WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 9 | 10 || 12 | 13 |

«СПРАВОЧНИК Лабораторные методы исследования в клинике Под редакцией профессора В.В.Меньшикова МОСКВА „МЕДИЦИНА" 1987 ББК 53.4 М51 УДК 61б-074/-078:061.6 В. В. МЕНЬШИКОВ, Л. Н. ДЕЛЕКТОРСКАЯ, Р. П. ...»

-- [ Страница 11 ] --

тов при 4 °С сохраняется в течение года.

В ряде случаев антитела к ДНК III типа Об р а б о т к а э р и т р о ц и т о в т а ни- можно выявить при выраженной активности ном. Обработку формалинизированных эритро- хронического активного гепатита или болезни цитов танином проводят перед их использова- Шегрена.

нием. 2,5 % взвесь формалинизированных эритроцитов с равным объемом танина, раство ренного в ССР в соотношении 1:200000. Смесь инкубируют в течение 15 мин при 37 °С, после Ли т е р а т у р а. Поверенный А. М. и др.— чего эритроциты отмывают от избытка танина Вопр. мед. химии, 1966. № 12, с. 117—119. Пове 10-кратным количеством ССР. ренный А. М. и др.— Вести. АМН СССР, 1967, Се н с и б и л и з а ц и я э р и т р о ц и т о в. № 2, с. 62—64. Белокриницкий Д. В. и др.— Формалинизированные и танированные эрит- Вопр. ревмат., 1971, № 12. с. 62—65. Гольд роциты сенсибилизируют ДНК, денатурирован- фарб Д. М., Замчук Л. А. Антитела к нуклеино ной в присутствии формальдегида. 2,5 % взвесь вым кислотам.— М.: Наука, 1975.

6.2.5. Ревматоидный фактор Надосадочная жидкость при последнем промы вании должна быть бесцветной. Из плотного Унифицированный метод определения реак- осадка готовят 1 % и 25 % взвесь эритроци ции гемагглютинации. Пр и н ц и п. Ревматоид- тов в фосфатно-солевом буфере рН 7,4.

ный фактор, находящийся в сыворотке крови 2. Обработка исследуемой сыворотки: кровь, больных, обладает свойством агглютинировать взятую из локтевой вены больных в коли эритроциты барана, предварительно сенсибили- честве 2—3 мл, ставят на 1 ч в термостат. Затем зированные кроличьим иммуноглобулином. сыворотку отделяют от сгустка (центрифугиру Ре а к т ив ы. 1. Кроличья гемолитическая ют 20 мин при 1000 об/мин, отсасывают над сыворотка (амбоцептор). Используют сухую или осадочный слой) и инактивируют в водяной жидкую прогретую гемолитическую сыворотку бане при 56 °С в течение 30 мин. Хилезные и ге с разными титрами, как готовую, так и получен- молизированные сыворотки непригодны для ис ную в лаборатории путем иммунизации кроли- следования.

ков эритроцитами барана. 2. Фосфатно-солевой 3. Разведение сывороток: сыворотки больных буфер рН 7,4. А. Натрия фосфат однозамещен- разводят фосфатно-солевым буфером рН 7, ный — 24,6 г и до 1 л дистиллированной воды. в соотношении 1:5 (0,2 мл сыворотки и 0,8 мл Б. Натрия фосфат двузамещенный — 22,4 г буфера).

и до 1 л дистиллированной воды. В. Хлорид 4. Адсорбция исследуемой сыворотки: прово натрия — 8,5 г и до 1 л дистиллированной воды. дят с целью устранения гетероагглютининов.

Перед опытом смешивают раствор А с раствором 1 мл 25 % взвеси эритроцитов барана центри Б в отношении 1:9, рН раствора доводят до 7,4. фугируют 15 мин при 1000 об/мин. Надосадоч Затем одну часть смеси добавляют к 9 частям ную жидкость удаляют и к осадку добавляют раствора В. 3. Эритроциты барана: а) свежая 0,75 мл исследуемой сыворотки, предварительно дефибринированная кровь барана, срок разведенной в фосфатно-солевом буфере в со использования до 7 дней, хранение при 2—8 °С;

отношении 1:5. Пробирки со смесью встряхи б) эритроциты, консервированные в растворе вают и оставляют при комнатной температуре Олсвера;

срок хранения до 2 мес при температу- на 1 ч, а затем на 1 ч в холодильнике при ре 2—8 °С. 4. Раствор Олсвера: глюкоза — 4 °С. После этого центрифугируют 15 мин при 20,5 г, натрия цитрат — 8 г, лимонная кисло- 1000 об/мин и осторожно сливают находящуюся та — 0,552 г, хлорид натрия — 4,2 г, дистилли- сверху надосадочную жидкость. Далее эту над рованная вода — до 1 л;

рН раствора 6,1. осадочную жидкость, которая является сыво Раствор стерилизуют дробно (кипятят на водя- роткой в разведении 1:5, используют для при ной бане 3 дня по 20 мин). Срок хранения до готовления разведений при постановке реакции 1 мес при температуре 2—8 °С. гемагглютинации в основном опыте.

Ход о п р е д е л е н и я. Постановке основ- 5. Титрование кроличьей гипериммунной сы ного опыта предшествует подготовительная ра- воротки (амбоцептор): проводят для определе бота. ния ее агглютинирующей способности к барань 1. Приготовление 1 % и 25 % взвеси барань- им эритроцитам. Готовят серию разведений их эритроцитов: дефибринированную кровь ба- амбоцептора в фосфатно-солевом буфере. Для рана или бараньи эритроциты в растворе Олс- этого первоначально готовят разведение сы вера центрифугируют и удаляют надосадочную воротки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл жидкость. Осадок трижды отмывают 5—6 объе- фосфатно-солевого буфера) и из него готовят мами изотонического раствора хлорида натрия. дальнейшие разведения:

200 — 0,5 мл гемолитической сыворотки 1:100 + 0,5 мл фосфатно-солевого буфера 300 0,5 То же 1:100+1,0 То же » 400 0,5 » 1:100+1,5 » » » 500 0,5 » 1:100 + 2,0 » » 600 0,5 » » 1:100 + 2,5 » » » 700 0,5 » 1:100 + 3,0 » » » 800 0,5 » 1:100 + 3,5 » » » 900 0,5 » 1:100 + 4,0 » » » 1:100 + 4,5 » » 1000 0,5 » Из каждой пробирки с данным разведенцем нии 1:4 от концентрации конечного разведе переносят в каждую пробирку второго ряда по ния сыворотки, давшего положительную реак 0,5 мл сыворотки, затем добавляют равный цию агглютинации.

объем 1 % бараньих эритроцитов (0,5 мл). 6. Приготовление сенсибилизированных эри Пробирки оставляют при комнатной температу- троцитов: к разведенной кроличьей сыворот ре на 15 мин, затем встряхивают и оставляют ке прибавляют равный объем 1 % эритроци на 2 ч при 4 °С, после чего учитывают результат. тов барана. После тщательного встряхивания Агглютинационным титром гемолитической сы- смесь оставляют при комнатной температуре воротки считается наивысшее ее разведение, на 15 мин;

так как при добавлении кроличьей при котором происходит агглютинация на 1+. иммунной сыворотки взвесь эритроцитов разво Для постановки основного опыта используют дится вдвое, то конечная ее концентрация 0,5 % кроличью гемолитическую сыворотку в разведе- и ее используют для основной реакции.

Таблица 42. Схема реакции № пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Разведение 1 5 10 20 40 80 160 320 640 1280 — — — — — — — — — Сыворотка 1:5, мл 0,2 0,2 0, Фосфатно-солевой буфер, мл — 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0, Из каждой пробирки, начиная со 2-й, последовательно переносят по 0,2 мл в следующую пробирку;

из 10-й пробирки 0,2 мл выливают Ос н о в н о й о пыт ( т и т р о в а н и е Р е а к т и в ы 1. Латекс СКИ-3 — полисти и с с л е д у е м ых с ыв о р о т о к ). 1. Готовят роловые частицы величиной 0,8 мкм. Срок хра последовательные двойные разведения исследу- нения 1 год. Диагностикум латексовый для об емой сыворотки фосфатно-солевым буфером в наружения ревматоидного фактора (каунасское объеме 0,2 мл, учитывая исходное разведение предприятие бактерийных препаратов). 2. Гам 1,5.

ма-глобулин (готовый препарат 10 % гамма 2. В каждую пробирку вносят по 0,2 мл 0,5 % глобулина). Хранить при 2—8 °С. 3. Глициново сенсибилизированных бараньих эритроцитов. боратный буфер: борная кислота — 3,1 г, гли Разведения, схему реакции см. в табл. 42. цин — 7 г, хлорид натрия — 8,5 г, дистиллиро 3. Таким же образом для контроля ставят ванная вода — до 1 л;

рН 8,2. Хранить в холо реакцию с сывороткой клинически здорового че- дильнике при 2—8 °С. Срок хранения 1 мес, ловека и с сывороткой больного с известным Ход о п р е д е л е н и я. Постановке основ высоким титром. ного опыта предшествует подготовительная ра 4. Пробирки встряхивают и помещают в бота.

холодильник при 4 °С на 18 ч. На другой день 1. Приготовление латекс-глобулинового оставляют их на полчаса при комнатной темпе- реагента: 10 % готовый препарат гамма-глобу ратуре и макроскопически учитывают наличие лина инактивируют при 60 °С 15 мин или при агглютинации. Для обозначения интенсивности 56 °С 30 мин. Затем разводят изотоническим агглютинации пользуются системой четырех раствором натрия хлорида до 1 % концентрации плюсов. В реакции гемагглютинации определя- (1 мл 10% гамма-глобулина и 9 мл изотони ется конечное разведение исследуемой сыворот- ческого раствора).

ки, дающее положительный результат агглюти- Латекс разводят в дистиллированной воде из нации на 1 +. расчета 1:30 (1 мл латекса и 29 мл дистиллиро Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Наличие ванной воды). Полученную взвесь тщательно агглютинации до титра 1:20 считается нормой. взбалтывают. К 30 мл суспензии латекса Реакция с титром 1:40 и выше—положитель- добавляют 24 мл прогретого и разведенного ная. 1 % гамма-глобулина (5 мл латекса и 4 мл Ис т о ч н и к и ошибок. 1. Плохая кон- гамма-глобулина).

сервация эритроцитов барана. Суспензию латекса и гамма-глобулина 2. Несоблюдение правил при сенсибилиза- тщательно смешивают перевертыванием пробир ции эритроцитов. ки и оставляют в термостате при температуре 3. Неполная инактивация исследуемой сы- 37 °С в течение 30 мин, периодически перемеши воротки. вая. Затем добавляют 3 мл раствора челове ческого альбумина (100 мг сухого альбумина Ли т е р а т у р а. Иммунохиминеский ана растворяют в 10 мл изотонического раствора лиз. Под ред. Л. А. Зильбера.— М., 1968;

хлорида натрия), оставляют на 30 мин при ком Методические указания по применению унифи натной температуре и на 18 ч в холодильнике, цированных клинических лабораторных методов после чего смесь фильтруют через тонкий слой исследований.—М., 1973, с. 149—153.

гигроскопической ваты и суспензия готова.

Унифицированный метод определения ревма- 2. Обработка исследуемой сыворотки: кровь, тоидного фактора в сыворотке крови капельной взятую из пальца или из локтевой вены больных латекс-глобулиновой пробой (латекс-тест в мо- в количестве не менее 1 мл, ставят на 1 ч в термо дификации Сперанского). Пр и н ц и п. Ревма- стат. Затем сыворотку отделяют от сгустка, тоидный фактор, находящийся в сыворотке центрифугируют 20 мин при 1000 об/мин, осто больных, обладает свойством вступать в реак- рожно отсасывают сыворотку и инактивируют цию преципитации с инактивированным челове- ее на водяной бане 56 °С в течение 30 мин.

ческим гамма-глобулином, адсорбированным на Хилезные, гемолизированные и проросшие сыво нейтральных частицах латекса.

ротки непригодны для использования.

Ход о п р е д е л е н и я. Сыворотку иссле- Ис т о ч н и к и о шиб о к. 1. Потеря пре дуемого больного разводят в 20 раз глициново- ципитирующей способности частиц при длитель боратным буфером (0,1 мл цельной сыво- ном их хранении. 2. Испортившаяся при долгом ротки и 1,9 мл буфера). 0,2 мл разведенной или неправильном хранении контрольная сыво сыворотки наносят на предметное стекло и до- ротка. 3. Грязная, плохо обезжиренная посуда.

бавляют пастеровской пипеткой 1 каплю латекс - Кл и ни ч е с к о е з на ч е ние. Ревма глобулинового реагента (сенсибилизированной тоидный фактор выявляется часто при ревмато суспензией латекса). После тщательного пере- идном артрите. Величина титра коррелирует мешивания стеклянной палочкой смесь оставляют с активностью процесса. В то же время отсут на 3 мин, затем осторожно покачивают стекло ствие ревматоидного фактора в сыворотке не мо в течение 10—15 с. Окончательный результат жет служить основанием для изменения клини учитывают через 5—6 мин в проходящем свете ческого предположения. Существуют сероне от настольной лампы. гативные формы ревматоидного артрита. «Рев Параллельно проводят исследование суспен- матоидная активность» фактора может быть зии латекса со стандартной положительной секвестрирована в иммунных комплексах и быть и отрицательной сыворотками для контроля выявлена после их диссоциации.

годности реагентов. Ревматоидный фактор (факторы) может При количественной постановке пробы гото- быть выявлен и при других заболеваниях.

вят различные разведения сыворотки— 1:20, В высоких титрах он встречается при хрони 1:40, 1:80 и далее. Пробу ставят указанным ческом активном гепатите, болезни Шегрена, выше способом. в 30 % случаев подострого бактериального Оц е н к а р е з у л ь т а т о в р е а к ц и и. эндокардита, при системных заболеваниях Реакцию считают положительной, если наблю- соединительной ткани. Наличие ревматоидного дается агглютинация частиц латекса. Величину фактора даже в низких титрах может быть реакции учитывают в плюсах: 4 плюса — все информативным при диагностике латентных частицы агглютинированы, раствор прозрачен;

форм ревматического процесса.

3 плюса — 1/4 частиц агглютинированы, рас Ли т е р а т у р а. Механизмы иммунопато твор прозрачен по краю;

2 плюса — 1/2 час логии/Под ред. С. Колна, П. А. Уорда, тиц агглютинирована, раствор мутноватый;

Р. Т. Мак-Класки.— М.: Медицина, 1983;

1 плюс — слабая агглютинация, раствор мут Сперанский А. И.— В кн.: Материалы докладов ный.

на научной сессии, посвященной десятилетию Норма. Проба положительная при титре Института ревматизма АМН СССР. М., 1968, 1:20. При положительном результате в более вы с. 75;

Цончев В., Попов П., Коларов С., Карака соких титрах оценка производится согласно шов А. Лабораторная диагностика ревмати титру.

ческих заболеваний.— София, 1964.

6.3. РЕАКЦИЯ ИММУННОГО ЛИЗИСА 6.3.1. Гемолитическая активность концентрации бараньих эритроцитов, коли комплемента чества антител, использованных для сенсиби лизации, величины рН, ионной силы системы.

Унифицированный метод определения гемо- В связи с тем что присоединение к иммунному литической активности комплемента по 50 % ге- комплексу первого компонента комплемента молизу. Пр и н ц и п. Комплемент, содержа- не происходит в отсутствие Са + +, а для при щийся в исследуемой сыворотке, вызывает ге- соединения 4-го компонента (следующего ++ за молиз сенсибилизированных бараньих эрит- активацией C1) необходимо наличие Mg, роцитов в присутствии сыворотки кролика, важно строго соблюдать концентрацию этих иммунизированного бараньими эритроцитами веществ в буферных растворах. Необходимо (гемолитическая сыворотка). стандартизировать время реакции, температуру.

Активность комплемента выражают в гемо- Ре а к т и в ы. 1. Гемолитическая сыворотка литических единицах. За одну 50 % гемолити- (гемолизин). Выпускаются стандартные серии ческую единицу комплемента (СН50) принимают препарата в ампулах с титром гемолитической такое его количество, которое вызывает гемолиз сыворотки, указанным на этикетке. Такие сыво 50 % 0,5 мл стандартной суспензии сенсибили- ротки имеют длительный срок годности при зированных эритроцитов при 37 °С за 45 мин.

Эта единица условная, величина ее зависит от комплемента в зависимости от его количества выявило сигмовидный характер кривой Изначально гемолитическая активность корреляции, причем полный гемолиз наступает комплемента определялась минимальным коли- в широкой зоне верхней части кривой, когда чеством сыворотки, вызывающим лизис 100 % сенсибилизированные эритроциты малочувстви определенного количества стандартных эритро- тельны к количественному возрастанию компле цитов. Однако изучение литической активности мента.

хранении при температуре 2—8 °С. 2. Эритроци- После приготовления 3 % взвеси эритроци ты барана. 3. Веронал-мединаловый буфер. тов готовят гемолитическую сыворотку.

