WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 11 |

«1 1-й том издания медицинской электронной библиотеки Под редакцией профессора К.А. Лебедева ИММУНОЛОГИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ 1996 ОГЛАВЛЕНИЕ 00.1. Предметный указатель 00.2. Список ...»

-- [ Страница 3 ] --

Следует помнить, что иммунограмма периферической крови может дать перечис ленную выше информацию о ходе воспаления лишь я самом общем, "неспецифиче ском" виде. Рассчитывать в данном случае на более конкретную и специфическую ин формацию - значит обманывать себя и в конечном итоге пациента. (Заметим, однако, что для решения задачи о воспалении в конкретном очаге более точная информация о динамике иммунных реакций может быть получена непосредственно из ткани очага или участка, находящегося вблизи от очага воспаления. Однако способы получения и анализа таких местных иммунограмм не вхо дят в задачи настоящей монографии.) 1.3.4.2. ПАТОЛОГИЧЕСКОЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ, ВЫЗВАННОЕ ДЕФЕКТОМ СПЕЦИФИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В ряде случаев отклонения течения воспалительной реакции от оптимального приобретают вид патологической реакции всей иммунной системы. Такие патологии выделены в отдельные группы заболеваний - аутоиммунные, аллергические и онколо гические. Действительно, в иммунной системе при неизменности ее общей структу ры и отдельных компонентов (как специфических, так и неспецифических) на конкретные антигены или аллергены может возникать извращенная реакция: ли бо неадекватно усиленная (аллер-гические и аутоиммунные заболевания), либо ослабленная (онкологические заболевания). При этом сама иммунная система бу дет осуществлять реакции с нормальными закономерностями и в нормальной последо вательности, а патологию реакции будут определять специфические компоненты и ме ханизмы, атипично и неадекватно реагирующие на конкретный антиген. В этих случаях мы можем говорить о патологии реакции иммунной системы именно потому, что данная неадекватность ее реакции на чужеродное является не временной такти- ческой ошибкой, а постоянной, запрограммированной неадекватной реакцией, с кото рой организм с трудом и относительно редко может справиться сам, причем за счет элиминации или подавления клонов клеток, ответственных за данный специфический антиген. Иными словами, для успешной борьбы с этими заболеваниями требуется ис правление ошибок, заложенных в систему иммунитета природой или индуцированных внешней средой.

Поскольку вся данная группа патологий работы иммунной системы связана со специфиче ской реакцией на какой-либо конкретный антиген, выявление этих патологий должно опираться на специфические иммунные реакции, прежде всего серологические. Их описание можно найти в многочисленных методических руководствах.

Что же касается самой системы иммунитета, то при патологиях данной группы она в основ ном не изменена, в частности, не изменена ее реакция на подавляющее большинство антигенов (за исключением тех, на которые имеется извращенная реакция). Поэтому динамика сдвигов в иммунограмме при этих заболеваниях будет отражать в полном соответствии со своими законо мерностями лишь силу реагирования системы на чужеродное, но никак не будет давать непо средственной информации о данной патологии. Но даже такие иммунограммы могут иметь суще ственное значение для тактики клинициста при крнкретном заболевании у конкретного больного.

Например, при обострении ревматоидного артрита (типичного ауто-иммунного процесса) за счет образования антител и Т-лимфоцитов, специфических к соединительной ткани суставов, начина ется воспалительный процесс со всеми своими обычными характеристиками. При этом по сдви гам в иммунограмме можно выявить изменения, характерные для любого воспалительного про цесса. Они будут указывать на силу идущего процесса, начало нового обострения или его окон чание, что даст возможность правильно назначать лечение. В другом случае, при злокаче ственных новообразованиях, наличие слабой динамики сдвигов показателей иммунограммы (во всяком случае, на ранних этапах заболевания) - обычное явление, отражающее суть реакции системы при данном заболевании. Появление же после тех или иных воздействий (например, БЦЖ) достаточно резких сдвигов, характеризующих активный воспалительный процесс, является положительным признаком, указывающим на появление развитой реакции организма против чу жеродного.

1.3.4.3. ПАТОЛОГИЧЕСКОЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ, ВЫЗВАННОЕ ВРОЖДЕННЫМ ИЛИ ПРИОБРЕТЕННЫМ ДЕФЕКТОМ КОМПОНЕНТОВ ИЛИ ЗВЕНЬЕВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ Существует группа заболеваний, связанных с истинной поломкой опреде ленных компонентов или звеньев самой системы иммунитета. Эти нарушения мо гут быть связаны как со злокачественным перерождением иммунокомпетентных клеток определенных типов (лейкозы и другие лейкопролиферативные заболевания), так и с нарушением, поломкой в тех или иных звеньях иммунной системы (врожденные - "пер вичные" или приобретенные - "вторичные" иммунодефекты). Классификацию лейкозов можно найти в любом пособии по клинической гематологии (Кассирский, Алексеев, 1948;

Руководство по гематологии, 1979;

Клиническая гематология, 1985), первичных иммунодефицитов - в любом издании по клинической иммунологии (Клиническая имму нология, 1986;

Иммунологические аспекты инфекционных заболеваний, 1982;

Меха низмы иммунопатологии, 1983;

Петров, 1983;

Иммунология, 1987). Классическим при мером приобретенного иммунодефицита стало заболевание, широко известное под на званием "синдром приобретенного иммунодефицита" (СПИД), при котором от вируса страдают Т-лимфоциты-хелперы. Во всех этих случаях, несомненно, имеется реаль ная патология иммунной системы, которая клинически выражается в резком ос лаблении сопротивляемости организма чужеродному в атипичности течения иммунных реакций.

Все заболевания этой группы в отличие от заболеваний других типов могут быть четко дифференцированы по резким отклонениям показателей иммунограммы в спо койном периоде (фазе ремиссии). Дефект того или иного звена накладывает на имму нограмму специфический отпечаток не только в спокойном состоянии организма, но и при течении активного воспалительного процесса, обусловливая в большой части слу чаев атипичность его динамики. Однако, несмотря на эту атипичность, иммунограмма и в этих случаях дает возможность следить за ходом воспалительной реакции.

1.3.4.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В этой части монографии мы лишь наметили общие контуры работы иммунной системы, стараясь обосновать основные закономерности, лежащие в основе ее функ ционирования, постоянно проецируя их на сдвиги ИКК, выявляемые в периферической крови. Однако наши знания сегодняшнего дня могут дать лишь эскиз реально функ ционирующей системы организма. Понимание этого поможет врачу правильно вос пользоваться знаниями современной иммунологии для осознанного подхода к интер претации иммунограммы периферической крови.

В зависимости от многочисленных внешних и внутренних причин целые эта пы иммунной реакции в отдельных случаях могут практически не проявляться или же абсолютно доминировать при наличии нормальной иммунной системы.

Часть эффек-торных и регуляторных функций из-за сугубо морфологических особенностей органа или ткани может практически не проявляться.

Почти каждая из ИКК имеет, кроме иммунных, ряд параллельных функций, о которых мы часто забываем, изучая иммунную систему организма. Однако существование этих функций, по-видимому, накладывает ощутимые искажения на сдвиги в показателях ИКК периферической крови по сравнению с предсказываемыми теоретически. Исходя из параллелизма и дублирования функций разными компонентами иммунной системы, надо иметь в виду, что, например, уменьшение количества Т-супрессоров приведет к усилению иммунного ответа, только если не увеличится уровень всех других супрессо ров (В-, макрофагальных, метаболитических) и при этом не сократится суммарная ак тивность всех стимулирующих факторов (Т-, В-, макрофагальных и гуморальных хелпе ров). В ином случае эффекта усиления не только может не быть, но даже возможен об ратный эффект.

Во всех звеньях реально существующих взаимодействий компонентов иммунной системы как на уровне регуляции их образования, активации, так и на уровне непо средственного проявления эффекторных функций у нас остается еще слишком много белых пятен для того, чтобы можно было создать реальную рабочую схему количест венной работы иммунной системы и на ее основе четко понять сдвиги клеток перифе рической крови при патологии и точно прогнозировать развитие дальнейших событий в организме.

Основная задача этой теоретической главы состояла в том, чтобы дать клиницисту общие представления о сегодняшних знаниях функционирования отдельных компонен тов иммунной системы и об их реальном месте в общей системе, функционирующей как единое целое.

Самой большой ошибкой клиницистов (как, впрочем, и многих теоретиков- имму но- логов), прочитавших данную главу и ознакомившихся с достижениями в теоретических исследованиях механизмов регуляции, взаимодействий и функционирования отдель ных ИКК, будет решение непосредственно применить их для практической интерпрета ции динамики иммунограммы в клинике, забыв, что сегодня эти закономерности полу чены в основном в опытах, поставленных в отрыве от целостной реально функциони рующей иммунной системы. Ведь теоретические результаты свидетельствуют лишь о возможных механизмах и в основном очень мало о реальной функциональной значи мости этих механизмов в реальных ткани или органе, подвергшихся агрессии чужерод ного.

И все же мы надеемся, что теоретические основы прикладной иммунологии, опи санные в этой главе, помогут читателю более глубоко осмыслить те закономерности сдвигов в иммунограмме, которые выявила большая клиническая практика изучения изменений в иммунограмме при различных патологиях. Возможно, этот теоретический материал хотя бы частично поможет осознать и те имеющиеся ограничения в трактовке иммунограммы, которые необходимо знать при работе с анализом крови в клинике.

2.0. Глава МЕТОДОЛОГИЯ И ТЕХНИКА ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА Можно с полным основанием утверждать, что становление и развитие важней шего направления клинической иммунологии - оценки иммунного статуса человека - совпало с появлением и разработкой методов анализа клеток крови и продуктов их функционирования. Это не случайно, поскольку именно кровь является практически единственным легко доступным для исследования материалом, позволяющим судить о состоянии иммунной системы всего организма (секреты и смывы со слизистых поверх ностей служат основным материалом для оценки местной иммунной системы). Хотя кровь не является ареной непосредственного проявления главных - эффекторных функций иммунокомпетентных клеток (ИКК), она служит основным руслом их транспор та к местам выполнения этих функций. Поэтому анализ клеток крови и их продуктов по зволяет судить о состоянии иммунной системы организма Разработка методов анализа клеток крови проходила в два этапа.

Первый этап начался в конце прошлого века с разработки теорий кроветворения и ретикуло-эндотелиальной системы П. Эрлихом, А.А. Максимовым и др. и завершился работами В. Шиллинга, в которых отобраны простые надежные методы определения основных клеточных показателей крови и даны основы их клинической интерпретации.

Огромное практическое значение этого этапа не вызывает сомнений: лейкограмма яв ляется важнейшим помощником врача и повседневно используется в клинике.

Второй этап хотя и зародился во времена И.И. Мечникова, но, по сути, начался с клональной теории М.-Ф. Бернета в 50-е годы нашего века. Далее, в 60-70-е годы, по следовало интенсивное развитие методологии анализа популяций и функциональной активности лимфоцитов. В эти годы были открыты и развиты основные иммунологиче ские методы: иммунофлюоресценции, бласттрансформации, розеткообразования, тор можения миграции лейкоцитов и др. Для завершения этого этапа необходимо широкое внедрение наиболее простых и информативных из данных методов в практику, что в отличие от методов первого этапа возможно только при высокой степени технологич ности и автоматизации с использованием стандартных комплектов реактивов, мате риалов и оборудования.

За рубежом для этой цели созданы высокопроизводительные автоматические приборы, которые вместе с четко отработанной для них технологией и комплектами специальных реактивов разрабатываются и продаются разными фирмами. Эти автома ты и наборы реактивов к ним весьма дорогостоящи. Их использование целесообразно при большом потоке анализов. Дру-гой возможный путь внедрения иммунологических методов состоит в разработке на основе их простых модификаций механизированных технологий, для осуществления которых не требуется дорогостоящих автоматов и ре активов и которые при обеспечении возможности приобретения стандартных комплек тов реактивов и материалов могут повсеместно использоваться как для единичных, так и для серийных анализов.

В настоящей главе кратко приводится методология иммунологического анализа основных, преимущественно клеточных, компонентов периферической крови, которая должна помочь читателю разобраться во всем многообразии иммунологических мето дик и их модификаций. Кроме того, подробно описана технология определения ком плекса важнейших иммунологических показателей. Описание ее, с одной стороны, по может желающим внедрить данный компекс в своей лаборатории, даже если эта лабо ратория принадлежит обычной больнице или поликлинике, с другой - явится примером, иллюстрирующим фактическую сложность любого, даже самого простого метода, сви детельствующим о том, что использование любого иммунологического метода связано с серьезной кропотливой повседневной работой сотрудников лаборатории.

2.1. ВАЖНЕЙШИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЯДРОСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК КРОВИ Методы анализа основных типов(популяций) ядросодержащих клеток крови, со ставляющих лейкограмму, и большинство субпопуляций этих клеток принципиально различаются.

В основе определения лейкоцитов разных типов лежат их морфологические раз личия по размеру, форме ядра, наличию в цитоплазме гранул и т.д., в связи с чем для их идентификации достаточно подобрать условия, позволяющие выявлять указанные особен-ности более четко (варианты окрашивания, приспособления для распознавания клеток, такие, как микроскоп, гемоцитометр и др.). В противоположность этому субпо пуляции лимфоцитов морфологически обычно различаются слабо или не различаются вообще, поэтому их можно определить только в иммунологических реакциях, позво ляющих оценивать функциональную активность или выявлять поверхностные структу ры (рецепторы или антигены), характерные для данной субпопуляции.

Лимфоциты подразделяют на субпопуляции на основании наличия на поверхности клеток разнообразных маркеров (рецепторов, антигенов) и выполнения клетками определенных функ ций (эффекторных, регуля-торных). Долгое время считалось, что наличие на клетке того или ино го маркера соответствует выполнению ею определенной функции (например, наличие рецептора к эритроцитам барана - Е-рецептора - характеризует Т-лимфоциты, в то время как наличие ре цептора к эритроцитам мыши и третьему компоненту комплемента СЗ отличает В-лимфоциты;

наличие Fсµ -рецептора и CD 4 антигена отличает Т-хелперы, а Fc-рецептора и CD 8 антигена характеризует Т-лимфоциты, обладающие супрессорной и цитотоксической активностью). На са мом деле все обстоит значительно сложнее, и это надо хорошо понимать.

Во-первых, было показано, что определенную функцию осуществляет лишь очень не большое количество лимфоцитов с данным маркером (Mingari, Мorettа, 1982): выполнению клетками данной функции более близко соответствует наличие на них сочетания нескольких мар керов (Miedema et al., 1985;

Thomas et al., 1982). Более того, функциональная активность кле ток в сильной степени зависит от качественного и количественного состава гуморального и клеточного окружения, составляющего среду, в которой клетки находятся: в зависимости от этих факторов функция клеток (например, хелперная) может не только исчезать, но даже частич но заменяться другой (например, супрессорной) (Lehner et al., 1985). Поэтому, говоря о функции клеток лишь на основании того или иного поверх ностного маркера, нужно понимать, что эта функция является лишь преимущественной, на самом деле субпопуляция весьма гетерогенна.

