WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |

«Учебная литература для студентов медицинских вузов Р.М.Хаитов, Г.А.Игнатьева, И.Г.Сидорович Рекомендовано Департаментом научно-исследовательских и образовательных медицинских учреждений Министерства ...»

-- [ Страница 2 ] --

Тучные Гипотала- Лихорадка, и клетки, мус, эндо- возрастание телий проницаемос эндотелий, ти сосудов фибро бласты Лейкотриены Тучные Нейтро- Хемотаксис и клетки, лейкоцитов, дегрануляция нейтрофилов Фактор, акти- Моноциты, Тромбо- Активация и вирующий эндотелий циты, тромбоцитов тромбоциты — лейкоциты и лейкоцитов, PAF (platelet- локальное activating factor) воспаление Продолжение таблицы Молекулы, Конститутив- Физиологи- Мишень Функции вовлеченные ный (К) ческое (лиганд) в реакции место индуцибель резистентности действия ный (И) биосинтез VI.

острой фазы:

Пентраксины И Плазма Поверх- Опсонизация, (СРП);

МСЛ;

ность мик- активация СЗ;

LPS-свя- роорганиз- комплемента, мов активация протеин лейкоцитов Глава 4. АНТИТЕЛА. В-ЛИМФОЦИТЫ Антитела стали первой «иммунологической материей», кото рую открыли для себя современные люди. Точнее говоря, был открыт противодействия ядам со животных.

природы" был выделен из тела человека Вепсе Jones последний из нов — иммуноглобулин — был выделен 100 лет спустя не зависимо шведскими и японскими учеными: в 1960 г.

Kishizaka и и в 1965 г. S.G.OJohansson и H.Bennich.

Впервые термин сыворотка» ввели Эмиль Беринг (Emil von и Шибасабуро Китасато (Sbibasaburo г. для обозначения открытого ими феномена нейтрализации токсических свойств дифтерийного токсина сы вороткой крови животных, переболевших дифтерией и выздо ровевших. Справедливости ради напомним, что факт наличия противомикробньгх свойств у крови млекопитающих был опи сан первыми «микроскопистами», наблюдавшими стерильность препаратов из крови здоровых животных и людей. Персидский врач Рази (IX в.) предлагал же убивать бак терии, опубликовано G.Nuttall в 1888 г. Дальше один за одним открывали механизмы среды организма от постоянно туда микробов.

В 1891 г. термин «антитоксин» использовали итальянские исследователи Д.Тиццони и Д.Каттани применительно к не ким факторам, которые появляются в сыворотки крови жи вотного после введения ему несмертельных доз токсина воз будителя столбняка. Эти факторы способны нейтрализовать токсическое действие токсина. Кроме феномена нейтрализации токсических свойств, эти исследователи нашли способ «дотронуться» до антитоксинов руками: они сумели осадить антитоксин из цельной сыворотки сульфатом магния. На основании этого биохимического свойства в пер вой же работе антитоксины правильно были отнесены к бел кам и, более того, к белкам-глобулинам. И в наши дни са мая первая и доступная методика по выделению иммуногло булинов — осаждение солями серной кислоты (сульфатом аммония, сульфатом натрия).

В том же 1891 г. в статье термин «ан титело». Первооткрыватели точно при контакте с вредными внешними ве ществами способен вырабатывать особые собственные веще ства, предназначенные для избирательного (специфического) связывания попавшего в организм внешнего вещества. Вот эти то собственные «спасительные» вещества и называют анти телами. Семантически этот термин на первый взгляд не очень корректен, ибо антитела в большинстве ситуаций предназна чены для защиты собственного тела, а не для антительного действия. Но в понимании П.Эрлиха «тела» — это не соб ственное тело, а те внешние субстанции, которые попадают в организм и с 1899 г. с работ Л.Детре (сотрудника И.И.Меч никова) и до сих пор называют антигенами. Термин «анти ген» логически также небезупречен, поскольку далеко не все, что распознает иммунная система, направлено против (анти) собственного генома, более того, часть — и не малая — яв ляется продуктами собственного генома.

Поэтому антиген следует понимать, как любое вещество, которое потенциально может быть распознано иммунной сис темой организма.

4.1. Антитела Антитела — это особые растворимые белки с определенной био химической структурой (иммуноглобулины), которые присут ствуют в сыворотке крови и других биологических жидкостях и которые организм вырабатывает для связывания разнообраз ных антигенов.

Чрезвычайно важное и фундаментальное свойство пары открыл К.Ландштейнер в 30-е годы.

Правда, ни он сам и никто другой долгие ли фундаментальность наблюдения К.Ландштейнера, пока не достигла надлежащего уровня развития молекулярная гене тика иммуноглобулинов. Экспериментальное наблюдение К.Ландштейнера состояло в том, что млекопитающие спо собны вырабатывать антитела с одинаковым успехом как на природные антигены, так и на искусственно синтезирован ные химические соединения, не похожие по химической структуре на природные биомолекулы. Прикладной вывод из этих работ К.Ландштейнера был сделан незамедлительно: по всему миру в лабораториях стали получать иммунные сыво ротки против интересующих веществ как специфические реа генты для определения заданных веществ. Фундаментальный же вывод состоит в том, что репертуар антигенсвязывающих свойств антител организма формируется на основе неких случайных процессов, а не запрограммирован эволюционным «знанием» (не закреплен отбором) со стороны организма — что является для него антигеном, на который надо выра батывать антитела, а что нет. В дальнейшем мы увидим, что эволюционные генетические ограничения в отношении того, что может, а что не может быть антигеном для дан ного организма, существуют и весьма серьезные, но соот ветствующие экспрессируются в основном не в лимфо цитах, т.е. за пределами собственно иммунной системы как таковой.

Антитела были предметом подробного изучения классичес Фундаментальными признаны работы R.Porter (1920—1985) по исследованию биохимичес ких свойств и вторичной структуры молекул антител. Все без исключения антитела принадлежат к одному типу белковых молекул, имеющих глобулярную вторичную ра бота по электрофорезу опубликована A.Tiselius в 1937 г. Все антитела — иммуноглобулины. Строго говоря, утверждать обратное некорректно. Нельзя сказать, что все — только относительно антигена, т.е. если знаем антиген. Если комплементарный некоему иммуногло булину, который оказался у нас «в руках», то мы имеем толь ко иммуноглобулин. Международная аббревиатура иммуногло булинов Заглавная латинская буква рядом с обозначает один из 5 существующих у млекопитающих классов иммуно глобулинов — М, G, А, Е, D, последующая арабская цифра обозначает субкласс. Субклассы есть только у иммуноглобули нов классов G G3, G4) и А (А1, А2). Классы и подклассы, вместе взятые, называют изотипами иммуноглобу линов. Таким образом, изотипов 9. Пять классов иммуногло булинов* имеются у но зато у всех видов млекопитающих гомологичны все эти 5 классов. Это го ворит о том, что 5 классов иммуноглобулинов в эволюции до видообразования млекопитающих. То что они столь консервативно сохранились в период дивергентной эво люции, свидетельствует об оптимальности их биологических свойств и необходимости для выживания в условиях земной природы.

4.2. Структура молекул иммуноглобулинов R.Porter подверг препарат кролика протеолизу д р р р g ф под действием фермента папаина и в результате получил раз деляемые ионообменной хроматографией три фрагмента. Два из них были одинаковыми и сохраняли способность связы вать антиген, поэтому автор обозначил их Fab (fragment, antigen binding). Третий фрагмент отличался от первых двух и имел свойство легко кристаллизоваться, он был обозначен как Fc (fragment, crystallizable). Впоследствии стало известно, что иммуноглобулинов в пределах одного изоти па у данного организма строго идентичны независимо от спе цифичности антитела по антигену. За эту инвариантность их стали называть константными — fragment, constant — Fc (аб бревиатура совпала).

В 1961 г. Edelman и Poulik и независимо от них Fleischman и соавт. сумели диссоциировать не протеолитически цельные молекулы антител на отдельные белковые цепи. Выяснили, что цепи ассоциированы между собой дисульфидными связя ми. В 1962 г. R.Porter предложил схему строения молекул иммуноглобулинов, которая оказалась совершенно верной:

4 полипептидные цепи — пара одинаковых тяжелых плюс пара одинаковых легких. Тяжелые цепи обозначают буквой «Н» от High — тяжелый, легкие — буквой «L» от Light — легкий. Принципиальная схема строения молекулы иммуно глобулина приведена на рис. 4.1.

-цепь IgG состоит примерно из 450 остатков аминокис лот и имеет относительную молекулярную массу около 50 000, а легкая цепь — из 212 остатков аминокислот и име ет молекулярную массу около 25 000. Общая относительная молекулярная масса молекулы IgG составляет 150 000.

Антигенсвязывающие домены обеих цепей имеют сильно варьирующий аминокислотный состав (поэтому и способны связывать разные антигены). Поэтому эти участки (или облас ти) молекулы — как Н-, так и L-цепи называют вариабель ными и обозначают буквой «V» (variable region). Внутри вариа бельных участков выделяют и гипервариабельные. V-область занимает один домен в -цепи и один домен в L-цепи.

что «ниже» вариабельных участков, имеет строго инвариантный для каждого изотипа иммуноглобулинов аминокислотный со став и называется С-областью (от constant region). Соответству ющие домены в полипептидных цепях называют С-доменами.

В тяжелой цепи 3 или 4 С-домена, их обозначают 1, В легкой цепи один С-домен, Рис. Принципиальная схема строения молекул иммуноглобулинов.

1 — центры молекулы иммуноглобулина;

2 — легкие цепи (L);

3 — тяжелые цепи (Н);

4 — шарнирная область;

5 — Fab-фрагмент;

6 — 7 — Fc-фрагмент.

Fc-фрагменты молекул иммуноглобулинов (разные у раз личных изотипов, но тождественные в пределах изотипа) обеспечивают разное взаимодействие комплексов титело по санирующим деструктивным механизмам, способ ным расщепить и вывести антиген из организма — с систе мой комплемента, фагоцитами, эозинофилами, базофилами, тучными клетками. Каждый класс иммуноглобулинов специа лизирован по вступлению во взаимодействие (найму) с опре деленными «исполнителями» деструкции антигена (лейкоцита ми или системой комплемента).

Следующий фундаментальный этап в исследовании анти тел — работы Г.Келера (Georges 1946—1995) и Ц.Миль штейна (Cesar Milstein), которые в клеток получения моно б Им присуждена Нобелевская Это одна из двух Нобелевских премий по медицине, присужденная за методическую работу. Всемирно признано беспрецедентное прикладное значение этой работы. Но велик и ее фундаментальный смысл. Она стала идеальным экспери ментальным доказательством всеобщности био синтеза иммуноглобулинов в В-лимфоцитах, что точно соот ветствует клонально-селекционной теории (гипотезе) устрой ства воооще, лауреатом Нобелевской премии 1960 г. Ф.Бернет опубликовал свою ги потезу в 1957 г. и сам рассматривал ее как развитие теории Н.Йерне о моноспецифичности антителообразую щих клеток.

Антитела синтезируют только и исключительно циты. Ниже, разбирая молекулярную генетику дифференци ровки В-лимфоцитов и биосинтеза иммуноглобулинов, мы увидим механизм процесса, в результате которого каждый единичный В-лимфоцит оказывается способен к синтезу един ственного варианта антитела по признаку структуры антиген связывающего центра молекулы. В динамике по мере диффе ренцировки В-лимфоцита, уже распознавшего свой антиген и вступившего в межклеточные взаимодействия, необходимые для развития иммунного ответа, происходит переключение син теза изотипа иммуноглобулина при сохранении неизменной структуры антигенсвязывающего центра.

Все вместе, т.е. совокупность В-лимфоцитов организма, спо собно синтезировать разнообразие антител — около случайных по специфичности к антигенам вариантов.

Каждому единичному В-лимфоциту и его митотически возникшим дочерним клеткам (это клон лимфоцитов по оп ределению) «на роду написано» обслужить, если потребует ся, некоторое множество антигенов.

4.3. Биохимические свойства иммуноглобулинов Известно два типа легких цепей — (каппа) и (лямб да). Соотношение количеств и — видоспецифичный и строго стабильный генетический признак: у человека оно рав но 2:1, у мыши — 20:1, у кошки — 1:20. Отклонение от это го соотношения у отдельных особей имеет диагностическое значение, так как является скорее всего признаком опухоле вого процесса — В-лейкоза. Функциональных различий меж ду иммуноглобулинами с легкими -цепями или с легкими до сих пор никто не выявил.

Классы иммуноглобулинов различаются между собой по тяжелым цепям. Тяжелые цепи обозначают греческими буква ми соответственно латинской аббревиатуре класса: для —, для — у, для — для — е, для — (рис. 4.2).

Легкие цепи примыкают к N-концу тяжелых цепей. С-ко нец тяжелых цепей формирует Fc-фрагмент молекулы имму ноглобулина.

Вторично регулярная структура полипептидных цепей пред ставлена, как мы уже упоминали, доменами. Домен составля ют ПО остатков аминокислот. Каждая L-цепь состоит из двух 4.2. Строение иммуноглобулинов 5 разных классов (схема).

1 — углеводные компоненты молекул иммуноглобулинов;

2 — J-цепь (от joint) — полипептидная цепь, связывающая в пентамер, a IgA в димер. IgA при секреции сквозь слизистые оболочки формирует димерный комплекс;

IgM в крови формирует пентамерный комплекс.

доменов — и -цепи молекул и IgA состоят каждая из 4 доменов и -цепи молекул IgM и IgE имеют по «лишнему» 5-му домену. По первичной струк туре С-домены похожи. Это указывает на то, что кодирую щие их структурные гены когда-то произошли путем дупли каций из общего предкового гена. По данным электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа кристаллов иммуноглобулинов, цепи сплетены в «косичку». Угол между двумя симметричными антигенсвязывающими центрами моле кулы подвижен в диапазоне от 0 до 100° и больше. Антиген связывающие участки молекулы способны к ротационному движению. Все это вместе облегчает возможность связывания антигенов обоими активными центрами одновременно. Это су щественно: опыт показывает, что в природе устроено так, что «достойный» иммунный ответ развивается лишь в тех случа ях, когда (и если) антиген «сшивает» несколько познающих рецепторов на поверхности лимфоцита.

IgM и IgA формируют полимерные структуры: IgM из «рогаток» формирует пентамер, находящийся в растворе в крови;

IgA из двух «рогаток» формирует димер, но не в кро ви, а в составе экзосекретов на слизистых оболочках. Для по лимеризации IgM и IgA включают в свой состав дополнитель ную полипептидную цепочку с молекулярной массой 15 000, называемую J-цепью (joint-связь). Эта J-цепь связывает терми нальные цистеины на С-концах соответственно тяжелых - и -цепей IgM и IgA.

Секреция IgA через слизистые оболочки наружу происхо дит в процессе так называемого трансцитоза через клетки эпителия слизистых оболочек. Изотип IgA синтезируется глав ным образом В-лимфоцитами неинкапсулированной лимфо идной ткани слизистых оболочек ЖКТ, дыхательных путей, мочеполовых путей, слезных, слюнных и молочных желез.

Димер IgA диффундирует сквозь базальную мембрану слизис тых оболочек. На базолатеральной поверхности эпителиальных клеток слизистых оболочек экспрессированы особые рецепто ры для молекул иммуноглобулинов, так называемые рецепторы. Эти рецепторы сорбируют димеры IgA, после чего происходят эндоцитоз комплексов — димер IgA, трансцитоз внутри эпителиальной клетки в виде особой везикулы и экскреция этого комплекса наружу в состав сли зи. При экскреции от отщепляется неболь шой фрагмент. его часть остается в связи с димером IgA, ее называют секреторным компонентом.

