WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 11 |

«1 1-й том издания медицинской электронной библиотеки Под редакцией профессора К.А. Лебедева ИММУНОЛОГИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ 1996 ОГЛАВЛЕНИЕ 00.1. Предметный указатель 00.2. Список ...»

-- [ Страница 4 ] --

Соотнесение центробежного ускорения и числа оборотов ротора центрифуги Для соотнесения центробежного ускорения и числа оборотов ротора центрифуги используют следующую формулу:

g = 1,1 х N 2 х R х 10 - где g - центробежное ускорение;

N - число оборотов ротора в 1 мин;

R - радиус окруж ности вращения (расстояние от центра ротора до центра тяжести вращающейся жидко сти).

Приставка к горизонтальному ротору центрифуги для центрифугирования 96-луночных планшетов Если нет готовой приставки, ее можно изготовить самостоятельно. Для этого из листа стали толщиной 2 мм вырезают фигуру соответствующих размеров и формы, края загибают и получают платформу-приставку, величина которой соответствует раз мерам 96-луночного планшета, с бортиками высотой 1-2 см и боковыми стенками, имеющими отверстие для закрепле-ния на боковинах ротора центрифуги. Готовые при ставки попарно уравновешивают (те,которые будут находиться напротив, должны иметь одинаковую массу).

Капельница-дозатор для раскапывания суспензий и растворов.

Капельница-дозатор состоит из двух частей: большого наконечника пипеточного доза-тора, конец которого подрезан таким образом, чтобы площадь его сечения соот ветствовала выходу капли нужного объема (что устанавливается экспериментально), и пустотелого бал-лона (баллончик медицинской пипетки, малая резиновая груша и т.п.).

Обе части наконечник и баллон - герметично соединяют, в результате чего получают капельницу-дозатор.

2.2.1.2. МАТЕРИАЛЫ Планшеты для иммунологических реакций однократного применения 96-луночные с круглодонными лунками объемом 0,2 см 3;

скарификаторы-копья;

триацетатцеллю лозная (ТАЦ) пленка, покрытая тонким слоем дубленого желатина;

стеклянные капил ляры с отметкой на объем 0,008 мл;

пластмассовые трубочки диаметром 3 мм с отмет ками на объемы 0,04 и 0,2 мл;

пластмассовые трубочки, обработанные гепарином;

по лоски хроматографической бумаги № 15.

Триацетацеллюлозная пленка, покрытая слоем желатина. Используемая ТАЦ пленка, покрытая ровным слоем дубленого желатина, аналогична рентгеновской плен ке, но без наполнения солями серебра. Ее режут на прямоугольники размером мм и укладывают в пачки покрытием книзу.

Стеклянные капилляры. Капилляры нарезают длиной 6-7 см, в случае необходимо сти концы их шлифуют. На каждом капилляре делают отметку, соответствующую объе му 0,008 мл. Готовые капилляры стерилизуют нагреванием или облучением ультра фиолетовым светом.

Пластмассовые трубочки для взятия крови на тесты клеточного иммунитета. Про зрачные трубочки должны быть диаметром 3 мм и длиной 6-7 см. С одного конца тру бочки делают две отметки. Одна должна соответствовать объему 0,04 мл, другая - объему 0,2 мл. Трубочки стерилизуют облучением ультрафиолетовым светом или ки пячением в дистиллированной воде.

Пластмассовые трубочки для взятия крови с целью определения содержания им муноглобулинов. Трубочки диаметром 3 мм и длиной 1-6 см промывают водным рас твором гепарина (1000 ед. гепарина/мл дистиллированной воды), содержащим 0,1-0, % агара, высушивают при 500 С в вертикальном положении. На каждой делают отметку, соответствующую объему 0,1 мл. Стерилизуют облучением ультрафиолетовым светом.

Полоски хроматографической бумаги. Хроматографическую бумагу № 15 нарезают на полоски размером 2Х5 мм.

2.2.1.3. РЕАКТИВЫ Раствор Хенкса, физиологический раствор, раствор Олсвера, глутаровый альдегид, формалин, уксусная кислота ледяная, теофиллин кристаллический, бальзам канадский или пихтовый, желатин пищевой, красители (метиловый зеленый, пираний G, эозин, азур-2), моноспецифические антисыворотки для определения иммуноглобулинов, по лиэтиленгликоль (мм 6000), сухой агар, эритроциты барана, эритроциты мыши, дрожжи пекарские Saccharomyces cerevisiae (или другие частицы для фагоцитоза: формалини зированные эритроциты барана либо частицы латекса).

Раствор Хенкса.

Для приготовления 10-кратного концентрата раствора Хенкса на 1 л раствора бе рут: NaCI - 80,0 г;

КСl - 4,0 r;

MgSO4 1O H 2 0 - 2,0 г;

СаCl 6 Н 2 0 - 2,76 г;

КН 2РО 4 -0,6г;

Примечание [ГАсГ1]:

Na 2 HPO 4 ·12 Н 2 0 - 1,53 г;

глюкоза - 10,0 г;

феноловый красный - 0,2 г. остальное - во да дистиллированная.

Для получения раствора Хенкса (однократного) 1 объем 10-кратного концентрата раствора Хенкса смешивают с 9 объемами дистиллированной воды. рН раствора дово дят до 7,2-7,4, добавляя по каплям 1%-ный NaOH.

Забуференный физиологический раствор.

Для приготовления 10-кратного концентрата забуференного фосфатами физиоло гического раствора смешивают 9 частей 1,5 М NaCI и 1 часть 1,5 М фосфатного буфе ра. 1,5 М NaCI: 87,7 г NaCI в 1 л раствора;

1,5 М фосфатный буфер: 29,6 мл раствора КН 2 РО 4 (90,73 г/л) смешивают с 70,4 мл раствора Na 2 HPO 4 ·2H 2 0 (118,7 г/л).

Для получения забуференного физиологического раствора (1-кратного концентра та) 1 объем 10-кратного концентрата забуференного физиологического раствора сме шивают с 9 объемами дистиллированной воды. Если рН полученного раствора отлича ется от 7,2-7,4, то его доводят, добавляя по каплям один из растворов, составляющих фосфатный буфер.

Забуференный 10-кратный физиологический раствор с желатином.

4 г кристаллического пищевого желатина смешивают с 96 мл забуференного 10 кратного физиологического раствора. Оставляют для набухания желатина на 1-2 ч. За тем нагревают при перемешивании на водяной бане при 70-800 С до полного растворе ния желатина. Горячий раствор фильтруют. Разливают в стерильные баночки по 5 мл и хранят при +4-100 С. Перед использованием желированный раствор разогревают до комнатной температуры. Раствор желатина может храниться до 1 мес. Даже самое слабое помутнение раствора указывает на развитие в нем микробов. т.е. непригод ность для использования.

Раствор Олсвера Для приготовления раствора Олсвсра на 1 л раствора берут трехзамешенный нит рат натрия - 8,0 г;

лимонную кислоту - 0,55 г, NaCI - 4,18 r;

глюкозу - 18,66 г, остальное - дистиллированная вода. Если рН готового раствора отличается от 6,4, то его доводят, добавляя по каплям раствор трехзамещенного цитрата натрия или лимонной кислоты.

Фиксатор.

К 86 мл забуференного физиологического раствора (или раствора Хенкса) прилива ют 12 мл формалина и З мл 25%-ного раствора глутарового альдегида, перемешивают.

Хранят в плотно закрытой посуде при 4-120 С до 1 мес.

Раствор теофиллина Готовят непосредственно перед использованием. Для приго-товления 0,01 М раство ра 18 мг кристаллического теофиллина растворяют в 10 мл раствора Хенкса.

Краска метиловый зеленый - пиронин.

Раствор А: смешивают 17,5 мл 5%-ного водного раствора пиронина G, 10 мл 2 % ного раствора метилового зеленого (если в красителе содержится примесь метилового фиолетового, то его предварительно отмывают хлороформом и сушат на воздухе) и 250 мл дистиллированной воды.

Раствор Б: 0,02 М ацетатный буфер (рН 4,8). Для его приготовления 4,61 мл ледя ной уксусной кислоты и 16,3 г ацетата натрия смешивают с дистиллированной водой, доводят объем раствора до 1 л.

Растворы А и Б смешивают в равных объемах, добавляют 15% этилового спирта.

Готовую краску фильтруют через плотный фильтр. Вновь приготовленную краску перед использованием проверяют.

Краска Романовского-Гимза.

Для приготовления краски смешивают 3 г азура-2 (азур-2состоит из азура-1 и мети ленового синего в соотношении 1:1), 0,8 г эозина В (желтого водорастворимого эозина), 251) г глицерина и 250 г метанола. Перед использованием краску спешивают с ней тральной или слабокислой дистиллированной водой (с рН 6,7-7) в соотношении 1:10.

Поскольку часто дистиллированная вода имеет рН менее 6, то для разведения краски лучше использовать буферный раствор, который готовят следующим образом.

Раствор А (рН 8,3): 17,81 г Na 2HPO 2 2Н 2 O в 1 л раствора.

Раствор Б (рН 4,5): 13,64 г КН 2РО 4 в 1 л раствора.

Буфер для разведения краски (рН 6,8);

к 1 л дистиллированной воды приливают по 5 мл растворов А и Б.

Раствор канадского или пихтового бальзама.

Готовят насыщенный раствор канадского или пихтового бальзама в ксилоле. Для этого бальзам заливают небольшим количеством ксилола и выдерживают при комнат ной температуре 1-2 нед, периодически встряхивая.

Суспензии эритроцитов Эритроциты барана получают от одного и того же животного. Перед постановкой реакции эритроциты отмывают физиологическим раствором, осаждая каждый раз цен трифугированием при 400g в течение 10 мин до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет бесцветной (обычно 2-3 раза). Для приготовления 0,05%-ной суспензии 0, мл отмытого плотного осадка эритроцитов смешивают с 10 мл раствора Хенкса, после чего к 2,5 мл полученной суспензии добавляют 7,5 мл раствора Хенкса. Суспензию хранят при 4-120С не более трех часов, перед использованием взбалтывают.

Свежие отмытые эритроциты хранят в растворе Олсвера при 4-120С не более нед. Имеется способ, позволяющий хранить эритроциты без ухудшения их способности к розеткообразованию до 12 мес. Для этого отмытые эритроциты смешивают с раство ром Олсвера или физиологическим раствором в соотношении 1:1, к 10 мл полученной смеси добавляют 0,1 мл формалина, перемешивают и хранят при 1- 40С. В этом случае эритроциты отмывают перед использованием физиологическим раствором 5 раз.

Для получения эритроцитов мыши кровь нелинейной мыши берут в пробирку с ге пари-ном. Отмывают и готовят суспензию таким же способом, что и суспензию эритро цитов барана. Хранят так же, как эритроциты барана.

Суспензия клеток пекарских дрожжей.

Свежие или люфилизированные пекарские дрожжи разводят в физиологическом растворе (соотношение объем/объем 1:1) и выдер-живают на кипящей водяной бане мин. После охлаждения половину надосадочной жидкости сливают и добавляют 10% формалина. Хранят при +4-120 С до 12 мес. Не менее чем за 12 ч до иапользования формалинизированные дрожжи трижды отмывают забуферен-ным физиологическим раствором или раствором Хенкса и оставляют в растворе при 4-120С. Перед использо ванием дрожжи трижды отмывают (рН надосадочной жидкости после последней отмыв ки должен составлять 7,2-7,4, т.е. раствор Хенкса не должен менять свой цвет. В про тивном случае отмывку повторяют). Суспензию клеток дрожжей готовят и используют так же, как суспензию эритроцитов.

Пластины, покрытые слоем агара с антисывороткой.

На крышку 96-луночного планшета (размером 9Х12 см), закрепленную по краям винтами на нагревательной подставке из металла (температура 500С ) в строго гори зонтальном положении, наливают 16 мл раствора агара, содержащего моноспецифи ческую антисыворотку к имму- ноглобулинам определенного класса. После осаждения на крышке получается ровный слой геля.

Используемые металлические подставки с закрепленными на них крышками для нагревания перед началом работы помещают в термостат с температурой 600С. Выни мают по очереди непосредственно перед заливкой агара.

Раствор агара, содержащий моноспецифическую антисыворотку, готовят следую щим образом. Вначале готовят раствор, содержащий 1,5% агара, 2% полиэтиленглико ля (М.м. 6000) (в случае приготовления раствора агара для определения lgM полиэтиленгликоль не добавляют), 0,0001% мертиолата, остальное - физиологический раствор (рН дистилли рованной воды, взятой для приготовления физиологического раствора, должен быть не менее 6.8). Агар и полиэтиленгликоль смешивают с физиологическим раствором и на гревают на кипящей водяной бане до полного растворения всех компонентов (обычно в течение 3-4 ч), после чего добавляют мертиолат. Приготовленный коллоидный раствор (в застывшем виде - гель) можно хранить в холодильнике до использования. Готовый раствор агара доводят до температуры 50 0C, после чего к нему приливают моноспе цифическую антисыворотку к иммуноглобулинам соответствующего класса в таком ко личестве, которое рекомендуется в паспорте используемого комплекта антисывороток.

Полученный раствор немедленно разливают на пластины (ими могут служить пласт массовые крышки планшетов).

Крышку со слоем агара, содержащего моноспецифическую антисыворотку, охлаж дают до +40C, после чего плотно закрывают аналогичной пустой крышкой, герметизируют при помощи изоляционной полиэтиленовой ленты и хранят при +4- +120 C до использо вания (в пределах года).

Система "Иммунокап".

При отсутствии коммерческой системы Иммунокап ее можно приготовить самостоя тельно (Петров и др., 1987;

Лебедев и др., 1988). Приведем вариант системы, отрабо танный А.А. Тотоляном (Тохтабаев и др., 1987).

Готовят агарозную среду, содержащую 80 мг агарозы, 50 мг полиэтиленгликоля (М.

м. 6000), 80 мл веронал-мединалового буфера (рН 8.6), 0,0001% мертиолата и около мл (в зависимости от партии) моноспецифической антисыворотки для определения иммуноглобулинов классов А, М или G. При этом гель для определения lgA подкраши вают красным цветом (добавляя 20 мкг сафранина), для определения lgM - синим (до бавляя 10 мкг кумасси голубого), гель для определения lgG оставляют бесцветным.

Каждым из трех приготовленных растворов при температуре 50-520C заполняют по од ному каналу трехканального капилляра (длиной 3 см), после чего каналы запаивают с обоих концов. Приготовленные таким способом капил-ляры укладывают во флакон, за ливают 10-20 % -ным раствором желатина и хранят при О- +40C до 1 года. Из указанно го количества агарозной среды может быть получено 300-350 готовых капилляров.

2.2.2. ТЕХНОЛОГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГРАММЫ 2.2.2.1. ВЗЯТИЕ КРОВИ Кровь для определенна комплекса иммунологических показателей забирают ут ром. Кровь берут из 2-4-го пальца любой руки. Подушечку пальца обрабатывают ват ным тампоном, смоченным спиртом, затем протирают сухим стерильным ватным там поном, после чего прокалывают стерильным скарификатором- копьем однократного применения резким быстрым движением. Первую каплю крови убирают при помощи стерильного тампона. Затем, нажимая на палец, выдавливают следующую каплю, ко торую и используют для анализа. Кровь не должна растекаться на пальце, она должна быть в виде капли. Кровь для определения содержания лейкоцитов и лейкограммы, оценки показателей клеточного иммунитета и определения уровней иммуноглобулинов обычно набирают раздельно (в этом случае на весь комплекс анализов идет 0,07-0, мл крови), но можно набирать одновременно на все тесты в пластмассовую гепарини зированную пробирку объемом 0,5 см 3 (в этом случае необходимо 0,2 - 0,3 мл крови).

Мазок крови для подсчета формулы делают вначале.

При взятии крови не следует сильно надавливать на палец, поскольку это спо собствует выходу вместе с кровью тканевой жидкости. Для облегчения взятия крови ру ки, если они холодные, лучше разогреть (например, теплой водой) или встряхнуть кисти рук в опущенном положении. Качественный прокол пальца на всю длину копья не толь ко является менее болезненным, но и облегчает взятие крови.

Поскольку кровь, взятая из пальца, начинает свертываться не сразу, а через 1- мин, то в тех случаях, когда взятую кровь обрабатывают сразу (например, смешивают с раствором уксусной кислоты или с дистиллированной водой при осуществлении гемо лиза), соответствующие капилляры и трубочки нет необходимости обрабатывать анти коагулянтом.

В капилляр кровь поступает самотеком, за счет капиллярной силы, в трубочку ее набирают при помощи медицинской пипетки, надетой на противоположный ее конец.