Во-вторых, на поверхности каждой клетки находится огромное количество самых разнооб разных рецепторов и антигенов (Манько, 1987, 1988;

McDonald, 1982;

Winchester, Kunkel, 1979), поэтому разделение популяций по одному маркеру позволяет выявлять лишь субпопуля ции, весьма гетерогенные по другим маркерам и выполняемой функции. В то же время раз деление клеток на субпопуляции с учетом нескольких маркеров приведет к выявлению фактиче ски бесчисленного количества субпопуляций, которые функционально будут частично дублиро вать друг друга. Таким образом, учитывая большое разнообразие рецепторов и антигенов на по верхности клеток, а также различие их экспрессии на отдельных клетках, можно прийти к выводу о том, что каждая клетка по своему поверхностному составу индивидуальна, неповторима, а та или иная функция выполняется за счет коллективного действия клеток, которые могут весьма сильно различаться по своей поверхностной структуре.

Втретьих, необходимо учитывать различие в физиологической активности клеток одной и той же субпопуляции, что проявляется в разной авидности и плотности рецепторов и ан тигенов на поверхности клеток (Лебедев, Понякина, 1981). По-видимому, какую-либо функцию выполняют клетки не только с определенным сочетанием поверхностных маркеров, но и с опре деленной степенью экспрессии каждого из них, т.е. клетки, находящиеся в определенном физио логическом состоянии.

Наконец, ясно, что функции клеток in vivо и in vitro могут существенно различаться (Mingari, Мorettа, 1982). Поскольку мы определяем функциональную активность клеток, выделен ных из крови и очищенных, при помощи специальных тестов (например, продукцию иммуноглобу линов В-клетками в смешанной культуре лимфоцитов или под влиянием митогенов, киллерную активность в цитотоксическом тесте и др.), мы не можем быть полностью уверенными в том, что в организме функциональная активность этих клеток будет аналогичной. Это подтверждается данными о том, что функция клеток каждой субпопуляции сильно зависит от присутствия клеток других субпопуляций (Lehner et al., 1985), их концентрации, наконец, от концентрации лейкоцитов в крови, из которой клетки были выделены (Johnstone et al., 1982).

Каждый иммунолог или врач другой специальности, четко осознав сказанное выше, не должен быть разочарован огромной сложностью рецепторного и антигенного поверхностного состава и вариантов функционирования иммунокомпетентных клеток организма. Напротив, он должен по нять, как неограниченны его возможности в поисках того рационального, что не только поможет оценивать состояние иммунной системы пациента, но и сделать новый шаг к осознанию общих и частных закономерностей работы системы защиты организма.

2.1.1. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПОПУЛЯЦИЙ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ Определение содержания в крови лейкоцитов и количественная оценка основных типов клеток (формула крови, или лейкограмма) осуществляются в практической меди цине с ЗО-х годов нашего столетия, когда В. Шиллингом были описаны простые методы определения этих показателей с применением микроскопического исследования. В на стоящее время на практике используются несколько способов подсчета количества лейкоцитов и определения лейкограммы, основанных на одном принципе: распознава ние образа клеток за счет различия их внешнего вида (Шиллинг, 1931;

Кассирский, Алексеев, 1948;

Кост, Смирнова, 1964;

Козловская, Николаев, 1984).

В нашей стране наиболее распространен способ визуального определения клеток с помощью микроскопа. Суммарное содержание лейкоцитов в объеме крови определя ют путем подсчета количества клеток в известном объеме жидкости, представляющей собою кровь, разбавленную 20-кратным объемом 3%- ного водного раствора уксусной кислоты, разрушающего эритроциты. Технически подсчет клеток в точном объеме осу ществляют при помощи камеры Горяева (Кост, Смирнова, 1964;

Козловская, Николаев, 1984).

Лейкограмму определяют в мазке, который говорят из капли крови на предметном стекле, и после фиксации окрашивают так, чтобы четко различать основные клеточные структуры (ядро, цитоплазму, гранулы и т.д.), характеризующие клетки отдельных попу ляций. Клетки всех основных популяций хорошо различаются после окрашивания сме сями азура и эозина.

Широкому распространению визуального метода анализа крови способствовала его простота и надежность, хотя низкая производительность, связанная с необходимо стью микроскопирования, заставляла искать новые методы.

За рубежом в последние 30 лет появились и сейчас широко распространены вы сокопроизводительные автоматические приборы для подсчета не только общего коли чества лейкоцитов, но и формулы клеток. В основе автоматического подсчета лейкоци тарной формулы лежит принцип распознавания образа клетки либо в окрашенном маз ке (сравнение морфологических характеристик клеток с образом клеток разных типов, хранящимся в памяти компьютера), либо в цельной крови (по размеру и цитохимиче ским свойствам клеток после их окрашивания). Подобные автоматы обладают высокой производительностью и точностью. Повышенная точность автоматического подсчета достигается вследствие возможности оценки результата при просчете не 100-200 кле ток, как с использованием светового микроскопа, а нескольких тысяч клеток, что позво ляет более точно определять количество тех клеток, содержание которых в крови не велико (зозинофилы, базофилы, плазматические клетки).

Следует отметить, что высокая точность анализа в клинике нужна нечасто, в большинстве случаев врача удовлетворяет обычный анализ на 100-200 клеток (Шиллинг, 1931). Во многих слу чаях на практике бывает достаточно определить в крови, помимо общего количества лейкоци тов, содержание лишь нескольких основных популяций - лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов.

Клетки всех этих популяций легко дифференцировать и подсчитывать в процессе определения содержания в крови лейкоцитов, если кровь разбавлять не 3%-ным, а 10%-ным водным раство ром уксусной кислоты, который не только лизирует эритроциты, но и способствует набуханию ядер клеток и за счет этого- четкой видимости формы ядер клеток основных популяций. Хотя данный способ дает возможность получать лишь ограниченную лейкограмму, он обладает прин ципиальной простотой, доступен и требует минимального количества крови.

Поскольку клетки существуют и функционируют в обшей системе крови, лейко грамму целесообразно дополнять показателями, оценивающими свойства цельной крови. Одним из таких показателей является скорость оседания эритроцитов (СОЭ), отражающая реологи-ческие свойства плазмы (связанные, в частности, с содержанием в ней белков). Для определения СОЭ кровь перемешивают с антикоагулянтом (обычно цитратом натрия), помещают в мерный капилляр, выдерживают в течение часа и изме ряют столб плазмы над осевшим осадком клеток в миллиметрах (Козловская, Никола ев, 1984).

2.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В отличие от методов определения лейкограммы, методы оценки субпопуляций лимфоцитов более сложны, поскольку основаны на проведении иммунологических ре акций. Эта сложность обусловливает наличие огромного количества модификаций лю бого из этих методов, в связи с чем результаты, получаемые разными исследователя ми, зачастую не совпадают, что, в свою очередь, оказывает влияние на их интерпрета цию, а следовательно, снижает клиническую эффективность тестов. Поэтому в на стоящее время в широкую практику вошли лишь некоторые из иммунологических мето дов, а именно те, для которых была отработана несложная, стандартизированная тех нология.

Среди немногих иммунологических методов, вошедших в медицинскую практику зарубежных стран, можно назвать методы определения субпопуляций ИКК с помощью мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител, оп ределение содержания иммуноглобулинов - основного продукта В-клеток - методами лазерной нефелометрии и радиальной иммунодиффузии. Другие тесты используются более или менее широко лишь в лабораториях научно-исследовательских медицинских учреждений.

Клеточные реакции определения субпопуляций и функциональной активно сти ИКК проводят обычно в суспензиях лейкоцитов или их отдельных популяций, которые выделяют из цельной крови. Большинство реакций (методы иммунофлюо ресценции, розеткообразования, фагоцитоза и др.) можно ставить с использованием как суспензий очищенных клеточных популяций, так и суспензий неразделенных лейко цитов.

Для предотвращения свертывания в кровь при взятии обычно добавляют антикоагулянты:

гепарин (20 ед. на 1 мл крови), цитрат натрия (3,8%-ный раствор) или этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) (5%-ный раствор) (Новикав, Новикова, 1979;

Иммунологические методы, 1987).

Все антикоагулянты дозозависимо влияют на реакционную способность клеток (Steel et al., 1974).

Гепарин, пожалуй, оказывает на клетки наименьшее влияние, однако присутствие в нем консер ванта угнетает активность клеток. Поэтому для этих целей используют гепарин без консерванта.

Свертывание крови предотвращает также не менее чем 20-кратное разбавление ее сразу же по сле взятия, например, физиологическим раствором (Тотолян и др., 1986), а также дефибриниро вание при помощи вращения в стеклянной посуде в присутствии стеклянных бус.

В настоящее время разработаны и используются разнообразные способы выделения по пуляций и субпопуляций ядросодержащих клеток крови, основанные на их физических свойствах:

1) различиях удельной массы клеток разных популяций (способы выделения лейкоцитов и их по пуляций при помощи спонтанной седиментации или в результате центрифугирования с примене нием градиентов плотности);

2) различиях устойчивости клеток к изменениям осмотического дав ления среды (методы гемолиза эритроцитов дистиллированной водой или растворами различных веществ);

3) различиях адгеэивной активности клеток (методы адгезии клеток на поверхности пластмассы, нейлоновой вате и т.д.);

4) различиях поверхностного электростатического заряда клеток (методы электрофореза);

5) различиях в физиологических свойствах клеток (методы ро зеткообразования и фагоцитоза с последующим отделением клеток, вступивших в реакцию, при помощи градиентов плотности или магнита). Большинство из этих способов имеют важное пре паративное значение, т.е. позволяют выделять клетки тех или иных популяций и субпопуляций для экспериментального исследования. Для аналитических целей, особенно для методик массо вого использования, пригодны лишь простые, надежные, наименее трудоемкие методы.

Получение суспензий лейкоцитов. Первая группа способов получения лейкоци тов основана на различиях удельной массы эритроцитов (1,097 кг/л) и лейкоцитов (1,07-1,08 кг/л).

Одним из наиболее простых является метод спонтанной седиментации эритроци тов. Он состоит в том, что кровь выдерживают при 20-370 С в течение 0,5-1,5 ч, в ре зультате чего она расслаивается: нижний слой содержит преимущественно эритроциты (с примесью лейкоцитов), верхний представляет собой плазму, обогащенную лейкоци тами (однако содержащую большую или меньшую примесь эритроцитов). Плазму отби рают, клетки осаждают центрифугированием.

Для улучшения отделения лейкоцитов от эритроцитов к крови можно добавлять вещества, образующие коллоидные растворы (декстрин, желатин, метилцеллюлозу, фибриноген, гуммиа рабик и др.) (Новиков, Новикова, 1979;

Линг, 1971). Например, З%-ный раствор желатина в фи зиологическом растворе смешивают с кровью в соотношении 1:3, после чего инкубируют при 370С в течение 30-40 мин, собирают надосадочную жидкость, полученные клетки осаждают цен трифугированием (Понякина и др., 1983).

Данный способ прост, он позволяет выделять лейкоциты крови с минимальным их повреж дением, и, что самое важное, в выделенных с его помощью лимфоцитах соотношение субпопу ляций почти такое же, как в цельной крови (Uduра et а1., 1980). Однако популяционный состав выделенных лейкоцитов зависит от времени расслаивания крови: поскольку удельная масса гра нулоцитов больше, они осаждаются после эритроцитов в первую очередь. В связи с этим, учиты вая различие в вязкости плазмы разных образцов крови, трудно подобрать индивидуальное вре мя расслаивания крови так, чтобы состав лейкоцитов полностью соответствовал их соотношению в крови. Кроме того, в выделенной суспензии лейкоцитов практически всегда присутствуют эрит роциты. Их можно удалять путем гемолиза дистиллированной водой или раствором хлористого аммония (Иммунологические методы, 1987;

Лебедев и др., 1976).

Вторая группа методов основана на удалении эритроцитов из цельной крови пу тем их гемолиза гипотоническими растворами (Новиков, Новикова, 1979;

Иммунологи ческие методы, 1987;

Лебедев и др., 1987). Поскольку содержание эритроцитов в цель ной крови велико, лизис ведут с использованием большого избытка растворов. Для ге молиза обычно берут либо дистиллированную воду, либо раствор хлористого аммония (обычно 0,83%-ный, возможно, с различными добавками), реже - смесь уксусной и вин нокаменной кислот, сапонин, грамицидин, лизолецитин, гемолитические сыворотки, стрептолизин и др.

Наиболее часто применяют следующие два способа гемолиэа.

Гемолиз дистиллированной водой. К крови добавляют 40-50-кратный объем дистиллиро ванной воды, перемешивают 30-40 сек., после чего восстанавливают осмотическое давление, приливая соответствующее количество 10-кратного концентрата раствора Хенкса или забуфе ренного физиологического раствора (Тотолян и др., 1986). Клетки осаждают центрифугировани ем.

Гемолиз раствором хлористого аммония. К крови добавляют 8-10-кратный объем 0,83% ного раствора хлористого аммония (рН 7,4), перемешивают в течение 2-3 мин. Затем приливают столько же раствора Хенкса. Клетки осаждают центрифугированием.

Одним из главных недостатков гемолиза является повреждение лейкоцитов, которое в большей или меньшей степени происходит всегда. При этом гемолиз с использованием дистил лированной воды является более мягким, поскольку предполагает: а) менее длительное воздей ствие на клетки;

б) практически мгно-венное и полное снятие этого воздействия, которое дости гается прибавлением 10-кратного концентрата раствора Хенкса. Это подтверждают данные о жизнеспособности клеток, близкой к 100%, и полной сохранности фагоцитарной активности ней трофилов (Лебедев и др., 1987). При использовании раствора хлористого аммония воздействие вещества на клетки не снимается фактически до их отмывки. По сравнению с лимфоцитами гра нулоциты менее устойчивы к воздействию ионов аммония: после гемолиза раствором хлористого аммония способность нейтрофилов к фагоцитозу резко уменьшается, вплоть до полного исчез новения (Иммунологические методы, 1987;

Лебедев и др., 1987).

Способ получения лейкоцитов путем гемолиза эритроцитов позволяет получать все лейко циты, содержащиеся в крови, практически без потерь, хотя гипотонический шок влияет на со стояние клеточной мембраны, в частности, открывает значительное количество Fc-рецепторов (Saal et al., 1982).

Получение отдельных популяций лейкоцитов. Эти способы основаны на раз личиях удельной массы эритроцитов и лейкоцитов разных популяций (Boyum, 1968).

Для выделения моноядерных клеток обычно используют градиенты плотности. Гради ент обычно представляет собой водный раствор фиколла с добавкой гипака, изопака, верографина, диагинола или других веществ. Принцип метода состоит в том, что сус пензию клеток помещают сверху градиента и центрифугируют. В результате те клетки, которые имеют плотность больше, чем градиент, проходят через него и скапливаются на дне пробирки, в то время как все остальные остаются над градиентом.

.

Одна из возможных схем такого выделения клеток состоит в следующем. На 3 мл смеси ги пак-фиколла (10 частей 34%-ного гипака и 24 части 8-9 %-ного раствора фиколла в дистиллиро ванной воде, плотность смеси доводится до 1,077 кг/л) наслаивают 6-12 мл крови, разбавленной физиологическим раствором в 2-3 раза. Центрифугируют при 400g в течение 30- 40 мин. В ре зультате клетки крови разделяются: моноядерные клетки и тромбоциты находятся в интерфаз ном слое между плазмой и градиентом, в то время как гранулоциты и эритроциты оседают на дно пробирки. Интерфазный слой собирают и пос-ле трехкратной отмывки получают суспензию моноядерных клеток - выход лимфоцитов со ставляет 60-75% (Нaугу et аl., 1977). Гранулоциты, осевшие на дно пробирки вместе с эритроци тами, выделяют так же, как лейкоциты из цельной крови: седиментацией в присутствии желатина или декстрана.

