WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Метод полимеразных цепных реакций (ПЦР) с каждым годом все шире применяется в клинической практике. В последние десять лет он перешел из раз ряда уникальных методов, доступных только элитным клиникам, в

разряд высо коточных, но доступных исследований.

Все это время за ПЦР-исследованиями шествует шлейф «мифов и преда ний», распространяемых теми, кто «слышал звон, да не знает где он», т. е. людь ми, не имевшими возможности на практике пользоваться ПЦР-исследованиями.

Попытаемся развеять некоторые из них.

Миф ПЦР-исследования столь чувствительны, что дают много лож ноположительных реакций, особенно при выявлении мико плазм, уреаплазм, гарднерелл и т. п.

Реалии Чувствительность ПЦР — параметр вполне регулируемый, и ре гулируется он количеством циклов амплификации. Так, хлами дии выявляются после 42-45 циклов, уреаплазмы и микоплаз мы — после 30-32 циклов (что соответствует чувствительности 104 КОЕ/мл), лактобактерии — после 20 циклов амплификации (что соответствует 106 КОЕ/мл).

Миф В ПЦР-исследованиях легко возникает контаминация — пере крестное загрязнение проб от положительных образцов, что также ведет к ложноположительным результатам.

Реалии Контаминация в ПЦР теоретически произойти, конечно же, мо жет, но ее частота весьма мала. Поскольку риск контаминации был известен давно, его учли при проектировании ПЦР-лабора торий, создании аппаратуры и тест-систем.Современная ПЦР лаборатория надежно разделяет различные зоны проведения анализа, ламинарные шкафы создают чистый незагрязненный воздух, а фасованные в пробирки в заводских условиях реаген ты сводят риск контаминации к минимуму.

Миф ПЦР не признан никакими нормативными документами Реалии ПЦР-исследования широко вошли в список рекомендуемых те стов в рекомендациях ЦНИКВИ в 2002 г., в рекомендациях ге патологов МЗ РФ. Большинство реагентов для ПЦР-исследова ний зарегистрированы и разрешены МЗ РФ.

Где же с наибольшей эффективностью работают все плюсы этого метода?

1. Диагностика инфекций, передающихся половым путем (лидер сре ди ПЦР-исследований).

2. Диагностика вирусных инфекций — вирусные гепатиты (А, В, С, D, E, G, TTV), ВИЧ, вирус клещевого энцефалита, инфекции, вызываемые ви русами герпеса различных типов и т. п.

3. Диагностика инфекционных заболеваний, вызываемых плохо культивируемыми возбудителями — боррелия лайма, легионелла, некоторые виды сальмонелл и т. п.

4. Диагностика врожденных, генетически обусловленных заболева ний (в т. ч. еще до рождения ребенка).

5. Быстрая диагностика особо опасных инфекций.

6. Определение пола плода на ранних сроках беременности.

7. Идентификация личности.

Этот список увеличивается с большой скоростью.

1. Подготовка пациента За 10 дней до взятия материала на исследование необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Материал для исследования у женщин следует брать перед менструацией или через 1-2 дня после ее оконча ния. Перед взятием материала необходимо воздержаться от мочеиспускания (в течение 3-4 часов) и половых сношений. Женщины накануне обследования не должны проводить туалет наружных половых органов и спринцевание. Исследу емый материал должен быть без примесей крови. Не следует для исследования брать свободно стекающие уретральные выделения. Секрет простаты следует брать только после окончания острых явлений простатита.

2. Особенности получения материала для ПЦР-исследований 2.1. Особенности взятия материала из уретры • перед взятием материала пациенту рекомендуется воздержаться от мо чеиспускания в течение 1,5-2 часов;

• непосредственно перед взятием материала наружное отверстие уретры необходимо обработать тампоном, смоченным стерильным физиологи ческим раствором;

• при наличии гнойных выделений соскоб рекомендуется брать через 15 20 мин. после мочеиспускания, при отсутствии выделений необходимо провести массаж уретры с помощью зонда для взятия материала;

• у женщин перед введением зонда в уретру проводится ее массаж о лоб ковое сочленение;

• в уретру у женщин зонд вводится на глубину 1,0-1,5 см, у мужчин — на 3 4 см, и затем делается несколько вращательных движений;

• у детей материал для исследования берут только с наружного отверстия уретры.

После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда, либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают, пробирка закрывает ся и маркируется, и в таком виде доставляется в лабораторию.

2.2. Особенности взятия материала из цервикального канала • перед взятием материала необходимо удалить ватным тампоном слизь и затем обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором;

• зонд вводится в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см;

• при наличии эрозий цервикального канала необходимо их обработать стерильным физиологическим раствором, материал следует брать на границе здоровой и измененной ткани;

• при извлечении зонда необходимо полностью исключить его касание со стенками влагалища.

После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда, либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают, пробирка закрывает ся и маркируется, и в таком виде доставляется в лабораторию.

2.3. Особенности взятия материала из влагалища Материал должен быть взят до проведения мануального исследования. Зер кало перед манипуляцией можно смочить горячей водой, применение антисеп тиков для обработки зеркала противопоказано. Влагалищное отделяемое соби рают стерильным одноразовым зондом из заднего нижнего свода или с патоло гически измененных участков слизистой.

После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда, либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают, пробирка закрывает ся и маркируется, и в таком виде доставляется в лабораторию.

2.4. Особенности взятия секрета предстательной железы Перед взятием секрета простаты головка полового члена обрабатывается стерильным ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором. Се крет простаты берется после предварительного массажа простаты через пря мую кишку. Врач проводит массаж с надавливанием несколькими энергич ными движениями от основания к верхушке. Затем из кавернозной части вы давливается простатический секрет, который собирается в стерильную емкость (сосуды с широким горлом, пробирки). После взятия секрета проста ты он должен быть доставлен в лабораторию в течение 1-3 часов. Транспор тировка биологического материала должна производиться только в сумке холодильнике.

2.5. Особенности взятия (сбора) мочи Мочу собирают утром натощак после сна или не ранее чем через 2-3 часа по сле последнего мочеиспускания.

При сборе мочи желательно использовать широкий сосуд с крышкой, по воз можности собирать мочу сразу в посуду, в которой она будет доставлена в лабо раторию. Минимальный объем мочи, необходимый для проведения анализа, составляет 20 мл.

Если в лабораторию доставляется не вся собранная моча, то перед тем, как часть мочи сливается в посуду для транспортировки, ее необходимо тщательно взболтать.

Собранную мочу доставляют в лабораторию в течение 1-3 часов без дополни тельного охлаждения. Длительное хранение мочи при комнатной температуре до исследования приводит к изменению не только ее физических свойств и к разрушению клеток, но и к размножению бактерий.

2.6. Особенности взятия материала с конъюнктивы глаз При наличии обильного гнойного отделяемого его убирают стерильным ват ным тампоном, смоченным физиологическим раствором.

Соскоб берут с внутренней поверхности нижнего века движением к внутрен нему углу глазной щели. При взятии соскоба необходимо придерживать веко ру ками, чтобы при моргании ресницы не касались зонда.

После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда, либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают, пробирка закрывает ся и маркируется, и в таком виде доставляется в лабораторию.

2.7. Особенности взятия материала с задней стенки глотки Одноразовый зонд вводят за мягкое небо в носоглотку и проводят по задней стенке глотки.

Если целью исследованию стоят миндалины, то лучше вводить зонд в лакуны миндалин и ротировать там.

После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда и доставляют в ла бораторию.

Либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают.

Пробирка закрывается и маркируется.

2.8. Особенности взятия мазка из носоглотки Взятие мазка проводится натощак или не ранее, чем через 2-4 часа после еды. При взятии материала необходимо хорошее освещение, пациент сидит про тив источника света, корень языка придавливают шпателем, материал берут сте рильным зондом, не касаясь языка, слизистой щек и зубов.

После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда, либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают, пробирка закрывает ся и маркируется, и в таком виде доставляется в лабораторию.

2.9. Мазки из зубодесневых карманов.

Мазки из зубодесневого кармана собираются в стерильную пробирку (типа эппендорф) с физиологическим раствором. В этом случае пробирки могут хра ниться в холодильнике (+4… 6°С) не более 12 часов, а их транспортировка осу ществляется в сумке-холодильнике.

Можно брать мазки и жесткими уретральными зондами. В этом случае зонд после взятия материала помещают в его одноразовую упаковку, и в таком виде доставляют в лабораторию.

