WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 13 |

«СПРАВОЧНИК Лабораторные методы исследования в клинике Под редакцией профессора В.В.Меньшикова МОСКВА „МЕДИЦИНА" 1987 ББК 53.4 М51 УДК 61б-074/-078:061.6 В. В. МЕНЬШИКОВ, Л. Н. ДЕЛЕКТОРСКАЯ, Р. П. ...»

-- [ Страница 10 ] --

создавая вакуум водоструйным насо сом, катехоламины элюируют 6 мл 0,25 н. уксус ной кислоты. Время между промывкой колонки 5.7.5. Адреналин, норадреналин подщелоченной водой и окончанием элюции не Метод раздельного определения. П р и н- должно превышать 30 мин.

ц и п. Адреналин и норадреналин выделяются В кислотных элюатах рН бывает в пределах из мочи адсорбцией на окиси алюминия, как 3,5—3,9, их можно хранить 2—3 дня до анализа.

и в других методах. Адреналин окисляется во Перед исследованием остатки взвеси окиси флюорофор феррицианидом при рН 4,2, нор- алюминия удаляют центрифугированием. Для адреналин при рН 6,2. Чтобы при рН 6,2 не определения адреналина к 1 мл холодного элюата происходило образование флюорофоров из адре- добавляют 1 мл холодного фосфатного буфер налина, в реакционную смесь добавляют тио- ного раствора рН 4,2, 1 каплю 0,5 н. NH4OH гликолевую кислоту и формалин;

гидросуль- (рН должен быть в пределах 4,1—4,3) и фит натрия, удаляя растворенный кислород, 0,5 мл 0,25 % раствора феррицианида калия.

способствует стабилизации флюорофоров, обра- На этом этапе исследуемая проба и все реактивы зовавшихся из норадреналина. должны находиться в бане со льдом. Точно Ре а к т и в ы. 1. НС1, 6 моль/л. Готовят через 2 мин окисление останавливают, добавля разведением промышленно изготовляемой кон- ют 0,2 мл 0,3 % раствора аскорбиновой кислоты центрированной 10 н. НС1 до концентрации в 5 н. NaOH, а еще через 3 мин 1 мл воды, охлаж 6 н. 2. Этилендиаминтетрауксусная кислота или денной на льду, перемешивают и флюорометри ее соли (версен, трилон, хелатон, ЭДТА). руют, измеряя флюоресценцию в области 500— 550 нм при возбуждении светом с длиной волны 3. Гидрат окиси аммония (NH4OH), растворы 0,5 н. и 1 н. 4. Окись алюминия очищенная и 400 нм.

активированная по Брокману II. 5. Уксусная Для определения норадреналина, которое кислота, 0,25 н. раствор. 6. Фосфатные буфер- также проводят при постоянном охлаждении ные растворы рН 4,2 и 7,4, концентрация 1/15. всех реагентов в бане с ледяной водой, к 1 мл 7. Калия феррицианид (железистосинеродистый отцентрифугированного элюата добавляют калий, красная кровяная соль, КзFе/СN/6), 1 мл холодного фосфатного буфера рН 7,3 (при растворы концентрации 5 и 2,5 г/л. Готовят этом рН смеси устанавливают в пределах из препарата, очищенного перекристаллиза- 6,2—6,5) и 0,4 мл 0,5 % раствора феррицианида цией. 8. Аскорбиновая кислота, 3 г/л. В день калия. Перемешивают и точно через 2 мин опыта растворяют 30 мг перекристаллизованно- добавляют 1,2 мл смеси, которая приготовлена го препарата в 10 мл 5 н. NaOH. 9. Тиоглико- за несколько минут до этого путем смешива левая кислота, раствор 0,58 моль/л: 5,34 г (что ния 3 мл охлажденной тиогликолевой кислоты составляет 4 мл) доводят водой до объема 100 и 8 мл охлажденного раствора едкого натра с мл. 10. Формальдегид, раствор 0,05 моль/л на формалином, еще через 3 мин добавляют на 2,5 н. NaOH. На 100 мл 2,5 н. раствора едкого кончике стеклянной палочки 2—3 мг порошка натра берут 0,375 мл имеющегося в продаже гидросульфата натрия, перемешивают и изме 40% раствора формалина. 11. Гидросуль- ряют флюоресценцию в тех же условиях, что фит натрия (натрий гидросернистокислый, при определении адреналина.

Na2S2O4), сухой препарат в виде порошка. Для калибровки анализируют в таких же 12. Калибровочные растворы адреналина и нор- условиях пробы, содержащие 25—100 нг кате адреналина, содержащие по 100 нг основания холамина, по этим данным строят калибро в 1 мл. Могут быть использованы как кристал- вочный график. При повседневной работе ка лические, так и ампулированные фармацевти- либровочные пробы не проводят через стадию ческие препараты;

если используются соли, то элюции, а обрабатывают их так же, как и надо пересчитать на чистое основание. элюаты. Чтобы рассчитать концентрацию кате Ход о п р е д е л е н и я. Моча, подкислен- холамина в моче, его содержание в элюате ная 6 н. НС1 до рН 3,0, может храниться в за- (нг/мл или нмоль/мл) умножают на 0,4, так мороженном состоянии без потерь в течение как 1 мл элюата соответствует 2,5 мл мочи.

месяца. Для анализа берут подкисленную мо- Пр и м е ч а н и я. 1. Флюоресцирующие чу, стоявшую по крайней мере одну ночь в хо- продукты, образующиеся при определении лодильнике, за это время максимальное коли- норадреналина, быстро окисляются кисло чество солей успевает выпасть в осадок. К 15 мл родом воздуха, поэтому свечение падает.

отфильтрованной мочи добавляют 200 мг ЭДТА Гидросульфит натрия, поглощая кисло и 1 н. раствором NaOH доводят рН до 8,2 при род воздуха, делает флюорофоры более тщательном перемешивании и под контролем стойкими, слишком энергичное перемеши рН-метра. Колонки для хроматографии диа- вание способствует аэрации раствора и метром около 7 мм заполняют окисью алюми- уничтожает защитное действие гидросуль ния, для чего 1,2 г А12О3 взбалтывают в 3 мл фита. 2. Если при рН 6,2 проводить окисле воды и вносят в колонку, нижний конец кото- ние так же, как и при рН 4,2, т. е. после до рой рыхло закрыт ватой, прокипяченной в воде бавления фосфатного буфера к элюату доба вить 0,5 мл 0,25 % раствора феррицианида но перемешивать механической мешалкой в и точно через 2 мин 0,2 мл 0,3 % раствора течение часа. К этому количеству добавляется аскорбиновой кислоты в 5 н. NaOH, то бу- 9 мл воды до образования густой массы, кото дет определена сумма адреналина и нор- рую после тщательного перемешивания с по адреналина. 3. В целом определение адре- мощью специального аппарата наносят на обез налина более надежно, чем норадреналина;

жиренную стеклянную пластину размером основная ошибка анализа связана с гаше- 8X18 см слоем толщиной 0,25 мм. Пластину нием флюоресценции посторонними ве- высушивают на воздухе в защищенном от пы ществами, что проявляется в том, что до- ли месте на протяжении 2 ч, а затем прогре бавки адреналина или норадреналина к мо- вают при 120 °С еще 2 ч. Хранят в плотно че определяются не полностью. Этот эффект закрытом эксикаторе над хлоридом кальция во многом зависит от качества окиси алю- (для предотвращения впитывания паров воды).

миния, поэтому при налаживании методики Свежесобранную суточную мочу подкисляют >келательно проверить полноту открытия НС1 до рН 1,0, ее можно хранить в холодиль добавок исследуемых веществ к моче. нике несколько дней. К 1 мл подкисленной мо чи добавляют 300 мг порошка NaCI и дважды Но р ма л ь н ые в е л и ч и н ы. Выведение экстрагируют ВМК порциями по 3 мл этила адреналина 30—80 нмоль/сут (5—15 мкг/сут), цетата. Этилацетатные экстракты (верхний норадреналина 20—240 нмоль/сут (7— слой) отсасывают, объединяют, осушают без 44 мкг/сут).

водным сульфатом натрия и выпаривают в токе воздуха при 35—40 °С.

5.7.6. Ванилил-миндальная кислота Сухой этилацетатный остаток растворяют в 0,1 мл этилового спирта и наносят на хрома Метод тонкослойной хроматографии. тографическую пластинку небольшими порция Пр и н ц и п. Ванилил-миндальную кислоту ми;

следующую порцию наносят на то же место (ВМК) экстрагируют из мочи этилацетатом, после того, как предыдущая уже высохла.

экстракт упаривают и подвергают тонкослой- Повторно омывают пробирку 0,1 мл этилового ной хроматографии на силикагеле. Для обна- спирта и наносят на то же место хроматогра ружения на хроматограммах и количественно- фической пластинки. Дважды проводят восхо го определения используют цветную реакцию дящее хроматографирование так, чтобы слой с дйазотированным п-нитроанилином. растворителя поднимался на 12 см, после этого Ре а кт ив ы. 1. НС1 концентрированная, пластину высушивают и проявляют. Тонкослой примерно 10 н. 2. Этилацетат '. 3. Натрия суль- ное хроматографирование проводят в спе циальных плотно закрывающихся банках или фат безводный, порошок. 4. Натрия хлорид, эксикаторах, воздух внутри которых предвари порошок. 5. Силикагель марки АСК или КСК, тельно насыщен парами растворителя.

порошок, размер зерен 150—175 меш. 6. Гипс медицинский. 7. Дихлорметан (метиленхлорид).

Для проявления пластин их после высуши 8. Метиловый спирт. 9. Гидрат окиси аммония вания опрыскивают проявляющим диазореак (NH4OH), 17 % водный раствор, плотность тивом. При этом у самого финиша видно пят 0,933. 10. Раствор для хроматографирования. но гомованилиновой кислоты, пятно ВМК нахо Смешивают 40 мл дихлорметана, 40 мл мети- дится примерно на 4 см выше линии старта лового спирта и 2 мл 17 % раствора аммиака. (R/ в среднем 0,16), оно окрашивается в ярко 11. Раствор п-нитроанилина, 1 г/л. 12. Натрия фиолетовый цвет. Пятна соскабливают в про нитрит (NaNCb), раствор 2 г/л. 13. Калия кар- бирки, куда добавляют по 2 мл метанольной бонат (поташ, К.2СО3), раствор 100 г/л. 14. Про- щелочи и 0,1 мл усиливающего диазореактива.

являющий диазореактив. Непосредственно пе- Тщательно перемешивают и через 20 мин ред употреблением на холоду смешивают 1 центрифугируют, надосадочную жидкость фото часть раствора п-нитроанилина, 1 часть раство- метрируют при трех длинах волн: 450;

520 и ра натрия нитрита и 10 частей раствора пота- 590 нм против экстрактов из соскобов пластин ша. Смесь годна к употреблению лишь несколь- в участках, где нет ВМК.

ко минут. 15. Усиливающий окраску диазореак- Одновременно с опытными пробами через тив. Непосредственно перед употреблением на всю процедуру анализа пропускают калибро холоду смешивают равные объемы раствора вочные пробы, содержащие 4;

6 и 8 мкг ВМК.

п-нитроанилина и натрия нитрита. Реактив го- Для этого 0,04—0,08 мл калибровочного раст ден к употреблению лишь несколько минут. вора, содержащего ВМК в концентрации 16. Натрия карбонат (сода, Na2CO3), раствор мкг/мл, выливают в порции по 1 мл ацетатно 20 г/л. 17. Метанольная щелочь. В день опре- го буфера рН 1,96, затем экстрагируют этил деления смешивают 1 объем раствора натрия ацетатом так же, как и опытные пробы и т. д.

карбоната и 2 объема метилового спирта. Для расчета сначала вычисляют исправлен 18. Этиловый спирт. 19. Ацетатный буферный ную величину экстинкции с поправкой на не раствор рН 1,96 (концентрация 0,1 М). 20. Ка- специфическое поглощение по формуле:

либровочный раствор, содержащий ВМК в кон центрации 100 мг/л в 0,1 н. НС1.

E = E520—1/2 • (Е350 +Е590) Ход о п р е д е л е н и я. 2,5 г силикагеля тщательно смешивают с 0,4 г гипса, желатель- как для опытных, так и для калибровочных проб. По этим данным строят калибровочный Очистку см. с. 251. график, который служит для непосредствен 9 п/р В. В. Меньшикова Та б л и ц а 41. Содержание гистамина, серотонина и 5-ОИУК ного расчета содержания ВМК. в моче в микро- способны реагировать с о-фталевым альдегидом граммах в 1 мл. с образованием флюорофоров, но для серото Но р ма л ь ные в е л и ч и ны: 2,5—38 нина эта реакция идет в кислой среде, а для мкмоль/сут (0,5—7 мг/сут). гистамина — в щелочной. Кроме того, серото Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Небольшое нин сам обладает флюоресценцией и может, проходящее повышение свидетельствует о повы- реагируя с нингидрином, также давать флюорес шении функциональной активности симпатико- цирующие соединения.

адреналовой системы, стойкое повышение Метод совместного определения гистамина и бывает при феохромоцитоме. серотонина. Пр и н ц и п. Гистамин содержится главным образом в лейкоцитах, серотонин — в тромбоцитах, поэтому оба вещества опреде 5.7.7. Гистамин, серотонин ляют в цельной крови после осаждения белков хлорной кислотой. Для очистки и выделения Биогенные амины — гистамин и серотонин используют способность этих соединений при (окситриптамин, 5-ОТ) — содержатся главным щелочных рН переходить в органическую фазу, а образом в клетках крови (табл. 41), гистамин при кислых в водную. Анализ завершается изме в базофильных лейкоцитах, а серотонин в тром- рением флюоресценции продуктов конденсации боцитах, поэтому результаты их определения в гистамина с ортофталевым альдегидом, а серо тонина с нингидрином.

цельной крови в большей степени зависят от Ре а к т ив ы. 1. Калия оксалат, раствор количества соответствующих клеток. Имеются данные, что и то, и другое вещество, будучи 13,4 г/л. 2. Хлорная кислота (НСlO4), 1 н. рас твор. 3. Натр едкий, растворы 1 н. и 5 н. 4. Натр добавлено к плазме, связывается с белками — гистамино- и серотонинопексия. едкий, 0,1 н. раствор, насыщенный поваренной Гистамин освобождается при анафилактиче- солью. К 0,1 н. NaOH добавляют кристаллы ских и аллергических реакциях, но в целом поваренной соли в таком количестве, чтобы на клиническое значение результатов его определе- дне все время был осадок. 5. Натрия хлорид, ния невелико. Серотонин образуется в клетках сухой порошок. 6. HCI, 0,1 н. раствор. 7. Фосфат желудочно-кишечного тракта и продуцируется ный буферный раствор рН 8,0, концентрации особым видом опухолей — карциноидом. Основ- 1/15 моль/л. 8. Хлороформ. 9. Бутиловый спирт ной метаболит серотонина — 5-оксииндолилук- нормальный (н-бутанол). 10. Бутанол-хлоро сусная кислота — выводится с мочой в виде форменная смесь. Смешивают 150 мл н-бута парных соединений с серной и глюкуроновой нола и 100 мл хлороформа. 11. Кислота фос кислотами. Особенно информативно повышение форная, 1,5 моль/л: 17,3 мл имеющейся в про содержания серотонина в плазме и оксииндоли- даже 85 % фосфорной кислоты доводят водой до луксусной кислоты в моче при карциноидах объема 100 мл. 12. Ортофталевый альдегид, кишечника или легких, некоторое увеличение раствор 1 г/л в абсолютном метаноле '.13. Нин может быть и при заболеваниях желудочно- гидрин, раствор 100 ммоль/л. Растворяют 180 мг кишечного тракта. нингидрина в 10 мл воды. 14. Калибровочные Как гистамин, так и серотонин обычно опре- растворы гистамина и нингидрина, содержащие деляют после разрушения клеток и осаждения по 100 мг/л в 0,01 н. НС1. Для приготовления белков, но и при этом теряется до 40 % исход ного содержания биогенного амина;

лучшие результаты получаются при разрушении клеток замораживанием — оттаиванием. Оба вещества См. с. 259.

можно использовать серотонинкреатинсульфат, деляют в кислой фазе флюорометрическим мето 2,312 мг которого эквивалентны 1 мг серотонина дом после конденсации с ортофталевым альдеги основания. дом.

Ход о п р е д е л е н и я. Кровь берут в про- Ре а к т ив ы. 1. Натрия оксалат, раствор бирку, содержащую 1,34 % раствор оксалата 13,5 г/л. Растворяют 1,35 г натрия оксалата натрия в количестве, составляющем 1/10 от в 100 мл воды. 2. Кислота хлорная, 1 моль/л, предполагаемого количества крови. К 1 мл крови имеет концентрацию 1 н. или 10 %. 3. Натр приливают 1 мл воды и 1 мл н. хлорной кислоты, едкий, растворы 1 н. и 5 н. Готовят, растворяя перемешивают и через 30 мин центрифугируют.