расщепляет молекулу иммуноглобулина выше ди сульфидных связей между тяжелыми цепями, поэтому в ре зультате получаются два Fab-фрагмента и Fc фрагмент. Пепсин расщепляет молекулу иммуноглобулина ниже дисульфидных связей между тяжелыми цепями и в ре зультате получается (двухвалентный по свя зыванию антигена) и Fc-фрагменты.

Во всех доменах молекул иммуноглобулинов есть одина ковые (общие) последовательности остатков аминокислот. С наибольшей стабильностью в этих консервативных (или, как их еще называют, гомологичных) последовательностях присут ствует триптофан. Наличие таких консервативных общих пос ледовательностей рассматривают как молекулярное свиде тельство генетической общности: гены, кодирующие отдель ные домены, произошли из общего предкового гена (путем дупликации, мультипликации и затем дивергентной эволю ции). Гомологичные названным последовательности амино кислот присутствуют, помимо иммуноглобулинов, и в мо лекулах других белков. Эти другие белки экспрессируются в клетках иммунной и по крайней мере нервной систем. Та кой общности в структуре соответствует и общность функ ционального предназначения — участие в процессах моле кулярного распознавания и взаимодействия клеток. Белки, содержащие последовательности аминокислот, идентифици рованные исходно в иммуноглобулинах, объединяют в одно суперсемейство — суперсемейство иммуноглобулинов superfamily). Кроме самих иммуноглобули нов, к этому суперсемейству относят рецептор Т-лимфоци тов для антигена (TCR — receptor), не все, но ряд ре цепторов клеток для цитокинов (для IL-1 тип I и II, IL-6, M-CSF, c-kit), мембранные молекулы межклеточной адгезии (ICAM-2, ICAM-3, VCAM-1), рецепторы клеток для Fc «хвостов» иммуноглобулинов классов А и G мембранную молекулу CD80 (второе название В7) — для CD28, мембранные молекулы CD4, CD8, CD3 и др.

Дальше мы увидим, как фундаментально и дружно задей ствованы в иммунном ответе все эти молекулярно-генетичес кие родственники.

Вариабельные последовательности аминокислот (т.е. разные у иммуноглобулинов, являющихся продуктами различных В лимфоцитов) не случайно распределены по V-области, а чет ко локализованы в определенных участках, называемых гипер вариабельными областями — их выделяют от 3 до 4: HV1, HV2, HV3, HV4 (HV — от hypervariable). У обозначений «HV» есть синоним — CDR (complementary determining regions):

CDR1, CDR2, CDR3 и CDR4. Именно эти последовательно сти аминокислот вступают в физическое комплементарное связывание с антигеном. Связывание с антигеном осуществ ляется следующими типами химических взаимодействий (сил, связей) между молекулой антитела (так же как и рецептора Т-клеток для антигена) и молекулой антигена: ионными, водородными и гидрофобными. Опти мальная реализация этих связей возможна только при физи ологических значениях рН, ионной силы, концентрации со лей. Если в лабораторной работе in vitro стоит задача диссо циировать комплекс антиген — антитело, то подбирают не обходимые и достаточные изменения рН, ионной силы или вводят в систему детергенты.

Иммуноглобулины могут связывать лиганды (антигены) разной химической природы: пептиды, карбогидраты, саха ра, полифосфаты, стероидные молекулы. Существенным и уникальным свойством антител, отличающим их даже от ре цептора Т-клеток для антигена, является их способность всту пать в связывание с цельными, нашивными молекулами анти генов, непосредственно в том виде, в каком антиген проник во внутреннюю среду организма. Для этого не требуется никакая предварительная метаболическая обработка анти генов. Следовательно, не требуется и время на предоб немедленно.

фактор безотлагательной пчел и др.). легкие и тяжелые цепи молекул иммуноглобулинов по отдельности, могут и вместе. У цельной молекулы мономерного иммуно глобулина два цельных и потенциально равнодееспособных симметрично расположенных активных центра для связывания антигенов. Сродство между антигенами и антителами количе ственно и качественно характеризуют такими понятиями, как аффинность и авидность.

Силу химической связи одного антигенного эпитопа с одним из активных центров молекулы иммуноглобулина называют аф финностью связи антитела с антигеном.

Аффинность количественно принято оценивать по констан те диссоциации одного антигенного эпитопа с одним актив ным центром в Так как в цельных молекулах антител классов и в норме по два активных центра, а в мо лекулах — 4, — 10, скорость диссоциации цельной молекулы иммуноглобулина от цельной молекулы антигена меньше, чем скорость диссоциации одного из активных цент ров.

Силу связи цельной молекулы антитела со всеми, которые ей удалось связать антигенными эпитопами, называют авидностью связи антитела с антигеном.

Авидность количественно также измеряют как константу диссоциации соответственно цельной молекулы антитела со всеми связанными эпитопами.

Эпитоп — это небольшой участок цельной молекулы ан тигена, который непосредственно вступает в ионные, водо родные, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные связи с активным центром антитела. Если антиген пептид, то размер эпитопа составляет от 5 до 7 аминокислотных остатков. Площадь свя зи активного центра с эпитопом равна 70—90 нм2. Синоним антигенного эпитопа — антигенная детерминанта. Эпитоп может представлять участок последовательно связанных аминокислотных остатков.

Такой эпитоп называют линейнъш (continuous). Но эпитоп может быть сформирован во вторичной структуре макромо лекулы антигена не из последовательно связанных аминокис лот. Такие эпитопы называют конформационными (или по-англ.

discontinuous epitopes). Современные химики успешно имити руют линейные эпитопы белковых антигенов, синтезируя пеп тиды любой заданной длины. Воссоздание эпитопов в синтетических пептидах — гораздо более трудная задача.

Промежутки между обозначают FR (framework regions), т.е. каркасные области. Их также 4: FR1, FR2, FR3 и FR4. Последовательности аминокислотных остатков в них весь ма консервативны. Исследования самых последних лет пока зывают, что этим консервативным последовательностям, кро ме чисто «скелетной» функции, случается выполнять и дру гие функции, отличные и от связывания с антигеном. Связы вание с антигеном — функция CDR. Забегая вперед, скажем, что в FR-участках V-области молекул иммуноглобулинов мо гут локализоваться такие активности, как ферментативная (протеазная и нуклеазная), связывание ионов металлов, свя зывание с суперантигенами. Ниже мы остановимся на этом подробнее.

4.4. Гены иммуноглобулинов Индивидуальный организм здорового человека в течение жиз ни создает несколько миллионов вариантов антител по спо собности связывать разные антигены (потенциально ан тигенов). Никакой геном физически не несет столько отдель ных структурных генов. Наследуемое от родителей количество генетического материала (ДНК), предназначенного для про граммирования биосинтеза антител, не так уж и велико — всего 120 структурных генов. Это наследуемое множество ге нов называют зародышевыми генами иммуноглобулинов, или зародышевой конфигурацией (germline configuration).

Разнообразие генетических кодов для миллионов вариан тов вариабельных участков молекул иммуноглобулинов фор мируется в течение всей жизни в процессе дифференцировки в каждом отдельном В-лимфоците осуществ ляется своя уникальная рекомбинация ДНК из зародышевых ге нов, и трансляция РНК, и последующий синтез белка уже идут с персонального для каждого В-лимфоцита генетического кода V-области.

Феномен рекомбинации ДНК соматических клетках, по крайней мере насколько известно современной науке, строго уникален исключительно для лимфоцитов. Подобного никто не наблюдал не только при дифференцировке каких-либо других клеток млекопитающих, но даже и каких-либо клеток иных эукариот. Соматическая рекомбинация ДНК «ниспосла на» только генам антигенраспознающих молекул лимфоци тов — иммуноглобулинов в В-лимфоцитах и рецептора Т-кле ток для антигена в Т-лимфоцитах.

Этот уникальный процесс генерации разнообразия анти генраспознающих молекул внутри организма понадобился для того, чтобы многоклеточные сумели выжить под инфекцион ным давлением разнообразных земных микроорганизмов. Мле копитающие эволюционируют так медленно, что человеку трудно это даже представить. Микроорганизмы, наоборот, эволюционируют в считанные дни — недели. Так вот, лимфо циты — специальное уникальное творение природы внутри организма многоклеточных с неслучайной, но запрограмми рованной изменчивостью только в генах антигенсвязывающих молекул TCR) в количественном отношении хоть в ка кой-то мере сопоставимы с разнообразием микробов. Разно образие это столь велико (например, относительно общего числа клеток в организме млекопитающего), что механизм генерации разнообразия соответствующих структурных генов мог быть (и стал) в основе запрограммированно случайным.

Свойство случайности при рекомбинации соответствующей ДНК объясняет тот широко известный факт, что иммунная система «в лице» лимфоцитов распознает разные вещества, а не только инфекционные микроорганизмы. В естественных природных условиях инфекционные микроорганизмы в боль шей мере, чем другие внешние объекты, способны проры ваться сквозь барьерные ткани многоклеточных. Если покров ные ткани «подтекают», т.е. в силу каких-либо патологичес ких причин, например, барьеры ЖКТ или слизистые оболоч ки дыхательной системы пропускают лишнее из пищи или вдыхаемого вещества, то лимфоциты распознают и реагиру ют на пищевые и ингаляционные антигены. Но вот к чему природа не готовила иммунную систему, так это к быстрому внедрению непосредственно во внутреннюю среду, минуя барьерные ткани, чужеродных веществ. Это чисто антропоген ные деяния по парентеральным введениям, вливаниям чужой крови, трансплантациям органов. Мы разберем в дальнейшем, что, например, трансплантат чужого органа организм реци пиента отторгает, как это не покажется странным, но по ошибке, которую совершают примерно % они они на ЧУЖИХ за свои.

а не 90 % Т-лимфоцитов никогда не ошибались, то чужая почка, печень, кожа, кровь и т.п. оставались бы «невидимыми» для иммунной системы.

Примерно 20 лет назад еще методами классической био химии, а именно аналитическим электрофорезом фрагменти рованной ДНК, обнаружили, что генетический материал для кодирования белков-иммуноглобулинов структурирован («ра зорван») на сегменты, расположенные друг относительно друга на уловимом расстоянии. Во всех клетках тела, включая стволовую кроветворную, кроме начавших дифференцировку В-лимфоцитов, гены иммуноглобулинов навсегда остаются в «разорванном» состоянии, которое называют зародышевой конфигурацией. И только в В-лимфоцитах на самом раннем этапе их специальной дифференцировки начинается сложный генетический процесс объединения сегментов ДНК, предназна ченных для кодирования разных частей молекулы иммуногло булина — V- и С-фрагментов, причем по отдельности для каждой из 3 типов полипептидных цепей — двух типов лег ких (к и ) и тяжелой. Это и есть феномен рекомбинации ДНК в соматической клетке. Этот феномен открыли S.Tonegava и его коллеги (1975—1976) при электрофорезе ДНК, выявив шем разницу во фрагментах рестрикции из антитело продуцирующих В-лимфоцитов и из любых других не проду цирующих антитела клеток данного организма (зародышевая конфигурация).

Структура генов иммуноглобулинов подробно изучена (рис.

4.3 и 4.4). Отдельные сегменты молекулярно клонированы, оп ределено их число. Кодирующая ДНК для вариабельной час ти каждой из цепей иммуноглобулина собирается из Зародышевая конфигурация ДНК генов L J Перестройка ДНК Перестроенная Транскрипция:

Первичный -ААА РНК-транскрипт Сплайсинг первичного транскрипта РНК:

Трансляция белка L-Цепь иммуноглобулинов 4.3. Структура генов легкой (L) цепи иммуноглобулинов (схема).

У человека 1 - 2 7 1 - У мыши 4.4. Структура генов тяжелой (Н) цепи иммуноглобулинов (схема).

С на lgG С на 4.5. Рекомбинация ДНК при переключении синтеза классов имму ноглобулинов в В-лимфоците.

тов, извлекаемых из трех отдельных кластеров: собственно V (вариабельный) (код для 95—101 аминокислоты), а также D (diversity — разнообразие) у тяжелых цепей и J (joining ~ связующий) (код для нескольких аминокислот — до 13). Пе реключение синтеза изотипов иммуноглобулинов показано на рис. 4.5. Гены для локализованы в хромосоме 2, для — в хромосоме 22, гены для тяжелых цепей всех изотипов — в хромосоме 14 (табл. 4.1).

Молекулярные генетики группируют сегменты в несколько семейств. В одно семейство включают в ко торых более 80 % последовательности нуклеотидов гомологич ны. Выделяют 7 семейств 7 семейств 8 семейств Таблица 4.1. Число сегментов генов вариабельных областей имму ноглобулинов человека* Легкие цепи Кластер Тяжелая цепь сегментов V D Нет Нет = J 5 4 * Поскольку молекулярного клонирования трудоемок и его вы полняют всякий раз для конкретного индивидуального генома, разумно до пустить, что у отдельных индивидуумов конкретное число сегментов может варьировать, но в узких пределах;

также разным может быть число псевдо генов.

Считают, что члены одного семейства произошли от одного древнего гена путем дупликаций.

Рекомбинацию ДНК иммуноглобулинов катализируют спе циальные ферменты — Эти же ферменты ката лизируют рекомбинацию ДНК генов TCR в Т-лимфоцитах, т.е. рекомбиназы — уникальные ферменты лимфоцитов. Но в В-лимфоцитах эти ферменты не «трогают» гены TCR, а в Т лимфоцитах не «трогают» гены иммуноглобулинов. Следова тельно, до начала процесса перестройки ДНК в клетке уже существуют генрегуляторные протеины — свои у Т-лимфоци гпов и свои у Гены, кодирующие эти белки, называют мастер-генами. Они в большей степени воображае мые, чем изученные, но являются реальным объектом иссле дования фундаментальной науки. Субстратом для рекомбиназ служат определенные последовательности нуклеотидов в ДНК генов-мишеней (кстати, одинаковые у Т- и В-лимфоцитов).

Эти последовательности фланкируют (т.е. расположены с ка кого-либо края) каждый отдельный сегмент генов-мишеней и их называют сигнальными для рекомбинации (rss — recom bination signal sequence). Rss расположены с З'-конца V-сегмен тов, с 5'-конца J-сегментов и с обеих сторон D-сегментов.

Последовательность нуклеотидов в rss расшифрована: консер вативный гептамер CACAGTG, затем вариабельный спейсер из 12 или 23 нуклеотидов и консервативный нонамер ACAAAAACC/GGTTTTTGT.

Самый первый акт расщепления цепи ДНК осуществляют два других специальных фермента лимфоцитов — гетеродимер ные эндонуклеазы, кодируемые генами, называемыми RAG-1 и (recombination-activating genes). Последовательность нук леотидов в гене RAG-1 подобна таковой в гене дрожжей HRP-1 и в генах топоизомераз бактерий, катализирующих разрывы и сшивки ДНК, что свидетельствует о «глубинном» единстве всего живого. Но среди клеток млекопитающих RAG- и RAG-2 только в лимфоцитах. Репарацию разрывов ДНК катализируют по крайней мере 3 ядерных фермента: один называют аутоантигеном второй — ДНК зависимой протеинкиназой, третий еще недостаточно охарак теризован.

У мышей с генетическим нокаутом по любому из генов ферментов, участвующих в перестройке ДНК антигенрецеп торных молекул TCR), лимфоциты не развиваются со всем и имеется клинический синдром тяжелой комбинирован ной иммунной недостаточности — scid (severe combined immunodeficiency).