Состав буфера (в граммах): 85 — NaCl;

Р а з в е д е н и е г е м о л и т и ч е с к о й 5,75 — веронал;

3,75 — мединал;

0,22— с ыв о р о т к и. Перед опытом ампулу вскры СаС12-2Н2О;

1 — Mg5Cl2-6H2O;

pH 7,3—7,8 вают, содержащийся в ней лиофильный пре (6,75 г веронала растворяют в 500 мл горячей парат разводят стерильным изотоническим рас дистиллированной воды, смесь охлаждают до твором хлорида натрия согласно инструкции.

+ 20 °С, добавляют другие компоненты и дово- Гемолитическую сыворотку берут в разведении, дят дистиллированной водой до объема 2 л. которое в 3 раза превышает ее исходную кон Буфер хранят при температуре 3—5 °С). центрацию. Так, если титр гемолитической сы Ход о п р е д е л е н и я. Постановке основ- воротки равен 1:1200, готовят разведение 1:400.

ного опыта предшествует подготовительная Исходя из необходимого для постановки реак работа. ции объема гемолитической системы, отмери 1. Приготовление буфера: в день постановки вают нужное количество гемолитической сыво опыта к одной части буферного раствора доба- ротки. После этого ампулу запаивают и остаток вить 4 части дистиллированной воды. Разведен- гемолитической сыворотки сохраняют до следу ный буферный раствор пригоден в течение 12 ч. ющего опыта в холодильнике при 4—8 °С. Толь 2. Обработка исследуемой сыворотки боль- ко после приготовления 3 % взвеси бараньих ного: кровь, взятую из вены больного в коли- эритроцитов и разведения по титру гемолити честве 2—3 мл, оставляют на 2 ч при комнатной ческой сыворотки можно приступить к приго температуре, затем центрифугируют 10—15 мин товлению гемолитической системы.

при 1500 об/мин. Сыворотку осторожно отса- Г е м о л и т и ч е с к а я с и с т е ма — это сывают и исследование проводят в тот же день. смесь равных объемов разведенной по трое Пр и г о т о в л е н и е г е мо л и т и ч е с - кратному титру гемолитической сыворотки и кой с и с т е мы. Приготовление 3 % взвеси 3 % взвеси бараньих эритроцитов от объема бараньих эритроцитов: дефибринированную плотного осадка (100 мл 3 % взвеси и 100 мл кровь барана отмывают 3 раза 5—10-кратными разведенной гемолитической сыворотки: 0,1 мл объемами изотонического раствора хлорида нат- гемолитической сыворотки и 99,9 мл изотони рия, который после третьего отмывания должен ческого раствора хлорида натрия).

быть бесцветным. Из плотного осадка эритро- Смешивание гемолитической сыворотки цитов готовят 3 % (по объему) взвесь в изото- (0,1 мл и 99,9 мл изотонического раствора нат ническом растворе.

рия хлорида) с эритроцитами производят по С т а н д а р т и з а ц и я в з в е с и э р ит - возможности быстро, причем гемолитическую р о ц и т о в б а р а на. Густота взвеси эритро- сыворотку примешивают к взвеси эритроцитов, цитов барана оказывает значительное влияние а не наоборот. Смесь выдерживают при 37 °С на титр комплемента и поэтому имеет существен- в термостате 30 мин для сенсибилизации эрит ное значение. Наиболее точным методом стан- роцитов.

дартизации эритроцитов является фотометриро- Т и т р о в а н и е к о мп л е ме н т а. Иссле вание. Используют для этой цели ФЭК М-56.

дуемую сыворотку, разведенную 1:10 буферным Ме т од ика. За 15—20 мин до начала раствором, разливают в 2 пробирки: 0,1 и исследования включают ФЭК и устанавливают 0,25 мл. Разлитую сыворотку (1:10) доводят зеленый светофильтр;

1 мл 3 % взвеси отмытых веронал-мединаловым буфером до объема бараньих эритроцитов добавляют в пробирку 1,5 мл. Затем в каждую пробирку прибавляют к 9 мл дистиллированной воды, полученную 1,5 мл стандартизированной гемолитической лизированную кровь вливают в 10-миллиметро- системы.

вую кювету, в другие две кюветы (такого же Одновременно с опытными пробирками ста объема) наливают растворитель, т. е. смесь из вят контроль на отсутствие гемолиза сенсибили 1 мл изотонического раствора и 9 мл дистиллиро- зированных эритроцитов: 1,5 мл гемолитической ванной воды. системы и 1,5 мл веронал-мединалового буфера.

В левый кюветдержатель ставят кювету с Пробирки встряхивают и помещают в термо растворителем, в правый — кювету с лизирован- стат при 37 °С на 45 мин. После инкубации их ной кровью. Величину оптической плотности охлаждают в рефрижераторе при 2—4 °С в тече раствора отсчитывают по правой части бара- ние 18—19 ч. На следующий день проводят бана. Определенной концентрации эритроцитов фотометрирование надосадочной жидкости из соответствует определенный показатель шкалы каждой пробирки (против изотонического рас оптической плотности. Если 3 % взвесь ба- твора хлорида натрия или дистиллированной раньих эритроцитов приготовлена правильно, воды в контрольной кювете колориметра).

то шкала оптической плотности показывает 0,4.

Для у ч е т а степени гемолиза необходимо использовать шкалу стандартных разведений Если показатель оптической плотности менее лизированных эритроцитов по А. П. Конникову, 0,4, то к приготовленной взвеси следует добавить которую готовят для каждой партии эритроци соответствующее графику количество эритроци- тов и гемолитической сыворотки, как указано тов. Если же показатель оптической плотности на с. 286.

выше 0,4, то к приготовленной взвеси бараньих Для вычисления 50 % единицы гемолиза эритроцитов следует прибавить соответству- строят калибровочную кривую. Контролем слу ющее количество изотонического раствора хло- жит оптическая плотность пробирки № 4 из рида натрия (рис. 9). шкалы Конникова, которая соответствует 50 % Рис. 9. Кривая стандартиза ции взвеси бараньих эритро цитов по ФЭК-М. Кювета 10 мл. Светофильтр зеленый.

1 — взвесь бараньих эритроци тов (%);

II — бараньи эритро циты (мл), которые нужно доба вить к 100 мл взвеси, чтобы получить 3 % взвесь;

III — изо тонический раствор хлорида нат рия (мл), который нужно доба вить к 100 мл взвеси, чтобы полу чить 3 % взвесь.

гемолизу. На оси ординат откладывают вели- Результаты исследования: фотометрирова чину оптической плотности, измеренной на ние первой пробирки, которая содержит 0,1 мл ФЭКе, как контроля, так и исследуемого матери- сыворотки, показывает 0,07;

второй пробирки, содержащей 0,25 мл,—0,12. Соединяют эти две ала, и проводят горизонталь, параллельную оси абсцисс, до пересечения с перпендикулярами, точки и линию соединения продолжают до пере восстановленными на оси абсцисс в соответ- сечения с линией 50 % гемолиза. Из точки пере сечения опускают перпендикуляр на линию аб ствующих 0,1 и 0,25 разведениях сыворотки.

Пр и ме р : пробирка из шкалы Конникова сцисс, где отмечены показания разведения сыво № 4, отражающая 50 % гемолиза, соответст- ротки (например 0,25).

вует показаниям ФЭК-13. Ра с ч е т ведут по формуле: 0,25 мл (1:10):

СН50=1 мл:х.

№ пробирки 1 2 3 4 5 В связи с тем что 0,25 мл — это испытуемая Гемологическая сыворотка, разведенная 1:10, результат надо ум система разведе 0, ния вдвое, мл 0,2 0,3 0,5 0,6 0,7 ножить на 10, т. е. в 1 мл исследуемой сыворотки будет 40 СН50. В сыворотках здоровых доноров Дистиллирован обычно содержится 20—40 гемолитических еди ная вода, мл 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0, ниц комплемента. Уровень комплемента у жен Гемолиз, % 20 30 40 50 60 щин ниже, чем у мужчин, в пределах 10 %.

Ли т е р а т у р а. Иммунохимический ана- ходя из данных, указанных на этикетке. Разве лиз/Под, ред. Л. А. Зильбера.- М., 1968;

Лабо- денный таким образом препарат стрептоли раторная иммунология/Под ред. О. Б. Вязова.— зин-О должен содержать в объеме 0,3 мл одну М., 1967;

Резникова Л. С. Комплемент и его рабочую дозу, т. е. то количество стрептолизи значение в иммунологических реакциях.— М., на-О, которое почти полностью нейтрализуется 1967;

Бойд У. Основы иммунологии.— М.: Мир, половиной международной единицы антистреп 1969;

Kabat E., Mayer М. Experimental Immu- толизина-О стандарта ГИСК.

nochemistry. 2 ed., 1964.

3. Т и т р о в а н и е а н т и т е л. Разведен ную сыворотку или разведенную надосадочную жидкость из крови в растворителе и другие ингредиенты разливают по пробиркам, как это 6.3.2. Антистрептолизин-О указано в табл. 43.

Результаты титрования обозначают: плюс Унифицированный метод определения в сы- (+) — положительная реакция — отсутствие воротке крови. Пр и н ц и п. Если исследуемая гемолиза, в осадке эритроциты;

плюс-минус сыворотка содержит антитела к антигену стреп- (±) — сомнительная реакция — частичный ге тококка — стрептолизину-О, то добавление по- молиз;

минус ( —) — отрицательная реакция — следнего к сыворотке способствует специфиче- полный гемолиз.

скому связыванию антител и отмене феномена При чтении реакции учитывают последнюю гемолиза эритроцитов, добавленных в качестве пробирку, в которой сыворотка еще нейтрали индикатора реакции к той же сыворотке. зует рабочую дозу стрептолизина-О (0,3 мл).

По с у д а и о б о р у д о в а н и е. 1. Термо- Гемолиз эритроцитов в этой пробирке должен стат на 37 °С. 2. Пробирки химические. 3. Шта- отсутствовать. Титр сыворотки выражают чис тивы. лом единиц антистрептолизина-О в 1 мл.

Ре а кт ивы. 1. Препарат стрептолизина-О AEST-O — интернациональная единица ан (предприятие по производству бактериологи- тистрептолизина-О — равна двум условным еди ческих препаратов Ленинградского научно-ис- ницам антистрептолизина-О, принятым ранее следовательского института вакцин и сыворо- в Советском Союзе.

ток). 2. Фосфатный буфер рН 6,5—6,7. На 1 л В табл. 43 приведено число AEST-O в 1 мл дистиллированной воды добавляют 7,4 г при нейтрализации стрептолизина-О различ NaH(PO4) ;

3,17r KН2PO4;

1,81 г К НРО -2Н2О ными разведениями сыворотки.

2 2 и NaOH до рН 6,5—6,7. Хранить буфер в рефри- 4. Ко н т р о л ь. Пробирки № 12 и 13 служат жераторе при температуре от 3 до 8 °С. 3. Взвесь. для контроля эритроцитов и стрептолизина-О.

эритроцитов: дефибринированную или взятую Эритроциты не должны при учете реакции быть с цитратом натрия кровь кролика или человека гемолизированы. Стрептолизин-О в дозе 0,3 мл (любой группы) наливают в центрифужные про- рабочего разведения должен вызывать полный бирки, отмечают уровень крови, центрифуги- гемолиз 0,2 мл 5 % взвеси эритроцитов.

руют и удаляют надосадочную жидкость. Эри- Унифицированный метод определения в ма троциты троекратно промывают 0,85 % раство- лом объеме крови. Пр и н ц и п тот же.

ром NaCl, добавляют до метки 0,85 % раствор Ре а к т и в ы. Растворитель крови: 2,05 г NaCI, взвесь тщательно размешивают и к 5 мл глюкозы, 0,16 г цитрата натрия, 0,5 г хлорида такой взвеси добавляют 95 мл фосфатного буфе- натрия, до 100 мл дистиллированной воды, ра рН 6,5—6,7. Взвесь эритроцитов готовят рН 6,1—6,3.

в день постановки опыта. После автоклавирования к растворителю до 4. Сыворотка больных: кровь, взятую из бавляют мертиолат натрия до концентрации пальца или локтевой вены в количестве не менее 1:20000, затем равномерно разливают в сте 0,5 мл, ставят на 15 мин в термостат при 37 °С, рильных условиях по пробиркам и сохраняют а затем в холодильник. Через 2—24 ч стояния в холодильнике (при температуре от 4 до 8 °С).

при температуре от 3 до 8 °С сыворотку отде- Ход о п р е д е л е н и я. Кровь в количестве ляют от сгустка, прогревают при 56 °С в течение 0,3 мл, взятую из пальца, смешивают с 2,7 мл 30 мин и используют для титрования антител. растворителя (на 0,5 мл крови 4,5 мл раствори Хилезные, гемолизированные и проросшие сыво- теля). После тщательного перемешивания раз ротки непригодны для титрования. При титро- веденную в растворителе кровь помещают в хо вании антител можно использовать сыворотку лодильник. На следующий день форменные эле или кровь, смешанную с растворителем. менты крови (осадок) удаляют центрифугиро Ход о п р е д е л е н и я. 1. Разведением ванием, надосадочную жидкость пастеровской сывороток. Сыворотки больных разводят фос- пипеткой отсасывают в другую пробирку, про фатным буфером рН 6,5—6,7. А. 1:50—0,1 мл гревают при 56 °С в течение 30 мин, затем про сыворотки плюс 4,9 мл буфера. Б. 1:250—0,5 мл бирки плотно закрывают резиновыми пробками из разведения 1:50 плюс 2 мл буфера. В. и сохраняют в холодильнике до проведения 1:1000—0,5 мл из разведения 1:250 плюс 1,5 мл опыта. Определение антител в малом объеме буфера. крови может быть Произведено после длитель 2. Пр и г о т о в л е н и е с т р е п т о л и з и - ного хранения (в течение 25 дней) крови, раз на- О. Высушенный лиофильным методом веденной в растворителе.

стрептолизин-О непосредственно перед добавле- Разведение надосадочной жидкости, полу нием в пробирки осторожно, не вспенивая, рас- ченной из крови в растворителе. Все разведения творяют в фосфатном буфере, рН 6,7—6,5, ис- надосадочной жидкости, полученной из крови, Та б л и ц а 43. Схема титрования антистрептолизина-О в сыворотках Разведение 1:50 1:250 1:1000 Контроль сыворотки эрит- стреп № пробирки ро- толи цитов зина-О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Доза сыво — — ротки, мл 0,4 0,2 0,15 0,1 0,4 0,3 0,25 0,2 0,1 0,25 0, Фосфатный буфер рН 6,5 — 6,7, мл 0,1 0,3 0,35 0,4 0,2 0,25 0,3 0,4 0,25 0,35 0,8 0, 0, Стрептоли зин-О, мл 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 — 0, Термостат, 15 мин при 37 °С 5 % взвесь эритроци тов, мл 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0, Термостат, 1 ч при 37 °С Число интер националь ных единиц в 1 мл 63 125 165 250 313 413 500 625 1250 2000 3000 Кон троль предварительно смешанной с растворителем, де- Определение антистрептолизина-О имеет лают на фосфатном буфере рН 6,5—6,7. Исход- особенно большое значение при дифференциа ное разведение крови в растворителе 1:10 соот- ции ревматизма от ревматоидного артрита, ветствует разведению сыворотки 1:20. Исходя из так как при последнем эти антитела, как пра этого, из надосадочной жидкости готовят сле вило, обнаруживаются в низких титрах.

дующие разведения.

Определение антистрептолизина-О может A. 1:50 — 1 мл надосадочной жидкости и быть использовано для выявления скрыто про 1,5 мл буфера.

текающих форм ревматизма, а также для оценки Б. 1:250 — 0,5 мл надосадочной жидкости, степени активности ревматического процесса.

разведенной 1:50, и № мл буфера.

Определение антистрептолизина-О у больных B. 1:1000 — 0,5 мл надосадочной жидкости, с целью диагностики ревматизма рекомендуется разведенной 1 : 50, и 1 мл буфера. производить параллельно определению титра Разведенную надосадочную жидкость из кро- антигиалуронидазы. Обычно у больных ревма ви в растворителе и другие ингредиенты разли- тизмом антигиалуронидаза обнаруживается в вают по пробиркам, как это указано в табл. 43. высоких титрах (1000 единиц и больше) чаще, Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Титр анти- чем высокие титры антистрептолизина-О. Одна стрептолизина-О до 250 AEST-O в 1 мл обнару- ко в некоторых редких случаях, при низких живается у практически здоровых лиц (титры титрах антигиалуронидазы, обнаруживаются антистрептолизина-О приведены в интернацио- высокие титры антистрептолизина-О.

нальных единицах). В связи с этим титр антител Ли т е р а т у р а. Анохин В. Н., Черкасо до 250 в 1 мл следует считать в пределах нормы.

ва В. Л.— Лаб. дело, 1964, № 7, с. 406;

Лям Повышенные титры антистрептолизина-О обна перт И. М. Серологические методы исследова руживаются при ряде стрептококковых инфек ния.— М., 1962: МРТУ-42-139-66. Наставление ций (скарлатина, ангина, хронический тонзил по применению сухого препарата стрептолизи лит, ревматизм, гломерулонефрит и др.). Повы на-О для определения антистрептолизина-О в шение титра этих антител является показателем сыворотках больных.— М., 1973.