2.10. Особенности сбора слюны За 12 часов до взятия (сбора) слюны исключается прием пищи, алкоголя и ле карственных препаратов. Непосредственно перед сбором слюны необходимо ис ключить использование зубной пасты и удалить зубные протезы.

Перед тем, как собрать слюну, необходимо почистить зубы без зубной пас ты, затем хорошо прополоскать рот без использования раздражающих средств.

Далее, общую слюну (смешанную) выплевывают изо рта или отсасывают со дна рта одноразовым шприцем и переносят в пробирку (типа эппендорф). Слюна может храниться в холодильнике (+4…6°С) не более 12 часов, а ее транспорти ровка осуществляется в сумке-холодильнике.

2.11. Венозная кровь Кровь на исследование желательно брать натощак. Венозная кровь в коли честве 2-2,5 мл отбирается в стерильную пробирку объемом 5 мл. Пробирка с кровью может храниться в холодильнике (+4…6°С) не более 24 часов. Пробир ку не замораживать (исследование проводится из сыворотки).

Непосредственно перед взятием крови участок кожи над пунктируемой ве ной с особой тщательностью обрабатывается ватным тампоном с 70° спиртом, затем тампоном с 10% раствором йода от центра к периферии. Перед взятием крови дезинфицирующее средство должно испариться с поверхности кожи.

Нельзя пальпировать вену в месте пункции. После взятия крови удаляют следы йода тампоном с 70° спиртом во избежание возможного воспаления кожи.

Для взятия крови необходимо пользоваться шприцами для одноразового пользования либо системами вакуумного взятия крови — Vacuette, Vacutainer.

Освобождение шприцев из упаковки производится непосредственно перед взя тием крови.

3. ПЦР в клинической практике: диагностика ИППП Для специальностей: акушерство и гинекология, урология и андрология, дерматовенерология, педиатрия 3.1. Урогенитальный хламидиоз 3.1.1. Краткая информация о возбудителе Урогениталыные хламидиозы по распространенности занимают важное ме сто среди ИППП, а их последствия в виде трубного бесплодия и эктопической бе ременности у женщин, нарушения сперматогенеза у мужчин оказывают суще ственное влияние на репродуктивное здоровье населения.

Наряду с характерным течением заболевания, часто встречаются атипичные и бессимптомные формы хламидийной инфекции, представляющие трудности в диагностике.

Хламидии (Chlamidia)— мелкие грамотрицательные неподвижные облигатно паразитические бактерии, основными морфологическими формами которых яв ляются элементарные (ЭТ) и ретикулярные (РТ) тельца. ЭТ хламидий обладают инфекционными свойствами, способны проникать в чувствительные клетки, где происходит их цикл развития — превращение мелких ЭТ в более крупные РТ, ко торые затем претерпевают деление. Хламидии имеют основные признаки бакте рий: содержат ДНК, РНК и рибосомы. Все виды, входящие в семейство Chlamydiaceae, обладают сходной структурой липополисахаридного (ЛПС) анти гена. Основные белковые антигены, представленные на поверхности ЭТ (белки МОМР массой 40 кД и ОМР2 массой 60 кД) также проявляют значительное структурное сходство у разных видов семейства, что зачастую затрудняет диффе ренциальную диагностику.

Исходя из того, что виды се мейства Chlamydiaceae отличают ся между собой лишь различия ми в нуклеотидной последова тельности некоторых генов, становится очевидным, что пра вильная диагностика возбудите ля хламидийной инфекции воз можна лишь при использовании методов обнаружения генома возбудителя, т. е. ПЦР.

Рис. 1. Жизненный цикл хламидий.

1) адсорбция ЭТ;

2) проникновение ЭТ в клетку;

3) реорганизация ЭТ в РТ;

4) деление РТ;

5) созревание РТ в ЭТ;

6) накопление РТ в эндосоме;

7) выход из клетки.

3.1.2. Показания для диагностики хламидий методом ПЦР:

• Острая фаза заболевания.

• Установление этиологии хронического инфекционного процесса уроге нитального тракта, в т. ч. его верхних отделов. Возможность обнаружить единичные молекулы ДНК хламидий, не выявляемые методами прямого обнаружения антигена (культуральный, ПИФ).

• Беременность с отягощенным акушерским анамнезом.

• Бесплодие неясного генеза.

• Контроль эффективности терапии (не ранее чем через 1 месяц после приема антибактериальных препаратов).

3.1.3. Материал для исследования:

• соскоб из уретры или цервикального канала (пп. 2.1., 2.2.);

• секрет предстательной железы (п. 2.4.);

• осадок мочи (п. 2.5.);

• соскоб с конъюнктивы (п. 2.6.);

• у новорожденных в качестве материала для исследования используют соскоб с конъюнктивы глаз и задней стенки глотки (п. 2.7.);

• у девочек в качестве материала для исследования используют соскоб из вульвы, у мальчиков — мочу.

3.2. Урогенитальные микоплазмозы (уреаплазмоз) 3.2.1. Уреаплазмозы 3.2.1.1. Краткая информация о возбудителе Представители рода Ureaplasma относятся к группе урогенитальных мико плазм и обладают всеми отличительными признаками этих микроорганизмов:

наименьший среди прокариот размер генома, чрезвычайно простая организа ция, отсутствие плотной клеточной стенки и, как следствие, выраженный поли морфизм.

Уреаплазмы способны длительно персистировать на мембране эпителиаль ных клеток макроорганизма и локализоваться внутриклеточно. При этом, подоб но другим генитальным микоплазмам, могут расти на искусственных бесклеточ ных питательных средах. Уреаплазмы являются условно-патогенными микроор ганизмами и способны вызывать различные заболевания урогенитального тракта человека.

По современной классификации, к роду Ureaplasma относят два вида: U. par vum и U. urealyticum, ранее (до 2000 г.) считавшимися двумя биоварами одного вида U. urealyticum. Из них преимущественно U. parvum способна вызывать во спалительные процессы со стороны слизистых урогенитального тракта, тогда как U. urealyticum является комменсалом в составе вагинального микробиоценоза.

Уреаплазменная инфекция может сопровождаться воспалительными про цессами гениталий, приводящими к бесплодию, прерыванию беременности, преждевременным родам, пренатальной патологии плода, а также вызывать уретриты, простатиты и бесплодие у мужчин. Недавно было показано, что уреа плазма является кофактором развития СПИД.

3.2.1.2. Особенности течения уреаплазменной инфекции • Бессимптомное протекание.

• Отсутствие стойкого иммунного ответа.

• Быстрая изменчивость генома, приводящая к возникновению феномена ухода от иммунного ответа • Природная устойчивость к антибиотикотерапии.

3.2.1.3. Материал для исследований Наибольшую диагностическую значимость при выявлении ДНК U. urealyti cum и U. parvum методом ПЦР имеют следующие биологические материалы:

• соскоб из уретры (п. 2.1.);

• соскоб из цервикального канала (п. 2.2.);

• соскоб с задней стенки влагалища (диагностика бактериального вагино за) (п. 2.3.);

• соскоб с задней стенки глотки (у новорожденных) (п. 2.7.);

• секрет предстательной железы, сперма (п. 2.4.);

• осадок мочи (п. 2.5.).

3.2.2. Микоплазмозы 3.2.2.1. Краткая информация о возбудителе.

Микоплазмы — микроорганизмы с наименьшим среди прокариот размером генома и чрезвычайно простой организацией. Отличаются от бактерий отсутстви ем клеточной стенки и, как следствие, выраженным полиморфизмом. При этом способны расти на бесклеточных питательных средах, метаболизировать ряд субстратов и обладают чувствительностью к некоторым антибиотикам. Плазма тическая мембрана микоплазм содержит антигены, сходные с человеческими.

Исключительно важная особенность микоплазм состоит в том, что все из вестные виды способны длительно персистировать на мембране клеток макро организма: эпителиальных, лимфоцитах, тромбоцитах и т. д. Микоплазмы спо собны внедряться внутрь эпителиальных клеток и локализоваться внутриклеточ но, где происходит их активное размножение.