В качестве градиента можно использовать также 35%-ный раствор химически чистой сахаро зы в воде (Лебедев, Андреева, 1974), 10%-ный раствор сахарозы в реополиглюкине, смеси веро графина и сахарозы (Новиков, Новикова, 1979) и т.д. Для выделения достаточного количества клеток с использованием градиентов требуется не менее 1 мл цельной крови из-за потерь клеток в процессе манипуляций.

Использование градиентов позволяет разделять сумму лейкоцитов на отдельные популя ции: моноядерные клетки и гранулоциты. Однако при постановке иммунологических реакций сле дует помнить, что получаемые моноядерные клетки на 8-35% обогащены моноцитами (в основ ном малыми), причем степень обогащения зависит не только от содержания моноцитов в крови (Udupa еt аl., 1980). Поскольку в микро-скопе при малом увеличении (которое обычно используют для оценки результатов иммунологических реакций) отличить малые моноциты от лимфоцитов очень трудно, а зачастую невозможно, для корректного анализа субпопуляций лимфоцитов необ ходимо удалять моноциты, для чего используют их способность фагоцитировать частицы латекса или карбонильного железа. Градиентное центрифугиро-вание, особенно при низких температу рах, приводит к более или менее выраженному изменению субпопуляционного состава лимфоци тов, поскольку часть Т- лимфоцитов может осаждаться на дно пробирки из-за образования ауто логичных розеток (Udupa et al., 1980). Кроме того, фиколл приводит к изменению физиологиче ской активности клеток, в частности, стимулирует экспрессию М-рецепторов (Eremin, Binns, 1982).

Таким образом, если методы спонтанной седиментации или гемолиза эритроцитов позволяют по лучать в общей суспензии лейкоцитов моноядерные клетки в таком же соотношении их популя ций и субпопуляций, как в цельной крови, то градиентное центрифугирование изменяет состав моноядерных клеток за счет селективного обогащения одних и потерь других популяций или суб популяций клеток. Итак, использование градиентов создает дополнительные нефизиологические условия (длительный контакт с градиентом) и приводит к изменениям состава моноядерных кле ток, степень которых предсказать невозможно.

Мы перечислили основные способы выделения клеток, применяемые для поста новки иммунологических реакций, различающиеся по степени сложности и популяцион ному составу получаемых клеток. Какой из этих способов следует предпочесть, зависит от используемых иммунологических методик и целей исследования. Необходимо, одна ко, иметь в виду, что высокоочищенные клетки одной популяции (например, лимфоци ты) значительно слабее реагируют на различные воздействия и менее активны в имму нологических реакциях, чем те, которые имеют примесь клеток других популяций (Ле бедев, Понякина, 1985;

Новиков, Новикова, 1979). Это может быть связано с наличием кооперативного эффекта, влияющего на проявление клетками в реакциях полноценной активности. Немаловажно и то, что более высокая степень очис-тки требует более сложных и длительных манипуляций с клетками, что существенно их трав-мирует и обусловливает частичные потери клеток. Поэтому при разработке аналитических мето дов для практической клинической иммунологии следует, по-видимому, предпочесть наиболее простые, щадящие методы выделения, дающие минимальные потери клеток.

2.1.2.1. ОЦЕНКА СУБПОПУЛЯЦИЙ ПО РЕЦЕПТОРАМ И АНТИГЕНАМ НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК Основой этих методов является обнаружение поверхностных маркеров (антиге нов, рецепторов), имеющихся на поверхности клеток определенных субпопуляций. Та кие поверхност-ные маркеры обнаруживают при помощи молекул или частиц, имеющих молекулярные структуры, комплементарные тем, которые находятся на поверхности клеток, и соединенных с индикаторами, позволяющими установить факт прикрепления их к клетке. Индикаторами могут служить флюоресцирующие красители, ферменты или крупные корпускулярные частицы, хорошо видимые в микроскоп при увеличении, дос таточном для идентификации клеток крови.

Методы, использующие в качестве индикаторов флюоресцентные красители (методы мембранной иммунофлюоресценции), основаны на том, что если молекулы иммуноглобулинов соединить с молекулами флюоресцентных красителей, то их спе цифическая активность в плане присоединения к соответствующим антигенам полно стью сохранится (Coons et al., 1941). В качестве таких красителей чаще всего исполь зуют препараты флюоресцеина (зеленое свечение) и родамина (красное свечение).

Люминесцентно-серологический метод. Этот метод применяют для обнаружения имму ноглобу-линов на поверхности лейкоцитов. Поверхностные иммуноглобулины присутствуют в больших количествах на В-лимфоцитах, что дает возможность выявлять их среди общей популя ции лимфоцитов.

Для обнаружения мембранных иммуноглобулинов конъюгаты антител к иммуноглобулинам крови человека и флюорохрома смешивают с суспензией живых, отмытых от сывороточных бел ков клеток крови человека и инкубируют при О- 4° С в течение 20-30 мин. Затем окрашенные та ким способом клетки трижды отмывают и просчитывают количество светящихся клеток с исполь зованием флюоресцентного микроскопа. Для увеличения информативности можно проводить двойное окрашивание (окрашивание одной и той же клеточной суспензии двумя разными анти сыворотками). Увеличение чувствительности может быть достигнуто при помощи непрямого ок рашивания: для этого клетки вначале обрабатывают антисывороткой, затем, после отмывки, флюоресцирующей антисывороткой, содержащей антитела к иммуноглобулинам первой сыво ротки (Лебедев, Ганина, 1969;

Лебедев и др., 1976;

Методы исследозаний в иммунологии 1981).

Данный метод сложен и трудоемок, поскольку требует большой подготовительной работы, связанной с получением и очисткой антисывороток, подбором подходящей партии флюорохрома, приготовлением конъюгатов и подбором условий, индивидуальных для каждой системы, поэтому нашел широкое практи-ческое применение лишь после разработки автоматизированной техноло гии и налаживания выпуска приборов (проточных цитофлюориметров) и комплектов меченых мо ноклональных антител.

Метод лазерной проточной цитофлюориметрии. С начала 80-х годов с разви тием техники иммунологического анализа люминесцентно-серологический метод всту пил на принципиально новый этап развития. К этому времени были разработаны гиб ридомные способы получения моноклональных антител к различным антигенам мем бран клеток, характеризующим разнообразные субпопуляции, был автоматизирован способ учета результатов путем замены флюоресцентного микроскопа автоматическим лазерным проточным цитофлюориметром, позволяющим идентифицировать клетки с учетом интенсивности флюоресцентного свечения и размера при прохождении их в по токе жидкости.

На поверхности иммунокомпетентных клеток находят самые разнообразные дифференци ровочные антигены, которые можно выявлять при помощи соответствующих моноклональных ан тител (Манько, 1987, 1988;

Bach, Bach, 1981а). В настоящее время моноклональные антитела для определения субпопуляций иммунокомпетентных клеток человека производят и продают разные зарубежные фирмы, в частности "Orto Diagnostic Systems Inc." (США) - антитела ОКТ, ОКВ, ОКМ и др.(OK - Orto Klon) и "Becton Dickinson Monoclonal Center Inc". (США) - антитела Leu.

Антигены CD 3 (CD - кластер дифференцировки), выявляемые с помощью моноклональных антител ОКТ 3, ОКТ 1, Leu 4, присутствуют на зрелых Т-лимфоцитах, находящихся в перифери ческих лимфоидных органах или тимической медулле.

Антигены CD 4, выявляемые моноклональными антителами ОКТ 4 и Leu 2а, обнаруживают ся на Т-лимфоцитах, обладающих хелперной (для продукции иммуноглобулинов) и индукторной (генерирующие цитотоксичные Т-клетки, отвечающие на растворимые антигены пролиферацией и продукцией лимфокинов) функцией.

Антигены СD 8, выявляемые моноклональными антителам ОКТ 8 и Leu 3a, находятся наТ лимфоцитах, обладающих супрессорной (для продукции иммуноглобулинов) и цитотоксической активностью, а также предшественниках цитотоксических клеток.

Антигены CD 2, выявляемые моноклональными антителами ОКТ 11, присутствуют на всех периферических Т-лимфоцитах. По-видимому, эти антигены являются рецепторами к эритроци там барана (В-рецепторами). Моноклональные антитела ОКТ 6 выявляют антигены (CD 1) на не зрелых, кортикальных тимоцитах. ОКТ 9 и ОКТ 10 выявляют антигены на претимических клетках, Т-лимфоцитах, находящихся на ранних стадиях дифференцироаки, и на активированных Т лимфоцитах.

Моноклональные антитела ОКВ 1 и Leu 12 обнаруживают антигены на зрелых В лимфоцитах. ОКВ 2 выявляют антигены, характеризующие молодые формы В-лимфоцитов и на ходящиеся на гранулоцитах, ОКВ 7 выявляют типирующие В-лимфоциты;

моноклональные анти тела OK la 1 выявляют клетки, экспрессирующие Iа (иммуноассоциированные) антигены, ОКМ 1 и Leu 7 выявляют антигены, характерные для моноцитов, гранулоцитов, естественных киллеров, ОКМ 5 обнаруживают антигены на молодых моноядерных клетках.

В настоящее время для изучения клеток используют и сочетания моноклональных антител, позволяющие более узко характеризовать субпопуляции клеток, несущих одновременно два или несколько антигенов (Nicholson et al., 1986).

Определение на клетках поверхностных антигенов методом иммунофлюориметрии с ис пользо-ванием лазерной цитометрии и моноклоиальных антител может проводиться как в цель ной крови, так и в клеточных суспензиях, выделенных из крови (так же как люминесцентно- серо логическим методом). В настоящее время в клинической иммунологии достаточно широко ис пользуется метод с применением небольших количеств капиллярной крови из пальца. Одна из модификаций этого метода состоит в следующем. 0,05 мл крови с антикоагулянтом инкубируют с раствором моноклональных антител, конъюгиро-ванных с флюорохромами при 00С в течение 15-30 мин. Затем эритроциты лизируют, выдерживая с гемолитической жидкостью (0,83%-ный раствор хлористого аммония с добавкой ЭДТА) при 200С в течение 40-60 с. Результаты учиты вают при помощи жидкостного проточного цитофлюориметра, идентифицируя клетки по размеру (популяции лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов) и по интенсивности свечения (определение субпопуляций по присоединению конъюгатов моноклональных антител с флюорохромом).

Метод лазерной проточной цитофлюориметрии достаточно широко распространен в клини ческой иммунологии за рубежом, поскольку там налажен серийный выпуск и продажа комплектов моноклональных антител и приборов с отработанной технологией анализа, подробно описанной в инструкции. Однако как моноклональные антитела, так и прибор весьма дорогостоящи;

кроме того, прибор требует постоянного технического контроля специалистами. Поэтому данный способ экономически оправдывает себя только при обеспечении высокопроизводительной работы (не прерывного потока анализов). Это несколько сужает возможности повсеместного применения данного способа. Конечно, вместо жидкостного цитофлюориметра можно применять флюорес центный микроскоп, но в этом случае приходится менять технологию, подбирая условия таким образом, чтобы свечение окрашенных конъюгатами клеток было хорошо видно;

резко увеличива ется время анализа, поскольку исключается автоматизация.

Методы, использующие в качестве индикаторов корпускулярные частицы ( метод розеткообразования), используются и развиваются в клинической иммуноло гии с начала 70-х годов. Они основаны на феномене прилипания к поверхности клеток корпускулярных частиц различной природы с образованием розеток (розеткой называ ют клетку, к которой прикреплено не менее трех таких индикаторных частиц) (Bach, 1973;

Понякина, Лебедев, 1983). Акт прили-пания к поверхности клетки достаточно крупной частицы происхо-дит за счет неспецифических сил адгезии, однако направля ется и обусловливается он взаимодействием комплементарных структур (рецепторов или антигенов, имеющихся на поверхности клетки и индикаторной частицы).

Методы розеткообразования используют для определения на клетках самого широкого спек тра поверхностных маркеров. Розетки с определенными корпускулярными частицами образуют клетки крови всех популяций: лимфоциты, нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, базофилы (Ле бедев, Понякина, 1985). Однако в каждой популяции те или иные розетки образуют обычно не все клетки, а их часть, т.е. клетки отдельных субпопуляций.

Наиболее давно открытыми и самыми простыми являются тесты розеткообразования с эритроци-тами животных. Тест розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РО) применяют для выявления Т-лимфоцитов (показано, что Е-рецепторы идентичны антигенам, выявляемым моноклональными анти-телами ОКТ 11 и присутствуют в больших количествах на Т-клетках).

Кроме этого, Т-лимфоциты способ-ны образовывать розетки с эритроцитами козы, свиньи, лоша ди, обезьяны Rhesus, человека, собаки и др. (Stathopoulos еt аl., 1974;

Charreire, Bach, 1974;

You et al., 1977).

Тест розеткообразования с эритроцитами мыши (М-РО) используют для обнаружения В лимфоцитов (показано, что М-рецепторы в больших количествах присутствуют на наименее зре лых В-клетках) (Новиков, Пчельников, 1983;

Gupta еt al., 1975). В-лимфоциты могут образовывать розетки также с эритроцитами обезьяны Масаса spesiosa (Paid et al., 1978). К розеткообраэова нию с эритроцитами животных способны не только лимфоциты, но также клетки всех других по пуляций крови, тканевые макрофаги, эпителиальные клетки (Кочергин и др., 1977;

Петрова, Ва сильева, 1983;

Понякина и др., 1984), поэтому данные тесты можно использовать и для оценки субпопуляций всех указанных клеток.

Использование эритроцитов или иных корпускулярных частиц, нагруженных антителами, компле-ментом, другими белками, существенно расширяет возможности розеткообразования.

Тест розетко-образования с эритроцитами, нагруженными иммуноглобулинами разных классов (так называемыми ЕА-частицами, т.е. частицами эритроцит-антитело, при изготовлении которых обычно используют относи-тельно инертные эритроциты, не образующие или образующие в ус ловиях теста минимальное количест-во спонтанных розеток с клетками человека, например, эритроциты быка или человека), используют для обнаружения рецепторов к Fc-фрагментам им муноглобулинов соответствующего класса (Bаstеn et al., 1972;

Johnsen, Madsen, 1978). Эти ре цепторы находят в больших количествах на В-лимфоцитах, в меньших - на нулевых клетках, к числу которых относятся естественные киллеры, а также Т-лимфоцитах. Т-клетки, несущие ре цепторы к Fc-фрагменту lgG (Ес-рецепторы), проявляют супрессорную и цитотоксическую актив ность. Т-лимфоциты с рецепторами к Fc-фрагменту lgM (Fcµ-рецепторы) обладают хелперной ак тивностью. Т-клетки, обладающие рецепторами к Fс-фрагменту lgA, входят в субпопуляцию кле ток, имеющих хелперную активность и обладающих цитотоксичностью. Fc-рецепторы находят также на нейтрофилах, моноцитах, эозинофилах, макрофагах (Unkless et al..1981;

McDonald.1982).

