридные (с пока единственным исключением). Прокариотические РО являются, как правило, транскрипционными факторами, тогда как только один из описанных пока эукариотических РО имеет ДНК-связывающий домен.

Структура и функции гистидиновых протеинкиназ У типичных двухкомпонентных систем сенсорные ГК "следят" за внешними стимулами и передают полученную информацию РО путем его фосфорилирования. ГК, как правило, содержит две основных "части" – характеризующуюся большим разнообразием сенсорную и консервативную киназную. Общая активность киназы модулируется сигналами, детектируемыми сенсорным доменом.

ГК претерпевает АТФ-зависимое автофосфорилирование по инвариантному гистидиновому остатку, расположенному в киназном же домене. ГК – димер, причем в реакции автофосфорилирования один мономер ГК фосфорилирует консервативный гистидиновый остаток другого. В отличие от типичных киназных каскадов, в которых одна киназа имеет множество мишеней, в случае двухкомпонентных систем РО стехиометрически переносит фосфат с фосфо-ГК на консервативный Asp своего регуляторного домена. К тому же многие ГК имеют фосфатазную активность, позволяющую им дефосфорилировать свой РО. Такие ГК используются при необходимости быстро "выключать" сигнальную цепочку.

ГК исключительно разнообразны, и Сенсорный домен Каталитический домен все это разнообразие было создано за G N H N D F C счет простых комбинаций сенсорных, каталитических и вспомогательных N H N D F G C доменов (Рис. 6.2). Модульная структура этих белков позволяет адаптировать свойства каждой ГК к специфическим G N H N D F C (a) нуждам конкретной сигнальной системы.

Различные ГК имеют размер в пределах Принимающий Эффекторный домен Класс 40-200 kDa. Более крупные ГК могут OmpR D13 D57 K109 Связывание ДНК состоять из 5-6 структурно и функционально различных доменов.

Связывание ДНК FixJ D13 D57 K Несмотря на такое разнообразие ГК могут быть разделены на два больших Связывание ДНК NtrC D13 D57 K109 АТФаза класса: классические и гибридные.

Метилэстераза/ D13 D57 K109 CheB/SprE деградация Наиболее "традиционные" ГК, например, осмосенсор EnvZ из E. coli, D13 D57 K109 CheY действуют как мембранные рецепторы с (b) сенсорным доменом, расположеным в периплазме. EnvZ имеет две Рис. 6.2. Доменная организация гистидинкиназ (a) и трансмембранных -спирали, которые регуляторов ответа (b).

разделяют белок на периплазматический Серыми овалами обозначены трансмембранные домены.

аминоконцевой сенсорный домен и Консервативные участки каталитических доменов цитоплазматический карбоксиконцевой обозначены буквами.

киназный домен. Другие ГК могут иметь больше трансмембранных сегментов (до 4-8) или не иметь их вовсе (киназы хемотаксиса CheA и азотного регулона NtrB). В последнем случае ГК являются цитоплазматическими и детектируют внутриклеточные изменения (непосредственно либо в результате взаимодействия с цитоплазматическими регуляторными белками).

ГК, принадлежащие ко второму классу, гибридных ГК, имеют множественные донорные и акцепторные сайты для передачи фосфата. Вместо одного акта передачи фосфата гибридные ГК используют многоступенчатые схемы "ретрансляции" сигнала фосфорилирования. Сложность общей структуры гибридных ГК позволяет иметь несколько "входов", а иногда и "выходов" для одного сигнального пути. Типичным представителем гибридных ГК является белок ArcB, регулятор активности ряда генов в анаэробиозных условиях. ArcB имеет два N-концевых трансмембранных сегмента, за которым следуют киназный домен, затем домен, сходный с регуляторным у РО и, наконез, - 29 - второй гистидинсодержащий домен, называемый HPt-домен (от His-containing phosphotransfer – гистидинсодержащий фосфатпереносящий) Каталитическое киназное ядро.

Унифицирующим структурным свойством семейства ГК является характерное киназное ядро, состоящее из домена димеризации и АТФ/АДФ-связывающего фосфотрансферного или каталитического домена.