2.2.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ И ФОРМУЛЫ КЛЕТОК КРОВИ (ЛЕЙКОГРАММЫ) Определение содержания лейкоцитов.

В стерильный стеклянный капилляр набирают 0,008 мл (точно до отметки) крови из пальца (или из пробирки) и быстро переносят в лунку планшета для иммунологических реакций, куда предварительно залито 0,1 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты, пе ремешивают. Кровь сбрасывают из капилляра в лунку при помощи пипетки с переход ником, с которой соединяется капилляр. Полученная взвесь может храниться до 4 ча сов.

Перед просчетом результатов взвесь тщательно перемешивают пипеткой с пласт массовым наконечником и заполняют ею камеру Горяева (следить за тем, чтобы в ка меру не попали пузырьки воздуха). Подсчитывают с применением объектива 20 и окуляра 7 общее количество лейкоцитов. При указанных условиях одновременно можно подсчитывать и количества лимфоцитов и моноцитов. При подсчете количества клеток в 20 больших квадратах камеры Горяева абсолютное содержание клеток в 1 мкл крови определяют по формулам:

L=K х a1 / 1000, где L - содержание лейкоцитов в крови (10 9 /л), а 1 - количество лейкоцитов, найденных в 20 больших квадратах камеры Горяева Л = K х а2 / 1000, где Л - содержание лимфоцитов в крови, 10 9 /л, а 2 - количество лимфоцитов, найден ных в 20 больших квадратах камеры Горяева, К - коэффициент пересчета;

при указанном режиме подсчета в стандартной камере Горяева (имеющей площадь 9 мм 2 и глубину 0.1 мм 2 ) К= 169.

При использовании других режимов подсчета (других объемах раствора уксусной кислоты и крови, другом количестве просчитанных в камере квадратов) формулу пере счета можно вывести из следующей общей формулы:

=400 х a х в / 1000 х б, где Х - содержание исследуемых клеток в крови, 10 9л;

а - количество клеток, най денных в определенном числе квадратов;

б - количество сосчитанных малых квадратов (в 1 большом квадрате содержится 16 малых);

в - разведение крови.

Определение популяционного состава клеток крови в мазке (формулы крови).

Для приготовления мазка необходимо использовать чистые тщательно обезжирен ные предметные стекла. Поверхностью предметного стекла (ближе к краю) касаются капли крови, выступившей из пальца (или помещают на него небольшую каплю из про бирки), и тотчас же делают мазок при помощи другого стекла, имеющего шлифованный край, ширина которого должна быть меньше ширины первого стекла. Для этого второе стекло прикладывают к первому под углом 450 и после соприкосновения с каплей и рас текания последней по всей ширине шлифа двигают его в направлении свободного кон ца так, чтобы степень нажатия определя-лась только массой этого шлифованного стек ла. Полученный мазок сушат на воздухе, затем на нем пишут графитным карандашом дату обследования и данные пациента. Высушенный мазок фиксируют, выдерживая в метаноле в течение 5-10 мин.

Мазки окрашивают по методу Романовского-Гимза. Способ состоит в том, что на мазок наливают краску, приготовленную так, как описано ранее (краску разводят буфе ром непосредственно перед окрашиванием). Выдерживают 5 мин, иногда до 20 мин (время подбирают экспериментально), после чего препарат промывают водой и высу шивают на воздухе.

Обычно подсчет клеток проводят при иммерсионном увеличении объектива Х90.

(При определенном навыке и настройке света в микроскопе по Кеплеру можно считать формулу клеток и при увеличении объектива 20 и окуляра 10, что существенно по вышает скорость счета без потери качества. В этом случае, конечно, любой мазок с по дозрением на присутствие атипичных клеток нужно просматривать при иммерсионном увеличении объектива 90.) Подсчет ведут во всем мазке, передвигая его, пытаясь захватить разные поля, зиг загообразно. Следует помнить, что более крупные клетки крови находятся ближе к краю препарата. Клетки различают по величине, форме ядра и окраске. Определяют процентное соотношение клеток разных популяций.

В хорошо приготовленном, правильно зафиксированном и окрашенном мазке клет ки имеют следующий вид.

Лимфоциты - округлые клетки диаметром 5-15 мкм. Имеют округлое или овальное хорошо прокрашивающееся (темно-фиолетовое) ядро, окруженное более или менее узким поясом цитоплазмы, окрашивающейся в ярко-голубой или синий цвет.

Моноциты - крупные клетки округлой (реже неправильной) формы размером 12- мкм с хорошо выраженной цитоплазмой, окрашивающейся в серо-голубой или дымча тый цвет и имеющей мельчайшую азурофильную зернистость, с большим эксцентриче ски располо-женным ядром округлой, бобовидной или неправильной формы, которое прокрашивается на столь интенсивно, как ядро лимфоцитов (в светло-фиолетовый или сиреневый цвет).

Нейтрофилы - округлые клетки диаметром 10-15 мкм, имеющие узкое ядро, окра шивающееся в фиолетовый цвет, в виде изогнутой палочки или подковы (палочкоядер ные нейтрофилы) или в виде 2-5 сегментов (сегментоядерные нейтрофилы). У сегмен тоядерных нейтрофилов ядро прокрашивается более интенсивно. Цитоплазма нейтро филов прокрашивается слабо (обычно она бесцветная либо бледно-розовая, либо бледно-сиреневая из-за очень мелкой зернистости).

Эозинофилы - округлые клетки диаметром 12-17 мкм. Ядро у них более широкое, чем у нейтрофилов, состоит обычно из 2-3 сегментов и окрашивается в фиолетовый цвет. Цитоплазма бесцветна и имеет характерные эозинофильные зерна ярко оранжевого или красного цвета.

Базофилы имеют округлую или округло-овальную форму и диаметр 8-12 мкм, яд ро неясной структуры, обычно двух- или трехлопастное или округлое, которое окраши вается в фиолетово- розовый цвет. Цитоплазма окрашивается в слабо-розовый цвет (обычно более интенсивный, чем у нейтрофилов), но содержит крупные базофильные гранулы, окрашивающиеся в темный фиолетовый цвет.

2.2.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПЛЕКСА ПОКАЗАТЕЛЕЙ РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ И ФАГОЦИТОЗА Получение лейкоцитов.

В стерильную пластмассовую трубочку, которая соединена с медицинской пипет кой, набирают 0,02-0,04 мл крови из пальца (или из ампулы), быстро переносят ее в лунку планшета, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, тщательно перемеши вают. Через 40 с осмотическое давление среды восстанавливают, приливая в лунку той же трубочкой 0,2 мл 10-кратного концентрата забуференного физиологического рас твора, содержащего 4% желатина, перемешивают. Полученная взвесь клеток может храниться в лунке до 2 часов.

Клетки осаждают центрифугированием при 80-120g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость полностью сливают из планшета, осторожно, но быстро переворачивая его вверх дном лунок. К полученному осадку лейкоцитов приливают 0,3 мл раствора Хен кса. В результате получают суспензию лейкоцитов, которую используют для постановки комплекса тестов розеткообразования и фагоцитоза (перед использованием клетки ре суспендируют).

Постановка реакций розеткообразования и фагоцитоза.

Реакции ставят в 96-луночных планшетах доя иммунологических реакций одно кратного применения, имеющих круглодонные лунки объемом 0,2 мл. Для герметизации в крышку планшета вкладывают полиэтиленовую пленку-прокладку. В процессе поста новки реакции крышку закрепляют на планшете при помощи обхвата из тонкой резины.

Для работы с суспензиями и растворами пользуются капельницами с объемом капель 0,05 и 0,025 мл.

Различают спонтанное розеткообразование и фагоцитоз (т.е. без дополнительной нагрузки, используют для выявления Т-, В-лимфоцитов, фагоцитарной активности ней трофилов) и нагрузочные тесты розеткообразования.

Е-розеткообразование (Т-лимфоциты).

В лунку планшета заливают 0,05 мл суспензии лейкоцитов. Приливают 0,05 мл 0,05%-ной суспензии эритроцитов барана. Центрифугируют при 200g в течение 5 мин, затем инкубируют при 8-120С 30 мин.

М-р о з е т к о о б р а з о в а н и е (В-л и м ф о ц и т ы).

Тест М-розеткообразования ставят так же,как тест Е-розеткообразования,но вместо суспензии эритроцитов барана приливают 0,05 мл 0,05%-ной суспензии эритроцитов мыши.

Фагоцитоз нейтрофилов.

Тест фагоцитоза ставят так же, как тест Е-розеткообразования, но вместо суспензии эритроцитов барана приливают 0,05 мл 0,05%-ной суспензии фиксированных клеток пекарских дрожжей (вместо дрожжевых клеток можно использовать эритроциты, фик сированные альдегидами, частицы латекса или микробы).

Нагрузочные тесты.

Нагрузочный тест Е-розеткообразовання с теофиллином ставят для оценки субпо пуляций Т-лимфоцитов, обладающих хелперной (теофиллин-резистентные Т-клетки) и супрессорной (теофиллин-чувствительные Т-клетки) активностью. Для постановки это го теста в лунку планшета заливают 0,05 мл суспензии лейкоцитов, приливают 0,05 мл 0,01 М раствора теофиллина в растворе Хенкса. Инкубируют при 370С в течение 1 часа.

Далее приливают 0,05 мл 0,05%-ной суспензии эритроцитов барана и ставят реакцию Е-розеткообразования, как описано выше.

Нагрузочные тесты с другими препаратами (например, антигенами, иммуномодуля торами) ставят аналогично, но инкубируют обычно при 370С в течение 0,5 часа (можно ставить нагрузочные тесты с инкубацией клеток при 370С без препаратов в течение 0,5;

1,0;

1,5 часа;

можно ставить нагрузочные тесты не только Е-розеткообразования, но также М-розеткообразования и фагоцитоза).

После завершения реакций (т.е. после инкубации осадка при 8 -120С в течение мин) приступают к этапу приготовления препаратов. Для этого в лунки осторожно, так, чтобы не повредить осадок, добавляют 0,025 мл фиксатора, выдерживают при комнат ной температуре 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют одновременно из всех лунок планшета ин тенсивным стряхиванием. Затем в каждую лунку заливают по 0,05 мл раствора краски.

Далее к планшету прикладывают лист триацетатцеллюлозной пленки, покрытый слоем дубленого желатина. Сверху накладывают металлическую крышку, к нижней стороне которой (той, которая прикладывается к пленке) приклеен ровный слой поролона тол щиной 0,5 см. Крышку плотно прижимают при помощи зажимов. Осадки клеток тща тельно ресуспендируют постукиванием планшета вверх и вниз дном лунок. Затем планшет центрифугируют вверх дном лунок при 200g в течение 5-10 мин. После этого планшет переворачивают, жидкость стряхивают обратно в лунки, а пленку осторожно вынимают и быстро высушивают под вентилятором в токе воздуха (лучше теплого).

Высушенную пленку немедленно промывают водопроводной водой, промокают фильт ровальной бумагой и повторно сушат в токе воздуха в распрямленном состоянии.

На высушенную пленку со стороны препаратов наносят раствор канадского или пихтового бальзама и прижимают к предметному стеклу. Препараты готовы к микроско пированию. На одном стандартном предметном стекле помещается 24 препарата.

Оценка результатов.

В готовых препаратах подсчитывают количество розеткообразующих лимфоцитов и нейтрофилов на 50 соответствующих клеток или количество фагоцитирующих нейтро филов на 50 нейтрофилов с применением объективов 20 или 40 при обязательной настройке света в микроскопе по Кеплеру. За розеткообразующую считают клетку, к ко торой прикрепилось 3 или большее количество эритроцитов. За фагоцитирующий счи тают нейтрофил, захвативший 1 или большее количество частиц. Вычисляют % розет кообразующих и фагоцитирующих клеток.

Определение абсолютного содержания клеток в объеме крови проводят по форму лам:

Е-РОЛ 10 9/л = Л 10 9/л Е-РОЛ% / 100%, М-РОЛ 10 9 /л = Л 10 9/л М-РОЛ% / 100%, где Е-РОЛ - Е-розеткообразующие лимфоциты, соответственно 10 9/л и %;

М-РОЛ - М-розеткообразующие лимфоциты, 10 9 /л и %, Л - содержание лимфо цитов в крови, 10 9 /л.

Абсолютное содержание остальных розеткообразующих и фагоцитирующих клеток определяют аналогично.

Определение количества теофиллин-чувствительных Е- РОЛ осуществляют по формуле Етф.ч.- РОЛ = Е- РОЛ - Етф.р.- РОЛ, где Е- РОЛ - количество Е-розеткообразующих лимфоцитов (спонтанных), %, Етф-р.- РОЛ - количество теофиллин-резистентных Е- РОЛ, % (субпопуляция, обогащенная клетками с хелперной активностью), Етф.ч.-РОЛ - количество теофиллин чувствительных Е-РОЛ, % (субпо-пуляция, обогащенная клетками с супрессорной ак тивностью). Определение содержания нулевых клеток производится по формуле О-кл., %=100 % - (Е- РОЛ, % + М- РОЛ, %), где О-кл. - нулевые клетки.

Определение индекса нагрузки производится по формуле ИH = E- РОЛ, % / Е- РОН, %, где ИН - индекс нагрузки (индекс напряженности). Вычисляется как для препаратов спонтанных Е-РОК, так и для препаратов Е- РОК в нагрузочных тестах. Наибольшее диагностическое и прогностическое значение приобретает ИН в препарате, имеющем минимальный (среди прочих) уровень Е- РОН.

Полезно вычислять среднее значениеИН в комплексе нагрузочных тестов.

Определение индекса сдвига производится по формуле ИC = E- РОК с препаратом / Е- РОК без препарата, где ИС - индекс сдвига, показывающий влияние препара та(антигена,иммуномодулятора) на активность клеток в тесте;

Е- РОК с препаратом - количество Е-розеткообразующих клеток в нагрузочном тесте, который заключается в инкубации клеток в течение определенного времени с препаратом;

Е-РОК без препара та - количество Е-розеткообразующих клеток того же типа в нагрузочном тесте, который заключается в инкубации клеток в тех же условиях и в течение того же времени, но без препарата.

2.2.2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Модифицированный метод радиальной иммунодиффузии.

Определение содержания иммуноглобулинов в предлагаемом комплексе микроме тодов осуществляют с использованием либо цельной крови, либо плазмы, которыми пропитывают полоску хроматографической бумаги размером 25 мм. Пропитку полоски бумаги кровью ведут непосредственно на пальце, после чего ее немедленно помещают на слой агара с антисывороткой.

Плазму получают следующим образом. В пластмассовую трубочку, предваритель но обработанную гепарином и высушенную, забирают из пальца 0,1 мл крови при по мощи глазной пипетки, подсоединенной к другому концу трубочки, после чего ее не медленно и осторожно вставляют в слой вязкого материала (например, в лунку план шета, набитую пластилином). Центрифугируют при 200g в течение 10 мин, в результате чего кровь расслаивается: внизу находятся эритроциты и лейкоциты, вверху - плазма.

Трубочку в месте разделения слоев разрезают ножницами, и ту часть, где содержится плазма, ставят в другой планшет с пластилином. Трубочки закрывают сверху кусочком пластилина и хранят в морозильной камере до проведения анализа. Перед использо ванием плазму размораживают, пропитывают ею полоски бумаги и немедленно поме щают их на слой агара.

Если кровь забирают в гепаринизированную пробирку объемом 0,5 мл, то ее цен трифугируют при 100g 10 мин, плазму отбирают при помощи пласт массовой трубочки (негепаринизированой), насаженной на пипетку, ставят ее в планшет, набитый пласти лином, хранят и используют так же, как описано выше.

Определение содержания иммуноглобулинов осуществляют так. Пропитанные кро вью или плазмой полоски хроматографической бумаги немедленно накладывают на слои агара, содержащие антисыворотку к иммуноглобулинам классов А, М и G, плотно прижимая к поверхности агара пинцетом. На каждый планшет с агаром накладывают также полоски, пропитанные образцами стандартной сыворотки человека: неразведен ной и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. После этого слои агара накрывают крышкой и герметизируют при помощи изоляционной ленты. Инкубируют при комнатной темпера туре: для определения содержания lgG в течение 12-24 часов, lgA - 20-30, lgM - 24- часов. Увеличение времени инкубации повышает чувствительность реакции, т.е. сни жает порог выявления минимального уровня иммуноглобулинов.