Тест розеткообразования с эритроцитами, нагруженными антителами к иммуноглобулинам человека (метод антиглобулинового РО) (Haegert, Coombs, А., 1976;

Bright, cl al., 1977), исполь зуют для обнаруже- ния клеток, несущих на своей поверхности большие количества иммуноглобулинов - В лимфоцитов (т.е. для тех же целей, что и люминесцентно-серологический метод). Разработан метод прямого и непрямого анти-глобулинового РО, причем последний более чувствителен и позволяет выяв лять поверхностные иммуноглобулины на части нулевых клеток.

Тест розеткообразования с инертными эритроцитами или искусственными частицами (на пример, латекса, полиакриламидного геля), покрытыми моноклональными антителами, можно использовать для определения самых разнообразных субпопуляций иммунокомпетентных клеток (тех же, которые определяют методами иммунофлюоресценции). В отличие от метода лазерной проточной цитофлюориметрии, этот метод не требует дорогостоящего оборудования или флюо ресцентного микроскопа, а предполагает работу со световым микроскопом. Приготовление инертных частиц с иммобилизованными на них моноклональными антителами, возможно, решит проблему создания более стандартных индикаторных частиц, нежели эритроциты, к тому же об ладающих большей специфичностью и большими возможностями, что весьма важно для практи ки.

Метод комплементарного РО используют для обнаружения клеток, несущих на своей по верхности рецепторы к компонентам комплемента. С этой целью используют корпускулярные частицы, нагружен-ные соответствующим компонентом комплемента (ЕАС-частицы: эритроцит антитело-комплемент;

YC-частицы: пекарские дрожжи-комплемент;

ZC-частицы: зимозан комплемент;

ВАС-частицы: бактерия-антитело-ком-племент (НuЬег, Wigzell, 1975;

Shannon, Hostings, 1977;

Gormus et al., 1980;

Uchida et al., 1982). Рецепторы к компонентам комплемента, особенно третьему компоненту (СЗ), находят на В-лимфоцитах, на части нулевых клеток, ней трофилах, эозинофилах, моноцитах, макрофагах.

Приведенные выше тесты РО наиболее хорошо разработаны и часто применяются, однако не исчерпывают всех возможностей этого метода. Метод РО позволяет обнаруживать любые маркеры, если для этого имеются подходящие корпускулярные частицы. Так, эритроциты, нагру женные стафилококковым белком А, используют для обнаружения В-лимфоцитов человека, не сущих lgG, lgM и lgD. С помощью метода РО можно обнаруживать на клетках HLA-антигены (ан тигены главного комплекса гистосовместимости человека), рецепторы к агглютинину арахиса и т.д. (Indivery et al., 1979;

Romagnani et al., 1980).

Смешанные тесты РО, основанные на одновременном испольэоаании двух видов индика торных частиц, дают возможность выявлять одновременно клетки, несущие несколько маркеров.

Для постановки таких тестов обычно берут частицы, различающиеся по внешнему виду (напри мер, эритроциты и ZC- или YC-частицы), либо какие-либо частицы метят флюорохромом (Поня кина, Лебедев, 1983).

Для постановки реакций розеткообразования используют суспензии клеток крови: либо сус пензию очищенных лимфоцитов, либо суспензию лейкоцитов цельной крови. Принцип постановки всех тестов один. Суспензию исследуемых клеток смешивают с суспензией корпускулярных ин дикаторных частиц (эритроцитов, нагруженных эритроцитов или других частиц), клетки осаждают центрифугированием и инкубируют при 4-200С обычно 30-60 мин. Подсчет количества розетксоб разующих клеток осуществляют либо непосредственно в полученной суспензии, либо в окрашен ных препаратах, полученных после фиксации, приготовления и окраски мазков, визуально, с ис пользованием светового микроскопа.

Способы розеткообразования просты, доступны, они не требуют дорогостоящих реактивов и сложного оборудования, поэтому широко используются в клинической иммунологии. Число мо дификаций метода РО огромно: фактически почти в каждой лаборатории используется своя мо дификация метода. Это приводит к различиям получаемых результатов и, следовательно, к сложностям их трактовки. Некоторые считают, что главным недостатком метода РО является его нестабильность. Однако этот недостаток может быть устранен теми же способами, что и в отно шении других методов (в частности, мембранной имунофлюоресценции), а именно за счет упро щения методов, что позволит снизить количество влияющих факторов, создания на основе уп рощенной модификации четкой стандартной технологии постановки и создания коммерческих стандартных наборов реактивов и материалов.

2.1.2.2. ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ ТЕСТ (РЕАКЦИЯ ЦИТОЛИЗА) Установить факт присоединения антител к антигенам клеточной поверхности мож но не только при помощи флюоресцентного красителя или корпускулярных частиц, но и на основании изменения жизнеспособности клеток в цитотоксическом тесте (реакции лимфо- или лейкоцитолиза), разработанном в 50-е годы (Вегенер, 1979;

Gorer, O’Corman, 1956). Этот тест основан на том, что живые клетки, несущие определенный поверхностный антиген, после присоединения к нему антител в присутствии компле мента теряют жизнеспособность. Оценка количества погибших клеток позволяет опре делять число клеток этого типа в исследуемой популяции.

Реакцию обычно осуществляют в микроварианте (Terasaki, McClelland, 1964). В лунки панели Терасаки для микротитрования вносят суспензию клеток, антисыворотку к лимфоцитарным анти генам определенного типа и комплемент. Инкубируют при 370С. Затем окрашивают витальным красителем (чаще трипановым синим), после чего фиксируют формальдегидом. С использовани ем светового микроскопа просчитывают количество клеток, потерявших жизнеспособность (т.е.

окрашенных). В исполнении данный тест весьма прост. Сложность состоит в трудоемкости полу чения специфических антисывороток. В настоящее время цитотоксический тест наиболее часто ставят с антисыворотками к Т-лимфоцитам, В-лимфоцитам, а также нейтрофилам, эозинофилам, макрофагам (Новиков, Новикова, 1979).

При точно соблюдаемых условиях воспроизводимость цитотоксического теста высока и дос тигает 95% (Вегенер, 1979). Результаты оценки субпопуляций лимфоцитов, получаемые с приме нением данного теста, близки к тем, которые получают другими методами, например методом розеткообразования (Ботвиньева, Федорова, 1988).

Наиболее широкое распространение цитотоксический тест получил для типироваиия HLA антиге-нов. Именно с помощью этого теста были открыты наиболее часто встречающиеся HLA антигены (Иммуно-логические методы, 1979, 1987). С целью типирования цитотоксический текст осуществляют с исполь-зованием антисыворотки к HLA-антигенам (которые получают от добро вольцев, иммунизирован-ных этими антигенами, или от много рожавших женщин) (Зарецкая, Аб рамов, 1986). Антигены системы HLA экспрессируются в больших количествах на В-лимфоцитах.

В связи с тем, что В-лимфоцитов в крови относительно немного, для получения адекватных ре зультатов типирование клеток проводят обычно в очищенной суспензии В-лимфоцитов.

В-лимфоциты для типирования выделяют в два этапа: вначале получают моноядерные клет ки центрифугированием крови на градиенте плотности (п. 1.2), затем выделяют В-лимфоциты, проводя реакцию Е-розеткообразовання (для более полного связывания Т-лимфоцитов для реакции используют эритроциты барана, обработанные нейраминидазой или папаином) и отделяя образовавшие ро зетки Т-лимфоциты повторным центрифугированием на градиенте. Полученные клетки исполь зуют для типирования, проводя цитотоксический тест с соответствующими антисыворотками так, как описано выше. Результат типирова-ния оценивают в зависимости от количества погибших клеток.

Успех HLA-типировання зависит от чистоты суспензии жизнеспособных В-лимфоцитов и от концентрации клеток, используемой при проведении цитотоксического теста (Зарецкая, Абрамов 1986).

Процесс выделения В-клеток является многостадийным и сложным, и даже небольшие по грешности на каждой стадии, суммируясь, существенно увеличивают риск гибели клеток и обед нения получаемой суспензии В-лимфоцитов за счет присутствия малых моноцитов, нулевых кле ток, гранулоцитов и, следовательно, в конечном итоге приводят к ложноотрицательным резуль татам реакции лимфоцитолиза. Ложноотрицательная реакция может быть вызвана также повы шенной концентрацией клеток в суспензии, используемой при постановке цитотоксического теста (и, напротив, слишком низкая концентрация клеток может привести к ложноположительной реак ции). Кроме того, этот метод требует большого (15-20 мл) количества венозной крови, что делает его весьма травматичным для пациента.

Для уменьшения числа стадий метода и, следовательно, снижения вероятности погрешно стей разработан метод типирования с использованием двухцветного флюоресцентного окраши вания (Van Rood et al., 1977). Этот метод требует (Зарецкая, Абрамов, 1986) 5 мл крови и исклю чает этап выделения В-клеток. В соответствии с ним для проведения цитотоксического теста ис пользуют суспензию лимфоцитов пери-ферической крови, в которой В-клетки метят, проводя с ними реакцию иммунофлюоресценции (т.е. присоединяя к ним антитела к иммуноглобулинам че ловека, коньюгированные с флюоресцеинизотиоцианатом, ФИТЦ.

Для выявления погибших в результате реакции цитолиза клеток используют флюоресцент ный краситель другого цвета - родамин или бромистый этидий. Реакцию учитывают с помощью инвертированного флюо-ресцентного микроскопа с определенной комбинацией фильтров, по зволяющего наблюдать одновременно зеленое свечение ФИТЦ и красное свечение родамина или бромистого этидия. Этот метод является более чувствительным и быстрым (из-за снижения количества этапов реакции) и более информативным, поскольку позволяет определять, с клетка ми каких субпопуляций вступают в реакцию типирующие аллоантисыворотки. Однако метод тре бует высококачественных реактивов и сложного оптического оборудования, а также повышенного внимания при учете результатов.

2.1.3. ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК Основой этой группы методов является изучение физиологически обусловленного изменения функционального состояния клеток при контактировании их с веществами, чужеродными клетками или корпускулярными частицами.

2.1.3.1. РЕАКЦИЯ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ (РБТЛ) Реакция бласттрансформации основана на феномене активации лимфоцитов под влиянием стимулов (митогенов или антигенов) с последующей трансформацией их в бласты (большие делящиеся клетки). Эта реакция определяет пролиферативный по тенциал изучаемых клеток.

Реакцию осуществляют следующим образом (Новиков, Новикова, 1979;

Jensen, Cristingen, 1981). К суспензии лимфоцитов или лейкоцитов крови (в последнее время чаще используют раз веденную в 10-20 раз цельную кровь) приливают раствор митогена или антигена в концентрации, нетоксичной для клеток, но способной вызывать бласттрансформацию. Инкубируют в среде СО при 370С. По окончании культивирования эритроциты (в тех случаях, когда для реакции исполь зуют цельную кровь) лизируют и подсчитывают количество клеток, трансформировавшихся в бласты. Подсчет можно вести визуально в окрашенных мазках, однако морфологический метод учета может давать субъективные ошибки. Поэтому чаще учет результатов ведут по изменению радиоактивности культуры клеток в результате включения радиоактивного изотопа в клетки, вхо дящие в митотический цикл (например, 3H-тимидина), используя для этого автоматический сцин тилляционный счетчик.

В качестве активаторов РБТЛ обычно используют фитогемагглютинин (ФГА), конканавалин А (Кон А), митоген лаконоса (МЛ), бактериальные липополисахариды (ЛПС), ферменты, стафило кокковый экстракт и др. ФГА и Кон А стимулируют преимущественно Т-лимфоциты, поэтому до появления тестов розеткообразовання бласттрансформацию с этими митогенами использовали для количественной оценки популяции Т-клеток. Липополисахариды (например, Е. coli, сальмо нелл и др.), антитела к иммуноглобулинам, очищенный белковый дериват туберкулина, декстра ны стимулируют бласттрансформацию преимущественно В-клеток. Митоген лаконоса стимулиру ет клетки обоих типов.

Таким образом, подбирая митогены, можно изучать функциональную активность отдельных субпопуляций лимфоцитов;

подбирая оптимальные условия проведения реакции, можно в прин ципе давать количественную оценку содержания Т- и В-лимфоцитов в общей популяции. Однако реально такие условия подобрать весьма сложно, поскольку поведение плеток в многокомпо нентной среде может быть неоднозначным. Так, в определенных условиях под действием ФГА могут трансформироваться в бласты В-клетки: надосадочная жидкость Т-клеточных культур вы зывает бласттрансформацию В-лимфоцитов.

Для оптимального протекания РБТЛ необходимо присутствие макрофагов, поэтому исполь зовать высокоочищенные лимфоциты не рекомендуется. Постановка реакции и культивирование должны осуществляться в стерильных условиях. Поскольку оптимальные дозы антигенов и мито генов и время инкубации для каждого случая индивидуальны, то рекомендуется применять не сколько доз стимуляторов (обычно, помимо оптимальной дозы, более низкую н более высокую) и разное время культивирования (Лебедев и др., 1976;

Zieger et al., 1974), а на основании получен ных данных строить кривые доза-эффект и время-эффект.

К трансформации лимфоцитов в бласты может приводить также совместное культивирова ние клеток двух разных доноров (культивирование в смешанной культуре лимфоцитов, СКЛ). Для оценки результатов трансформации тестируемых клеток у стимулирующих клеток блокируют син тез ДНК (обработкой митомицином С или облучением) (Методы исследований в иммунологии, 1981). Уровень ответа в СКЛ зависит от генетических различий между индивидами, поэтому СКЛ широко используется для подбора оптимальных пар при трансплантации органов и тканей. Ис пользование РБТЛ в клинике для количественной оценки субпопуляций лимфоцитов в настоящее время в значительной степени утратило свое значение в связи с появлением более простых ме тодов (розеткообразования и мембранной иммунофлюоресценции с мечеными моноклональными антителами). Однако достаточно большим остается значение бласттрансформации для опреле ления физиологической активности (пролифера-тивного потенциала) клеток как на неспецифиче ские активаторы (митогены), так и на специфические (антигены простейших, грибов, бактерий, вирусов, тканей организма), хотя и в этом случае велика роль неспецифического воздействия ан тигенов. Результаты неспецифической и специфической РБТЛ взаимно дополняют друг друга, поэтому рекомендуют ставить реакцию с набором тест- антигенов и митогенов. СКЛ имеет важ ное значение для трансплантационной иммунологии, подбора донора и реципиента (хотя при этом не следует забывать, что уровень ответа зависит не только от аллоантигенных различий лимфоцитов, но и от общей способности к стимуляции тестируемых клеток). Определенную важ ность представляет применение СКЛ и стимуляции МЛ для оценки глобулинопродукции стимули рованных В-лимфоцитов in vitro.

Метод РБТЛ достаточно распространен в лабораториях клиник медицинских институтов, причем используется в многочисленных модификациях. Различие результатов, получаемых при использовании различных модификаций, затрудняет четкую их трактовку в клинике. Широкому распространению этого метода в практике препятствует необходимость стерильной работы и от сутствие стандартизированной технологии.

2.1.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Продукция иммуноглобулинов является одной из наиболее важных функций В лимфоци-тов. Это заставляет нас в данной главе, посвященной определению функцио нальной актив-ности клеток, остановиться на основных методах определения содержа ния иммуноглобулинов.

Принцип определения содержания иммуноглобулинов основан на взаимодействии их с антителами, полученными против них (т.е. на реакции антиген-антитело, где в роли ан тигена выступают определяемые иммуноглобулины).