M. hominis являются условно-патогенными для человека микроорганизмам.

Персистируя в эпителиальных клетках и на их поверхности, микоплазмы способ ны вызывать различные заболевания урогенитального тракта человека: эндоме триты, сальпингиты, негонококковые уретриты. У новорожденных, которые, ви димо, инфицируются при прохождении родовых путей, М. hominis колонизиру ет чаще всего носоглотку и влагалище. У мужчин микоплазма чаще колонизирует уретру и крайнюю плоть, у женщин — влагалище, реже шейку матки и уретру. По казатели инфицированности этим видом микоплазм варьируют от 10 до 50%.

Более патогенна и практически не встречается в норме M. genitalium.

3.2.2.2. Особенности течения микоплазменной инфекции:

• Бессимптомное протекание.

• Отсутствие стойкого иммунного ответа.

• Быстрая изменчивость генома, приводящая к возникновению феномена ухода от иммунного ответа.

• Природная устойчивость к антибиотикотерапии.

3.2.2.3. Материал для исследований Наибольшую диагностическую значимость при выявлении ДНК М. hominis и M. genitalium методом ПЦР имеют следующие биологические материалы:

• соскоб из уретры (п. 2.1.);

• соскоб из цервикального канала (п. 2.2.);

• соскоб с задней стенки влагалища (диагностика бактериального вагино за) (п. 2.3.);

• соскоб с задней стенки глотки (у новорожденных) (п. 2.7.);

• секрет предстательной железы, сперма (п. 2.4.);

• осадок мочи (п. 2.5.).

3.3. Трихомониаз 3.3.1. Краткая информация о возбудителе Трихомоноз (трихомониаз) занимает первое место по распространенности среди инфекций, передающихся половым путем. По данным ВОЗ, примерно 170 180 млн человек ежегодно заболевают трихомониазом. В целом пораженность взрослого населения в популяции составляет 8-10%. Среди лиц с воспалитель ными заболеваниями урогенитального тракта эта цифра составляет 32-35 %.

Возбудителем заболевания является Trichomonas vaginalis, простейший одно клеточный микроорганизм, приспособившийся в процессе эволюции к парази тированию в мочеполовых органах человека. Для выживания в организме хозяи на у них имеется несколько механизмов: способность проникать подобно лейко цитам между клетками хозяина в узкие щели, фиксация на поверхности клетки трихомонады большого количества антитрипсина, с одной стороны, и протеоли тических ферментов (гиалуронидаза и т. п.) — с другой. Ферменты трихомонад легко разрушают иммуноглобулины урогенитального тракта. Трихомонады фа гоцитируют целый ряд других возбудителей ИППП — гонококков, хламидий, ми коплазм, грибов, обеспечивая этим микроорганизмам защиту от воздействия антибиотиков.

Моноинфекция трихомонадами встречается не более чем в 10% случаев.

В основном трихомонадная инфекция имеет сочетанное с другими возбудителя ми течение. Наиболее частыми и тяжелыми осложнениями (последствиями) хронического трихомонадного поражения являются обтурационные процессы в семенных канатиках и маточных трубах. Трихомониаз — одна из основных при чин трубного бесплодия. Это обусловлено тем, что в ответ на воздействие трихо монадной гиалуронидазы возникают грубые рубцы и спайки.

Заражение трихомониазом происходит от больного человека. Без лечения влагалищные трихомонады не покидают организм человека и способны вызы вать различные осложнения.

В ответ на трихомонадную инфекцию вырабатываются АТ к трихомонаде классов IgG, IgM, которые, однако, не способны осуществлять иммунную защи ту, а являются лишь «свидетелями» инфекции.

Трихомониаз часто протекает субъективно бессимптомно: до 61% женщин и до 83% мужчин, у которых обнаруживают трихомонады, не предъявляют ника ких жалоб. При беременности, в послеродовом или послеабортном периоде, при чрезмерной сексуальной активности, на фоне приема алкоголя, снижения иммунологической реактивности скрытая форма трихомониаза может перейти в острую.

Для успешной диагностики трихомониаза следует придерживаться следую щих принципов [И. И. Ильин, Е. Н. Туранова, 1991]:

• сочетанное использование различных способов диагностики;

• неоднократные исследования изучаемого материала;

• взятие материала из разных очагов (уретра, мочевой пузырь, вульва, ва гина, протоки больших вестибулярных желез);

• правильная техника взятия и транспортировка материала.

Взятие клинического материала для выявления трихомонад осуществляют из всех возможных очагов инфекции (у женщин в начале и конце менструального кровотечения). Химическая провокация путем инстилляции в уретру и обработ ки цервикального канала растворами азотнокислого серебра нецелесообразна в связи с губительным действием этих растворов на влагалищную трихомонаду.

Выявлению простейших в большом числе случаев способствуют повторные мно гократные исследования.

ПЦР-исследование позволяет с высокой специфичностью обнаруживать три хомонаду в различных биологических материалах: мазках из уретры, цервикаль ного канала, семенной жидкости, соке простаты. В настоящее время после куль турального метода ПЦР — самый надежный и перспективный метод. В крупных межклинических исследованиях совпадение результатов ПЦР и культурального составило 99,7-100%.

3.3.2. Материал для исследований • соскоб из уретры (п. 2.1.);

• соскоб из цервикального канала (п. 2.2.);

• соскоб с задней стенки влагалища (п. 2.3.);

• секрет предстательной железы, сперма (п. 2.4.).

3.4. Диагностика бактериального вагиноза 3.4.1. Краткая информация Микробиоценоз влагалища — сложившаяся экологическая система, основ ная функция которой — защитная. Микрофлора влагалища способна реагиро вать качественными и количественными изменениями на любые физиологиче ские и патологические сдвиги в состоянии макроорганизма и препятствовать ин вазии патогенных микроорганизмов.

Ведущее место в вагинальном микробиоценозе занимают лактобактерии (80-90%), число которых может достигать 109 КОЕ/мл. Колонизируя слизистую влагалища, лактобактерии участвуют в формировании экологического барьера и обеспечивают тем самым резистентность вагинального биотопа.

Нарушение нормальной микрофлоры влагалища приводит к возникновению переходного состояния — бактериального вагиноза, наиболее широко распро страненного заболевания у женщин детородного возраста.

Бактериальный вагиноз (БВ) — это переходное состояние вагинального био топа, характеризующееся замещением лактофлоры G. vaginalis и условно-пато генной анаэробной флорой, в первую очередь представителями семейства Bacteroides, Mobiluncus, M. hominis и U. urealyticum.

Предварительный диагноз БВ может быть поставлен при наличии у пациент ки трех из четырех перечисленных ниже признаков:

• наличие «ключевых» клеток при цитологическом исследовании урогени тального мазка;

• рН влагалищного отделяемого >4,5;

• специфический характер выделений;

• положительный аминотест.

Окончательное установление диагноза БВ возможно только на основании данных о состоянии микрофлоры влагалища. Комплексная диагностика состоя ния вагинальной микрофлоры, основанная на сочетании цитологического иссле дования и ПЦР анализа позволяет выявить изменения вагинальной микрофло ры, характерные для БВ:

• резкое снижение количества или отсутствие лактобактерий;

• увеличение количества G. vaginalis, грамотрицательных анаэробных бак терий — Mobiluncus curtissi, Bacteroides spp., а также M. hominis и U. urea lyticum;

• наличие «ключевых» клеток при цитологическом исследовании урогени тального мазка и наличие или отсутствие лейкоцитарной реакции.

3.4.2. Лактобактерии (Lactobacillus spp.) Лактобактерии (Lactobacillus spp.) занимают ведущее место в вагинальном микробиоценозе (80-90%) (в норме 106-109 КОЕ/мл).

Колонизируя слизистую влагалища, лактобактерии участвуют в формирова нии экологического барьера и обеспечивают тем самым резистентность ваги нального биотопа, препятствуя инвазии патогенных микроорганизмов. Наруше ние нормальной микрофлоры влагалища приводит к резкому снижению титра лактобактерии или полному их исчезновению. Происходит замещение лакто флоры G. vaginalis и условно-патогенной анаэробной флорой, в первую очередь представителями семейства Bacteroides, Mobiluncus, M. hominis и U. urealyticum.

Выявление лактофлоры методом ПЦР позволяет оценить состояние ваги нального микробиоценоза, используя принцип доказательной медицины.

К примеру, выявление лактофлоры на фоне отсутствия представителей условно-патогенной флоры свидетельствует о нормальном состоянии вагиналь ного биотопа. При обнаружении как лактобактерии, так и какого-либо другого микроорганизма можно предположить переходное состояние, тогда как отсут ствие лактофлоры свидетельствует о серьезных нарушениях состояния микро биоценоза влагалища — бактериальный вагиноз или вагинит Преимущества полуколичественного определения лактобактерий методом ПЦР:

1. Быстрота получения результатов.