По окончании инкубации на пластинах замеряют ширину полос преципитации от края полоски бумаги при помощи окуляр-микрометра лупы бинокулярной стереоскопи ческой (МБС-9 или МБС-10) при косом освещении пластины, всегда используя одно и то же выбранное увеличение лупы. Повысить визуальную четкость края преципитата можно путем заливки пластин агара с преципитатами 10%-ным раствором уксусной ки слоты.

Содержание иммуноглобулинов в исследуемых образцах определяют по калибро вочной кривой, которую строят на полулогарифмической бумаге. Для этого по оси абс цисс откладывают размеры преципитатов стандартной сыворотки человека в различ ных разведениях, по оси ординат - известное количество иммуноглобулинов в граммах, содержащееся в 1 л стандартной сыворотки. Полученные точки соединяют. Таким спо собом строят калибровочные кривые для каждого класса иммуноглобулинов.

Для определения содержания иммуноглобулинов в исследуемом образце на оси абсцисс откладывают ширину преципитата, восстанавливают перпендикуляр до пере сечения с калибровочной кривой, точку пересечения проецируют на ось ординат и счи тывают содержание иммуноглобулинов.

Метод иммунодиффузии с использованием системы "Иммунокап" Для определения содержания иммуноглобулинов этим способом обычно использу ют плазму (или сыворотку) крови, разбавленную в 10-50 раз физиологическим раство ром. Плазму вначале выделяют из крови, а потом уже разбавляют, поскольку разбав ление крови физиологическим раствором смещает равновесие белков, что приводит к десорбции с поверхности клеток иммуноглобулинов и, следовательно, созданию до полнительных нестандартных условий.

Перед проведением анализа флакон с капиллярами, залитыми желатином, извле кают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 часов или при 37-400С 10-15 мин. После разжижения желатина капилляр достают из флакона пинцетом, отмывают под струей теплой водопроводной воды, высушивают фильтро вальной бумагой и погружают в пластмассовую пробирку объемом 0,5 см3, заполнен ную смесью плазмы и физиологического раствора. Пробирку закрывают крышкой и ин кубируют в горизонтальном положении при 370C в течение 48 часов.. После окончания инкубации капилляры вынимают, протирают сухой марлей и измеряют длину столбика преципитации при помощи шкалы окуляр-микрометра бинокулярной стереоскопической лупы. С помощью калибровочных кривых определяют содержание иммуноглобулинов соответствующего класса.

При наличии коммерческих наборов системы Иммунокап данный способ явится для практики более удобным в связи с простотой и экономией времени и материалов, а также из-за возможности анализа не только одновременно десятков проб (как на пла стине), но и единичных проб фактически сразу же при их получении.

2.2.3. ВОЗМОЖНЫЕ ДЕФЕКТЫ ПОСТАНОВКИ КОМПЛЕКСА МЕТОДОВ РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ И ФАГОЦИТОЗА И ПУТИ ИХ УСТРАНЕНИЯ Поскольку клеточные иммунологические методы основаны на взаимодействии жи вых клеток с разнообразными идикаторными частицами, они крайне чувствительны к изменению условий проведения реакции. Постановка этих методов требует особенной тщательности, и в процессе обучения могут возникать ошибки, на первый взгляд мало заметные, которые могут существенно сказаться на конечном результате. Многие из этих возможных ошибок неочевидны, и их устранение требует внимательного анализа.

Остановимся на типичных дефектах, которые наиболее часто встречаются при осуще ствлении описанной технологии, с указанием основных причин, их обусловливающих.

Безусловно, кроме приведенных, возможны и другие дефекты, но они встречаются крайне редко и определение их причин потребует консультации опытного специалиста.

Заметим, что указанные здесь причины возможных ошибок представляют собой те са мые нюансы методики, своеобразное “ноу хау”,без знания которых трудно ожидать ус пешного и быстрого внедрения данной технологии. Мы надеемся, что подробный раз бор ряда ошибок, которые могут встретиться при постановке комплекса тестов розетко образования и фагоцитоза, поможет читателю глубже разобраться в методической сути и тонкостях этих методов и легче их освоить.

1) Через некоторое время после лизиса эритроцитов среда, содержащая клетки и оболочки эритроцитов, желируется в лунках планшета (это может происходить как до, так и после центрифугирования). В связи с этим клеток в получаемых препаратах содержится очень мало.

Причины. Образованию в лунках желеобразной массы способствуют: слишком большое количество (более 0,035-0,04 мл) взятой для гемолиза крови;

длительное хра нение суспензии клеток в лунках перед центрифугированием, особенно при температу ре воздуха выше 200С ;

недостаточно хорошее перемешивание крови и раствора, ис пользуемого для восстановления осмотического давления Устранение. Уменьшить количество забираемой крови до 0,02 - 0,03 мл. Уменьшить время хранения крови перед центрифугированием. Проконтролировать качество пере мешивания крови с водой в процессе гемолиза и после добавления 10-кратного физио логического раствора.

2) В готовых препаратах большое количество эритроцитов человека (они обычно крупнее, чем эритроциты барана или мыши).

Причина. Плохо прошел гемолиз эритроцитов.

Устранение. Прежде всего проверить используемую для этой цели дистиллиро ванную воду: из нескольких партий воды выбрать лучшую (дистиллированная вода, по лученная из водопроводной с большим содержанием ионов хора, даже после повтор ной дистилляции не дает хорошего гемолиза;

в этом случае хорошие результаты мож но получить при деионизации такой воды). Улучшению гемолиза способствуют: интен сификация перемешивания крови с водой во время гемолиза;

уменьшение количества крови, взятой для гемолиза, до 0,02 - 0,03 мл. Следует заметить, что при некоторых за болеваниях (например, при гемолитической желтухе) часть эритроцитов весьма устой чива к изменениям осмотического давления. В этом случае даже повторный их гемолиз дистиллированной водой, как правило, эффекта не дает. Однако нужно знать, что если количество оставшихся нелизированными эритроцитов сравнимо с количеством лейко цитов (даже превышает их число, но не более чем в 2-3 раза), то это практически не влияет на результаты розеткообразования и фагоцитоза.

3) В готовых препаратах (всех или части препаратов, полученных на одной пленке) настолько мало клеток всех типов (лейкоцитов, эритроцитов, дрожжей), что счет практически невозможен.

Причины. Во-первых, неплотное прижатие прокладки крышкой (либо из-за слабых зажимов, либо из-за потери эластичности прокладкой из поролона), в связи с чем в процессе центрифугирования суспензия клеток вытекает из лунок. Во-вторых, плохое ресуспендирование осадка в краске, в связи с чем клетки остаются в осадке на дне лунки и не попадают на пленку.

Устранение. О наличии первой причины свидетельствует отсутствие краски в лун ках после центрифугирования, а также капли краски на кожухе центрифуги. Для устра нения причины необходимо проверить плотность прилегания крышки с прокладкой к планшету, при наличии зазоров следует уплотнить зажимы. Кроме того, если исполь зуемая прокладка недостаточно эластичная и ровная, следует заменить ее новой.

Если вытекания краски с клетками при центрифугировании не отмечено, то наибо лее вероятная причина дефекта состоит в слабом ресуспендировании осадков с крас кой. В этом случае при внимательном просмотре препаратов иногда можно увидеть от дельные конгломераты клеток. Для устранения дефекта необходимо резко усилить ин тенсивность ресуспендирования. Правильное интенсивное ресуспендирование осадка приводит к полной гомогенности распределения клеток на препарате. Следует иметь в виду, что даже при максимальной силе взбалтывания интенсивность перемешивания клеток с краской из-за малого объема лунок значительно меньше той, которая может травмировать или разрушать образованные розетки.

4) В готовых препаратах попадаются клетки из соседних препаратов (например, в препаратах с эритроцитами имеются дрожжевые клетки и наоборот).

Причины. Этот дефект может отмечаться из-за недостаточно плотного прижатия прокладки крышкой или из-за стекания жидкости в процессе извлечения пленки с пре паратами.

Устранение. Первую причину устраняют так же, как предыдущую. Для устранения второй причины планшет с краской после центрифугирования переворачивают пленкой вверх и для того чтобы краска лучше стекала обратно в лунки, постукивают им по по верхности стола несколько раз. Извлекают пленку очень осторожно, тут же перевора чивают ее и сушат в горизонтальном положении.

5) Клетки располагаются в препарате неравномерно, имеются конгломераты.

Причина. Плохо ресуспендирован осадок. Как указывалось выше, ресуспендиро вание осадка должно быть интенсивным. Однако ресуспендирование резко затруднит ся, если среди выделенных лейкоцитов будет часть погибших и разрушенных клеток (из них выбрасываются ДНК и РНК, которые способствуют склеиванию живых клеток в конгломераты) или если из-за плохого гемолиза среди них будет велико содержание эритроцитов человека.

Устранение. Повысить интенсивность ресуспендирования осадка. Проконтролиро вать точность соблюдения всех режимов постановки реакции (на предмет возможного превышения времени хранения лейкоцитарной взвеси после ее получения, качества гемолиза, скорости и времени центрифугирования в процессе постановки реакции, рН используемого раствора Хенкса, времени фиксации). Краску необходимо заливать в лунки немедленно после стряхивания фиксатора во избежание высыхания осадка.

6) В препаратах достаточное количество лейкоцитов, но почти нет эритроцитов, низкое содержание розеток.

Причины. Во-первых, низкая концентрация эритроцитов в рабочем растворе сус пензии эритроцитов. Во-вторых, недостаточное (или отсутствие) перемешивание сус пензии эритроцитов непосредственно перед раскапыванием их в лунки планшета. В третьих, окрашивание недофиксированных клеток, приводящее к лизису эритроцитов.

Устранение. Если в препаратах снижено количество эритроцитов только одного вида (барана или мыши), то третья причина ошибки маловероятна: целесообразно ос тановиться на анализе первых двух причин. Для выявления конкретной причины нужно после тщательного перемешивания используемой суспензии эритроцитов подсчитать содержание этих клеток в камере Горяева. Если содержание эритроцитов окажется ни же 7 х107/мл (обычно в нормальной суспензии их содержание колеблется в пределах 7-17·10 7/ мл), то следует проанализировать первую причину. Низкая концентрация эритроцитов в суспензии может быть из-за недостаточной плотности базисного осадка эритроцитов (в связи с уменьшением времени центрифугирования или снижением цен тробежного ускорения, в частности, из-за снижения напряжения в электросети);

из-за технической ошибки при разведении базисного осадка;

из-за частичного лизиса эрит роцитов при их разведении в недостаточно чистой посуде, а также использования ги пертонических или гипотонических солевых растворов для разведения;

из-за неполного отмывания эритроцитов от лизированных клеток (это обычно бывает в том случае, если отмывка эритроцитов проводится в малом объеме физиологи-ческого раствора, взвесь центрифугируют с большим центробежным ускорением - более 400g и длительно - бо лее 10 мин). Для устранения этой причины необходимо приготовить новую суспензию эритроцитов с учетом перечисленных замечаний.

Если же в рабочей суспензии содержание эритроцитов достаточно, то следует по вторить постановку реакции с той же суспензией, но после тщательного ее перемеши вания (поскольку эритроциты, обладающие большой удельной массой, быстро оседают на дно пробирки). Получение качественных препаратов будет указывать на то, что де фект был обусловлен второй причиной.

Если дефект не устранился, то нужно внимательно пересмотреть дефектный пре парат. Отсутствие в нем целых эритроцитов, наличие мембран эритроцитов вокруг час ти лейкоцитов утвердят оставшееся предположение о том, что причина дефекта состо ит в применении испорченного фиксатора или в несоблюдении времени фиксации.

(Следует помнить, что глутаровый альдегид, который входит в основу фиксатора, - ве щество крайне неустойчивое и быстро разрушается, особенно на свету. По этой причи не срок хранения готового фиксатора не должен превышать 1 мес. Не рекомендуется использовать для приготовления фиксатора старый глутаровый альдегид). Для устра нения дефекта следует приготовить свежий фиксатор из реактивов, использованных ранее. Если это не поможет устранению дефекта, нужно приготовить новый фиксатор с использованием свежих реактивов (глутарового альдегида, формалина, буферного раствора).

7) В препарате мало лейкоцитов, в то время как количество эритроцитов и дрожжевых клеток нормальное.

Причина. Потери клеток в процессе гемолиза или хранения лизированной крови в физиологическом растворе.

Устранение. Для предупреждения потерь клеток в процессе гемолиза необходимо точно соблюдать все режимы операции: время гемолиза и соотношение дистиллированной воды и 10-кратного концентрата физиологического раствора, добавляемого для восстановле ния осмотического давления (это соотношение должно составлять точно 9:1, т.е. на восстановление осмотического давления среды после добавления 1,8 мл дистиллиро ванной воды необходимо брать точно 0,2 мл 10-кратного концетрата физиологического раствора, быстро перемешивать). В результате гемолиза должны оставаться все лей коциты, присутствующие в данной капле крови (это проверяется по их соотношению, которое должно быть таким же, как в крови). Следует помнить, что, повреждение лей коцитов вредно еще и потому, что разрушенные клетки высвобождают ДНК и РНК, ко торые способствуют слипанию других, неповрежденных клеток в конгломераты и, как следствие этого, их потере.

Для сохранности клеток в процессе гемолиза, и особенно при хранении, важнейшее значение имеет рН дистиллированной воды. Оптимальным для жизнедеятельности клеток является рН 7,2-7,4. Однако часто дистиллированная (так же как и бидистилли рованная) вода имеет рН 5,5 и даже ниже. В этом случае с целью создания для клеток оптимальной среды по окончании гемолиза используют забуференный 10-кратный фи зиологический раствор. Для гемолиза лучше использовать дистиллированную воду с рН, во всяком случае, не ниже 6 (с этой целью перед перегонкой в дистилляторе в воду добавляют раствор бикарбоната натрия - несколько капель 1%-ного раствора на 1 л воды).

8) На всем препарате плотно лежат слабоокрашенные тени оболочек клеток, при этом клеток очень мало, они плохо контурированы.

Причина. Оседание оболочек эритроцитов, образовавшихся в результате гемоли за, на дно лунки вместе с клетками и последующий перенос их в лунки постановочных планшетов. При изготовлении препаратов оболочки забивают поле пленки, препятствуя осаждению клеток.

Устранение. Обратить внимание на этапы гемолиза и осаждения клеток. Прежде всего необходимо проконтролировать скорость вращения центрифуги - следить за тем, чтобы центробежное ускорение не превышало 120g (или даже уменьшить его до 80g) при времени центрифугирования 5 мин. Из-за колебаний напряжения в электросети при одном и том же положении ручки регулятора число оборотов ротора центрифуги может существенно изменяться (эти изменения могут составлять до 50% от номинала). При сильных колебаниях напряжения в сети к центрифуге необходимо поставить стабили затор напряжения или наблюдать по шкале число оборотов до выхода центрифуги в режим с их последующей корректировкой. Если скорость центрифугирования нормали зована, а дефект сохраняется, необходимо проконтролировать тщательность переме шивания раствора лизированной крови с 10-кратным физиологическим раствором. Со держание желатина в 10-кратном физиологическом растворе должно составлять не менее 4 %. Необходимо следить за полнотой сливания надосадочной жидкости, содер жащей оболочки эритроцитов.

9) Клетки на препарате видны плохо на фоне слабоокрашенных теней. При большом увеличении видно достаточное количество клеток и розеток.

Причина. Неровная поверхность слоя дубленого желатина на пленке, в связи с чем клетки находятся на разной глубине препарата, а неровности отбрасывают тени.

Устранение. Заменить пленку на новую, с ровной поверхностью желатина.

10) Все поле препарата забито сильно окрашенными частицами.

Клетки видны плохо, их мало.

Причины. Загрязнение большим количеством корпускулярных частиц либо реакци онной среды, либо пленки. Эти примеси препятствуют прилипанию клеток к поверхно сти пленки, а если часть клеток все же осела, то затрудняют их различие.

Устранение. Для постановки реакции необходимо использовать чистые, отфильт рованные растворы. Особенно это касается раствора краски: вновь приготовленную краску нужно тща- тельно отфильтровать, иногда дважды, контролируя отсутствие в ней нерастворивших ся час тиц под микроскопом. Новую партию пленки со слоем желатина перед использованием также необходимо проверить. Пленка хорошего качества на вид должна быть абсолют но прозрачной: замутненность ее свидетельствует о наличии механических примесей.

Если пленка замутнена несильно, необходимо проверить в ней количество загрязняю щих ее частиц под микроскопом и, если оно слишком велико (более трех в поле зрения при увеличении 407), заменить ее другой пленкой.

11) Окраска клеток в препаратах слабая, нечеткая.

Причина. Плохое окрашивание препаратов.