Методы иммунодиффузии в геле. Метод радиальной иммунодиффузии был предложен Манчини (Manchini и др., 1964) и получил наиболее широкое из всех методов распространение в клинике благодаря простоте и надежности. Суть его состоит в следующем. На гладкую поверх ность равномерно наносят гель агара или агарозы, содержащий антитела к иммуноглобулинам определяемого класса. В затвердевшем геле вырезают лунки, которые заполняют исследуемой биологической жидкостью. Молекулы антигена радиально диффундируют из лунки и, встретив шись с антителами, образуют кольцо преципитации. Площадь образующегося преципитата прямо пропорциональна концентрации иммуноглобулинов в исследуемой жидкости. Для завершения диффузии lgA и lgG требуется обычно 2 сут, lgM - 5-7 сут. Поэтому реакцию преципитации прово дят обычно в модификации Fahey (Fahey, 1965), не доводя реакцию до конца и считывая резуль таты для lgA и lgG через сутки, lgM - через 2 сут., поскольку было доказано, что в этом случае, так же как при линейной иммунодиффузии, между диаметром кольца преципитата и логарифмом концентрации антигена имеется линейная зависимость. Эта модификация менее точна, однако ее точность, как правило, удовлетворяет запросы клиники. Учет реакции ведут обычно без окра шивания преципитатов. Слабые преципитаты становятся лучше различимы после обработки та нином или раствором уксусной кислоты. Иногда преципитаты окрашивают красками для белков (амидочерным, кумасси синим, бромфенолом синим и др.), предварительно удалив все белки, не принявшие участия в образовании преципитата, промывкой гипертоническим раствором NaCI.

В настоящее время рядом зарубежных фирм производятся коммерческие герметично закры тые готовые системы для определения содержания иммуноглобулинов методом радиальной им мунодиффузии, что очень важно для широкого практического использования метода, поскольку применение готовых систем стандартизирует метод и упрощает проведение анализа.

Метод линейной иммунодиффузии состоит в том (Оudin, 1971), что агаровый или агарозный гель, содержащий антисыворотку, заключают в тонкую трубочку или пробирку. Трубочку верти кально погружают в исследуемую биологическую жидкость (или в случае использования пробирки жидкость наслаивают на столбик геля), инкубируют двое суток. Антигены диффундируют в гель со скоростью, пропорциональной их концентрации, и в результате взаимодействия с антителами образуют преципитаты. Концентрацию антигенов в исследуемой жидкости определяют по калиб ровочной кривой в соответствии с длиной преципитата.

Хотя этот метод был предложен Уденом в 1946 г., он не нашел широкого применения в связи с низкой точностью результатов, на которые сильно влияют температура, малейшие отклонения трубочки от вертикального положения и другие причины. Недавно (Лебедев и др., 1987, Петров и др., 1987) была разработана новая модификация этого метода, позволившая устранить указан ный недостаток. Согласно этой модификации, гель с антисывороткой заключают в капилляры, которые для проведения реакции погружают в исследуемую биологическую жидкость и инкуби руют в горизонтальном положении при 370 С в течение 1-1,5 сут. Для осуществления этой моди фикации А.А.Тотоляном и К.А. Лебедевым (1987) разработана стандартная система "Иммуно кап", представляющая собой трехканальный капилляр длиной 3 см, каждый канал которого за полнен агарозным гелем с антисывороткой соответственно для lgA, lgG и lgM, подкрашенным для удобства в разные цвета. Капилляры консервируются в герметично закрытых пробирках. Пре имущества этой системы в сравнении с коммерческими системами, основанными на ра диальной иммунодиффузии, состоят в экономии реактивов и материалов, возможности длитель ного хранения без потери свойств (в связи с минимальной поверхностью испарения и снижением температуры хранения благодаря использованию антифриза) и в простоте использования.

Методы иммунодиффузии довольно чувствительны (видимые преципитаты образуются при концентрации белка свыше 5 мг/л), их ошибка составляет не более 10%. Основным недостатком этих методов является длительное время анализа (1-2 сут). Сократить это время до 3-18 ч по зволяет использование электрического поля - метод иммуноэлектрофореза в геле, в частности ракетного иммуноэлектрофореза (Иммунологичеекие методы, 1987;

Saurell, 1966).

Суть метода состоит в том, что гель агарозы, содержащий моноспецифическую антисыворот ку, равномерно распределяют по гладкой поверхности. Вырезанные лунки заполняют исследуе мой жидкостью. В электрическом поле молекулы антигена мигрируют в гель и, взаимодействуя с антителами, образуют преципитаты, вытянутые в сторону анода. Длина полосы такого преципи тата в стандартных условиях пропорциональна концентрации антигена в исследуемой жидкости.

Точность электроиммунного анализа не отличается от точности иммунодиффузии. Однако суще ственное увеличение скорости получения результата, достигаемое данным методом, требует специальной аппаратуры и технических усложнений.

Метод лазерной нефелометрии. Суть этого метода состоит в том, что исследуемую биоло гическую жидкость, содержащую антиген, смешивают с моноспецифической антисывороткой. В результате инкубации образуются иммунные комплексы, способные рассеивать проходящий свет. Интенсивность рассеивания или поглощения света прямо пропорциональна количеству об разовавшихся компексов (Davies, 1971).

Данный метод обладает высокой точностью, он прост в исполнении и, самое главное, требу ет для анализа минимума времени. С широким внедрением в иммунологию лазерных нефело метров метод становится все более доступным для практики. Однако он требует использования высокоочищенных антисывороток, дающих прозрачные растворы, очистки исследуемых биологи ческих жидкостей от твердых частиц, на которых могут осаждаться иммунные комплексы, и четко отработанной технологии, - при выполнении всех этих требований метод целесообразно вне дрять а лабораториях крупных клинических больниц.

Радиоиммунологический метод. Этот метод развивается с 1960 г., основан на феномене конкуренции определяемого (немеченого) антигена с известным количеством меченого антигена (обычно антиген метят изотопами 131I, 125I, 3Н) за ограниченное количество специфических к анти гену антител, введенных в систему (Иммунологические методы, 1987;

Клиническая иммунология, 1986). Чем больше в исследуемой жидкости содержится определяемого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами и, следовательно, больше останется в растворе. Для определения соотношения связанного и свободного меченого антигена их необходимо разде лить. Разделение можно проводить методами копреципитации, адсорбции, электрофореза. Од нако наибольшее распространение получила твердофазная техника радиоиммунологического анализа, в которой антитела или антиген иммобиотзуются на сорбенте (полистирол, полиэтилен, полипропилен, акриламад, целлюлоза, сефадекс и др.), что существенно упрощает разделение свободного и связанного антигена.

Метод твердофазного радиоиммунного анализа осуществляют следующим образом. Вначале получают пробирки с адсорбированными антителами: для этого раствор антител инкубируют в пластиковых пробирках, после чего избыток антител удаляют промыванием. Для проведения анализа в обработанные таким образом пробирки заливают исследуемую жидкость, инкубируют, далее ее удаляют и вносят известное количество меченого антигена. После инкубации и отмывки определяют количество свяавшегося меченого антигена при помощи жидкостного сцинтилляци онного счетчика.

Часто используют неконкурентные методы анализа, суть которых состоит в том, что антигены (или антитела) известной специфичности связывают на сорбентах. В результате инкубации их с исследуемой пробой происходит связывание антител (или антигенов). Далее к ним добавляют меченые антитела и после инкубации по радиоактивности определяют количество связавшихся антител. К неконкурентным методам относится и метод двойных антител (сэндвич-метод), в ко тором используется свойство антигенов, связанных с иммобилизованными антителами, сохра нять способность участвовать в последующих реакциях.

Радиоиммунный анализ обычно используют для определения lgE, различных антител, гор монов, тиреоглобулина, компонентов комплемента и т.д.

Радиоиммунологические методы просты и надежны. Колебания в серии анализов не превы шают 10%. Несомненным их достоинством является высокая чувствительность (нанограммы ве ществ), которая повышается при использовании метода двойных антител. Однако использование радиоактивной метки (необходимость специальных средств защиты от облучения, необходи мость иметь сцинтилляционный счетчик) и повышенные требования к чистоте реактивов ограни чивают его использование лабораториями институтов и специализированных клиник.

Иммуноферментный метод. Иммуноферментный анализ, предложенный в начале 70-х го дов, основан на том же принципе, что радиоиммунный и люминесцентно-серологический, только в нем взамен радиоактивной или люминесцентной метки используют ферментную (пероксидаза, щелочная фосфотаза, глюкозооксидаза и др.) (Иммунологические методы, 1987;

Клиническая иммунология, 1986).

Количество меченых антигенов или антител, вступивших в реакцию, определяют на основа нии изменения окраски субстрата под влиянием этого фермента. Варианты осуществления им муноферментного анализа принципиально те же, что и радиоиммунологического. Прежде всего это гомогенный и гетерогенный вари-анты. Гомогенный иммуноферментный анализ, который ис пользуют для определения низомолекулярных веществ, основан на различии активности фер мента в зависимости от характера его связывания (например, подавление активности в результа те связывания с гаптеном и восстановление ее после реакции антиген-антитело). При гетероген ном иммуноферментном анализе антиген или антитело иммобилизуется на твердой фазе. В ка честве твердой фазы обычно используют пластик - лунки планшетов для иммунологических ре акций. Основные варианты техники гетерогенного иммуноферментного анализа (техники ELISA):

конкурентный тест с использованием меченых антигенов и антител и неконкурентные тесты, к ко торым относятся метод двойных антител (сэндвич- метод) и непрямой метод.

Сущность метода двойных антител состоит в следующем. Антитела фиксируют на твердой фазе, для чего инкубируют их в лунках планшета из полистирола с последующей отмывкой не связавшихся антител. Затем в лунки добавляют растворы анализируемого или стандартного ан тигена, инкубируют, отмывают. После отмывки в лунки приливают избыток меченных ферментом антител (эти антитела должны принадлежать к животному другого вида, чем иммобилизованные), несвязавшиеся антитела удаляют отмыванием. На последнем этапе анализа в лунки добавляют субстрат, который под влиянием фермента превращается в окрашенный продукт реакции. Коли чество этого продукта (а значит, и интенсивность окраски) пропорци-онально количеству связав шихся с антигеном конъюгатов антитело - фермент. Степень окраски раствора измеряют фото метрически (используя специальные спектрофотометры, позволяющие измерять поглощение света в пробах, находящихся непосредственно в планшетах).

Для определения антител часто используют непрямой метод, смысл которого состоит в том, что в лунках иммобилизуют антиген, затем инкубируют его с пробой, содержащей исследуемые антитела, затем, после отмывки, обрабатывают конъюгатом антиглобулин-фермент, после чего добавляют субстрат и измеряют количество продукта реакции.

Иммуноферментный метод в основном соответствует радиоиммунологическому по чувстви тельности и возможностям использования. Вместе с тем он обладает рядом весьма существен ных преимуществ: коньюгаты белка с ферментами более стабильны, чем изотопная метка, по этому их можно хранить более длительное время;

использование ферментной метки исключает необходимость применения мер предосторожности, как при изотопной метке;

наконец, изменение окраски субстрата можно наблюдать не только фотометрически, но и визуально (полуколичест венный метод), т.е. не требуется дорогостоящих счетчиков радиоактивности. Создание коммер ческих автоматизированных систем для проведения иммуноферментного анализа и наборов вы сокоспецифических реагентов открыло широкие возможности его практического использования.

2.1.3.3. ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ Лимфоциты периферической крови способны разрушать in vitro клетки-мишени, как сенсибилизированные антителами, специфическими к этим клеткам, так и несенси билизиро- ванные чужеродные клетки. Это свойство лимфоцитов используют для оцен ки их киллерной активности. Принцип метода заключается в том, что лимфоциты (необ ходимо использовать суспензии очищенных лимфоцитов, поскольку моноциты и грану лоциты также вызывают лизис клеток-мишеней) инкубируют с клетками-мишенями, по сле чего определяют цитотоксическия эффект лимфоцитов по количеству оставшихся живыми клеток-мишеней морфологически или чаще по выбросу лизированными клет ками-мишенями радиоактивного изотопа Сг в культуральную среду. Обычно берут несколько проб с разными соотношениями лимфоцитов и клеток-мишеней. В зависимо сти от характера клеток-мишеней различают антителозависи-мую клеточно-опо средованную цитотоксическую реакцию лимфоцитов и естественную киллерную актив ность (Иммунологические методы, 1987).

Определение антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфо цитов. В качестве клеток-мишеней в данном тесте используют обычно эритроциты животных или другие клетки (например, клетки мастоцитомы мышей, резистентные к лизису моноцитами и гра нулоцитами), сенсибилизированные специфическими для них антителами, меченные 51Сг, путем инкубации с раствором Na 2 51 СrО4 или Nа2 51 Cr 2О 7. Лимфоциты инкубируют с клетками мишенями в течение 2-24 ч. В результате лизиса клеток-мишеней в среду выделяется радиоак тивный хром, количество которого пропорционально величине цитотоксичности лимфоцитов.

Определение активности естественных киллеров. В данном тесте в качестве клеток мишеней используют обычно опухолевые клетки, культивируемые in vitro (например, миелоидную линию К-562, линии Р-4788, M-Hela н др.) (Шпарик, Билынский, 1988), которые метят солями ра диоактивного изотопа 51Сr. Лимфоциты инкубируют с клетками-мишенями в течение 3-24 ч. Ак тивность естественных киллеров (нормальных киллеров, NK-клеток) оценивают по выделению в культуральную среду радиоактивного изотопа.

Данный метод обладает теми же недостатками, что и метод антителозависимой клеточно опосредованной цитотоксичности, поэтому пока широкое использование его в практике мало ре ально.Ориенти- ровочную количественную оценку естественных киллеров значительно проще можно осуществлять путем изучения морфолцогии клеток (большие гранулярные лимфоциты) или поверхностных маркеров с использованием моноклональных антител.

2.1.3.4. РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ (РТМЛ) РТМЛ основана на феномене подавления миграции лейкоцитов фактором, который выделяют сенсибилизированные лимфоциты при взаимодействии со специфическим антигеном (фактор, ингибирующий миграцию лейкоцитов, МИФ). Данный фактор не является ви доспеци- фичным, поэтому для его выявления можно использовать макрофаги животных (на пример, морских свинок).

Наиболее распространенный в клинической иммунологии капиллярный вариант РТМЛ (Нови ков и др., 1976) состоит в следующем. Капилляры плотно заполняют лейкоцитами крови, вводя в них суспензию клеток последующим центрифугированием и отламыванием конца, не содержащего осадка клеток. Ан тигены (бактерий, вирусов, грибов, тканей и др.) добавляют или к суспензии лейкоцитов, или в среду ин кубационных камер. Капилляры помещают в камеры, содержащие среду 199, и инкубируют при 370 С в течение 18-24 ч. За это время лейкоциты мигрируют из капилляра, образуя визуально обнаружимую зону помутнения, "облако". Площадь этой зоны измеряют, проецируя на бумагу. Вычисляют индекс подавления миграции клеток антигеном в сравнении со спонтанной (без антигена) миграцией.