перенесенной стрептококковой инфекции. Осо бенно высоких титров достигают эти антитела при ревматизме и нефрите. Характерной особен ностью этих двух заболеваний является обнару- 6.3.3. Антигиалуронидаза жение антистрептолизина-О в высоких титрах (500 AEST-O и выше) с первых дней заболева- Унифицированный метод определения в сы ния, что может быть использовано с целью вспо- воротке крови. Пр и н ц и п. Специфические могательного метода диагностики.

антитела сыворотки больного вступают в реак цию с вносимым в нее антигеном — ферментом ка, прогревают при 56 °С в течение 30 мин и ис гиалуронидазой и ингибируют ее активность, пользуют для титрования антител. Хилезные, что проявляется в сохранении сгустка муцина, гемолизированные и проросшие сыворотки не образованного гиалуроновой кислотой в кислой пригодны для титрования.

среде. Разведение сывороток. Сыворотки больных Пос у д а и о б о р у д о в а ни е. 1. Термо- разводят 0,85 % раствором хлорида натрия:

стат на 37 "С. 2. Пробирки химические. 3. Шта- 1) 1:50—0,1 мл сыворотки и 4,9 мл 0,85 % хло тивы. рида натрия;

2) 1:250—0,5 мл сыворотки, разве Ре а к т и в ы. 1. Препарат (лиофилизиро- денной 1:50, и 2 мл 0,85% хлорида натрия;

ванный) стрептококковый гиалуронидазы (про- 3) 1:1000—0,5 мл сыворотки, разведенной 1:250, изводства Института эпидемиологии и микроби- и 1,5 мл 0,85 % хлорида натрия.

ологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР). Б. Кровь с растворителем: для приготовле 2. Гиалуроновая кислота. Для приготовле- ния растворителя крови к 100 мл дистиллиро ния гиалуроновой кислоты используют пупоч- ванной воды добавляют 2,05 г глюкозы, 0,16 г ные канатики новорожденных. Освобожденные нитрата натрия и 0,5 г хлорида натрия рН 6,1 — от сосудов канатики измельчают до кашицеоб- 6,3. После автоклавирования к растворителю разного состояния, взвешивают, заливают двой- крови добавляют мертиолат до концентрации ным объемом дистиллированной воды и поме- 1:20 000, з'атем равномерно в стерильных услови щают на 2—10 ч в холодильник при 3 °С. После ях разливают по пробиркам и сохраняют в холо этого смесь нагревают, доводят до кипения, дильнике при температуре от 4 до 10 "С.

фильтруют через стеклянную вату и сохраняют Кровь в количестве 0,3 мл, взятую из пальца, при температуре 3 "С. смешивают с 2,7 мл растворителя (на 0,5 мл При титровании антигиалуронидазы в крови крови 4,5 мл растворителя). После тщательного больных рекомендуется использовать раствор перемешивания разведенную растворителем гиалуроновой кислоты с относительной вязко- кровь помещают в холодильник. На следующий стью, равной 3. С этой целью сопоставляют день форменные элементы крови (осадок) уда время истечения дистиллированной воды и рас- ляют центрифугированием, надосадочную жид твора гиалуроновой кислоты при температуре кость пастеровской пипеткой отсасывают в дру 36—37 °С в вискозиметре Оствальда. Расчет гую пробирку, прогревают при 56 °С в течение относительной вязкости раствора гиалуроновой 30 мин, затем пробирки плотно закрывают рези кислоты производят следующим образом. На- новыми пробками и сохраняют в холодильнике пример, время истечения гиалуроновой кислоты до проведения опыта. Определение антител в ма равно 27 с, а время истечения воды — 9с, следо- лом объеме крови может быть произведено после вательно, относительная вязкость раствора гиа- длительного хранения (в течение 25 дней) крови, луроновой кислоты равна 3 (27:9). В том слу- разведенной растворителем.

чае, если эта величина больше 3, следует рас- Разведения надосадочной жидкости, полу твор развести дистиллированной водой до нуж- ченной из крови с растворителем. Все разведе ной вязкости и в качестве рабочей дозы взять ния надосадочной жидкости, полученной из кро 0,3 мл. ви, предварительно смешанной с растворителем, При отсутствии вискозиметра Оствальда за делают на 0,85 % растворе хлорида натрия.

рабочую дозу гиалуроновой кислоты принимают Исходное разведение крови в растворителе 1: ту дозу, которая при подкислении жидкости соответствует разведению сыворотки 1:20.

уксусной кислотой образует отчетливый сгусток Исходя из этого, из надосадочной жидкости при полном просветлении среды. Рабочая доза готовят следующие разведения:

гиалуроновой кислоты обычно равна 0,3 мл. а) 1:50—1 мл надосадочной жидкости и В том случае, если рабочая доза гиалуроновой 1,5 мл 0,85 % хлорида натрия;

кислоты больше 0,3 мл, она не может быть при- б) 1:250—0,5 мл надосадочной жидкости, менена для титрования гиалуронидазы. Опреде- разведенной 1:50, и 2 мл 0,85 % хлорида натрия;

ление рабочей дозы гиалуроновой кислоты сле- в) 1:1000—0,5 мл надосадочной жидкости, дует производить перед каждым титрованием разведенной 1:250, и 1,5 мл 0,85% хлорида гиалуронидазы. При использовании гиалуроно- натрия.

вой кислоты, вязкость которой неизвестна, необ- Приготовление раствора стрептококковой ги ходимо в каждом опыте в качестве контроля алуронидазы: высушенный лиофильным мето титровать сыворотку с известным титром анти- дом препарат стрептококковой гиалуронидазы гиалуронидазы. перед добавлением в пробирки растворяют в Приготовление 15 % раствора уксусной ки- изотоническом растворе натрия хлорида, как это слоты: 15 мл ледяной уксусной кислоты х. ч. указано на этикетке. Разведенный таким обра прибавляют к 85 мл дистиллированной воды. зом препарат должен содержать в объеме 0,2 мл Ход о п р е д е л е н и я. Обработка сыво- одну опытную дозу, т. е. то количество гиалуро ротки больных и крови с растворителем. При нидазы, которое нейтрализуется одной единицей титровании антител можно использовать сыво- рабочего стандарта антигиалуронидазы ГКИ.

ротку или кровь, смешанную с растворителем.

Т и т р о в а н и е а н т и т е л. Разведенную А. Сыворотка больных: кровь, взятую из сыворотку или разведенную надосадочную жид пальца или из локтевой вены в количестве не ме- кость из крови в растворителе и другие ингреди нее 0,5 мл, ставят на 15 мин в термостат, а затем енты разливают по пробиркам (табл. 44).

в холодильник. Через 2—4 ч стояния при темпе- Пр и м е ч а н и е. Общий объем ингредиен ратуре от 3 до 8 °С сыворотку отделяют от сгуст- тов в пробирке равен 1 мл, он слагается из 10 п/р В. В. Меньшикова Таблица 44. Схема титрования антигиалуронидазы в сыворотках или в надосадочной жидкости количества сыворотки больного, гиалурони- няется на ± одно разведение. В последующих дазы, гиалуроновой кислоты и 0,85 % рас- опытах при отсутствии эталона для контроля твора NaCl. можно использовать одну из сывороток боль ных, титр которой был установлен по эта Результаты титрования обозначают: плюс лону.

( + ) —положительная реакция — сгусток и просветление среды;

плюс и минус (±) — сом- Унифицированный метод определения в ма нительная реакция — хлопья и нити;

минус лом объеме крови. Пр и н ц и п тот же.

( —) — отрицательная реакция — мутная среда Ре а к т и в ы. Растворитель (модифициро без сгустка. ванный раствор Олсвера — Эйнсли): глюко Титр сыворотки выражают числом единиц за— 2,05 г, нитрат натрия — 0,16 г, хлорид антигиалуронидазы (AEHyS) в 1 мл сыворотки. натрия — 0,5 г, дистиллированная вода — За 1 AEHyS принимают то минимальное ко- 100 мл, рН 6,1. Раствор автоклавируют, добав личество сыворотки, которое нейтрализует одну ляют мертиолат (1:20000) и разливают в про опытную дозу гиалуронидазы. бирки.

В табл. 44 приведено число AEHyS в 1 мл при Об р а б о т к а к р о в и б о л ь н ых. Опре нейтрализации стрептококковой гиалуронидазы деленный объем цельной крови больных, взятой различными разведениями сыворотки. из пальца пипеткой, смешивают с растворите Ко нт р о л ь. 1. Пробирки № 12, 13 служат лем (на 0,1 мл крови 0,9 мл растворителя).

для контроля гиалуроновой кислоты и гиалуро- После тщательного перемешивания смесь поме нидазы. Гиалуроновая кислота при учете реак- щают в холодильник при 5—10 °С. На следую ции при подкислении уксусной кислотой должна щий день ее центрифугируют и удаляют осадок.

образовать полный сгусток. Гиалуронидаза дол- Надосадочную жидкость прогревают при 56 °С жна разрушать гиалуроновую кислоту, которая в течение 30 мин.

при этом 'теряет способность образовывать Исходное разведение крови в растворителе сгусток при добавлении уксусной кислоты. 1:10 соответствует разведению сыворотки 1:20.

2. Для контроля условий опыта используют Дальнейшее разведение сыворотки делают на эталон стрептококковой антигиалуронидазы, изотоническом растворе хлорида натрия (см.

2 ампулы которой вложены в коробку со стреп- раздел «Разведение сывороток»).

тококковой гиалуронидазой. Определение антигиалуронидазы — см.

Содержимое ампулы с эталоном разводят табл. 44.

1:50, растворяя его в 10 мл изотонического рас- Оце нк а п о л у ч е н н ы х р е з у л ь т а твора, и титруют одновременно с сыворотками тов. Титр антигиалуронидазы до 300 единиц больных (см. табл. 44). Результаты титрования (AEHyS) обнаруживают у практически здоро сывороток могут быть учтены, если титр эталона вых людей. Активность фермента, не превы соответствует указанному на этикетке или откло- шающая эти цифры, считается нормой.

Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Определе- нию умеренных доз стероидных гормонов.

ние титра антигиалуронидазы широко исполь- В трудных дифференциально-диагностических зуют в диагностике ревматического процесса. случаях, когда необходимо оценить характер Количественная характеристика антител — их лихорадки у больных ревматизмом, значитель титр — служит критерием активности ревмати- ное повышение титров антигиалуронидазы поз ческого процесса. Однако, оценивая этот пока- воляет врачу склониться в пользу активации затель, необходимо всегда помнить, что уровень ревматизма и применить соответствующую тера антител в крови пациента прямо указывает на певтическую тактику.

состояние иммунореактивных систем и косвен- Ли т е р а т у р а. Иоффе В. И. Иммуноло но — на активность патологического процесса. гия ревматизма.— Л., 1962;

Лямперт И. М.

У больных ревматизмом титры антигиалурони- Серологические методы исследования.— М., дазы достигают 1000 единиц и более. Данные 1962;

МРТУ-42 № 136-66 на стрептококковую литературы, а также опыт работы лаборатории гиалуронидазу. Наставление по применению иммунологии I ММИ им. Сеченова указывают, стрептококковой гиалуронидазы для определе что больные ревматизмом с высокими функцио- ния антигиалуронидазы в сыворотках боль нальными показателями иммунокомпетентных ных.— М., 1966;

Сачков В. И., Кузнецова Н. И., систем хорошо поддаются терапии. Высокие тит- Анохин В. Н., Токмачев Ю. К- Иммунологи ры противострептококковых антител и в большей ческие методы изучения реактивности при рев степени антигиалуронидазы у больных ревма- матизме.— В кн.: Вопросы ревматизма. М.:

тизмом могут служить показанием к назначе- Медгиз, 1961, с. 34—48.

6.4. РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ 6.4.1. С-реактивный белок концом в исследуемую сыворотку или серозную жидкость (последние набирают также на '/з длины капилляра — 3 см).

Унифицированный метод кольцепреципита- Капилляр протирают ватой (при заполне ции в капиллярах. Пр и н ц и п. Сыворотка кро- нии капилляра не должно быть воздуха между ви, экссудат или асцитическая жидкость, содер- реагентами). Затем капилляр, заполненный на жащие белок острой фазы — С-реактивный /з длины, покачивают, перемещая жидкость от протеин, образуют хлопьевидный преципитат одного его конца к другому, вследствие чего при взаимодействии со специфической преципи- реагенты перемешиваются (необходимо произ тирующей иммунной сывороткой к этому анти- вести 10—12 таких перемещений жидкости).

гену. Перед установлением капилляра в штатив Пр и б о р ы и о б о р у д о в а ни е. 1. Стек- следует наклонить его с тем, чтобы конец, через лянные капилляры (комплектуются в наборе который набирали сыворотку, был свободен на с антисывороткой). 2. Штатив — брусок пласти- 15 мм. Затем этот конец капилляра погружают лина. в пластилин так, чтобы уровень жидкости в нем Ре а кт ив ы. Антисыворотка к С-реактив- был выше поверхности пластилина на 10 мм ному белку (предприятие по производству бакте- (сыворотка находится на воздушном столбике).

рийных препаратов Московского научно-иссле- Чтобы не вылить содержимое капилляра при довательского института вакцин и сывороток фиксации, его следует держать горизонтально, им. И. И. Мечникова). а штатив вертикально. Реакция проходит при Ис с л е д у е мый ма т е р и а л. Сыворот- комнатной температуре. Предварительный учет ку крови получают обычным путем из 0,5 мл результата реакции производят через 4 ч, после крови. Можно набирать в отдельный капилляр чего капилляр со штативом оставляют на сутки из пальца или уха и отслоившуюся сыворотку при комнатной температуре или ставят на то же отламывать, отбрасывая оставшиеся в другом время в холодильный шкаф (температура от конце капилляра форменные элементы. Подоб- 2 до 8 °С).

ный метод мы рекомендуем для получения сыво- Через 24 ч производят окончательный учет ротки из малых объемов крови при радиальной результата реакции. Выпадение преципитата иммунодиффузии, иммуноэлектрофорезе, методе (хлопья, осадок) в капилляре указывает на на Оухтерлони и других методах с необходимым личие С-реактивного белка в исследуемой сыво объемом исследуемого материала 2—5 мкл. Се- ротке или серозной жидкости.

розную цереброспинальную жидкость набирают Оценка реакции. Наличие преципитата в ка предварительно в пробирку, а из нее в капилляр. пилляре высотой 1 мм оценивают одним ( + ) Необходимо следить, чтобы жидкость была про- крестом — реакция слабоположительная;

пре зрачной, без примеси крови. ципитат высотой 2 и 3 мм оценивают соответ Ход о п р е д е л е н и я. Постановка реак- ственно двумя (++) и тремя (+ + +) кре ции. Стеклянный капилляр берут посередине стами — реакция положительная;

преципитат двумя пальцами и, держа под углом 40—45 °, высотой 4 мм и более оценивают четырьмя опускают концом во флакон с антисывороткой, ( + + + +) крестами — реакция резко поло набирая ее на '/з длины капилляра (3 см). жительная (количество преципитата учитывают Капилляр протирают ватой и опускают тем же по всему капилляру).

Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Белок ост- преципитата, или квадрат диаметра кольца, пря рой фазы неспецифичен для какого-либо опре- мо пропорциональна количеству внесенного в деленного заболевания, но характерен для ост- лунку антигена и обратно пропорциональна кон рого воспалительного процесса и может служить центрации антител в агаре. При этом между признаком активности. концентрацией испытуемого антигена и пло щадью преципитата имеется линейная зависи мость. Как показали исследования Mancini и соавт., прямая пропорциональность между 6.4.2. Циркулирующие площадью преципитата (или квадратом диа иммунные комплексы метра) и концентрацией антигена устанавлива ется лишь после прекращения роста колец. Это Метод преципитации с 3,5 % раствором по время различно для разных антигенов и зависит лиэтиленгликоля ПЭГ-тест ОП280. Пр и н ц и п.

от их молекулярной массы. Так, при одной и той Раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) способен же концентрации рост колец преципитации пре осаждать из сыворотки агрегированные иммун кращается для белков Бенс-Джонса через 24 ч, ные глобулины и иммунные комплексы. Измене IgG — через неделю, a IgM — через 10 дней.

ние плотности раствора регистрируется на спек Уже через 1 ч после начала диффузии можно трофотометре при длине волны 250 нм.

получить линейную зависимость между диамет Различные концентрации ПЭГ (2,5;

3,5;

7 и ром колец преципитации и логарифмом кон даже 10 %) вызывают преципитацию различных центрации. Fahey и McKelvey (1965) предло по молекулярной массе и размерам иммунных жили односуточную инкубацию. В этом случае комплексов. Низкие концентрации ПЭГ осаж линейная зависимость устанавливается лишь дают комплексы крупных размеров, высокие в небольшом диапазоне концентраций.

концентрации вызывают преципитацию низко Однако использование односуточной инкуба молекулярных соединений. 3,5 % ПЭГ флокку ции более удобно в практической работе. Поэ лирует наиболее распространенные «промежу тому все дальнейшее описание метода радиаль точные» комплексы средних размеров.