Устранение. Качество окрашивания препарата зависит от: 1) качества фиксатора;

2) качества краски и времени окрашивания;

3) отмывки окрашенного высушенного пре парата водой. Одним из первых признаков непригодности фиксатора является ослабе вание окрашивания клеток (конечно, при хорошей краске). Поэтому, не дожидаясь сле дующих признаков непригодности фиксатора (например, лизиса эритроцитов), необхо димо приготовить новый фиксатор. Если фиксатор работает хорошо, то необходимо проверить краску. Если краска недостаточно сильная, то ее необязательно выбрасы вать: улучшить окрашивание можно за счет увеличения времени выдерживания клеток с краской до 10-25 мин. При низкой эффективности этой меры лучше приготовить но вую краску. Наконец, эффект плохого окрашивания может наблюдаться в тех случаях, когда упускают этап промывания проточной водой пленки с препаратами после пер вичного высушивания (или же промывают слишком долго, более 5 с, и не промокают после промывки).

12) В препаратах достаточно лейкоцитов и дрожжевых клеток, но фагоцитоз практически отсутствует.

Причины. Во-первых, плохое качество частиц, взятых для фагоцитоза. Во- вторых, токсичность среды, в которой находятся клетки, или изменение условий их выделения и хранения, что приводит к резкому угнетению физиологической активности нейтрофилов вплоть до их гибели.

Устранение. Если в цельной крови фагоцитоз идет хорошо (проверочный тест), то нужно проанализировать вторую причину. Нейтрофилы - клетки, пожалуй, наиболее чувствительные к различным воздействиям. Поэтому необходимо проверить условия выделения клеток (время гемолиза не должно превышать 45 с), токсичность среды, ис пользуемой для их выделения и проведения реакции (изменение рН, использование некачественного раствора Хенкса и других реактивов), время хранения лизированной крови в лунках, особенно при несоответствии рН значению 7,2-7,4, чистоту используе мой посуды. Устранение дефектов по перечисленным пунктам позволит устранить вто рую причину отсутствия фагоцитоза.

Если фагоцитоз не идет в цельной крови, то причина дефекта скорее всего в пло хом качестве (например, токсичности) частиц, используемых для фагоцитоза. В про цессе их хранения в суспензии могут накапливаться токсические для нейтрофилов про дукты, резко изменяться рН (например, рН хранящихся дрожжей составляет 2-3). По этому частицы перед использованием необходимо тщательно отмыть (не менее трех раз) и проверить рН жидкости после последней промывки. Если это не устраняет де фект, следует приготовить новую партию частиц для фагоцитоза.

13) В препаратах встречаются микробы, которые частично поглощены нейтрофилами.

Причина. Использование реактивов, контаминированных микроорганизмами (с ак тивным размножением последних).

Устранение. Проверить используемые реактивы, в которых могут развиваться мик робы: раствор гепарина (если кровь берется в пластмассовые пробирки);

10-кратный концентрат фи- зиологического раствора, содержащий желатин (в нем микробы размножаются наибо лее часто);

забуференный физиологический раствор;

раствор Хенкса, используемый для реакции;

растворы лекарственных препаратов и антигенов;

суспензии хранящихся (без добавления формалина) эритроцитов. При обнаружении в реактиве микробов (об этом свидетельствуют изменение рН, помутнение, появление неприятного запаха) ре актив заменяют свежим.

2.2.4. ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ИММУНОГРАММЫ Организация труда по определению иммунограммы может различаться в зависи мости от реальных условий проведения анализа.

В тех случаях, когда забирают кровь непосредственно в лаборатории или месте, находящемся в пределах 1 часа. транспортировки, т.е. в условиях лабораторий поли клиник, клиник, медсанчастей, медпунктов предприятий, передвижных лабораторий, кровь из пальца на все виды анализа целесообразно забирать раздельно, что, во первых, сокращает необходимое количество крови, во-вторых, снижает затраты труда.

В этом случае применяется схема 1 организации труда.

Схема I А. Взятие крови у пациента и ее начальная обработка:

а) приготовление мазка для подсчета формулы крови;

б) взятие крови на определение содержания лейкоцитов и перемешивание ее с ук сусной кислотой в лунках планшета;

в) взятие крови на определение субпопуляций и физиологической активности кле ток, проведение гемолиза в лунках планшетов;

г) взятие крови для определения содержания иммуноглобулинов - пропитывание кровью полосок хроматографической бумаги и накладывание их на слой агара.

Б. Завершение анализа:

а) подсчет общего содержания лейкоцитов в камере Горяева, окрашивание мазков и подсчет формулы лейкоцитов;

б) постановка комплекса тестов розеткообразования и фагоцитоза, подсчет резуль татов;

в) инкубация агаровых пластин и определение содержания иммуноглобулинов по величине зоны преципитации.

В. Оценка результатов и оформление документации.

В тех случаях, когда на транспортировку крови требуется свыше 1 часа(но не более 4 часа), особенно если количество обследуемых невелико, целесообразно забирать кровь в гепаринизированную пробирку, откуда затем ее берут на все виды анализа. В этом случае применяют схему II организации труда.

Схема II А. Взятие крови у пациента:

а) приготовление мазка для подсчета формулы крови;

б) взятие крови в гепаринизированную пластмассовую пробирку объемом 0,5 см для определения содержания лейкоцитов и постановки иммунологических реакций.

Б. Разделение крови для каждого анализа и ее начальная обработка.

а) перемешивание и взятие в лунку с уксусной кислотой ;

б) центрифугирование, отбор плазмы в трубочки (при необходимости постановка их на хранение);

в) взятие части осадка клеток из пробирки, проведение гемолиза.

В. Завершение анализа:

а) подсчет общего содержания лейкоцитов в камере Горяева, окрашивание мазков и просчет формулы лейкоцитов;

б) постановка комплекса тестов розеткообразования и фагоцитоза, подсчет резуль татов;

в) постановка реакции преципитации (пропитка полосок хроматографической бумаги плазмой, накладывание их на агар), инкубация пластин с агаром, определение содер жания иммуноглобулинов.

Г. Оценка результатов и оформление документации.

Мы привели две наиболее различающиеся схемы организации работ по проведе нию иммунологического обследования в пределах предложенной технологии. Однако в зависимости от конкретных условий их можно варьировать. Например, если в условиях лабораторий небольших поликлиник, больниц и т.д. поток больных невелик (менее чел. в день) и если результаты не требуются достаточно быстро, то постановку реакции преципитации для определения содержания иммунологлобулинов можно осуществлять не сразу при взятии крови, а после накопления определенного количества образцов плазмы. В этом случае при осуществлении схемы 1 кровь на иммуноглобулины берут не на полоски бумаги, а в гепаринизированные трубочки. Конечно, в этом случае до бавляются операции их центрифугирования и отделения плазмы путем разрезания трубочки. С другой стороны, при осуществлении схемы II полоски хроматографической бумаги можно пропитывать непосредственно кровью из пробирки и сразу же наклады вать их на агар, не проводя операций по отделению и отбору плазмы.

При хорошо организованной работе и наличии готовых коммерческих комплектов материалов и реактивов группа, состоящая из 3 сотрудников (1 врача- лаборанта и лаборантов), может определять полную иммунограмму не менее чем у 100 пациентов в неделю.

Приведем ориентировочные нормативы времени осуществления некоторых опера ций постановки иммунограммы для одного лаборанта.

Взятие крови с предварительной обработкой по схеме 1 у 24 пациентов (при обес печении непрерывного потока пациентов) - 1 час.

Подсчет содержания лейкоцитов в камере Горяева у 24 пациентов - 1 час.

Постановка комплекcа тестов розеткообразования и фагоцитоза для 48 пациентов с получением окрашенных препаратов (по 5 тестов на каждого пациента) - 4 часа.

Просчет уровней розеткообразования или фагоцитоза лимфоцитов и нейтрофилов в 24 препаратах - 1-1,5 часа.

Определение содержания иммуноглобулинов трех классов (с пересчетом по ка либровочной кривой) у 24 пациентов - 2 часов.

Заполнение всей документации (в том числе бланков ответов) на 24 пациента (без составления заключения) - 2 часов.

Один лаборант может в течение 3 рабочих дней сделать 24 комплексные иммуно граммы.

3.0. Глава ИММУНОГРАММА ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ Выше мы отмечали, что понятие нормы иммунной системы неоднозначно: нор мальным является не только спокойное состояние иммунной системы здорового человека, но и ее активная работа в период протекания острого воспалительного процесса. Для каждого из этих состояний - и спокойного, и активного, конечно, будут свои нормативные значения показателей, которые могут различаться весьма сильно.

Например, значения уровней эозинофилов и Т-лимфоцитов периферической крови в активном состоянии иммунной системы будут значительно ниже, чем в спокойном, а уровни лейкоцитов - существенно выше. Впрочем, для каждой стадии нормально теку щего воспалительного процесса характерны свои уровни показателей. В целом они со ставляют определенную оптимальную (нормальную) динамику показателей, сравнение с которой изменений показателей пациента позволяет составить прогноз его состояния.

Подробному описанию такой оптимальной динамики посвящена гл.6 данной книги.

Однако для того, чтобы хорошо ориентироваться в изменениях показателей при воспалительном процессе, необходимо иметь точку отсчета. Ею может служить обще принятый критерий - нормативные значения показателей у клинически здоровых людей.

Здесь недостаточно ограничиться знанием одних лишь среднегрупповых значений па раметров: необходимо знать их возможные значения в популяциях людей разных воз растных групп и иметь представление об их изменениях у индивидов с течением вре мени, под влиянием биоритмических колебаний в организме и разнообразных нагру зочных факторов. Перед тем, как рассмотреть в указанных аспектах значения основных иммунологических показателей, полученные с применением комплексной технологии постановки микрометодов, остановимся кратко на современном представлении о “нор ме” у здоровых людей.

Определение значений иммунологических показателей у здоровых людей тесно касается понятия медицинской нормы. Вопрос о том, что есть норма в биологии и медицине, обсуждался учеными с древнейших времен. Многие ученые и философы указывали на тесное единство нор мы и патологии, невозможность определения одного без другого (Корольков, Петленко, 1977).

И.В. Давыдовский писал (1969), что с общетеоретической и философской точки зрения норма и патология составляют динамическое единство, они представляют две неразрывные стороны жизнедеятельности и характеризуют приспособление организма, поэтому поиски качественных различий между здоровьем и болезнью противоречат здравому смыслу. Однако и врачи, и паци енты всегда будут ощущать необходимость принципиально различать здоровье и болезнь, т.е. с медицинских позиций понятия "норма" и "патология" являются разнокачественными.

В современной медицине, особенно в клинической иммунологии, наиболее распространен ным является представление о норме как о среднестатистической величине отдельных показа телей в группе клинически здоровых людей. Такую норму обычно характеризуют как среднюю арифметическую величину показателя со среднеквадратичным отклонением ( М±m) либо с ука занием границ 95%-ного доверительного интервала.

Хотя многие исследователи указывают на весьма ограниченную ценность подобного опре деления нормы, что связано с большими разбросами показателей (Аничков, 1938;

Петленко, 1982;

Петров, Лебедев, 1985), тем не менее им продолжают широко пользоваться: по всем из вестным параметрам, в том числе периферической крови, имеются таблицы средних показате лей нормы. Однако практический опыт показывает, что для реальной клиники гораздо большее значение имеют не средние значения, а возможные пределы разбросов показателей здоровых людей, хотя большая широта этих разбросов вносит существенные ограничения в информатив ность параметров.

Большие разбросы показателей в группах здоровых людей не случайны: они обусловлены огромным разнообразием значений параметров у индивидов. Если за норму считать значения показателей в границах 95%-ного доверительного интервала, то, как показал Р. Уильямс (1960), у индивида хотя бы один из сотен параметров выйдет за указанные границы нормы;

следователь но, практически каждый человек представляет собой то или иное отклонение от общепринятой нормы. Таким образом, а) каждому человеку присуща своя индивидуальная характеристика нор мы;

б) не всякое отклонение от "нормальных" значений является патологией (Уильямс, 1960).

Принцип индивидуальности нормы справедлив и для динамики состояний. В.М. Дильман показал (1987), что формирование в процессе роста организма нормы, свойственной взрослому человеку ("оптимальной нормы"), происходит индивидуально и заканчи вается у разных людей в разные сроки в интервале от 20 до 25 лет.

Итак, индивидуальная норма человека всегда конкретна и специфична. При этом зна чения отдельных показателей часто вообще не могут служить критерием нормы, посколь ку известны многочисленные случаи резкого отклонения уровней показателей далеко за выявленные пределы нормы (вплоть до полного отсутствия тех или иных компонентов) у клинически здоровых людей, и, напротив, при незначительных отклонениях может на блюдаться серьезная патология (Петленко, 1982;

Петров, Лебедев, 1985). Возникает вопрос:

не является ли норма вследствие указанных причин субъективным, сугубо индивидуальным по нятием, имеющим смысл только для конкретного человека и не имеющим каких-либо обобщен ных, объективных критериев? По-видимому, это не так. Объективные критерии нормы можно вы явить в результате комплексного изучения и сопоставления значений группы показателей.

Обобщенные критерии нормы, вероятно, лежат на уровне системных механизмов, и обнаружить их можно, рассматривая показатели с точки зрения целостной характеристики системы.

Попытки определения нормы с позиции целостной системы организма предпринимались учеными с давних времен. В основном их можно свести к определению нормы как гармонического целостного единства, согласованности всех частей организма (Корольков, Петленко, 1977). В по следние десятилетия подобное осмысление нормы происходит более интенсивно и конкретно.

Так, А.А. Богомолец (1958) оценивал проблему нормы и патологии как проблему нормальной и патологической реактивности. И.В. Давыдовский рассматривал понятие нормы с точки зрения приспособления, уравновешивания физиологическими системами организма воздействий внеш ней среды;

поскольку такое определение характеризует жизнедеятельность вообще, то оно в большей степени вскрывает единство физиологического и патологического, чем определяет по нятие нормы (Давыдовский, 1965). В.В. Парин и Р.М. Баевский (1970) писали, что при рассмотре нии нормы нельзя не учитывать взаимосвязи и взаимовлияния систем и органов, которые могут в интересах целостного организма смещать значения отдельных показателей весьма сильно. При веденные определения, а также подобные определения нормы другими учеными можно сумми ровать следующим образом: норма есть понятие динамическое (Богомолец, 1918;

Клиорин, 1968;

Степанов, 1975;

Шорников, 1981) и должна включать в себя характеристики функционирования и адаптации целостной системы организма (Давыдовский, 1965;

Парин, Баевский. 1970;

Степанов, 1975;

Шорников, 1981;

Петленко, 1982). По-видимому, одним из наиболее глубоких определений нормы является определение ее как функционального оптимума состояния системы (Корольков, Петленко, 1977;

Парин, Баевский, 1970;

Лебедев и др., 1986). Следует отметить, что определе ние нормы - понятие развивающееся и с углублением знаний оно должно совершенствоваться и конкретизироваться.

Не вызывает сомнения, что представление о норме с позиции функционирования целостной системы более научно и полезно, чем определение нормы как среднестатистической величины отдельных показателей. Однако определение системных критериев нормы значительно сложнее, нежели определение отдельных показателей, и является предметом дополнительных исследо ваний. Такие конкретизации системного представления о норме, как биологическая полноцен ность индивида, самочувствие, трудоспособность, душевное и социальное благополучие, отсут ствие болезни или инвалидности (Степанов, 1975;

Петленко, 1982), не могут служить безуслов ными критериями нормы хотя бы из-за их субъективности, поскольку развитие болезни зачастую может происходить незаметно для индивида. По-видимому, эти критерии нуждаются в допол няющих их объективных критериях, которые являлись бы также характеристиками целостной системы организма.

Первый объективный системный критерий состояния организма был выявлен в ре зультате анализа взаимосвязей между компонентами иммунной системы - ИКК (Лебедев и др., 1989). Таким критерием, как было показано выше, оказалась связанность этих компо нентов, которую определяют как количество корреляционных взаимосвязей между пара метрами в изученном комплексе показателей. Считают, что величина связанности компо нентов отражает уровень напряженности системы (Горохов, 1982). У здоровых людей уровень связанности компонентов обычно достаточно низок. При возникновении острого заболевания связанность резко (иногда в несколько раз) повышается, возвращаясь после выздоровления к норме. Однако в случае хронизации процесса связанность постоянно поддерживается на высо ком уровне, поэтому в ремиссии хронических или в промежутках между обострениями рецидиви рующих заболеваний уровень связанности в несколько раз выше, чем в норме. В этом случае ка ждое новое обострение процесса сопровождается не повышением связанности, а снижением, иногда значительным (Лебедев и др., 1987). По-видимому, степень связанности (напряженности) - это важнейший критерий, который должен определяться при оценке состояния здоровья чело века. При этом следует помнить, что с возрастом напряженность системы увеличивается, но это увеличение постепенное и по величине оно обычно в несколько раз слабее, чем при возникнове нии заболевания.