2. Возможность проведения комплексной диагностики (из одной пробы определяется большой спектр микроорганизмов).

Чувствительность тест-системы адекватна выявлению лактобактерий в титре 106 КОЕ/мл.

3.4.3. Материал для исследования • мазок из заднего и бокового сводов влагалища (п. 2.3.).

Не рекомендуется взятие мазков из цервикального канала или уретры, по скольку их микрофлора не идентична и не может характеризовать БВ, хотя и не сет определенную информацию о наличии воспалительного процесса.

3.4.4. Интерпретация результатов Алгоритм интерпретации результатов комплексного лабораторного исследо вания биотопов влагалища представлен в таблице 1.

3.5. Гонорея 3.5.1. Краткая информация о возбудителе Возбудителем гонореи является Neisseria gonorrhoeae — грамотрицательный диплококк, имеющий форму кофейных зёрен, обращённых своей вогнутой по верхностью друг к другу. Гонококки имеют хорошо выраженные трёхслойную на ружную стенку и цитоплазматическую мембрану, цитоплазму с рибосомами и ядерной вакуолью. Гонококки обычно располагаются внутриклеточно в прото плазме лейкоцитов, обычно группами, но иногда можно видеть и внеклеточных гонококков. Исследования гонококков в последние годы указывают на измене ния их биологических свойств (наличие капсул, фагосом, Р-лактамазы, сниже ние чувствительности к антибиотикам, появление L-форм).

Гонококки поражают слизистые оболочки, в частности мочеиспускательного канала, влагалища, прямой кишки, полостей рта, носа, гортани. Процесс может распространяться на предстательную железу, семенные пузырьки, придатки яи чек, яичко, семявыносящие протоки, а у женщин — на матку, яичники, маточные Таблица Комплексное лабораторное исследование состояния биотопа влагалища.

Результат микроскопического Рекомендации Результат ПЦР исследования Заключение исследования мазка Lactobacillus spp (+) > Gardnerella vaginalis ( ) Эпителиальных клеток Mycoplasma hominis ( ) соответственно фазе МЦ;

НОРМОЦЕНОЗ Норма.

Ureaplasma urealyticum ( ) доминирование лактобактерий, Moblluncus curtlsil ( ) отсутствие грамотрицательной флоры.

Bacteroides spp ( ) Lactobacillus spp ( ) < Gardnerella vaginalis ( ) Лейкоциты — в небольшом Mycoplasma hominis ( ) количестве;

полное отсутствие в KОМПЕНСИРОВАННЫЙ Наблюдение, повторное исследование Ureaplasma urealyticum ( ) исследуемом материале микрофлоры БАKТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ через 1 2 месяца.

Moblluncus curtisii ( ) при неизменных эпителиоцитах.

Bacteroides spp ( ) Lactobecillus spp ( ) <106 «Kлючевые» клетки единичные в поле Gardnerella vaglnalls ( ) зрения;

умеренный лейкоцитоз Mycoplasma hominis чаще (+) (15 25 лейкоцитов в поле зрения);

СУБKОМПЕНСИРОВАННЫЙ Заместительная терапия (местное Ureaplasma urealyticum.. чаще (+) возрастание количества БАKТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ лечение лактобактерином).

Moblluncus curtlsil (+) или ( ) сопутствующей грамвариабельной Bacteroides spp.(+) или ( ) полиморфной бактериальной флоры.

Lactobacillus spp ( ) < Gardnerella vaginalis (+) Лейкоциты в умеренном количестве;

Этиотропное лечение Mycoplasma hominis (+) присутствие бактериальной флоры в ДЕKОМПЕНСИРОВАННЫЙ (антибактериальная терапия, Ureaplasma urealyticum (+) виде монокультуры или в различных БАKТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ направленная в основном против Moblluncus curtisii (+) морфо и видовых сочетаниях. анаэробной флоры).

Bacteroides spp (+) Большое количество лейкоцитов, Lactobacillus spp ( ) <106 макрофагов, эпителиальных клеток, Проведение дополнительного Gardnerella vaginalis ( ) выраженный фагоцитоз, НЕСПЕЦИФИЧЕСKИЙ ВАГИНИТ микробиологического исследования Mycoplasma hominis ( ) морфологический пейзаж на наличие возбудителя (посев с Ureaplasma urealyticum ( ) воспалительного процесса на фоне При выявлении ИППП — выделением чистой культуры с Moblluncus curtisii ( ) полного отсутствия лактобактерий и СПЕЦИФИЧЕСKИЙ ВАГИНИТ определением чувствительности к Bacteroides spp ( ) отсутствии явно выраженного антибиотикам), ПЦР иследование.

этиотропного возбудителя.

трубы. Распространяясь по кровяному руслу, гонококки могут иногда вызывать гонококковый сепсис и метастазы в различные органы. При гонококковой бакте риемии поражаются суставы, глаза, плевра, эндокард, мышцы, кости, нервы.

У новорождённых поражаются глаза, развиваются конъюнктивит, кератит.

3.5.2. Материал для исследования При подозрении на наличие гонококковой инфекции исследуют:

• отделяемое мочеиспускательного канала (п. 2.1.);

• мазок из цервикального канала (п. 2.2.);

• мазок из носоглотки (п. 2.8.);

• парауретральных протоков;

• большой железы преддверия влагалища;

• стенок влагалища (п. 2.3.);

• секрет предстательной железы (п. 2.4.);

• семенных пузырьков, желез и лакун мочеиспускательного канала;

• мочу (п. 2.5.);

• промывные воды прямой кишки;

• отделяемого с конъюнктивы глаза (п. 2.6.).

3.6. Вирус папилломы человека 3.6.1. Краткая информация о возбудителе Вирусы папилломы человека (ВПЧ) считаются агентами, отвечающими за предраковые поражения гениталий и плоскоклеточный рак у мужчин и женщин.

Папилломавирусы видоспецифичны и тканеспецифичны. У человека описано более 60 различных папилломавирусов [De Villiers E. M., 1989]. Они поражают только поверхностный эпителий кожи и слизистых. Большинство бородавок, вы званных ВПЧ, спонтанно регрессирует, но при некоторых поражениях, особенно плоского эпителия, наблюдается озлокачествление. Принято с достаточной до стоверностью, что ВПЧ ответственен за развитие остроконечных кондилом и что он связан с развитием плоской кондиломы шейки матки и с цервикальной интра эпителиальной неоплазией. Различные типы ВПЧ связаны с различными видами поражений.

Типы вирусов папилломы человека и вызываемые ими болезни представле ны ниже [R. C. Reichman, 1987].

Тип вируса Болезни 1 Подошвенные и ладонные бородавки 2 Обыкновенные бородавки 3, 10, 28, 29 Плоские бородавки 4 Подошвенные и обыкновенные бородавки 5,8-9, 12, 14-15, 17, 19-25, 36, 39, 40 Бородавчатая эпидермодисплазия 6, 11 Остроконечные кондиломы (генитальные бородавки), неоплазия шейки матки, па пилломатоз гортани 7 Обычные бородавки у людей, контакти рующих с мясом и животными 13, 32 Фокальная гиперплазия эпителия (болезнь Хека) 16, 18 Плоскоклеточное интраэпителиальное по ражение, инвазивный рак. 99,7 % раков шейки матки ассоциировано с этими типа ми ВПЧ 31, 33, 35 Генитальная дисплазия и карциномы 30, 45, 51, 56 Редкие формы рака, плоскоклеточные по ражения полового члена 26, 27 Бородавки больных с ослабленным имму нитетом 34, 37, 38 Отдельные случаи доброкачественных и злокачественных новообразований Очень много данных свидетельствуют о возможной роли ВПЧ-инфекции в развитии рака у человека. Папилломавирусы чрезвычайно широко распростра нены и эпителиотропны. Это очень важно, так как известно, что большинство ра ковых опухолей человека представляют собой злокачественные образования, состоящие из эпителиальных клеток. В течение последних 10 лет установлено, что инфекция, вызванная ВПЧ, связана с развитием предраковых поражений поло вых органов — внутриэпителиальных неоплазий шейки матки, вульвы, влагали ща, ануса, полового члена, а также плоскоклеточного рака. Описаны различные пути, объясняющие генез карциномы из вирусных папиллом шейки матки.