В результате данной реакции рекомбинации в непрерывную последовательность ДНК соединяются по одному сегменту из V-, D- и J-областей — этот процесс называют нацией. Вся остальная ДНК D- и J-областей вырезается и выбрасывается из генома в виде кольцевых ДНК. Поэтому приобретение В-лимфоцитом в начале своей дифференциров ки специфичности по потенциальному антигену происходит раз и навсегда и строго необратимо на уровне ДНК.

В каждом единичном В-лимфоците случается своя уникаль ная комбинация VDJ для тяжелой цепи и VJ — для каждой из легких цепей. Таким образом и подсчитали возможное чис ло вариантов антител по антигенной специфичности, исходя из правил случайной комбинаторики. Для из 40 V сегментов и 5 J-сегментов может получиться 40x5 = 200 ва риантов V-области для — 30x4 = 120 вари антов;

всего для легких цепей 320 вариантов;

для тяжелой цепи 50V х 30D х 6J 9000 вариантов антигенсвязывающих областей тяжелых полипептидных цепей. В цельной молекуле иммуноглобулинов разные легкие и тяжелые цепи объединя ются в тетрамер также случайным образом (по крайней мере теоретически). Число случайных сочетаний из 320 и 9000 — около ЗХ106.

Но это не все, что обеспечивает разнообразие антигенсвя зывающих областей антител. Есть еще два молекулярных про цесса: запланированная неточность связи сегментов V-D-J и запланированный гипермутагенез именно в иммуногло булинов. Последнее свойство — гипермутагенез — отличает иммуноглобулинов даже от генов TCR: у TCR есть и комбинаторика сегментов, и неточность связи V-D-J, но не выявлен гипермутагенез.

Под неточностью связи V-D-J понимают тот факт, что при формировании этих связей происходит добавление лишних некодируемых наследуемым генетическим кодом нуклеотидов.

Их два «сорта»: Р-нуклеотиды и N-нуклеотиды. Нуклеотиды (от palindromic sequences) возникают на концах сегментов при вырезании одноцепочечных петлей ДНК и «достройки хвостов» ферментами репарации ДНК. Нуклеотиды N (от non template-encoded) пристраиваются к одноцепочечной ДНК после вырезания петли специальным ферментом лимфоци тов — терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой Этот фермент достраивает от 1 до 20 дополнительных нукле отидов, а ферменты репарации подстраивают комплементар ные пары и лигируют (ковалентно продольно состыковыва ют) двухцепочечную «пристройку» ДНК с двухцепочечными Р-нуклеотидами. TdT экспрессируется недолго и на ранних стадиях дифференцировки В-лимфоцитов. Поэтому N-нуклео тиды характерны для тяжелых цепей, поскольку гены тяже лых цепей перестраиваются в первую очередь. Гены легких цепей перестраиваются во вторую очередь и в них N-нуклео тидов уже не находят.

«Платой» за эти попытки увеличить разнообразие антиген связывающих областей антител, таким образом, является то, что в случаев добавление некодируемых нуклеотидов сдви гает рамку считывания в матричной (м) РНК так, что транс ляция белка становится невозможной. Это называют непродук тивной рекомбинацией генов иммуноглобулинов. Зато с учетом присоединения N- и Р-нуклеотидов число пар V-генов от тяжелой и легкой цепей достигает около 3500 и число вари антов антигенсвязывающих областей цельных молекул имму ноглобулинов, получающихся только в результате комбинато рики сегментов при перестройке ДНК, оказывается порядка 1013. Если учесть врожденные варианты V-, D- и J-сегментов, то мыслимое разнообразие и составляет около 1016, но реаль но меньше, так как в организме нет такого количества лим фоцитов.

Гипермутагенез, процесс возникновения точечных мутаций, происходит не под случайным воздействием космических ча стиц. Он запланирован и имеет место не во время лимфопо эза В-лимфоцитов в костном мозге, а во время иммуногене за (т.е. после реально состоявшегося распознавания антигена и начавшегося иммунного ответа) и локализован в лимфоид ных фолликулах периферических лимфоидных органов и тка ней (лимфатических узлах, селезенке, NLT). (Мы вернемся к его рассмотрению в соответствующем разделе.) Отметим толь ко, что именно гипермутагенез генов V-области иммуногло булинов и отбор В-лимфоцитов по силе связи с антигеном являются механизмом возрастания аффинности антител по мере прогрессивного развития так называемого вторичного иммунного ответа. Интенсивность гипермутаций в в В-лимфоцитах оценивают как замену одного нуклео тида из 1000 на один митоз: каждый второй В-лимфоцит клона в зародышевом центре приобретает точечную мутацию в V-Ig. Для всей остальной ДНК явление точечной мутации реализуется с частотой на 9 порядков ниже, т.е. одна замена нуклеотида на 1012 пар нуклеотидов на митоз.

Процессы перестройки генов иммуноглобулинов в В-лим фоците отрегулированы так, что из двух родительских хромо сом в конечном счете в одном В-лимфоците будет использо ван только единственный вариант как легкой, так и тяжелой цепи. Это явление называют исключением. А в орга низме в целом разнообразие удвоено — половина от «мамы», половина от «папы».

Описанные генетические механизмы генерации разнообра зия антигенсвязывающих областей антител имеются у чело века и мышей. У животных других видов есть иные молеку лярные механизмы. Например, у птиц, а также у некоторых млекопитающих (кроликов, овец) нет разнообразия зароды шевых сегментов в V-области. Поэтому первично перестроен ные гены иммуноглобулинов одинаковы у всех незрелых В лимфоцитов. Такие В-лимфоциты у птиц мигрируют из кост ного мозга в специализированный орган — сумку Фабрициу са, где они интенсивно пролиферируют. В процессе митозов в уже перестроенных генах V-области создается разнообразие по механизму, называемому конверсией генов: фрагменты ДНК из перестроенной V-области одной из гомологичных хромо сом обмениваются на фрагменты из неперестроенной и ра нее не использованной V-области второй из гомологичных хромосом. У овец, например, наибольший вклад в разнооб разие антигенсвязывающих областей антител вносят сомати ческие мутации, и процесс их накопления локализован в пейеровых бляшках подвздошной кишки.

Структурные гены константных частей полипептидных це пей иммуноглобулинов расположены в тех же хромосомах, что и V-, D- и J-гены, «ниже по течению», т.е. к З'-концу от J-сегментов. Для легких и существует по одно му С-гену - и C. «Стыковка» нуклеотидного кода для V и С-частей легких цепей происходит на уровне не ДНК, а РНК — по механизму сплайсинга первичного транскрипта Для каждого изотипа иммуноглобулинов есть свой отдель ный У человека такие гены расположены в следующем порядке, считая от J-сегмента к З'-концу:

(псевдоген е-цепи), у мыши: C, СуЗ, C.

Завершившие лимфопоэз, В-лимфоциты любого клона по антигенной специфичности (специфичности V-области имму ноглобулина) экспрессируют иммуноглобулины только клас сов и D. При этом мРНК транскрибируется в виде непре рывного транскрипта с перестроенных генов и 5.

При этом ДНК остальных С-генов других изотипов цела и не вредима. В результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта РНК образуются мРНК отдельно для тяжелых цепей и которые и транслируются в белок. Этим процессом заканчивается полноценный лимфопоэз В-лимфо Переключение же на синтез иммуноглобулинов других изо типов (G, Е, А) происходит уже в процессе развития им мунного ответа, т.е. после распознавания антигена и под воз действием определенных (в значительной мере известных на сегодня) цитокинов Т-лимфоцитов и молекул клеточной мембраны Т-лимфоцитов (CD40L). Существенно, что такое переключение вдет опять по механизму рекомбинации ДНК: в ДНК к ранее и единожды перестроенной комбинации VDJ присоединяется какой-либо один из С-генов тяжелой цепи (либо либо Су2, либо СуЗ, либо Су4, либо Се, либо 1, либо ДНК неиспользованных С-генов слева от использованного С-гена на этом этапе развития В-лимфоцита элиминируется в виде кольцевых структур. С этого момента судьба В-лимфо цита определена как по единственной антигенной специфич ности, так и изотипу тяжелой цепи. Если из окружений про должают поступать регулирующие переключение изотипов сигналы, то возможен еще акт переключения на изотип, С-ген которого «правее» в ДНК от уже экспрессированных С-генов.

Если с инструкциями «покончено», вступает в терминальный этап своего развития: он становится плазмати ческой клеткой — продуцентом больших количеств монокло нального секретируемого иммуноглобулина.

При переключении изотипа тяжелой цепи ДНК разрыва ется по так называемым областям переключения (switch region — расположенных в перед каждым С-ге ном (за исключением С<5). SR перед C состоит из 150 по второв последовательности (GGGGGT)]. SR пе ред другими С-генами отличаются в деталях, но во всех из них содержатся повторы GAGCT и GGGGGT. При переклю чении изотипов с ДНК работают физически другие фермен ты, чем при рекомбинации VDJ (см. рис. 4.5).

Молекулы иммуноглобулина одной и той же специфичнос ти по антигену присутствуют в организме в двух физических состояниях — в растворе и на мембране клеток и в в растворимой форме в крови и других биологических жидкостях клеткой иммуноглобулин);

на мембране В-лимфоцита в составе рецептора В-лим фоцитов для антигена — BCR receptor) мембранная форма иммуноглобулина). Трансмембранные формы всех классов иммуноглобулинов, включая и мономеры;

в связи с клетками, но не в трансмембранном вариан те, а связанным за Fc-конец Fc-рецептором клетки.

В свободном виде только иммуноглобулины класса способны быть связанными с на тучных клетках, / базофилах, дендритных клетках и некоторых других ти пах клеток. Для остальных изотипов иммуноглобулинов 1 характерна фиксация на FcR на клетках только после связывания антитела с антигеном, т.е. фиксируется не / свободное антитело, а комплекс антиген — антитело / через Fc-конец молекулы иммуноглобулина (на макро фагах, нейтрофилах, эозинофилах).

Возвращаясь к трансмембранной и секретируемой формам иммуноглобулинов, отметим, что они различаются по своему С-концу тяжелых цепей: в трансмембранной форме у тяже лых цепей молекулы есть лишние 25 остатков гидрофобных аминокислот, которые «заякоревают» молекулу в фосфолипид ном бислое мембраны. Трансмембранная и секретируемые «версии» тяжелых цепей кодируются разными экзонами соот ветствующих С-генов. В данном случае экзонами называют структурные гены каждого из отдельных доменов полипептид ной цепи. Последний экзон каждого С-гена содержит после довательности нуклеотидов для кодирования трансмембранно го участка молекулы. Первичный транскрипт РНК дифферен цирующего В-лимфоцита содержит все экзоны С-гена. Транс ляция белка с полноразмерной мРНК обеспечивает биосин тез тяжелых цепей для трансмембранной формы. Но после дний экзон может быть легко удален из первичного крипта РНК, и тогда будет транслироваться секретируемая форма иммуноглобулина. В зрелых плазмоцитах трансмембран ная форма уже совсем не синтезируется, а только продуци руется секретируемая форма.

4.5. Изотипы, аллотипы и идиотипы иммуноглобулинов В классической серологии для характеристики иммуноглобули нов используют не только понятие изотипа, но и такие поня тия, как аллотипы и идиотипы конкретных молекул иммуно глобулинов. Эти понятия обусловлены различиями между мо лекулами иммуноглобулинов, которые можно выявить по ре акции данных белков с антителами к ним. Для этого лабора торных животных иммунизируют так или иначе выделенными препаратами иммуноглобулинов и получают антисыворотки.

Во-первых, существует легко выявляемая с помощью ан тисывороток общность иммуноглобулинов одного изотипа у всех особей данного вида животных (видовая антиклассовая/ субклассовая или антиизотипическая специфичность), т.е. изо типами иммуноглобулинов называют варианты классов и под классов (вместе взятые) иммуноглобулинов по тяжелым цепям.

У человека есть 9 изотипов: М, G2, G3, G4, 2, Е, D. Но отдельные особи одного вида продуцируют несколько отличающиеся варианты иммуноглобулинов в пределах одноимен ного изотипа — это аллельные варианты, или аллотипы, имму ноглобулинов. Факт существования свидетельствует о некотором генетическом полиморфизме внутри вида по ло кусам С-генов как легких, так и тяжелых цепей.

\ Антисыворотки против уникальных вариабельных участков молекул иммуноглобулинов называют антиидиотипическими, а эпитопы в молекуле антител — идиотопом — — уникальный, не такой, как другие).

Таким образом, идиотип антитела — это вариант уникального участка молекулы иммуноглобулина.

Перечислим свойства человеческих иммуноглобулинов раз ых классов (табл. 4.2).

4.2. Свойства человеческих иммуноглобулинов lgA lgG2IgG3IgG Свойство Тяжелая цепь e Молекулярная 146 146 165 146 970 160 184 масса, х Концентрация в 0,5 3 0, 1 0,03 0,00003 1, 9 сыворотке крови, 0, Время полураспада 7 21 6 6 3 21 в крови, сут — Активация комп- — — +++ — — ++ + лемента по клас + сическому пути — Связывание с — — ++ — — +++ — Fc-рецептором фагоцитов — Связывание с — — — — +++ — — — тучных кле ток и базофилов ++ Способность ++ ++ ++ — — + ++ ++ нейтрализовать инфекционность вирусов и бактерий +++ Экзосекреция _ +++ — ++ + — — через эпителий оболочек Проникновение — — — — +++++++++ +++ — через плаценту Количественная выраженность того или иного свойства в данном случае представлена в условных знаках: «—» — отсутствие;

«+» — немного;

«++» — больше, чем «+»;

— больше, чем «++».

Низкие концентрации, например, в крови не означа ют, что организм продуцирует IgA меньше, чем Скорее наоборот: суточная продукция IgA возможно максимальна среди прочих изотипов и составляет около 3 г, но его физи ологическое место не в крови, он секретируется из внутрен ней среды во внешнюю — в слизистые экзосекреты и таким образом является фактором специфической иммунной защи ты внутренней среды, вынесенным во внешнюю за пределы покровных тканей. Кстати, в работах последних лет появились данные, свидетельствующие о том, что и иммуноглобулины другого изотипа — более чем на 90 % секретируются в слизистый экзосекрет ЖКТ. (Подробнее о функциональных свойствах антител разных классов рассказано в главе 8.) 4.6. Дифференцировка В-лимфоцитов Дифференцировка В-лимфоцитов из общей лимфоидной клет ки-предшественницы — потомка стволовой кроветворной клетки состоит из следующих этапов и процессов:

• развитие молекулярно-генетического аппарата, обеспе чивающего биосинтез иммуноглобулинов — это пере стройка генов иммуноглобулинов (обеспечивающая раз нообразие антигенсвязывающих областей иммуноглобу линов) и настройка этих генов на продуктивную интег рацию в клеточный метаболизм;

• экспрессия генов молекул, обеспечивающих проведение сигнала с иммуноглобулинового рецептора для антиге на внутрь клетки;

• экспрессия генов мембранных молекул, необходимых для участия В-лимфоцита во взаимодействиях с другими клет ками, в первую очередь с Т-лимфоцитами и фоллику лярными дендритными клетками. Это молекулы CD40, МНС-И, CD45, рецепторы для роста (IL-7 во время лимфрпоэза, IL-2 во время иммуногенеза);

• для эффективного функционирования В-лимфоцитов "су щественна экспрессия на мембране корецепторов 19, CD20 и CD21. Не случайно именно эти мембранные молекулы используются как маркеры для определения содержания В-лимфоцитов лабораторными методами идентификации клеток.