Однако на практике уровень связанности выявить не так просто, поскольку вычисление кор реляционных взаимосвязей требует наличия нескольких десятков измерений комплекса показа телей. Вместе с тем было обнаружено, что изменению уровня связанности иммунологических компонентов у здоровых людей соответствует изменение соотношения Е- РОЛ / Е- РОН в нагру зочных тестах (индекс нагрузки ИН). При повышении напряженности иммунной системы у боль ных ИН снижается. Этот показатель обычно изменяется не столь резко, как связанность, однако он прост в определении и может служить достаточно надежным системным показателем нормы.

3.1. НОРМАТИВЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ РАЗНОГО ВОЗРАСТА Для определения нормативов в обследуемые группы отбирались лица, у которых в результате клинического обследования не было выявлено никаких хронических или ре цидивирующих заболеваний, частота ОРЗ составляла не более 1-2 раз в году. Среди людей старше 60 лет обследовались лица, не имеющие хронических воспалительных заболеваний. В момент обследования и за 2 нед до обследования у всех отобранных лиц никаких физиологических отклонений в функционировании органов выявлено не было. Кровь для получения иммунограммы у обследуемых забирали в 9-10 ч утра. В каждую исследованную возрастную группу входило от 54 до 110 человек. Средние зна чения и возможные разбросы показателей иммунограммы у здоровых людей разного возраста представлены в табл. 1-3.

Таблица Значения показателей иммунограммы у здоровых детей раннего и младшего возраста -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Обозна- Среднее значение М ± m у детей в возрасте Показатель начение ------------------------------------------------------------------------------- 3 - 12 мес 1 - 3 года --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Лейкоциты, 109/л L 10,3 ± 0,21 (6,5 -16,9) 9,3 ± 0,23 (4,8 - 15,6) Лимфоциты, % Л 56,3 ± 1,34 (30 -76) 50,0 ± 1,2 (28 - 72) То же, 109/л 5,80 ± 0,22 (2,1 -11,2) 4,65 ± 14 (1,56 - 9,12) Нейтрофилы Н палочкоядерные, % П 3,3 ± 0,04 (1 - 6 ) 3,6 ± 0,04 (1 - 7) сегментоядерные,% С 25,9 ± 1,10 (14 - 54) 34,1 ± 1,01 (17 - 62) Моноциты,% М 11,2 ± 0,62 (4 -17) 10,2 ± 0,57 (3 - 15) Эозинофилы,% Э 2,1 ± 0,02 (1-5) 1,8 ± 0,02 (1 - 5) Базофилы,% Б 0,2 ± 0,005 (0 -1) 0,3 ± 0,003 (0 - 1) Т -лимфоциты (Е-РОЛ), % Т 48,8 ± 1,05 (21 -83) 62,5 ± 0,86 (30 - 85) То же, 109/л 2,83 ± 0,06 (0,82 -8,20) 2,91 ± 0,07 (0,74 - 6,72) В-лимфоциты (М-РОЛ),% В 19,8 ± 0,95 (4 -55) 15,6 ± 0,60 (4 - 42) То же, 109/л 1,15 ± 0,03 (0,09 -3,21) 0,72 ± 0,03 (0,07 - 2,96) Нулевые клетки, % 0 31,4 ± 1,16 (-10 -56) 21,9 ± 0,93 (-4 - 46) Теофиллин-резистентные Тx 36,3 ± 1,16 (15 -58) 46,1 ± 1,05 (23 - 75) Т-лимфоциты, % Теофиллин-чувствительные Тс 12,5 ± 0,88 (-12 - 40) 16,4 ± 0,95 (-11- 42) Т-лимфоциты, % Е-РОН, % Фа 32,5 ± 0,82 (8 - 60) 31,2 ± 0,78 (7 - 55) Д-фагоцитирующие нейтрофилы,% Фз 28,8 ± 1,36 (9 - 64) 37,6 ± 1.05 (15 - 70) lgA, г/л 0,34 ± 0,03 (0,09-0.72) 0,81±0,05 (0,02 - 1.88) lgM, г/л 0,62 ± 0,04 (0,15-1,73) 0,86±0,05 (0,31 - 1,70) lgG, г/л 4,24 ± 0,15 (1,21-6,34) 9,45±0,27 (4,2 -13,1) СОЭ, мм/ч 4,5 ± 0,18 (1-8) 5,2±0,15 (1 - 10) ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------ Указанные обследованных. Фа - фагоцитоз (фаза адгезии);

Фз - фагоцитоз (фаза захвата). Эти обозначения будут использоваться в последующих примерах.

Здесь и далее в скобках даны минимальное и максимальное значения показателей в группе Как видно из представленных таблиц, средние групповые значения более чем поло вины рассмотренных показателей с возрастом претерпевают заметные изменения. Че рез все возрастные группы проходит постепенное уменьшение абсолютного содержа ния в крови лейкоцитов, суммарных лимфоцитов и их субпопуляций - Т- и В-клеток и постепенное повышение абсолютного содержания нейтрофилов и lgA, а также соотно шения Т- и В-лимфоцитов (если у де- тей в возрасте до 1 года оно составляет 2,5, то у стариков - 8,4). Некоторые показатели суще- ственно изменяются только в детском возрасте, а затем стабилизируются и практиче ски не изменяются до старости. Так, среднее количество нулевых клеток к 1-3 годам жизни снижается почти в 1,5 раза, после чего изменяется незначительно. Содержание lgG увеличивается до 1-3 лет, lgM - до 12-14 лет, относительное содержание фагоцити рующих нейтрофилов и теофиллин- резистентных Т-лимфоцитов (Т-хелперов) - до 8- лет;

после указанных возрастов эти показатели изменяются мало. Некоторые показатели, в частности СОЭ, претерпевают существенные изменения в старости. В целом наиболее сильные изменения иммуноло гических показателей отмечаются в детском возрасте, особенно раннем, что, по видимому, отражает процессы формирования иммунной системы у детей.

Отсутствие изменений ряда иммунологических показателей в зрелом возрасте по сравнению с юношеским вовсе не указывает на то, что изменения в иммунном статусе с возрастом ослабевают. По-видимому, эти изменения достаточно интенсивны, но про являются они в основном на другом уровне - уровне системных взаимоотношений ком понентов иммунной системы. Это подтверждается монотонным усилением связанности компонентов иммунной системы с возрастом, изменением характера взаимосвязей ме жду параметрами (Лебедев и др., 1986, 1987, 1989). В соответствии с этим с возрастом монотонно изменяется индекс нагрузки - системная характеристика, отражающая свя занность параметров (табл. 4).

Таблица Значения показателей иммунограммы у здоровых подростков Среднее значение М ± m у подростков в возрасте Показатель 8 - 10 лет 12 - 14 лет Лейкоциты, 109/л 7,30 ± 0,24 (3,1 -10,0) 7,48 ± 0,28 (3,0 - 9,8) Лимфоциты, % 41,0 ± 1,05 (20 - 55) 33,2 ± 1,12 (18 - 52) То же, 109/л 3,00 ± 0,19 (1,06 - 4,90) 2,50 ± 0,18 (0,95 - 4,68) Нейтрофилы палочкоядерные, % 2,4 ± 0,03 (1 - 6 ) 2,5 ± 0,03 (1 - 6) сегментоядерные,% 45,6 ± 1,17 (32 - 66) 53,0 ± 1,28 (36 - 70) Моноциты,% 8,6 ± 0,43 (3 -12) 8,6 ± 0,43 (3 - 12) Эозинофилы,% 2,0 ± 0,02 (1-5) 2,2 ± 0,02 (1 - 5) Базофилы,% 0,4 ± 0,003 (0 -1) 0,4 ± 0,003 (0 - 1) Т -лимфоциты (Е-РОЛ), % 63,0 ± 1,33 (34 -80) 62,6 ± 1,18 (40 - 81) То же, 109/л 1,89 ± 0,09 (0,66 -3,53) 1,56 ± 0,08 (0,68 - 3,34) В-лимфоциты (М-РОЛ),% 12,9 ± 0,83 (3 -27 12,6 ± 0,80 (3 - 22) То же, 109/л 0,39 ± 0,02 (0,05 -1,15) 0,32 ± 0,02 (0,05 - 1,00) Нулевые клетки, % 24,1 ± 0,91 (-6 - 45) 24,8 ± 0,95 (-3 - 47) Теофиллин-резистентные 46,1 ± 1,05 (23 - 75) 49,5 ± 1,12 (25 - 74) Т-лимфоциты, % Теофиллин-чувствительные 16,9 ± 0.93 (- 8 - 48) 13,1 ± 0,89 (-10 - 43) Т-лимфоциты, % Е-РОН, % 26,7 ± 0,79 (10 - 50) 28,6 ± 0,82 (10 - 51) Д-фагоцитирующие нейтро- 45,6 ± 1,02 (15 - 72) 40,2 ± 1.28 (14 - 71) филы,% lgA, г/л 0,91 ± 0,08 (0,3 - 2,10) 1,12 ± 0,09 (0 - 2,22) lgM, г/л 0,83 ± 0,08 (0,40 - 1,85) 1,00 ± 0,09 (0.52 - 1,90) lgG, г/л 7,82 ± 0,35 (4,5 - 11,6) 9.25 ± 0,38 (5,6 -12,0) СОЭ, мм/ч 9,8 ± 0,19 (1 - 15) 9,0 ± 0,18 (1 - 13) Различия показателей иммунограммы у людей разного пола выражены в основном слабо. Лишь СОЭ у женщин обычно имеет более высокие значения, чем у мужчин. Од нако эти различия четко проявляются на уровне взаимосвязей - в различиях характера связей между иммунологическими параметрами у мужчин и женщин, которые начинают обнаруживаться в 9-14 лет и поддерживаются в течение всей дальнейшей жизни (Шор и др., 1987).

При анализе данных, представленных в табл. 1-3, привлекают внимание весьма широкие диапазоны разбросов каждого из изученных показателей иммунограммы.

Минимальные и максимальные значения показателей у отдельных лиц в группах могут различаться в 10 и более раз. У части здоровых людей могут почти полностью отсутст вовать отдельные компоненты: например, практически не выявлено lgA у здоровых де вочки 14 лет и мужчины 33 лет (повторное клиническое обследование этих людей не выявило у них никаких хронических или рецидивирующих заболеваний, а повторные иммунологические обследования в первом случае через несколько месяцев, во втором - через 0,5 и 1 год подтвердили отсутствие lgA, связанное, вероятно, с генетическими особенностями организма этих людей). Данные литературы свидетельствуют о том, что у здоровых людей практически любого возраста могут отсутствовать не только lgA, но и lgG, lgE, другие компоненты. Конечно, людей с отсутствием какого-либо компонента, так же как людей со слишком низкими или слиш ком высокими значениями того или иного показателя, очень мало, но при анализе им мунограммы не следует упускать из виду возможность весьма резких отклонений пока зателей здоровых людей от средних нормативных значений. Возможные крайние зна чения содержания лейкоцитов и их популяций у здоровых людей подробно рассматри ваются И.А. Кассирским и Д.И. Денщиковым (1974).

Таблица Значения показателей иммунограммы у здоровых людей разного воз раста ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------ Cреднее значение М ± m у людей в возрасте Показатель --------------------------------------------------------------------------------------------------- ------- 18 - 25 лет 27 - 55 лет 60 - 80 лет ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------ Лейкоциты, 109/л 6,53 ± 0,25(3,23-9,6) 5,60 ± 0,21(3,12- 9,5) 4,90 ± 0,26 (2,65 - 8,6) Лимфоциты, % 30,8 ± 1,07 (18 - 48) 29,4 ± 1,11(17- 46) 27,1 ± 1,00 (15 - 44 ) То же, 109/л 2,02 ± 0,15 (0,85-4,19) 1,65 ± 0,11 (0,72-4,10) 1,33 ± 0,12 (0,6 - 3,5) Нейтрофилы палочкоядерные, % 1,8 ± 0,02 (1 - 5 ) 1,56 ± 0,015 (1 - 5) 1,6 ± 0,02 ( 1 - 5 ) сегментоядерные,% 58,2 ± 1,13(40 - 72) 60,3 ± 1,18(42 - 73) 62.6 ± 1,15 ( 43 - 75 ) Моноциты,% 6,5 ± 0,27 (2 -10) 6,2 ± 0,24 (2 - 10) 5,9 ± 0,25 ( 1 - 10 ) Эозинофилы,% 2,3 ± 0,03 (1-5) 2,2 ± 0,03(1 - 5) 2,4 ± 0,03 ( 1 - 5 ) Базофилы,% 0,4 ± 0,003(0 -1) 0,4 ± 0,003( 0 - 1) 0,4 ± 0,003( 0 - 1 ) Т-лимфоциты (Е-РОЛ),% 63,7 ± 1,35(39 -81) 67,3 ± 1,21(40 - 84) 71,2 ± 1,30 ( 38 - 85 ) То же, 109/л 1,28 ± 0,11(0,58-3,25) 1,11 ± 0,10(0,40-3,12) 0,95 ± 0,10( 0,33 - 2,8) В-лимфоциты(М-РОЛ),% 9,6 ± 0,78(3 -26) 8,2 ± 0,88 (2 - 25) 8,5 ± 0,85 ( 2 - 31 ) То же, 109/л 0,19 ± 0,01(0,03-1,03) 0,14 ± 0,01(0,02-0,98) 0,11 ± 0,01( 0,02 - 0,92) Нулевые клетки, % 26,7 ± 0,90(-3 - 42) 24,5 ± 0,92(-4 - 40) 20,3 ± 0,96(- 2 - 37 ) Теофиллин-резистентные 49,8 ± 1,05(32 - 82) 55,6 ± 1,17(36 - 80) 54,4 ± 1,29( 29 - 84 ) Т-лимфоциты, % Теофиллин- 13,9 ± 0.88(- 7 - 45) 12,7 ± 0,91(-10 - 43) 16,8 ± 0,93( -4 - 50 ) чувствительные Т-лимфоциты, % Е-РОН, % 26,4 ± 0,77(9 - 43) 25,4 ± 0,82(10 - 42) 25,5 ± 0,96( 10 - 40 ) Д-фагоцитирующие 41,7 ± 1,35(17 - 70) 45,0 ± 1,08(20 - 71) 47,4 ± 1,06( 10 - 76 ) нейтрофилы,% lgA, г/л 1,39 ± 0,10( 0,3 - 3,50) 1,86 ± 0,09(0 - 4,4) 1,90 ± 0,10(0,4 - 3,45) lgM, г/л 1,2 ± 0,10(0,42- 3,10) 1,00 ± 0,09(0.35-2,90) 1,01 ± 0,10( 0,35 - 3,0) lgG, г/л 11,37 ± 0,39(6,6 - 19,0) 9,85 ± 0,26(5,7-18,0) 11,01±0,45( 6,5 - 20,5) СОЭ. мм/ч 6,8 ± 0,12(2 - 15) 8,1 ± 0,15 (2 - 16) 12,2 ± 0,19( 3 - 25 ) Часто недоумение у иммунологов и клиницистов вызывают такие отклонения показа телей у клинически здоровых людей, которые кардинально отличаются от средних групповых значений. К ним относятся, в частности, отрицательные значения нулевых клеток и теофиллин-чув-ствительных Т-лимфоцитов (Т-супрессоров). Как уже отмеча лось в гл. 2, в получении отри- цательных значений данных показателей на основании использования функциональ ных тестов нет ничего противоестественного. При использовании одного и того же метода количе ство выявляемых Т- и В-лимфоцитов, так же как и чувствительность Т-клеток к теофил лину, зависит от исходного физиологического состояния клеток во всей гетерогенной популяции лимфоцитов. В зависимости от этого состояния на том или ином числе кле ток могут выявляться одновременно маркеры Т- и В-лимфоцитов - тогда вычисляемая сумма Т- и В-клеток превысит 100% и соответственно количество нулевых клеток будет определяться отрицательной величиной. Инкубация (нагрузочный текст) клеток с тео филлином, ингибируя розеткообразование одних Т-клеток, может активизировать ро зеткообразование других, и если последний эффект превалирует, то результатом реак ции будет повышение розеткообразования клеток после инкубации с препаратом, вследствие чего будет выявлено отрицательное количество теофиллин чувствительных Т-лимфоцитов. Для правильного анализа иммунологических данных в клинике важно знать частоту встречаемости подобных "отрицательных" значений па раметров в норме. Для нулевых клеток она обычно не превышает 4-6 % у взрослых и 7- 8% у детей младшего возраста и стариков. Отрицательные значения теофиллин чувствительных Т-клеток встречаются обычно у 3-5% взрослых и у 5-8% детей младше го возраста.