ВПЧ инфекция очень распространена в общей популяции. При обследова нии женщин студенческого возраста у 26% ВПЧ обнаружен при первичном прие ме и у 46% — в последующие 3 года наблюдения. У женщин с нормальной коль поцитологией ВПЧ выявляются в 10-25% случаев (как правило, неонкогенные ти пы). При измененной кольпоскопической картине и кольпоцитологии доля женщин, инфицированных онкогенными типами, достигает 32-47%.

3.6.2. Материал для исследования Материал для исследования оптимально брать при кольпоскопии с пора женных участков шейки матки и цервикального канала (п.2.2.). Допускается взя тие материала без кольпоскопии из цервикального канала и уретры у женщин, и уретры и головки полового члена у мужчин.

4. ПЦР в клинической практике:

диагностика вирусных гепатитов Для специальностей: гастроэнтерология, гепатология, инфекцион ные болезни 4.1. Вирусный гепатит В 4.1.1. Краткая информации о возбудителе.

Вирус гепатита В (HBV) является ДНК-содержащим вирусом, в ряду виру сных гепатитов был открыт одним из первых. Наличие четких серологических маркеров и наличие у вируса поверхностной частицы — HBsAg — существенно облегчает его диагностику. При гепатите В может происходить развитие хрони ческого гепатита, цирроза и первичного рака печени. Кроме того, с наличием бессимптомного носительства вируса связаны трудности борьбы с этой инфек цией. О вирусоносительстве судят по обнаружению HBsAg. По данным ВОЗ, в мире проживает более 300 млн носителей вируса, из которых около 5 млн рос сиян. Одна из особенностей вируса гепатита В — чрезвычайно высокая инфек ционность.

Лабораторная диагностика острого и хронического гепатита В включает в се бя определение нескольких серологических маркёров инфицирования вирусом гепатита В: HBsAg, ДНК HBV (ПЦР-исследование), HBeAg, IgM анти-НВс, анти НВс, анти-НВе и анти-HBs. Последовательное их появление и исчезновение при остром, и хроническом гепатите В позволяет судить о характере инфекционного процесса и активной репликации вируса. Длительное время считали, что только при наличии IgM анти-НВс и HBeAg имеет место активная репликация вируса ге патита В. Тестирование ДНК HBV, которое можно осуществить при помощи ПЦР исследований, выявило наличие в сыворотках крови HBsAg без HBeAg, или даже с анти-НВе-позитивной реакцией, свидетельствующей об активной репликации вируса. Секвенирование этой ДНК позволило установить существование мутант ных форм вируса гепатита В, обозначенных как Pre-Core мутанты. Заболевание, обусловленное этой формой HBV, протекает тяжелее, быстро переходит в цир роз и дает худшие результаты интерферонотерапии.

4.1.2. Материал для исследования • сыворотка крови (п. 2.11.).

4.2. Вирусный гепатит С 4.2.1. Краткая информация о возбудителе С открытием в 1989 г. вируса гепатита С (HCV) началось интенсивное изуче ние HCV-инфекции, являющейся основной причиной развития хронических диффузных заболеваний печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Хроническая инфекция вируса гепатита С представляет серьезную проблему для здравоохра нения во всем мире. Распространенность ее в популяции колеблется от 0.5-1% (Северная Европа, Бельгия) до 4-10% (Африка, Ближний Восток, Восточная Ев ропа, Азия).

Отличительной особенностью вируса гепатита С является способность к дли тельной персистенции в организме, что обусловливает высокий уровень хрони зации инфекции — в 50-80% случаев.

Генотипы HCV имеют важное биологическое значение: их гетерогенность мо жет определять тяжесть течения гепатита. Гетерогенность генотипов создает трудности при разработке диагностических тест-систем и профилактических вак цин. В настоящее время известно 6 основных генотипов HCV и более 80 субти пов. В разных регионах мира распределение генотипов неравномерно: в Север ной Америке превалирует генотип 1а, в Северной и Центральной Европе чаще встречаются 1b, 2а, на Ближнем и Среднем Востоке — 3а. В ряде исследований по казано, что генотип 1b сочетается с более высоким уровнем виремии и низким от ветом на лечение -интерфероном.

Образующиеся вируснейтрализующие антитела являются высокоспецифич ными и не способны нейтрализовать вновь появляющиеся вирусные варианты, что также создает условия для «иммунологического ускользания» и не исключа ет возможности повторного инфицирования. В патогенезе поражения органов при HCV-инфекции обсуждаются прямой цитопатический эффект вируса и вы званные им иммунологические реакции, обусловливающие повреждение пече ни и других органов и тканей;

репликация вируса вне печени — в тканях лим фоидного и нелимфоидного происхождения. Размножение вируса в иммуно компетентных клетках (лимфоцитах) приводит к нарушению их иммунологической функции.

Для диагностики HCV-инфекции используются иммуноферментный метод (ELISA) для определения антител и ПЦР. Использование ПЦР позволяет подтвер дить HCV инфекцию в спорных случаях и при отсутствии антител к HCV, встре чающемся в 10% случаев, в том числе при алкогольной болезни печени, у лиц, получающих иммуносупрессивную терапию или имеющих криоглобулинемию.

Большое значение этот метод имеет для ранней диагностики ОВГС и HCV-инфек ции у доноров, для контроля за перинатальной передачей вируса, определения показаний к противовирусной терапии и оценки ее эффективности.

4.2.2. Материал для исследования • сыворотка крови (п. 2.11.).

4.3. Вирусный гепатит D 4.3.1. Краткая характеристика возбудителя:

Вирус гепатита D (HDV, произносится как «дельта») относится к РНК-содер жащим вирусам. Заражение дельта гепатитом возможно только при наличии ви руса гепатита В (точнее, его поверхностной частицы — HBsAg). Это определяет две основных формы инфицирования дельта вирусом: коинфицирование — од новременное заражение HDV и HBV;

и суперинфицирование — заражение HDV носителя HBV («бессимптомного» носителя HBsAg или больного хроническим ге патитом В). Так же, как и при других вирусных гепатитах, большое значение для постановки диагноза и контроля заболевания имеют диагностические маркёры инфицирования. К ним относят: дельта-антиген, антитела к дельта-антигену классов IgM и IgG, тестируемые в ИФА, а также РНК HDV (определяется ПЦР).

HDV может ассоциироваться с широким спектром клинических проявлений за болевания, от бессимптомного носительства до фульминантного гепатита и цир роза печени.

4.3.2. Материал для исследования • сыворотка крови (п. 2.11.).

4.4. Вирусный гепатит G 4.4.1. Краткая характеристика возбудителя Вслед за открытием вирусов гепатитов А и В последовала идентификация возбудителей гепатитов С, D и Е. Наличие случаев заболевания, при которых не удается выявить маркеры инфицирования этими вирусами, позволило предпо ложить существование еще нескольких вирусных гепатитов. Открытие вирусов, ответственных за развитие гепатита G, и разработка методов их выявления и те стирования маркеров инфицирования вызвали интенсивное накопление факти ческих данных.

Дальнейший прогресс в исследовании гепатита G стал возможен лишь после разработки в 1993 г. новых молекулярно-биологических методов, т. е. ПЦР-ис следований, позволяющих целенаправленно идентифицировать новые вирусы.

Вирус гепатита G (HGV), так же, как и НСV, относят к семейству Flaviviridae. Ге ном вируса представлен одноцепочечной РНК. По своей организации геном HGV подобен РНК HCV.

Основным маркером, применяемым для диагностики и изучения эпидемио логии гепатита G, является выявление РНК вируса гепатита G методом ПЦР. В от личие от гепатита С, выявление антител при гепатите G не может быть использо вано для поиска вирусоносителей, а пригодно для регистрации уже прошедшей инфекции и проведения эпидемиологических исследований для оценки распро странения инфекции в различных группах населения.

Несмотря на пристальный интерес к проблеме гепатита G, количество работ, посвященных изучению клинических проявлений этой инфекции, ограничено.

Вероятнее всего, это можно объяснить редким выявлением случаев моноин фекцнн гепатита G. Так, при анализе структуры заболеваемости острыми виру сными гепатитами в США (1982-95 гг.) из 10533 заболевших у 322 (3%) зареги стрирован острый гепатит ни А, ни Е. При исследовании на наличие РНК HGV таких больных позитивный результат отмечен у 4 (9%).