соответственно 4 или 20 г NaOH в воде, объем К 2 мл надосадочной жидкости добавляют 0,2 мл доводят до 100 мл. 4. Натрия хлорид в виде 5 н. NaOH, 1 г порошка хлорида натрия и 4 мл сухого порошка. 5. НС1 0,1 н. 6. Натр едкий, 0,1 н бутанол-хлороформенной смеси, встряхивают раствор, насыщенный поваренной солью. Добав 3 мин, а затем центрифугируют для разделения ляют кристаллический NaCl в 0,1 н. NaOH в слоев. Водную фазу удаляют, а к органической таком количестве, чтобы на дне флакона все добавляют 2 мл 0,1 н. NaOH, насыщенного хло- время был осадок нерастворившейся соли.

ридом натрия, встряхивают и центрифугируют, 7. Бутиловый спирт нормальный (н-бутанол).

3,5 мл органической фазы переносят в другие 8. Хлороформ, лучше использовать марки «для пробирки, где экстрагируют 2,5 мл 0,1 н. НС1.

наркоза». 9. Бутанол-хлороформенная смесь:

После разделения фаз из кислотной (верхней) смешивают 150 мл н-бутанола и 100 мл хлоро фазы отбирают порции по 1 мл, которые исполь- форма. 10. Метиловый спирт (метанол), не зуют для определения гистамина и серотонина.

содержащий воды. 11. Ортофталевый альдегид, Для о п р е д е л е н и я г и с т а м и н а раствор 1 г/л в абсолютном метаноле. Жела к 1 мл кислотной фазы добавляют 0,2 мл 1 н. тельно использовать ампулированный препарат, NaOH и 0,1 мл раствора ортофталевого альде- в случае необходимости ортофталевый альдегид гида в метаноле. Через 4 мин приливают 0,1 мл можно очистить перекристаллизацией из лиг 1,5 М фосфорной кислоты, доводят объем до роина. Для приготовления реактива используют 5 мл и измеряют флюоресценцию при длине абсолютный (не содержащий воды) метиловый волны 470 нм при возбуждении светом с длиной спирт. 12. Ортофосфорная кислота, раствор волны 360—365 нм. 1,5 моль/л. 17,3 мл изготовляемой пром.ышлен Для о п р е д е л е н и я с е р о т о н и н а ностью 85 % фосфорной кислоты (Н3РО4) плот к 1 мл кислотной фазы добавляют 1 мл фосфат- ности 1,65 доводят водой до объема 100 мл.

ного буфера рН 8,0 (при этом в растворе должен 13. Калибровочные растворы готовят на 0,4 н.

установиться рН 7,0) и 0,2 мл 0,1 М раствора хлорной кислоте, растворяя 1,63 мг крис нингидрина. Смесь инкубируют 30 мин при таллического гистаминхлорида или 1 мг гиста 75 "С, затем еще 1 ч выдерживают при комнат- мина основания в 100 мл 0,4 н. НС1О4. И в том, и ной температуре, доводят объем до 5 мл и изме- в другом случае получается раствор, содержа ряют флюоресценцию в области 490 нм при щий 10 мг/л. Хранят в замороженном состоянии возбуждении светом с длиной волны 365 нм. в полиэтиленовом (стеклянный может лопнуть!) Для калибровки берут пробы, содержащие флаконе. Из него готовят рабочий калибровоч по 0,05 и 0,1 мкг серотонина и гистамина соответ- ный раствор с концентрацией 1 мкг/мл в 0,4 н.

ственно, доводят водой до объема 1,5 мл и при- хлорной кислоте.

ливают 0,5 мл 1 н. хлорной кислоты. В холостой Ход о пр е д е л е ния. Кровь берут в про опыт берут 1,5 мл воды и 0,5 мл 1 н. хлорной кис- бирку, содержащую раствор натрия оксалата лоты. Калибровочные и холостую пробы экстра- в количестве 1/10 от предполагаемого количе гируют бутанол-хлороформенной смесью после ства крови. К 4 мл оксалатной крови добавляют добавления 0,2 мл 5 н. NaOH и обрабатывают равный объем 1 н. хлорной кислоты, перемеши так же, как и опытные пробы. Свечение холостой вают и через 10 мин центрифугируют. К 4 мл пробы вычитают из результатов, полученных надосадочной жидкости добавляют 0,5 мл 5 н.

для опытных и калибровочных проб. NaOH, 1,5 г сухого порошка поваренной соли и Ра с ч е т проводят по калибровочному гра- хорошо перемешивают, затем приливают 10 мл фику, по данным которого рассчитывают содер- смеси бутанол — хлороформ, встряхивают 5 мин, жание гистамина или серотонина в пробе. Чтобы центрифугируют и водную фазу удаляют. К узнать содержание в 1 мл цельной крови, полу- органической фазе добавляют 5 мл 0,1 н. NaOH, ченные результаты умножают на 3/2, так как насыщенного хлоридом натрия, встряхивают, в опыт взято 2 мл хлорного экстракта крови из центрифугируют и водную фазу удаляют. Точно общего объема 3 мл. 8 мл органической фазы переносят в пробирку, Определение гистамина в цельной крови, содержащую 3 мл 0,1 н. НС1, и встряхивают унифицированный метод по реакции с ортофта- 3 мин, при этом гистамин переходит в кислотную левым альдегидом. Пр и н ц и п. Гистамин фазу, которую и используют для дальнейшего содержится главным образом в лейкоцитах, анализа.

поэтому определение выполняется в цельной К 2 мл кислотной фазы добавляют 0,4 мл крови, а не в сыворотке или плазме. Белки осаж- 1 н. NaOH и 0,12 мл 0,1 % раствора ортофтале дают хлорной кислотой, добавлением едкого вого альдегида в метаноле, а через 4 мин еще натра устанавливают щелочную реакцию, кото- 0,2 мл 1,5 М ортофосфорной кислоты. После рая необходима для экстракции смесью бута- этого измеряют флюоресценцию при длине вол нола и хлороформа. После промывания экст- ны 460 нм при возбуждении светом с длиной ракта гистамин реэкстрагируют кислотой и опре- волны 360 нм. Из показателя опытной пробы вычитают результаты измерения холостого опы- 5-ОИУК;

их подкисляют и обрабатывают так же, та, в который вместо крови берут соответствую- как и опытные пробы. По результатам измерений щее количество воды. строят калибровочный график, который позво Ра с ч е т проводят по калибровочному гра- ляет непосредственно определить количество фику, для построения которого пробы, содержа- микрограммов 5-ОИУК в 1 мл мочи.

щие 0,1;

0,5 и 1 мкг гистамина в 4 мл 0,4 н. хлор Пр и ме ч а н и е. При заболеваниях, сопро ной кислоты, обрабатывают так же, как и кровь.

вождающихся нарушениями аминокислот При окончательном расчете учитывают, что в ного обмена, необходима дополнительная опыт взято 4 мл крови, поэтому в 1 мл содержа очистка, которая заключается в том, что ние гистамина в 4 раза меньше.

после упаривания этилацетатного экстракта и растворения сухого остатка в этаноле отби рают 0,1 мл, к которым добавляют 3 мл воды 5.7.8. 5-Оксииндолилуксусная кислота и 2 мл хлороформа, встряхивают и переносят водную фазу в чистую пробирку, где прово Определение 5-оксииндолилуксусной кис дят цветную реакцию, как описано выше.

лоты в моче. Унифицированный метод по реак ции с а-нитрозо-b-нафтолом. Пр и н ц и п. Диа- Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы. Суточное выведение 5-ОИУК у взрослых 10— зотированный а-нитрозо-b-нафтол реагирует с 20 мкмоль/сут.

5-оксииндолилуксусной кислотой (5-ОИУК) с образованием окрашенных в сиреневый цвет Ли т е р а т у р а. Лаб. дело, 1973, № 10, продуктов. Для повышения специфичности опре с. 637—638.

деления 5-ОИУК экстрагируют из подкисленной мочи этилацетатом, определение ведут в высу- Определение свободной и связанной 5-окси шенном экстракте, повторную очистку экстрак- индолилуксусной кислоты в моче по реакции с цией этилацетатом проводят уже после проведе- а-нитрозо-р-нафтолом. Пр и н ц и п. Парные ния цветной реакции. В случае необходимости соединения 5-ОИУК с серной и глюкуроновой может быть проведен еще третий этап очистки: кислотами гидролизуют нагреванием с хлорной удаление мешающих веществ хлороформом. кислотой в присутствии унитиола, который пре Ре а к т и в ы. 1. HCI, 5 н. раствор. Для его дохраняет определяемые вещества от полного получения концентрированную НС1 осторожно разрушения. После нейтрализации свободную смешивают с равным объемом воды. 2. Кислота оксииндолилуксусную кислоту экстрагируют серная 1 н. 3. Натрия хлорид, насыщенный эфиром, экстракт выпаривают и проводят опре раствор. 4. а-Нитрозо-р-нафтол, раствор 1г/л в деление по цветной реакции диазотированным абсолютном этаноле. 5. Натрия нитрит, водный а-нитрозо-р-нафтолом аналогично тому, как это раствор 25 г/л. Растворяют 1 г NaNO2 в 40 мл делается в унифицированном методе.

воды. 6. Нитрозокислотный реактив. Непосред- Р е а к т и в ы. 1. Хлорная кислота концент ственно перед употреблением смешивают 0,2 мл рированная, содержащая не менее 42 % НС1О4, раствора натрия нитрита и 5 мл 1 н. серной т. е. концентрация не менее 4,2 н. 2. Унитиол.

кислоты. 7. Этилацетат (уксусноэтиловый 3. Кали едкое, 4 н. раствор: растворяют 22,4 г эфир). 8. Абсолютный этиловый спирт. 9. Ка- КОН в 70—80 мл воды, добавляя гранулы щело либровочный раствор ОИУК, содержащий чи мелкими порциями, объем доводят водой до 100 мкг вещества в 1 мл воды. 100 мл. 4. Натрия хлорид, сухой порошок. 5. Сер Ход о п р е д е л е н и я. Из общего количе- ная кислота 2 н. 6. Натрия нитрит (NaNO2), ства суточной мочи отбирают небольшую пор- раствор 25 г/л. 7. Нитрозокислотный реактив:

цию и подкисляют ее 5 н. НС1 до рН 1,0. 1,5 мл непосредственно перед употреблением смеши подкисленной мочи смешивают с 1,5 мл насы- вают 0,2 мл раствора нитрита натрия и 5 мл 2 н.

щенного водного раствора хлорида натрия и серной кислоты. 8. а-Нитрозо-р-нафтол, раствор дважды экстрагируют этилацетатом порциями 1 г/л в абсолютном спирте. 9. Эфир (диэтиловый по 4 мл. Оба экстракта смешивают и упаривают эфир), лучше использовать марки «для нар на водяной бане при температуре не выше 47 °С коза». 10. Этилацетат (этилово-уксусный эфир).

досуха. Сухой остаток растворяют в 0,15 мл 11. Калибровочный раствор, содержащий 100 мг абсолютного этанола и из этого количества 5-оксииндолилуксусной кислоты в 1 л воды.

0,1 мл переносят в чистую сухую пробирку, куда Ход о п р е д е л е н и я. Определение сум добавляют также 2,9 мл воды, а затем 0,3 мл марной (свободной и связанной) оксииндоли спиртового раствора а-нитрозо-b-нафтола, а луксусной кислоты. Из суточной мочи отбирают затем 0,3 мл свежеприготовленного нитрозокис- порцию 5 мл, к которой добавляют 0,1 г уни лотного реактива. Перемешивают и нагревают тиола, 1 мл концентрированной хлорной кислоты на водяной бане при 47 °С в течение 7 мин. К и нагревают 15 мин на кипящей водяной бане.

неостывшему раствору добавляют 3 мл этилаце- После охлаждения добавляют 4 н. КОН до тех тата и встряхивают. После разделения фаз ниж- пор, пока рН не станет равным 2,0;

выпавший ний слой приобретает сиреневую окраску, его осадок отделяют фильтрованием. К фильтрату отсасывают и фотометрируют при длине волны добавляют 1 г хлорида натрия (примерно) и 526 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см экстрагируют 13 мл эфира в течение 30 мин на против холостого опыта, в который берут вместо аппарате для встряхивания. После разделения мочи 1,5 мл воды.

фаз, для чего может потребоваться центрифуги Одновременно ставят калибровочный опыт, в рование, отбирают 8 мл эфирного экстракта который берут пробы, содержащие 10—100 мкг и переносят в чистую сухую пробирку, где выпа ривают досуха на водяной бане при 40 °С. Сухой досуха, так же как при определении общей остаток растворяют в 2 мл воды, приливают 1 мл 5-ОИУК. Дальнейшее определение проводят, раствора нитрозонафтола и 1 мл нитрозокислот- как описано выше в предыдущем разделе.

ного реактива, перемешивают и ставят на 10 мин По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о г о на водяную баню при 37 °С. Для удаления г р а фи к а и ра с че т. Для построения избытка нитрозонафтола приливают 10 мл эти- калибровочного графика 5 мл пробы, содержа лацетата и встряхивают. После разделения сло- щей 10—100 мкг 5-ОИУК в виде водного раст ев внизу оказываются хромогены синего цвета, вора, обрабатывают так же, как опытные пробы, этот слой переносят в кювету с толщиной опти- включая гидролиз хлорной кислотой, ее удале ческого слоя 1 см и фотометрируют при длине ние в виде калиевой соли и экстракцию эфиром волны 540 нм против холостой пробы. Холостую и т. д. Линейность графика сохраняется до пробу готовят так же, как и опытную, но вместо 70 мкг в пробе. Чтобы узнать содержание эфирного экстракта мочи берут 8 мл эфира, 5-ОИУК в 1 мл мочи, полученную по калибро который выпаривают и сухой остаток обрабаты- вочному графику величину делят на 5 (так вают, как описано выше.

как в пробу берется 5 мл мочи), чтобы узнать Определение свободной оксииндолилуксус- суточное выведение, умножают на суточный ной кислоты. К 5 мл мочи из суточного количе- диурез.

ства добавляют 2 н. серную кислоту в таком Для определения свободной 5-ОИУК строят количестве, чтобы рН был 2,0, затем 1 г порошка отдельный калибровочный график, который хлорида натрия и экстрагируют 13 мл эфира, может несколько отличаться, так как не будет встряхивая пробу 30 мин на аппарате для встря- потерь, связанных с кипячением с хлорной кис хивания;

8 мл эфирного экстракта упаривают лотой. В остальном расчет аналогичен.

5.8. НЕОРГАНИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА В отличие от других разделов лабораторной процессе формирования сгустка угольная кис диагностики, где почти монопольно господствует лота теряется, при этом изменяются соотноше фотометрия, при определении неорганических ния эритроцитарного и плазматического объе элементов и показателей КЩС широко исполь- мов, что сказывается на концентрации натрия, зуются и другие физико-химические методы. колебания которой в сыворотке больше, чем в В связи с тем что анализы выполняются на плазме. По этой причине для точного определе приборах — пламенных фотометрах, потенцио- ния надо анализировать плазму, полученную метрах и т. д., заводские инструкции к которым с гепарином, так как солевые антикоагулянты, содержат подробные указания о том, как следует изменяя осмотическую концентрацию среды, работать, в настоящем разделе описывается вызывают сморщивание эритроцитов и разведе только химическая сторона методик, а принципы ние плазмы. Некоторые препараты гепарина устройства аппаратуры и советы о том, как ее содержат много натрия, тогда надо вводить на лучше использовать, вынесены в главу 1.6. него поправку. Результаты определения натрия в плазме в целом имеют то же клиническое зна чение, что и результаты определения осмотиче 5.8.1. Натрий и калий ской концентрации.

Клинико-диагностическое значение опреде Несмотря на то что физиологические функ- ления натрия и калия в эритроцитах невелико, это скорее область научных исследований, а не ции натрия и калия в организме различны, для их определения используют одинаковые физиче- практической медицины.

ские принципы. Подавляющая часть калия в Выведение натрия с мочой относительно организме находится внутри клеток, и его кон- равномерно на протяжении суток, в то же время центрация в плазме, которая лишь очень при- экскреция калия имеет четкий пик в утренние близительно отражает общее содержание эле- часы, соответственно возрастает и отношение мента в организме, может колебаться в значи- K/Na, которое коррелирует с активностью глю тельных пределах, особенно у тяжелобольных. кокортикоидов. Минералокортикоид альдосте Она тесно связана с состоянием кровообраще- рон вызывает задержку натрия в организме, ния и кислотно-щелочного равновесия, поэтому увеличивая отношение K/Na мочи.

определение калия в плазме или сыворотке — Унифицированный метод фотометрии пла один из важнейших показателей в реанимацион- мени. Определение в сыворотке и плазме крови.

ной клинике. Пр и н ц и п. Разведенная водой плазма или Натрий почти исключительно внеклеточный сыворотка крови распыляется и в виде мельчай элемент, его общее количество хорошо коррели- ших капелек с током воздуха поступает в пламя рует с объемом межклеточной жидкости. У каж- газовой горелки, которому калий придает слабое дого индивидуального человека концентрация красно-фиолетовое, а натрий ярко-желтое окра натрия в плазме поддерживается с большим шивание. Интенсивность окраски измеряется постоянством, физиологические колебания, как фотоэлементом. В связи с тем, что концентрация правило, меньше, чем точность обычных лабора- калия в плазме невелика, при его определении торных методов, но межиндивидуальные колеба- калибровочный раствор должен содержать ния гораздо выше. При получении сыворотки в также соли натрия, а при некоторых конструк циях прибора и соли кальция. Натрия в плазме рабочие калибровочные растворы путем разве много и он ярко окрашивает пламя, поэтому дения водой во столько же раз, во сколько разво калибровочный раствор может содержать толь- дят и исследуемую плазму или сыворотку, жела тельно с использованием тех же пипеток, дозато ко соли натрия.