Киназное ядро имеет размер ~350 АК и отвечает за связывание АТФ и осуществление киназной реакции. Консервативный остаток гистидина, являющийся субстратом киназной реакции, располагается в домене димеризации.

HPt-домены у прокариот встречаются исключительно в составе гибридных киназ, тогда как у эукариот – как отдельные белки. Эти домены имеют размер около 120 АК и содержат остаток гистидина, способный участвовать в фосфотрансферных реакциях. HPt-домены не имеют ни киназной, ни фосфатазной активности, поэтому они идеально приспособлены для коммуникации между различными белками.

Интересно, что при всем разнообразии первичных последовательностей HPt-доменов их третичная структура очень схожа и напоминает таковую домена димеризации киназного ядра, включая расположение консервативного гистидинового остатка.

Сенсорный домен Изменения в окружающей среде детектируются непесредственно (или опосредованно) аминоконцевым сенсорным доменом ГК. Между разнообразными мембранными сенсорными доменами практически полностью отсутствует сходство на уровне первичной последовательности, что поддерживает идею о специфичности детектируемых ими взаимодействий. В большинстве случаев специфический стимул и механизм его детекции остаются неизвестными. Информация о трехмерной структуре этих доменов начинает появляться только сейчас, поэтому как сигнал передается к киназному ядру, пока не ясно.

Примером цитоплазматических сенсоров являются PAS-домены. Эти универсальные модули "чувствуют" изменения освещенности, окислительно-восстановительного потенциала, концентрации кислорода и небольших лигандов. Имя домена происходит от первых букв названий трех эукариотических белков, в которых он был впервые обнаружен. С доменом обычно связана одна из нескольких простетических групп, которые как раз и определяют распознавание разнообразных сигналов. Такими кофакторами могут быть, например, гем, ФАД, ФМН и т.д. PAS-домены имеют небольшой размер (~100 АК) и располагаются перед (ближе к N-концу) киназным ядром, как правило, после одной или нескольких пар трансмембранных сегментов. Таким образом, цитоплазматические сенсоры с PAS-доменами тоже являются мембранными белками. Однако имеются и не связанные с мембраной цитоплазматические сенсоры, например, NtrB, участвующий в регуляции азотного метаболизма.

(более подробно о снсорных доменах и механизме работы трансмембранных сенсорных ГК поговорим в разделе о хемотаксисе).

Линкерный домен У трансмембранных ГК периплазматический сенсорный домен соединяется с цитоплазматическим киназным ядром при помощи трансмембранной -спирали и цитоплазматического линкера. Линкерные домены совершенно необходимы для нормального функционирования сенсорных ГК, однако об их функциях известно немного. Размер линкеров варьирует в пределах 40-180 АК. Многие из них имеют характерный -спиральный coiled coil мотив, в большинстве случаев предшествующий фосфорилируемому гистидиновому остатку киназного ядра. Две наиболее вероятные функции линкерных доменов – правильное расположение мономеров в димере ГК и передача сигнала от сенсорной к киназной части белка.

Структура и функции регуляторов ответа Активности и структура У большинства прокариот РО – конечное звено сигнального пути, функционирующее как зависящий от фосфорилирования "выключатель" адаптивного ответа. РО катализирует перенос фосфата от фосфогистидина ГК к консервативному остатку аспартата в своем регуляторном домене.

Большинство РО также катализируют автодефосфорилирование, что ограничивает время пребывания - 30 - белка в активированном состоянии. Фосфорилирование РО приводит к его конформационному изменению, затрагивающему значительную часть поверхности РО. Изменение поверхности позволяет происходить новым внутри- и межмолекулярным взаимодействиям, которые и вызывают адаптивный ответ. Такой принцип работы РО делает возможным многообразные регуляторные механизмы, оптимизированные для различных эффекторных функций в различных системах.

Большинство РО состоит из двух доменов: консервативного аминоконцевого регуляторного и варьирующего карбоксиконцевого эффекторного. Большинство РО являются транскрипционными факторами с ДНК-связывающими эффекторными доменами (25 из 32 РО у E. coli). ДНК-связывающие домены могут быть разделены на три группы, представленные OmpR, NarL и NtrC (соответственно 14, и 4 члена). Не все РО имеют ДНК-связывающие домены. Карбоксиконцевые домены некоторых РО являются ферментами, как, например, метилтрансфераза CheB, участвующая в хемотаксисе. Некоторые РО вообще лишены эффекторного домена. Примером такого белка является опять же белок хемотаксиса CheY, который функционирует путем взаимодействия с эффекторным белком FliM, компонентом жгутикового мотора.