Острый гепатит G протекает в клинически выраженной и бессимптомной форме. В качестве общей клинической характеристики могут рассматриваться умеренные показатели активности сывороточных трансаминаз. Исходами остро го гепатита G могут быть:

• выздоровление с элиминацией РНК HCV и появлением антител;

• формирование хронического гепатита с длительным выявлением РНК HCV;

• персистирующая форма гепатита G;

• формирование длительного носительства HGV.

Морфологические показатели хронического гепатита G очень схожи с изме нениями, описанными для гепатита С. К гепатиту G может быть отнесено опреде ление, данное доктором Weisiger — «клинически молчаливая инфекция».

Различия биохимических показателей у пациентов с хроническим гепатитом в зависимости от наличия РНК HGV были зарегистрированы Соlombatto с соавт.

При позитивной реакции на наличие вируса отмечалось более чем двукратное повышение активности -глутамилтрансферазы и щелочной фосфатазы. Эти данные позволили предположить, что увеличение активности холестатических энзимов, свидетельствующее о преимущественном поражении желчевыводя щих протоков, может стать специфическим маркером гепатита G.

Коинфекция вируса гепатита G с вирусами гепатита В, С и D выявляется зна чительно чаще, чем моноинфекция. Определение РНК HGV среди больных ос трым гепатитом В и С находится на уровне до 24.5% и 37.0% соответственно, а хроническим гепатитом B и С — 9.7-16.7%. Высокая частота выявления РHК HGV зарегистрирована среди больных хроническим гепатитом D — 39.9%.

4.4.2. Материал для исследования • сыворотка крови (п. 2.11.).

4.5. Вирусный гепатит TTV 4.5.1. Краткая информация о возбудителе Новый вирус гепатита был обнаружен в 1997 г. в сыворотке пациента с ини циалами Т. Т., страдавшего гепатитом неизвестной этиологии. Инициалы паци ента определили название — вирус ТТ (ТТV). В дальнейшем это сокращение об рело второй смысл — вирус гепатита, передающийся с трансфузиями — Transfused Transmitted Virus (TTV).

TTV относится к ДНК-содержащим вирусам (однонитевая спиральная круго вая ДНК, около 3800 нуклеотидов) и, по-видимому, является членом нового се мейства вирусов гепатита — Circinoviridae.

Проведены обширные исследования по выявлению TTV у пациентов с забо леваниями печени, особенно неизвестной этиологии. ТТ-виремия обнаружена при фульминантной форме гепатита, хроническом активном гепатите и циррозе неизвестной этиологии. У 15% больных криптогенным циррозом печени, 27% больных идиопатической фульминантной печеночной недостаточностью, у 19% пациентов, ожидающих ортотопической трансплантации печени, также находят TTV. Разноречивы данные о связи TTV с гепатоцеллюлярной карциномой.

Т. Yamamoto и соавт. выявили TTV у 20 неинфицированных вирусами гепатита В и С пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, однако отсутствие интегра ции ДНК вируса и ДНК гепатоцита авторы считают доказательством неканцеро генности TTV.

При обследовании категорий населения, относящихся к группам риска (нар команы, проститутки, гомосексуалисты), не выявлено преобладания вируса TTV (4,5-13%) по сравнению с популяционной. Хотя в эксперименте (шимпанзе) при внутривенном введении TTV развивается виремия, полагают, что распростране ние вируса половым путем и при внутривенном введении наркотиков не являет ся преобладающим. Первоначально вирус был определен как гемотрансмиссив ный. Однако выявление широкого бессимптомного носительства у здоровых лю дей, никогда не получавших трансфузий крови, и у детей поставило под сомнение исключительность парентерального пути передачи инфекции. Уста новлено, что вирус экскретируется желчью, выделяется из желудочно-кишечно го тракта и передается фекально-оральным путем. С другой стороны, относи тельно низкая встречаемость TTV-инфекции в группах риска свидетельствует, что половой и инъекционный пути передачи не являются основными.

ДНК TTV выявляют с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Помимо циркулирующей в плазме крови, ДНК TTV выявлена также и в лей коцитах. Т. Kanda и соавт. обнаружили, что 60% лиц, перенесших транспланта цию костного мозга, инфицированы TTV, тогда как среди доноров костного моз га TTV-позитивны лишь 10%. Полагают, что TTV реплицируется в основном в ге мопоэтических клетках и не является причиной повреждения гепатоцитов. Даже при высоком уровне трансаминаз крови не всегда удается обнаружить повреж дения ткани печени при моно-TTV-инфекции.

Выделено 6 генотипов (G1…6) вируса гепатита TTV, при этом не определено каких-либо географических различий между генотипами вируса. Наиболее рас пространены генотипы G1-3. Генотип G1а и G2а чаще встречается при заболева ниях печени.

По предварительным данным, разрушение TTV происходит при пастериза ции в течение 10 ч при 60°С, и TTV обнаруживается лишь у 0,5% больных гемо филией, получающих только термически обработанные концентраты факторов свертывания. Предстоит уточнить, насколько эффективны методы обеззаражи вания гемокомпонентов в отношении TTV.

4.5.2. Материал для исследования • сыворотка крови (п. 2.11.).

5. ПЦР в клинической практике:

диагностика хеликобактерной инфекции Для специальности: гастроэнтерология 5.1. Краткая характеристика возбудителя Helicobacter pylori (HP) — грамотрицательная скрученная S-образная бакте рия. Одна из главных микробиологических характеристик Н. pylori — ее способ ность производить большое количество уреазы. Данный микроорганизм суще ствует под слоем желудочной слизи, где он защищен от кислой среды, созда ваемой желудочным соком.

Н. pylori играет важную роль в патогенезе гастрита и других заболеваний пи щеварительной системы. В настоящее время является общепризнанным, что большинство случаев эрозивных гастритов и язвенной болезни желудка и две надцатиперстной кишки связано с хеликобактерной инфекцией. Этот микроор ганизм может повреждать эпителиальные клетки, вызывая воспалительные про цессы, что при отсутствии соответствующего лечения способствует развитию хро нического атрофического гастрита. У большинства больных в процесс вовлекается антральный отдел и тело желудка, постепенно развиваются атрофия желез, фиброзирование и кишечная метаплазия. Аутоиммунный механизм ра звития гастрита также инициируется геликобактерной инфекцией. Н. pylori была обнаружена в 95-100% случаев гастрита типа В и в 90-95% случаев язвы двенад цатиперстной кишки. Кроме того, установлено, что Helicobacter pylori является ос новным фактором риска развития лимфомы и рака желудка.

Этот микроорганизм не является облигатным патогеном, то есть инфициро вание далеко не всегда сопровождается развитием клинически выраженного за болевания. Основными путями передачи инфекции являются оро-оральный и фекально-оральный. Особое внимание уделяется оро-оральному пути переда чи, поскольку хеликобактер прекрасно выживает и размножается в зубодесне вых карманах полости рта инфицированных людей.

Накоплены достаточно надёжные данные о распространении инфекции НP среди населения земного шара. Установлено, что интенсивность эпидемическо го процесса определяется общим социальным и гигиеническим уровнем населе ния. В развивающихся странах уже к 20-летнему возрасту инфицированность на селения НР может достигать 90%, а в высокоразвитых она, как правило, не пре вышает 30-50%.

Исследования последних лет показали, что развитие гастрита и язвы желуд ка связано, в первую очередь, с колонизацией слизистой оболочки токсикоген ными штаммами Н. pylori, в то время как колонизация нетоксикогенными штам мами только в небольшом проценте случаев приводит к развитию заболеваний.

Токсикогенность штаммов обусловлена продукцией вакуолярного цитотоксина, синтез которого связан с продукцией белка с молекулярной массой 120000 128000, кодируемого геном CagA (Cytotoxin associated gene А).

Для определения наличия НР в организме обследуемых лиц разработано большое число инвазивных и неинвазивных методов. Из инвазивных методов диагностики чаще всего применяются быстрый уреазный тест, морфологический и бактериологический методы, фазово-контрастная эндоскопия;

из неинвазив ных — ряд дыхательных тестов на уреазу и серологические методы, в которых определяют специфические к НР антитела, относящиеся к иммуноглобулинам классов A, G и М. Простое определение антител в сыворотке крови не дает ин формации о том, что она вызвана наличием токсикогенных штаммов бактерий, поэтому принято определять количественно антитела к белку цитотоксичности.