Пр и г о т о в л е н и е к а л и б р о в о ч - ров и мерных колб.

н ы х ра с т в оров. Есть два способа приго- 5. Если чувствительность пламенного фото товления калибровочных растворов. В первом метра такова, что исследуемую плазму крови для случае сначала готовят серию основных калиб- определения надо разводить в 20 раз, рабочие ровочных растворов, концентрации электроли- калибровочные растворы для определения калия тов в которых перекрывают возможный диапа- могут быть приготовлены также более простым зон колебаний состава плазмы, а затем эти способом. Для этого в мерную колбу вмести растворы разводят так же, как и исследуемая мостью 1 л вносят 7 мл исходного калибровоч плазма. Этот способ позволяет в максимальной ного раствора NaCl с концентрацией степени избежать погрешностей, связанных с 1000 ммоль/л и 2,5 мл исходного раствора неточностями пипеток, используемых при разве- СаСОз с концентрацией 100 ммоль/л и доводят дении, но необходим двойной набор посуды — объем до 1 л водой. Получают фоновый раствор для основных и рабочих растворов. В другом с концентрацией натрия и кальция 7 и случае сразу готовят рабочие калибровочные 0,25 ммоль/л. Готовят также калибровочный растворы, которые имитируют состав разведен- раствор калия с содержанием 5 ммоль/л, для ной для сжигания плазмы;

такой раствор может чего исходный раствор с концентрацией быть использован лишь в том случае, если плаз- 100 ммоль/л разводят водой в 20 раз в мерной ма всегда разводится совершенно одинаково. колбе вместимостью 100 мл. Смешивают оба Ниже даются прописи и того, и другого способа, раствора, согласно приведенной ниже таблице.

считая, что первый более подходит для лабора торий, где электролиты определяются не очень часто, второй — для лабораторий, где проводит Фоновый ся много определений и методику можно счи- Раст Если исследуемый материал, раствор, вор разведенный 1:20, соответ тать хорошо налаженной.

содержащий КС ствует содержанию При приготовлении калибровочных раство 7 ммоль/л в плазме, ммоль/л ров используют соли натрия, калия и кальция, Na и ммоль/ 0,25 ммоль/л высушенные в сушильном шкафу при 100— Са, мл 120 °С.

Na Са К 1. Натрия хлорид. Исходный калибровочный раствор, содержащий 1000 ммоль/л. Готовят, 6,0 До 100 6,0 140,0 2, растворяя 11,69г NaCI (поваренной соли) вводе 5,0 > 100 5,0 140,0 2, и доводя объем до 200 мл.

4,0 » 100 4,0 140,0 2, 2. Калия хлорид. Исходный калибровочный 3,0 » 100 3,0 140,0 2, раствор с концентрацией 100 ммоль/л. Готовят, растворяя 0,746 г K.CI в воде и доводя объем до 100 мл.

3. Кальция карбонат. Исходный калибровоч- 6. Основной калибровочный раствор для ный раствор, содержащий 100 ммоль/л. Готовят, определения натрия готовят, помещая в мерную растворяя 1,001 г СаСОз (кальция карбоната) колбу вместимостью 100 мл 12—18 мл исходного в 1 н. HCI и доводя объем до 100 мл той же кис- раствора с концентрацией Na 1000 ммоль/л, лотой. затем доводят водой до метки. Получается серия 4. Основной калибровочный раствор для основных калибровочных растворов, которые определения калия готовят из исходных калиб- содержат натрий в концентрациях от 120 до ровочных растворов.

180 ммоль/л. Для построения калибровочного При построении калибровочного графика из графика каждый из этих растворов разводят основного калибровочного раствора готовят в 100 раз, желательно с помощью тех же пипеток или дозаторов и мерных колб, которые использу ются при разведении исследуемого материала.

7. Рабочий калибровочный раствор для опре Исходный калибровочный Концентрация, деления натрия в плазме крови можно пригото раствор, мл ммоль/л вить также по следующей прописи: 2 мл исход Вода, мл ного калибровочного раствора с содержанием KCI, NaCl, СаСОз, 100 1000 100 к Na Са натрия 1000 ммоль/л вносят в мерную колбу ммоль/л ммоль/л ммоль/л вместимостью 200 мл и доводят до метки водой.

Из этого раствора, содержащего 10 ммоль/л, 6,0 14,0 2,5 До 100 6,0 140 2,5 берут по 12—18 мл и вносят в мерные колбы 5,5 14,0 2,5 > 100 5,5 140 2,5 вместимостью 100 мл и доводят водой, до метки.

5,0 14,0 2,5 > 100 5,0 140 2,5 Получается серия растворов, содержащих нат 4,5 14,0 2,5 » 100 4,5 140 2,5 рий в концентрациях от 1,2 до 1,8 ммоль/л, т. е. в 4,0 14,0 2,5 » 100 4,0 140 2,5 таких, которые соответствуют содержанию нат 3,5 14,0 2,5 » 100 3,5 140 2,5 рия в плазме крови от 120 до 180 ммоль/л, при 3,0 14,0 2,5 » 100 3,0 140 2,5 условии, что исследуемый материал разводился перед определением в 100 раз.

Соответствует содержанию Содержание в в моче при условии, что она Основной калибровочный раствор, 100 мл, мкмоль была разведена 1:100, содержащий 80 ммоль/л Na и Вода, мл ммоль/л 20 ммоль/л К, мл Na Na К К 4,0 До 100 320 80 320 3,5 » 100 280 70 280 3,0 » 100 240 60 240 2,5 » 100 200 50 200 2,0 » 100 160 40 160 Ход о пр е д е л е ния. При определении Содержание калия в плазме или сыворотке калия в плазме крови очень важно, чтобы не возрастает при ацидозе, печеночной недостаточ было гемолиза, так как эритроциты значительно ности, передозировке некоторых лекарств. Со богаче этим элементом, чем плазма, и разруше- держание его уменьшается чаще всего в резуль ние даже небольшого их количества приводит к тате неправильного применения диуретиков, а завышенным результатам. Если есть хоть малей- также при истощении калиевых запасов орга шее сомнение в том, что эритроциты удалены низма при некоторых поражениях почечных полностью, плазму или сыворотку надо повторно канальцев и при альдостеронизме.

центрифугировать. В связи с тем, что калий, Унифицированный метод определения в хотя и медленно, но выходит из эритроцитов моче. Пр и н ц и п. Определение натрия и калия через неповрежденную мембрану, предпочти- в моче аналогично их определению в плазме тельнее использовать для исследования плазму, крови с той разницей, что размах физиологиче которую получают центрифугированием в тече- ских колебаний здесь больше, а различие между ние 15 мин при 3000 об/мин не позднее чем через концентрациями Na и К не так велико, как в 45—60 мин после взятия крови. плазме, поэтому требования к точности меньше Обычно для определения калия исследуемую и можно работать с общим калибровочным раст плазму разводят водой в 20 раз, а для определе- вором.

ния натрия в 100 раз, но разведения могут быть Пр и г о т о в л е н и е к а л и б р о в о ч и другими в зависимости от чувствительности н о г о р а с т в о р а. Используют те же исход прибора. Определение начинают с того, что ные калибровочные растворы, что и при анализе сжигают серию калибровочных растворов, за- плазмы. Для приготовления основного калибро тем исследуемые пробы и снова калибровочные вочного раствора в мерную колбу вместимостью растворы, определение считают успешным, если 100 мл вносят 8 мл исходного калибровочного калибровка, полученная вначале, совпадает с раствора хлорида натрия, содержащего полученной в конце. 1000 ммоль/л ', и 20 мл раствора хлорида калия, Р е з у л ь т а т ы р а с с ч и т ыв а ют п о содержащего 100 ммоль/л 2, и доводят водой до к а л и б р о в о ч н о м у г р а фи к у. После метки 100 мл. Получается раствор, содержащий окончания анализа надо с особой тщатель- 80 ммоль/л Na и 20 ммоль/л К. Из него готовят ностью промыть и просушить распылитель, разведения согласно приведенной выше таблице.

согласно заводской инструкции. Это очень Ход о п р е д е л е ни я. Если в исследуемом ответственная и легко повреждаемая деталь материале имеется осадок, его тщательно пере прибора, коррозия которой или засорение делает мешивают, 0,5 мл мочи вносят в мерную колбу невозможным выполнение анализа.

вместимостью 50 мл и доводят до метки водой Содержание натрия в плазме крови опреде- либо 1 мл вносят в колбу вместимостью 100 мл и ляют так же, как и содержание калия, с той доводят водой до метки. На пламенном фотомет разницей, что исследуемый материал разводят, ре сжигают сначала калибровочные растворы, как правило, в 100 раз и используют калибровоч- затем исследуемые и снова повторяют калиб ный раствор для определения натрия. ровку.

Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы. Содержа- Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы. Содержа ние натрия в плазме 130—156 ммоль/л, содер- ние натрия в моче может колебаться от ничтож жание калия 3,4—5,3 ммоль/л. ных величин до 320—340 ммоль/л, калия — до Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Значитель- 80—100 ммоль/л.

ное увеличение или уменьшение содержания Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Выведение натрия в плазме или сыворотке наступает пото- натрия возрастает при спадении отеков, умень му, что человек в процессе дегидратации непро- шается при их развитии. Высокое выведение ка порционально теряет воду и соли. Это состояние требует неотложных лечебных мероприятий.

Увеличение выведения натрия с мочой — обычно благоприятный симптом, оно бывает при рас сасывании отеков или выпотов, а также под ' Реактив 1, с. 262.

влиянием лечения диуретиками. Реактив 2, с. 262.

лия бывает при неправильно подобранной гипо Раствор, Соответствует тензивной терапии. Фоновый Концен содержащий содержанию раствор трация, Унифицированный метод определения в эрит 10 ммоль/л натрия в эритро КС1 3, ммоль/л роцитах. Пр и н ц и п. Эритроциты отделяют NaCl и цитах при разве ммоль/л, центрифугированием, гемолизируют водой и оп- 3,3 ммоль/л дении 1:26, ределяют содержание электролитов методом KCI, мл К Na ммоль/л фотометрии пламени. В связи с тем что между эритроцитами всегда остается некоторое количе 5 До 100 3,3 0,5 13, ство плазмы, большое значение имеет единооб 6 » 100 3,3 0,6 15, разие режимов центрифугирования;

приведен 7 » 100 3,3 0,7 18, ный ниже режим рекомендован в качестве уни 8 » 100 3,3 0,8 20, фицированного.

Пр и г о т о в л е н и е к а л и б р о в о ч н ых р а с т в о р о в. В качестве исходных используют те же растворы, что и при определе нии натрия и калия в плазме. Из упакованного слоя эритроцитов берут пробу, 1. Рабочий калибровочный раствор для опре- которую разводят для определения калия в деления калия в эритроцитах. В мерную колбу раз, а для определения натрия — в 26 раз водой.

вместимостью 100 мл вносят 3,84 мл исходного Пробы сжигают одновременно с калибровочны калибровочного раствора КС1, содержащего ми растворами. Расчет проводят по калибро 100 ммоль/л ', и доводят объем водой до 100 мл;

вочному графику.

получается основной калибровочный раствор с Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: натрий концентрацией 3,84 ммоль/л. Из него готовят 13—22 ммоль/л, калий 77—96 ммоль/л.

разведения согласно приведенной ниже таблице. Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Высокое содержание натрия в эритроцитах бывает у лиц с наследственной предрасположенностью к ги пертонической болезни.

Соответст вует содер Раствор жанию калия Концентра КС1 3,84 в эритроци Вода, мл ция калия, 5.8.2. Кальций ммоль/л, тах при раз ммоль/л мл ведении 1:260, Около 40 % всего кальция плазмы крови ммоль/л связано с белком, еще примерно 5 % образуют комплексы с лимонной, фосфорной или угольной кислотой, остальной кальций находится в физио 7,5 До 100 0,288 логически активном, ионизированном состоянии.

8,0 » 100 0,308 Доля кальция, связанного с белками (так назы 8,5 » 100 0,327 ваемый неультрафильтруемый кальций), зави 9,0 » 100 0,346 сит от содержания протеина в плазме крови, 9,5 » 100 0,365 поэтому четкой количественной связи между общим и ионизированным кальцием не сущест вует, и тот, и другой параметр имеют клиниче ское значение. Во многих физиологических и 2. Рабочий калибровочный раствор для опре патологических ситуациях представляет интерес деления натрия в эритроцитах. В мерную колбу именно содержание ионизированного кальция, вместимостью 1 л вносят 33 мл исходного калиб но, к сожалению, он может быть определен лишь ровочного раствора KCI, содержащего с помощью специальных кальциевых электро 100 ммоль/л ', и доводят до 1 л;

получается фо дов, аналогичных электродам для определения новый раствор, содержащий 3,3 ммоль/л КС1. В рН, которые недоступны практическим лабора колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл исход ториям. Содержание общего кальция точнее все ного калибровочного раствора NaCl, содержа го может быть определено методом атомной щего 1000 ммоль/л, и доводят до объема 100 мл абсорбционной спектроскопии;

в данном случае фоновым раствором, содержащим 3,3 ммоль/л этот метод может быть принят в качестве рефе KCI;

получается раствор, содержащий 10 ммоль/л рентного.

NaCl и 3,3 ммоль/л KCI. Из полученных Предложено много химических методов опре растворов готовят разведение, согласно сле деления кальция в сыворотке крови и в моче;

они дующей таблице.

основаны главным образом на способности Ход о п р е д е л е н и я. Кровь для исследо образовывать окрашенные соединения с комплек вания берут с гепарином из расчета 5 мг сонами, т. е. веществами, образующими прочные (650 ЕД) на 1 мл, центрифугируют 15 мин при комплексы с металлами. Здесь можно выделить 3000 об/мин, отсасывают плазму с верхним сло две подгруппы — либо общее количество комп ем эритроцитов и снова центрифугируют лекса непосредственно определяется фотомет 30 мин при 3000 об/мин и удаляют верхний слой.

рией, либо окрашенный комплекс используется лишь как индикатор конца титрования, методы Реактив 2, с. 262. второй группы сейчас практически не находят применения.

Реактив 1, с. 262.

К сожалению, ни один из описываемых ниже методов не обладает бесспорными преимуще- Основной ка либровочный Раствор Концентра ствами, чтобы полностью вытеснить все осталь раствор магния Вода, мл ция кальция.

ные. Большинство работников отдает предпочте 25 ммоль/л 3 мг/мл, мл ммоль/л ние методу с крезолфталеинкомплексоном, кото Са, мл рый принят в качестве унифицированного. При нятый ранее в качестве унифицированного метод с глиоксаль-бис-2-оксианилином, видимо, менее 6,0 1,0 До 100 1, точен, но для этого метода чехословацкое пред 8,0 1,0 » 100 2, приятие «Лахема» выпускает готовые наборы 10,0 1,0 » 100 2, реактивов, которые продолжают совершенство 12,0 1,0 » 100 3, ваться. Самый старый метод с мурексидом так 14,0 1,0 » 100 3, же продолжает использоваться в некоторых лабораториях, наконец, самый чувствительный метод с флурексоном имеет то преимущество, что позволяет обходиться минимальным коли Через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной чеством исследуемого материала. Описанный оптического пути 0,5 см при длине волны 500— ниже метод унифицирован в 1979 г.

560 нм (зеленый светофильтр) против рабочего Унифицированный метод по цветной реакции раствора крезолфталеинкомплексона. Одновре с крезолфталеинкомплексоном. Пр и н ц и п.

менно обязательно ставят хотя бы одну калибро Крезолфталеинкомплексон образует с кальцием вочную пробу. Расчет ведут по калибровочной в щелочной среде комплекс красно-фиолетового кривой либо по правилу пропорций.

цвета, интенсивность окраски пропорциональна концентрации кальция. В реакционную смесь Пр и м е ч а н и е. Некоторые сорта стекла добавляют 8-оксихинолин, который связывает могут выщелачиваться, отдавая в раствор металлы, мешающие определению, но образует соли кальция, поэтому лабораторную посуду, с кальцием менее прочный комплекс, чем крезол особенно пробирки, желательно предвари фталеинкомплексон.

тельно прокипятить в соляной кислоте. Опре Ре а кт ив ы. 1. Боратный буфер: 200 г деление желательно проводить в сыворотке борной кислоты (Н3ВОз, ортоборная кислота) или в плазме, полученной из гепаринизиро растворяют при нагревании в 300 мл воды, ванной крови, так как щавелевая, лимонная добавляют 580 мл 5 н. КОН, объем доводят кислота и другие антикоагулянты, связываю водой в мерной колбе до 1 л, при температуре щие кальций, могут помешать определению.

ниже 56 °С из раствора могут выпадать кристал Ли т е р а т у р а. Boross M., Szilagyil лы. 2. Глицин 2 моль/л: 7,5 г глицина растворя L Kisrl. Orvostud, 1974, vol. 24, p. 96— ют в 40 мл воды, переносят в мерную колбу и 102.

доводят объем до 50 мл. Для консервации до бавляют 2 капли хлороформа, хранят в холо- Метод определения кальция по цветной реак дильнике. 3. 8-Оксихинолин (оксин), 1 % раст- ции с глиоксаль-бис-2-оксианилом. Пр и н ц и п.