Данный метод позволяет вне организма, не ставя кожных проб, определять сенсибилизацию лимфоцитов человека к различным антигенам и аллергенам. Однако технически метод сложен, требует стерильной работы и относительно большого количества клеток, из-за чего необходимо брать кровь из вены. Получаемые результаты часто нестабильны вследствие нестандартности многих процедур.

2.1.3.5. ФАГОЦИТОЗ Тест фагоцитоза широко используют для оценки функциональной активности ней трофилов периферической крови. В качестве объектов фагоцитоза используют живые или убитые клетки микроорганизмов (микробные, дрожжевые клетки), ядросодержащие эритроциты птиц, формалинизированные эритроциты животных, различные твердые частицы - полистирола, латекса, угля, крахмала и др. (Лебедев и др., 1980;

Земсков, 1984;

Иммунологические методы, 1987;

Levinsky et al., 1978;

Nikola, 1980;

Dunn, 1981).

Использование культур живых клеток микроорганизмов позволяет оценивать не только фагоцитарную, но и киллерную способность фагоцитов.

Наиболее распространенная схема постановки реакции фагоцитоза состоит в том, что лей коциты, выделенные из периферической крови, смешивают с суспензией частиц, используемых для фагоцитоза, и инкубируют (часто при перемешивании) при 37° в течение 30-60 мин. Затем в фиксированных и окрашенных мазках просчитывают фагоцитарный индекс (% фагоцитирующих клеток) и фагоцитарное число (среднее количество поглощенных частиц на один фагоцит). Ско рость фагоцитоза резко увеличивается в результате осаждения смеси клеток и фагоцитирусмых частиц центрифугированием: в этом случае для завершения реакции достаточно 5 мин (Петров и др., 1983). Хотя осуществление реакции фагоцитоза чрезвычайно просто, имеются проблемы, связанные со стабилизацией реакции, поскольку акт фагоцитоза является результатом взаимо действия множества факторов (состояния лейкоцитов и объектов фагоцитоза, малейших измене ний состава среды реакции, температуры, количества остаточного белка после выделения кле ток, состояния посуды, в которой проводится реакция, и т.д.). Поэтому при постановке реакции необходимо соблюдать предельную точность. При подсчете результатов в тех случаях, когда размер фагоцитируемой частицы составляет менее 1 мкм, возможны затруднения в определении ее локализации: находится она внутри лейкоцита или на его поверхности. Во избежание больших ошибок просчета в этом случае следует использовать иммерсионное увеличение (объектив Х90) либо удалять частицы с поверхности клеток путем обработки их ферментами (например, трипси ном). При использовании более крупных частиц (например, клеток дрожжей или эритроцитов) по добных затруднений не возникает. Широкое внедрение реакции фагоцитоза в практику клиниче ской иммунологии зависит в значительной степени от создания стабильных и стандартных час тиц для фагоцитоза.

2.1.3.6. ТЕСТ ВОССТАНОВЛЕНИЯ НИТРОСИНЕГО ТЕТРАЗОЛИЯ ( НСТ-ТЕСТ ) Данный тест характеризует окислительно-восстановительный потенциал нейтро филов, являющийся одним из важных показателей их фагоцитарной активности. НСТ тест основан на пиноцитозе нейтрофилами раствора нитросинего тетразолия (НСТ) и накоплении его в фагоцитарных вакуолях с последующим восстановлением и превра щением растворимого бесцветно- го НСТ в нерастворимый темно-синий формазан, который легко идентифицировать в ейтрофилах визуально.

Постановку метода осуществляют обычно в цельной крови (Нагоев, Шубич, 1981).

Каплю крови смешивают на предметном стекле с раствором нитросинего тетразолия, инкубируют при 37°С 30 мин. Затем в предварительно окрашенном мазке просчиты вают количество нейтрофилов, содержащих гранулы формазана.

Технически метод достаточно прост, однако требует использования высокоочи щенного свежего хорошо растворимого нитросинего тетразолия. Hepacтворимый НСТ, выпавший в осадок, для реакции полностью не годится, поскольку в этом случае на блюдается обычный фагоцитоз частиц.

2.1.4. НАГРУЗОЧНЫЕ ТЕСТЫ Имеются два основных типа тестов, применяющихся для оценки популяций и суб популяций иммунокомпетентных клеток: определение поверхностных маркеров на клетках и определение функциональной активности клеток, присущей той или иной субпопуляции. Вместе с тем и экспрессия поверхностных маркеров, и функциональная активность, по сути, отражают физиологическую активность клетки, т.е. состояние клет ки, определяемое ее возрастом, окружением, ретроспективным функционированием и другими причинами, которое обуслов-ливает эффективность выполнения клеткой свойственной ей функции при наличии соответствующей потребности всей системы.

Методы определения поверхностных маркеров позволяют, в сущности, оценивать не только фенотип клетки, но н ее физиологическую активность. Физиологическая активность клетки (ее поверхностный рецепторный и антигенный состав и степень функциональной активности) обу словлена, с одной стороны, этапом дифференцировки клетки, с другой - ее активацией, которая зависит от потребностей всей системы, в которой клетка существует, т.е. ее окружения.

Выявление поверхностных рецепторов или антигенов при помощи различных реакций сильно зависит от состава среды, в которой проводится реакция (рН, наличие ионов Са 2+ и Mg 2+, поли катионов и полианионов и др.) (Bach, 1973;

Steel et al., 1974).

Различные воздействия на клетки могут существенно изменять обнаружение рецепторов.

Так, инкубация клеток с аутологичной или эмбриональной телячьей сывороткой, метогенами, нейраминидазой существенно увеличивает розеткообразование клеток с эритроцитами барана, мыши, человека, различных животных (Steel et al., 1974;

You, 1975). Преинкубация клеток с сыво роткой, нейраминидазой, трипсином, а также гипотонический шок дистиллированной водой при водят к существенному увеличению обнаружения клеток с Fс-рецепторами, по-видимому, из-за снятия блокирующих их веществ (Haegert, 1977;

Moretta et al., 1977). Инкубация клеток с различ ными веществами приводила и к изменению количества моноклональных антител, присоединяе мых к клеткам (Лебедев и др., 1987;

Joffe et al., 1983). Все это свидетельствует о вариабельности экспрессии поверхностных маркеров клеток в зависимости от их физиологического состояния.

Следует отметить, что поверхностные рецепторы на клетках неравноценны, они существен но различаются по авидности. Поэтому их выявление сильно зависит от качества используемых индикаторных частиц и чувствительности используемого метода. Так, обработка эритроцитов ба рана нейраминидазой, папаином, бромидом 2-аминоэтилизотиомочевины, а эритроцитов мыши - нейраминидазой или проназой существенно повышает розеткообразование (You, 1975;

Potter, Мооге, 1978). Использование методов непрямого иммуноглобулинового розеткообразования или непрямой иммунофлюоресценции в отличие от прямых модификаций тестов позволяет выявлять поверхностные иммуноглобулины не только на В-клетках, но и на нулевых и даже Т-лимфоцитах (Лебедев, Рыжова, 1969;

Haegert, Coombs, 1976).

Итак, выявление на поверхности клеток рецепторов или антигенов зависит от многих причин, в частности, от чувствительности метода, состава среды реакции, исходного состояния клеток, с которыми проводится реакция. Оптимизация условий проведения реакций и активация клеток по зволяют существенно увеличить обнаружение на клетках тех или иных маркеров. Следователь но, рецепторы и антигены распреде-лены на клетках крайне неравномерно и их выявление в большой степени является не качественной характеристикой клетки (есть - нет), а количествен ной (больше - меньше).

Каждый исполыуемый метод выявляет рецепторы или антигены в том случае, если их коли чество выше определенного порога, составляющего предел чувствительности данного метода, и факт их невыявления вовсе не говорит о том, что их нет вообще. Кроме того, часть рецепторов или антигенных детерминант могут быть блокированы, у части активные центры могут быть скрыты, и обнаружить подобные маркеры возможно лишь при определенных изменениях условий постановки реакций или определенным воздействием на клетки, приводящим к их активизации.

Клетки, выделенные из организма, имеют вполне определенную физиологическую активность, которая зависит от множества факторов (клеточное и гуморальное окруже ние, возраст, биологические ритмы, гормональный цикл, уровень стресса, наличие ин фекционных, регенеративных и других процессов и т.д.), а в целом отражает общее со стояние организма. Определение иммунологических показателей (как поверхностных маркеров, так и показателей функциональной активности) связано с приведением кле ток в контакт с химическими веществами (обычно природного происхождения) или час тицами при определенных условиях, т.е. с определенным воздействием (нагрузкой) на клетки. Получаемый при этом результат зависит не только от физиологической актив ности клеток, но и от условий постановки метода, а по сути от дозы и качества нагрузки.

Условия постановки метода можно подобрать таким образом, чтобы он выявлял пре имущественно те или иные популяции или субпопуляции ИКК либо клетки, обладающие в данной популяции определенным уровнем функциональной актив-ности. Это по зволяет у разных людей констатировать снижение или повышение количества клеток указанных типов. Однако для оценки физиологической активности клеток этого недос таточно, поскольку, как было сказано выше, результат теста сильно зависит от условий его постановки. Очевидно, исходную физиологическую активность клеток можно оце нить, осуществляя несколько поста- новок теста (несколько измерений) в разных условиях.

В процессе развития методов клинической иммунологии определилась важность осуществления клеточных методов в нескольких вариантах их постановки. Эти методы по аналогии с клиническими были названы "нагрузочными тестами" (Понякина, 1984;

Лебедев и др., 1987). В широком смысле под нагрузочными тестами понимаются такие, которые ставятся в несколь-ких разных вариантах (при разной нагрузке на клетки) с це лью сравнения полученных результатов. Это позволяет оценить физиологическую ак тивность клеток.

Мы выделили понятие нагрузочных тестов для того, чтобы помочь читателю четко осознать их важность и осознанно применять в научной и практической работе. Обычно в иммунологической литературе эти тесты не выделяются, хотя являются основой по лучения полезных результатов одними методами и часто исполыуются при осуществ лении других методов.

Тесты, основанные на изменении одного или нескольких параметров. Эти тесты вхо дят в основу постановки реакций бласттрансформациии и определения цитотоксической актив ности, они часто используются в розеткообразовании.

При постановке реакции бласттрансформации используют обычно разные (2-5 доз) концен трации митогенов или антигенов либо разное время культивирования клеток. Это дает возмож ность не только оценивать возможности вступления клеток в пролиферацию, но и определять ак тивность клеток в реакции.

Определение цитотоксической активности лимфоцитов проводят также, как правило, при различном соотношении клеток-эффекторов и клеток-мишеней (обычно в 3-6 разных соотноше ниях). Это дает возможность, с одной стороны, выявить максимальный уровень цитотоксичности, с другой - дополнительно получить характеристику физиологической активности клеток.

При определении количества розеткообразующих клеток часто не ограничиваются постанов кой теста в оптимальных условиях, наиболее полно выявляющих субпопуляции. Дополнительно определяют еще "активные" розетки (образуются при четко определенном соотношении коли честв эритроцитов и лимфоцитов, которое в несколько раз ниже, чем достаточно доя насыщения реакции, и без инкубации после центрифугирования) (You, 1975: Semenzato et al., 1981), высоко аффинные розетки (получают при соотношении количеств эритроцитов и лимфоцитов, равном 25, и инкубации реакционной смеси при 290С ) (West et al., 1978), стабильные (образуются при 370С ), а иногда - гравитационные (образуются при спонтанной седиментации клеток, т.е. без центрифугирования, в течение 1 ч) (Наn et аl., 1979). Постановка таких дополнительных тестов дает возможность оценки физиологической активности клеток, однако весьма трудоемка (напри мер, определение активных и высокоаффинных розеток требует подбора четкого соотношения клеток и индикаторных частиц).

Использование клеточных тестов в качестве модели для испытания сыворотки крови и других гуморальных факторов. Наиболее простые клеточные тесты используют в качестве моделей для изучения свойств (стимулирующих, супрессирующих, опсонизирующих) сыворотки крови, различных секретов, а также их отдельных факторов. В качестве таких моделей наиболее часто используют методы розеткообразования (Bach, 1973) и фагоцитоза, преимущественно с крупными частицами, такими, как дрожжевые клетки и эритроциты (Лебедев и др., 1980;

Levinsky et al., 1978).

При постановке таких тестов обычно используют клетки, выделенные из крови здоровых до норов, на которые перед постановкой реакции или в процессе ее действуют изучаемыми сыво ротками. По направленности изменения показателя розеткообразования или фагоцитоза (в срав нении с контролем) констатируют наличие стимулирующей или супрессивной активности, изуча ют опсонизирующую активность (в случае фагоцитоза). При использовании этих тестов следует помнить, что конечный результат, в частности направление изменений в сравнении с контролем, зависит не только от свойств и концентрации сыворотки, но и от исходного физиологического со стояния клеток, поэтому для получения объективных данных такие тесты нужно проводить с од ной партией клеток и индикаторных частиц, которые должны храниться, например, в заморожен ном состоянии. Эти тесты просты и доступны, поэтому пригодны для широкого использования в практике.

Определение чувствительности клеток к антигенам. Эти тесты получили весьма широ кое распространение в клинической иммунологии. Наиболее часто чувствительность клеток к ан тигенам оценивают по изменению их активности в тестах розеткообразования и реакции тормо жения миграции лейкоцитов. Тесты ставят как с микробными, так и с тканевыми антигенами.

Обычно от этих тестов (по аналогии с кожными пробами) ждут помощи в диагностике забо леваний, поскольку снижение или повышение активности клеток в реакциях после воздействия на них антигенами обычно расценивают как наличие сенсибилизации к ним клеток. Однако на самом деле все значительно сложнее, поскольку физиологическая активность клеток в отношении анти генов зависит от слишком многих причин, в том числе от общего состояния организма, стадии и фазы заболевания и т.д. Огромное значение для этих тестов имеет степень очистки и подбор до зы антигена. Однако, несмотря на указанные трудности, эти тесты при правильном их использо вании и трактовке могут принести в клинике определенную пользу.

Тесты роветкообразования с антигенами осуществляют следующим образом (Лебедев и др., 1981;

Offner et al., 1980;

Ramey et al., 1980). Выделенные клетки инкубируют с антигенами (обыч но в пределах одного часа;

антиген берут в двух-трех разведениях), после чего ставят с ними ре акцию розеткообразования, наиболее часто с эритроцитами барана. Параллельно проводят кон трольный опыт без антигена, с которым сравнивают полученный результат.

РТМЛ используют главным образом для определения чувствительности клеток к антигенам и аллергенам. Индекс подавления (а зачастую и стимуляции) миграции клеток антигеном или ал лергеном вычисляют в сравнении с контролем.

Нагрузочные тесты с лекарственными и другими веществами. Выше мы рассмотрели наиболее распространенные иммунологические тесты, которые при условии проведения их в до полнительных вариантах в измененном режиме или в присутствии дополнительных компонентов можно считать нагрузочными. Наиболее четко использование нагрузки отражает следующая схе ма постановки нагрузочного теста:

дозированное Клетки после тестирование Клетки нагрузки Результат воздействие в реакции По сути, нагрузочные тесты предполагают получение и анализ не одного показателя, а обя зательно комплекса показателей (не менее двух: при нулевом и каком-либо определенном, дози рованном воздействии). В качестве такого дозированного воздействия обычно применяют инкубацию кле ток в течение определенного времени с определенными количествами препаратов или без них.