ПЦР-диагностика, безусловно, играет важную роль в быстрой идентифика ции цитотоксических штаммов H. pylori. Для диагностики можно использовать как биопсийный материал, так и мазки из зубодесневых карманов, что делает эту диагностику уникальной.

Однако в настоящее время нет ещё единого мнения о том, сочетание каких методов выявления НР является оптимальным для диагностики вызываемой ею инфекции.

5.2. Материал для исследования В качестве материала удобнее всего брать мазки из зубодесневых карманов, реже берут слюну. Если есть возможность — для диагностики берут биоптат из антрального отдела желудка. При контроле за эффективностью терапии берут биоптаты из тела желудка не ранее чем через 4 недели после окончания курса эрадикационной терапии.

6. ПЦР в клинической практике:

диагностика внутриутробных инфекций Для специальностей: педиатрия, неонатология Цитируется по: «Диагностика внутриутробных инфекций у новорожден ных детей методом полимеразной цепной реакции». Методические реко мендации для врачей. / Под ред. А. П. Помогаевой. — Томск, Новосибирск. — 2001. — 38 с.

Верификация возбудителей инфекционных заболеваний в педиатрической практике определяет тактику лечения пациента. Представление о некоторых ви дах бактерий как о непатогенных недопустимо, когда речь идет о плоде или но ворожденном (Дэвис П. А., Готефорс Л. А., 1987).

Наиболее распространены среди патогенов, вызывающих развитие внутриу тробных инфекций у новорожденных детей, вирус простого герпеса (ВПГ), цито мегаловирус (ЦМВ), вирус гепатита В (ВГВ), а также возбудителей хламидиоза (Chlamydia trachomatis), микоплазмоза (Mycoplasma hominis) и уреаплазмоза (Ureaplasта urealyticum).

6.1. Диагностическое значение выявления ДНК вируса простого герпе са в неонатальном периоде Герпес является самой распространенной хронической вирусной инфекцией человека, существующей в организме преимущественно в латентной форме и протекающей у беременных женщин в бессимптомной форме. Из семейства герпесвирусов патогенными для человека являются вирусы простого герпеса ти пов 1 и 2, а также вирусы герпеса 3 (вирус ветряной оспы — герпес зостер), 4 (ви рус Эпштейна-Барр) и 5 (вирус цитомегалии). Наибольшее значение по распро страненности и тяжести вызываемых ими поражений имеют вирусы простого герпеса. Фактическая частота неонатального герпеса остается неясной, от пока затели смертности детей при герпетическом поражении в этом возрастном пе риоде очень высоки.

Возможно трансплацентарное проникновение ВПГ в организм плода. Внут риутробный герпес часто сопровождается рождением недоношенного ребенка, при этом ВПГ обычно вызывает клинически выраженное заболевание новорож денных. По клиническим проявлениям выделяют диссеминированную (генера лизованную) и локализованную (кожную, глазную, оральную, энцефалитиче скую, с поражением печени) формы герпеса. Кроме этого, поражение кожи при внутриутробном герпесе может проявляться в виде буллезного эпидермолиза.

У доношенных детей, выделяющих ДНК ВПГ из крови, при рождении отме чается синдром нарушенной адаптации, хроническая внутриутробная гипоксия плода, аспирация околоплодных вод. Ухудшение состояния происходит в тече ние первых-вторых суток жизни и сопровождается развитием СДР, ранним по явлением желтухи (до II-III степени), умеренной гепатомегалией, развитием сим птомов интоксикации и нарушениями гемоликвородинамики. Впоследствии развивается пневмония со среднетяжелым или тяжелым течением.

У недоношенных детей, выделяющих ДНК ВПГ из крови, состояние при рож дении тяжелое или очень тяжелое. В клинической картине преобладают выра женный СДР, нередко требующий проведения искусственной вентиляции легких, желтуха, изменения со стороны нервной системы, проявляющееся в повышен ной возбудимости, отказе от еды, судорогах, гипертензионно-гидроцефальном синдроме. В дальнейшем у таких детей могут отмечаться тяжелая энцефалопатия с развитием микроцефалии или гидроцефалии, отставание в психическом ра звитии и явления детского церебрального паралича.

Сочетанная детекция ВПГ и ЦМВ клинически проявляется в раннем неона тальном периоде развитием двусторонней пневмонии, но течение заболевания носит затяжной, вяло текущий характер. Нередко родители обращаются к врачу после 1 месяца жизни с жалобами на длительно текущую желтуху, срыгивания, недостаточную прибавку в весе. Сочетание ВПГ и ЦМВ представляет собой при мер развития сочетанных инфекций, когда один из возбудителей препятствуют развитию другого. Манифестация инфекционного процесса может произойти при присоединении бактериальной инфекции.

6.2. Диагностическое значение выявления ДНК цитомегаловируса в неонатальном периоде ЦМВ наиболее часто вызывает перинатальную вирусную инфекцию и встре чается приблизительно у 1% всех инфицированных внутриутробно новорожден ных (Adler S. P., 1992). Наиболее тяжелыми отдаленными последствиями ЦМВИ являются врожденные пороки развития, глухота и умственная отсталость, а так же развитие хронических заболеваний легких.

Вирус переносится при тесном контакте с инфицированными выделениями, а также трансплацентарно, через половые контакты, при переливании крови и пересадке органов. ЦМВ имеет широкое распространение в популяции: анти тела к вирусу обнаруживаются у 50-85% людей (Raynor B. D., 1993). Подобно ВПГ, ЦМВ способен реактивироваться и вызывать рецидив инфекции.

ЦМВ может проходить через плаценту в любой период беременности. Пер вичное инфицирование матери во время беременности вызывает наиболее тя желое течение врожденной ЦМВИ. Врожденная инфекция, вызванная рециди вом заболевания, протекает менее тяжело, но приблизительно у 10% детей раз виваются поздние осложнения. Популяционный скрининг беременных не дает желаемых результатов в диагностике ЦМВИ, так как современные лабораторные методы не дифференцируют первичную и вторичную инфекции.

Беременность может быть фактором риска для реактивации латентной ЦМВИ. Серонегативные беременные женщины имеют высокий риск развития первичной ЦМВИ с последующим внутриутробным инфицированием плода. Да же если имеются антитела к ЦМВ, это не предотвращает развития внутриутроб ной инфекции. Инфицирование в первом триместре беременности ассоциирует ся с врожденными аномалиями центральной нервной системы и чувствительных нервов. Инфекция новорожденных может развиваться при непосредственной контаминации в материнских родовых путях и при инфицировании через груд ное молоко. Возможно инфицирование новорожденных ЦМВ при переливании крови или использовании донорского молока.

Внутриутробная ЦМВИ проявляется мультисистемным поражением, вызы вающим значительную тяжесть заболевания и смертность. Клиническое обсле дование наиболее часто выявляет петехии, гепато- и спленомегалию, пневмо нию и неврологические нарушения с дальнейшей задержкой психомоторного развития. Часто появляются интракраниальные кальцификаты, гипоплазия моз жечка, перивентрикулярная лейкомаляция, внутрижелудочковые кровоизлия ния, гидроцефалия, порэнцефалические кисты, микроцефалия. Для лаборатор ных показателей характерно увеличение активности трансфераз, конъюгиро ванная гипербилирубинемия и тромбоцитопения. Белок в спинномозговой жидкости повышен, что ассоциируется с поражением нервной системы и поте рей слуха.

Одновременное выделение ДНК ЦМВ из крови и мочи сопровождается осо бенно тяжелым течением заболевания с цианозом кожных покровов, СДР, жел тухой и гепатоспленомегалией, поражением центральной нервной системы.

При выявлении ДНК ЦМВ только в крови или только в моче состояние детей расценивается как средней степени тяжести, клинические симптомы аналогичны описанным выше, течение заболевания характеризуется монотонностью и тор пидностью к проводимой терапии.

При развитии клинической картины ЦМВИ у новорожденных детей не следу ет исключать вероятность постнатального инфицирования, особенно при отсро ченной реализации инфекции или одновременном течении соматического забо левания.

ЦМВИ часто комбинируется с другими бактериальными и вирусными забо леваниями. В частности, сочетание ЦМВИ и хламидийной инфекции проявляет ся рождением недоношенного ребенка, вялым течением пневмонии и желтухой II-III ст., сохраняющейся в течение первого месяца жизни.

При одновременном выделении ДНК ЦМВ и микоплазмы состояние может оставаться средней степени тяжести и не требует длительного пребывания ре бенка в стационаре. В клинической картине преобладают пневмония и перина тальная энцефалопатия.