ной иммунодиффузии относится к этому вари По с у д а и о б о р у д о в а н и е. 1. Про анту.

бирки химические и центрифужные. 2. Пипетки.

Пр и б о р ы и о б о р у д о в а н и е. 1. Стек 3. Центрифуга высокооборотная с ускорением ла 9 X 12 см. 2. П-образная рамка 120Х90Х не менее 2000 g. 4. Спектрофотометр.

X 8 мм и толщиной 1 мм для облегчения заливки Ре а к т ив ы. 1. Буфер боратный 0,1 М, стекла агаром (при определенном навыке агар рН 8,4. 2. Полиэтиленгликоль (мол. м. 6000).

можно заливать непосредственно на стекло).

Ход о п р е д е л е н и я. Готовят 7 % рас 3. Водяная баня на 50—-60 °С. 4. Автомати твор полиэтиленгликоля на 0,1 М боратном ческая пипетка вместимостью 2 мкл или пасте буфере рН 8,4. 200 мкл исследуемой сыворотки ровские пипетки с оттянутым концом. 5. Влаж смешивают с 5 мл боратного буфера указанной ная камера. 6. Измеритель. 7. Миллиметровая концентрации;

4 мл этой смеси приливают к 4 мл линейка.

7 % раствора полиэтиленгликоля (конечная Ре а к т ив ы. 1. Моноспецифические сыво концентрация 3,5 %). Пробирку ставят в холо ротки к иммуноглобулинам А, М и G (выпускают дильник при 4 "С на 18—20 ч. После инкубации в СССР, ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, ИЭМ в смесь центрифугируют при 2000 g 10 мин. Надо г. Горьком и Институте биологических препа садочную жидкость удаляют. Преципитат два ратов им. И. И. Мечникова, Москва). 2. 3 % жды отмывают 3,5 % раствором ПЭГ и раст агар «Дифко» (США) или «Серва» (ФРГ), воряют затем в 5 мл 0,1 н. раствора едкого дальневосточный агар, предварительно очищен натра.

ный ' в 0,2 М вероналовом буфере, рН 8,56.

Уровень циркулирующих иммунных комплек Навеску 3 г сухого очищенного агара заливают сов (ЦИК) измеряют на спектрофотометре при 50 мл дистиллированной воды и ставят на не 280 нм и выражают в единицах оптической большой огонь, постоянно помешивая в течение плотности.

40 мин, затем добавляют 50 мл 0,2 М веронало Учитывают только те показатели, которые вого буфера рН 8,56 и доводят на огне до пол превышают величину X + 2S здоровых лиц.

ного растворения агара (не доводить до кипе ния! ). Добавляют 2 мл 1 % раствора мертио лата. 3. Вероналовый буфер 0,2 М, рН 8, 6.4.3. Иммунные глобулины (5,52 г веронала растворяют в 300 мл дистилли рованной воды, постоянно перемешивая при Одномерная радиальная иммунодиффузия в нагревании, добавляют 35,04 г мединала;

дис агаровом геле для определения иммуноглобу- тиллированную воду добавляют до 1 л при ох линов. Пр и н ц и п. Антиген, внесенный в лунку лаждении раствора до 20 °С). 4. Окрашива агарового слоя, содержащего специфические ющая жидкость: амидо-черный — 1 г, ледяная антитела, диффундируя в агаре, образует коль- уксусная кислота — 100 мл, дистиллированная цо преципитации. Диаметр колец увеличивается вода — до 1000 мл. Профильтровать. 5. Отмыва до тех пор, пока весь внесенный в лунку антиген ющая жидкость: ледяная уксусная кислота — не будет связан содержащимися в геле анти- 70 мл, дистиллированная вода — до 1000 мл.

толами. Величина преципитата отражает коли чество антител в геле, эквивалентное концентра ции антигена, внесенного в лунку. Площадь См. с. 298.

Ход о п р е д е л е н и я. Т е х н и к а по- на расстоянии 15 мм друг от друга. Для того с т а н о в к и о п ыт а. Т и т р о в а н и е ан- чтобы предотвратить деформацию периферичес т и с ыв о р о т к и и в ыбо р р а б о ч е г о ких колец, особенно IgM, за счет подсыхания р а з в е д е ни я. Берут две стеклянные пласти- агара и появления эндоосмотических потоков ны 9X12 см, одна из которых смазана гидро- делают по периметру агара дополнительные фобной жидкостью (например, ГК.Ж-94), дру- лунки. Готовят разведения стандарта, меняя пи гая — тонким слоем агара (каплю горячего ага- петки после каждого разведения. Для исследо ра растирают на пластине пипеткой, а пластину вания сывороточных иммуноглобулинов исполь прогревают над пламенем). Между этими плас- зуют стандартную сыворотку (см. ниже), нераз тинами устанавливают П-образную рамку тол- веденную и разведенную до 1:2—1:8. В лунки щиной 1 мм и всю систему скрепляют зажи- микрошприцем вносят по 2 мкл каждого разве мами. Готовят ряд разведений антисывороток дения и испытуемых препаратов. Пластины по на 0,1 М веронал-мединаловом буфере, рН 8,6. мещают во влажную камеру и инкубируют сутки Так, для исследования сывороточных иммуно- при 4 °С. Через 24 ч (ровно!) пластины погру глобулинов разведения выпускаемых в насто- жают в забуференный изотонический раствор ящее время антисывороток могут колебаться натрия хлорида и отмывают от несвязавшихся белков в течение 2 сут с троекратной сменой от 1/10 до 1/60.

Пробирки, содержащие по I мл каждого буфера. Затем пластины сушат под фильтро разведения антисыворотки, помещают в водя- вальной бумагой и окрашивают амидо-черным.

ную баню при 56 °С и добавляют в них по 1 мл Учет результатов возможен в неокрашенных растопленного и охлажденного до 56 °С 3 % ага- пластинах на темном поле с косым освещением, ра '. Смесь агара и антисыворотки хорошо пере- при этом используют для измерения препарато мешивают и быстро выливают в пространство водитель с нониусом, позволяющим измерить между пластинами, держа последние под углом диаметр с точностью до 0,1 мм.

так, чтобы в них не попали пузырьки воздуха. Определив диаметр колец преципитации Начинают с большего разведения антисыворот- в стандартном препарате с известным уровнем ки, добавляя каждое последующее разведение иммуноглобулинов, строят кривую на полулога после застывания предыдущего. На пластине рифмической бумаге, где на оси ординат откла можно разместить 4 ряда смеси агара с анти- дывают концентрацию иммуноглобулинов, а на сывороткой в объеме 2 мл каждое. После засты- оси абсцисс — диаметр колец. Такую кривую вания последнего ряда агара снимают зажимы, строят для каждой пластины. Далее, измерив рамку и пластинку, смазанную гидрофобной диаметр колец в испытуемом препарате, опре жидкостью. В каждом ряду, соответствующем деляют по стандартной кривой концентрацию разведению антисыворотки, пробойником дела- иммуноглобулинов в этом препарат.

ют лунки, куда с помощью микрошприца до- Ч у в с т в и т е л ь н о с т ь ме т ода. Чув бавляют разведения стандартного препарата ствительность метода характеризуется тем мини в объеме 2 мкл. Через сутки инкубации при мальным количеством антигена, который доста 1 С, оценивают результаты. Рабочим разведе- точен для образования измеримого диска пре нием антисыворотки для каждой системы (для ципитации. Это количество различно для разных исследования сывороток, секретов и др.) нужно белков и зависит от молекулярной массы анти считать максимальное разведение антисыво- гена. По данным Манчини, для альбумина таким ротки, дающее со стандартом четкие кольца пределом является 1,25 мкг/мл. По данным преципитации, интенсивность которых доста- Е. В. Чернохвостовой, при использовании вари точна для их измерения. анта с односуточной инкубацией предельной Ко л и ч е с т в е н н о е о п р е д е л е н и е концентрацией для IgQ и IgA является 40— и м м у н о г л о б у л и н о в в и с п ы т у е м ы х 50 мкг/мл, для IgM — 150 мкг/мл. Вместе с тем п р е п а р а т а х. Растопленный и нагретый до пределы чувствительности метода радиальной 56 °С 3 % агар в объеме 4 мл смешивают с рав- иммунодиффузии в геле можно расширить, ным объемом антисыворотки, разведенной веро- увеличивая диаметр колец преципитации. С этой нал-мединаловым буфером 0,1 М до '/2 рабочего целью можно пользоваться вместо агара 0,8 % разведения. Эту смесь в объеме 8 мл заливают агарозой или ацетат-целлюлозой. Наиболее про в пространство между двумя пластинами, как стым и распространенным методом является описано выше (см. «Титрование антисыворо- разведение антисыворотки, поскольку при разве ток»). Пластины с залитой смесью оставляют дении антисыворотки увеличивается площадь на 10 мин при комнатной температуре. После геля, содержащего антитела, которые необхо застывания смеси агара с антисывороткой сни- димы для связывания данного количества анти мают зажимы, рамку и пластину, смазанную гена, т. е. увеличивается размер преципитата.

гидрофобной жидкостью. На каждой пластине пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм Приведена концентрация, пригодная для большинства серий агара. Для разных серий необходимая концентрация агара устанавлива ется эмпирически.

Т а б л и ц а 45. Содержание иммуноглобулинов в стандартных препаратах ВОЗ и Института эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР IgG IgM IgA МЕ/мл мг/мл1 МЕ/мл мг/мл' МЕ/мл мг/мл ВОЗ (67/97) 96,2 8,04 93,5 1,42 96,2 0, Институт им. Га малея 143,5 11,52 126,6 1,8 144,0 1, Уровень иммуноглобулинов в весовых единицах — средний уровень, полученный в 10 лабора ториях с разными реферанс-антигенами.

Уровень иммуноглобулинов в стандарте Института им. Н. Ф. Гамалеи получен при сравне нии со стандартом ВОЗ.

Однако с разведением антисыворотки умень- ошибка метода увеличивается до 10 %. При шается плотность преципитата и необходимы этом в зависимости от природы антигена и кон дополнительные изменения методики для того, центрации антисыворотки меняется наклон стан чтобы этот преципитат можно было измерить. дартной кривой, что также отражается на вос Так, можно усилить интенсивность колец окра- производимости метода. При определении IgM, шиванием их амидо-черным или нигрозином дающего наименьшие кольца преципитации и с ледяной уксусной кислотой. Плотность преци- наиболее крутую стандартную кривую по срав питата можно повысить также с помощью ряда нению с другими иммуноглобулинами, ошибка копреципитирующих факторов. Например, нор- определения составляет 13 %, а при определе мальная кроличья сыворотка, используемая вме- нии IgG — 10 %.

сто буфера для разведения антисыворотки, бу- Ст а н д а р т и т р е б о в а н и я к не му.

дет включаться в комплекс антиген — антитело, Одним из важных условий количественного оп усиливая плотность преципитата. Аналогичный ределения иммуноглобулинов является правиль эффект оказывает дополнительная обработка ный выбор стандарта, по которому строится пластин антиглобулиновой сывороткой: пласти- калибровочная кривая. Такой стандарт должен ны после инкубации и отмывки погружают быть единым, чтобы можно было сравнивать в раствор антисыворотки, содержащей антитела результаты, полученные в разных лаборато к глобулину сыворотки, включенной в агар;

риях.

спустя сутки кольца преципитации можно уви- Использование очищенных иммуноглобули деть в неокрашенных пластинах. нов в качестве такого референс-препарата неце Наиболее эффективным способом повышения лесообразно, во-первых, потому, что очищенные чувствительности метода радиальной иммуно- белки менее стабильны при хранении и, во-вто диффузии является использование меченной 131 1 рых, потому, что при выделении иммуноглобу антисыворотки. В этом случае агар можно линов возможны изменения их структуры (рас смешивать с антисывороткой, меченной 131 1 в та- щепление, агрегирование и т. п.) и, следователь ком разведении, что кольца преципитации ви- но, антигенных и диффузионных свойств. Неже зуально не обнаруживаются, учет результатов лательно также использовать в качестве стан возможен лишь при авторадиографии. Возмож- дарта сыворотки больных парапротеинемически на и другая модификация этого метода — обыч- ми ретикулезами, так как содержащиеся в таких ная постановка радиальной иммунодиффузии со сыворотках IgG и IgM структурно отличаются столь высокими разведениями антисыворотки, от нормальных иммуноглобулинов. Наиболее что кольца преципитации визуально не выявля- целесообразно использовать в качестве стан ются. Последующая обработка такой пластины, дарта нормальную человеческую сыворотку или меченной 131 1 антисывороткой к глобулину сы- плазму.

воротки, включенной в агар, и авторадиогра- Отделение биологической стандартизации фия повышают чувствительность реакции в 32— Национального института по медицинским ис 64 раза. следованиям в Лондоне выпустило такой стан В о с п р о и з в о д и м о с т ь ме т о д а ра- дарт. Он представляет собой плазму 465 здоро диальной иммунодиффузии определяется дли- вых взрослых мужчин-доноров, проживающих тельностью инкубации и наклоном стандартной в Англии. Часть этого препарата была исполь кривой. Если результаты учитывают после пре- зована ВОЗ как международный стандарт им кращения роста колец, когда между всеми кон- муноглобулинов G, А, М человека.

центрациями антигена и площадью соответст- В СССР стандартная сыворотка для коли вующих им преципитатов устанавливается ли- чественного определения иммуноглобулинов ме нейная зависимость, то ошибка метода состав- тодом радиальной иммунодиффузии выпуска ляет 2 %. При более короткой инкубации, когда ется Институтом эпидемиологии и микробио линейная зависимость между концентрацией ан- логии им. Н. Ф. Гамалеи (Москва) и Горьков тигена и диаметром колец устанавливается ским институтом эпидемиологии и микробиоло лишь в небольшом диапазоне концентраций, гии (табл. 45, 46).

Та б л ица 46. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке здоровых людей в зависимости от возраста, мг/100 мл Имму- Колебание 1 — 15 4-6 7—12 13— 24— 4-5 6-8 9—11 12— Взрос ногло- сут — показателей сут мес мес 24 мес 36 мес лет лет лет 16 лет лые булин 3 мес IgG Верхний предел 1268 656 693 1199 1250 1185 1418 1432 4746 1432 Среднее геометри ческое 852 390 392 638 789 822 883 967 945 944 Нижний предел 572 232 222 339 498 570 550 653 625 604 Верхний предел 69 151 161 205 207 280 313 461 469 IgM Среднее геометри ческое 23 71 77 85 124. 143 182 218 258 Нижний предел 8 33 37 35 74 73 106 103 142 Верхний предел 94 107 150 157 188 128 138 164 143 160 Среднее геометри ческое 11 49 85 95 92 80 84 102 93 91 Нижний предел 1 22 49 58 47 49 51 63 61 51 IgA Выпускаемые стандарты следует использо- При некоторых заболеваниях повышение вать как референс-препараты для калибровки уровня IgM сопутствует хронизации процесса.

собственного рабочего стандарта, в качестве Уровень сывороточного IgG колеблется в очень которого может быть использована любая смесь широких пределах при разных заболеваниях.

свежих сывороток от здоровых доноров. Рабочий Повышение его чаще сопутствует активности стандарт следует сохранять при низкой темпе- процесса. В клинической практике интерпрета ратуре (— 20 °С и ниже) либо в лиофилизиро- ция результатов исследования иммуноглобули ванном состоянии. нов должна осуществляться в комплексе с кли Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Относи- ническими данными, результатами других имму тельная простота исполнения, доступность реак- нологических показателей.

тивов способствовали широкому внедрению ме- Определение иммуноглобулинов в других, не тода в клиническую практику. Однако данные жели сыворотка, биологических жидкостях име литературы и наш собственный опыт работы ет большую диагностическую информативность.

Уровень иммуноглобулинов мочи позволяет быть этим методом с сыворотками самых различных больных в течение более 10 лет позволяют реко- более объективным в оценке активности почеч мендовать ограничение применения этого мето- ного процесса и глубины поражения клубочко да довольно узким спектром нозологических вого аппарата. Появление IgM в моче крайне форм. В первую очередь речь идет о диагности- редко и наблюдалось только в тяжелых случаях ке заболеваний, сопровождающихся синтезом волчаночной нефропатии и при амилоидозе. Со моноклоновых парапротеинов. Метод радиаль- держание иммуноглобулинов в бронхоальвео ной иммунодиффузии выступает в данной ситу- лярной жидкости при фиброзирующем альвео лите коррелирует с глубиной морфологических ации скрининговым методом, представляющим патологическую сыворотку для детального ана- изменений альвеолярной мембраны. Уровень лиза в иммуноэлектрофорезе и др. Высока диаг- IgG в желчи позволяет дифференцировать воспалительные заболевания желчевыводящих ностическая информативность метода в оценке первичных и вторичных иммунодефицитов, про- путей. Большую роль в диагностике заболеваний являющихся блокированием синтеза или врож- женской половой сферы, изучении причин бес денным отсутствием отдельных классов иммуно- плодия играет характеристика иммуноглобули глобулинов или их всех — тип Брютона. Высо- нов в шеечном секрете (шеечный фактор).