Таблица Значения показателей нагрузочных тестов и индекса нагрузки у здоровых людей разного возраста Возраст Показатель 1- 3 года 8 - 14 лет 18 - 55 лет 60 - 80 лет Спонтанные (без нагрузки) Е- РОЛ, % 62,5±0,8б 62,8±1.24 65,5±1.28 71.2±1, Е- РОН, % 31,2±0,78 27,5±0,84 25,8±0,80 25,5±0,9б Нагрузка: инкубация клеток при 37 0 в течение 1 ч E1.0 - РОЛ,% 60,8±0,2 56,4±1.0З 58,3±1,08 63,2±1, E1.0 - РОН, % 33.7±0,83 28,5±0,76 23,8±0,65 22,8±0. Нагрузка: инкубация клеток при 37 течение 1 ч с теофиллином Етф.р- РОЛ, % 45.1±1.05 47,8±1,07 52,9±1,06 54,4±1, Етф.р- РОН, % 29,9±0.77 25.5±0,75 24,0±0,б9 21.8±0, ИН* 1,83±0,02 1,98±0.02 2,52±0,02 2,80±0, (1,30-3,6) (1,40-3,9) (1,6-4,1) (1,8-5,5) *Здесь и далее ИН определялся в том нагрузочном тесте из их серии, в котором Е- РОН имел максимальное значение 3.2. ИЗМЕНЕНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ Значения иммунологических показателей у индивидов изменяются не только в он тогенезе, но и под действием разнообразных факторов, влияние которых как на боль ной, так и на здоровый организм неизбежно. По-видимому, колебания физиологических показателей отдельных компонентов иммунной и других систем организма - это важ нейшее явление природы, позволяющее сохранить функциональную целостность всего организма, его систем и подсистем в постоянно меняющемся окружении. Важнейшими факторами, обусловливающими колебания иммунологических параметров, являются биологические ритмы и разнообразные нагрузочные факторы.

Биоритмические колебания иммунологических параметров.

Функционирование целостной иммунной системы, и в частности ее компонентов, подвержено, так же как функционирование других систем и органов, биоритмическим колебаниям.

Жизнедеятельность организма человека тесно связана с биоритмическими колебаниями самых разных диапазонов. Природа этих колебаний до конца не выяснена;

считают, что в их формиро вании при нимают участие как экзогенные, так и эндогенные факторы (Бюнинг, 1961;

Моисеева, Сысуев, 1981). Среди биологических ритмов выделяют околосуточные (циркадные) и многодневные рит мы. Из многодневных ритмов различают, в частности, околонедельные ритмы (6, 9-10 дней), око ломесячные ритмы (23-24, 28-32 дня), сезонную и окологодовую периодичность. Каждый биоритм характеризуется амплитудой и фазовым сдвигом. Биоритмические колебания самой различной частоты, сдвигаясь друг относительно друга по фазе, взаимодействуют между собой, обеспечи вая в совокупности динамическую стабильность внутренней среды организма, оптимум его адап тации и функционирования в непрерывно меняющихся условиях внешней среды. Такое взаимо действие может приводить к изменениям амплитуды колебаний, блужданию акрофаз (фаз мак симальных значений показателей). Характер биологических ритмов различается не только у лиц разного пола и возраста, но имеет свои особенности у отдельных индивидов.

В соответствии с потребностями клинической практики, нас в данном случае инте ресует прежде всего, насколько велик диапазон изменений значений иммунологических показателей под влиянием биоритмов разной периодичности. Для выяснения этого во проса рассмотрим несколько примеров.

В примере 1 показаны значения иммунологических параметров у здорового мужчины в раз ные сезоны года. Как видно, колебания этих параметров могли достигать 2-З-кратной величины.

Не менее сильные колебания иммунологических показателей отмечались в течение одного месяца, причем не только у женщин, у которых сильнейшее влияние на эти показатели оказыва ют гормональные сдвиги, определяемые фазами менструально-овариального цикла (примеры 2, 3), но и у мужчин (пример 4).

В течение дня значения иммунологических параметров также претерпевают весьма значи тельные изменения (примеры 5, 6). Эти изменения не только индивидуальны, но и зависят от околомесячных циклических колебаний.

Из этих примеров ясно видна обусловленная биоритмами высокая лабильность им мунологических показателей у индивидов: их значения могут порой изменяться в не сколько раз, иногда достигая у одного и того же человека в разное время и минималь ных, и максимальых границ нормы. Важно то, что характер этих изменений индивидуа лен не только в отношении объекта, но и во времени.

Пример Время L* Б Э М П С Л Т В О Тх Тс Фа Фз ИН СОЭ 1 года Мужчина 32 лет весна 7,5 0 5 2 1 69 23 71 21 3 60 11 23 40 2,4 Клинически лето 6,0 0 6 4 1 56 33 60 19 21 50 10 24 51 3,5 здоров осень 6,9 1 4 5 1 59 30 66 22 12 51 15 30 64 3,1 зима 7,7 0 5 6 2 65 22 75 16 9 58 17 34 68 2,2 Здесь и далее: L- 10 9 /л ;

СОЭ - мм/ч ;

остальные показатели ( кроме ИН) в %. Расшифровка дана в табл. 1.

Пример Дни менстру- L Э М П С Л Т В О Тх Тс Фа Фз ИН 2 ально-овари- ального цикла Женщина 35 лет. 1 5,2 2 9 1 66 22 46 5 49 27 19 17 3, Клинически 8 3,4 1 13 1 48 37 53 7 40 45 8 22 2, здорова 15 3,9 1 5 0 54 40 60 11 29 46 14 12 4, 22 4,2 2 6 0 61 31 72 6 22 49 23 14 3, Пример 3 2 6,8 1 8 2 70 19 47 8 45 33 14 10 3, Женщина 27 лет. 9 4,5 1 6 1 71 21 52 5 43 36 16 21 4, Клинически 16 5,9 2 7 1 67 23 54 3 43 44 10 25 2, здорова 24 5,4 1 8 2 66 23 53 9 38 45 8 21 3, Влияние нагрузки на иммунологические показатели.

Вся жизнедеятельность человека проходит в условиях воздействия на него разно образных нагрузочных факторов.

Нагрузочные факторы можно разделить на физиологические (естественные для человека) и нефизиологические (неестественные, обычно вредные), кратковременные (дейст вующие минуты или часы) и длительно действующие (влияющие месяцы, годы), сла бые и сильные. К физиологическим нагрузкам можно отнести приемы пищи, физиче скую и психоэмоциональную нагрузку, воздействие климато-географических условий, к нефизиологическим - сильное переохлаждение или перегревание, курение, воздейст вие различных факторов, загрязняющих среду обитания человека (химические вещест ва, пыль, радиация и т.д.). Решающее значение для человека наряду с его индивиду альной восприимчивостью к нагрузке имеют количественные характеристики нагрузоч ных факторов - сила и длительность воздействия. Например, слишком сильные и дли тельно воздействующие физическая или психоэмоциональная нагрузки могут стать нефизиологичными для организма, в то время как к достаточно низким дозам веществ, загрязняющих среду обитания, организм относительно хорошо адаптируется.

Все эти разнообразные нагрузочные факторы, в той или иной степени воздействуя на им мунную систему, не могут не изменять иммунологические параметры. Рассмотрим на нескольких примерах возможные диапазоны изменения иммунологических показателей под влиянием неко торых нагрузок.

Обильный прием пищи (пример 7) приводил к значительным изменениям иммунологических параметров, иногда двукратным. Анализ ряда подобных примеров показал, что сила этих изме нений зависит от и от особенностей индивида, и от рациона питания.

Пример Дни ме- L Э М П С Л Т В О Тх Тс Фа Фз ИН СОЭ 4 сяца Мужчина 39 лет.

Клинически здоров 1 5,0 4 8 2 54 34 74 11 15 50 24 20 70 4,0 5 4,6 4 6 1 65 24 70 9 21 42 28 18 50 6,2 10 4,5 5 9 0 68 18 58 6 38 51 7 19 63 4,5 15 5,9 2 9 0 56 33 49 9 42 31 18 21 60 3,9 20 4,0 3 10 0 57 30 50 5 45 34 16 18 75 4,2 25 4,3 3 6 1 56 34 61 6 33 39 22 20 73 4,7 Пример Время L Б Э М П С Л Т В О Тх Тс Фа Фз ИН 5 суток Мужчина 30 лет.

Клинически 9ч. 3,8 0 1 7 2 53 37 70 10 20 56 14 10 40 7, здоров 12ч. 5,0 0 2 7 1 50 40 72 5 23 64 8 10 64 7, 15ч. 6,5 0 2 6 1 47 44 74 9 17 66 8 11 69 5, 18ч. 6,2 0 2 7 2 54 35 62 13 25 55 7 16 48 5, 21ч. 7,0 0 1 5 3 55 36 67 11 22 58 9 10 51 6, Пример Время L Б Э М П С Л Т Б О Тх Тс Фа Фз ИН 6 суток Женщина 26 лет. 9ч 6,7 0 2 4 0 62 32 48 7 45 30 18 8 48 2, 1-й день менстру- 12ч. 8,0 0 1 7 1 62 29 40 4 56 29 11 8 41 2, ально-овариаль- 15ч. 8,5 0 3 5 1 61 30 45 3 52 24 21 9 59 4, ого цикла 18ч. 7,0 0 3 7 0 56 34 62 6 32 38 24 12 72 4, 21ч. 6,2 0 4 7 1 62 26 44 4 52 30 14 10 69 2, 18-й день 9ч. 5,2 0 3 5 2 61 29 66 14 20 57 9 14 52 5, 12ч. 5,3 0 2 5 2 56 35 62 8 30 55 7 8 62 4, 15ч. 5,8 0 1 8 3 51 37 49 7 44 45 4 10 68 5, 18ч. 7,2 0 1 9 3 53 34 59 6 35 55 4 12 73 3, 21ч. 8,2 0 1 6 2 61 30 70 9 21 59 11 12 65 4, Пример L Б Э М П С Л Т Б О Тх Тс Фа Фз ИН Прием пищи:

До 5,6 0 4 5 2 61 28 77 10 13 54 23 22 60 3, Женщина После 7,9 0 7 5 1 62 25 68 6 26 48 21 25 55 3, 26 лет через 10 мин Пример L Б Э М П С Л Т В 0 Тх Тс Фа Фз ИН Женщина 21 г.

Клинически Количество приседаний здорова 0 7,4 0 3 7 1 54 35 58 5 37 44 14 18 76 4, 50 6,5 0 4 6 2 56 32 52 9 39 42 10 12 72 3, 100 7,0 0 3 10 2 55 30 51 7 42 43 8 11 68 3, Пример Количество L Б Э М П С Л Т В О Тх Тс Фа Фз ИН 9 приседаний Мужчина 36 лет 0 6,3 0 2 8 1 62 27 56 9 35 42 14 15 66 4, 100 4,8 0 2 9 1 64 26 64 7 29 45 19 20 57 3, 200 6,2 0 2 7 1 64 24 59 8 33 47 12 17 63 3, Пример Нагрузка L Б Э М П С Л Т В О Тх Тс Фа Фз ИН Студент До экзамена 3,6 0 5 7 1 56 31 62 8 30 51 11 21 72 4, 20 лет. После экзамена 4,9 0 6 7 1 51 35 67 15 18 39 28 30 56 2, Пример L Б Э М П С Л Т В О Тх Тс Фа Фз ИН Рабочий До начала 4,3 0 2 6 1 69 22 70 9 21 54 16 32 62 3, 42 года После 8,6 0 3 9 1 62 25 84 10 6 63 21 26 82 2, окончания рабочей смены В результате физических упражнений (примеры 8, 9) и эмоциональной нагрузки (пример 10) значения иммунологических параметров также в той или иной степени изменяются. Работа в тя желых вредных условиях химического производства влекла за собой резкие, порой 2-З-кратные изменения ряда показателей у рабочего (пример 11);

впрочем, эти изменения явились результа том суммарного действия не только физической и психоэмоциональной нагрузки, но и циркадного ритма.

Мы привели изменения иммунологических показателей под действием небольших, кратковременных и, как правило, повседневных нагрузок и увидели, что эти изменения могут быть весьма существенными. Сильные нагрузки, приводящие к стрессу, дают обычно значительно более сильные изменения показателей (Крыжановский, 1985;

Landmann et al., 1984). Все эти изменения индвидуальны, их характер зависит от мно жества факторов, в том числе от генетических особенностей человека, поэтому пред сказать их интенсивность у конкретного индивида очень сложно.

Особо следует обсудить вопрос о влиянии на сдвиги иммунограммы периферической крови таких длительно действующих и часто неизбежных факторов, как климатогеографические усло вия и экологическая обстановка. Сочетание этих факторов, безусловно, действует на иммуноло гические показатели людей, живущих в разных регионах страны, сдвигая их в ту или иную сторо ну (Лозовой, Шергин, 1981;

Козаченко и др., 1988). Обычно эти изменения в количественном вы ражении индивидуальны и колеблются у индивидов от сильных сдвигов до полного их отсутст вия, хотя в сумме они могут иметь определенную общую тенденцию. По-видимому, в основе по добных изменений, какими бы по величине и направлению они ни были, так же, как и в основе изменений показателей при любом другом виде нагрузки, лежит приспособительная реакция ор ганизма в ответ на воздействия внешних факторов. Поэтому в применении в клинике оценивать эти изменения у индивидов будет правильно не в свете общей тенденции их изменений, а с уче том всего диапазона возможных индивидуальных значений показателей. При анализе индивиду альных иммунограмм эти изменения полезно иметь в виду, однако их нужно правильно оцени вать, основываясь на больших адаптационных возможностях организма.

Примером этому может служить анализ содержания лейкоцитов в крови здоровых людей.

Если несколько десятилетий назад содержание лейкоцитов в периферической крови здоровых жителей промышленных городов редко выходило за пределы 5 - 8 х 10 9/л (Шиллинг, 1931), то сейчас, с изменением экологической обстановки, колебания данного показателя в пределах 3 - х 10 9/л удивления уже не вызывают. Эти изменения следует помнить при анализе иммунограм мы у индивидов, но из этого отнюдь не следует вывод о дефектности иммунной системы орга низма у здоровых жителей современных городов. Другой пример: у здоровых жителей некоторых регионов страны обнаружено изменение средних значений некоторых иммунологических показа телей, в частности снижение количества Т-лимфоцитов. Неправильно было бы думать, что в свя зи с этим у них имеется дефект Т-системы иммунитета и им тре- буется иммунокоррекция. Если исходить из системных представлений о свойствах иммунной сис темы, то становится ясно, что в процессе адаптации системы к соответствующим условиям у ряда людей (не у всех, но, возможно, у большего числа, чем среди живущих в других климатогеографических и экологических условиях) оказался необходимым сдвиг тех или иных показателей (например, снижение количества Т-клеток) в интересах целостной иммунной системы, с целью поддержания ее оптимального функционирования.

3.3. ПРАКТИЧЕСКИЕ ВЫВОДЫ Значения иммунологических показателей у здоровых людей неодинаковы.

Они характеризуются индивидуальностью значений, возрастными изменениями и колебаниями под влиянием биологических ритмов и нагрузочных факторов.

Одни показатели подвержены более сильным изменениям, другие менее силь ным. Подобной изменчивостью характеризуются и иммунологические параметры больных. Значит ли это, что попытки соотнести это колеблющееся многообразие ин дивидуальных норм с истинным состоянием человека при трактовке конкретной имму нограммы бесполезны? По-видимому, это не так. Изменчивость биологических показа телей - это объективный факт, который нельзя отбросить, но она не будет мешать оценке результатов, если придерживаться трех основных принципов:

1) при взятии анализа устранять возможность тех колебаний, которых можно избе жать;

2) при оценке результатов помнить о возможных причинах и величине всех осталь ных колебаний;

3) помня, что мы имеем дело со сложной биологической системой, при оценке дан ных следует простым, детализированным показателям предпочитать системные пока затели, включающие результат взаимодействия нескольких компонентов.