6.3. Диагностическое значение выявления ДНК хламидий в неонатальном периоде Chlamydia, подобно вирусам, являются облигатными внутриклеточными па разитами, их выживание зависит от внутриклеточного роста и размножения, а их жизнедеятельность может протекать в любых клетках организма-хозяина.

Chlamydia представляют собой неподвижный грамотрицательный организм и за нимают промежуточное место между бактериями и вирусами. Из трех видов воз будителей, относящихся к роду Chlamydia, C. trachomatis передается половым пу тем и вызывает заболевания новорожденных.

Хламидиоз занимает ведущее место среди урогенитальных инфекций и ха рактеризуется широкой распространенностью, субъективно асимптомным тече нием, многоочаговостью поражения, склонностью к диссеминированию. Веро ятность передачи хламидийной инфекции ребенку от больной матери составля ет 40-70%.

Принято считать, что клинически у новорожденных заболевание проявляет ся в виде конъюнктивитов, назофарингитов, бронхитов, пневмонии, гастроэнте ритов, проктитов, вульвитов, уретритов, а также менингитов, миокардитов и ре активных артритов.

При детекции ДНК хламидий заболевание часто сопровождается быстрым развитием СДР на фоне мекониальной аспирации, что можно объяснить не толь ко химическим характером поражения респираторной ткани загрязненными околоплодными водами, но и большим количеством возбудителя, проникшем непосредственно в легкие новорожденного ребенка. У детей, аспирировавших околоплодные воды, и у недоношенных новорожденных дыхательные расстрой ства в клинической картине заболевания выступают на первый план: одышка, участие вспомогательной мускулатуры в акте дыхания, мелкопузырчатые хрипы в легких. У наименее зрелых недоношенных детей заболевание протекает по ти пу СДР, требующего оксигенотерапии. Течение заболевания осложняется дли тельным сохранением фетальных шунтов и нарастанием сердечно-легочной не достаточности.

В настоящее время признана роль С. trachomatis в развитии неонатальной пневмонии. Приобретение этого микроорганизма происходит во время прохож дения плода через родовые пути. Позднее развитие пневмонии, вызванной C.

trachomatis, может быть связано с относительно низкой вирулентностью. Отме чены случаи развития хламидийного конъюнктивита у новорожденных, извле ченных путем кесарева сечения, что свидетельствует о возможной трансмем бранной или трансплацентарной передаче инфекции.

Инфекция, вызванная C. trachomatis, сопровождается развитием затяж ной пневмонии с выраженной дыхательной недостаточностью (до III ст.), на рушениями гемоликвородинамики, желтушным окрашиванием кожных по кровов. В случаях проведения ИВЛ для ПЦР-диагностики могут использо ваться трахеобронхиальные аспираты. Наличие ДНК C. trachomatis в трахеобронхиальных аспиратах отражает развитие пневмонии. Характерно течение двусторонней пневмонии и перинатального поражения центральной нервной системы, гнойного конъюнктивита, кардиопатии, реже фетального гепатита.

Диагноз хламидийной инфекции не всегда устанавливается своевременно, что приводит к неадекватной терапии и формированию персистирующей или ла тентной инфекции, способствующей развитию вторичного иммунодефицита и аутоиммунных заболеваний. По данным литературы известно, что латентное течение хламидийной инфекции у ребенка не исключает возможность продук тивной репродукции хламидий в клетках и тканях ЦНС и экстраневрально, след ствием чего может явиться развитие астеновегетативного синдрома, судорож ных и ликвородинамических нарушений.

Для общего анализа крови характерны анемия, тромбоцитопения, лейкопе ния, эозинофилия, моноцитоз. Выделение ДНК C. trachomatis из мочи сопровож дается протеинурией, лейкоцитурией, цилиндрурией, десквамацией почечного эпителия.

При одновременном выявлении ДНК C. trachomatis и M. hominis течение бе ременности часто сопровождается угрозой прерывания в течение всего геста ционного периода. В первую неделю жизни развивается двусторонняя мелкооча говая пневмония, конъюгационная желтуха (II ст.), кардиопатия, перинатальное поражение центральной нервной системы.

6.4. Диагностическое значение выявления ДНК микоплазм и уреа плазм в неонатальном периоде В последние годы в отечественной и зарубежной литературе появились со общения о внутриутробной микоплазменной инфекции, которая чаще проявля ется в виде пневмоний, но может носить и генерализованный характер. Сущест вует связь инфицирования микоплазмами со спонтанными абортами, прежде временными родами, а также с малой массой тела детей при рождении.

Микоплазмы широко распространены в природе и некоторые их виды патоген ны для человека (M. pneumoniae, M. hominis, Ureaplasma urealyticum). Микоплаз мы не окрашиваются по Граму, окрашиваются по Гимзе и характеризуются выра женным полиморфизмом (кокки, палочки, нитевидные формы). U. urealyticum представляет собой Т-группы штаммов микоплазм, образующих маленькие ко лонии в среде с добавлением мочевины.

Диагностика микоплазм с использованием ПЦР позволяет установить этио логическое и патогенетическое значение микоплазм в патологии неонатального периода. Статистически выявлена значительная связь между уровнем колониза ции U. urealyticum и M. hominis и преждевременными родами, а также дородо вым (более 24 часов) излитием околоплодных вод. При этом несколько чаще ко лонизация отмечается у детей, перенесших эпизоды апноэ.

В целом, внутриутробная инфекция микоплазменной этиологии характери зуется средне тяжелым течением с постепенным нарушением состояния ребенка и развитием СДР, вялотекущей пневмонии, гнойного конъюнктивита, реже — гнойного омфалита, желтушности кожных покровов, нарушений гемоликворо динамики различной степени выраженности, кардиопатией.

U. urealyticum признана важным потенциальным патогеном недоношенных новорожденных, рожденных через естественные родовые пути. В то же время указывается, что неонатальная колонизация не связана с низким гестационным возрастом, малым ростом и весом при рождении. Инфицирование беременных женщин U. urealyticum ассоциируется с неблагоприятным исходами беременно сти, такими как ранние выкидыши, мертворождение, недоношенность, неона тальная заболеваемость и смертность.

Существуют следующие пути передачи U. urealyticum от матери к новорож денному ребенку:

1) внутриутробно трансплацентарно через материнскую кровь или вторич но восходящим путем из родовых путей;

2) в родах при прохождении через родовые пути;

3) постнатально по горизонтальному пути, возможна нозокомиальная пе редача.

Частота вертикальной передачи увеличивается при хориоамнионитах, осо бенно если U. urealyticum выделяется из амниотической жидкости.

Инфекция, вызываемая U. urealyticum, играет важную роль в развитии ран ней бронхолегочной дисплазии у недоношенных детей и других хронических за болеваний легких даже после лечения сурфактантом.

U. urealyticum может вызвать неонатальную бактериемию, пневмонию и ме нингиты, а также остеомиелит. Клинически уреаплазменная пневмония у недо ношенных часто сочетается с болезнью гиалиновых мембран, лейкопенией, тромбоцитопенией и развитием СДР.

При сочетании ДНК U. urealyticum и M. hominis диагностику инфекционного процесса могут затруднять врожденные пороки развития.

6.5. Материал для исследования В неонатологии для исследования на ВУИ рекомендуется исследовать:

• сыворотку крови (п. 2.11);

• мазок с задней стенки глотки (п. 2.7.);

• слюна (п. 2.10.);

• моча (п. 2.5.).

Ваши пациенты могут сдать или оплатить материал, взятый Вами для ПЦР исследований в ООО «МДЦ ДНК Диагностика» НАШИ ПРОЦЕДУРНЫЕ КАБИНЕТЫ РАСПОЛОЖЕНЫ:

1. ул. Солнечная поляна, ул. Энтузиастов (пересечение ул. Солнечная Поляна и ул. Энтузиастов). Тел. 48 41 01.

Проезд авт. №№ 1, 18, 39, 60;

марш. такси № 54 до остановки ост. авт.

№ «Детский сад».

дом дом 2. ул. Кулагина (б. Полевая), 10, поликлиника горбольницы № БМК (б. п ка РТП), 3 этаж.

ул. Кулагина, 10 (3 этаж) п ка ГБ № Проезд авт. №№ 2, 3, 21, 37;

марш.

такси №№ 42, 76;

трам. №№ 3, 4.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.