кое содержание сывороточных иммуноглобули Ли т е р а т у р а. Малкина Л. А., Шахани нов А, М, G наблюдается при системной красной на К. Л.— Журн. микробиол., 1975, № 3, с. 33;

волчанке, болезни Шегрена, хроническом актив Стефани Д. В. Иммунология детского возра ном гепатите, ювенильном ревматоидном артри ста.— м., 1981;

Чернохвостова Е. В. Количест те. Причину повышения уровня иммуноглобу венное определение иммуноглобулинов методом линов отдельных классов в каждом конкретном радиальной иммунодиффузии в геле: Методи случае необходимо анализировать отдельно и ческие рекомендации.— М., 1975;

Fahey 1., редко можно связать с определенным заболева McKelvey E. J. Immunology, 1965, vol. 94, p. 84— нием;

например, повышение уровня IgA патогно 102.

монично для особой формы геморрагического нефрита, при поражениях печени алкогольной 6.4.4. Альфа-фетопротеин природы, неспецифическом язвенном колите.

Высокие значения IgM характерны для ревма тоидного артрита, особенно в начальном, труд- Двухмерная иммунодиффузия в геле.

ном для диагностики, периоде заболевания, при Пр и н ц и п и в о з мо жн о с т и метода.

обострении системной красной волчанки. Исследуемые объекты, содержащие антигены и ан Рис. 10. Схема постановки метода двойной диффузии в геле для определения а-фетопротеина.

a схема стандартного штампа: диаметр периферических лунок 4 мм. радиус центральной лунки 9 мм;

б — типы реакций;

R - - схема постановки опыта;

AT — кроличья моноспенифическая антисыворотка против а-фетопротеина человека;

АГ — а-фетонротеин;

1,2,3,4 — испытуемые сыворотки;

ИР — изотонический раствор хлорида натрия.

титела, помещенные в гель, диффундируют в его Ре а к т и в ы. 1. Агар (очищенный и гото толще и, взаимодействуя друг с другом, обра- вый к употреблению). 2. 0,85 % раствор хлорида зуют в зоне эквивалентных количественных со- натрия, забуференный вероналовым буфером отношений преципитаты (рис. 10). (на 85 мл изотонического раствора хлорида Метод обладает высокой специфичностью, натрия 15 мл буфера, рН 8,4—8,6) -до рН 7,0— чувствительностью и разрешающей способно- 7,2 с консервантом (мертиолат 1:10000).

стью. Простота исполнения метода позволяет Ход о п р е д е л е н и я. Подготовка имму воспроизвести его в любых лабораториях. Двух- нодиагностикума: содержимое ампул растворя мерная иммунодиффузия в геле позволяет не ют в изотоническом растворе хлорида натрия только и (учить композицию биологических мате- (объем растворителя указан на этикетке ампу риалов, ни и качественно и количественно оха- лы). Получают слегка опалесцирующий рас рактеризовать примеси в высокоочищенных твор.

(с химической точки зрения) препаратах. Ис- По с т а н о в к а и у ч е т р е а к ц и и. Чи пользуя возможности качественного анализа ме- стую стеклянную камеру подсушивают, проведя тода, можно выявить минимальные антигенные ее несколько раз над пламенем горелки, и поме различия двух сравниваемых систем (например, щают на горизонтальную поверхность. В камеру появление в сыворотке или экскретах больных заливают 23 мл расплавленного 1 % прозрач белков с измененными антигенными свойст- ного агара Дифко на изотоническом растворе вами). Характеризуя количественные сторо- хлорида натрия рН 7,0—7,2, с мертиолатом ны компонентов системы, метод позволяет про- 1:10 000 и закрывают покровным стеклом. Через извести расчеты эквивалентных соотношений 30—40 мин в застывшем агаре просекают кон антигена и антител, без чего невозможен туры лунок стандартным штампом. Агаровые квалифицированный анализ специфически пробки отсасывают с помощью трубки, диаметр взаимодействующих белковых компонентов во которой на 2,5—3 мм меньше диаметра трубок всех методах, в основе которых лежит фено- штампа, и получают лунки с ровными краями.

мен преципитации: от одномерной диффузии В каждой камере можно отштамповать 6 фигур в геле до радиоиммунологического ана- и провести анализ 12 испытуемых сывороток.

лиза. В центральную лунку фигуры заливают AT, Определение антигена первичного рака пе- а в две периферические, противоположные друг чени и тератобластом в сыворотке и асцити- другу, лунки — AT иммунодиагностикума. Ос ческой жидкости. Пр и н ц и п. Моноспецифи- тавшиеся четыре боковые лунки заливают испы ческая антисыворотка, помещенная в лунку туемыми сыворотками и изотоническим раство агарового геля, диффундирует в нем. При нали- ром хлорида натрия. Реагенты вносят капил чии в исследуемой сыворотке или асцитической лярами в лунки вровень с поверхностью агара.

жискости специфического эмбрионального анти- После заполнения лунок реагентами плекси гена альфа-фетопротеина АФ11 — маркера пер- гласовую поверхность камеры смазывают тон вичного (но не вторичного или метастатичес- ким слоем технического вазелина, камеру закры кого) рака печени или тератобластомы, он (ан- вают стеклянной пластинкой и оставляют при гигеи) образует в зоне эквивалентных коли- комнатной температуре на 24—48 ч. Перед честв четкий преципитат с антителами антисы- регистрацией результатов открытую камеру ре воротки. комендуется поместить на 1 ч в 10 % раствор Пр и б о р ы и о б о р у д о в а н и е. Стан- NaCl. Такая обработка способствует исчезно дартный набор иммунодиапюстикума (ИЭМ им. вению непрозрачных ореолов вокруг лунок с ис Н. Ф. Гамалеи, Москва) в комплекте со штампом пытуемыми сыворотками, затрудняющих учет для пробивания лунок. результатов.

Р е з у л ь т а т ы р е а к ц и и оценивают по и последующее снижение (!) уровня антигена плюсовой шкале. Реакцию считают положитель- в отличие от гепатомы, когда происходит неук ной, если линия преципитации иммунодиагнос- лонное нарастание титров. В редких случаях тикума сливается с линией преципитации, обра- острого алкогольного гепатита можно выявить зованной антигеном испытуемой сыворотки и ан- антиген. В подобных ситуациях нарастание тит тителами иммунодиагностикума. В зависимости ров АФП отражает, по всей вероятности, актив от места слияния полос реакцию считают: слабо- ность процессов регенерации печеночной парен положительной ( + ). если слияние полос наблю- химы. Иными словами, АФП выступает здесь дается у лунки с испытуемой сывороткой. Со- как косвенный признак цирротической перест держание альфа-фетопротеина в сыворотке ройки органа. Наличие антигена в околоплод больного меньше 50 мкг/мл;

положительной ных водах беременных — достоверный признак ( + +), если линии преципитации иммунодиаг- тяжелого врожденного уродства плода, позво ностикума и испытуемой сыворотки находятся ляющий рекомендовать прерывание беремен на одинаковом расстоянии от центральной лун- ности. Появление альфа-фетопротеина в сыво ки. Содержание альфа-фетопротеина в сыво- ротке беременных женщин во II и III триме ротке больного 50 мкг/мл;

резко положитель- стре — физиологическое явление: проникнове ной (+ + +), если линия преципитации испы- ние эмбрионального антигена в кровоток бе туемой сыворотки диффузна и сдвинута в сто- ременной.

рону центральной лунки, а линия преципита- Приведенные факты свидетельствуют о необ ции иммунодиагностикума резко загибается ходимости повторных исследований материала в месте слияния с линией преципитации сыворот- при выявлении АФП.

ки больного. В некоторых случаях, когда реак Ли т е р а т у р а. Абелев Г. И. и соавт.— ция идет в сильном избытке антигена, содержа Биохимия, 1963, т. 28, № 4, с. 625—634;

Абе щегося в испытуемой сыворотке, линия преци лев Г. И. и соавт.— Бюл. экспер. биол. мед., питации этого антигена с антисывороткой не об 1971, № 76, с. 475;

Наставление по применению разуется, а линия преципитации иммунодиагно иммунодиагностикума для первичного рака пе стикума резко обрывается. При таком типе реак чени (ПРП) и тератобластом (ТБ).—М., 1977;

ции содержание альфа-фетопротеина в сыво Татаринов Ю. С.— Вопр. мед. химии, 1964, т. 10, ротке больного больше 50 мкг/Мл. В этих слу № I, с. 90—91.

чаях необходимо повторно поставить реакцию с разведенной испытуемой сывороткой и уста новить идентичность выявляемого антигена 6.4.5. Парапротеины альфа-фетопротеину иммунодиагностикума;

от рицательной (—), если линия преципитации Иммуноэлектрофоретический анализ.

иммунодиагностикума достигает своими кон- Пр и н ц и п. Белки исследуемой биологической цами лунок с испытуемыми сыворотками, так среды, предварительно разделенные в электри же как и лунок с изотоническим раствором ческом поле в соответствии с электрическим хлорида натрия. зарядом и подвижностью, зависящей от величи Диагностическими считают все три описан- ны заряда, градиента потенциала и свойств ных типа положительных реакций. среды-носителя, проявляются в реакции преци В редких случаях сыворотки больных дают питации с антисывороткой, содержащей специ неспецифическую реакцию с компонентами им- фические антитела к исследуемым антигенам.

мунодиагностикума. Как правило, это широкий Метод обладает высокой разрешающей спо диффузный преципитат, который образуется при собностью, несложен в исполнении. Он позво взаимодействии испытуемой сыворотки как с ан- ляет получить представление об относительной тисывороткой, так и с антигеном иммунодиаг- концентрации компонентов в системе, опреде ностикума. Принципиальное отличие неспецифи- лить индивидуальный антиген, не выделяя его ческой реакции от специфической заключается из смеси. Изменение физических свойств одного в том, что образующийся преципитат никак не из компонентов, ведущих к отклонениям в имму связан со специфической линией преципитации нологической специфичности, как это наблюда иммунодиагностикума: он либо пересекает спе- ется при гаммапатиях, четко выявляется при цифическую линию преципитации, либо образу- использовании иммуноэлектрофоретического ется независимо от нее. При обработке 10 % анализа.

раствором NaCI неспецифический преципитат По с у д а и о б о р у д о в а н и е. 1. Прибор исчезает совсем или заметно ослабляется. для электрофореза ПЭФ-3, выпускаемый заво Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Выявление дом «Физприбор» в г. Фрунзе, или для иммуно альфа-фетопротеина — высокоинформативный электрофореза УЭФ, выпускаемый эксперимен тест в диагностике гепатом. Он позволяет также тальными мастерскими Института физиологии дифференцировать первичные и вторичные гепа- им. А. Богомольца в г. Киеве. 2. Стекла 9Х 12 см.

томы, установить этиологическую причину опу- 3. Пробойник лунок диаметром 1,5 мм. 4. Нож холи яичка. Однако в определенных ситуациях для прорезания траншей в агаре. 5. Водяная антиген может появляться в сыворотке или баня. 6. Эксикатор. 7. Бачки для окрашивания других биологических жидкостях вне связи с ге- стекол с агаром и для последующего отмывания.

патомой или тератобластомой. АФП нередко Ре а к т и в ы. 1. Агар-агар. 2. Вероналовый и в высоких титрах может быть обнаружен буфер 0,05 М, рН 8,6, ионная сила 0,1 (0,05 М при остром гепатите А. Но при этом заболевании раствор веронала натрия, 0,01 М раствор диэ повторные исследования выявляют нарастание тилбарбитуровой кислоты и 0,05 М раствор ацетата натрия). 3. Краситель (амидо-черный Добавляя к надосадочной жидкости 0,2—0, или кислотный сине-черный). Антисыворотки: объема горячего спирта, получают белый хло а) поливалентная к сывороточным белкам чело- пьевидный осадок, хорошо формирующийся при века;

б) моноспецифические антисыворотки к стоянии при 37 °С. Большую часть опалесциру различным классам иммуноглобулинов;

в) анти- ющей надосадочной жидкости удаляют водо сыворотки к легким цепям типа каппа (х) и струйным насосом, а остаток — центрифуги ламбда (А.). Все перечисленные сыворотки вы- рованием. Осадок промывают абсолютным спир пускаются в СССР. том, сушат при 37 °С и растирают. Получают Ход и с с л е д о в а н и я. I. Пр и г о т о в - белый порошок, который хорошо сохраняется л е н и е а г а р а : предпочтительнее использо- в закрытых банках. Подобный порошок очень вать готовый к употреблению очищенный и лио- удобен для приготовления любых концентра филизированный бактоагар фирмы «Дифко» ций геля, прозрачен, пригоден для разделения (США) или «Серва» (ФРГ). Если таковых крупномолекулярных белков.

нет, можно с успехом применять дальневосточ П. З а л и в к а п л а с т и н. Стеклянные ный агар-агар (зарубежные авторы рекомен пластины 9 X 12 см (можно использовать фото дуют аналогичный дальневосточному японский графические стекла), тщательно вымытые и агар-агар) после предварительной обработки.

обезжиренные, заливают 1 % раствором агара Предлагаем несколько способов очистки на вероналовом буфере при 45 °С. Стекла пред агара.

варительно укладывают на столик с горизон Способ Клаузена [Clausen, 1970]. Агар тальным уровнем. Для образования слоя агара предварительно отмывают в проточной водопро толщиной 1 мм на пластину достаточно 10 мл водной воде. После этого набухший агар, отжа раствора агара. Для разливки агара удобно тый от излишков воды, растворяют при 90 °С использовать мерную пипетку вместимостью в дистиллированной воде, добавленной из рас 10 мл, предварительно прогретую. Для образо чета 10 % (по массе или объему) раствора.

вания ровного слоя геля, избежания неравно К раствору добавляют безводный хлорид каль мерного его подсыхания и засорения поверх ция из расчета 10 г на 100 г агара для осаждения ности стекла с агаром необходимо закрыть ко примесей. Горячий агар фильтруют через капро нической крышкой (чтобы образующийся кон новое сито или фильтр со стекловатой. После денсат не стекал на агар).

застывания его режут на маленькие блоки и по мещают в широкий сосуд, закрытый капроновой III. По д г о т о в к а а г а р о в о й пла сеткой, и ставят на 3 дня под проточную водо с т и н ы для п р о в е д е н и я и м м у н о проводную воду, а затем в течение 2 дней промы э л е к т р о фо р е т и ч е с к о г о а н а л и з а.

вают дистиллированной водой, 5 раз меняя воду, Исследуемый материал (сыворотка, моча, ла взятую в 1000-кратном объеме к объему блоков.

важная жидкость, околоплодные воды и т. д.) После этого агар вновь расплавляют и фильт помещают в лунки и подвергают электрофорети руют через капроновое сито. Растворы очищен ческому разделению. По окончании электрофо ного агара в буфере с добавлением мертиолата реза вырезают траншею, куда вносят соответст 1:100000 готовят из расчета первоначальной вующую целям исследования антисыворотку.

(взятой в обработку) массы или объема агара сырца. Готовый агар разливают в маленькие Для исследования парапротеинов в сыворот флаконы, объем которых достаточен для разо- ке больных применяют лунки диаметром 2 мм вого использования, и хранят в холодильнике на расстоянии 3 мм от траншеи, ширина которой при температуре от 4 до 6 °С. составляет 2 мм и длина 60 мм. Однако необхо Специальный метод очистки агара [Гра- димо помнить, что в зависимости от концентра бар П., Буртэн П., 1963]. В большой сосуд ции антигена и титра антител антисыворотки (вместимостью 25 л) помещают около 500 г расстояние лунки от траншей может изменять сухого волокнистого агара и промывают не ме- ся, его подбирают опытным путем (пробивают нее 1 ч проточной водой при 50 °С и столько же ряд лунок от минимального приближения к времени дистиллированной водой при той же траншее 1 мм, до максимального удаления — температуре. Затем агар быстро расплавляют 10 мм). Выбирают то расстояние, которое обес на водяной бане так, чтобы получился 3 % рас- печило наиболее «контрастный» преципитат.

твор в дистиллированной воде. К этому раствору Лунки пробивают пробойником соответству добавляют активированный уголь (1 г на 1 л) ющего диаметра, а затем агаровую пробу уда и центрифугируют 5 мин при 60 °С. Полученной ляют при помощи водоструйного насоса. Иссле прозрачной жидкости дают застыть. Гель разре- дуемую сыворотку вносят в лунку пастеровской зают на мелкие кусочки и оставляют при — 10 °С пипеткой. Наполнение лунки контролируют по до полного замерзания. После оттаивания гель исчезновении блика (не переливать!). Заполне отжимают в марле. Волокнистый отжим отмы- ние лунки требует определенного навыка. Нали вают дистиллированной водой и снова отжи- чие автоматической пипетки значительно упро мают, затем расплавляют и смешивают с равным щает технику внесения образца и повышает исходным объемом 0,85 % раствора хлорида стандартизацию исследования.