Регуляторный домен.

Наиболее консервативная часть белка. содержит кластер остатков аспартата, которые связывают Mg2+ и формируют активный сайт для переноса фосфата Эффекторный домен Эффекторным доменам сложно дать общую характеристику по причине их большого разнообразия. Большинство эффекторных доменов имеет ДНК-связывающую активность и действиет путем активации или репрессии транскрипции специфических генов. Тем не менее, узнаваемые последовательности ДНК, расположение сайтов связывания и механизм транскрипционной регуляции существенно различаются, даже у РО из одного подсемейства.

OmpR, детально охарактеризованный представитель самого большого подсемейства РО, действует и как активатор, и как репрессор, дифференциально регулируя экспрессию генов ompC и ompF, кодирующих порины внешней мембраны. Димеры OmpR последовательно связываются с F и C боксами, предшествующими пориновым генам. Белки-представители этого семейства связываются с ДНК посредством характерного мотива "крылатая спираль", состоящего из распознающей спирали, взаимодействующей с большой бороздкой в ДНК, и двух петель, или крыльев, по обе стороны спирали, которые взаимодействуют с малой бороздкой.

Второе подсемейсво РО представляет NarL, – транскрипционный фактор, который и активирует, и репрессирует гены, участвующие в метаболизме нитрита и нитрата. NarL связывается со множественными "NarL гептамерами" – сайтами связывания – путем типичного HTH мотива.

Наиболее сложное как структурно, так и функционально подсемейство РО представлено регулятором азотного метаболизма NtrC – энхансером транскрипции, активирующим содержащий холофермент РНК-полимеразы. Эффекторная область белков этого подсемейства состоит из двух доменов – АТФазного и ДНК-связывающего HTH домена. Способные связываться с ДНК димеры NtrC после фосфорилирования олигомеризуются в октамеры. Олигомеризация стимулирует гидролиз АТФ что дает энергию для образования открытого комплекса и активации транскрипции.

Активация фосфорилированием.

Большое разнообразие эффекторных доменов ставит вопрос о том, как консервативный регуляторный домен может изменять активность таких разнообразных эффекторных доменов.

Регуляторные домены РО существуют в виде находящейся в состоянии равновесия смеси активной и неактивной форм. Фосфорилирование регуляторного домена сдвигает равновесие в сторону активной формы, которая имеет существенно отличную поверхность. Различные молекулярные поверхности двух форм могут способствовать специфическим белок-белковым (или белок-ДНК) взаимодействиям.

Поэтому любой тип регуляции, кототрый может быть осуществлен за счет меж- или внутримолекулярных взаимодействий, может использоваться семейством РО.

Соответственно существуют различные механизмы активации РО. Каждый механизм основан на специфических регуляторных взаимодействях присущих фосфорилированному и(или) нефосфорилированному регуляторному домену. В некоторых случаях активация происходит за счет снятия ингибирования. При этом РО обычно можно активировать путем делеции регуляторного домена.

В других случаях фосфорилированный регуляторный домен играет активную роль. Фосфорилирование - 31 - может способствовать взаимодействию с другими белками либо ди- или олигомеризации. Так, связывание OmpR с соседними операторными участками усиливается при взаимодействии его субъединиц между собой, которое усиливается при фосфорилировании;

фосфорилирование NtrC способствует его олигомеризации в энхансерной области, что активирует транскрипцию. Некоторые белки используют комбинацию этих механизмов. Фосфорилирование обычно соответствует активации, но есть и исключения.

Для двух РО с известной структурой известен точный механизм ингибирования эффекторного домена нефосфорилированным регуляторным доменом. В нефосфорилированном состоянии регуляторный домен экранирует активный сайт эффекторного домена, не давая последнему взаимодействовать с субстратом, каковым может являться ДНК (в случае транскрипционного фактора NarL) либо белок (рецептор хемотаксиса в случае метилэстеразы CheB, о которой мы поговорим чуть позже). Для обоих белков активация происходит за счет взаимного перемещения N- и C-концевых доменов в результате индуцированных фосфорилированием конформационных изменений.