Прежде чем описать последовательность событий диффе ренцировки В-лимфоцитов, скажем о существовании двух известных на настоящее время субпопуляций В-лимфоцитов — и В-2. — это те лимфоциты, про кото рые знали стали известны относи тельно недавно и «проявили» они себя при детальных анали зах определенных клинических случаев лейкозов.

циты несут мембранный маркер, которого нет на фоцитах, — это Та же молекула экспрессиру ется и на части поддерживают свою физиологическую ре генерацию в течение всей жизни из отдельной клетки-пред шественницы, пул за счет общей Эта отселяется из кроветвор ной ткани на свою анатомическую территорию — в ную и плевральную полости — еще в эмбриональном перио де. — полости. В-1-лимфоциты значительно отличаются от В-2-лим фоцитов по способностям проду цируемых антител. Антитела, синтезированные тами, не имеют значительного разнообразия вариабельных участков молекул иммуноглобулинов, но, напротив, ограни чены в репертуаре распознаваемых антигенов, и эти антиге ны — наиболее распространенные соединения клеточных сте нок бактерий. Все В-1-лимфоциты представляют собой как бы один не слишком но определенно ентированный клон. продуци руемые почти исключительно пере ключение классов не Таким образом, В-1-лимфоциты — «отряд» противобактериальных «пограничников» в прибарьерных по лостях, предназначенных для быстрой реакции на «просачи вающиеся» через барьеры инфекционные микроорганизмы из числа широко распространенных. В сыворотке крови здорового человека часть иммуноглобулинов — продукт синте за как раз т.е. это относительно полиспе цифичные иммуноглобулины антибактериального назначения.

— это лимфоциты, характеризующиеся широким разнообразием антигенраспознающих участков мо лекул продуцируемых ими иммуноглобулинов. Они проходят свой лимфопоэз в раннем эмбриогенезе на территории пече ни, затем исключительно на территории костного мозга, а свой иммуногенез — строго в фолликулах периферических J лимфоидных органов. В лимфопоэзе В-2-лимфоцитов выделяют/ 6 этапов: [общая лимфоидная клетка-предшественник] ранняя поздняя про-В-клетка большая пре-В-клетка малая пре-В-клетка незрелая В-клетка зрелая неиммунная В-клетка (выходит из костного мозга в периферическую лимфоидную ткань).

Клетки стромы костного мозга обеспечивают оседлость развивающихся за счет взаимодействия опре деленных молекул межклеточной адгезии и факторы роста для необходимого числа циклов пролиферации. Как и во всех слу чаях клеточной дифференцировки, самые ранние механизмы комитации к данному пути, а не к другому, неизвестны. Но ряд маркеров движения по пути В-лимфопоэза известны.

На ранней лимфоидной клетке-предшественнице экспрес сируются несколько молекул адгезии, обеспечивающих осед лость в течение необходимого периода времени в костном мозге, среди них VLA-4 (very late antigen-4 — очень поздний антиген 4), лигандом которого на клетках стромы является (vascular cell adhesion — молекула адге зии 1 к стенке сосуда). На ранней про-В-клетке, кроме мо лекул адгезии, экспрессируется рецептор, называемый c-kit, для первого фактора роста — мембранной молекулы клеток стромы SCF (stem-cell factor) — стволовоклеточного фактора.

Это взаимодействие обеспечивает надлежащее число митозов еще не поделенных на клоны по рецепторам для антигенов предшественников В-лимфоцитов.

На следующей стадии — поздней про-В-клетке — экспрес сируется рецептор для IL-7, воспринимающий секретируемый теми же клетками стромы цитокин IL-7. Выявлен и еще один цитокин, продуцируемый клетками стромы костного мозга, нокаут гена которого полностью отменяет развитие В-лимфо цитов — это PBSF/SDF-1. Данные взаимодействия поддержи вают пролиферацию про-В- и больших пре-В-клеток, в ко торых уже произошла перестройка генов тяжелой цепи, но еще не было перестройки генов легкой цепи. Таким образом накапливаются «полуклоны» В-лимфоцитов с уже известной специфичностью по тяжелой цепи, но еще неизвестной — по легкой. Это тоже механизм приумножения разнообразия ан тигенсвязывающего репертуара цельных молекул иммуногло булинов: с одной и той же тяжелой цепью будут сочетаться в пары разные варианты легких цепей.

Главные события дифференцировки В-лимфоцитов — пе рестройка генов иммуноглобулинов — начинаются на стадии ранней про-В-клетки с перестройки D-J в генах тяжелых цепей, причем на обеих гомологичных хромосомах. В поздней про-В-клетке происходит рекомбинация ДНК V-DJ сначала на одной из гомологичных хромосом. Если она окажется не продуктивной, то та же попытка делается на второй гомоло гичной хромосоме. В случае продуктивной перестройки на первой хромосоме вторая использована не будет.

На следующей стадии в пре-В-клетке происходит пере стройка V-J легких цепей, причем сначала одной из цепей — к или, на одной из гомологичных хромосом. Если не полу чится продуктивная перестройка с первой попытки в случае легких цепей, предпринимаются следующие.

Клетки, в которых не получилось ни одной продуктивной перестройки в генах тяжелых и легких цепей, погибают по ме ханизму апоптоза — явления, весьма распространенного для лимфоцитов.

4.7. Рецептор В-лимфоцитов для антигена Экспрессия на поверхности клетки продуктов перестроенных генов иммуноглобулинов, кроме того, что является главным «опорным» параметром конечной цели всей дифференциров ки В-лимфоцитов, в динамике служит еще и решающими ориентирами процесса развития этих клеток.

Собственно связывание антигена — функция вариабельных доменов димера из тяжелой и легкой цепей иммуноглобули на во всех физических состояниях молекулы этого белка, но чтобы быть рецептором для антигена на клетке «чистой» мо лекулы иммуноглобулина мало. Кроме того, что мембранная форма иммуноглобулина имеет дополнительный гидрофобный трансмембранный участок полипептида в тяжелых цепях, в формировании BCR участвуют еще два обязательных полипеп тида, называемые (неудачно) (рис. 4.6). Дело в том, что участок трансмембранной формы тяжелых цепей состоит из остатков всего 3 аминокислот. Этого мало, чтобы иметь эф фективные связи с внутриклеточной метаболической «маши ной». Рецептор же по определению не только воспринимает сигнал (физически связывает лиганд), но и проводит его внутрь клетки. Так вот компоненты BCR и своими цитоплазматическими участками молекулы связаны с внутри клеточными тирозинкиназами, что и обеспечивает проведе ние сигнала от связывания антигена внутрь клетки, чтобы та могла изменить свой метаболизм в соответствии с внешними запросами. В цитоплазматических участках и присут ствуют характерные последовательности остатков аминокис A- / 4.6. Строение рецептора В-лимфоцита для антигена (схема).

лот, называемые активирующими последовательностями (ГТАМ — immunorecep tor tyrosine-based activation motifs). Такие же последовательно сти присутствуют в проводящих сигнал компонентах рецеп тора Т-клеток для антигена. Таким образом известно, что первой биохимической реакцией активации внутриклеточных процессов после связывания рецептором антигена является фосфорилирование остатков тирозина в ITAM.

Iga и имеют по одному внеклеточному домену, кото рым они прочно нековалентно связаны с тяжелыми цепями иммуноглобулинового компонента Экспрессия и начинается на стадии про-В-клетки и поддерживается в тече ние всего онтогенеза В-лимфоцита до самой терминальной стадии — плазмоцита, на котором экспрессия BCR прогрес сивно уменьшается до полного исчезновения.

Для того чтобы произошла эффективная активация В-клет ки через BCR, необходима перекрестная сшивка антигеном нескольких Для этого молекула антигена должна иметь повторяющиеся эпитопы на своей поверхности. Дальнейшие события активации В-лимфоцита показаны на рис. 4.7.

Выявлены 4 тирозинкиназы, ассоциированные с BCR: Fyn, Btk, Lyn и Syk. Сначала первые 3 обеспечивают фосфорили рование двух остатков тирозина в ITAM Iga и К фосфо рилированным присоединяется и тем активирует ся к действию Syk, продолжающая активационный каскад.

Тирозинкиназы активируются в результате фосфорилирования в одном месте и ингибируются в результате тоже фосфори лирования, но в другом месте молекулы: так устроено, что бы процесс активации клетки не принимал характера «враз нос».

Для активации необходимо дефосфорилирование ингиби ционных участков молекул тирозинкиназ. Такое дефосфори лирование катализирует мембранная тирозинспецифичная фосфатаза CD45. Эта молекула имеет несколько изоформ, экспрессирована на всех белых клетках крови, поэтому у нее есть второе название — общий антиген лейкоцитов.

Внутри клетки действует еще одна фосфатаза — SHP, торая дефосфорилирует активационные тирозины, чем огра ничивает процесс активации лимфоцита. Мыши, у которых этот фермент отсутствует по причине мутации, реагируют на существенно меньшие дозы антигенов, чем нормальные мыши, у них необыкновенно повышен уровень пролиферации лимфоцитов, и эти мыши умирают через несколько недель после рождения с клиническими признаками разлитой ауто иммунной патологии.

Тирозинкиназа Syk активирует фосфолипазу (PLC-y) и Ras. Ras в свою очередь активирует Raf— киназу, которая фосфорилирует внутриклеточные белки по Тирозинкиназы Тирозинфосфатаза CD Тирозинкиназа Syk отщепляет ингибирующие Fyn, Lyn фосфаты от Связывание BCR с антиге- ных с BCR чем способствует их активации ном вызывает активацию ассоциированных с рецеп тором Syk Активированные киназы связывается фосфорилируют по остатку с фосфорилированными тирозина кие участки молекул участками молекул и и при этом становится активной Активированные киназы фосфорилируют и тем "активируют фосфолипазу и Ras.

расщепляет фосфатидил-инозитолди - Ras активирует серин треонинкиназу Raf фосфат с образованием диацилглицерола (DAG) и инозитолтрифосфата DAG активирует способствует С повышению концентрации внутри клетки Фосфорилирование белков Активная Raf фосфорили Активация клетки по остаткам серина рует белки клетки по остат ферментов и треонина кам серина или треонина Активация белков, взаимодействующих с ДНК. В результате происходит транскрипция с определенных генов 4.7. Активация В-лимфоцита: внутриклеточная передача «сигнала».

остаткам серина или треонина, что вносит свой вклад в ак тивацию ДНК-связывающих белков и тем самым способно инициировать транскрипцию с генов.

Фосфолипаза катализирует расщепление фосфатидил инозитола бифосфата на диацилглицерол (DAG) и инозитол трифосфат DAG активирует протеинкиназу С — серии/ треонин киназу, которая начинает фосфорилировать белки по остаткам серина или треонина, что, как и при работе Raf, заканчивается активацией транскрипции с генов. Инозитол 4- трифосфат стимулирует повышение в клетке концентрации свободных ионов Са. В результате активируются кальцийзави ферменты, что также действует в направлении акти вации транскрипции с генов.

На клеточном уровне активация представляет собой соче тание двух феноменов — пролиферации и/или биосинтеза спе цифических белков.

О том, что проведение сигнала внутрь клетки — не толь ко конечная цель, но и необходимо для самого процесса диф ференцировки, свидетельствует тот факт, что генетический дефект в тирозинкиназе Btk (Bruton's tyrosine kinase) имеет следствием иммунодефицитную патологию с полным отсут ствием у человека В-лимфоцитов — Х-сцепленную агамма Брутона (Bruton's agammaglobuline mia — XLA).

4.8. Стадии лимфопоэза В-лимфоцитов Введение в зародышевые клетки перестроенного трансгена тяжелой цепи полностью подавляет перестройку одноименных собственных генов клетки. Но если трансген не содержит кода для трансмембранного участка тяжелой цепи, то трансген не мешает перестройке собственного одноименного гена. Следо вательно, для того чтобы в конечном счете дифференциро ванный имел строго один вариант тяжелой цепи и один вариант легкой, еще в процессе дифференцировки необходима экспрессия тяжелой цепи на мембране. Так оно и есть. Как только в клетке произошла трансляция полипеп тида тяжелой цепи, он экспрессируется на мембране в со ставе так называемого пре-В-рецептора. Чтобы это могло слу читься, в про-В-клетке синтезируются два специальных по липептида, которые нековалентно соединяются друг с другом и это соединение называют суррогатной легкой цепью. Один из этих полипептидов — второй — VpreB. Таким образом, пре-В-клеточный рецептор состоит из 5 + VpreB + + + + Его экспрессия транзиторна, но абсолютно не обходима для правильной дифференцировки В-лимфоцитов.

После экспрессии пре-В-рецептора временно инактивируют ся белки RAG, и клетки вступают в процесс интенсивной пролиферации, которая прекращается с исчезновением этого рецептора. После завершения этой волны пролиферации вновь экспрессируются и RAG2 и начинается перестройка генов легкой цепи. Как только это произойдет, на развиваю щемся В-лимфоците будет экспрессироваться дефинитивный BCR состава: L-цепь + -цепь + + Эту стадию раз вития называют незрелым Маркером завершения В-лимфопоэза — образования зре лого неиммунного В-лимфоцита, готового к выходу из кост мозга в периферическую лимфоидную ткань, — являет ся коэкспрессия на мембране двух типов BCR — с IgM и IgD альтернативный сплайсинг РНК-транскрипта с тяжелой цепи).

Прежде чем произойдет экспрессия на мембране IgD, но после того как произошла экспрессия BcR с полноценным в развитии В-лимфоцитов «предусмотрен» существенный и обязательный этап дифференцировки — селекция (апоптоз) аутореактивных клонов в местах прохождения лимфопоэза, т.е.

па территории костного мозга. В природе устроено так, что связывание антигена незрелой В-клеткой, на которой есть антигенраспознающий рецептор с IgM, но еще нет рецепто ра с IgD, является сигналом для апоптоза, т.е. запрограмми рованной гибели клетки. Таким образом, из случайного ре пертуара по антигенсвязывающим рецепторам на исходе лим фопоэза убираются В-лимфоциты, несущие рецепторы, спо собные с высокой аффинностью связывать белки собственных клеток и растворимые белки, присутствующие в достаточных количествах на территории костного мозга. Такой механизм толерантности к своему называют делецией клона (clonal deletion).

Толерантностью в иммунологии называют отсутствие им мунного ответа конкретной особи на тот или иной (те или иные) антигены, на который(ые) другие особи либо та же особь, но при иных конкретных условиях онтогенеза, потен циально способны развивать иммунный ответ. Делеция клона — не единственный механизм установления толерантности к конкретному антигену со стороны В-лимфоцитов. Известно еще два механизма: развитие состояния ареактивности (или анергии) и рецептора по антигенной специфично сти. Эти два механизма действуют в периферических лимфо идных тканях.

Реальность механизма делеции клона, специфичного к мультивалентному антигену, который экспрессирован на мем бранах собственных клеток, хорошо видна в экспериментах с трансгенными мышами. Например, в таком эксперименте, в котором трансгены — легкой и тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина, специфичного к молекулам главного комп лекса гистосовместимости I класса У таких мышей бла годаря описанным выше закономерностям все В-лимфоциты имеют один и тот же BcR с иммуноглобулином, кодируемым трансгеном. Если мыши-реципиенты такого трансгена в соб ственном организме не имеют антигена-мишени (т.е.

у них имеется нормальное количество В-лимфоцитов в пери ферических лимфоидных тканях, только все они с одним и тем же рецептором. Но если мыши-реципиенты сами имеют ген/антиген то у них находят нормальное количество пре-В-клеток, которые, однако, все погибают на территории 4* костного мозга апоптозом и в периферических лимфоидных тканях В-лимфоцитов совсем нет. По тому же механизму кло нальной делеции погибают и В-лимфоциты на периферии, если они несут рецептор, способный связывать молекулы мембран клеток, которые представлены в большом количе стве в тех или иных тканях (например, в печени).