натрия. К охлажденному до 65 °С раствору по- Лунки наносят по вертикальной оси стекла, степенно добавляют горячий спирт до появления желательно по трафарету, стабилизирующему осадка (обычно бывает достаточно 1,1 объема их положение на стекле относительно полюсов спирта). Этот первый осадок после центрифуги- и пробиваемых после проведения электрофореза рования при той же температуре отбрасывают.

траншей. Число лунок определяется количеством ныявляемых параметров: общая характеристика иммунологической специфичности сывороточных белков с поливалентной антисывороткой, с моно специфическими антисыворотками к иммуногло булинам А, М, G, к легким цепям каппа и ламб да (у. и Л).

Пр о в е д е н и е э л е к т р о фо р е з а.

Электролитные ванны прибора заполняют бу ферным раствором (катодная и анодная ван ны — одинаковым количеством раствора). Перед использованием необходимо проверить рН буфе ра. Учитывая, что в анодной ванне во время электрофореза происходят интенсивные процессы гидролиза, может меняться рН и ионная сила, необходимо смешивать катодный и анодный ра створы по окончании процедуры.

Стекла с агаром и нанесенными образцами соединяют с электродными кюветами при помо щи нескольких слоев фильтровальной бумаги.

Толщина слоя контактных полос, плотность при легания бумаги к плоскости агара могут изме нять величину силы тока. Наилучшее разделение фракции получают при величине подаваемого на агаровую пластину потенциала 9 В/см по оси электрофореза (I = 40—50 мА) в течение 3—4 ч.

Контроль за скоростью миграции можно осу ществлять, наблюдая движение «тени» альбу мина при боковом освещении агаровой пластины или используя «свидетель-краситель», скорость движения которого равна скорости миграции альбумина (пиронин).

По окончании электрофореза в агаровой пла стине вырезают траншеи в соответствии с тра фаретом (размеры траншеи указаны выше) и задачами исследования. Пластины с заполнен ными антисывороткой траншеями помещают во влажную камеру, в качестве которой удобнее всего использовать эксикатор с небольшим коли- Рис. 11. Определение типа парапротеинов и чеством воды. Появление полос преципитации белков Бенс-Джонса. Контроль специфичности отмечается уже на вторые сутки. Полностью антисывороток после адсорбции.

взаимодействие белков, диффундирующих из В траншеях — антисыворотка к л-цепи;

в лунках:

траншеи с антигенами, расположенными по оси 1 — нормальная человеческая сыворотка;

2 — моче вой концентрат, содержащий белок Бенс-Джонса электрофореза, заканчивается на 4—5-е сутки.

х-типа;

3 — мочевой концентрат, содержащий белок Достаточно четкие полосы преципитации позво Бенс-Джонса Я-типа;

4 — препарат очищенного ляют анализировать нативные препараты. При lgGx-типа в концентрации 0,1 %;

5 — препарат очи необходимости их можно окрасить. Для эффек щенного lgG?.-типа в концентрации 1 %.

тивного окрашивания все белки, не участвующие в специфической реакции, удаляют, промывая пластину в течение 2—3 дней изотоническим раствором, который несколько раз меняют. По окончании промывания гель накрывают смочен ной в дистиллированной воде фильтровальной пленку. Высыхая, агар полностью сохраняет всю бумагой (можно положить небольшой груз) и картину преципитации, плотно прилипает к оставляют сохнуть при 37 °С или комнатной тем- пленке и может быть сфотографирован или со пературе. Когда гель высыхает и превращается хранен как документ.

в присохшую к стеклу пленку, бумагу легко уда- Анализ преципитационных дуг проводят в ляют с его поверхности. Высушенную пластину соответствии со схемой постановки, т. е. учета помещают в кювету с красителем следующего специфичности антисыворотки в траншеях и состава: амидо-черный В — 1 мл, уксусная кис- взаимного их расположения с лунками, содер лота — 450 мл, 0,1 М ацетат натрия — 450 мл, жащими антиген. Примерная схема расположе глицерин — 100 мл. Окрашивание продолжают ния лунок и траншеи при исследовании парапро в течение 3—4 ч. После этого пластины извле- теина типа Бенс-Джонса представлена на кают и помещают в кюветы с отмывающей жид- рис. 11.

костью — 2 % уксусной кислотой, содержащей При исследовании парапротеинов сыворотки 10—15 % глицерина. Обработанную подобным типа Q в лунку помещают цельную сыворотку.

образом агаровую пластину легко снимают со В траншеи заливают антисыворотки к легкой стекла и переносят на отмытую рентгеновскую цепи, соответствующей типу исследуемого G-na Рис. 12. Различное расположение парапротеинов типа IgG по отношению дуги IgG (по Fauvert et al., 1962, 1978).

рапротеина. Образуется так называемая мие- клональных макроглобулинов необходимо иссле мая линия преципитации («ложкообразный» довать разведенные сыворотки, так как в про преципитат) с утолщением в одном ограничен- тивном случае линия нормального IgG мешает ном участке, идентичная по форме линии, обра- титрованию.

зующейся с антисывороткой к IgG. Моноклоно- Особого методического подхода требуют дру вость парапротеина и нередко высокая его кон- гие источники антигенов, подвергаемые имму центрация обусловливают плотность преципи- ноэлектрофоретическому анализу. Все они, и тата и приближенность его к траншее. Чувстви- моча, и промывные воды бронхоальвеолярной тельность метода позволяет рано выявлять син- системы, и цереброспинальная жидкость и др., тезируемый парапротеин. Низкие начальные как правило (исключение составляет моча, со концентрации — «Disglobulinemie mi ni ma» держащая в ряде случаев нефротичеекого синд [Greysel R. et al., 1958]— могут давать измене- рома большие количества белка), имеют низ ние концевого фрагмента дуги в виде утолщения кие концентрации антигенов. Поэтому иммуно или расщепления. электрофоретическому анализу должно пред Схема различных типов преципитатов пара- шествовать предварительное концентрирование протеина представлена на рис. 12. белка в этих жидкостях. Необходимо избирать При иммуноэлектрофоретическом титрова- наиболее щадящий режим концентрации, не нии парапротеинемий другого класса — A, D, Е изменяющий структуры антигена. Наиболее (которые встречаются крайне редко) — и моно- удобным и приемлемым для любых лабораторий можно считать метод испарения под вентилято- (HBsAt) производства ИЭМ им. Н. Ф. Гама ром без нагревания. Быстро и эффективно про- леи. 3. Барбитал-натриевый буфер рН 8,1—8,4:

ходит концентрация через полупроницаемую 8,14 г барбитал-натрия (мединал), 6,48 г аце мембрану (диализный целлофан) в среде высо- тата натрия, 90 мл 0,1 н. НС1, до 1 л дистиллиро комолекулярного полиэтиленгликоля. При нали- ванной воды. Перед использованием буфера чии вакуум-насоса применим метод ультра- необходимо строго контролировать рН и при фильтрации через миллипоровые фильтры или несоответствии указанным значениям (в зависи диализный целлофан. Исчисление степени кон- мости от отклонения) исправлять величину рН центрации можно вести по кратности объемов 0,1 н. НС1 или 0,1 н. NaOH.

(до и после концентрации). Однако более пра- Ход о п р е д е л е ни я. Готовят 1 % агар вильно будет измерение белка в конечном объе- на барбитал-натриевом буферном растворе рН ме, так как это дает возможность произвести 8,1—8,4. Если применяют порошкообразный предварительные расчеты разведений антисыво- очищенный агар, то его растворяют в буферном ротки в тест-системе. Последняя воспроизводит- растворе при постоянном помешивании, нагре ся для каждого типа исследуемого объекта. вая до 90 °С (не доводя до закипания). Гелизи Так, концентрированная моча исследуется в той рованный агар нагревают в стеклянной колбе на же системе, что и сыворотка. Но для лаважной, водяной бане при тех же условиях. 15 мл гото цереброспинальной жидкости, околоплодных вого агара, охлажденного до 45 °С, наливают вод и т. д. необходимо в предварительных опы- на подогретое тщательно обезжиренное стекло, тах по раститровке антисыворотки выбрать наи- уложенное на горизонтальную поверхность. На более оптимальную концентрацию антител. Это крыв конической крышкой, дают застыть гелю.

достигается при использовании метода двойной Затем пробойником наносят 4 ряда лунок по иммунодиффузии по Оухтерлони. вертикальному размеру стекла. Расстояние Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Иммуно- между лунками по вертикали в парных ря электрофоретический анализ позволяет рано вы- дах составляет 8 мм, по горизонтали — явить низкие концентрации парапротеина и точ- 8 мм. Расстояние между парными рядами но их титровать. Выявление парапротеина по- равно 15 мм.

зволяет правильно и своевременно поставить Количество лунок в вертикальном ряду опре диагноз больным и назначить правильную те- деляется числом сывороток, поступивших для рапию. Титрование легких цепей парапротеинов исследования. Для стандартизации постановок позволяет дифференцированно применять тера- удобно использовать трафарет, нанесенный на пию при амилоидозе, нередко сопутствующем миллиметровую бумагу и имеющий размеры парапротеинемиям. Динамическое наблюдение стекла. Накладывая стекло с агаром на трафа за концентрацией парапротеина — объективный рет, можно быстро и точно пробить лунки в тест оценки эффективности применяемой стеро- агаре.

идной или цитостатической терапии.

В первую и последнюю пару лунок капилля ром вровень с поверхностью агара вносят компо Лит е р а т у р а. Иммунохимический ана ненты иммунодиагностикума для контроля ре лиз / Под ред. Л. В. Зильбера.— М.: Медицина, жима опыта. АГ иммунодиагностикума и контро 1968 г.— 300 с.;

Ваппаров И., Иомтов М., Са лируемые сыворотки вносят в лунки, располо вов С. и др. Диспротеинемия.— София, 1978;

женные на стороне катода. AT иммунодиагно Грабар П., Буртэн П. Иммуноэлектрофорети стикума вносят в лунки, расположенные на сто ческий анализ.— М., 1963.

роне анода. После заполнения лунок стекло по мещают в прибор для электрофореза. На два противоположных края стекла со стороны анода 6.4.6. Поверхностный антиген и катода кладут куски фильтровальной бумаги, гепатита В и антитела к нему сложенные вдвое и смоченные в ацетат-барби таловом буфере. Фильтровальная бумага должна Метод встречного иммуноэлектроосмофореза. закрывать 0,5—1 см поверхности агара и плотно Пр и н ц и п. Метод основан на различной под- к нему прилегать.

вижности антигена и антител в гелевых носите- Свободный конец бумаги опускают в элект лях под воздействием электрического поля. Дви- родный сосуд, в который налит буфер. После жение антигена направлено к положительному включения прибора устанавливают напряжение полюсу — к аноду, антител — к катоду. При 120—160 В, а силу тока устанавливают 30 мА.

взаимодействии антигена и антител к нему по Через 1'/2—2 ч прибор отключают, бумажные фронту встречного движения образуется верти- соединители убирают и учитывают результаты.

кальный преципитат. Вначале проверяют реакцию у контрольных лу Пос у д а и о б о р у д о в а ни е. 1. При- нок. В связи с тем что антитела обладают боль бор для электрофореза ПЭФ-3. 2. Стекла 9Х шей подвижностью, они проходят большее рас Х12 см (очищенные фотопластинки). 3. Про- стояние до взаимодействия с антигеном. По бойники для лунок с внутренним диаметром этому полоса приципитации расположена ближе 3 мм. 4. Водоструйный насос. к лунке с антигеном. Этим она отличается от Ре а к т ив ы. 1. Агар (бактоагар «Дифко», других неспецифических полос, которые могут США;

«Серва», ФРГ, или дальневосточный образовываться при проведении реакции мето агар, очищенный по одному из способов, описан- дом встречного иммуноэлектроосмофореза, так ных выше). 2. Иммунодиагностикум на антиген как в сыворотке человека может присутствовать вирусного гепатита В (HBsAg) и антител к нему несколько преципитирующих систем.

Рис. 13. Схема постановки метода двойной иммунодиффузии в геле для определения антигена вирусного гепатита (HBsAg) и метода встречного иммуноэлектроосмофореза.

1 — схема стандартного штампа для пресечения контура лунок: радиус центральной лунки 8 мм, диаметр периферических лунок — 3 мм;

2 — схема внесения контролируемой антисыворотки: ДП — донорская плазма, АТх — истощенная кроличья антисыворотка;

3 — АГ и AT — антиген и антитела эталонного иммунодиагно стикума. АТх — контролируемая антисыворотка с разным титром AT;

4 — AT и АГ — компоненты эталонного иммунодиагностикума, АТх, АГу, АТу, АГх — компоненты контролируемого иммунодиагностикума серий «х» и «у»;

5 — АГ и AT — компоненты иммунодиагностикума: ИС — исследуемая сыворотка, ИР — изотони ческий раствор натрия хлорида;

6 — схема встречного иммуноэлектроосмофореза: ДТ и АГ — компоненты иммунодиагностикума, ИС|, ИС2, ИСз — исследуемые сыворотки;

а,б,в,г,д — различные типы положительных и отрицательных реакций на HBsAg.

Перед учетом результатов рекомендуется собствует дифференцированию гепатита В от ге пластинку с агаром поместить на 1 ч в 10 % патита А, алкогольного гепатита. Учитывая воз раствор NaCl. можность носительства антигена, необходимо Положительной на присутствие HBs-анти- провести исследование на HBs-антиген донор гена считается та сыворотка, которая с AT им- ской крови. Изучение путей передачи привело мунодиагностикума образует полосу преципита- многих передовых клиницистов к пониманию ции, расположенную ближе к лунке с исследу- необходимости обследования на HBs-антиген емой сывороткой и находящуюся на одной пря- всех пациентов стационаров, с тем чтобы во мой с полосой преципитации контрольных лу- время исключить возможность «шприцевого» нок (рис. 13). гепатита. HBsAg является причиной вспышек При исследовании сывороток для обнаруже- гепатита в отделениях хронического гемодиа ния антител к HBs-антигену реакцию ставят по лиза. Клинически обосновано исследование HBs той же схеме: в лунки, расположенные на сто- антител в сыворотке. Наличие их при отсутствии роне катода, вносят АГ иммунодиагностикума, антигена указывает на возможность секвестри в лунки, расположенные на стороне анода,— рования антигена в иммунных комплексах или контролируемые сыворотки. В верхнюю и ниж- фиксации в тканях. Обосновано определение нюю пару лунок вносят компоненты иммуно- HB Ag не только при установлении этиологи s диагностикума. Специфичность положительных ческой причины заболевания печени, но и при результатов по выявлению антигена и антител системных васкулитах. Так, в 45—60 % случаев в человеческих сыворотках, полученных методом узелкового периартериита реакция на HB,Ag встречного иммуноэлектроосмофореза, следует положительна. Находят этот антиген и при уточнять повторной постановкой в реакции пре- некоторых формах иммунокомплексных ципитации в геле с иммунодиагностикумом на нефритов.

антиген и антитела вирусного гепатита В. Выявление этого антигена представляется К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Поверх- важным именно потому, что современные методы ностный антиген гепатита В — HB -Ag, назван- терапии позволяют элиминировать его и тем s ный после публикации работ Блайберга австра- самым удалить основную причину, вызывающую лийским, является маркером именно этого вида развитие цепи взаимообусловленных патологи гепатита, его этиологической причиной. Выяв- ческих изменений. HB Ag может быть выявлен s ление его имеет диагностическое значение и спо- в тканях, в экссудатах.

Ли т е р а т у р а. Наставление по примене- ния калибровочной кривой. Антиген вносят ав нию иммунодиагностикума на антиген вирусного томатической пипеткой (выпускается в СССР) гепатита В (HBsAg) и антитела к нему (HB At) или микропипеткой в количестве 10 мкл. Под s сухого.— М., 1977;

Руководство по количествен- готовленные таким образом пластины помещают ному иммуноэлектрофорезу / Под ред. Н. Ак- на поверхности столика прибора для электро сельсен, И. Крелль.— М., 1977. фореза. Стекла с агарозой соединяют с элект родными кюветами агарозными пленками с ши риной, равной ширине стекла, и толщиной 3 мм.

6.4.7. Количественный анализ Можно применять и соединительные полоски из антигенов фильтровальной бумаги. Во избежание подсы хания и деформации геля в месте соединения Метод иммуноэлектрофореза в среде, содер- с бумажными полосами последние перед соеди жащей антитела. Пр и н ц и п ме т од а. Ан- нением их с пластинами смачивают в буферном тиген, помещенный в среду агара с антисыворот- растворе. Электрофорез ведут при потенциале кой, образует преципитат, который под дейст- 10 В/см в течение 2—10 ч в зависимости от ха вием электрического потенциала образует петлю рактеристик и количества антигена, взятого в (ракетку), вытянутую по оси электрофореза. определенном отношении к используемой анти Метод практически совмещает в себе описанную сыворотке. Если этот метод применяется для выше радиальную иммунодиффузию и электро- определения иммуноглобулинов в биологических форез. Величина петли преципитата находится жидкостях с исходно низкой концентрацией ан в линейной зависимости от эквивалентной кон- тигена (цереброспинальная жидкость, промыв центрации антигена, связанных антител и гра- ные воды бронхоальвеолярной системы), обычно диента потенциала. Если последняя величина достаточно 2 ч. Электрофорез предпочтительно постоянна, то первая может отражать концент- проводить при внешней температуре 4 °С (в хо рацию внесенного в агар антигена. лодильнике или холодной комнате). Время про По с у д а и о б о р у д о в а н и е. 1. Стек- ведения процедуры лимитируется также высотой лянные пластины 8X12 см. 2. Пробойники для образующихся при реакции пиков.