Зная, что иммунологические показатели довольно сильно изменяются под действием цир кадных ритмов, приемов пищи и физической нагрузки, можно для практики рекомендовать заби рать у пациента кровь на анализ в определенных стандартных условиях: в одно и то же время суток - лучше утром, натощак, до существенной физической нагрузки. По сути, из всех этих усло вий в реальной клинике используется обычно только первое. Основное количество других на званных выше факторов стандартизации не поддается вообще.

Для правильной оценки иммунограммы пациента необходимо знать, какой является иммунограмма у данного человека в норме. Как уже указывалось, вследствие больших колебаний параметров знания лишь среднегрупповых значений показателей здоровых людей соответствующего возраста для этой цели недостаточно. Использование воз можных разбросов параметров и их вероятной встречаемости среди группы здоровых людей является более информативным, однако большой диапазон этих разбросов су щественно ограничивает пользу от сравнения значений у данного пациента. Поэтому фактически без анализа клинической картины не представляется возможным дать за ключение о норме или патологии по иммунограмме конкретного человека.

Если учесть индивидуальность иммунограммы, становится ясным, что единствен ной возможностью получения максимального эффекта от иммунограммы как таковой, является наличие у пациента паспорта его индивидуальной иммунологической нормы.

Такая "норма", определяемая у каждого человека в процессе повторного обследования при диспансеризации, и составит довольно широкий спектр значений, которые могут принимать показатели иммунограммы у данного человека, но он будет существенно более узким, нежели в общей группе здоровых доноров.

Пока клиницисты не располагают данными о паспорте здоровья каждого человека, существенным подспорьем в их работе могут служить результаты массовых обследо ваний здоровых жителей конкретных регионов, городов или крупных предприятий. На пример, обследование работников крупных промышленных предприятий городов Моск вы и Караганды показало, что среднегрупповое содержание лейкоцитов в крови у здо ровых лиц составило там в среднем 5,8±1,3 х109/л и 3,9±1,6 х109/л соответственно.

Учитывая эти данные, врач, работающий в г.Караганде, у пациента, имеющего в крови 7,8х109/л лейкоцитов, может с большой уверенностью предположить лейкоцитоз, неже ли клиницист, работающий в г. Москве /Козаченко Н.В. и соавт., 1988/.

Часть II ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ИММУНОГРАММЫ В КЛИНИКЕ ВВЕДЕНИЕ Прежде чем рассмотреть проблемы интерпретации иммунограммы, ответим на вопрос, который часто задают врачи: сколько показателей должно быть в иммунограм ме для получения высокого эффекта от ее использования? Это вопрос отнюдь не праздный, ибо на сегодняшнем уровне методологии иммунограмма может включать сотни самых разнообразных показателей.

Значимость анализа клеток крови для клиники была обоснована в начале нашего века в тру дах А.А. Максимова, П. Эрлиха, И.И. Мечникова. И уже в первые два десятилетия разными уче ными было предложено большое количество методов и их модификаций для определения раз личных показателей клеток крови. Наиболее значительным было предложение Арнета (1928) просчитывать количество разных типов лимфоц-итов, нейтрофилов и других лейкоцитов по фор ме и величине ядра (по сути - оценивать "сдвиг ядерной формулы влево"). К концу 20-х годов анализ крови включал более 80 показателей (Шиллинг, 1931). Многие ученые настаивали на кли нической ценности этого полного для того времени анализа и даже предлагали включить в него добавочные тесты. Однако столь обширный анализ крови так и не распространился в клинческой практике, причем не только из-за технической сложности его осуществления, но и из-за избытка информации, который резко усложнял трактовку результатов.

К началу ЗО-х годов В. Шиллинг и его ученики максимально сократили анализ крови за счет выделения в нем 12 наиболее информативных показателей, методически упростив их определе ние. Именно благодаря этому анализ клеток крови начал быстро входить в клиническую практику, и в настоящее время он является обязательным при обследовании человека. Вместе с тем В.

Шиллинг подчеркивал, что во многих случаях даже эти 12 показателей не являются необходи мыми, а вполне достаточно использовать лишь часть из них. Действительно, сейчас в клиниче ской практике часто используют так называемую "тройку" - показатели СОЭ, содержания лейко цитов, эритроцитов и гемоглобина.

При дополнении анализа крови данными о субпопуляциях лимфоцитов и их физио логической активности также встал вопрос о минимизации количества показателей, по скольку их могут быть сотни (ч. 1 гл. 2). Для практического использования мы отобрали наиболее информативные показатели количества и физиологической активности суб популяций основных имуннокомпетентных клеток (ИКК), в основе определения которых лежат наиболее технически простые и дешевые методы. Однако совершенно ясно, что эти показатели различаются по степени информативности, причем не только в целом, но и в разных конкретных случаях клинической практики. Так, из выбранных показате лей относительное содержание в крови Т-, В-лимфоцитов и нулевых клеток является наиболее важным и необходимым дополнением к классическому анализу клеток крови.

Оценка количества и соотношения субпопуляций Т-лимфоцитов, обладающих хелпер ной и супрессорной активностью, также довольно часто имеет большое значение. Реже существенную информацию в иммунограмме несет оценка фагоцитарной активности нейтрофилов. Определение уровней иммуноглобулинов разных классов информативно для решения весьма ограниченного круга клинических задач. В то же время индекс на грузки (ИН) - соотношение показателей активности лимфоцитов и нейтрофилов в на грузочных тестах розеткообразования - несет клиницисту важную информацию не в меньшем количестве случаев, нежели содержание Т-, В- и нулевых лимфоцитов и сдвиг ядерной формулы нейтрофилов влево. Поэтому ИН является одним из основных критериев иммунограммы.

Несмотря на то, что все показатели иммунограммы, предлагаемые в данной книге для широкого использования, обоснованы и надежно проверены, в настоящее время трудно ожидать, что данная иммунограмма останется в ближайшие годы полностью неизмененной (за счет возможного нововведения или замены некоторых тестов). Ре альность этого положения подтверж дается тем, что некоторые показатели могут нести одинаковую информацию, другие являются информативными только в случаях ясной клинической картины, а все это снижает прогностическую и диагностическую пользу данных показателей для клинициста. Обычно такие тесты из клинической практики ав томатически исчезают. Подобное явление произошло с оценкой токсигенной зернисто сти нейтрофилов, которой еще в 30-40-е годы придавалось большое значение (Фрейн фельд, 1947). Этот показатель, будучи весьма информативным, в настоящее время продолжает использоваться в специализированных клиниках, в то время как в широкой клинической практике он почти не применяется. Причина этого в том, что токсигенная зернистость обнаруживается лишь при тяжело текущих воспалительных процессах, ко торые сейчас редки.

Нельзя исключить, что тот или иной показатель, добавленный к анализу крови, в процессе широкого клинического использования не повторит участи оценки токсигенной зернистости нейтрофилов и других подобных тестов, ранее использовавшихся в прак тике анализа крови, таких, как толстая капля и др.

В иммунограмму, обсуждаемую в данной книге, вошли далеко не все известные к сегодняшнему дню важнейшие субпопуляции ИКК и показатели их физиологической ак тивности. К их числу относятся естественные киллеры, регуляторные субпопуляции В лимфоцитов и макрофагов и др. (ч. I). В теоретических исследованиях, проведенных с группами больных, показана информативность их оценки для клиники. Однако сейчас нам представляется маловероятным, что оценка этих субпопуляций ИКК войдет в им мунограмму для широкого практического использования, поскольку клиническая ин формативность этих показателей едва ли будет достаточно широкой, чтобы перекрыть информацию, получаемую при анализе отобранных показателей, и в то же время до бавление их, с одной стороны, перегрузит иммунограмму информацией и усложнит клиницисту оперирование ее данными, с другой - усложнит технику лабораторного ана лиза. Иное дело - узкопрофильные специализированные клиники, которые по соответ ствующим показаниям уже сейчас должны определять все эти показатели и, самое главное, уметь их анализировать.

Таким образом, при внедрении иммунограммы в широкую клинику и при анализе ее врачом необходимо стремиться к ограничению объема используемых показателей при максимальной четкости и ясности их интерпретации.

Принципиально иное решение имеет этот вопрос в случае компьютеризации лабораторного анализа, что с внедрением в медицинскую практику персональных компьютеров становится все более актуальным. Компьютерная техника может анализировать одновременно сотни показате лей, выдавая в результате краткое заключение. В этом случае увеличение количества показате лей будет приводить к более точному заключению. Здесь важно лишь четко и корректно соста вить алгоритм анализа, что, конечно, требует на первом этапе большой кропотливой работы вра ча-лаборанта и врача-клинициста на огромном клиническом материале. Однако в медицинской практике нельзя исключить наличия нехарактерных, нетипичных случаев течения заболеваний, которые в большом количестве поставляет природа в виде огромного разнообразия возможно стей живого организма. Поэтому, вероятно, наибольших успехов в развитии этого направления можно будет ожидать не в случае выдачи компьютером готового заключения и рекомендаций, а в результате диалога врача с компьютером, который позволит совместить интуицию врача с ог ромной памятью и запрограммированным опытом в машине.

4.0. Глава ОСНОВНЫЕ ПРАВИЛА ИНТЕРПРЕТАЦИИ ИММУНОГРАММЫ Все основные принципы анализа иммунограммы были определены на основании большого практического опыта использования анализа крови в широкой клинической практике врачей клиник и поликлиник всего мира начиная с 20-х годов нашего века. Они описаны в многочисленных монографиях (Шиллинг, 1931;

Коган, Бобров, 1949;

Фрейн фельд, 1947;

Яновский, 1957) и распространяются как на традиционный анализ крови, так и на современный, расширенный (иммунограмму). Однако в учебных пособиях и монографиях последних лет эти основные и обязательные правила подробно не опи сываются. Именно следствием этого, на наш взгляд, является, с одной стороны, частое использование анализа крови там, где он не может принести существенной помощи клиницисту, с другой - часто неправильная, некорректная трактовка анализа крови.

Придавая особую важность преодолению этих недостатков, (столь частых в современ ной клинической практике и особенно опасных при их перенесении на иммунограмму при ее внедрении в клинику), мы подробно описываем и обос-новываем основные пра вила использования иммунограммы клиницистом.

Правило 1. Комплексный анализ иммунограммы более информативен, чем оценка каждого показателя в отдельности.

Не вызывает сомнений, что в симптоматическом отношении все составные части иммунограммы могут рассматриваться отдельно. Особенно это касается основных групп показателей, таких, как формула гранулоцитов, формула субпопуляций лимфоци тов, тестов, определяющих физиологическую активность клеток, нагрузочных тестов и др. Однако в основу диагностики и прогнозирования следует везде ставить совокуп ность изменения всех показателей иммунограммы как принципиально более информа тивную.

В гл. 1 многократно акцентировалось внимание на том, что один и тот же конечный результат иммунной реакции в однотипных условиях может достигаться разными коли чественными сочетаниями всех компонентов иммунной системы. Поэтому при одинако вой реакции всей системы в ответ на чужеродное мы зачастую сталкиваемся с сущест венной вариацией изменений отдельных иммунологических показателей. Вследствие этого комплексный анализ всех компонентов иммунограммы более информативен.

Только общий обзор сдвигов всех показателей иммунограммы может выявить общий характер изменений в иммунной системе.

В качестве примеров разберем два случая острой пневмонии в начальной фазе процесса, на вторые сутки после начала заболевания (примеры 12, 13). Клинически и рентгенологически у обоих больных было установлено наличие очагов воспаления в нижних долях правого легкого. Пример 12 представляет характерные для данного эта па воспаления сдвиги в формуле лейкоцитов - лейкоцитоз (хотя и небольшой), наличие нейтрофильного сдвига влево при высоком проценте нейтрофилов, отсутствие эозино филов, снижение количества лимфоцитов. Однако если этот же фрагмент иммуно граммы проанализировать во втором случае того же заболевания (пример 13), то мы не увидим в нем существенных сдвигов. Наконец, если мы проанализируем иммунограмму во всей совокупности ее показателей, то выявим ряд признаков, характеризующих на чавшийся воспалительный процесс, в обоих случаях. К ним относятся снижение коли чества Т-лимфоцитов, увеличение содержания нулевых клеток и существенно снижен ный индекс нагрузки.

Пример L Б Э М П С Л Т В О Тх Те Фа Фз ИН СОЭ Мужчина 39 лет 8.2 0 0 4 9* 70 17 45 5 50 32 13 20 37 1, Мужчина 62 лет 4,2 0 2 6 2 65 25 43 10 47 42 1 29 30 1, *Здесь и далее подчеркнуты измененные значений показателей.

Таким образом, отдельные характерные сдвиги в иммунограмме у ряда однотип ных больных могут провляться слабо или вовсе не проявляться. Поэтому анализ всей совокупности показателей иммунограммы может помочь клиницисту существенно в большем количестве случаев и с большей надежностью, нежели фрагментарный ана лиз отдельных ее параметров.

Правило 2. Полноценный анализ иммунограммы можно проводить лишь в комплексе с оценкой клинической картины у данного пациента.

В большей части случаев анализ иммунограммы, оторванный от клинической кар тины, теряет всякий смысл (конечно, тогда, когда мы не имеем дела с грубыми наруше ниями, поломками тех или иных компонентов или звеньев иммунной системы).

При грубых нарушениях в иммунной системе иммунограмма уже сама по себе име ет диагностическую значимость. Так, резкий лейкоцитоз, определяемый увеличением количества лимфоцитов за счет В-клеток (пример 14), дает основание предположить у пациента хронический В-лейкоз.

Наличие лейкопении, обусловленной лимфопенией за счет уменьшения количества Т-хелперов (пример 15), может с большой достоверностью указывать на синдром при обре-тенного иммунодефицита у данного пациента.

Однако даже при указанных заболеваниях непосредственно по изолированной им мунограмме ясные выводы возможны лишь в небольшой части случаев, там, где сдвиги в иммунограмме выражены резко, что обычно имеется лишь при далеко зашедшем па тологическом процессе, когда, впрочем, клиницист уже по клинике течения заболева ния достаточно уверенно ставит тот или иной диагноз, а иммунограмма лишь подтвер ждает его.

Пример L Б Э М П С Л Т В О Тх Тс Женщина 28 лет 82,5 0 1 1 0 12 86 10 78 12 - - Мужчина 25 лет 3,0 1 6 11 17 50 15 30 29 41 (Gupta, 1986) При подавляющем большинстве заболеваний делать какие-либо диагностические предположения по одной лишь иммунограмме без внимательного анализа клинической картины нельзя, поскольку это может принести пациенту вред, направив врача на не верный путь клиничес-кого анализа. Дело в том, что одни и те же сдвиги показателей иммунограммы могут проявляться при принципиально различных патологиях и на раз ных фазах процесса и в зависимости от этого их интерпретация будет неоднозначной.

Один и тот же сдвиг любого показателя в зависимости от фазы течения процесса, его типа и особенностей может рассматриваться и как благоприятный, и как неблагоприят ный симптом.

В примерах 16 и 17 иммунограммы предельно близки. В них можно отметить лишь снижение количества Т-лимфоцитов и за счет этого повышение числа нулевых клеток, а также снижение индекса нагрузки. Анализируя эти иммунограммы без клинической картины заболевания пациентов, мы можем заметить, что сумма имеющихся отклоне ний лишь с небольшой долей вероятности может соответствовать спокойному состоя нию иммунной системы здорового человека.

Пример L Б Э М П С% Л Т В О Тх Те Фа Фз ИН СОЭ Мужчина 45 лет 4,2 0 4 4 3 62 27 46 13 41 36 10 20 43 1, Девушка 15 лет 5,4 0 2 3 2 65 28 49 12 39 42 7 23 50 1, Теперь проанализируем эти иммунограммы с учетом реальной клинической карти ны. Иммунограмма, представленная в примере 16, получена у мужчины 45 лет, который после лечения в клинике по поводу тяжелой двусторонней пневмонии был переведен на амбулаторное долечивание. В этом случае сдвиги иммунограммы указывают на бла гоприятное завершение процесса, хотя и неполное его окончание, тем не менее по кли ническим симптомам процесс завершился. Другая иммунограмма, снятая у этого же пациента через 7 дней после приведенной, выявила отсутствие подобных сдвигов и полную нормализацию показателей, что указывало на полное окончание иммунной ре акции и завершение процесса, вследствие чего он был выписан на работу.

В примере 17 представлена иммунограмма девушки 15 лет, проходившей диспан серизацию в районной поликлинике при переводе ее во взрослую поликлинику из дет ской. Первичное клиническое диспансерное обследование не выявило у нее сущест венных отклонений. В анамнезе указаний на наличие хронических заболеваний не бы ло. На основании сдвигов иммунограммы у пациентки предположительно отмечено на чало вяло текущего воспалительного процесса (снижение количества Т-лимфоцитов и низкий ИН). Повторное обследование гинекологом выявило слабую гиперемию и при пухлость малых половых губ, небольшие гнойные выделения. При обследовании в кож но-венерологическом диспансере поставлен диагноз "гонорея" и начата специфическая терапия.