вор: 500 мг препарата растворяют в 50 мл абсо- Глиоксаль-бис-2-оксианил образует с кальцием лютного спирта. 4. Рабочий буферный раствор:

в щелочной среде окрашенный комплекс красно к 300 мл воды добавляют 12,5 мл боратного го цвета, интенсивность которого пропорцио буфера и 5 мл раствора глицина, перемешивают нальна концентрации кальция.

и устанавливают величину рН в пределах 10,5— Ре а к т ив ы. 1. Метиловый спирт (мета 10,6 с помощью 5 н. КОН, добавляют 50 мл 1 % нол) х. ч., безводный. 2. Глиоксаль-бис-2-оксиа раствора оксихинолина, переносят в мерную кол- нил (ГБОА), 0,05 % раствор в метаноле, 50 Mi бу вместимостью 500 мл и доводят до метки препарата растворяют в 100 мл этанола. Раствор водой, после чего снова проверяют рН. 5. Кре- нестойкий. 3. Боратный буфер рН 12,6. Раство зилфталеинкомплексон, 0,1 % раствор: 10 мг ряют в воде 10 г едкого натра (NaOH) и 10 г крезилфталеинкомплексона растворяют в 100 мл тетрагидробората натрия (Na2B4O7-10Н2О), основного буферного раствора. При хранении объем доводят до 1 л в мерной колбе. 4. Ацетон в холодильнике реактив стоек не более 2— х. ч. 5. Смесь метанола и ацетона 9:1 (по 3 дней. 6. Калибровочный раствор. Основной объему). 6. Калибровочные растворы. Основ калибровочный раствор, содержащий кальций ной калибровочный раствор, содержащий в концентрации 25 ммоль/л, готовят, растворяя 25 ммоль/л Са, готовят, растворяя 100 мг карбо 250 мг кальция карбоната (СаСОз) в 5 мл 1 н.

ната кальция (СаСОз) в 5 мл 1 н. HCI и доводя HCI. Раствор переносят в мерную колбу вмести- объем раствора до 100 мл водой в мерной колбе.

мостью 100 мл и доводят водой до метки. Для Из этого раствора готовят рабочие калибровоч консервации добавляют 2 капли хлороформа.

ные растворы с концентрацией 1,5—3,5 ммоль/л, Одновременно готовят раствор солей магния отбирая 6—14 мл в мерную колбу вместимостью 3 мг/мл, растворяя 2,5 г хлорида магния 100 мл и доводя объем водой до метки (приготов (MgCl2-6H2O) в 100 мл воды. Из этих растворов ление аналогично методу, описанному в преды готовят рабочие калибровочные растворы, со- дущем методе, но без солей магния).

гласно приведенной ниже таблице.

Ход о пр е д е л е ния. К 1,5 мл боратного Ход о п р е д е л е н и я. К 3 мл рабочего буферного раствора прибавляют 0,02 мл иссле раствора крезолфталеинкомплексона добавляют дуемой сыворотки и через l'/2 мин 0,5 мл 0,05 мл исследуемой сыворотки, перемешивают. 0,05 % раствора ГБОА в метаноле и еще через 1 '/2 мин 1 мл смеси метанола и ацетона. Фото- ных распадах костей, гиперпаратиреоидизме, метрируют точно через 5—10 мин после добав- гипервитаминозе D. Оно уменьшается при нару ления 0,05 % раствора ГБОА при длине волны шении всасывания в кишечнике в результате 540—550 нм в кювете с длиной оптического пути стеатореи или гиповитаминоза D, а также при 1 см против холостой пробы, в которую вместо некоторых почечных тубулопатиях и главным исследуемой сыворотки берут воду. Одновре- образом недостаточности паращитовидных же менно ставят также калибровочную пробу. лез.

Ра с ч е т выполняют по калибровочному графику либо по правилам пропорции.

5.8.3. Магний Пр и м е ч а н и е. ГБОА в щелочной среде распадается с образованием анилина и гли Методы определения магния во многом близ оксаля, который затем окисляется в глиокса ки методам определения кальция, так как и в левую кислоту, способную образовывать ком том, и в другом случае на первом месте по плексы с кальцием. Даже в растворе абсо точности стоит атомная абсорбция, на втором — лютного метанола на протяжении несколь химические методы, основанные на образова ких недель реактив разрушается. Накапли нии окрашенных комплексных соединений. Хотя вающаяся глиоксалевая кислота в значи магний, подобно кальцию, только частично на тельно большей степени сказывается на экс ходится в плазме крови в ионизированном со тинкции опытных, нежели калибровочных, стоянии, а частично связан с белками и низко проб. Поэтому измерение оптической плот молекулярными комплексообразователями — ности должно проводиться в совершенно лимонной и фосфорной кислотами, однако кли определенное время, причем при длине волны ническое значение имеет только определение 540—550 нм показания стабильнее, чем при общего магния.

длине 530 нм, при которой наблюдается Известно много веществ, образующих окра максимум пика.

шенные или флюоресцирующие комплексы с Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы и кли- магнием, аналитическая пригодность их опреде н и ч е с к о е з н а ч е н и е те же, что и в пре- ляется чувствительностью и главное способ дыдущем методе.

ностью избирательно реагировать с магнием в присутствии кальция. К сожалению, абсолютной Ли т е р а т у р а. Mayer M., Farese G. Clin.

избирательности достичь очень трудно, поэтому Chem., 1966, vol. 12, p. 234. Kao N., Rose Ch. F.

приходится использовать составные калибровоч Lab. Pract., 1971, vol. 20, N 3, p. 217—219.

ные растворы, в которых присутствует несколько Метод определения кальция по цветной реак- веществ.

ции с мурексидом в присутствии глицерина. Давно известен не очень чувствительный Пр и н ц и п. Мурексид образует с кальцием в метод определения с титановым желтым, кото щелочной среде окрашенный комплекс, устойчи- рый достаточно специфичен, но требует предва вость которого повышается путем добавления в рительной депротеинизации, благодаря чему раствор глицерина. может быть использован для определения маг Ре а к т и в ы. 1. Мурексидглицериновый ния в эритроцитах. Значительно чувствительнее реактив: 20 мг мурексида растворяют в 10 мл 4 н. метод с магоном (ксилидиновым синим II) или КОН, 1 мл этого раствора смешивают с 20 мл его сульфопроизводным (ксилидиновый си смеси из 10 мл воды и 10 мл глицерина. 2. Калиб- ний I). В кислой среде это вещество существует ровочные растворы готовят так же, как и в пре- в виде окрашенного в красный цвет недиссоции дыдущем методе '. рованного соединения, в слабощелочной — в Ход о п р е д е л е н и я. В 0,3 мл воды вно- виде однозарядного иона синего цвета, а в силь сят 0,1 мл исследуемой сыворотки, затем туда нощелочной — в виде двухзарядного иона крас же добавляют 3 мл мурексилглицеринового ного цвета. С ионом магния образуют устойчи реактива, перемешивают и через 5 мин фото- вый окрашенный в красный цвет комплекс два метрируют в кювете с длиной оптического пути однозарядных иона. Методы с титановым жел I см при длине волны 490 нм против холостой тым и магоном унифицированы в 1974 г.

пробы, в которую вместо исследуемой сыворотки Определение магния по цветной реакции с берут воду. Одновременно ставят калибровоч- титановым желтым. Пр и н ц и п. Магний в ную пробу, в которую вместо сыворотки берут щелочной среде образует комплекс красного 0,1 мл калибровочного раствора. цвета с титановым желтым, присутствие гидро Ра с ч е т производят по калибровочному ксиламина стабилизирует окраску. При анализе графику. сыворотки или эритроцитов белки осаждают вольфраматом натрия, моча предварительно Ли т е р а т у р а. Вишневская Т. М., Ля разводится до нужной концентрации.

шевская Т. Н. Лаб. дело, 1976, № 7, с. 444.

Ре а к т ив ы. 1. 0,075 % раствор титанового Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы для всех желтого: 18,7 мг вещества растворяют в 25 мл приведенных методов 2,3—2,75 ммоль/л (9— воды, хранят в холодильнике в темной склянке;

11 мг в 100 мл).

реактив очень светочувствителен, годен не более Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Содержа 10 дней. 2. 2 % раствор гидрохлорида гидрокси ние кальция в сыворотке повышается при массив ламина: 2 г гидроксиламинагидрохлорида (H2NOH-HC1) растворяют в 100 мл воды.

3. 0,1 % раствор метилового красного в 95 % См, с. 265.

этиловом спирте, индикатор с зоной перехода Пр и м е ч а н и е. Чехословацкая фирма рН 4,4—6,2. 4. 0,2 н. NaOH. 5. 1,5 н. NaOH. «Лахема» выпускает набор реактивов для 6. 10 % раствор вольфрамово-кислого натрия: работы этим методом.

10 г вольфрамата натрия (Na2WO4) растворяют Ре а к т ив ы. 1. Раствор магона, содер в воде, объем доводят до 100 мл. 7. 0,67 н. серная жащий 0,28 ммоль/л: 115,4 мг магона при кислота. 8. Калибровочный раствор магния нагревании растворяют в 50 мл диметилфор сульфата 1 ммоль/л: 246,5 мг сульфата магния мамида, объем доводят до 1л 96 % этило (MgSO -7H O) растворяют в воде, объем дово 4 вым спиртом. 2. 0,02 М боратный буфер рН дят в мерной колбе до 1 л.

9,5: примерно в 800 мл воды растворяют Ход о п р е д е л е н и я. К2 мл воды добав 7,63 г буры (Na B O - 10H O), прибавляют 2 4 7 ляют 1 мл исследуемой сыворотки и 1 мл 10 % 79 мл 0,1 н. NaOH и проверяют рН, добав вольфрамата натрия, затем 1 мл 0,67 н. серной ляют столько щелочи, сколько необходимо, кислоты. Перемешивают стеклянной палочкой, чтобы рН был 9,5, после чего водой доводят а затем через 10—15 мин центрифугируют или объем до 1 л. 3. Рабочий раствор магона. В день фильтруют. В градуированную пробирку или определения смешивают равные части раствора мерный цилиндр с отметкой 10 мл отмеривают магона и боратного буфера. Реактив нестоек, 2,5 мл безбелкового фильтрата, добавляют кап годен в течение одного рабочего дня. 4. Комп лю индикатора метилового красного и 0,2 н.

лексный калибровочный раствор: 200 мг метал NaOH до установления желтой окраски. После лического магния в виде стружки промывают этого прибавляют 1 мл 2 % гидрохлорида гидро разбавленной НС1, водой, спиртом и эфиром, ксиламина, 1 мл 0,075 % титанового желтого высушивают сначала в токе азота, затем под и 2 мл 1,5 н. NaOH и доводят объем водой до вакуумом и растворяют в 15 мл концентриро 10 мл. Фотометрируют в кювете с длиной опти ванной НС1, добавляют около 200 мл воды и ческого пути 1 см при длине волны 500—560 нм 2,5 г кальция карбоната (СаСОз), 2,86 г ка против холостого опыта, в который вместо сыво лия хлорида (КС1) и 65,4 г натрия хлорида ротки крови берут 1 мл воды.

(NaCl);

после растворения всех ингредиен Для построения калибровочного графика в тов объем доводят водой до 1 л. Получается серию пробирок вносят от 0,2 до 1 мл калибро раствор, содержащий 200 мг магния в 1 л, вочного раствора 1 ммоль/л, доводят водой до перед употреблением его разводят водой в объема 6 мл, прибавляют по 1 мл 2 % гидрохло 10 раз, получается рабочий калибровочный рида гидроксиламина, 0,075 % титанового жел раствор, содержащий 0,823 ммоль/л магния того и 2 мл 1,5 н. NaOH. Окраска раствора, в (2 мг%).

который добавлено 0,2 мл калибровочного раст Ход о п р е д е л е н и я. К 4 мл рабо вора, соответствует содержанию магния в плаз чего раствора магона прибавляют 30 мкл ме 0,4 ммоль/л, раствора, в который добавлено исследуемой сыворотки или спинномозговой 0,5 мл, — концентрации 1 ммоль/л и т. д.

жидкости, перемешивают и фотометрируют в Пр и м е ч а н и я. 1. При определении содер- кювете с длиной оптического пути 1 см при жания магния в эритроцитах 0,5 мл эритро- длине волны 505 нм против холостого опыта, цитарной взвеси, полученной так же, как и в который вместо сыворотки берут воду.

при определении в клетках калия и натрия ', Одновременно ставят калибровочный опыт, в вносят в 2,5 мл воды, через несколько минут, который вместо сыворотки берут 30 мкл рабо когда взвесь просветлеет (станет лаковой), чего калибровочного раствора, содержащего что свидетельствует о завершении гемолиза, 0,823 ммоль/л магния. Расчет ведут по пра добавляют вольфрамат натрия, серную кис- вилу пропорций.

лоту и т. д. аналогично определению в плаз ме. 2. Метод пригоден также для определения Ли т е р а т у р а. Chromy V., Svoboda V., магния в моче. В этом случае ее разводят Stepanova I. Biochem. Med., 1973, vol. 7, N 2, водой в 10 или 20 раз (так как концентрация p. 208—217.

может сильно колебаться), к 0,5 мл прилива- Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы: содержа ют 5,5 мл воды, по 1 мл растворов гидрохло- ние магния в сыворотке 0,7—1,2 ммоль/л.

рида гидроксиламина и 0,075 % титанового Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е определе желтого, а также 2 мл 1,5 н. NaOH и фото- ния магния в сыворотке ограничено. Повышение метрируют. его концентрации бывает при уремии, гипотирео зе и диабетическом ацидозе, понижение — при Ли т е р а т у р а. Лаб. дело, 1977, № 5, нарушении всасывания, тиреотоксикозе, хрони с. 303—304.

ческом алкоголизме и альдостеронизме.

Определение магния по цветной реакции с магоном. Пр и н ц и п. Магний дает с магоном (ксилидиловый синий II) яркое окрашивание, 5.8.4. Железо белки сыворотки не препятствуют его развитию.

В связи с тем что на интенсивности окраски ска зывается присутствие других катионов, исполь Подавляющая часть всего железа человече зуют комплексный калибровочный раствор.

ского организма находится внутри эритроцитов и входит в состав гемоглобина. Каждая его молекула содержит 4 атома двухвалентного См. с. 261. железа, на долю которых приходится 0,334 % ее массы, что при концентрации гемоглобина нового железа сыворотки, а также ее железо в крови 140 г/л соответствует содержанию желе- связывающей способности, т. е. того максималь за 500 мг/л крови. Определение содержания ного количества трехвалентного железа, которое железа в цельной крови не имеет практического может связаться с белками сыворотки.

значения, так как определять гемоглобин зна- Прочность комплекса трансферрин — желе чительно проще. Иное дело плазма крови, содер- зо максимальна при рН 7,0 и зависит от природы жание железа в которой примерно в 300 раз буферного раствора. При увеличении кислотно ниже и составляет около 1,5 мг/л. Его большая сти, а также восстановлении железа комплекс часть находится в окисленном состоянии, т. е. распадается. Другие соединения, например трехвалентна и связана с белком трансферрином гемоглобин, в этих условиях не разрушаются (сидерофилином);

кроме того, в плазме имеются или разрушаются лишь незначительно, поэтому геминовое железо, ферритин и внутрисосуди- кислотноотщепляемое или негеминовое железо стый гемоглобин. Так называемое гемино- лучше других компонентов плазмы характери вое железо входит в состав молекул, зует резервы железа в организме. Существует содержащих только по одной порфирино- несколько вариантов методов определения вой группе. Это продукты неполного син- негеминового железа, в частности некоторые теза или распада гемоглобина и дыхательных рекомендуют проводить нагревание на водяной ферментов, они связаны с транспортным сыворо- бане для лучшего разрушения комплекса, точным белком гемопексином. Ферритин — са- но при этом всегда существует угроза, что раз мый богатый железом сывороточный белок, в его рушатся и другие железосодержащие соеди составе находится мицелла, содержащая до нения, поэтому результаты анализа будут завы 4300 атомов окисленного железа. Молекулы шенными.

гемоглобина, образовавшиеся в результате Известно много цветных реактивов как на внутрисосудистого гемолиза, содержат 4 порфи- восстановленное (Fe+ + ), так и на окисленное риновых кольца, они связываются не с гемо- (Fe+ + + ) железо;

лучшие результаты получа пексином, а с гаптоглобином. Разрушение эри- ются с батофенантролином, который образует троцитов и увеличение содержания в плазме наиболее прочный и яркоокрашенный комплекс.

свободного гемоглобина почти неизбежны при Но батофенантролин нерастворим в воде, поэто взятии крови. Считается, что при соблюдении му его надо предварительно обработать хлор всех предосторожностей (игла с широким про- сульфоновой кислотой либо использовать спир светом, свободное вытекание крови, осторожное товой раствор. При определении железа после отслоение сгустка, центрифугирование в течение минерализации с серной кислотой надо всегда 45 мин при 2500 об/мин, отсасывание сыворотки иметь в виду, что почти неизбежно образующая и повторное центрифугирование) удается умень- ся в этих условиях пирофосфорная кислота, шить количество свободного гемоглобина в связывая железо, мешает проведению цветной сыворотке лишь до уровня около 30 мг/л, что реакции, поэтому ее надо разрушать, нагревая соответствует содержанию железа 100 мкг/л или на водяной бане слегка разбавленный минера примерно 1/15 всего железа сыворотки. Исполь- лизат.