Если незрелый В-лимфоцит (с но без связывает растворимый антиген (например, в организме дважды генных мышей: один трансген кодирует синтез растворимого белка, второй — антитела к нему), то лимфоцит не элими нируется апоптозом, а остается в организме, но приобретает состояние анергии: в результате связывания антигена с рецеп тором не наступает активация лимфоцита к иммунному отве ту, наоборот, развивается блок проведения сигнала.

У зрелых в лимфоидных тканях на большие дозы растворимых антигенов и особен но при отсутствии адекватного взаимодействия с Т-хелпе рами так же развивается состояние анергии.. Такие клетки долго не живут и в течение нескольких дней все равно поги бают.

Для полноценной реакции на антиген лимфоциту мало толь ко рецептора для антигена. У лимфоцитов есть еще такой обя зательный фактор, как корецепторный комплекс мембранных молекул, связанных с внутриклеточными системами проведе ния сигналов. Не на каждом антигене есть повторяющиеся эпитопы, следовательно, не каждый антиген способен вы звать перекрестную сшивку (или агрегацию) BCR. Вот CR 4.8. Корецепторный комп лекс В-лимфоцита.

Связывание рецептора для компле мента с лигандом приводит к фосфорилированию молекулы CD19. Фосфорилированная молеку ла CD19 связывает Lyn (из семейства Scr) и PI-3 (фосфатидилинозитол 3-киназу), которые вносят свой вклад в ITAM последователь ностей в цитоплазматическом учас тке обеспечива ющих передачу сиг нала) BCR, что усиливает актива цию В-лимфоцита. (от Target of proliferative antibody) — ранная молекула, структурно ассо циированная с рецептором В-лим фоцита для антигена;

ее функции точно еще не охарактеризованы.

Scr PI в этих случаях и нужны дополнительные сигналы. В торный комплекс входят по крайней мере та кие мембранные молекулы, как CD19/CR2 (CD21)/TAPA- (рис. 4.8).

Молекула 19 экспрессирована на всех В-клетках, начи ная с ранних стадий лимфопоэза. Генетический нокаут мы шей CD19 приводит к выраженному дефициту В-клеточ ного иммунного ответа на любой антиген. Точные механизмы участия 19 в активации антигеном неизвес тны. В мембране 19 физически ассоциирована с рецепто ром 2-го типа для компонентов комплемента — CR2 (CD21).

Связывание CR2 с компонентами комплемента имеет след ствием фосфорилирование молекулы 19 ассоциированными с BCR киназами. Фосфорилированная молекула 19 связы вает фосфатидилинозитол-3-киназу и молекулу vav (многофун кциональная молекула проведения внутриклеточных сигналов), которые усиливают активационные реакции, инициированные с BCR. Физически в мембране к CD19 и CR2 примыкает (CD81), но роль этой молекулы неизвестна.

В результате только совместной работы и корецептор комплекса возможен запуск в клетке таких процессов, как пролиферация, экспрессия на мембране молекул, необходимых для взаимодействия с Т-лимфоцитами, экспрессия на В-лимфо цитах молекул МНС-П, необходимых для представления В-лим фоцитом антигена Т-лимфоциту для распознавания.

Приведем краткие суммированные сведения о динамике приобретения признаков дифференцировки во время разви тия В-лимфоцитов (лимфопоэза) (табл. 4.3).

После распознавания антигена и вступления в иммунный ответ в периферических лимфоидных органах и тканях В-лим фоцит пройдет еще две стадии додифференцировки, которые называют иммуногенезом. На второй из этих стадий произой дет дихотомия: В-лимфоцит станет либо В-лимфоцитом па мяти (уйдет в дифференцированный резерв на случай, если тот же антиген попадет во внутреннюю среду организма по вторно), либо плазматической клеткой — терминальным про дуцентом больших количеств секретируемого иммуноглобули на заданной специфичности. Собственно иммуногенез мы бу дем разбирать ниже, здесь, забегая вперед, приведем призна ки дифференцировки В-лимфоцитов на разных стадиях им муногенеза в В-лимфоциты памяти и плазматические клетки (табл. 4.4).

Третий механизм избегания аутореактивности В-лимфоци тов, «редакция» рецептора, — используется, по-видимому, в небольшом проценте незрелых В-клеток, в которых еще ак тивны гены перестройки RAG-1 и RAG-2. В этих клетках свя зывание в составе BcR на поверхности незрелого фоцита с антигеном является сигналом для запуска нового Таблица 4.3. Стадии (признаки) дифференцировки в лимфопоэзе Стадия развития Состояние Состояние Экспрессия Маркеры В-лимфоцита в генов генов особых клеточной лимфопоэзе тяжелой легкой триклеточ- мембраны цепи цепи ных белков Общая Зародыше- Зародыше- CD лимфоидная вая конфи- вая конфи- RAG2 CD клетка-пред- гурация гурация шественник Ранняя про-В- Перестрой- То же CD RAG2 CD ка DJ TdT VpreB CD Перестрой- » » TdT В-клетка (ин- ка V-DJ CD VpreB тенсивно 5 CDI лиферирует) Рецепторы CD для МНС-П Большая пре- Перестро- » » CD45R В-клетка (ин- енный VDJ RAG2 МНС-И тенсивно про- VpreB Pre-BCR лиферирует) CD Рецепторы для IL-7 CD Малая пре-В- То же Перестрой- Тяжелая - CD45R клетка ка V-J цепь МНС-П Легкая к - CD или CD CD Незрелая В- Перестро- Перестро- — CD45R клетка енный VDJ енный VJ МНС-Н в CD в CD мембран- CD ной форме Зрелая неим- Экспрессия Экспрессия CD45R — мунная В- IgM и IgD легкой МНС-П клетка цепи CD CD CD BCR-IgM/ 4.4. Признаки в процессе развития иммунного ответа (иммуногенеза) Стадия Состояние ге- Состояние ге- Экспрессия Маркеры развития нов/РНК/белка нов/РНК/бел- особых клеточной тяжелой цепи ка легкой внутри- мембраны в иммуно- цепи клеточных генезе белков Альтернатив- Продук- Специфи- CD45R ный сплай- тивный ческое МНС-Н синг синтез антитело биосинтез легкой CD секретируе- цепи CD формы CD В V-генах CD45?

Произошло цит памяти переключе- произошли МНС-П ние класса гипермути тяжелой рование и Или отбор цепи с на наиболее у, или IgE В V-генах аффинных CD произошли антител CD гипермути CD рование и CD отбор наибо лее аффин ных антител Плазмоцит Массовая Массовая Массовая Антиген продукция продукция продукция плазмоци легких цельных тяжелых цепей цепей иммуно- (CD38) заданного заданного глобулинов в секре типа типа торной форме процесса рекомбинации на второй из двух гомологич ных хромосом: если «повезет», то для второго варианта VDJ/ VJ на территории костного мозга не найдется антигена и В лимфоцит выживет и будет иметь шанс быть использованным на периферии.

В костном мозге молодых здоровых мышей ежедневно всту пают в митоз 30—40Х106 клеток. Из них только клеток (меньше половины) выходит на периферию. Столько же периферических В-лимфоцитов ежедневно отмирает. Это ежедневное обновление пула составляет 5—10 % общего чис ла периферических В-лимфоцитов. Если «новый» В-лимфоцит по каким-то причинам не попал в лимфоидный фолликул периферических лимфоидных тканей, то его время полужиз ни не превысит 3 дней. В лимфоидных фолликулах неиммун ные время полужизни от 3 до 8 нед: все это время они готовы встретить «свой» процесс иммуногенеза, т.е. развития иммунного ответа, и стать либо плазмоцитом, либо В-лимфоцитом памяти.

Специализированное анатомическое место пребывания В лимфоцитов в периферической лимфоидной ткани — фолли кулы. В фолликулах В-лимфоциты удерживаются связями со специальными клетками стромы — дендритными клетками фолликулов (FDC — follicular dendritic cells). FDC — это не те же самые дендритные клетки, которые присутствуют в покровных тканях [под названием клеток Лангерганса (белых отростчатых эпидермоцитов — по новой классификации)], в тимусе (интердигитальные) и циркулируют в крови. Это дру гие по гистогенетическому происхождению клетки, по край ней мере FDC не костномозгового происхождения.

На FDC экспрессированы рецепторы для иммуноглобули нов — Fc-рецепторы, отличающиеся двумя особенными свой ствами. Первое, самое необычное, заключается в том, что, связав однажды комплекс антиген — антитело через FcR, FDC способны нести его на себе продолжительное время (дни, месяцы, возможно годы). Второе свойство FcR FDC — комплекс антиген не поглощается внутрь клетки.

Именно в познавший свой антиген и вступивший еще при прохожде нии через Т-зависимую парафолликулярную зону лимфатичес кого узла (или другого периферического лимфоидного орга на) в адекватное взаимодействие с также распознавшим ан тиген Т-лимфоцитом, интенсивно На этой стадии развития В-лимфоциты называют центробластами.

В центробластах происходит уникальное даже среди лим фоцитов явление — возрастание аффинности антител в отно шении своего антигена (по английски это называют affinity maturation). В дифференцировке Т-лимфоцитов аналогичного процесса нет.

Феномен возрастания аффинности антител по мере про грессивного развития иммунного ответа — пример классичес кого дарвиновского процесса на клеточном уровне. Уникаль ной особенностью молекулярной генетики В-лимфоцитов яв ляется запрограммированность на повышенную частоту сома тических мутаций в уже перестроенных иммуногло булинов: в центробластах происходит замена одной пары нук леотидов (п.н.) на каждые п.н. на 1 митоз. Во всяком другом участке ДНК такое событие случается с вероятностью т.е. на 9 порядков реже. Получается, что каждый второй центробласт несет мутацию в V-области молекулы иммуногло булина. Чем выше оказывается сила связи иммуноглобулина в составе BcR (больше аффинность) с антигеном, присутству в фолликуле на поверхности FDC, тем больше веро ятность выживания данного В-лимфоцита, ибо на этом этапе связь с антигеном является антиапоптоз сигналом на выживание — происходит индукция эксп в результате генети ческой или эпигенетической аномалии имеет место повышен ная экспрессия антиапоптозных генов, то развивается про который называют лимфопролиферативным, т.е. возни кают опухоли из В терминальной стадии дифференцировки В-лимфоцита, в сильно развит эндоплазматический ретикулум.

Более 20 % всего белкового синтеза плазмоцита составляют секретируемые иммуноглобулины. На мембране плазмоцита иммуноглобулинов уже нет. На плазмоцитах нет и МНС-П;

в них невозможно уже переключение классов иммуноглобули нов, невозможно соматическое гипермутирование иммуногло булиновых генов. Продукция антител плазматической клеткой уже не зависит от контакта с антигеном, не зависит и от вза имодействий с Т-лимфоцитами. Первые узла, в ко тором инициирован иммунный ответ, в мозговых тяжах (medullary cords), эти клетки вырабатывают антитела для «внутреннего пользования»: данные антитела связывают анти ген в комплекс и фиксируются на фолликулярных дендрит ных клетках. По мере прогрессивного иммунного ответа про шедшие аффинное созревание В-лимфоциты превращаются в плазмоциты, которые мигрируют из лимфатического узла в костный мозг или в lamina propria эпителиальных тканей, где живут и Этим сроком и ог раничена продолжительность гуморального иммунного ответа.

Для всех описанных стадий развития В-лимфоцитов опи саны и соответствующие опухоли, сохраняющие и локализа цию, и фенотипические признаки исходной нормальной клет ки. Опухоли из лимфоцитов всегда судя по пере строенным генам иммуноглобулинов, т.е. происходят из од ной клетки. Именно на опухолях из В-лимфоцитов была изу чена молекулярная генетика иммуноглобулинов. Плазмоцито мы (син. миеломы) локализуются в костном мозге. Хотя они являются опухолями из зрелых клеток, но растут, как прави ло, агрессивно, так как микроокружение изобилует фактора ми роста.

В типичных случаях нозологический диагноз лейкоза соот ветствует той или иной нормальной субпопуляции или ста дии развития В-лимфоцитов (табл. 4.5).

В опухолевых лимфоидных клетках часто обнаруживают транслокации, при которых локусы генов иммуноглобулинов оказываются физически приближенными к генам регуляции пролиферации.

Таблица 4.5. В-клеточные лейкозы Нормальный Локализация опухоли клеточный эквивалент Хронические -лимфоциты Кровь Острый лимфобласт- Ранние лимфоидные Костный мозг и кровь ный лейкоз клетки-предшествен ники Пре-В-лейкоз Пре-В-клетки То же Фолликулярная лим- Зрелые В-лимфоциты Периферические лим фоидные органы (фол (Burkitt's) ликулы) Периферические тка В-лимфоциты ни (Waldenstrom's) Множественная Плазматические миелома клетки (могут быть иммуноглобулины разных классов) Нормальные клеточные гены, контролирующие пролифе рацию, называют Онкогенами в свое время были названы открытые гены РНК-содержащих вирусов, от ветственные за опухолевое перерождение инфицированных вирусом клеток.

Позже выяснили, что эти гены вирусы «списывают» с клеточных генов, которые и назвали протоонкогенами. Про тоонкогеном является антиапоптозный ген 4.9. Конститутивные иммуноглобулины (нормальные антитела) Если в организм модельного млекопитающего не проникает ни один патоген и ни один антиген иной природы, в крови и биологических жидкостях этого организма тем не менее будут присутствовать (и в немалом количестве) иммуногло булины. Есть они и у естественно развивающихся организмов.

Такие иммуноглобулины называют нормальными, или консти тутивно синтезируемыми. Что это за иммуноглобулины? Это аутоантитела, т.е. антитела, направленные против молекул собственного организма. Они принадлежат к G и А, у взрослых большинство — к Антитела полиреак тивны, т.е. способны связывать множество антигенов, как ауто-, так и экзогенных. В связывании антигенов этими нор мальными антителами, как показывают опыты по направлен ному мутагенезу, принимает участие область CDR3 в мене тяжелых цепей и антигенсвязывающий центр кодирует ся зародышевыми V-генами.

Как правило, эти антитела имеют низкую аффинность, но высокую авидность к Константы диссоциации для нормальных иммуноглобулинов колеблются от 105 до М.

Но, например, для нормального аутоантитела к кон станта диссоциации составляет М. Нормальные антитела обнаруживают уже в крови новорожден ных, и спектр их реактивности консервативно сохраняется во взрослой жизни. Это говорит о том, что нормальные имму ноглобулины подвержены некоему положительному отбору в онтогенезе. для нормальных идиотоды каркасные и невариабельные молекул рецепторов для антигенов;

мо лекулы CD4, и HLA-I;

Fcy-рецепторы;

лиганды для мо лекул межклеточной адгезии и др.

Есть основания полагать, что нормальные антитела выпол няют ряд весьма важных для здоровья • первая линия «обороны» против инфекций;

• удаление из организма отживших клеток и продуктов катаболизма;

представление антигенов для Т-лимфоцитов (иммуногло булины на мембране В-лимфоцитов связывают раство римые антигены в крови, лимфоцит интернализует их рецепторопосредованным эндоцитозом, и внутри клет ки образуются комплексы пептидов с молекулами глав / ного комплекса гистосовместимости, которые экспрес на мембране В-лимфоцита);

• поддержание гомеостаза аутоиммунной реактивности;

противовоспалительное действие антигенов: индукция синтеза противовоспалительных цитокинов;

аттенуация комплементзависимого повреж дения тканей и др.).