Таким образом, в первом случае, учитывая клинику, небольшие сдвиги отдельных показателей иммунограммы трактовали как благоприятный признак заканчивающегося процесса - стадии реконвалесценции (в связи с чем больному был продлен больничный лист). Во втором случае с учетом анамнеза и отсутствия у пациентки ремиссии хрони ческого процесса аналогичные сдвиги показателей иммунограммы трактовали как не благоприятные, настораживающие на имеющийся воспалительный процесс, что под твердилось при подробном клиническом и лабораторном обследовании.

Одной из важнейших задач анализа иммунограмм является наблюдение за ходом патологического процесса с целью оптимизации прогнозирования его течения и обос нования фармакологической коррекции. Анализ иммунограммы без постоянного сопос тавления ее с динами-кой клинической картины в этих случаях теряет свой основной смысл.

Все сказанное выше подтверждает основной принцип анализа лабораторных дан ных, состоящий в том, что трактовка этих данных должна проводиться совместно вра чом-лаборантом и врачом, лечащим данного пациента.

До недавнего времени этот принцип описывался как основной во всех гематологических мо нографиях (Кассирский, Алексеев, 1948;

Руководство по клиническим лабораторным исследова ниям, 1960). Однако уже достаточно длительное время в практическом здравоохранении нашей страны он фактически не используется. Мы уверены, что перестройка здравоохранения в СССР будет иметь больше шансов к успеху, если начнется с повышения качества использования кли ницистами самых простых, начиная с традиционных, лабораторных методов исследования. В первую очередь это относится к указанному принципу интерпретации современного анализа кро ви - иммунограммы. Если данный вопрос не будет решен, внедрение самых сложных и новых ме тодов лабораторного анализа не даст здравоохранению должного эффекта. В основе использо вания сложных автоматизированных технологий лежит еще более высокий уровень культуры ра боты врача. Самые совершенные лабораторные тесты, любые программы для компьютеров ста нут мертвым грузом, если клиническая общественность не готова к их использованию. Опыт вне дрения сложных технологий в развивающихся странах на фоне низкой культуры здравоохране ния продемонстрировал пагубность такого подхода. Внедрение сложных методов диагностики и прогнозирования возможно лишь при подготовленности клинических работников, в том числе в плане глубокого понимания обязательности при использовании лабораторных показателей твор ческого подхода врача к каждому индивидуальному случаю заболевания пациента.

Правило 3. Рельную информацию в иммунограмме несут только сильные сдвиги показателей;

слабые сдвиги лишь позволяют повысить уверенность а правильности сделанного заключения.

Вначале определим, какие изменения показателя можно считать сильными. Это зависит от уровня показателя: чем значение показателя ниже, тем сильнее должна быть интенсив-ность его изменения. Так, у здорового человека выявляется в среднем 2% эозинофилов. Реально на повышение этого показателя будут указывать значения, большие 5%, а на снижение - меньшие 1%, т.е. отклоняющиеся от средних значений более чем в 2 раза. С другой стороны, если со- держание Т-лимфоцитов в норме в среднем составляет 70%, то обнаружение у пациен та 50% этих клеток уже заставляет предполагать у него снижение уровня Т лимфоцитов.

Причины, лежащие в основе реальной информативности лишь сильных изменений показателей, достаточно полно описаны в I части книги (гл. 2, 3).

Во-первых, это сильная лабильность уровней показателей у индивидов, связанная с биологи ческими ритмами и физиологическими нагрузками на организм и зависящая от метаболитических особенностей организма каждого отдельного человека, которая является необходимым свойст вом любого живого организма. Попытки преодоления широких разбросов показателей, возни кающих за счет лабильности, путем взятия крови для анализа в одинаковых условиях (натощак, до физических и эмоциональных нагрузок, т.е. утром, сразу же при пробуждении после сна) по объективным причинам воплотиться в широкую практику не смогли (исключение составляют ста ционары). К тому же подобное правило взятия крови снижает только те разбросы, которые связа ны с циркадным ритмом и физиологической нагрузкой, но не влияет на колебания, определяе мые биоритмами другой периодичности, индивидуальными особенностями человека и т.д. При знанием этого факта явилась замена средних значений показателей на широкие интервалы их значений в норме на бланках анализа крови в 60-е годы.

Во-вторых, обычные рутинные методы, применяемые в клинике для получения показателей иммунограммы, обычно несут ошибку не менее 10-15 %. Тесты, вводимые в иммунограмму на со временном этапе, основываются не на относительно жестком морфологическом разделении кле ток (как в традиционном анализе крови), а на иммунологических реакциях, в которых температу ра, качество химических реактивов и другие факторы существенно влияют на конечные результа ты. Из-за этого не всегда удастся добиться полной стабилизации результатов анализа. Это еще раз подтверждает важность совместной интерпретации иммунограммы врачом-клиницистом и врачом-лаборантом, при которой последний может внести в иммунограмму определенную кор рекцию (например, обратить внимание на то, что "в лаборатории в последнюю неделю шли бо лее низкие уровни фагоцитоза в связи с новой партией реактивов", или на другие факты).

Исходя из указанных причин, можно заключить, что наиболее эффективный подход к увеличению информативности не столь сильных сдвигов показателей иммунограммы должен состоять в получении средних значений показателей для каждого конкретного человека на основании ряда повторных диспансерных обследований и составлении на основании этого "пас-порта здоровья". Эта работа имеет принципиально важное значе ние для повышения информативности иммунограммы в случае заболевания данного индивида.

Итак, если у человека отсутствует его индивидуальная норма (паспорт здоровья), то при интерпретации иммунограммы следует опираться лишь на сильные сдвиги зна чений показателей относительно общепринятой нормы. При этом чем сдвиг параметра сильнее, тем с большей уверенностью его можно учитывать. Однако даже слабые тен денции изменения показателей помогают опытному специалисту повысить уверенность в правильности общего заключения, сделанного на основе анализа комплекса показа телей.

Рассмотрим пример №18 (случай заболевания трахеобронхитом в стадии разверну той картины течения процесса).В данной иммунограмме четкими сдвигами, на которые можно опереться, являются снижение количества Т-лимфоцитов, повышение уровня нулевых клеток и снижение индекса нагрузки. Эти сдвиги указывают на наличие теку щего воспалительного процесса. Вместе с тем не столь низкое содержание лейкоцитов, эозинофилов и моноцитов (у здоровых людей встречаются и существенно более низкие значения этих показателей) не противоречит наличию воспалительного процесса во второй фазе его развития и, по-видимому, может указывать на небольшую интенсив ность воспалительной реакции. Таким образом, учет суммы слабых сдвигов не только дает возможность убедиться в правильности трактовки иммунограммы на основе имеющихся сильных сдвигов, но и позволяет внести определенные нюансы в трактовку иммунограммы.

Пример L Б Э М П С Л Т В О Тх Тс ИН СОЭ Женщина 22 лет 6,1 0 3 6 3 56 32 50 7 43 33 10 1,9 Правило 4. Анализ иммунограммы в динамике всегда более информативен как в диагностическом, так и в прогностическом отношении, нежели однократно полученная иммунограмм.

Существенные различия показателей иммунограммы у индивидов (правило 3) не позволяют зачастую увидеть даже резкие изменения показателей у пациентов при от сутствии у них индивидуальной нормы. Здесь приходит на помощь оценка иммуно граммы в динамике.

Польза, получаемая от определения динамики изменения иммунограммы, хорошо видна из примеров 19 и 20, в которых представлены иммунограммы у двух человек в фазе клинического здоровья и на фоне ОРЗ.

Значения всех показателей иммунограммы как при заболевании, так и в период здо ровья соответствуют обычным значениям нормы для людей среднего возраста. Однако у одного пациента (пример 19) показатели иммунограммы при заболевании ОРЗ резко отличались от показателей периода клинического здоровья, что свидетельствует о су щественном реагировании иммунной системы на внедрение в организм чужеродного. У другого пациента (пример 20) процесс, по-видимому, не столь интенсивен и выявить сдвиги большинства показателей даже по отношению к его индивидуальной норме не удалось. Таким образом, даже без наличия индивидуальной усредненной нормы полу чение нескольких иммунограмм даст существенно большие возможности в оценке ре альных сдвигов иммунных показателей и, следовательно, повышает клиническую зна чимость иммунограммы.

Пример L Б Э М П С Л Т В О Тх Тс Фа Фз ИН СОЭ Мужчина 36 лет Клинически здоров 3,1 0 1 3 2 62 32 79 8 13 60 19 21 40 4,1 ОРЗ 4,9 0 3 7 1 60 29 58 5 37 44 6 30 30 2,2 Мужчина 42 лет.

Клинически здоров 7,3 0 4 5 3 59 29 60 22 18 55 5 15 39 3,1 - ОРЗ 8,0 0 1 6 4 60 29 56 20 24 56 0 25 40 2,6 - Не вызывает сомнений, что анализ иммунограммы в динамике заболевания кар динально увеличивает информативность в плане прогнозирования и контроля течения процесса. Все приведенные здесь и далее примеры указывают на это. Зная основные законы динамики изменения иммунологических показателей при воспалительном про цессе, можно, имея фактически только иммунограмму, полученную в динамике, эффек тивно следить за развитием процесса, конечно, в сопоставлении с клинической карти ной.

Правило 5. В подавляющем большинстве случаев анализ иммунограммы дает возможность делать ориентировочные,а не безусловные выводы диагностического и прогностического характера Конечно, если мы имеем в иммунограмме резко выраженные сдвиги, характерные для нарушения того или иного компонента иммунной системы, мы можем более точно поставить диагноз. Примером этому могут служить иммунограммы, характерные для хронического лимфолейкоза (пример 14) или синдрома приобретенного иммунодефи цита (пример 15). Однако, даже если для заболевания характерны столь выраженные нарушения иммунных компонентов, в большинстве случаев там, где необходима диаг ностика, мы сталкиваемся с начальной фазой процесса, при которой сдвиги выявляют ся не в столь резкой форме. В последних случаях в заключении может выдвигаться предположение того или другого диагноза, и лишь дальнейшие клинический и лабора торный анализы могут подтвердить или опровергнуть данное предположение. Проил люстрируем это положение двумя примерами.

Пример L Б Э М П С Л Т В 0 Тх Тс ИН Мужчина 26 лет 4,2 - - - - 76 17 60 11 29 28 32 1, Мужчина 23 лет 3,8 0 2 0 2 78 18 51 4 45 25 26 1, У мужчины 26 лет (пример 21) в иммунограмме отмечалось снижение содержания Т-хелперов при увеличении количества Т-супрессоров на фоне невысокого содержания лейкоцитов за счет пониженного уровня лимфоцитов. Однако и у здоровых людей по добные сдвиги лимфоцитов и лейкоцитов встречаются довольно часто. Вместе с тем резкое снижение ИН заставило предположить наличие у пациента активного иммуно логического процесса, а инвертированное соотношение Т-хелперов и Т-супрессоров не исключает процесса, связанного с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) или ту беркулезной инфекцией. В данном случае наличие у пациента (член рок-ансамбля, вы езжавший за границу) в анамнезе свободных половых связей, а также жалобы на рез кую потерю в весе за последние месяцы, потливость по ночам, субфебрильную темпе ратуру, постоянную в течение суток, и наличие у него лимфоаденопатии верхней поло вины тела склонило в сторону предположения об инфицированности пациента ВИЧ и начальных проявлениях пара-СПИД. Действительно, серодиагностика показала инфи цированность данного пациента ВИЧ.

В нашей коллекции иммунограмм имеется также случай (пример 22), по значениям параметров иммунограммы близкий к примеру 21. Предположение о наличии у данного пациента ВИЧ не подтвердилось. Однако у него были обнаружены положительные ту беркулиновые пробы. После специфического лечения в туберкулезном диспансере ис чезли клинические симптомы патологии, а иммунограмма нормализовалась.

Правило 6. В заключении, составляемом на основании анализа иммунограммы, ведущим является наличие ярко выраженных клинических симптомов Как мы уже указывали, при однотипном течении одного и того же заболевания у разных пациентов могут выявляться различные сдвиги показателей иммунограммы, ко торые, однако, в своей совокупности однозначно характеризуют данную патологию и этапы ее развития. Поэтому отсутствие характерного сдвига какого-либо параметра не может менять общее заключение о процессе, тем более при наличии четких клиниче ских симптомов.

Зачастую при трактовке иммунограмм мы встречаемся с еще более сложной си туацией. У пациента могут выявляться определенные четкие клинические симптомы, свидетельствующие о наличии тяжелого процесса или даже неспособности организма справиться с заболеванием, при отсутствии в иммунограмме каких-либо сдвигов, соот ветствующих этим процессам. В этом случае, конечно, определяющей будет клиниче ская картина заболевания. Отсутствие сдвигов иммунограммы при наличии кли нической картины воспалительного процесса должно трактоваться как атипич ность реакции иммунной системы и является отягощающим признаком течения процесса. В данном случае характерен пример трактовки классического анализа крови (Тареев, 1956). У больных людей, чаще пожилого возраста, при развитии тяжелой пневмонии может наблюдаться отсутствие лейкоцитоза и сдвига ядерной формулы нейтрофилов влево. Это рассматривается клиницистами как тяжелый, неблагоприят ный симптом течения заболевания.

Рассмотрим пример несоответствия иммунограммы клиническому течению забо левания. Больная 53 лет (пример 23) в течение последних 11 лет страдала хрониче ской бронхопневмонией, 10 лет - тяжело текущим хроническим гастритом.

Пример L Б Э М П С Л Т В О Тх Тс Фа Фз ИН Женщина 53 лет 5,6 0 1 2 72 20 66 25 9 25 52 14 38 20 3, Больная лежала в клинике в течение 30 дней по поводу воспаления придатков, где получила массированную антибиотикотерапию. Выписана для амбулаторного долечи вания. В период определения иммунограммы у пациентки отмечалась субфебрильная температура, влажный кашель. Рентгенологически - затемнения в области верхушек правого и левого легкого. В этих областях слабое притупление при перкуссии. Прослу шивались слабые хрипы. Однако в иммунограмме при этом каких-либо существенных сдвигов выявлено не было, т.е. в целом была получена иммунограмма, характерная для здорового человека. В данном случае можно определенно говорить о сниженной реакции иммунной системы на идущий патологический процесс в легких. Таким обра зом, отсутствие сдвигов в иммунограмме в данном случае - это отрицательный сим птом, указывающий на сниженную сопротивляемость организма. Дальнейшее тяжелое развитие процесса подтвердило правильность такого заключения.

Правило 7. Для диагностической и прогностической оценки иммунограммы важнейшее значение имеют инди- видуальные показатели нормы данного пациента.

Важно помнить, что нередко у здоровых людей гомеостаз иммунной системы фор ми-руется на фоне имеющихся дефектов отдельных ее компонентов за счет компенса ции недостающего гиперфункционированием других компонентов. В таких случаях "норма" в условиях клинического здоровья человека может быть весьма далека от зна чений показателей, встречающихся у большинства здоровых людей.

В качестве примера приведем иммунограмму практически здорового мужчины лет, в течение жизни в основном не страдавшего хроническими или рецидивирующими заболеваниями, не болевшего тяжелыми воспалительными заболеваниями, за исклю чением ряда обычных детских инфекций (пример 24). Этот человек имел агаммаглобу линемию по классу А, по-видимому, врожденную.

Пример L Б Э М П С Л Т В О Тх Тс Фа Фз ИН СОЭ lgA lgM lgG Мужчина 55 лет а 6,1 1 3 5 2 67 22 79 16 5 50 29 18 79 2,9 4 0 2,7 30, б 5,8 0 5 5 1 68 21 81 11 8 60 21 20 81 4,1 5 0 1,9 39, в 6,4 0 2 3 4 73 18 76 9 15 47 29 30 76 2,7 6 0 2,1 28, Анализ его иммунограммы проводился трижды в течение двух лет с интервалом около года (а, б, в). В крови у данного мужчины на фоне полного отсутствия lgA отме чалось повышение концентрации lgG и уровня фагоцитарной активности нейтрофилов, но не адгезивной активности этих клеток. Все это сочеталось с нормальным значением ИН. Ясно, что в случае заболевания этого человека сдвиги иммунограммы необхо-димо отсчитывать от этой индивидуальной нормы, ибо только в этом случае они будут ин формативны.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 11 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.