У с л о в и я в з я т и я ма т е р и а л а. Оп зуемые при получении плазмы антикоагулянты ределение сывороточного железа обычно прово сами связывают железо, поэтому рекомендуется исследовать содержание железа именно в сыво- дят для выявления железодефицитного состоя ротке. ния, поэтому, как правило, информативно умень Железо поступает в организм через желу- шение его содержания. Обследуемые по крайней дочно-кишечный тракт, а выводится почти мере 2 нед перед взятием крови не должны полу исключительное калом (конечно, если нет крово- чать железосодержащих препаратов. Кровь течения или гематурии), поэтому содержание надо брать широкими иглами, по возможности его в моче у здоровых очень мало — 0,7— новыми. Сыворотка должна быть свободна от 5,7 нмоль/сут (0,04—0,3 мкг), это количество не видимых следов гемолиза.

может быть уловлено обычными методами. Батофенантролиновый метод определения После приема некоторых железосодержащих железа унифицирован в 1974 г.

препаратов или комплексообразователя десфе- Определение железа по цветной реакции с рала, который способствует опустошению депо, сульфонированным батофенантролином.

выведение железа с мочой значительно увеличи- Пр и н ц и п. Белки осаждают трихлоруксусной вается и может быть измерено. кислотой, которая при прогревании разрушает Состояние обмена железа лучше всего харак- также комплекс железа с трансферрином. Для теризует количество негеминового сывороточ- установления оптимальной величины рН 4,8— ного железа, т. е. железо трансферрина и фер- 5,0 добавляют аммония ацетат, а для восстанов ритина, так как это основной резерв, который ления всего железа гидразин. Двухвалентное используется организмом в случае необходимо- железо образует окрашенный комплекс с бато сти. Общее количество трансферрина, связан- фенантролином, который переведен в сульфати ного с железом и свободного, может быть опре- рованную форму добавлением хлорсульфоновой делено также иммунологическими методами, кислоты.

определяют и количество свободного трансфер- Ре а к т ив ы. 1. Трихлоруксусная кислота, рина по его способности связывать радиоактив- 20 %. 2. Аммония ацетат: 70 г ацетата аммония ное железо. Для практических лабораторий, (СНзСООNН4) растворяют в воде, объем дово использующих обычные биохимические методы, дят до 100 мл. Препарат гигроскопичен. 3. Гид наибольшее значение имеет определение негеми- разина сульфат, насыщенный раствор, готовят, заливая 2,5 г препарата 100 мл воды. 4. Раствор Определение железа по цветной реакции со сульфонированного батофенантролина: в про- спиртовым раствором батофенантролина.

бирке к 100 мг батофенантролина (4,7-дифенил- Пр и н ц и п. Сывороточное железо восстанав 1,10-фенантролина) приливают 0,5 мл хлорсуль- ливают тиогликолевой кислотой, белки осаж фоновой кислоты, нагревают на кипящей водя- дают трихлоруксусной кислотой, в фильтрате ной бане 30 с, охлаждают и медленно приливают устанавливают нужную величину рН, добавляя 10 мл воды, после чего снова нагревают на ацетат натрия, и проводят цветную реакцию водяной бане 5 мин и разбавляют 100 мл воды. с батофенантролином. В связи с тем что он в Добавляя 5 н. NaOH, устанавливают рН 4,0 и воде нерастворим, используют спиртовой раст доводят объем водой до 200 мл. 5. Калибровоч- вор.

ный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л. Ре а кт ив ы. 1. Кислота тиогликолевая.

Сначала готовят раствор соли Мора (железо- 2. Кислота трихлоруксусная, раствор 400 г/л.

аммиачные квасцы, аммонийжелезо II сернокис- 3. Натрия ацетат, насыщенный раствор: в случае лое), FeSO4- (NH4)SO4-6H2О, содержащий необходимости его очищают от следов железа, 3 ммоль/л, растворяя 1,178 г в 5 мл 0,3 н. НС1 и растворяя 500 г в 1 л воды при 37 °С. К прозрач доводя объем до 1 л водой, содержащей в 1 л ной надосадочной жидкости добавляют раствор 1 мл концентрированной серной кислоты. Этот батофенантролина из расчета 10 мл на 1 л и раствор разводят подкисленной водой в 100 раз;

этиловый спирт в количестве, равном количеству получается раствор, содержащий 30 мкмоль/л, надосадочной жидкости;

на холоду выпадают или 1,67 мкг/мл. кристаллы СНзСООNа-ЗН2О. 4. Батофенантро Ход о п р е д е л е н и я. К2 мл исследуемой лин, 40 мг в 100 мл этанола. 5. НС1 1 н. раствор.

сыворотки прибавляют 2,5 мл воды и 1,5 мл 6. Калибровочный раствор железа: 100 мг мяг 20 % раствора трихлоруксусной кислоты, пере- кой железной проволоки растворяют в 4 мл кон мешивают и ставят на 15 мин на водяную баню центрированной НС1 и разводят до 1 л водой, температуры 90—95 °С. Затем центрифугируют получается раствор, содержащий 100 мкг/мл.

20 мин при 2000 об/мин и отбирают 4 мл про- Из него разведением в 60 раз получают раствор, зрачного слоя, к которым приливают 0,35 мл содержащий 30 мкмоль/л (1,67 мкг/л).

70 % раствора аммония ацетата и 0,3 мл раство Пр и ме ч а н и е. Учитывая, что метод опре ра сульфата гидразина. Смесь фотометрируют деления очень чувствительный, необходимо при длине волны 535 нм в кюветах с длиной опти принять все меры, чтобы реактивы и посуда ческого пути 1 см, затем прибавляют 0,4 мл ра не содержали железа, присутствие которого створа сульфонированного батофенантролина, выявляется при постановке холостых проб.

оставляют на 1 ч и снова фотометрируют при Посуду, в том числе пробирки для взятия той же длине волны. Обе фотометрии выполняют крови, необходимо обрабатывать разбавлен против холостого опыта, в который берут вместо ной HCI;

должна использоваться только исследуемой сыворотки 2 мл воды.

деионизированная или перегнанная в стек Калибровку проводят так же, как и основной лянной посуде вода;

реактивы очищаются опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибро перекристаллизацией.

вочного раствора.

Ра с ч е т сывороточного железа (мкмоль/л) Ход о п р е д е л е ни я. К 0,7 мл сыворотки выполняют по формуле:

прибавляют 2 капли тиогликолевой кислоты, взбалтывают, а затем еще 0,35 мл 1 н. НС1, опять перемешивают и прибавляют 0,2 мл раст вора трихлоруксусной кислоты. Энергично раз мешивают стеклянной палочкой в течение 45 с, а затем центрифугируют при 2500 об/мин. В про бирку с притертой пробкой отбирают из надоса дочной жидкости 0,7 мл, к которым прибавляют 0,6 мл насыщенного раствора аммония ацетата и 0,7 мл раствора батофенантролина. Окраска результаты фотометрии калибровочной пробы;

развивается за 20—30 с. Фотометрируют в кюве 30 — содержание железа в калибровочном раст те с длиной оптического пути 1 см при длине воре, мкмоль/л.

волны 536 нм против холостой пробы, в которую вместо сыворотки берут 0,7 мл воды. Одновре Пр и м е ч а н и я. 1. Надо тщательно следить менно обрабатывают и калибровочную пробу, в за содержанием железа в дистиллированной воде и реактивах, используя в случае необхо- которой вместо сыворотки используют 0,7 мл димости бидистиллированную воду, приго- калибровочного раствора, содержащего товленную в стеклянном перегонном аппа- 30 мкмоль железа в 1 л.

рате. 2. Если после удаления белков не уда- Ра с ч е т проводят по правилу пропорций.

ется набрать точно 4 мл надосадочной жид- Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Негемино вое железо плазмы 12—32 мкмоль/л (65— кости, можно взять меньшее ее количество 175 мкг/100 мл), у женщин на 10—15 % ниже, и сделать поправку при расчете или же взять чем у мужчин.

точно такое же количество калибровочного Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Уменьше раствора.

ние негеминового железа сыворотки свидетель Ли т е р а т у р а. Лаб. дело, 1977, № 5, ствует об истощении резервов и бывает при с. 302—303. железодефицитных состояниях. Железосвязы вающая способность сыворотки, т. е. общее вают 10 мл воды и ставят на кипящую водяную количество трансферрина, при этом возрастает. баню на 5—10 мин, после чего объем пробы до Определение железосвязывающей способ- водят до 20 мл водой. Отбирают 4 мл, к которым ности сыворотки крови. Пр и н ц и п. Исследуе- прибавляют 0,3 мл насыщенного раствора суль мую сыворотку выдерживают с раствором трех- фата гидразина и 1,2 мл насыщенного раствора валентного железа, при этом весь трансферрин ацетата аммония, после чего фотометрируют при насыщается. Избыток солей железа удаляют длине волны 535 нм в кювете с длиной оптиче адсорбцией на карбонате магния и определяют ского пути 1 см и прибавляют 0,5 мл раствора содержание железа в надосадочной жидкости сульфонированного батофенантролина и остав одним из приведенных выше методов. ляют на 1 ч, затем повторно фотометрируют в тех Ре а к т и в ы. 1. Железо хлорное, 5 мг/мл: же условиях.

2,42 г FеС1 -6Н О растворяют в 100 мл 0,005 н.

Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы. В норме 3 НС1. 2. Магния карбонат в порошке. 3. Все реак- этим методом железо в моче не определяется.

тивы, необходимые для определения сывороточ- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Железо в ного железа одним из описанных выше методов. моче определяется после приема железосодер Ход о п р е д е л е н и я. К2 мл исследуемой жащих препаратов, а также при проведении сыворотки добавляют 4 мл раствора хлорного десфералевой терапии (удаление избытка желе железа и тщательно перемешивают. Через 5 мин за из организма с помощью комплексообразова прибавляют порошок магния карбоната в телей).

объеме примерно 0,5 мл, встряхивают 10—15 с и центрифугируют. В надосадочной жидкости определяют железо одним из описанных выше 5.8.5. Фосфор методов. Полученный результат умножают на и фосфорсодержащие вещества (разведение сыворотки).

Но р ма л ь н ые в е л и ч и н ы. Железо связывающая способность сыворотки 45— Помимо неорганического фосфора, концент 75 мкмоль/л (250—400 мкг/100 мл), у женщин рация которого в плазме и эритроцитах практи на 10—15 % ниже, чем у мужчин.

чески одинакова, в крови различают еще фрак цию кислоторастворимого фосфора и липидного Ли т е р а т у р а. Caraway W. Т. Clin.

фосфора. Кислоторастворимый фосфор весь Chem., 1963, vol. 9, N 2, p. 188—189.

находится в клетках, липидный — ив эритроци Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Железо- тах, и в плазме.

связывающая способность возрастает при желе- Результаты определения неорганического зодефицитных состояниях. фосфора во многом зависят от используемого Определение железа в моче по цветной реак- метода (см. ниже). Концентрация его может ции с сульфонированным батофенантролином. значительно уменьшаться, например при алко Пр и н ц и п. Моча минерализуется с серной голизме, причем это реально не сказывается на кислотой, образовавшийся пирофосфат железа каких-то физиологических процессах. Клиниче разрушается гидролизом на кипящей водяной ски падение неорганического фосфора наиболее бане, раствор нейтрализуется ацетатом аммо- информативно у детей при рахите, когда оно ния, железо восстанавливается сульфатом гид- наступает из-за нарушения всасывания. Повы разина и проводится цветная реакция с сульфо- шение также нельзя трактовать всегда одина нированным батофенантролином. ково, поскольку оно может быть и признаком Ре а к т ив ы. 1. Кислота серная концентри- высокой тренированности спортсмена, и насту рованная. 2. Перекись водорода, 30 % раствор в пать при тяжелой уремии, когда почки не могут воде (пероксид). 3. Сульфат гидразина, насы- выводить соли фосфорной кислоты, образую щенный раствор: 2,5 г вещества заливают 100 мл щиеся при окислении пищевых белков и фосфо воды. 4. Аммония ацетат, насыщенный раствор: липидов.

к 148 г соли добавляют 100 мл воды. 5. Раствор Кислоторастворимый фосфор — это низко сульфонированного батофенантролина — см. молекулярные, органические соединения, кото определение в сыворотке крови. 6. Калибровоч- рые остаются в надосадочной жидкости после ный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л, осаждения белков кислотами — трихлоруксус см. определение в сыворотке крови. ной, хлорной и т. д. Это в основном промежуточ Ход о п р е д е л е н и я. В колбу Кьельдаля ные продукты гликолиза, моно- и динуклеотиды, помещают 5 мл исследуемой мочи и 1 мл кон- которые находятся в эритроцитах. Ядросодер центрированной серной кислоты и нагревают на жащие клетки, кроме того, богаты и поли электрической плитке с закрытой спиралью или нуклеотидами — ДНК и РНК, но этих клеток на песчаной бане, не должно быть бурного кипе- в крови мало, поэтому суммарный их вклад ния и образования пены, которая поднималась невелик. Примерно /з всего кислотораствори бы в горлышко колбы, в конце сжигания должны мого фосфора крови входят в состав молекул образовываться тяжелые белые пары, занимаю- дифосфоглицериновой кислоты эритроцитов — щие нижнюю часть колбы. Когда материал по- 2,3-ДФГ, количество которой увеличивается при темнеет и объем его уменьшится примерно напо- всех заболеваниях, сопровождающихся хрони ловину, добавляют несколько капель пергидро- ческой гипоксией;

остальное — это главным ля, что способствует просветлению пробы. образом фосфор АТФ и АДФ. Фосфорилирован Сжигание проводят до тех пор, пока раствор не ных Сахаров — гексозо- и пентозофосфатов — станет совсем светлым. После охлаждения доли- относительно немного. Поэтому клиническое значение определения кислоторастворимого нерализуют (сжигают). Некоторые авторы фосфора крови примерно такое же, как 2,3-ФДГ рекомендуют для этого нагреватель с серной эритроцитов. кислотой, так же как и при анализе азотистых Во фракцию липидного фосфора входят те соединений. В этом случае температура должна соединения, которые можно экстрагировать не быть около 300 °С, при этом образуются пиро смешивающимися с водой растворителями — фосфаты, которые надо разрушить, прокипятив эфиром, хлороформом и т. д. В эритроцитах разбавленный минерализат. Поэтому лучше ми они участвуют в образовании оболочки, в плаз- нерализовать нагреванием с хлорной кисло ме частиц липопротеидов. Большая часть ли- той, когда температура около 200 °С (дигидрат пидного фосфора приходится на долю производ- хлорной кислоты кипит при 203 °С), и пиро ных фосфатидиловой кислоты — фосфатидил- фосфаты не образуются.

холинов (лецитинов) и фосфатидилэтанолами- Но р ма л ь ные в е л ич ины: неоргани нов (кефалинов). ческий фосфор в плазме или сыворотке При определении неорганического фосфора 1—2 ммоль/л (3—6 мг/100 мл), в эритроцитах в плазме белки осаждают трихлоруксусной 1 —1,5 ммоль/л (3—4 мг/100 мл).

или хлорной кислотой и в безбелковом экстракте Ки с л о т о р а с т в о р и м ы й фос фор определяют фосфор. Результат в значительной в эритроцитах 7—14 ммоль/л (22—44 мг в мере зависит от используемого метода. При этом 100 мл).

играют роль два обстоятельства. Во-первых, Л и п и д н ы й фо с фо р в п л а з м е отщепление остатка фосфорной кислоты от орга- и л и с ыв о р о т к е 2—3,5 ммоль/л (7—11 мг/ нических соединений;

по этой причине при 100 мл), в эритроцитах 3—5 ммоль/л (10— осаждении белков трихлоруксусной кислотой 16 мг/100 мл).

результаты выше, чем при осаждении хлорной кислотой. Во-вторых, во всех методах определе ния фосфора на первом этапе образуется 5.8.6. Неорганический фосфор фосфорно-молибденовая гетерополикислота, ко личество которой чаще всего определяют путем Унифицированный метод определения фос восстановления до молибденового синего. Ге- фора по восстановлению фосфорно-молибдено терополикислоту образуют не только неоргани- вой гетерополикислоты (метод унифицирован ческий фосфор, но и некоторые его органи- в 1972 г.). Пр и н ц и п. Белки осаждают три ческие производные. Варьируя восстановитель, хлоруксусной кислотой, в кислой среде фосфор условия протекания реакции и длину волны ная кислота образует с молибденовой кислотой при фотометрии, можно в значительной мере фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, ко изменить чувствительность и специфичность торая восстанавливается эйконогеном с образо реакции. При определении неорганического фос- ванием ярко окрашенного молибденового си фора в крови или тканях самые точные резуль- него.

таты получаются, если восстанавливать фосфор- Ре а к т ив ы. 1. Кислота трихлоруксусная, но-молибденовую гетерополикислоту эйконоге- раствор 100 г/л (10%). 2. Кислота серная ном, другие вещества — аскорбиновая кислота, 5 н. 3. Аммоний молибденовокислый, 5 % раст гидрохинон и т. д.— в той или иной степени вор. Готовят, растворяя 5 г (NН4)6Мо7O2-4Н2О завышают результаты, так как на них сказы- в 100 мл 5 н. серной кислоты. 4. Натрий кислый вается присутствие фосфорных эфиров Саха сернистокислый NaHSO3. В такой форме соль ров и глицерина. Иное дело после минерализа- существует только в растворе, это скорее ком ции, тут годится любой восстановитель.