лунок в агаре с внутренним диаметром 3 мм. После электрофореза гелевые пластины на 3. Водоструйный насос. 4. Прибор для электро- стеклах отмывают в 0,2 М растворе хлорида фореза ПЭФ. 5. Измеритель. 6. Измерительная натрия в течение суток. Затем высушивают и миллиметровая линейка. окрашивают, как это описано выше.

Ре а к т и в ы. 1. Агароза (в СССР выпуска- Пики максимальной миграции комплексов ется заводом химреактивов в г. Олайне). 2. Бар- антиген—антитело измеряют миллиметровой ли биталовый буфер рН 7,4 (ионная сила 0,07) нейкой. Ошибка измерения не должна превы с 2 М лактата кальция. 3. Антисыворотки (к им- шать 0,2 мм при высоте пиков от 2 до 5 см.

муноглобулинам А, М, О, к легким цепям -л и К, Стандартную кривую строят на соотношении к aF-протеину, секреторному IgAS), выпускае- величины пиков и концентраций белка в разве дениях стандартов антигена обычным путем.

мые ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи в Москве, НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова в Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Метод Москве, ИЭМ в г. Горьком. 4. Краситель и от- может быть рекомендован для определения низ мывающая жидкость (прописи см. в разделе ких концентраций антигена в таких биологиче «Иммуноэлектрофоретический анализ»). ских жидкостях, как моча, цереброспинальная, Ход о п р е д е л е н и я. 1% (по объему бронхоальвеолярная жидкость, слюна и т. д.

Высокая чувствительность и воспроизводимость или по массе) раствор агарозы на барбиталовом буфере растворяют при подогревании на кипя- метода дают основания для более широкого ис щей водяной бане, а затем охлаждают до 45 °С. пользования его в клинико-иммунологическом Предварительно выбранное количество антисы- анализе.

воротки (титрование антисыворотки проводят Ли т е р а т у р а. Laboratory techniques in аналогично описанной процедуре в иммуно Biochemistry and molecular biology/Ed by электрофорезе) тщательно смешивают с раство T. S. Work, E. Work, 1970, p. Il l : 534;

Руковод ром агарозы и заливают между двумя стеклян ство по количественному иммуноэлектрофорезу.

ными пластинами с помещенной между ними / Под ред. Н. Аксельсен, И. Крелль, Б. Бике.— П-образной рамкой (см. выше). Заливка ага М., 1977.

розы и формирование слоя происходит более успешно, если форму и пипетку, которой зали 6.4.8. Возможные источники вают смесь агарозы с антисывороткой, предва рительно нагревают до 40—45 °С. Дают остыть ошибок и неспецифические реакции форме при комнатной температуре, а затем осто при использовании иммунодиффузионных рожно снимают верхнее стекло. По линии пер методов пендикулярной оси электрофореза параллельно длинной стороне стекла наносят ряд лунок на Качественные и количественные результаты расстоянии не менее 2 см между рядами. Центры иммунодиффузионных методов прежде всего за соседних лунок не должны быть ближе 8 мм. При висят от профессионального мастерства иссле таких условиях на стекло можно поместить дователя. Тем не менее ряд объективных факто 24 лунки. В средние лунки вносят разведения ров, которые необходимо знать и учитывать стандарта (требования к стандарту и его раз- при критическом анализе результатов, могут ведениям см. выше), используемые для построе- вызывать определенные отклонения.

Все варианты методов указанной группы тигенных характеристик легких цепей парапро требуют использования тщательно сбалансиро- теина и нормального иммуноглобулина анти ванной системы по отношению антигена и анти- сыворотки.

тел. Низкая концентрация антигенов вызывает При наличии в исследуемом материале мо смещение преципитата к лунке с антигеном номерной формы можно наблюдать размытое вплоть до полного слияния его с краем отверстия большое кольцо диффузии без четкого кольца и невозможностью определения при двойной преципитации.

иммунодиффузии в геле. Аналогичная картина Необходимо учитывать воздействие физи может наблюдаться при избытке антител (пре- ческих и медикаментозных факторов, которые ципитат сливается с краем лунки, содержащей могут изменять диффузионные свойства и элект антитела). Число молекул антител, которое сое- рофоретическую подвижность. Так, рентгенов диняется с молекулами антигена, называют эк- ское или радиоактивное облучение, длительная вивалентным количеством. Хейдельберг и Кен- терапия высокими дозами кортикостероидов мо далл впервые определили это количество на гут вызывать расщепление белков на субъеди основании опытов преципитации в пробирке как ницы с различными молекулярными размерами количество антигена, которое присоединяется и массой, но с идентичными иммунологически к определенному количеству антител с образо- ми свойствами. Это приводит к появлению ванием максимального количества преципитата. артефактов, которые могут быть непра Необходимо знать, что при использовании коли- вильно интерпретированы («ложные пара чественных методов иммуноэлектрофореза в протеины»).

ходе реакции все увеличивающееся число моле- Большое внимание необходимо уделять зна кул антител присоединяется к молекулам анти- нию качеств среды, применяемой для иммуно генов, образуя преципитат, который уже не про- диффузии или иммуноэлектрофореза в соответ двигается в геле в ходе электрофореза. Коли- ствии с теми задачами, которые стоят перед ис чество антител, приводящее к преципитации в следователем. Плохая очистка геля может слу ходе иммуноэлектрофореза, меньше, чем экви- жить причиной электростатического взаимо валентное количество антител, установленное по действия антигенов с некоторыми ионизирован преципитации в пробирках. Следовательно, им- ными группами геля, антигены могут образовы мунные комплексы в преципитате должны быть вать преципитаты в плохо очищенном геле, ко относительно ненасыщены антителами. При торые могут быть приняты за специфические.

дальнейшем ведении электрофореза уже обра- Исследователь должен творчески подходить к зовавшиеся преципитаты остаются в геле и ста- оценке деталей исполнения метода. Так, при новятся все отчетливее по мере того, как соот- изучении высокомолекулярных антигенов с боль ветствующее число молекул антител мигрирует шим размером молекулы, например определение к области преципитации из окружающего геля. высокополимерной ДНК в плазме методом встреч Таким образом, при подборе в каждом конкрет- ного иммуноэлектроосмофореза, правильнее ном случае соотношения в системе антиген—ан- использовать агарозный гель с концентрацией титело необходимо использовать условия (ха- его в буфере 0,7—0,8 %. Наоборот, применяя рактеристики электрического поля, среда, время стандартный метод радиальной иммунодиффу преципитации), которые будут в дальнейшем зии для количественной оценки секреторного применены в основном опыте.

компонента IgAS, можно допустить применение Ложноотрицательные реакции могут наблю- более плотных гелей, с которыми проще рабо даться в системе с избытком антигена — обра- тать и к очистке которых предъявляются мень зование растворимых комплексов. При несба- шие требования.

лансированном отношении антиген—антитело Все иммунопреципитационные методы ана возможно образование нескольких полос пре- лиза антигенов требуют тщательного подбора ципитации или ложных «шпор», что затрудняет антисывороток. Налаживание промышленного интерпретацию результатов в методе двойной производства гибридомных сывороток значи иммунодиффузии. тельно повысит специфичность реакции. Все Необходимо учитывать молекулярную массу выпускаемые в настоящее время моноклоновые и размер белковых субстратов, включаемых в и очищенные сыворотки требуют обязательного реакцию, так как эти параметры оказывают зна- контроля специфичности (особенно это касается чительное влияние на скорость диффузии и люминесцирующих антисывороток к иммунным электрофоретической подвижности в гелях. Бел- глобулинам, к альфа-фетопротеину и др.). При ки с молекулярной массой свыше 200 000 мед- работе с каждой партией антисывороток необ ленно диффундируют в агаре. Иммунный гло- ходимо определять концентрацию антител. Имеет булин М, a2-макроглобулин, а2-липопротеин и значение вид животного, использованного в ка фибриноген обладают и более низкой электрофо- честве объекта иммунизации (кролик, лошадь, ретической подвижностью. коза, свинья и т.д.). Наиболее удобны для Неправильная обработка сыворотки может практической работы в потоковых методах козьи приводить к агрегации белков и образованию и кроличьи антисыворотки. Лошадиная антисы крупномолекулярных агрегатов, например агре- воротка может быть причиной удвоения полос гированного IgG. Значительно меняется диффу- преципитации.

зия сыворотки, содержащей иммунные комп- При использовании этой антисыворотки лексы, особенно IgM с IgG. При исследовании часто наблюдается растворение уже сформиро парапротеинов могут наблюдаться двойные вавшегося преципитата как в избытке антигена, кольца преципитации вследствие общности ан- так и антител (т. е. эта антисыворотка требует очень тщательного подбора эквивалентных Такие преципитаты часто растворяются в 10 % концентраций). В редких случаях может иметь растворе хлористого натрия в отличие от устой место преципитация неиммунной природы. чивого к этой обработке иммунного преципитата.

6.5. АНТИЯДЕРНЫЕ АНТИТЕЛА Иммунофлюоресцентный метод определения объемами изотонического раствора и четырьмя антиядерных антител. Пр и н ц и п ме т ода. объемами ацетона. После отстаивания мате Тиоизоцианат флюоресцеина или производные риала надосадочную жидкость вместе с гомо родамина (чаще всего применяемые метки), генатом печени сливают, отделив его от квар конъюгированные с антителами, под действием цевого песка, а после дополнительного отстаи ультрафиолета светятся желто-зеленым или вания сливают надосадочную жидкость. Остав оранжево-красным светом, указывая на распо- шийся осадок гомогената заливают четырьмя ложение антигена, с которым специфически свя- объемами ацетона и фильтруют через воронку зались меченые антитела. Бюхнера с бумажным фильтром. Высушивание Существуют два основных варианта метода порошка проводят в стерильных чашках, при Кунса: прямой, когда метится непосредственно крытых фильтровальной бумагой, в течение 18 ч у-глобулиновая фракция антисывороток (т. е.

при 37 "С. Высушенный материал растирают в антитела), и непрямой, в котором используется ступке, просеивают через мелкое сито и расфа промежуточная инкубация среза с немеченой совывают. Предпочтительнее использовать пе антисывороткой (или антителами, предположи- нициллиновые флаконы, которые после запол тельно находящимися в исследуемой сыворотке) нения порошком закупоривают резиновыми и последующим проявлением образовавшегося пробками и заливают парафином. Порошок со комплекса антигаммаглобулиновой меченой сы- храняет способность устранять неспецифиче вороткой другого животного. скую люминесценцию в течение 3 лет.

Непрямой метод более чувствителен и более Ход о п р е д е л е н и я. Сыворотку крови применим в условиях клинических исследований. больного, получаемую обычным путем, раститро Однако он сопровождается повышением неспе- вывают забуференным изотоническим раствором цифической адсорбции белков и поэтому требует хлорида натрия (1 ч 0,15 М фосфатного буфера обязательной постановки контролей. рН 7,4 и 9 ч 0,87 % раствора хлорида натрия) Антинуклеарный фактор (АНФ) определя- 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80... и т. д. Послед ется методом иммунофлюоресценции на крио- нее разведение сыворотки, при котором еще оп статных срезах печени крыс или мышей. Анти- ределяется четко выраженное свечение (не ме тела к различным антигенам клеточного ядра — нее 2 + ), определяется как титр АНФ. Опыт ДНК, нуклеогистону, рибосомам, нуклеолам, на- подсказывает необходимость разведения сыво ходящиеся в исследуемой сыворотке, вступают ротки до 320—640, в редких случаях концентра в специфическое связывание с антигенами, ко- ция АНФ достигает 1 : 10240.

торое определяется меченой ФИТЦ-антиглобу- Пр и г о т о в л е н и е с ре з о в п е ч е ни.

линовой сывороткой (иммунная сыворотка, Печень извлекают из только что забитых крыс конъюгированная с флюоресцеинизотиоциана- или мышей,1 тут же разрезают на блоки том — ФИТЦ). 10Х 10Х5 мм и помещают в термостат с жид По с у д а и о б о р у д о в а ние. 1. Пред- ким азотом на 1—2 мин. После этого блоки по мещают на столик криостата, камера которого метные и покровные стекла. 2. Чашки Петри.

охлаждена до —20 "С. Полученные срезы нано 3. Центрифуга. 4. Люминесцентный микроскоп сят кисточкой на тщательно вымытые обезжи (МЛ-2, МЛ-3, «Люмам»).

ренные предметные стекла по 3—4 среза на одно Ре а к т и в ы. 1. Антигаммаглобулиновая сыворотка, меченная ФИТЦ. 2. Нефлюоресци- стекло. Стекла со срезами могут храниться 1 — рующее иммерсионное масло. 3. Фосфатный бу- 2 мес в морозильной камере холодильника и ис фер рН 7,2—7,4 : 0,53 г однозамешенного фос- пользоваться по мере надобности.

фата калия, 0,95 г двузамещенного фосфата Предметные стекла со срезами печени (если калия, 8,75 г хлорида натрия на 1 л дистиллиро- они извлечены из морозильника, необходимо ванной воды. 4. Печеночный порошок (для спе- подождать, пока испарится конденсат, т. е. стек цифической адсорбции). У обескровленного жи- ло прогреется до комнатной температуры) по вотного извлекают печень и прополаскивают ее мещают в фосфатный буфер рН 7,5 на 8—10 мин.

в изотоническом растворе хлорида натрия, раз- Затем их извлекают и дают стечь буферу. На резают на мелкие кусочки и растирают в ФаР~ влажные срезы пастеровской пипеткой наслаи форовой ступке с кварцевым песком. Получен- вают (по капле) разведения сыворотки. Стекла ную массу заливают двойным объемом 0,87 % с исследуемой сывороткой на срезах помещают раствора хлорида натрия и добавляют 4 объема во влажную камеру (чашки Петри с кусочками ацетона (по отношению к полученной смеси). смоченной ваты) при комнатной температуре Смесь интенсивно взбалтывают 3—5 мин. Над- на 45 мин, после чего стекла со срезами промы осадочную жидкость сливают, а осадок промы вают изотоническим раствором хлорида натрия до исчезновения гемоглобина в надосадочной жидкости. Осадок снова разбавляют двумя Необходимо отбирать здоровых животных.

11 п/р В. В. Меньшикова вают в течение 10 мин в фосфатном буфере. чения оценивают в плюсах (от 4+ до 2+).

Излишки буфера на стекле вокруг срезов тща- По характеру свечения различных структурных тельно промокают фильтровальной бумагой. На образований ядра выделяют 4 формы свечения, влажные срезы наслаивают антисыворотку к которые отражают отличные друг от друга анти IgQ человека, меченную ФИТЦ и предвари- нуклеарные факторы. Дифференциация их тельно истощенную печеночным порошком для имеет диагностическое значение.

исключения фонового свечения, которое связано Результаты непрямого метода иммунофлюо с взаимодействием нормальных печеночных ан- ресценции могут быть учтены при условии соб тител, находящихся, как правило, в небольших людения техники постановки реакции и выпол титрах в нормальных и патологических сыворот- нения контролей на специфичность свечения:

ках. 1) наслаивать на срезы сыворотку, истощен Люминесцирующая (меченная ФИТЦ) сы- ную антигеном — ДНК, нуклеопротеином или воротка выпускается в ампулах в лиофилизиро- гистоном;

ванном виде. На этикетке ампулы обозначено 2) использовать сыворотку с заранее опре рабочее разведение препарата. Для употребле- деленными антителами другой специфичности.

ния сыворотку в ампуле разводят 0,5 мл забу- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Диагно ференного изотонического раствора хлорида стическую информативность имеют концентра натрия и затем адсорбируют на печеночном ция и тип антинуклеарного фактора. Низкие порошке. На 1 мл сыворотки берут 80 мг по- титры АНФ часто определяются при разнообраз рошка. Смесь тщательно встряхивают. В течение ной патологии и у здоровых доноров. Высокие часа при комнатной температуре периодически концентрации характерны для системной крас через 5—10 мин перемешивают, интенсивно ной волчанки (СКВ), хронического активного ге встряхивая. Затем центрифугируют 15 мин при патита (ХАГ), в ряде случаев при ревматоидном 9000 об/мин. Надосадочную жидкость — адсор- артрите с системными проявлениями (РА). При бированную сыворотку — отсасывают. При тем- СКВ, как правило, выявляется диффузное све пературе хранения 4 °С сыворотка может быть чение ядер, при ХАГ — кольцевидное (или крае использована в течение 3—6 дней. вое), при РА — крапчатое. Последний тип све Инкубацию срезов с меченой антисывороткой чения встречается при исследовании сывороток также проводят во влажной камере 45 мин при больных склеродермией. Сочетание высоких кон комнатной температуре. Затем срезы отмывают центраций АНФ с гомогенным (диффузным) в фосфатном буфере (удаляют непрореагиро- свечением ядер гепатоцитов и низкими значе вавшие белки) в течение 10—15 мин и высуши- ниями гемолитической активности комплемента вают на воздухе. характерно для СКВ. Нарастание титра АНФ Микроскопирование готовых препаратов при динамическом исследовании сыворотки па производят при возбуждающем ультрафиолето- циента может служить ранним признаком обост вом облучении с использованием входного свето- рения процесса (до появления клинических фильтра УФС-3 и окулярного светофильтра симптомов) и диктовать необходимость повы ОС-3 в системе масляной иммерсии. Степень све- шения дозы стероидных гормонов.