Например появляются данные о том, что в случае клини ческой манифестации некоторых патологических аутоиммун ных болезней, в патогенезе которых действуют тела, имеет место дефект регуляции этих патогенных со стороны нормальных антиидиотипических Пока зано, что в периоды ремиссии аутоиммунных васкулитов, в патогенезе которых действуют антинейтрофильные тела (ANCA), в крови в достаточных количествах появляются антиидиотипические по отношению к ANCA разными препаратов донорских объясняются «противовоспалительным» действием нормальных иммуноглобулинов.

Глава 5. Т-ЛИМФОЦИТЫ.

ГЛАВНЫЙ КОМПЛЕКС 5.1.

Сущность всякого лимфоцита, как Т, так и В, состоит в экспрессии антигенраспознающего рецептора и необходимых дополнительных сервисных молекул, чтобы факт распознавания антигена имел действенные последствия, на правленные на санацию организма от мешающих антигенов.

Эти сервисные молекулы (мембранные, а также секретируе мые цитокины) обеспечивают взаимодействие Т-лимфоцитов с другими клетками организма.

Антигенраспознающий рецептор Т-лимфоцитов обознача ют receptor). TCR кодируется генами из суперсе мейства иммуноглобулинов, т.е. родственниками генов имму ноглобулинов. Молекула TCR представляет из себя как бы молекулы иммуноглобулина — аналог одного TCR является гетеродимером — состоит из двух равновели ких полипептидных цепей. У млекопитающих известно две разновидности пар цепей в TCR. В одной паре цепи обозна чают, соответствующие Т-лимфоциты — Вторая пара цепей — у и, соответствующие Т-лимфоциты обозна чают Каждый индивидуальный Т-лимфоцит несет какой либо один вариант рецептора — либо <, либо.

В отличие от иммуноглобулинов TCR исключительно трансмембранные молекулы, т.е. Т-лимфоцит всегда работает собственным «клеточным телом».

Более того, в отличие от иммуноглобулинов не способен распознавать (связывать) растворимые антигены. Это относится по крайней мере к и подавляющему большин ству антигенов, за исключением патогенных суперантигенов.

Что же тогда распознают Т-лимфоциты? Природой Т-лим фоциты предназначены для распознавания поверхностных структур собственных клеток организма. Если что-то на повер хности своих клеток будет «раздражать» Т-лимфоцит (напри мер, примесь вирусных пептидов), то он постарается зовать уничтожение Т-лимфоцит комплекс MHC-I или МНС-И с неким пептидом, который и есть антиген в общем понимании. Один определенный участок молекулы TCR вступает в химическую связь с молекулой MHC-I/II, второй участок того же TCR в тот же момент времени всту пает в связь с пептидом-антигеном. Этот феномен называют двойным распознаванием. Он был открыт Р.Цинкернагелем (R.M.Zinkernagtel) и П.Дохерти (P.C.Doherty) более 20 лет назад, в 1996 г. они получили за это открытие Нобелевскую премию. Их первая публикация в журнале «Nature» относится к 1974 г. и занимает половину страницы. Но это открытие многие расценивают как самое великое в иммунологии за последние 100 лет. В англоязычной литературе этот феномен называют еще МНС-рестрикцией Т-лимфоцитов (МНС restricted cells).

Существенно, что присоединяется к моле кулам МНС не снаружи клетки, т.е. он не сорбируется на клетке. Пептид-антиген встраивается в комплекс с МНС при формировании конформации молекул МНС после их биосин теза в клетке и перед их экспрессией на клеточной мембране молекул. МНС не бывает на наружной мембране клеток, они просто не Выть" ны, не примут правильной конформации, если еще внутри клетки не вступят в связь с длины.

Таким образом, Т-лимфоцитов с рецептором не распознают свободные нативные антигены (еще раз подчеркнем отличие от иммуноглобулинов, которые как раз умеют работать с нативными антигенами в том виде, в каком «судьба забросила» их во внутреннюю сре ду организма или даже на слизистые оболочки). Другие клет ки должны каким-то образом пропустить антиген через себя и выставить его на своей мембране в комплексе с MHC-I/II, чтобы Т-лимфоцит «обратил на антиген свое внимание». Это и есть феномен представления антигена (или, как иногда го ворят, транслитерацией с английского — презентации анти гена) Т-лимфоциту. Какие клетки в организме способны быть антигенпредставляющими и механизмы этого процесса мы разберем в отдельном разделе, здесь лишь отметим строгую необходимость представления антигена Т-лимфоциту другими клетками.

5.2. Строение рецептора Т-лимфоцитов для антигена (TCR) Вторичная и третичная структуры рецепторов и принципиально аналогичны. Поэтому мы опишем строение рецептора Т-лимфоцитов для антигена на примере Т-лимфоциты с — это более «при вычные» Т-лимфоциты, которые стали известны на несколь ко десятков лет раньше, чем 99 % Т-лимфоцитов, про ходящих лимфопоэз в тимусе, это TCR был открыт как особая молекула на клеточной мембра не Т-лимфоцитов, с которой связываются моноклональные антитела, полученные как специфично реагирующие с инди видуальным клоном Т-лимфоцитов. С помощью таких антител «увидели», что на отдельном Т-лимфоците экспрессировано около 30 000 таких молекул. Быстро изу чили молекулярную структуру рецептора. Оказалось, что соб ственно антигенсвязывающая часть его состоит из двух рав новеликих полипептидных цепей — (мол. масса 40 000— 60 000, кислый и (мол. масса 40 000—50 000, нейтральный или основный гликопротеин). Каждая из цепей имеет по два домена во внеклеточной части, гидрофобную положительно заряженную (за счет остатков лизина и арги нина) трансмембранную часть и короткий (из 5—12 остатков аминокислот) цитоплазматический участок. Между собой цепи соединены одной дисульфидной связью выше мембраны. Каж дый из внеклеточных доменов имеет по одному сайту (месту связывания) гликозилирования и соответственно гликозили рован.

Наружные внеклеточные домены обеих цепей имеют вари абельный аминокислотный состав от рецептора к рецептору (от лимфоцита к лимфоциту), гомологичные V-области мо лекул иммуноглобулинов и названные одноименно — ластью TCR. Проксимальные домены обеих цепей гомологич ны константным областям молекул иммуноглобулинов и так же названы одноименно — С-областью TCR. Соответственно обозначены и гены, кодирующие эти области полипептидов:

V и С a, W и C.

Именно V-области а- и -цепей вступают в связь с ком плексом MHC-I/I1 — пептидом. Место контакта с пептидом в — участок CDR3, причем с центральной частью пептида вступает в связь участок контакта V — J.

Короткий цитоплазматический участок как у а-, так и физически недостаточен для обеспечения проведения сигнала внутрь клетки. Для проведения сигнала с TCR слу жат входящие в рецепторный комплекс еще 6 инвариантных (т.е. одинаковых у всех Т-лимфоцитов) полипептидных цепей:

у,, две и две. Цепи у, и две расположены по паре по бокам от и Комплекс у + + 2, как выяс нили, и составляет мембранную структуру CD3, идентифи цированную раньше по реактивности с моноклональными антителами, связывающими все без исключения Т-лимфоци ты. Цепи у, и имеют внеклеточный, трансмембранный (отрицательно заряженный за счет остатков и поэтому электростатически связанный с трансмембранными участками и и цитоплазматический участки.

В случае генетических дефектов в комплексе CD3 а- и на мембране Т-лимфоцита не появляются. Это свидетельству ет о том, что полипептиды у, и строго необходимы для формирования правильной конформации а- и -цепей и эк спрессии их на мембране.

Рис. Строение рецептора Т лимфоцитов для антигена (схема).

Рецептор состоит из 8 полипеп тидных цепей. Антигенсвязываю щая область рецептора формирует ся цепями и цепи у, е (вместе их называют комплексом CD3) необходимы для экспрес сии цепей й и, их стабилиза ции и, вероятно, проведения сиг нала внутрь клетки;

— са мая «внутриклеточная», обеспечи вает проведение сигнала внутрь клетки.

Полипептиды комплекса CD3 — у, <5 и гомологичны друг другу. Их гены локализованы рядом, все в хромосоме 11 у чело века, и, очевидно, про изошли путем дупликации от одного предкового гена.

Две соединены между собой дисульфидной связью, в мембране встро ены между трансмембран сигнала ными участками и цепей и часть по липептидной уходит в цитоплазму клетки. Там эта цепь и «задействуется» в реакциях проведения сигнала при связывании антигена V-областями и на внутриклеточные структуры и процессы.

Во всех цитоплазматических участках полипептидных цепей у,, и содержатся последовательности аминокислот — tyrosine-based activation motifs), кото рыми эти полипептиды взаимодействуют с протеин-тирозин киназами цитозоля (активация этих ферментов и составляет биохимическую суть реакций по проведению сигнала).

Схематически структура состоящего из 8 полипеп тидных цепей, представлена на рис. 5.1.

Рецептор для антигена присоединяет свои лиганды ион ными, водородными, ван-дер-ваальсовыми и гидрофобными связями. Рецептор достаточно «жив» и подвижен. При свя зывании с антигеном его конформация существенно изме няется. Как показывают исследования с применением самых современных методов с использованием трансгенных TCR мышей (у которых все Т-лимфоциты имеют единственный вариант TCR) и коллекции синтетических пептидов и кон тролируемых комплексов пептидов с растворимыми молеку лами МНС, один потенциально способен связывать до статочно много разных антигенов (если под антигенами по нимать 9-членные пептиды): по минимальным оценкам по максимальным — по наиболее точным оценкам по рядка Причем один связывает не только родствен ные по структуре антигены (их понимают как перекрестно реагирующие), но и антигены, не имеющие гомологии в структуре.

5.3. Гены и рецептора для антигена Гены и (а также у- и устроены гомо логично генам иммуноглобулинов и претерпевают соматичес кую рекомбинацию (перестройку ДНК) в процессе диффе ренцировки Т-лимфоцитов. Это и обеспечивает генерацию разнообразия свойств оцениваемо го так же, как и для иммуноглобулинов: теоретически поряд ка вариантов, реально в 1000—10 000 раз меньше соответственно числу лимфоцитов в организме.

Гены «-цепи имеют 70—80 V-сегментов и 61 J-сегмент, комбинации которых по одному из каждой области обеспе чивают дополнительное разнообразие антигенсвязывающих свойств Гены имеют 52 V-сегмента, 2 D-сегмента и 13 J-сегментов, а также 2 С-сегмента, расположенных, как показано на рис. 5.2. Между V- и J-сегментами «-цепи нахо дится локус генов -цепи второго варианта —. Ло кус состоит из 3 D-сегментов, 3 J-сегментов, 1 С-сегмента.

-Цепь TCR J L V J (61 сегмент) сегментов) -Цепь TCR !

L сегментов) (6 сегментов) (7 сегментов) 5.2. Структура генов и рецептора Т-лимфоцитов для антигена (схема).

Зародышевая конфигурация II генов -цепи ДНК Г и сплайсинг J С Трансляция белка -цепи Экспрессия на мембране -гетеродимера Трансляция белка -цепи Транскрипция и сплайсинг мРНК V ДНК Зародышевая конфигурация ДНК генов -цепи 5.3. Перестройка и экспрессия генов рецептора Т-лимфоцитов для антигена.

V-сегменты (ориентировочно их всего 4) «вкраплены» среди Рекомбинация ДНК происходит только при объединении V-, D- и J-сегментов и катализируется тем же комплексом рекомбиназ и под контролем тех же генов RAG-1 и RAG-2, которые действуют при дифференцировке Только субстрат для рекомбиназ — гены а не гены в Т-лимфоцитах — определяют тканеспецифичные промото ры. Рекомбиназы «узнают» определенные гептамерные или нонамерные последовательности, фланкирующие каждый из сегментов V, J, D и называемые recombination signal sequences — последовательностями, сигнальными для реком бинации. Перед каждым V-экзоном имеется L-экзон (leader sequence — лидерная последовательность), который обязатель но транслируется и обеспечивает правильное расположение полипептидной цепи в эндоплазматическом ретикулуме и правильную экспрессию на клеточной мембране (рис. 5.3).

После перестройки VJ в генах и в генах цепи, а также присоединения некодируемых - и Р-нуклео тидов с ДНК транслируется РНК. Объединение с том и удаление лишних неиспользуемых осуще ствляются уже на уровне РНК сплайсингом в первичном транскрипте.

Гены могут перестраиваться неоднократно при уже правильно перестроенных и экспрессированных генах Параметры разнообразия антигенсвязывающих участков Т-кле точных рецепторов приведены в табл. 5.1.

Программа для соматического гипермутагенеза в генах TCR отсутствует (в отличие от генов иммуноглобулинов).

Столь большое число — от 1018 до — потенциально возможных вариантов антигенсвязывающих рецепторов на лимфоцитах является попыткой медленно размножающихся и медленно эволюционирующих видов многоклеточных организ мов «угнаться» за изменчивостью сверхбыстро размножающих ся и эволюционирующих инфекционных микроорганизмов.

Природа сделала такой шаг — наделила суперизменчивостью в процессе онтогенеза в рамках одного тела единственный гистотип клеток (только лимфоциты) и единственную кате горию молекул в этих клетках (антигенраспознающие рецеп 5.1. Параметры разнообразия антигенсвязывающих облас тей TCR Число вариантов Генетический элемент Зародышевое число Зародышевое число Транскрипция D-сегментов по 3 рамкам считывания Зародышевое число J-сегментов Присоединение - и Р-нуклеотидов торы — TCR, Лимфоцитарный иммунитет есть у очень небольшого числа видов земных многоклеточных животных, напомним — всего у 1,4 %. Следовательно, 98,6 % видов мно гоклеточных не имеют лимфоцитарной иммунной системы.

Лимфоцитарный иммунитет понадобился для спасения от инфекций особей таких видов животных, которые оставляют единичное потомство — рожают редко и мало детенышей, значит, если не каждому, то большинству надо выжить, что бы сохранился вид. Лимфоциты со своими рецепторами по явились 300 млн лет назад, вероятно, у челюстных рыб (jawed fish).

5.4. молекулы Т-лимфоцитов — CD4 и CD Как уже отмечали, распознает антиген-пептид толь ко в связи с молекулами MHC-I или II. Каждый конкретный Т-лимфоцит предназначен для работы с молекулами либо I класса, либо II класса МНС. Собственно в связь с МНС (ион ными, ван-дер-ваальсовыми, водородными и гидрофобными связями) вступают вариабельные участки полипептидных це пей и. Но со стороны Т-лимфоцита есть еще одна из двух (у индивидуального лимфоцита какая-то одна) мембранных молекул, вступающих в связь с молекулами МНС на антиген представляющих клетках или клетках-мишенях для Т-лимфоци тов — это молекулы CD4 и Молекула CD4 имеет хими ческое сродство и вступает в связь с инвариантной частью молекулы МНС-П молекула CD8 — с инвари антной частью молекулы MHC-I Поэтому моле кулы CD4 и CD8 Т моделирующих отсутствие на клетке этих молекул, требуется минимум в 100 раз большие дозы антигена, Т-лимфоцит.

представляет собой одну полипептидную цепь с молекулярной массой 55 000. Она имеет 4 домена во внеклеточной части и по первичной структуре принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов. Цитоплазматический уча сток молекулы CD4 связан с тирозинкиназой Lck и, вероят но, вносит свой вклад в проведение сигнала внутрь клетки при состоявшемся взаимодействии рецептора с лигандом.