мерческое, нежели химическое, название. При Некоторые методы определения фермен- кристаллизации выпадает пиросернистокислый тов — фосфатаз и фосфокиназ (например, натрий (Na2S2O5), который называют также креатинкиназы), а также фосфорсодержащих метабисульфитом. Все три названия — бисуль соединений (например, АТФ) — в конечном фит, пиросульфит и метабисульфит — синони итоге сводятся к анализу содержания отщепив- мы;

препараты с этими названиями могут быть шегося в определенных условиях фосфора. с равным успехом использованы для определе Очень важно, чтобы неорганический фосфор ния фосфора. 5. Натрий сернистокислый без в этих случаях определялся таким методом, водный, сульфид натрия Na2SO3. 6. Эйконоген, на результаты которого не влияют другие фос- раствор. Растворяют полностью 6 г бисульфита форсодержащие вещества. натрия в 20—25 мл воды, вносят в этот раствор Наилучшие результаты с точки зрения 0,1 г эйконогена (аминонафтолсульфоновой точности и чувствительности дают методы, кислоты), который также должен полностью в которых фосфорно-молибденовая гетерополи- раствориться, на что уходит некоторое время.

кислота не восстанавливается до молибдено- Отдельно в небольшом объеме растворяют 1,2 г вого синего, а образует окрашенный комплекс безводного сернокислого натрия, оба раствора с каким-либо основным красителем, лучше смешивают, доводят объем до 50 мл, дают от всего с малахитовым зеленым. В образовании стояться несколько часов и фильтруют. 7. Ка комплекса на один атом фосфора может при- либровочный раствор. Основной калибровочный ходиться до 3 молекул красителя, поэтому раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л, чувствительность и точность получаются очень готовят, растворяя 702,2 мг высушенного до по хорошими.

стоянной массы при 120 °С однозамещенного При определении кислоторастворимого и фосфата калия КН2РО4 в 100 мл воды. Из него липидного фосфора исследуемый материал ми- готовят рабочие калибровочные растворы, со держащие 1;

2 и 3 ммоль/л. Для этого 1;

2 или Ход о п р е д е л е н и я. 0,02 мл сыворотки 3 мл основного раствора доводят водой до вносят в 1,5 мл воды, к раствору добавляют объема 50 мл.

2 мл цветного реактива и 1 каплю 1,5 % ра Ход о п р е д е л е н и я. К1 мл прибавляют створа твина. Через 10—15 мин фотометриру 4 мл воды и 5 мл раствора трихлоруксусной ют при длине волны 600—650 нм против хо кислоты, через 10 мин центрифугируют или лостого опыта, который ставят так же, как фильтруют. К 5 мл безбелкового фильтрата и основной опыт, но без сыворотки.

добавляют 1 мл раствора молибденовокислого Для построения калибровочного графика аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл берут 0,5;

1 и 1,5 мл рабочего калибровочного воды. Через 20 мин фотометрируют при длине раствора, т. е. 10;

20 и 30 нмоль фосфора, волны 630—690 нм в кюветах с длиной опти- доводят объем до 1,5 мл, добавляют цветной ческого пути 1 см против холостого опыта. реактив и раствор твина так же, как в основ Одновременно ставят холостой опыт, в который ном опыте. Калибровочная проба, в которую вместо исследуемой сыворотки берут воду, и ка- взято 20 нмоль фосфора, по окраске соответ либровочные опыты, в которые вместо сыворотки ствует опытной пробе, у которой взята сыворот берут рабочие калибровочные растворы. ка, содержащая фосфор в концентрации Ра с че т проводят по калибровочному гра- 1 ммоль/л. Калибровочные пробы, в которые фику или правилу пропорций. взято 10 и 30 нмоль, соответствуют сыворот кам, содержащим 0,5 и 1,5 ммоль фосфора Пр и ме ч а н и я. 1. Чувствительность ме в 1 л. По этим данным строится калибровочная тода можно значительно повысить, если кривая, которая и используется для расчета.

после добавления эйконогена пробы нагре вать 7 мин на кипящей водяной бане и Ли т е р а т у р а. Грибанов Г. А., База фотометрировать при длине волны 830 нм. В нов Г. А. Лаб. дело, 1976, № 9, с. 527—530.

этом случае вместо 5 % раствора молибде Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. В сыворот нового аммония берут 0,5 % раствор в 0, ке или плазме содержится 1—2 ммоль/л (3— н. серной кислоте, остальные реактивы те же.

6 мг в 100 мл) неорганического фосфора.

2. Согласно унифицированному методу окон Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Неоргани чательный объем фотометрируемых проб со ческий фосфор увеличивается при почечной ставляет 8 мл, если объем кюветы меньше, недостаточности, гипопаратиреоидизме, передо все дозировки можно пропорционально зировке витамина D, уменьшается при наруше уменьшить.

нии кишечного всасывания, рахите, почечных Ли т е р а т у р а. Fiske С., Subbarow 1. тубулопатиях, гиперпаратиреоидизме.' J. Biol. Chem., 1925, vol. 66, p. 375;

Bartlett G. R. J. Biol. Chem., 1959, vol. 234, N 3, p. 466.

5.8.7. Липидный фосфор Метод определения фосфора по образованию Унифицированный метод определения фос окрашенного комплекса малахитового зеленого фора после осаждения белков трихлоруксусной с фосфорномолибденовой кислотой. Прин кислотой (метод унифицирован в 1972 г.).

цип. Неорганический фосфор образует с мо Пр и н ц и п. При осаждении белков крови либденовой кислотой фосфорномолибденовую трихлоруксусной кислотой все фосфолипиды гетерополикислоту, которая, реагируя с основ осаждаются вместе с белковым сгустком, а не ным красителем — малахитовым зеленым, дает органический и кислоторастворимый фосфор зеленовато-синее окрашивание. Если фосфора остаются в растворе. Белковый сгусток мине нет, то малахитовый зеленый в кислой среде рализуется нагреванием с хлорной кислотой окрашен в желто-коричневый цвет. Белок не и фосфор определяется эйконогеновым методом.

мешает проведению реакции, поэтому депротеи В связи с тем что белки плазмы не содержат низацию не проводят, для обеспечения коллоид фосфора, весь осаждаемый трихлоруксусной ной устойчивости образовавшегося комплекса кислотой фосфор входит в состав фосфоли в раствор добавляется твин 20.

пидов.

Ре а к т ив ы. 1. Малахитовый зеленый.

Ре а к т и в ы. 1. Кислота хлорная 57 %. Ее 2. Аммоний молибденовокислый. 3. Цветной концентрация должна быть 5,7 н., что прове реактив. 1,5 г малахитового зеленого растворя ряется титрованием. Если концентрация зна ют в 250 мл воды, одновременно растворяют чительно ниже, что часто случается, так как 10,3 г молибденовокислого аммония в 250 мл продажный препарат может содержать 40 или 5 н. НС1. Оба раствора смешивают, дают 50 % НСЮ4, соответственно увеличивается отстояться и фильтруют, за это время цвет количество реактива, используемого при мине реактива меняется. 4. Твин 20, 1,5 % раствор.

рализации (см. ниже). 2. Кислота трихлор 0,15 мл твина 20 разводят 10 мл воды. 5. Ка уксусная, 100 г/л (10 %). 3. Аммоний молибде либровочный раствор. Основной калибровочный новокислый, раствор 40 г/л. Готовят, растворяя раствор, содержащий 50 ммоль/л., готовят, 4 г (NН4) Мо7О24-4Н2О в 100 мл воды. 4. Натрий растворяя 702,2 мг однозамещенного кислого кислый сернистокислый '. 5. Натрий сернисто фосфата калия КН2РО4, высушенного при 120 °С до постоянной массы, в 1 л воды. Из него готовят калибровочный раствор, содержащий 20 мкмоль/л.

См. с. 271.

кислый безводный '. 6. Эйконоген, раствор. на, объем доводят водой до 10 мл. Через 20 мин 7. Калибровочный раствор. Основной калибро- фотометрируют в кюветах с длиной оптического вочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора пути 1 см при длине волны 630—690 нм, против в 1 л, разводят водой в 50 раз;

получается холостого опыта, в который берут 0,8 мл хлорной раствор, содержащий 1 мкмоль/мл. кислоты, 7 мл воды и далее проводят цветную Ход о п р е д е л е н и я. К 0,2 мл исследуе- реакцию так же, как и в опыте.

мой сыворотки добавляют 3 мл воды и медленно Для построения калибровочной кривой 3 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты, минерализуют калибровочные пробы, содержа через 1—2 мин центрифугируют, надосадочную щие 0,2—1 мкмоль фосфора. Для этого к ним жидкость сливают — пробирку переворачивают прибавляют по 1 мл хлорной кислоты и ставят и дают стечь жидкости. К осадку добавляют нагревать вместе с опытными пробами, после 1 мл 57 % хлорной кислоты;

если ее концентра- чего проводят цветную реакцию. По калибровоч ция ниже, соответственно увеличивают коли- ному графику вычисляют содержание фосфора чество кислоты, переносят в колбу или в боль- в пробе, эту величину умножают на 5 и полу шую пробирку для сжигания и минерализуют. чают концентрацию мкмоль/мл или, что то же Минерализация — наиболее ответственный самое, ммоль/л.

этап определения. Дигидрат хлорной кислоты Но р ма л ь н ые в е л ич ины: в плазме НСlO -2Н О кипит при 203 °С, при более низкой или сыворотке содержится 2,0—3,5 ммоль/л 4 температуре из пробы удаляют воду, а при (7—11 мг в 100 мл) липидного фосфора.

повышении температуры начинает улетучивать Лит е р а т у р а. Zilversmit A., Davis A.

ся сама хлорная кислота. Температурный режим J. Lab. Med., 1950, vol. 36, p. 155.

должен быть подобран так, чтобы пары дигидра та хлорной кислоты конденсировались на стен Пр и ме ч а н и е. После минерализации ках и в виде капелек опускались на дно, где образовавшийся неорганический фосфор опять испарялись, и т. д. При оптимальных может быть определен любым методом, в том условиях минерализация заканчивается за не числе и наиболее чувствительным с мала сколько часов;

если температура слишком низ хитовым зеленым. Иногда в процессе ми кая, она затягивается, если слишком высо нерализации образуется некоторое коли кая, хлорная кислота улетучивается и проба чество пирофосфата, что приводит к зани будет испорчена. Лучше всего сжигать пробы женным результатам анализа. В этом слу в больших пробирках 20X200 мм, которые чае пробу после разведения водой ставят устанавливают в подогреваемом электричеством на несколько минут на кипящую водяную металлическом блоке (каждую пробирку в от баню, при этом пирофосфат гидролизуется.

дельном гнезде). Сверху пробирки прикрывают специальными затычками или колпачками, на Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Липидный которых также конденсируются и стекают вниз фосфор возрастает при гиперлипопротеидемиях.

пары хлорной кислоты. Высота блока должна быть 2—3 см;

большая часть пробирки, которая находится над блоком, остается свободной 5.8.8. Фосфонуклеотиды и относительно холодной, на ней и конденсиру ется хлорная кислота. Желательно, чтобы тем- Определение нуклеотидов эритроцитов элек пература в блоке поддерживалась на уровне трофоретическим методом. Пр и н ц и п. Белки 200—210 °С с помощью электронного реле, эритроцитов осаждают трихлоруксусной кисло соединенного с контактным термометром (как той, надосадочную жидкость подвергают элект в термостате). Такое устройство позволяет рофорезу на бумаге в цитратном буфере рН 5,1.

сжигать большое количество проб с наимень- Пятна А'ГФ и АДФ идентифицируют в ультра шими затратами времени лаборанта, но можно фиолетовом свете, вырезают, элюируют и коли работать также с круглодонными колбами с чественно определяют прямой спектрофотомет длинными горлышками (колбы Къельдаля) на рией в ультрафиолетовом свете при длине волны песчаной бане, но это требует больше внимания 260 нм.

за ходом минерализации. Внешний признак Ре а к т ив ы. 1. Натрия цитрат трехзаме того, что минерализация окончилась — просвет- щенный. 2. Гепарин, ампулированный препарат, ление проб, но он может быть обманчивым, активность 5000 ЕД/мл. 3. Натрия хлорид в то же время слишком длительное нагревание 0,85% раствор (физиологический раствор).

приводит к потерям, поэтому перед началом 4. Кислота трихлоруксусная 150 г/л (15 % ра серийных анализов надо отработать режим створ). 5. НС1 0,01 н. 6. Цитратный буфер рН сжигания, проверяя воспроизводимость в серии.

5,1. Готовят, растворяя в воде 17,65 г натрия После охлаждения к минерализованной про- цитрата трехзамещенного и 4,41 г лимонной кис бе прибавляют 7 мл воды, 1 мл раствора молибде- лоты. Объем доводят до 1 л. 7. Бумага для новокислого аммония и 1 мл раствора эйконоге- электрофореза, разрезанная на ленты 35 X X 200 мм.

Ход о п р е д е л е н и я. Кровь берут с гепа рином из расчета 0,1 мл на 5 мл крови. Эритро циты отделяют центрифугированием, плазму См. с. 271. отсасывают, а клетки дважды промывают изото См. с. 271. ническим раствором натрия хлорида при 4 °С, См. с. 271. каждый раз центрифугируя, отсасывая надоса дочную жидкость и вновь ресуспендируя в но- определение показателей адениловой системы вой порции раствора. К 0,5 мл эритроцитной крови доноров.— Лаб. дело, 1976, № 2, взвеси добавляют 0,5 мл 15 % трихлоруксусной с. 92—94.

кислоты, перемешивают палочкой, выдержи- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Повторное вают при 4 °С 10 мин и центрифугируют.

донорство приводит к возрастанию содержа Надосадочную жидкость используют для опре- ния обоих нуклеотидов.

деления нуклеотидов.

Определение адениловых нуклеотидов эрит Электрофоретическую камеру заполняют роцитов методом тонкослойной хроматографии.

цитратным буфером рН 5,1 и смачивают бу- Пр и н ц и п. Белки эритроцитов осаждаются магу для электрофореза, согласно правилам ра- хлорной кислотой, избыток которой удаляется боты на приборе. На место старта равномер- в виде калиевой соли. Безбелковый фильтрат ной поперечной полосой наносят 0,05 мл иссле- хроматографируется в тонком слое на пластинах дуемого трихлоруксусного экстракта и проводят «Силуфол», нуклеотиды идентифицируются в электрофорез при напряжении 12—14 В/см при ультрафиолетовом свете и определяются по све силе тока 0,5—1 мА на 1 см поперечного сече- топоглощению элюатов.

ния.ленты в течение 3 1/2 ч. После этого электро- Р е а к т и в ы. 1. Диоксан. 2. Изопропи фореграммы высушивают в темноте и рассмат- ловый спирт. 3. Аммиак, концентрированный ривают при освещении коротким ультрафиоле- раствор. 4. Кислота хлорная, 0,8 н. (8 % НС1О4).

товым светом (длина волны меньше 300 нм, 5. Калия карбонат, раствор 2 моль/л. Готовят, можно пользоваться ультрахемоскопом Блюм- растворяя 27,6 г карбоната калия (поташ, берга или другим аналогичным прибором). К2СО3) в воде, объем доводят до 100 мл.

Бумага слегка флюоресцирует за счет примесей, В случае необходимости препарат предвари а адениловые нуклеотиды, которые сильно по- тельно сушат при 105—110°С. 6. Подвижная глощают свет в этой области, видны в виде тем- фаза для хроматографии. Смешивают 40 мл ных пятен. Ближе к старту находится АДФ, диоксана, 20 мл изопропилового спирта, 40 мл дальше от старта — АТФ. Контуры пятен обво- воды и 10 мл концентрированного раствора дят карандашом, вырезают и элюируют 5 мл аммиака. Можно использовать и более 0,01 н. HCI в течение 4 ч. Одновременно простую систему, которую готовят без изопропа экстрагируют аналогичный участок бумаги, не нола, смешивая 40 мл диоксана, 40 мл воды содержащий нуклеотидов;

этот раствор исполь- и 10 мл раствора аммиака. 7. НС1, 0,1 н. 8. Нат зуют в качестве холостого опыта. Экстинкции рия хлорид, 0,85 % раствор (изотонический всех растворов измеряются при длине волн 260 раствор). 9. Пластины для тонкослойной хро и 290 нм в кюветах с длиной оптического пути матографии «Силуфол».