При этом используют небольшие, физиологические дозы препаратов или других воздействий, по скольку большие дозы могут быть для клеток токсичными, что приведет к получению неадекват ных результатов.

По указанной схеме можно ставить нагрузочные тесты розеткообразования, иммунофлюо ресценции, фагоцитоза, НСТ, РБТЛ и др. Наиболее часто подобные тесты ставят с лекарствен ными препаратами, в частности иммунокорригирующими (левамизол, диуцифон, препараты ти муса и др.), для того чтобы, определив действие препарата на клетки, прогнозировать эффектив ность его применения при лечении (Лебедев и др., 1980;

Успенский, Ващенков, 1984). Однако во просы прогнозирования не столь просты, как казалось авторам первых работ, поскольку реакция клеток на препарат в целостном организме и вне его неравнозначна. Выяснению же вопроса о том, какая именно реакция клеток на препарат соответствует желаемому эффекту, должна пред шествовать большая исследовательская работа (Петрухин и др., 1986). Вместе с тем уже сегодня ясно, сколь большой вклад могут внести нагрузочные тесты в оценку иммунного статуса человека (Лебедев и др., 1987), требуя при этом лишь минимальных дополнительных затрат.

В розеткообразовании, например, наиболее часто используются следующие нагрузочные тесты:

1) инкубация клеток при 370С в течение 0,5-2 ч;

2) инкубация клеток в течение того же времени с растворами различных препаратов в концентрациях, близких к физиологическим, например с левамизалом, теофиллином, Т-активином, другими иммунокорригирующими препаратами;

3) инкубация клеток с различными дозами этих же препаратов. Практическое значение этих тестов будет показано ниже. Отметим лишь, что нагрузочный тест с теофиллином приобрел особую по пулярность как наиболее простой способ оценки функциональных субпопуляций лимфоцитов, по скольку инкубация с этим препаратом приводит к подавлению розеткообразования преимущест венно клеток, обладающих супрессорной активностью, мало влияя на клетки с хелперной актив ностью (Ярилин, 1985, Limatibul et al., 1978).

2.1.5. ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В КЛИНИКЕ В предыдущих разделах мы кратко остановились на иммунологических методах анализа клеток крови лишь в тех рамках, в каких это необходимо для общего понима ния методической основы клинической иммунологии. И при общем знакомстве с мето дами, и при освоении их, а также при повседневной работе с ними у исследователя и практика неизбежно возникают вопросы, разрешение которых очень важно для успеха всей работы.

Вопрос 1. Что можно и чего нельзя ожидать от иммунологических методов анали за крови?

Сначала напомним, что сам объект исследования имеет определенные особенно сти. Находясь в крови, ИКК, как правило, не выполняют свойственных им иммунологи ческих эффекторных функций: они пребывают там обычно весьма короткое время, не обходимое для тран- спортировки в органы, ткани и очаг воспаления. В каждый период времени в крови на ходится лишь очень небольшое количество ИКК организма (например, менее 0,5% всех имею щихся в организме лимфоцитов (Иммунологические методы, 1987). Поэтому анализ ИКК крови может дать представление лишь об общем физиологическом состоянии им мунной системы в данный момент времени, а не о прямом их функционировании. В организме ИКК существуют и функционируют не как разобщенные самостоятельные по пуляции, а как сбалансированное единое целое - иммунная система.

Тесное взаимодействие компонентов иммунной системы происходит на всех этапах их суще ствования: на уровне формирования клеток, их активации, выполнения эффекторной функции и т.д. И хотя в теоретическом разделе мы пытались как можно более четко охарактеризовать от дельные популяции и субпопуляции ИКК, определенные элементы их сопряженности, необходи мо еще раз подчеркнуть, что сегодня мы знаем лишь очень небольшое количество механизмов функционирования элементов иммунной системы как в отдельности, так и в их целостности, и тем более многие из них неясны в своем количественном проявлении. Даже такие, казалось бы, ясные механизмы, как выполнение Т-лимфоцитами супрессорной и хелперной функций, не яв ляются однозначными: различие в количестве носителей той или иной функции может приводить к появлению противоположного эффекта. Более того, поскольку указанными регуляторными функциями могут обладать не только Т-лимфоциты, но и другие клетки, например В-лимфоциты и макрофаги, ясно, что в целостном организме они действуют в комплексе, суммируясь в опреде ленный конечный эффект. Сделать вывод о характере этого конечного эффекта по данным о не которых известных элементах, входящих в эту сумму, практически невозможно из-за огромной сложности системных взаимодействий.

На все разнообразие неспецифических системных взаимоотношений компонентов в организ ме накладывается элемент специфики, который зависит от количества и качества антигенной на грузки. Этот элемент также может принципиально изменять активность клеток, примером чего является специфическая опсонизация, сильно влияющая на фагоцитоз.

В целом конечный эффект той или иной функции ИКК зависит от системных взаимодействий специфических и неспецифических компонентов.

Оценить системные механизмы на основании изучения отдельных параметров очень сложно, а сегодня практически невозможно. Однако для практики важно знать, что каждый иммунный показатель благодаря системным взаимодействиям несет в себе информацию об интегральном воздействии на него как клеточных и гуморальных фак торов самого организма, так и чужеродного, поэтому его определение вполне может служить для оценки общей иммунологической реакции организма (и крайне редко, в ос новном в случае полного отсутствия компонента, - о наличии иммунодефицита).

Наконец, для иммунологического анализа мы используем клетки, выделенные из организма, т.е. помещенные принципиально в иные условия существования. Поэтому, анализируя клетку любым методом, мы определяем физиологическое состояние выде ленной клетки, которое, возможно, имеет весьма мало общего с ее реальной физиоло гической активностью в организме. Однако для практических целей знать истинную ак тивность клетки в организме не столь важно, если она так или иначе отражается в со стоянии выделенных клеток : для решения многих задач вполне достаточно иметь по добные косвенные данные.

Вопрос 2. Какие методические приемы и методы предпочесть для адекватной оценки иммунологических показателей?

Перед исследователем, разрабатывающим метод, всегда стоит проблема, до какой степени очищать тестируемые клетки. На первый взгляд может показаться, что это де ло вкуса методиста, однако на самом деле этот вопрос является принципиальным. Для того чтобы на него ответить, вспомним, что для интерпретации получаемых данных важно то, что каждый компонент, функционируя в целостной системе организма, несет в себе информацию об интегральном воздействии на него компонентов этой системы.

По мере углубления очистки клеток эта информация уменьшается и ее заменяет дру гая, связанная с особенностью используемых методов и длительностью обработки.

Из этого следует, что настоятельные предложения и попытки некоторых исследователей ис пользовать в лабораторных реакциях "чистые" популяции ИКК неправомерны по следующим при чинам.

Во-первых, каждая добавочная манипуляция по очистке клеток связана с созданием допол нительных нефизиологических условий и увеличением длительности процесса, что с каждым этапом все более изменяет физиологическое состояние выделенных клеток по сравнению с их состоянием в орга низме.

Во-вторых, многие функциональные тесты в суспензиях высокоочищенных клеток практиче ски не идут, что заставляет вводить в них клетки других популяций в произвольных количествах и таким образом создавать искусственную ситуацию, еще более отдаляясь от системы целостного организма. Например, реакция бласттрансформации Т-лимфоцитов в отсутствие макрофагов почти не идет. Поэтому на практике лимфоциты выделяют для этой реакции так, чтобы остава лось небольшое количество макрофагов, и таким образом создают искусственно для клеток но вую систему. Проведение этой реакции в суспензии лейкоцитов цельной крови существенно при близит условия реакции к реальным условиям в организме.

Втретьих, высокая степень очистки может заставить клетки вести себя совершенно нехарак терным образом по сравнению с их поведением в целостном организме. Так, например, облуче ние животных приводило к резкому подавлению фагоцитарной функции в организме (Фриден штейн, 1958), в то время как очищенные фагоциты в высокой степени радиорезистентны (Чахава, 1972).

Таким образом, высокая степень очистки ИКК слишком далеко уводит от реальной ситуации в организме.

Из этого следует, что для проведения иммунологических реакций необходимо для клеток избирать условия, наиболее близкие к реальным, имеющимся в организме. В частности, при невозможности использования цельной крови лучше применять суспен зию суммарных лейкоцитов, выделенных из цельной крови. Не случайно в настоящее время все более широкое распространение получают именно эти методы (для поста новки РБТЛ, НСТ-теста, метода иммунофлюоресценции с моноклональными антитела ми используют цельную кровь, для поста-новки РТМЛ и розеткообразования использу ют суспензию нефракционированных лейкочитов цельной крови и т.д.).

Как указывалось выше, большинство иммунологических реакций позвяляет оцени вать физиологическую активность клеток лишь при определении комплекта показате лей в нагрузочных тестах. Для определения адекватной реакции клеток выбираемые нагрузки должны быть физиологическими.

Критерием физиологичности нагрузки может быть разнонаправленное ее действие на клетки разных образцов крови, поскольку постоянное однонаправленное действие, например подавле ние, может свидетельствовать о токсичности используемого вещества или неблагоприятности режима постановки теста. Даже в РТМЛ антигены при правильном подборе их концентрации могут не только тормо зить, но и стимулировать миграцию, и это неудивительно, поскольку феномен миграции лейкоци тов обусловлен выделением лимфоцитами фактора торможения миграции лейкоцитов, а направ ленность действия этого фактора (тормозящее или стимулирующее) зависит от его концентрации и ряда других причин, например уровня физиологической активности нейтрофилов, причем дей ствие всех этих причин является комплексным.

Все клеточные иммунологические методы основаны на определении тех или иных фи зиологических характеристик клеток, которые позволяют относить клетки к определен ным субпопуляциям или определять их функциональную активность. Поскольку актив ность самих клет- ок постоянно меняется (как в организме, так и вне его), то все методы позволяют оце нивать субпопуляции лишь с тем или иным физиологически обусловленным уровнем точности.

Рассмотрим конкретный вопрос: какой метод анализа Т-супрессоров и Т-хелперов лучше применять в клинике - иммунофлюоресцентный с использованием моноклональных антител (для обнаружения клеток с дифференцировочными антигенами CD 4 и CD 8), розеткообразования для определения клеток с Fcµ и Fc y -рецепторами или же нагрузочный тест розеткообразования с теофиллином.

Заметим сразу, что первые два метода, особенно первый, более точно выявляют клетки с указанными маркерами, в то время как тест с теофиллином позволяет лишь косвенно судить о них по изменению физиологической активности клеток после инкубации с препаратом. В ряде ра бот показано, что данные, получаемые с помощью каждого из указанных методов, в той или иной степени коррелируют между собой (Ярилин, 1985;

Петров и др., 1986;

Limatibul et al., 1978;

Mingari, Moretta, 1982). В то же время, как было показано выше, ни один из указанных тестов не дает возможности выявить истинное количество хелперов и супрессоров в крови (Лебедев, Поня кина, 1985;

Mingari, Moretta, 1982). Более того, даже если бы мы смогли определить истинное со держание в крови клеток рогуляторных субпопуляций, оно ничего не скажет нам о действитель ном хелперном или супрессорном эффекте в организме, ибо, с одной стороны, их функциональ ная активность крайне гетерогенна, с другой - эффект складывается из системных взаимоотно шений регуляторных субпопуляций не только Т-лимфоцитов, но и В-клеток и макрофагов, сы вороточных регуляторных компонентов и множества других факторов.

Таким образом, для анализа субпопуляций можно использовать любой из указанных методов, нужно только правильно трактовать его результаты, учитывая точность мето да и физиологические характеристики клеток, определяемых данным методом. При вы боре метода оценки той или иной характеристики ИКК надо исходить из реальных воз можностей и при этом никогда не переоценивать значимости метода, четко знать его ограничения, в противном случае нас всегда ждет разочарование при его применении в клинике. При работе с любым методом желательно определять не один показатель, а серию показателей в нескольких нагрузочных тестах, что позволит более полно реали зовать возможности метода в оценке физиологического состояния клеток.

Вопрос 3. Какие методы оценки иммунного статуса следует внедрять в клинику в первую очередь?

Свыше чем 20-летний опыт разностороннего иммунологического обследования больных позволил выделить комплекс иммунологических показателей, имеющих в до полнение к лейкограмме первостепенное значение для оценки иммунного статуса па циента (Механизмы иммунопатологии, 1983;

Иммунологические аспекты инфекционных заболеваний, 1982;

Петров и соавт., 1984). Этот комплекс включает определение в пе риферической крови следующих показателей: содержания Т- и В-лимфоцитов, субпо пуляций Т-лимфоцитов, обладающих хеллерной и супрессорной активностью, фагоци тарной активности нейтрофилов, содержания иммуноглобулинов (классов А, М, G). Ог ромную диагностическую важность представляют нагрузочные тесты (Лебедев и др., 1987).

Для определения субпопуляций лимфоцитов практически наиболее пригодны два метода: метод цитофлюориметрии с моноклональными антителами и метод розеткооб разования. Метод цитофлюориметрии хорош по всем показателям, однако требует ис пользования дорогостоящих, а зачастую пока и мало доступных реактивов и оборудо вания. Он может использоваться в крупных диагностических центрах, где имеется большой постоянный поток исследований и использование автоматов становится эко номически оправданным. Метод розеткообразования удовлетворяет всем перечислен ным выше требованиям при условии надежной технологии его постановки и создания дешевых коммерческих комплектов материалов и реактивов. Особенно важно то, что он позволяет определять сколько угодно широкий комплекс показателей в нагрузочных тестах.

Методы определения фагоцитарной активности нейтрофилов различаются в ос новном по виду частиц, используемых для проведения реакции. Для широкого практи ческого использования не годятся культуры живых клеток (микробных или дрожжевых).

Следует использовать крупные частицы, дающие при длительном их хранении ста бильные результаты.

Всем перечисленным выше требованиям определения содержания иммуноглобу линов удовлетворяют методы иммунодиффузии (как радиальной, так и линейной). Ме тоды лазерной нефелометрии, радиоиммунный, иммуноферментный предъявляют особые требования к реактивам, для учета их результатов необходимы более или ме нее сложные приборы. Поэтому в настоящее время они могут использоваться только в крупных специализированных диагностических лабораториях.

Все указанные методы могут быть использованы для оценки иммунологических по казателей уже в настоящее время. В перспективе методы определения этих показате лей, конечно, должны совершенствоваться, и после создания максимально простых, дешевых и стандартизированных технологий они могут заменять и дополнять данные методы в широкой практике. Прогрессивной, по-видимому, явится разработка простых невизуальных способов определения расширенной лейкограммы, автоматизированных стабильных методов определения иммуноглобулинов на основе иммуноферментного анализа, принципиально иных, более простых и надежных способов оценки субпопуля ций ИКК и определения интегральных показателей нагрузочных тестов in vitro.

Вопрос 4. Каким критериям должен удовлетворять метод, применяемый в практи ческой клинической иммунологии?

Основными критериями любого метода являются чувствительность, точность, на дежность. Определим в отношении методов клинической иммунологии каждый из них.