В процессе активации Т-лимфоцита одну молекулу TCR «об служивают» две молекулы CD4 (происходит димеризация мо лекул CD4) (рис. 5.4). Молекула CD8 представляет собой гете родимер из двух цепей, традиционно обозначаемых и.

В некоторых случаях на клетке обнаруживают гомодимер из двух Такой гомодимер также имеет свойство взаи модействовать с молекулами MHC-I. Во внеклеточной части каждая из а- и имеют по одному иммуноглобулин подобному домену. Между собой цепи соединены дисульфид Рис, Структура молекул — CD4 и CD (схема).

Молекула CD4 представляет собой одну полипептидную цепь и имеет 4 вне клеточных домена. При вовлечении в функциональный процесс CD4, вероятно, димеризуется. Молекула CD8 — гетеродимер из и ной связью. участки цепей также связаны с тирозинкиназой Lck (см. рис. 5.4).

Почти все лимфоциты — 99 %, дифференцирующиеся на территории тимуса в жизни, это Т-лимфоци ты с и менее 1 % — Т-лимфоциты с В пери ферических тканях содержание больше чем 1 % и состав ляет, возможно, 10—50 % всех Т-лимфоцитов тела. Но диф ференцируются большинство не в тимусе, а в слизистых оболочках, в первую очередь желудочно-кишечного тракта.

Мы вернемся к немногим известным фактам их дифферен цировки ниже.

5.5. Т-лимфоцитов в тимусе.

Позитивная и негативная селекция тимоцитов Процессы происходящие в тимусе, описа ны достаточно подробно и представляются как следующая последовательность событий (см. также раздел 2.2).

Тимоциты дифференцируются из общей стволовой крове творной клетки. На клетках-предшественниках Т-лимфоци тов еще вне тимуса у человека обнаружены такие мемб ранные маркеры, как CD7, CD2, CD34 и цитоплазмати ческая форма CD3. [У мышей HSA (heat-stable antigen), H-2, (Ly-6 A/E), немного CD4.] к дифференцировке в Т-лимфоцит клетка-предшественник мигрирует из костного мозга через стенку больших венул в кортико-медуллярной области и оттуда перемещается в субкапсулярную зону коры тимуса. Здесь происходит медленная пролиферация клеток — примерно в течение 1 нед. Характерной осо бенностью клеток-предшественников явля ется сохранение в них экспрессии уникального фермента стволовой кроветворной клетки — теломеразы, репари рующей хромосомы. Это указывает на то, что лимфо циту на его жизненном пути предстоит еще не раз пройти циклы пролиферации. Клетки-предшественники, коммитированные к дифференцировке в другие ростки кроветворения, утрачивают экспрессию теломеразы не обратимо. Из этих клеток будут развиваться (боль шинство), и дендритные клетки тимуса. На тимо цитах, самыми ранними известными маркерами которых являются молекулы CD2 и CD7, в этот период эксп рессированы еще такие мембранные молекулы, как CD44 и CD25.

Затем на клетках исчезают молекулы CD44 и CD25, клетки физически перемещаются несколько в глубь коры тимуса. В них начинаются перестройка генов цепи TCR и экспрессия полипептидного комплекса CD3.

Экспрессируется инвариантная суррогатная полипептид ная цепь, называемая ( — от partner, мол. масса 33 kD), которая заменяет собой настоящую и позволяет перестроенной в комплексе с CD оказаться экспрессированной на наружной клеточной мембране. Это, как мы увидим дальше, существенный момент. На данной стадии деградирует белок RAG-2 и ингибируется транскрипция с генов RAG-1 и RAG-2.

Клетки активно пролиферируют и микроскопически выглядят как бласты. При этом накапливается масса клеток с уже известной -цепью, но с еще неперест роенными генами -цепи, что внесет свой вклад в бу дущее разнообразие В это же время экспрессируются совместно молекулы и (по этой причине тимоциты на этой стадии развития называют дважды позитивными — double-positive — На следующем этапе клетки перестают делиться, син тезируют RAG-1 и RAG-2 и перестраивают причем несколько раз в течение 3—4 сут. Каждый вари ант TCR с разной клетка экспрессирует и «пробуется» на связывание с комплексами пептид — экспрессированными на мембранах эпителиаль ных клеток тимуса. Обратим внимание на то, что пеп тиды в данном случае свои, т.е. являются продуктами катаболизма собственных белков антигенпредставляющих клеток. которые свяжут какой-либо из ком плексов пептид — МНС с правильной (т.е. средней по силе) аффинностью, получают сигнал на выживание и продолжат дифференцировку. Тимоциты, которые не свяжут никакой из доступных комплексов пептид — МНС, не получат сигнала на выживание, и в них бу дет инициирована программа на апоптоз, они погибнут.

Это и называют позитивной селекцией тимоцитов. В ре зультате позитивной селекции в тимусе погибает 95— 99 % тимоцитов.

Если какой-то связывает какой-то комплекс «пеп тид — МНС» со слишком высокой аффинностью, то тимоцит также может погибнуть. Это называют негативной селекцией тимоцитов. В количественном отношении негативная селекция элиминирует существенно меньше тимоцитов, чем позитив ная — от 10 до 70 % клеток, которые прошли позитивную селекцию.

Неоднократная перестройка и экспрессия генов «-цепи при одной и той же в одном тимоците оставляет шанс на то, что одна клетка может нести более одного ва рианта По крайней мере на моделях мышей, ных по генам - и закономерно обнаруживают вто рой вариант рецептора на с эндогенной цепью. (Обратим на это внимание затем, чтобы вспомнить в разделе об аутоиммунных патологических процессах.) На короткое время с мембраны тимоцитов исчезают обе молекулы корецепторов и (double-dull), затем экс прессируется одна из этих молекул: на тимоцитах, ко торых имеет сродство к молекулам экспрессируется корецептор и на периферии эти Т-лимфоциты на всю свою жизнь будут иметь «паспортную» характеристику или На тимоцитах, которых имеет сродство к МНС II, экспрессируется корецептор и на периферии такие Т-лимфоциты будут или Т4.

Анатомически процессы селекции проходят ближе к гра нице коркового и мозгового слоев тимуса при взаимодействии развивающихся тимоцитов эпителиальными клетками стро мы тимуса и с дендритными клетками костномозгового про исхождения. Напомним, что на клетках эпителия тимуса экс прессированы молекулы адгезии LFA-3 и а на ти моцитах — комплементарные им молекулы адгезии соответ ственно и LFA-1. Эти адгезивные взаимодействия удер живают тимоциты на территории тимуса на необходимый период времени. На эпителиальных и дендритных клетках Этапы дифференцировки в тимусе Таблица 5.2.

Анатомическая Мембранный фенотип Основные процессы, и зона в тимусе происходящие с клеточное окружение Кора перифе- CD3-/CD4-/CD8- Интенсивная рической пролиферация клетки коры (митозы) дважды негативных клеток предшественников Экспрессия -цепи рецептора и сурро Эпителиальные клетки коры;

гатной а дендритные клетки также проводящего сигнал-комплекса CD3. Пролиферация Глубокие слои Дважды позитивные коры и Эпителиальные клетки;

с дендритные клетки;

рессированной макрофаги и суррогат ной <х -цепью ре цептора Граница корко- TCR Дважды позитивные вого и тимоциты с полно го вещества клетки;

ценным дендритные /слетки;

тором. Позитивная макрофаги и негативная селек ция Мозговое Однопозитивные вещество (либо либо зрелые Эпителиальные клетки неиммунные мозговой зоны Т-лимфоциты мозговой зоны и на внешних структурах телец Гассаля (телец вилочковой железы — по новой классификации) экспресси рована в большом количестве мембранная молекула CD30L На тимоцитах же, активированных аутоанти генами, экспрессируется молекула CD30. Полагают, что имен но взаимодействие CD30L — CD30 между стромой и тимо цитами, имеющими на мембране набор молекул обеспечивает сигнал на апоптоз для тимоцитов и это и есть негативная селекция реактивных клонов тимоцитов.

В кратком виде этапы дифференцировки Т-лимфоцитов в тимусе приведены в табл. 5.2.

Дифференцировка Т-лимфоцитов в тимусе продолжается около 3 нед.

Рассмотрим некоторые подробности дифференцировки Т-лим фоцитов в тимусе.

и Ту<5 происходят из общей клетки-предшественни цы. В развивающемся тимоците практически одновременно начинается перестройка генов -, у- и Если обе у и успеют перестроиться «in-frame» (т.е. получится та кая ДНК, с которой возможна транскрипция РНК), то лим фоцит будет Но если первой успеет перестроиться и экспрессироваться на мембране в паре с то это ста новится сигналом к запрету на продолжение перестройки ге нов у и 5, а также сигналом к пролиферации клетки, эксп рессии корецепторных молекул CD4 и CD8 и чуть позже к перестройке генов и экспрессии При перестройке генов происходит необратимая делеция -локуса, который расположен внутри генов Непродуктивная с первой попытки перестройка генов не означает, что тимоцит обречен на гибель. Структура генов (см. рис.

5.2) позволяет предпринять еще одну попытку и кпд продук тивности перестройки генов превышает 80 %.

Вероятный лиганд для комплекса — на мембране тимоцитов — молекула CD81, экспрессированная на эпите лиальных клетках стромы тимуса.

Перестройка генов происходит неоднократно, пока не получится продуктивный вариант, причем без аллельного исключения (т.е. параллельно на обеих гомологичных хромо сомах). До этапа позитивной селекции на тимоцитах могут быть экспрессированы два варианта TCR с одинаковыми -, но разными Позитивная селекция оставит един ственный вариант рецептора, но иногда может быть и не единственный.

Позитивная селекция на удовлетворительное связывание с комплексами своих пептидов со своими молекулами МНС происходит на стадии развития тимоцитов с низкой плотно стью экспрессии TCR и совместной экспрессией корецепто ров CD4 и CD8. Клетки — партнеры тимоцитов в данном процессе, клетки — носители молекул МНС — это эпители альные клетки стромы коры тимуса. Напомним, что эпители альные клетки тимуса продуцируют такие цитокины, как IL 1, 3, 6 и 7, (leukocyte inhibitory factor), GM-CSF. Они же, эпителиальные клетки тимуса, являются продуцентами внутритимического стероидного гормона, а именно прегнено лона, участие которого необходимо в регуляции экспрессии генов в дифференцирующихся тимоцитах, в том числе в ин дукции апоптоза тимоцитов при позитивной и негативной селекции. (В эксперименте, ввести фармакологи ческие дозы глюкокортикоидных то за несколько часов произойдет «глюкокортикоидная тимэктомия» — более 99 % тимоцитов погибнет апоптозом, останется небольшая «пленочка», содержащая немного стероидрезистен тных Т-лимфоцитов.) В качестве примера экспериментов, ставших источником этих знаний, приведем опыты с мышами — радиационными костномозговыми химерами. Если летально облученным реци пиентам одной из родительских линий, например гаплотипа трансплантировать клетки костного мозга интактных доноров-гибридов то дифференцированные в тиму се реципиента будут способны распоз навать антиген только в комплексе с молекулами но не Забегая немного вперед, скажем, что профессиональные клетки — это клетки костномозгово го происхождения, а именно дендритные клетки, В-лимфо циты и моноциты/макрофаги. Это поможет понять результа ты следующего опыта. Если летально облученным мышам-ре ципиентам гаплотипа трансплантировать костный мозг от доноров гаплотипа то дифференцирующиеся в организме (в тимусе) реципиента Т-лимфоциты оказываются неспособными развивать иммунный ответ в периферической лимфоидной ткани. В тимусе их «отобрали» на распознавание а представляют антиген им в организме антиген-пред ставляющие клетки генотипа т.е. «своего родного» для Т-лимфоцитов, но они его «не приучены» распознавать: им вообще распознают не «свое» и «чужое». Что будут, а что не будут распознавать антигенраспознающие ре цепторы лимфоцитов, определяется закономерностями дина мики морфогенеза, складывающимися в конкретной ситуации процесса развития, а даже и неимманентной генетической программой как таковой.

Описанный выше эксперимент показывает, почему при трансплантации костного мозга у людей с лечебной целью необходимо совпадение по МНС: столько для избежания отторжения трансплантата реципиентом," для обеспе чения возможности дифференцировки иммунокомпетентных Т-лимфоцитов из стволовых клеток костного мозга донора в тимусе реципиента.

У мышей, трансгенных по перестроенному гену TCR, рас познающему пептид в комплексе с MHC-I, все Т-лимфоци ты будут нести только этот трансгенный рецептор и все Т лимфоциты в организме будут только Если трансген ный TCR предназначен для антигена в комплексе с МНС II, то все Т-лимфоциты в организме такой мыши будут толь ко Та же закономерная зависимость распознавательной ориен тировки TCR либо на MHC-I, либо на МНС-П и экспрессии на зрелом лимфоците соответственно или CD8, или CD4 про является у людей с наследственным иммунодефицитным син дромом «голых лимфоцитов» (bare lymphocyte syndrome). Есть варианты этого синдрома, когда генетический дефект прояв ляется в отсутствие экспрессии на эпителиальных клетках ти муса и на лимфоцитах молекул MHC-I. У таких пациентов не обнаруживают Т-лимфоцитов. При вариантах синдрома с отсутствием экспрессии на клетках МНС-П у больных в пери ферических лимфовдных органах нет Т-лимфоцитов Корреляция экспрессии TCR с молекулами CD8 и CD4 в описанном варианте сильная, но не абсолютная. Как мы уви дим дальше, в организме есть и иные субпопуляции Т-лим фоцитов, например (мо лекула CD8 состоит из двух одинаковых «-цепей, т.е. гомо димер, а не из одной и одной как в «классическом» варианте молекулы CD8). Кстати, ты именно с таким фенотипом мембраны являются преобла дающей субпопуляцией среди внутриэпителиальных лимфоци тов слизистой оболочки ЖКТ. Не зависит от CD4 и CD8 и экспрессия Т-лимфоциты, экспрессирующие CD4, и Т-лимфоциты, экспрессирующие CD8, предназначены для выполнения раз ных функций в предстоящих иммунных ответах. Но во всех случаях независимости TCR от CD4 или CD8 лимфоциты с такими TCR распознают антиген независимо от MHC-I/II.

Правда, это не означает (по крайней мере не всегда очевид но) независимость распознавания антигена от других моле кул, способных представлять антиген, но не являющихся ни MHC-I, ни МНС-П. Примером таких антигенпредставляющих молекул является Если молекулы MHC-I и II «работа ют» (т.е. формируют комплексы) исключительно с пептидны ми антигенами, то «неклассические молекулы МНС» (иногда их так дважды некорректно называют в литературе вместо того, чтобы сказать, что это не MHC-I/II) специализируют ся на комплексообразовании с антигенами другой химичес кой природы — небелковой (углеводными, фос фатсодержащими). С молекулами кластера взаимодейству ют особые субпопуляции зрелых Т-лимфоцитов, а именно «дважды негативные» и особая суб популяция Процессы негативной селекции тимоцитов идут при взаи модействии их с профессиональными антигенпредставляющи ми клетками — дендритными и макрофагами, что иллюстри руют эксперименты с костномозговыми радиационными хи мерами мышей. Если реципиентов любой из родительских линий или летально облучить и транспланти ровать им костный мозг от гибридов то в тимусе таких мышей будут развиваться Т-лимфоциты, не кожный лоскут ни от донора ни от донора т.е. развивается толерантность к антигенам как реци пиента, так и донора, которые в тимусе могут быть представ лены только на тимоцитах, дендритных клетках и макрофа гах. При некоторых комбинациях линий мышей в таких экс периментах кожный трансплантат, однако, отторгается. Это объясняют тем, что для отторжения ткани существенны и неглавные антигены гистосовместимости (minor histocompatibi lity antigens), которые в данном случае присутствуют в ткани донорской кожи, но не присутствуют на донорских антиген представляющих клетках в тимусе и на уровне дифференци ровки лимфоцитов в тимусе толерантность к ним не возни кает. Неглавные антигены гистосовместимости при отторже нии трансплантатов у людей иногда имеют большее значение, чем антигены главного комплекса гистосовместимости, что будет проиллюстрировано в соответствующем разделе.