1 см, из первой величины вычитают вторую. Ход о п р е д е л е н и я. Кровь берут с гепа Ра с ч е т основывается на данных моляр- рином, добавляя его из расчета 12 ME на 1 мл ного коэффициента экстинкции при длине волны крови. Эритроциты отделяют центрифугирова 260 нм, который у разных нуклеотидов несколь- нием, плазму отсасывают, а клетки 3 раза про ко отличается, авторы данного метода считают мывают холодным изотоническим раствором возможным пренебречь этими небольшими 3 раз- натрия хлорида, каждый раз центрифугируя по личиями и принимают его равным 14,2-10. Это 20 мин при 3000 об/мин. К 1 мл эритроцитной значит, что такая величина оптической плот- массы добавляют 1 мл раствора хлорной кислоты, ности получится, если фотометрировать в кювете перемешивают и через несколько минут осадок с длиной оптического пути 1 см раствор отделяют центрифугированием. К 1 мл надоса концентрации 1 моль/л и вычесть из этой ве- дочной жидкости прибавляют 0,1 мл раствора личины оптическую плотность при 290 нм. Для калия карбоната и оставляют на холоде, пока раствора концентрации I мкмоль/л величина полностью не выпадут кристаллы образовав будет 0,0142. В данном методе окончательное шегося перхлората калия. 0,05—0,1 мл холодной разведение пробы в 200 раз (нуклеотиды из надосадочной жидкости (если она согреется, 25 мкл эритроцитной массы оказываются в кристаллы частично растворяются) наносят 5 мл), поэтому расчет производят по формуле:

в виде полоски на пластину «Силуфол» и проводят восходящую хроматографию в течение 60—90 мин в смеси диоксана, изопропилового спирта и аммиака. Перед началом хроматогра фии камера должна быть насыщена парами растворителя, фронт растворителя должен пройти расстояние не менее 3/4 пластины;

если он не пройдет его, то наиболее вероятная где Е — разность оптических плотностей, изме- причина этого — плохое насыщение камеры па ренных при длинах волн 260 и 290 нм. рами подвижной фазы или плохая герметиза Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: для АТФ ция камеры.

600—14-00 мкмоль/л, для АДФ 250—800 Вынутые из камеры пластины высушивают мкмоль/л, отношение молярных концентраций на воздухе и просматривают в коротком ультра АТФ/АДФ в норме 2. фиолетовом свете (на ультрахемоскопе Блюм берга или другом аналогичном приборе), нахо дят пятна нуклеотидов и обводят их острым Ли т е р а т у р а. Шаврова Ю. А., Бирюко- предметом. В этой системе быстрее всего ва Т. В., Шанояп С. А. Электрофоретическое движется АМФ, медленнее АТФ. Порошок с от меченных мест пластины соскабливают и элюи- для того, чтобы вычислить содержание органи руют 3 мл 0,1 н. HCI. Определяют светопогло- ческих кислот, которое соответствует разности щение надосадочной жидкости при длине волны между суммами неорганических катионов и 260 нм. анионов.

При налаживании методики рекомендуется Хлор чаще всего определяют титрованием, провести определение в калибровочном раство- так как, подобно другим галоидам, Cl ~ образует ре, содержащем в 1 мл 30—60 нмоль (15—. плохо растворимые соли с ионами серебра и 30 мкг) ампулированного препарата АТФ, кото- ртути. Основная методическая проблема — как рый непосредственно наносят на хроматографи- установить конец титрования, т. е. появление ческую пластину так же, как и нейтрализован- избытка серебра или ртути. Для этого исполь ный хлорный экстракт. Эти препараты обычно, зуются электрохимические методы или обратное помимо АТФ, содержат также АДФ и АМФ. титрование, когда ионы хлора осаждаются иона Ра с че т проводят, исходя из молярных ми серебра, а их избыток затем оттитровывает коэффициентов экстинкции: для АТФ — 14 600, ся роданид-ионами, используя в качестве инди для АДФ—15000, для АМФ— 14700. Если катора конца титрования соли железа. Однако для хроматографии было взято 0,1 мл нейтра- практичнее всего прямой метод, при котором лизованного экстракта и окончательный к исследуемому раствору добавляются соли рту объем после элюции был 3 мл, разведение ти и в осадок выпадает нерастворимая каломель.

составляет 1:63, поэтому, для того чтобы выра- Эти методы стали возможны потому, что появи зить концентрацию АТФ в мкмоль/л, надо вели- лись эффективные индикаторы на ртуть —орга чину умножить на 4315, для АДФ коэффициент нические вещества, ртутные соли которых окра составляет 4200, для АМФ 4286. Если же для шены. Когда весь хлор удален из раствора, хроматографии берут 0,05 мл нейтрализован- новые порции титранта окрашивают его. На ного экстракта, коэффициенты должны быть в этом основан унифицированный метод, в кото 2 раза выше. ром в качестве индикатора на ртуть использует Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы: содержа- ся дифенилкарбазон.

ние АТФ 726 + 2,4 мкмоль/л, содержание АДФ Самые перспективные методы определения 262±1,2 мкмоль/л, АМФ 4,1 ±1,3 мкмоль/л. хлора аппаратурные, в которых используется кулонометрическое титрование. Оно заключает Ли т е р а т у р а. Захаров Н. В., Рубин В. И.

ся в том, что измеряется количество электри Тонкослойная хроматография нуклеотидов эрит чества, необходимое для того, чтобы удалить роцитов на пластинках силуфол.— Лаб. дело, весь хлор из раствора. Анализ сводится к тому, 1980, № 12, с. 735—738.

что небольшое количество исследуемой жид Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е то же, что кости (порядка 0,01—0,02 мл) —плазмы, сыво и в предыдущем методе. ротки, мочи или пота — разводится буферным раствором, содержащим соли азотной кислоты.

В раствор погружены три электрода: рабочий, 5.8.9. Хлор индикаторный и индифферентный. К рабочему (серебряному) электроду прилагается положи тельный электрический потенциал, в результате Хлор, как и натрий,— внеклеточный элемент, поэтому их определение имеет аналогичное кли- чего через раствор течет ток, количество ко ническое значение с той разницей, что физиоло- торого измеряется специальной электронной гические механизмы поддерживают концентра- схемой — кулонометром. Атомы серебра на ра цию натрия в значительно более узких пределах. бочем электроде превращаются в ионы Ag +, ко Происходит это потому, что натрий — основной торые сразу же реагируют с ионами С1-, катион внеклеточных жидкостей, на его долю в результате чего выпадает нерастворимое хлор приходится 92—93 % всех положительных за- ное серебро. Когда весь хлор удален из раство рядов, в то время как главных анионов три: ра, концентрация в нем резко возрастает;

хлор, бикарбонат и органические кислоты, при- это улавливается индикаторным электродом, чем на долю хлора приходится лишь 2/з их об- сигнал с которого останавливает титрование.

щего количества. Хотя сумма анионов также Содержание хлора в пробе вычисляется по постоянна, как и сумма катионов, но колебания формуле Фарадея, которая связывает коли хлора относительно больше, чем натрия, так как чества электрического тока и выделившегося уравновешиваются изменениями других анио- серебра, потребовавшегося, чтобы связать весь нов. хлор.

Определение натрия в биологических жид- Унифицированный меркуриметрический ме костях на пламенном фотометре просто и надеж- тод определения хлора. Пр и н ц и п. Иссле но;

для хлора аналогичного метода нет, поэтому дуемая биологическая жидкость титруется натрий определяют в биохимических лаборато- раствором азотнокислой ртути, образующаяся риях значительно чаще, чем хлор. Однако в не- каломель выпадает в осадок. Когда весь хлор которых случаях, если речь идет об анализе от- связан, избыток ионов ртути образует с индика дельных проб в небольших лабораториях, осо- тором дифенилкарбазоном темное, сине-лиловое бенно при исследовании мочи, определение хло- окрашивание, что служит признаком конца ра предпочтительнее, так как не требует почти титрования.

никакого оборудования. Одновременное опреде- Ре а к т и в ы. 1. Ртуть азотнокислая, раст ление и хлора, и натрия вместе с другими неорга- вор 6 ммоль/л. 2 г Hg (N03)2-0,5 Н2О растворя ническими ионами плазмы иногда используют ют в 200 мл воды, добавляют 20 мл 2 н. азотной кислоты и доводят водой до 1 л. 2. Дифенил- 4 капли (0,2 мл) раствора дифенилкарбазона и карбазон, спиртовой раствор: 100 мг дифенил- титруют раствором азотнокислой ртути при карбазона растворяют в 100 мл 96 % этилово- постоянном перемешивании до появления тем го спирта, хранят в посуде из темного стекла ной окраски. Удобнее всего перемешивать маг в холодильнике. Стоек в течение месяца.

нитной мешалкой. На титрование сыворотки 3. Азотная кислота, 2 н: 14 мл продажной должно пойти примерно 3 мл титранта.

концентрированной азотной кислоты (плотность Пр и м е ч а н и я. 1. Раствор азотнокислой 1,4) разводят в 100 мл воды. 4. Калибровочный ртути можно приготовить из красной окиси раствор, 10 ммоль/л. Хлорид натрия (поварен ртути. Для этого 1,3 г HgO растворяют ная соль) высушивают до постоянной массы в 11 мл концентрированной азотной кислоты при 120 °С, 584 мг препарата растворяют в воде и доводят объем водой до 1 л. 2. Раствор и доводят объем до 1 мл.

дифенилкарбазона должен быть красно Ход о п р е д е л е ни я. Сначала устанав оранжевого цвета;

если окраска становится ливают величину фактора раствора для титрова желтой или вишнево-красной, реактив не ния (титранта). Для этого в маленький стакан пригоден.

чик или колбочку вносят 2 мл калибровочного раствора и 4 капли (0,2 мл) раствора фенил- Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: содержа карбазона, постоянно перемешивая, титруют ние в сыворотке или плазме 97—108 ммоль/л, раствором азотнокислой ртути до появления выведение с мочой 150—2500 ммоль/сутки.

темного окрашивания. Фактор титранта вы Ли т е р а т у р а. Schales D., Schales S.

числяют, разделив 20 (количество микромолей J. Biol. Chem., 1941, vol. 140, p. 879.

хлорид-ионов в калибровочной пробе) на число миллилитров, пошедших на титрование. Фактор Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е определе указывает, какому количеству микромолей ния хлора такое же, как и натрия. Его увеличе хлорид-ионов соответствует 1 мл титранта. ние в плазме крови — признак выраженной При исследовании опытной пробы поступают дегидратации, уменьшение — признак значи аналогично: в маленький стаканчик или колбоч- тельного избытка воды в организме. Выведение ку наливают 1,8 мл воды и вносят 0,2 мл иссле- с мочой увеличивается при спадении отеков, дуемой биологической жидкости, добавляют уменьшается при их развитии.

Раз дел МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ 6.1. ОСОБЕННОСТИ МЕТОДОВ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ Широкое внедрение иммунологического взаимосвязь компонентов которых ему недоста анализа в клинику внутренних болезней, точно известна, чаще предполагается. Именно характеризующее последнее десятилетие, отра- поэтому в условиях клинико-лабораторной жает значительные успехи развития иммуно практики должны использоваться высокока биологии. Фундаментальные исследования чественные диагностические сыворотки и препа функциональных клеточных взаимодействий раты. На решение этой проблемы направлено в процессе иммунного ответа, развитие концеп постановление ЦК КПСС и Совета Министров ции иммунологического надзора, генетических СССР о развитии биотехнологии.

механизмов детерминации и регулирования Клиническая иммунология развивается на иммунных реакций организма изменили пред лучших традициях теоретических исследований.

ставление об иммунитете как о системе защиты, Однако далеко не всегда можно и нужно расширив его роль в сложном механизме адапта- экстраполировать результаты взаимодействия ции к постоянно меняющимся внешним услови- чистых систем, полученных в условной среде ям обитания, в охране генетического постоян- на таковые в сложных, мало еще изученных ства внутренней среды организма. Осмыслива- средах целостного организма. Причинно-след ние с этих позиций реакций иммунитета обусло- ственные взаимоотношения, установленные в вило активное внедрение в клиническую практи- эксперименте и прямо перенесенные на больно ку многих новых, в том числе клеточных, го, могут привести к возникновению серьез реакций, заставило по-иному взглянуть на став- ных диагностических ошибок и как следствие шие уже рутинными «старые» методы, совер- этого к неправильному лечению активными шенствовать их. Были разработаны методы препаратами — иммуномодуляторами, разви определения концентрации фракций компле тию ятрогений.

мента. Описаны способы выявления прямого, Методы иммунологических исследований «классического» и альтернативного путей его широко используются специалистами практи активации. Вновь усилилось внимание к фаго- чески всех клинических дисциплин. Опыт цитозу с позиций существующих представлений централизованных клинико-иммунологических о клеточных кооперациях в распознавании лабораторий указывает, что наибольший удель антигена и реализации иммунного ответа, взаи- ный вес в их работе занимают исследования модействия его с гуморальными компонентами.

для клиник терапевтического профиля, в кото Особый интерес представляют сывороточные рых создаются отделения иммунопатологии, факторы регуляции, значение которых возраста- иммунодефицитов. Эти патологические состоя ет с установлением их диагностической инфор- ния, объединяемые чаще по синдромному приз мативности. Новое значение приобретают и не- наку, нередко не имеющие четких нозологи специфические факторы реактивности, сыво- ческих границ, вызывают необходимость роточные бактериолитические и статические проведения наибольшего числа иммунологи факторы, система пропердина, лизоцима и т. д. ческих тестов. Правильно подобранный комп Число методов иммунологического анализа лекс последних отражает изменение иммунной очень быстро растет. И клиницисту, и сотрудни- реактивности, помогает выявить достаточно ку лабораторного подразделения все чаще точно характер и уровень этих изменений.

приходится останавливаться перед выбором, Иммунологические методы при этих заболева решающую роль в котором играет диагности- ниях определенно характеризуют активность ческая информативность того или другого процесса, отражают эффективность применяе теста. Такой своеобразно утилитарный подход, мой иммунодепрессантной или модулирующей отличающий клиническое использование лабо- терапии, но диагностическая информативность раторных исследований, значительно усложняет их далеко не равнозначна. При врожденных условия проведения анализа и, самое главное, (первичных) иммунодефицитных состояниях его интерпретации. В отличие от экспери- значение иммунных показателей определяет ментальных условий, когда исследователь сам диагноз. При иммунокомплексных заболеваниях определяет время введения антигена, знает его типа системной красной волчанки они могут характеристики, строго контролирует условия подтверждать логику диагностического процес проведения реакции, врач-лаборант работает со са, а при ряде других диффузных заболеваниях сложными биологическими композициями, соединительной ткани (системная склеродермия, узелковый периартериит и др.) изменения Таким образом, очевидно, что диагности иммунных показателей сопровождают пораже- ческая информативность иммунологического ние органов и не имеют определенной диагно- анализа ограничена нешироким кругом заболе стической информативности. Можно выделить ваний. В то же время применение иммунных группу заболеваний неинфекционной этиологии, методов позволяет специфически определять развитие которых специфически проявляется в и выделять биологически активные вещества, иммунных реакциях (I группа). Существуют играющие определенную роль в патогенезе за заболевания, в диагностике которых иммуноло- болеваний, устанавливать эффективность имму гические тесты играют существенную, но не номодулирующей терапии, объективизировать определяющую роль (II группа). обоснованность ее назначения.

Г р у п п а 1. 1. Первичные иммунные дефи- В основе иммунной реакции лежит специфи циты. ческое взаимодействие антигена с антителом.

2. Парапротеинемии. Именно оно обусловливает правильность 3. Гепатома, тератобластома яичка (а-фето- полученного ответа. Но необходимо строгое протеин). выполнение всех требований к ингредиентам 4. Сывороточный НВ гепатит (НВs-антиген). реакции, технике ее постановки и учета.

5. Рак желудочно-кишечного тракта (канце- Иммунный ответ целостного организма — ро-эмбриоспецифический антиген). это сложная, взаимосвязанная, генетически де 6. Аутоиммунная гемолитическая анемия. терминированная система последовательных 7. Тиреоидит Хашимото. реакций. В лабораторной практике при изучении Г р у п п а II. 1. Системные заболевания составных компонентов этой системы истори соединительной ткани (ревматические болезни). чески сложилось и сохраняется сейчас условное 2. Хронический активный гепатит, болезнь разделение на гуморальные и клеточные факто Шегрена. ры иммунитета. Поэтому в изложении материала 3. Некоторые болезни почек (иммуно- мы будем придерживаться этой традиции.

комплексный нефрит).

6.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА —РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ Общие п р и н ц и п ы. Агглютинация — пациента в реакции с предварительно сенсиби склеивание частиц — носителей антигенных де- лизированными эритроцитами донора (непря терминант антителами, находящимися в реак- мой тест).

ционной смеси. В результате образуются конгло- Пос у д а. 1. Пробирки химические. 2. Па мераты частиц, которые в среде электролита вы- стеровские пипетки. 3. Мелкие белые тарелочки.

падают в осадок и становятся видимыми для Ре а к т и в ы. 1. Раствор 5 % цитрата нат глаза. Частицами — носителями антигена могут рия. 2. 0,9 % раствор хлорида натрия. 3. Анти быть естественные клетки: клетки крови — эри- глобулиновая сыворотка (сыворотка Кумб троциты, лейкоциты, реже тромбоциты, бакте- са) С титром преципитинов не ниже 1:256— риальные клетки, а также созданные искусствен- 1 :512.

но: латекс, полистирол, бентонит, частицы угля Прямая реакция Кумбса. Ход опре д е и т. д. Основные требования, предъявляемые л е ния. 3 мл крови берут из локтевой вены к этим носителям,— возможность прочно при- исследуемого в одну пробирку с предварительно соединять антигены и не давать спонтанной внесенным 1 мл 5 % раствора цитрата натрия.