Недавно определенные структуры фосфорилированных регуляторных доменов нескольких белков подтверждают, что фосфорилирование вызывает протяженные структурные изменения, затрагивающие молекулярмую поверхность регуляторного домена. Фосфорилирование не изменяет общую третичную структуру и не вызывает существенных изменений во вторичной структуре. Единственным результатом фосфорилирования являются незначительные (на пару ангстрем) перемещения элементов вторичной структуры, которые, тем не менее, оказывают существенное влияние на молекулярную поверхность, изменяя ее топологические и электростатические характеристики.

Индуцированные фосфорилированием конформационные изменения затрагивают большую поверхность регуляторного домена, которая может быть использована во взаимодействиях со многими мишенями. И действительно, многие РО взаимодействуют с несколькими молекулами – ГК, вспомогательные фосфатазы, эффекторные домены, другие регуляторные домены в составе димеров и, возможно, компоненты транскрипционного аппарата.

Архитектура регуляторных систем Элегантность двухкомпонентвых систем заключается в их модулярности. Простейшая сигнальная система может состоять из одной пары ГК-РО. В более сложных случаях домены, входящие в состав ГК и РО, а также HPt-домены могут комбинироваться, образуя уже сигнальную цепочку или даже сеть, известную под назнанием фосфотрансляционная система (система передачи фосфата). Классические двухкомпонентные системы доминируют у прокариот, тогда как фосфотрансляционные системы чаще встречаются у эукариот (хотя прокариотические примеры тоже имеются). Дополнительная сложность фосфотрансляционных систем позволяет ввести дополнительные стадии контроля а также возможность взаимодействия между различными сигнальными путями.

Большинство регуляторных систем устроены просто. Трансмембранная сенсорная ГК посредством одной реакции передачи фосфата активирует цитоплазматический РО, который вызывает ссответствующий адаптивный ответ. Типичным примером такой системы, использующей единичный перенос фосфата от His к Asp, является осморегуляторрная пара EnvZ-OmpR, контролирующая экспрессию поринов внешней мембраны OmpF и OmpC. Есть и вариации на эту тему, когда несколько ГК могут фосфорилировать один РО или одна ГК контролирует несколько РО, но в любом случае для таких простых систем имеет место только один акт передачи фосфата в направлении His -> Asp.

Например, в системе контроля хемотаксиса одна ГК CheA фосфорилирует два РО, CheB и CheY. Еще более сложная ситуация встречается в системе контроля нитрат/нитрит-реагирующих генов, в которй две ГК, NarX и NarQ, контролируют два РО, NarL и NarP.

Фосфотрансляционные системы Еще более усложненные версии двухкомпонентных систем используют более одного акта передачи фосфата. Такие сигнальные пути называют фосфотрансляционными системами (системами передачи фосфата). В простейшем случае фосфотрансляционная система удлиняет цепочку передачи фосфата на два шага, Asp -> His и His -> Asp. Таким образом, базовая фосфотрансляционная система имеет уже четыре фосфорилированных белковых продукта и пять реакций переноса фосфата:

1. Автофосфорилирование ГК:

ГК-His1 + АТФ ГК-His1~Ф + АДФ - 32 - 2. 1-й перенос фосфата:

ГК-His1~Ф + РО1-Asp ГК-His1 + РО-Asp1~Ф 3. 2-й перенос фосфата:

РО-Asp1~Ф + HPt-His2 РО-Asp1 + HPt-His2~Ф 4. 3-й перенос фосфата:

HPt-His2~Ф + РО-Asp2 HPt-His2 + РО-Asp2~Ф 5. Дефосфорилирование:

РО-Asp2~Ф + H2O РО-Asp2 + PI В этой схеме в качестве фосфорилируемых субстратов используются домены, содержащие консервативные остатки гистидина и аспартата. Эти домены могут существовать как изолированные белки или же быть соединенными ковалентно, как это имеет место в случае уже описанных гибридных гистидинкиназ.

Pages:     || 2 | 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.