6.6. ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА Ос но в ные н а п р а в л е н и я и мето- Значительно шире современные оценки фаго д и ч е с к и е п р и н ц и п ы. Учение о клеточ- цитоза в комплексном анализе генетически де ной кооперации в осуществлении иммунологи- терминированных дефектов иммунитета: распо ческой адаптации, иммунологического надзора знавание антигенов макрофагами и представ за генетическим постоянством внутренней среды ление их Т-лимфоцитам.

организма получило значительное развитие за Существенное значение в понимании роли два десятилетия своего существования. Выде- клеточных реакций в формировании клини ление тимусзависимой (Т) и тимуснезависимой ческих синдромов приобретает все углубляюще (В) клеточных систем в конце 60-х годов позво- еся изучение сывороточных факторов: лимфоки лило изучить их функции и взаимодействие и нов, монокинов, костномозгового стимулятора детализировать эффекторное звено в реализа- антителопродуцентов и др.

ции иммунного ответа, определив субпопуляции Т-лимфоцитов: супрессоры, хелперы, киллеры, клетки антителозависимой цитотоксичности, от 6.6.1. Т-лимфоциты личающиеся друг от друга специфическими ре цепторами, по которым они и могут быть детер- Метод розеткообразования для определения минированы в общем пуле лимфоцитов. Были Т- и В-лимфоцитов в периферической крови.

выявлены специфические различия В-клеток по Пр и н ц и п. Поверхностные рецепторы, специ мембранным иммуноглобулинам, рецепторам к фичные для различных субпопуляций лимфо Fc-фрагменту иммуноглобулина G, к С3-компо- цитов, проявляются, связывая эритроциты, на ненту комплемента. Наконец, в последние годы тивные или нагруженные антителами к этим (1981 —1983) обнаружены супрессорные функ- рецепторам. Эритроциты образуют с поверхно ции В-лимфоцитов. стью лимфоцита фигуру розетки. За розетку принимают лимфоцит, присоединивший 3—5 к 1 мл сыворотки и инкубируют в течение 1 ч при эритроцитов. В ряде случаев эритроциты плотно 37 °С, периодически встряхивая. Желательна окутывают лимфоцит, образуя так называемую абсорбция сыворотки пулом лейкоцитов, учиты морулу. Интерпретация этого феномена крайне вая возможность наличия антилейкоцитарных разноречива. Нередко он отражает методичес- антител. При использовании человеческой сыво кие неточности постановки. Феномен розетко- ротки необходимо учитывать влияние аутоцито образования может быть усилен путем обра- лимфотоксинов, проявляющих максимум актив ботки эритроцитов нейраминидазой. ности при 4 °С.

Определение Т-лимфоцитов методом спон- Перед использованием суспензии лимфоци танного розеткообразования с эритроцитами ба- тов проверяют их жизнеспособность. Равные рана (Е-РОК). Пр и н ц и п. Тимусзависимые объемы 0,1 % раствора водного эозина на среде Т-лимфоциты имеют рецепторы для эритроцитов Хенкса или Рингера двойной концентрации без барана, которые выступают, таким образом, спе- глюкозы и 0,1 % раствора трипанового синего цифическим маркером для их распознавания на дистиллированной воде смешивают перед (Е-РОК: Erythrocyte — розеткообразующие употреблением и 1—2 капли добавляют к капле клетки). сус,пензии клеток и часть смеси переносят в Пр и б о р ы и о б о р у д о в а ни е. 1. камеру Горяева. Окрашенные (мертвые) клетки Центрифуга ЦЛК-1. 2. Холодильник (бытовой). просчитывают на 100 клеток в поле зрения. При 3. Термостат. 4. Микроскоп люминесцентный правильной обработке процент мертвых кле (МЛ-2 или другие типы). 5. Камера Горяева. ток не превышает 3.

6. Счетчик клеток. 7. Автоматические пипетки Пр и г о т о в л е н и е э р и т р о ц и т о в или микропипетки. 8. Пробирки силиконирован- б а р а на. Используют эритроциты одного жи ные или пластиковые. 9. Штатив для пробирок. вотного или смесь, полученную от нескольких.

Ре а к т ив ы. 1. Среда 199, раствор Хенкса. Эритроциты можно хранить в течение 2 нед при 2. Гепарин (готовят раствор из расчета 4 °С в растворе Олсвера (глюкоза — 2,05 г, 25 ЕД/мл крови). 3. Фосфатный буфер рН 7,4. цитрат натрия — 0,8 г, хлорид натрия — 0,42 г, 4. 0,01 % раствор акридинового оранжевого. дистиллированная вода—100 мл), рН этого 5. 0,1 % раствор эозина, 0,1 % раствор трипа- раствора устанавливают равным 6,1 с помощью нового синего на дистиллированной воде. 6. Ги- 10 % раствора лимонной кислоты. Перед упо пак (изопак, верографин, уротраст). 7. Фиколл- треблением эритроциты барана 3—4 раза отмы 400 (полисахарид с молекулярной массой вают фосфатным буфером и готовят 0,5 % (по 400000). 8. Эритроциты барана. объему) взвесь клеток.

Ход о п р е д е л е н и я. 10 мл крови из По д г о т о в к а и у че т р е а к ц и и ро локтевой вены вносят в пластиковую пробирку з е т к о о б р а з о в а н и я. Реакцию проводят с раствором гепарина (256 ЕД/мл) и осторожно по методу, описанному Jondal и соавт. в 1972 г.

перемешивают. Гепаринизированную кровь раз- В пластиковые пробирки (от 2 до 5) вносят водят фосфатным буфером рН 7,4 в соотношении 0,1 мл взвеси лимфоцитов и добавляют равный 1 : 2;

9 мл смеси осторожно наслаивают на раст- объем 0,5 % взвеси эритроцитов барана. Соотно вор фиколл-гипак плотности 1,077 г/мл (12 ча- шение эритроциты: лимфоциты не должно пре стей 9 % фиколла и 5 частей 33,9 % гипака плот- вышать 50 : 1. Инкубируют смесь в термостате ности 1,077 г/мл). Пробирки центрифугируют 37 °С в течение 10 мин. Затем пробы центри 40 мин при 1500 об/мин.

фугируют 5 мин при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) В связи с тем что могут использоваться раз- и оставляют на ночь в холодильнике при темпе ные системы центрифуг, необходимо применять ратуре 4 °С. Подсчет клеток мы рекомендуем такие режимы центрифугирования, чтобы сила проводить в камере Горяева. Существующий разделения в интерфазе составила 400 g. Вели- метод фиксации суспензии глютаровым альде чину центробежного ускорения G вычисляют по гидом с последующим приготовлением мазков 2 формуле: G=l, l -n -R-10- (n — число оборо- и просчетом розеток в окрашенных препаратах тов в минуту, R — радиус от центра оси центри- позволяет накапливать стекла и анализировать фуги до границы соприкосновения смеси фи- результаты реакций в другой, свободной от по колл-гипака с разделяемой суспензией в см).

становки или менее загруженный, день. Однако После центрифугирования слой лимфоцитов глутаровый альдегид изменяет поверхность осторожно пипеткой извлекают из интерфазы эритроцитов барана, вызывает неспецифическое и дважды отмывают буферным раствором. Кон- прилипание их к клеткам крови человека. Не центрацию клеток доводят до 2—4 млн. в 1 мл исключено, что глутаровый альдегид десеквест в среде 199 ', содержащей 10 % раствор телячь- рирует скрытые антигены в мембране бараньих ей сыворотки или сыворотки IV (АВ) группы эритроцитов, к которым имеются рецепторы у крови человека. При использовании последней лимфоцитов человека. Более перспективен в необходима инактивация при 56 °С в течение этом плане ацетальдегид, фиксация которым 30 мин и абсорбция эритроцитами. Для этого эритроцитов стандартизирует определение 0,5 мл осадка отмытых эритроцитов добавляют Т-лимфоцитов и делает возможным обоснован ное сопоставление результатов, полученных раз ными лабораториями.

Можно использовать любой буферный Для просчета клеток в камере Горяева оса раствор рН 7,0—7,2 без ионов Са + + (наличие док клеток в извлеченных из холодильника про ионов Са++ способствует конгломерации кле- бирках осторожно ресуспендируют пастеровской ток, их коагуляции).

пипеткой (несколько раз медленно набирают и выпускают клеточную взвесь) и добавляют Эритроциты человека: необходимо исполь 0,02 мл 0,01 % раствора в фосфатном буфере зовать эритроциты 0(1) резусотрицателынж акридинового оранжевого. Этот краситель дает группы крови. Следует брать, по возможности, ярко-зеленую люминесценцию при возбуждении кровь нескольких постоянных доноров. Приго ультрафиолетом. Через 2—3 мин заполняют ка- товление эритроцитов аналогично описанному меру Горяева и определяют процент Е-РОК пу- методу для эритроцитов барана. К взвеси лим тем подсчета 300 лимфоцитов в люминесцент- фоцитов в тех же соотношениях добавляют одно ном микроскопе. Это значительно облегчает и временно эритроциты барана и эритроциты че ускоряет процедуру счета ярко светящихся лим- ловека. Просчитывают лимфоциты, связавшие фоцитов, окруженных розоватыми эритроци- эритроциты и барана, и человека. Реакцию с тами. аутологичными эритроцитами проводят так же, В день взятия крови на Т-лимфоциты необ- как с аллогенными.

ходимо проводить общий анализ крови, который дает возможность высчитывать абсолютные зна чения Т-клеток. 6.6.2. В-лимфоциты Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы Т-клеток, определенные нами у 150 здоровых доноров: Определение В-клеток методом розеткообра 54,3±0,98 %;

979,8±16,8 кл/мкл. зования с эритроцитами барана в системе ЕАС.

Определение активных Т-лимфоцитов, обра- Пр и н ц и п. Тимуснезависимые В-лимфоциты зующих розетки с эритроцитами барана (ЕА- имеют на своей мембране специфические детер РОК). Все подготовительные операции выпол- минанты, позволяющие дифференцировать их от няют так, как это описано для Е-РОК, за исклю- Т-лимфоцитов. Таким детерминантом является чением сыворотки, которую при определении ЕА- поверхностный (мембранный) иммуноглобулин РОК не добавляют в инкубационную среду, и класса М. Число лимфоцитов, несущих иммуно длительной холодовой инкубации. После термо- глобулин A, G, Е или D, крайне незначительно статирования 10 мин при 37 °С и последующего (А — 1—5 %, D и Е — 2—4 %), рецепторы для центрифугирования при 1000 об/мин (для Fc-фрагмента иммуноглобулина G для третьего ЦЛК-1) в течение 5 мин проводили подсчет компонента комплемента (Сз). Выделяют и дру Т-активных лимфоцитов способом, описанным гие специфические рецепторы, в частности для выше для общих Т-клеток. вируса Эпштейна—Барр, плазмоклеточный ан Со д е р ж а н и е Т-активных лимфоцитов у тиген, антиген 1а. Однако последние не нашли 150 здоровых доноров составило: 34,6 ±1,92 %, еще отражения в клинической практике. Чаще 840+123 кл/мл. применяется метод выявления В-клеток по Определение теофиллинчувствительности Т- их способности образовывать розетки с ба клеток. Пр и н ц и п. Препараты, повышающие раньими эритроцитами, нагруженными антите уровень внутриклеточного цАМФ (теофиллин, лами в среде комплемента. Такие эритроциты аденозин), ингибируют реакцию спонтанного ро- маркируют и Fc, и Сз рецепторы В-лимфоцитов.

зеткообразования между зрелыми Т-лимфоци- Приборы и реактивы те же, что и для метода тами и эритроцитами барана. определения Т-лимфоцитов. Аналогично готовят Ход о п р е д е л е н и я. Используемые и суспензию лимфоцитов.

реактивы и оборудование аналогичны для опи- А н т и с ы в о р о т к у, с о д е р жа щу ю санного выше метода определения Т-активных а н т и т е л а к э р и т р о ц и т а м, готовят пу лимфоцитов. Исключение составляет теофиллин тем иммунизации кролика эритроцитами барана (химически чистое соединение), 0,3 М раствор или быка. Кролику в краевую вену уха вводят которого на дистиллированной воде, подогретой 3—5 мл 50 % суспензии эритроцитов. На 4—6-й до 60 °С, готовят каждый раз при постановке день у него берут кровь и получают сыворотку, метода. Охлажденный до комнатной темпера- которая в этот период на высоте иммунного от туры теофиллин добавляют в инкубационную вета преимущественно содержит антитела клас среду (без добавления сыворотки), термоста- са М. Наилучший эффект получают при работе тируют, центрифугируют и просчитывают клетки с гамма-глобулиновой фракцией сыворотки, ко так же, как и Т-активные. Выявляют 2 субпопу- торую получают высаливанием в насыщенном ляции: теофиллинчувствительные Т-клетки, т.е. растворе аммиака или риванола. Антисыворотку лимфоциты, утратившие способность к розетко- инактивируют и определяют ее гемолитический образованию под влиянием обработки теофил- и агглютинационный титр.

лином, и теофиллинустойчивые Т-клетки.

Можно использовать готовую и широко до У здоровых доноров соотношение теофиллин- ступную кроличью гемолитическую сыворотку.

чувствительных и устойчивых Т-клеток состав- Ко мп л е ме н т. Источником комплемента ляет 1 : 3. служат свежие сыворотки мышей. Беспородных Выявление Т-лимфоцитов, образующих ро- мышей декапитируют, кровь сливают в про зетки с аллогенными и аутологичными эритро- бирку, получают сыворотку, которую затем сор цитами. Пр и н ц и п. Существуют субпопу- бируют пулом человеческих эритроцитов и опре ляции лимфоцитов, образующих розетки с алло- деляют активность комплемента в гемолитиче генными и аутологичными эритроцитами. ской системе.

Пр и б о р ы, о б о р у д о в а н и е и ре а к- С е н с и б и л и з а ц и я э р и т р о ц и т о в.

т и в ы описаны выше. Суспензию лимфо- Смешивают равные объемы 1 % взвеси бараньих цитов выделяют уже описанным выше эритроцитов (предпочтительнее эритроциты бы методом. ка) и антисыворотки к виду эритроцитов, ис пользуемых в реакции (или кроличьей гемоли- сорную функцию (есть исследования, характе тической сыворотки) в субагглютинирующем ризующие их и как клетки-помощники). Теофил разведении. Смесь инкубируют 40 мин при 37 °С, линчувствительные клетки представлены субпо осторожно встряхивая каждые 10 мин. После пуляцией супрессоров, а теофиллинустойчи термостатирования эритроциты трижды отмы- вые — клетками-помощниками. Т-клетки, обра вают фосфатным буфером до 10 мин при зующие розетки с аутоэритроцитами, как пола 1500 об/мин. Супернатант отбрасывают, а к гают, несут киллерную функцию и играют ос осадку добавляют первоначальный объем фос- новную роль в механизмах аутоагрессии.

фатного буфера и равный объем абсорбирован- Изучение динамики эффекторных звеньев ной мышиной сыворотки, содержащей компле- клеточного иммунитета отражает активность мент в разведении 1 : 10. Смесь помещают в тер- процесса, помогает правильно подобрать тера мостат при 37 °С на 30 мин. Вновь эритроциты пию, уточнить механизмы медикаментозной трижды отмывают. При отмывании их центри- чувствительности. Но, как правило, эти методы фугируют осторожно при 1000 об/мин 5 мин, используют для научных исследований.

чтобы не вызвать агглютинации эритроцитов. Го товят 0,5 % суспензию эритроцитов и просмат ривают под микроскопом. При наличии агглюти- 6.6.3. Реакция миграции лейкоцитов нации эритроцитов суспензия непригодна. Го товые эритроциты, нагруженные антителами и Пр и н ц и п. Подвижность лейкоцитов пе комплементом (ЕАС), можно хранить в холо- риферической крови, их миграция к очагам дильнике (4 °С) 4—5 дней. тканевой деструкции, хемотаксис к ауто- и ге Оп р е д е л е н и е ЕАС л и м фо ц и т о в. тероантигенам, перераспределение между лим К 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл фоидными органами при стрессорно-адаптивных сенсибилизированных эритроцитов. Оптималь- реакциях являются составляющей компонентой ное соотношение эритроцитов к лимфоцитам общей системы реактивности, способности к со равно 20 : 1. Смесь инкубируют 45 мин при 37 °С, хранению постоянства внутренней среды.

Pages:     | 1 |   ...   | 9 | 10 || 12 | 13 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.