Чувствительность. С созданием новых иммунологических методов обычно возника ют мно- гочисленные способы повышения их чувствительности. С одной стороны, эффектив ность этих способов может быть очень высокой, поскольку, как мы отмечали выше, распределение на клетках рецепторов и антигенов, а также функциональные характеристики, опреде ляющие в совокупности физиологическую активность клеток, имеют градиентный ха рактер, т.е. являются преимущественно не качественной, а количественной характери стикой. С другой стороны, увеличение чувствительности метода может быть полезно отнюдь не всегда, поскольку в этом случае зачастую исчезает возможность дифферен циации физиологической активности клеток. Увеличение чувствительности метода мо жет приводить и к парадоксальной на первый взгляд ситуации снижения чувствитель ности к изменению физиологического состояния клетки под влиянием нагрузочных фак торов или в зависимости от состояния организма.

В качестве примера разберем ситуацию с выявлением нулевых лимфоцитов.Нулевые клетки (ни Т-, ни В-лимфоциты) определены как лимфоциты, имеющие незначительное количество по верхностных маркеров Т- и В-лимфоцитов, т.е. в обычных условиях проведения тестов не обра зующие Е- и М-розеток, не имеющие обнаружимых поверхностных иммуноглобулинов (Hokland et al., 1980). В результате повышения чувствительности методов обнаружения поверхностных структур (использования для определения Т-лимфоцитов эритроцитов барана, обработанных АЕТ,папаином или нейраминидазой либо метода иммунофлюоресценции с моноклональными антителами, а для определения В-клеток - непрямых методов антиглобулинового розеткообразо вания или иммунофлюоресценции) в общей популяции лимфоцитов обнаруживают в сумме 100% и даже больше Т- и В-клеток, т.е. отсутствие нулевых клеток и даже дублирование определения клеток разных субпопуляций. Некоторые ученые предлагали отказаться от концепции нулевых клеток, однако дальнейшие работы доказали ее пользу в клинической практике. Основную массу нулевых клеток составляют зрелые Т- и В-лимфоциты с резко пониженной по тем или иным при чинам физиологической активностью, а также юные формы этих клеток. В популяции нулевых лимфоцитов найдены клетки, проявляющие цитотоксическую активность, в их состав входят ес тественные киллеры (Abo, Balch, 1981;

Ng, 1981). При использовании высокочувствительных ме тодов анализа на нулевых клетках в небольших количествах удается обнаружить поверхностные маркеры Т-лимфоцитов (Е-рецепторы, антигены CD 3, CD 4, CD 8), В-лимфоцитов (поверхност ные иммуноглобулины, Iа- антигены), макрофагов (выявляемые ОКМ 1), естественных киллеров (выявляемые HNK 1), Fc- и СЗ-рецепторы (Ng et al., 1981;

Lobo, 1981;

Hoffman, Ferrarini. 1985).

Использование в реакции розеткообпазования высокочувствительных эритроцитов барана, обработанных нейраминидазой, по сравнению с активными эритроцитами препятствовало выяв лению различий в Е-розеткообразовании клеток больных и здоровых, а также определению из менений розеткообразования в нагрузочных тестах (Gelfand et al., 1979).

Все это свидетельствует о том, что высокая чувствительность методов при изуче нии такой сложной структуры, как ИКК, может иметь как положительное, так и отрица тельное значение, и при определении необходимой степени чувствительности метода нужно всегда исходить из конкретных практических задач.

Точность. Некоторые исследователи считают, что метод тем лучше, тем он точнее.

Так ли это? Для ответа на этот вопрос рассмотрим объект исследования. Кровь пред ставляет собою динамическую систему, находящуюся в определенном балансе, в кото рой идет постоянный обмен веществом как между собственными компонентами, так и с другими системами. После взятия крови в пробирку этот баланс резко изменяется, что немедленно сказывается на физиологическом состоянии клеток и гуморальном составе среды. Дальнейшие операции по выделению клеток и плазмы или сыворотки еще бо лее отдаляют количественные характеристики компонентов от таковых в крови.

Как было показано в гл. 1, иммуноглобулины находятся в крови как в растворенном состоя нии, в плазме, так и на поверхности клеток, причем между этими состояниями существует дина мическое равновесие. Естественно, что любые изменения в крови вызовут сдвиг этого равнове сия в ту или иную сторону. Например, иммуноглобулиновый состав сыворотки зависит от величи ны образовавшегося сгустка, температуры, времени и многих других причин. Введение в кровь антикоагулянтов также сместит равновесие между поверхностными и растворенными иммуногло булинами и таким образом повлияет на иммуноглобулиновый состав плазмы. Таким образом, яс но, что иммуноглобулиновый состав и сыворотки, и плазмы более или менее отличается от со става иммуноглобулинов в крови, причем из-за большого количества влияющих факторов самым непредсказуемым образом. На этом фоне слишком высокая точность определения иммуноглобу линов выглядит абсурдной. Поэтому точность большинства методов определения иммуноглобу линов, ошибка которых составляет 10 %, является вполне достаточной для практических целей клиники.Другой пример - определение в крови абсолютного содержания лейкоцитов, лимфоцитов и их субпопуляций, нейтрофилов и других элементов. Известно, что содержание клеток в крови подвержено существенным (1,5-2-кратным) колебаниям, зависящим от биологиче ских ритмов, гормонального цикла, времени последнего приема пищи, диеты, уровня стресса и многих других причин, даже от положения тела во время взятия крови. Поэтому еще В. Шиллинг указывал на то, что высокая точность определения абсолютных показателей за частую смысла не имеет.

Не будем больше приводить подобных примеров, отметим лишь то, что существуют объек тивные факторы, связанные с динамической природой самого объекта исследований - крови, ко торые лишают практического смысла слишком высокую точность ряда анализов.

Динамические свойства крови, необратимые изменения в ней после взятия и обра ботки заставляют внимательно и дифференцированно отнестись к определению необ ходимой точности иммунологических исследований. Это важно еще и потому, что каж дый этап повышения точности обычно связан с усложнением методики, необходимо стью использования дорогостоящих высокоочищенных реактивов. Если при изучении абсолютных значений показателей содержание иммуноглобулинов, клеток в объеме крови) слишком высокая точность анализа практически бессмысленна, то при опреде лении относительных значений (формулы клеток крови, состава субпопуляций) точ ность должна быть более высокой, поскольку соотношение компонентов в организме более постоянно. В любом случае слишком высокая точность метода теряет смысл при грубом выделении клеток для анализа, в частности, таком, при котором изменяются их соотношение и физиологические свойства.

Надежность. Любой иммунологический метод, особенно используемый в практике, должен безусловно обладать надежностью, которая состоит в постоянном гарантиро ванном получении достоверного результата анализа каждого взятого образца с задан ной точностью и чувствительностью.

Повышения надежности любого метода можно достигнуть за счет: а) создания упрощенных модификаций, включающих как можно меньше манипуляций;

б) оптимизации режимов - так, что бы небольшие отклонения от заданного режима не изменяли (или минимально изменяли) конеч ный результат, в) автоматизации и механизации процесса, т.е. сокращения риска субъективных ошибок.

Гарантией надежности метода должно служить четкое выполнение всех инструкций. Это объясняется тем, что если произвольное изменение какого-либо одного параметра методики мо жет и не повлиять на получаемый результат, то изменения, пусть даже очень небольшие, одно временно нескольких параметров обязательно дадут суммарный эффект, который может изме нить конечный результат весьма существенно.

Вопрос 5. От чего зависит большая или меньшая распространенность методов в клинической практике?

При равной информативности и материалоемкости наибольшее распространение, очевидно, получит метод, наиболее простой в исполнении. Простота исполнения может быть достигнута за счет создания упрощенной модификации, доступности используе мых реактивов, использования автоматизированных или механизированных техноло гий.

Например, из известных методов определения содержания иммуноглобулинов наибольшее распространение получил метод радиальной иммунодиффузии по Манчини благодаря простоте, а также минимальному разнообразию и доступности необходимых реактивов и материалов. По пуляризации этого метода способствовал и выпуск иностранными фирмами готовой коммерче ской системы для определения иммуно-глобулинов методом радиальной иммунодиффузии.

Широкому распространению метода иммунофлюоресценции с моноклональными антитела ми способствовала разработка и продажа иностранными фирмами комплектов, включающих ав томатический прибор для оценки результатов, лазерный проточный флюориметр;

наборы гото вых меченых моноклональных антител, других реактивов и подробное описание технологии, со ответствующей параметрам прибора и характеристикам используемых реактивов. Таким обра зом, все наиболее сложные, трудоемкие и привно-сящие субъективизм операции осуществляют либо фирма, либо прибор, созданный ею;

лаборанту остается лишь пунктуально выполнить не большое количество несложных операций, которые подробно даны в прилагаемом описании тех нологии (с учетом возможных ошибок).

При наличии хорошей технологии и коммерческих стандартных наборов реактивов и мате риалов широкое распространение на практике может получить и метод розеткообразования, ко торый за рубежом в последнее время потеснен методом проточной цитофлюориметрии.

Любой метод сможет завоевать признание в клинике только в том случае, если: а) метод доступен;

б) получаемые с его помощью данные несут ценную для врача ин формацию;

в) врач умеет пользоваться этой информацией. Сегодня в клинической иммунологии проблема разра ботки доступных для практики методов в основном уже решена. Вторая проблема, ка сающаяся информативности того или иного метода, решается в тысячах публикуемых статей и книг. Но, к сожалению, вся эта масса публикаций не решает проблемы, ка сающей-ся использования получаемых данных на практике. Исходя из научных публи каций, врач часто ожидает от того или иного метода большего, чем он может дать, а столкновение с реальной действительностью приводит к разочарованию в очередном новом методе, потере к нему всякого интереса и в результате упущению всего ценного, что этот метод мог бы дать при его правильном использовании.

Так, в многочисленных исследованиях было показано, что различные вещества, в частности микробные и тканевые антигены и иммуномодулирующие препараты, могут значительно изме нять активность ИКК в различных тестах (розеткообразование, РБТЛ, РТМЛ и др.). В большинст ве работ в связи с этим делался вывод о возможности использования этого эффекта для диаг ностики заболеваний или для выбора лечебного препарата. Клиницисты делали попытки практи ческого применения этих тестов по их указанному назна-чению, ожидая столь же четкого эффек та в клинике, однако в этом их ждало разочарование, что вполне естественно, поскольку дейст вие препарата на ИКК зависит от слишком многих факторов, да и вообще неизвестно, какое именно действие препарата на клетки соответствует определенному эффекту его в организме. А ведь подобного разочарования можно было бы избежать, а от этих тестов получать так необхо димую клиницисту помощь, если анализировать данные этих нагрузочных тестов в совокупности с клиническими данными с позиций общей реактивности организма.

Все рассмотренные выше принципы были использованы нами для создания простой и надежной технологии постановки иммунограммы для использования в широкой кли нической практике.

2.2 ТЕХНОЛОГИЯ ЛАБОРАТОРНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА ПОКАЗАТЕЛЕЙ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ (ИММУНОГРАММЫ) В предыдущем разделе были перечислены основные показатели клеток крови, которые определяют для оценки иммунного статуса человека в первую очередь ("Пока затели первичного иммунологического обследования" (Петров и др., 1984). К ним отно сятся: содержание в крови лимфоцитов и их субпопуляций: Т-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-супрессоров, В-лимфоци-тов;

содержание основных продуктов В-лимфоцитов - им муноглобулинов;

фагоцитарная активность нейтрофилов. До настоящего времени оп ределение традиционной лейкограммы и так называемого комплекса показателей пер вичного иммунологического обследования в лабораториях шло раздельно. Однако, по скольку определение всех этих показателей служит единой цели и весь комплекс пока зателей должен интерпретироваться как единое целое, экономически целесообразно и определять эти показатели комплексно, в единой технологии. В основу представленной здесь технологии определения данного комплекса, разработанной авторами книги (По някина и др., 1984;

Лебедев и др., 1987, 1988, 1989;

Лебедев, Понякина, 1988), положе ны общепринятые, наиболее простые, дешевые, а значит, и доступные для широкого практического использования визуальные методы определения популяционного соста ва клеток крови, методы розеткообразования для оценки субпопуляций и методы им мунодиффузии для определения содержания иммуноглобулинов. Затраты труда на по становку данного комплекса тестов минимальны и снижаются пропорционально коли честву одновременно проводимых анализов. Важно то, что определение всего ком плекса перечисленных показателей (включая возможное расширение его за счет опре деления адгезивной актквности нейтрофилов и постановки серии нагрузочных тестов) требует минимальных количеств крови - от 0,07 до 0,2 мл (в зависимости от конкретной модификации технологии и широты спектра нагрузочных тестов), что существенно меньше, чем при раздельном определении данных показателей или при использовании других методов. Технология основана на использовании материалов однократного применения и химических реактивов отечественного производства.

2.2.1. ОСНОВНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ 2.2.1.1. ОБОРУДОВАНИЕ Микроскоп бинокулярный с препаратоводителем любой марки (Биолам Р-16 и др.), снабженный осветителем с диафрагмой (типа ОИ-9М, ОИ-18, ОМ-1 и др.);

микроскоп бинокулярныйстереоскопический (МБС-9, МБС-10 и др.);

счетчик клеток лабораторный (СЛ-2 и др.);

центрифуга с горизонтальным ротором и приставками для центрифугиро вания планшетов (ОС-6М, ЦЛС-З, ОПН-З, ОПН-8);

дозаторы пипеточные на разные объемы;

капельницы-дозаторы;

часы песочные на 40 с. или секундомер;

планшеты для агглютинации с объемом лунок 2 см3, камеры Горяева;

пинцеты глазные.

Настройка света по Келлеру для микроскопов с осветителями типа ОИ-18, ОИ-9М и ОМ-1.

Цель настройки микроскопа состоит в том, чтобы добиться такого положения опти ки, при котором поток света в виде узкого пучка параллельных лучей идет на объект исследования строго перпендикулярно, не рассеиваясь.

Микроскоп и осветитель фиксируют на крестовине. В микроскопе устанавливают плос-кое зеркало. Из конденсора убирают фильтры;

если в нем имеется добавочная собиратель-ная линза, то ее выводят из системы. Исследуемый препарат помещают на предметный столик микроскопа, включают освещение и устанавливают объектив 20 и окуляры 7. Затем максимально закрывают диафрагму осветителя. На зеркало микро скопа кладут матовое стекло или лист бумаги и, перемещая лампу осветителя вдоль оси, устанавливают ее таким образом, чтобы на матовом стекле была четко видна спи раль лампы. Далее лампу передвигают в центральное положение, что контролируется по выведению светового пятна в центр зеркала микроскопа при помощи боковых вин тов втулки патрона (как на осветителе ОИ-18) или сдвигая весь патрон с лампой (как на осветителе ОИ-9М). После этого матовое стекло убирают, диафрагмы осветителя и конденсора полностью открывают и, передвигая макро- и микровинтами, добиваются четкой видимости препарата в окуляре. Диафрагмы осветителя и конденсора вновь за крывают и, поворачивая зеркало микроскопа, устанавливают освещенное пятно в цен тре поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются максимально четких кра ев освещенного пятна. Наконец, диафрагмы осветителя и конденсора открывают и при помощи реостата устанавливают оптимальную силу освещения. Если поле освещено неравномерно, лампу поворачивают в патроне на несколько градусов вокруг оси в ту или иную сторону, не изменяя глубины ее положения в патроне. Необходимого увели чения контрастности добиваются, незначительно опуская конденсор. Настройку микро скопа осуществляют каждый раз перед началом работы. При правильно установленном свете для просмотра препарата при объективах 20 или 40 обычно достаточен мини мальный накал лампы (крайнее левое положение ручки реостата).

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 11 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.