агглютинации. Широкое распространение Эритроциты трижды отмывают в большом объе (доступность, удобство использования, легкость ме изотонического раствора натрия хлорида учета) в лабораторной практике получило путем центрифугирования при 1500 об/мин, в применение в качестве носителей специально течение 10 мин. Из отмытых эритроцитов го обработанных эритроцитов (человека или жи- товят 5 % взвесь на изотоническом растворе вотных). (1 капля отмытых эритроцитов и 19 капель Реакции агглютинации, в которых в качестве изотонического раствора). На сухую чистую субстрата использованы эритроциты, получили белую тарелку наносят каплю антиглобулиновой название реакций гемагглютинации. сыворотки, к ней добавляют каплю 5 % взвеси эритроцитов исследуемого. Сыворотку переме шивают с эритроцитами стеклянной палочкой.

6.2.1. Антитела к эритроцитам Рядом ставят контроль, используя вместо сы воротки изотонический раствор. Каждую новую Реакция Кумбса. Пр и н ц и п. При наличии серию антиглобулиновой сыворотки ставят ана неполных (блокирующих) антител на поверх- логичным путем со стандартными сенсибилизи ности эритроцитов исследуемого пациента про- рованными эритроцитами и с интактными до исходит агглютинация эритроцитов при инкуба- норскими эритроцитами различной группы. Пе ции их с антиглобулиновой сывороткой (прямой ремешанные эритроциты с сывороткой слегка тест Кумбса) или с разведениями сыворотки покачивают не более 10 мин.

Уче т р е а к ц и и. Появление агглютина- в диагностике аутоиммунных гемолитических ции указывает на наличие неполных антител анемий, эссенциальных или вторичных.

на поверхности эритроцитов. Реакция может При системных заболеваниях (системная быть проведена в пробирках. В этом случае красная волчанка, хронический активный гепа 2 капли (0,1 мл) различного разведения тит, болезнь Шегрена) бывает чаще положи антиглобулиновой сыворотки (в зависимости от тельной непрямая реакция Кумбса.

титра преципитинов) помещают в пробирки и добавляют каплю отмытых эритроцитов. Осто рожно встряхивают и инкубируют 30 мин 6.2.2. Резус-фактор при 37 °С.

Уч е т р е а к ц и и проводят после центри- Реакция конглютинации с применением же фугирования при 1500 об/мин в течение 1 мин латина. Пр и н ц и п. Эритроциты с наличием (центрифуга ЦЛК-1). резус-антигена агглютинируют в среде с непол Непрямая реакция Кумбса. Ход опре де - ным антирезус-антителами в присутствии анти л е ния. Из локтевой вены исследуемого берут глобулиновой сыворотки.

3 мл крови в чистую сухую пробирку.

Ре а к т ив ы. 1. Групповые (по системе Р е а к ц и я идет в два э т а па : АВО) антирезусные сыворотки. 2. Стандартные первый — сенсибилизация стандартных эритро- эритроциты всех групп системы АВО. 3. 10 % цитов неполными антителами, предположитель- раствор желатина (ампулированный).

но находящимися в исследуемой сыворотке;

Ход о п р е д е л е н и я. Кровь из локтевой второй — агглютинация сенсибилизированных вены необходимо брать в две пробирки. В одну эритроцитов антиглобулиновой сывороткой.

пробирку с предварительно внесенным 1 мл 5 % Необходимо использовать троекратно отмы- раствора цитрата натрия — 3 мл, в другую — тую в изотоническом растворе смесь эритроцитов только 3 мл крови. Пробирки должны быть различных аллотипов 0(1) группы резусположи- тщательно промаркированы. В сопроводитель тельных. Каплю этих эритроцитов вносят в про- ном направлении указывают полностью фами бирку и на них наслаивают 3 капли исследуемой лию, имя, отчество и группу крови пациента.

сыворотки. Пробирки энергично встряхивают Кровь, смешанная с цитратом натрия, слу и помещают в термостат при 37 °С на 40 мин.

жит источником эритроцитов. По одной капле Параллельно опыту ставят контрольные пробы.

(0,05 мл) исследуемых эритроцитов вносят в Первая: в пробирку с 2 каплями стандартных 3 химические пробирки. В первые две добавляют отмытых резусположительных эритроцитов 0(1) 0,1 мл антирезусной сыворотки различной серии группы вносят 3 капли антирезусной сыворотки соответствующей группы крови. Далее во все АВ (IV);

вторая: в пробирку с 2 каплями три пробирки доливают 0,1 мл (2 капли) 10 % отмытых стандартных резусотрицательных раствора желатина, предварительно прогретого эритроцитов 0(1) вносят 3 капли сыворотки на водяной бане температуры 40—45 °С. Таким AB(IV). Контрольные пробирки помещают, образом, 3-я пробирка, в которой находятся так же как и опытные, в термостат при 37 °С на.только эритроциты и желатин, служит контро 40 мин. лем на спонтанную агглютинацию в присутствии После термостатирования из пробирок желатина. В целях одновременного определения осторожно отсасывают сыворотку. Эритроциты резус-антител используются стандартные эрит трижды отмывают в изотоническом растворе роциты 0(1) группы резусположительные, в ко натрия хлорида. На сухую чистую тарелку торые добавляют сыворотку крови из пробирки наносят в 3 точках по 1 капле антиглобулиновой без раствора цитрата и то же (что и в трех сыворотки. В первую каплю добавляют эритро- предыдущих пробирках) количество желатина.

циты, сенсибилизированные сывороткой пациен- В качестве контроля необходимо использовать та, во вторую и третью — эритроциты контроля стандартные резусположительные и отрица 0(1) резусположительных с антирезусной сыво- тельные эритроциты всех 0(1), А(II), В(III), роткой AB(IV) и 0(1) резусотрицательные с AB(IV) групп крови. Содержимое всех пробирок антирезусной сывороткой AB(IV). Эритроциты осторожно перемешивают, встряхивают и поме тщательно перемешивают стеклянной палочкой щают в термостат при 46—48 °С на 30 мин.

с антиглобулиновой сывороткой. После этого После термостатирования во все пробирки вно осторожно покачивают тарелку в течение 10 мин, сят по 8 мл 0,85 % раствора хлорида натрия но не более. и перемешивают осторожным ротированием.

Уч е т р е а к ции. При наличии в сыворот- Уч е т р е з у л ь т а т о в. Результат можно ке пациента неполных антител в опытной смеси считать достоверным только при совпадении его будет наблюдаться агглютинация. Контроль с в обеих пробирках разных серий антирезусной резусположительными 0(1) эритроцитами дол- сыворотки и правильно прошедших контролях.

жен дать агглютинацию. В контроле с резусот- Агглютинация эритроцитов в первых двух про рицательными 0(1) эритроцитами агглютинации бирках, видимая в проходящем свете или под не должно быть. В ряде случаев неполные анти- микроскопом (в сомнительных случаях), указы тела вступают в реакцию при низкой температу- вает на наличие резус-антигена. Склеивание ре (4 °С), о чем необходимо помнить в исследо- эритроцитов в 4-й пробирке документирует не ваниях при подозрении на холодовую иммунную полные резус-антитела в сыворотке исследуе цитопению.

мого. Если происходит агглютинация в 3-й Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Выявление пробирке, содержащей только эритроциты и же антител к эритроцитам играет ведущую роль латин, результат реакции в первых двух пробир ках не может быть учтен вследствие возмож- По с т а н о в к а р е а к ц и и ле йко ности неспецифической агглютинации. а г г л ют и н а ц и и. Готовят ряд (кратных Резус-антитела. Определение в грудном мо- двум) разведений исследуемой сыворотки (5— локе (молозиве). Грудное молоко в количестве пробирок), которую предварительно инактиви 10—15 мл, взятое в пробирку, центрифугируют руют 30 мин при 56 °С. К 0,1 мл (2 капли) 10 мин при 1000 об/мин. Со дна пробирки отса- сыворотки добавляют по капле взвеси лейко сывают небольшое количество и 2—3 капли цитов. Пробирки интенсивно встряхивают и тер наслаивают на стандартные эритроциты 0(1) мостатируют в течение полутора часов при 37 °С.

группы. Затем добавляют 0,1 мл 10 % раствора После извлечения из термостата пробирки желатина и ставят в термостат при 46 °С на 30 центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Над мин. Дальнейший ход реакции и учет результа- осадок удаляют, а к клеточному слою добавляют тов уже описан выше. 2 капли 3 % уксусной кислоты для удаления Ис т о ч н и к ошибок. Раствор желати- примеси эритроцитов и осторожно перемеши на: наличие помутнения, хлопьев, утрата способ- вают. Каплю клеточной взвеси помещают на ности «застывать» при температуре 4—8 °С мо- предметное стекло и рассматривают под малым жет приводить к ложноположительным резуль- увеличением микроскопа.

татам. Антирезусные сыворотки: снижение титра Уч е т р е а к ц и и п р о в о д я т по двум антител при длительном или неправильном критериям: выраженности агглютинации (ин хранении (определяется в контрольных иссле- тенсивная, т. е. крупные агломераты, значи дованиях каждый раз при использовании новой тельная площадь свободной жидкости,— 4 плю серии). Ошибки при использовании иногруп- са;

выраженная агглютинация, когда наряду с пных сывороток. агломератами лейкоцитов в жидкости можно Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Определе- видеть небольшое количество свободных кле ние резус-фактора обязательно при переливании ток,— 3 плюса;

степень агглютинации, при крови и у беременных. В последнем случае которой среди взвешенных клеток выявляются необходимо исследование резус-фактора у отца островки агглютинатов,— 2 плюса и слабая будущего ребенка. мелкоглыбчатая агглютинация, когда в поле Прогноз гемолитической болезни зависит от зрения преобладают свободные клетки, но встре динамики резус-антител, которые необходимо чаются небольшие комочки склеившихся кле исследовать в течение беременности. ток,— 1 плюс) и величина разведения сыворот ки, в которой еще отмечается агглютинация.

Во з мо жн ые и с т о ч н и к и о шиб о к.

6.2.3. Антитела к лейкоцитам Часто встречается неспецифическая агглютина ция, особенно при крупноглыбчатой интенсивной Пр и н ц и п мет ода. При наличии в реакции. В каждом случае необходимы контроли исследуемой сыворотке антител к лейкоцитам выделенных лейкоцитов с нормальной совмести последние образуют агглютинаты, видимые под мой референтной сывороткой. Спонтанная микроскопом. агглютинация наблюдается при высокой кон Ре а к т ив ы. 1. Гепарин кристаллический центрации в выделенном клеточном осадке (предпочтительнее) или готовый (во флаконах) нежизнеспособных лейкоцитов.

раствор (Гедеон Рихтер). 2. Среда 199 (или фос- Более информативен в клинической практике фатный буфер рН 7,4). 3. 0,35 % и 5 % растворы учет крайних разведений сыворотки с агглюти хлорида натрия. нацией.

Ход о п р е д е л е н и я. Выд е л е н и е Лит е р а т у р а. Лимфоциты: выделение, л е й к о ц и т о в. В пробирку с предварительно фракционирование и характеристика/Под ред.

внесенным раствором гепарина (25 ЕД на 1 мл Дж. Б. Натвича, П. Перлманна, X. Вигзелля.— крови) из локтевой вены донора вносят 10 мл М.: Медицина, 1980;

Руководство по иммуно крови, перемешивают и помещают в термо логии/Под ред. О. Е. Вязова и Ш. К. Ходжае стат при 37 °С в наклонном (45°) положении на ва. — М.: Медицина, 1973;

Тодоров Йордан.

1 ч. После отстаивания плазму с прилегающим Клинические лабораторные исследования в к эритроцитам слоем лейкоцитов осторожно педиатрии.— София, 1963.

отсасывают пастеровской пипеткой и переносят в центрифужную пробирку. После 5 мин центрифугирования при 1000 об/мин надосадоч ную жидкость удаляют. К клеточному осадку 6.2.4. ДНК и антитела к ДНК для лизирования примеси эритроцитов добавля ют 5 мл 0,35 % раствора NaCl и осторожно Реакция пассивной гемагглютинации.

ресуспендируют клетки пастеровской пипеткой, Пр и н ц и п. Формалинизированные эритроци не допуская образования пены, в течение 30— ты барана с присоединенными к их поверхности 45 с. Вслед за этим немедленно добавляют прочной ковалентной связью ДНК агглютини 0,6 мл 5 % раствора NaCl и тщательно пере- руют в сывороточной среде с наличием антител мешивают (раствор становится изотоничным). к ДНК. В зависимости от конформации моле Полученную взвесь лейкоцитов трижды отмы- кулы антигена, используемого в реакции (натив вают средой 199 или фосфатным буфером. ная, высокополимерная ДНК, денатурирован Проводят пробу на жизнеспособность выде- ная кипячением в стандартном солевом ленных клеток (см. в разделе «Методы исследо- растворе — ССР, прогретая в присутствии вания клеточного иммунитета»). формальдегида), различают 3 типа антител к ДНК. Антитела I типа—к формалинизи- свежетанированных эритроцитов в фосфатно рованной однотяжевой ДНК, антитела II ти- цитратном буфере рН 5,2 смешивают с равным па — к термоденатурированной ДНК, в которой объемом ДНК в концентрации 10—20 мкг/мл около 60 % нуклеотидов организовано в спира- в том же буфере. Смесь выдерживают в течение лизованные участки, антитела III типа — анти- 30 мин при комнатной температуре, а затем тела к нативной высокополимерной ДНК. собранные центрифугированием эритроциты от Определение типов антител к ДНК более мывают троекратно ССР в разведенной в нем информативно в клинической практике, так как нормальной кроличьей сывороткой, предвари может быть использовано в целях дифферен- тельно инактивированной в соотношении 1:250.

циальной диагностики. Приготовленные эритроциты хранят при 4 °С Ре а к т и в ы. 1. Препарат нативной ДНК с добавлением 0,4 % раствора формальдегида («Реахим». Олайнский завод химреактивов. в ССР с разведенной в нем кроличьей сыворот «Реанал», Венгрия). 2. Препараты ДНК с мо- кой. Срок годности — до 4 мес.

дифицированной первичной и вторичной В каждом случае перед сенсибилизацией структурой. Денатурированную ДНК получают серии эритроцитов необходимо определять коли кипячением 50—200 мкг/мл ДНК в стандартном чество ДНК, адсорбированной на эритроцитах.

солевом растворе (0,15 М NaCl и 0,015 М ра- Ме т о д и к а п о с т а н о в к и РПГА.

створ трехзамещенного цитрата натрия) в тече- Для постановки используют полистироловые ние 10 мин с последующим охлаждением пластины с лунками. В каждую лунку разливают в ледяной бане. Однотяжевую формалинизи- по 0,4 мл, а в первую лунку 0,9 мл ССР и 0,1 мл рованную ДНК получают прогреванием раство- исследуемой сыворотки. Пассажем из лунки ра ДНК 400 мкг/мл 10 мин при 100 °С в присут- в лунку равных объемов готовят двукратные ствии 1,3 % формальдегида. Формальдегид разведения, после чего во все лунки добавляют взаимодействует с освобождающимися при де- по 0,05 мл 2,5 % взвеси эритроцитов, сенсиби натурации аминогруппами азотистых оснований, лизированных ДНК. Пластинки энергично препятствуя восстановлению разделившихся встряхивают и оставляют при комнатной тем при нагревании цепей ДНК. 3. Формалинизиро- пературе на 4 ч.

ванные и танированные бараньи эритроциты. Если эритроциты агглютинируют, то они 4. Фосфатно-цитратный буфер рН 5,2. равномерно устилают все дно лунки. В отсут Ход о п р е д е л е н и я. В лунки полисти- ствие агглютинации эритроциты собираются на роловых титровочных пластин разливают 0,9 мл самом дне лунки, образуя компактный диск в первую лунку, а в остальные — по 0,4 мл или небольшое кольцо.

и добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки, В качестве контроля одновременно с той предварительно инактивированной при 56 °С 30 же самой сывороткой при тех же разведениях мин. закапывают формалинизированные эритроциты, Фо р м а л и н и з а ц и я б а р а н ь и х не сенсибилизированные ДНК.

э р и т р о ц и т о в. Эритроциты барана отделя- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Выявле ют от фибринового сгустка и несколько раз ние антител к ДНК может служить характе промывают изотоническим раствором натрия ристикой процессов аутоиммунитета. В сочета хлорида (0,15 М NaCl). 12,5 % взвесь эритро- нии с определением типа антител исследова цитов в изотоническом растворе рН 7,0 помеща- тель может оценить активность репаративных ют в сосуд, в который опускают целлофановый процессов, способность организма к адаптивным мешок, содержащий нейтрализованный форма- реакциям (например, нарастание антител лин,— 1/4 объема взвеси эритроцитов. Диализ к ДНК I типа после оперативных вмешательств).

проводят при 4 °С в течение 2 сут и далее при Антитела к ДНК I типа широко встречаются как комнатной температуре в течение 2—5 сут про- в норме, так и при различных инфекционных тив изотонического раствора. Взвесь эритроци- процессах (например туберкулезе), вирусных тов периодически встряхивают. После оконча- заболеваниях (грипп). Антитела II типа, осо ния диализа эритроциты отмывают в 10-кратном бенно в титрах 1:160 и выше, отражают актив объеме изотонического раствора хлорида натрия ность ревматических болезней. Антитела III типа с повторным центрифугированием. Отмытые преобладают при системной красной волчанке эритроциты суспендируют в равном объеме и служат дифференциально-диагностическим изотонического раствора. 50 % взвесь эритроци- критерием.

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 13 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.