Созревшие в тимусе Т-лимфоциты мигрируют в Т-зоны периферических лимфоидных органов. В разделе 2.2 уже отме чалось, что путей выхода тимоцитов из тимуса на основании гистологических наблюдений можно предполагать 3: а) сво бодный — через эфферентный лимфатический сосуд в кор тико-медуллярной зоне;

б) путем экстравазации через стенку посткапиллярных венул с высоким эндотелием там же в кор тико-медуллярной зоне;

в) путем экстравазации через стенку капилляров в русле транскапсулярных артерий.

Во введении мы сформулировали, что базовым свойством лимфоцитов является самораспознавание. Теперь это можно понять несколько лучше: дифференцировка и отбор антиген распознающих рецепторов Т-лимфоцитов в тимусе идут при взаимодействии (комплементарном связывании) исключитель но с эндогенными, т.е. со своими молекулами МНС в комп лексе со своими, но разнообразными пептидами. Приведем со впадающее с нашим мнение авторитетного экспериментатора и теоретика Ч.Джейнвэя (Charles A.Janeway) и его коллег.

Опыты на мышах, трансгенных по гену TCR, а так же с knock-out по определенному гену МНС в раз ных аранжировках привели этих авторов к заключению (ги потезе, но обоснованной), что не только в тимусе в процес се лимфопоэза идет отбор Т-лимфоцитов на способность пра вильно связывать своим TCR комплексы «свои пептиды — МНС», но и на жизнеспособность Т-лимфоцитов в течение длительного времени поддерживается сигналами на выживание от тех же комплексов «свои пептиды — МНС», экспрессированными на дендритных клетках в Т-зависимых зонах периферических лимфоидных органов. В отсутствие та кого сигнала Т-лимфоцит быстро погибает. Более того, такой свой сигнал поддерживает некий «базальный» уровень проли ферации жизнеспособных Т-лимфоцитов на периферии в те чение всей жизни организма. Но эта пролиферация отличает ся от экспансии клона лимфоцитов в процессе развития ак тивного продуктивного иммунного ответа на антиген, подле жащий элиминации из организма. Пролиферация по сигналу от своего в норме не сопряжена с синтезами и секрецией активных цитокинов Т-лимфоцитов и индукцией иммунного воспаления. Таким образом можно объяснить и ально существующее явление, что после 15-летнего возраста, когда Т-лимфопоэз в тимусе существенно угасает, тем не менее в течение всей взрослой жизни в организме Причем достаточно постоянное (не снижающееся прогре диентно с возрастом) количество яериферических фоцитов.

Репертуар распознающих рецепторов периферических Т-лимфоцитов зависит от МНС организма. Исходная биоло гическая комплементарность рецепторов Т-лимфоцитов рас считана именно на молекулы МНС всех клеток собственного организма.

В функциональном отношении зрелые неиммунные лимфоциты, выходящие из тимуса, представлены двумя ос новными субпопуляциями: одна из них на мембране молекулу CD8, вторая — CD4. Т-лимфоциты дифферен цированы для выполнения функций цитотоксических Т-лим фоцитов ЦТЛ сами непосредственно, своим «клеточ ным телом», убивают клетки (поэтому «Ц»— от цито-), на мембране которых они распознали антиген. Т-лимфоци ты дифференцированы в продуцентов цитокинов — секрети руемых из клетки биологически активных молекул, предназ наченных для взаимодействия и вовлечения в процесс других клеток-партнеров по иммунному ответу. Т-лимфоциты около 30 лет назад назвали лимфоцитами-хелперами (helper — помощник), поскольку эксперименты свидетельствовали, что В-лимфоциты не способны продуцировать антитела без помо щи Т-лимфоцитов, хотя сами Т-лимфоциты не синтезируют иммуноглобулины, но В-лимфоциты без участия их тоже не синтезируют либо совсем, либо синтезируют иммуногло булины только класса М. За Т-лимфоцитами закрепи лась аббревиатура Th (от Дихотомию дифференцировки Т-лимфоцитов в про цессе развития иммунного ответа с возникновением либо ТЫ, либо Th2 называют иммунным отклонением (immune deviation) — отклонение иммунного ответа в сторону той или иной субпопуляции —ТЫ или ТЫ. В генетически здоровом орга низме отклонение иммунного ответа в сторону или Th зависит от внешних факторов: в первую очередь химических качеств антигена, его дозы, пути попадания во внутреннюю среду, сопутствующих факторов типа адъювантов или инфек ций, кратности и т.д. Подробно свойства и функционирование Th2, и других субпопуляций Т лимфоцитов описаны в главе 8.

Хотя опухоли — образования патологические, но они по зволяют составить представление о нормальных субпопуляци ях клеток той или иной ткани. В клинике известны нозологи ческие единицы опухолей из клеток тимуса (табл. 5.3).

5.3. Опухоли тимуса: из и ляющих клеток Болезнь Тип клеток Маркеры на Локализация мембране Острый Ранний CD10 Тимус, кровь, CD лимфобластный предшественник CD лейкоз лимфоцитов Эпителиальные Цитокератины Тимус клетки стромы тимуса Острый CD1 Тимус, кровь лимфобластный Т-лейкоз Синдром Сезари* Та или иная Периферичес (Sezary);

Т-лейкоз субпопуляция CD4 или CD8 кие лимфоид взрослых зрелых Т-лим- ные органы, (HTL V-1);

фоцитов*** кровь Mycosis fungoides;

Хронический Т-лейкоз Болезнь Антиген- CD30 Периферичес Ходжкина** кие ткани (Hodgkin's) клетки *Синдром Сезари называют еще эксфолиативным дерматитом. Он характе ризуется сильным зудом, инфильтрацией кожи атипичными мононуклеар клетками, алопецией, отеком, измененной пигментацией кожи, из менениями ногтей.

**Болезнь Ходжкина разнообразна по клиническим формам. В основе пато генеза — опухолевая трансформация клеток, веро ятнее всего, моноцитов. Но опухолевые антигенпредставляющие клетки сти мулируют пролиферацию Т-лимфоцитов, и их количество может существен но превосходить нормальные показатели в крови и в тканях. Поэтому бо лезнь называют Ходжкина. В некоторых случаях лимфопролифера ция отсутствует. ретикулярные стромальные клетки, и кли нически эту форму идентифицируют как узелковый склероз — nodular sclerosis. Прогноз более благоприятен при лимфоме Ходжкина, чем при узел ковом склерозе.

***Клональность лимфомы диагностируют анализом генов TCR в опухоле вых клетках. Если планируют костного мозга после ра дио- или химиотерапии, то методом цепной полимеразной реакции важно показать отсутствие генов TCR опухолевого клона в ткани костного мозга.

Главный комплекс «Главный комплекс гистосовместимости» (Major histocompa tibility complex — — одно из трудных понятий для на чинающих изучать иммунологию. Главная причина этого — оторванность названия от природного предназначения. Эта оторванность объясняется историей развития наших знаний о Так сложилось, что сначала МНС был выявлен в сугубо искусственной модели трансплантации тканей и ор ганов одного организма во внутреннюю среду другого как некий значительный по размеру комплекс генов, от кото рых больше, чем от других, зависит скорость отторжения трансплантата. Но поскольку в естественной природе нет процессов трансплантации тканей отдельных особей во внут реннюю среду других особей, много лет имело место мол чаливое недоумение — зачем нужны эти гены и продукты, которые они кодируют, организмам, которым не пересажи вают и никогда не будут пересаживать чужие органы? Это недоумение разрешили Р.Цинкернагель и П.Дохерти, от крывшие в гг. природные функции белков МНС — представлять для распознавания пептидные антиге ны для Т-лимфоцитов.

Гены МНС были открыты и был введен этот термин в работах 40-х годов в лаборатории, а затем институте Георга Снелла (George — знаменитого иммуногенетика. Ранее антигены, от которых в наибольшей степени зависит оттор жение трансплантатов у мышей, описал Gorer. Иммуногене тики затратили много труда на выведение инбредных линий мышей и описали основные законы трансплантации. Главный закон трансплантации, состоящий в том, что природа не рассчитана на смешение органов уже рожденных особей и пересаженные органы от другого организма в норме всегда отторгаются, люди знали, судя по всему, всегда, сколько су ществует человеческая культура. Давно знали, что пересадки тканей своего организма в пределах своего организма возмож ны: пластические операции с аутотрансплантацией описыва ли средневековые хирурги.

Применительно к генетическим отношениям доноров и реципиентов используют следующие термины:

— свой собственный;

• (или изогенный) — полностью генети чески идентичный организм (трансплантат). Сингенны мыши одного пола одной инбредной линии. Сингенны однояйцевые близнецы;

• — другой организм в пределах одного вида. Аллогенны мыши разных инбредных линий;

• конгенный — организм, отличающийся от другого одним (в идеале) геном при одинаковости всех других;

• — организм другого биологического вида.

Из экспериментов по иммуногенетике пересадки органов и тканей следуют 5 законов трансплантации.

и ксеногенные трансплантаты всегда оттор гаются.

Аутологичные и сингенные трансплантаты приживают ся.

Гибриды 1-го поколения — F1 не отторгают трансплантаты обеих родительских линий P2), но каждая из родительских линий отторгает трансплантат от гибрида (это свидетельствует о кодоминантности в гиб ридах экспрессии генов, кодирующих продукты, кото рые являются мишенью отторжения). Кодоминантность означает, что экспрессируются аллели обеих гомологич ных хромосом (т.е. от каждого из родителей):

АА х ВВ i АВ 50 % потомства от обратного скрещивания (F1 х быстро отторгают трансплантат от второй линии (в случае трансплантации кожного лоскута быс трое отторжение наступает на 8-е сутки). Отсюда по законам менделевской генетики следует, что быстрое от торжение контролирует один Его-то Г.Снелл и назвал Major histocompatibility complex АВ х I АА. АА. АВ, АВ Пятый закон трансплантации открыл в 1922 г. H.Woglom.

Он наблюдал, что если данному реципиенту, один раз отторгшему трансплантат, пересадить повторно транс плантат от того же донора, то во второй раз одноимен ный трансплантат отторгнется достоверно быстрее. Это свидетельствовало об иммунных механизмах отторжения, поскольку феномен иммунологической памяти из биоло гических подсознательных процессов специфичен имен но для иммунитета, а не других физиологических реак ций.

У мышей локус сегрегируется вместе с геном, коди рующим некий антиген, выявляемый антителами на эритро цитах мышей. Этот антиген в то время называли Локус, контролирующий гистосовместимость, обозначили Н- (Н — от histocompatibility). Верхний буквенный индекс при Н- и т.д.) означает гаплотип данного локуса.

У различных инбредных линий гаплотип Н-2 может быть раз ным или одинаковым.

Локус МНС весьма значителен по размеру — порядка 4хЮ6 пар нуклеотидов (это 2—3 сентиморгана), что соизме римо с целым геномом бактерии Escherichia Такое коли чество ДНК у человека содержит около 100 генов. Далеко не все из этих генов и их продуктов описаны и идентифициро ваны. У мышей выявлены 3 независимых локуса в комплексе МНС — Н-2К, H-2D и H-2L. Позже между ними картирова ли локусы I-A и (I — от immune responce genes). В 60-х годах B.Benacerraf,. McDevitt и др. в опытах на морских свинках установили, что интенсивность продукции антител к белковым антигенам контролируется генами из комплекса МНС. Аналогичное явление ясно обнаруживалось и в опытах на мышах разных инбредных линий.

Гомологичный комплекс локусов у человека идентифици ровали уже другие исследователи и др.) и не в экспериментах по трансплантации, а в исследованиях реак тивности антител из крови людей, перенесших транспланта ции, или многорожавших женщин с лейкоцитами из крови других людей. Поэтому комплекс обозначен (от Human leukocyte antigen). Первые 3 антигена, выявленные в этих се рологических реакциях (и соответствующие гены), обозначи ли HLA-A, HLA-B, Следующий локус обнаружили не серологически, а по индукции пролиферации в смешанной культуре лимфоцитов донора и реципиента;

его обозначили HLA-D. Следующий идентифицированный серологически ло кус был близкосцеплен с его обозначили HLA-DR (от Следующие два локуса обозначили соседними с R буквами и Q — HLA-DP и HLA-DQ.

Позже, когда выяснили, какие белковые продукты коди руют разные структурные гены из комплекса МНС, комплекс разбили на два класса — I и II — MHC-I, МНС-П. К I классу у человека отнесли локусы HLA-A, и HLA-C, у мыши — Н-2К, H-2D и H-2L, ко II классу — соответствен но HLA-DR, и HLA-DQ у человека, - и у мыши. Схема расположения в геноме локусов комплекса МНС человека и мыши показана на рис. 5.5 и 5.6.

Продукты генов локусов MHC-I — мембранные белки, конститутивно экспрессированные на всех ядросодержащих клетках тела, но в разных количествах на клетках различных гистотипов: больше всего этих молекул на лимфоцитах и лей коцитах. МНС-П — тоже мембранные молекулы, но экспрес сированы не на всех, а только на некоторых гистотипах кле ток — на дендритных клетках, В-лимфоцитах, моноцитах/ макрофагах, эндотелии сосудов. Первые 3 типа клеток отно сят к так называемым профессиональным 5.5. Расположение генов МНС человека в хромосоме щим клеткам — это дендритные клетки, и мак рофаги, поскольку на этих клетках, кроме молекул и I, экспрессируются все необходимые корецепторные моле кулы и цитокины, достаточные для активации Т-лимфоцита к иммунному ответу (табл. 5.4).

Каждый локус MHC-I кодирует полипептидную цепь, обо значаемую традиционно а, с молекулярной массой около 44 000, примерно из 325 остатков аминокислот. Цепь имеет 3 внеклеточных домена трансмембранный уча сток и цитоплазматический участок из 55 аминокислотных остатков. С внеклеточными нековалентно ассоци ирована легкая полипептидная цепь с мол. массой 12 000, на зываемая Микроглобулин 2 кодирует ся геном, не сцепленным с МНС. Домены и форми руют углубление размером около 2,5 нм. Именно в этом уг лублении (cleft) располагается пептид-антиген, предназначен ный для распознавания Т-лимфоцитом. Пептид ни в коем случае не сорбируется на МНС извне клетки, а конъюгирует ся с нековалентными связями, но с достаточной аффинностью (К. ) внутри клетки при формирова II класс I класс I класс к 5.6. Расположение генов главного комплекса гистосовместимости мыши (Н-2) в хромосоме 17 (схема).

5- 5.4. Относительные уровни экспрессии и II на раз ных клетках Клетки MHC-I МНС-П +++ Т-Лимфоциты + (у человека, не у мыши) В-лимфоциты +++ +++ Дендритные клетки +++ +++ Макрофаги +++ ++ + Эпителиальные +++ клетки тимуса + Эндотелий + +++ Нейтрофилы Нет + Нет + Клетки почки Нет + Нейроны мозга Нет Эритроциты Нет Нет Количественная выраженность того или иного свойства представлена в условных знаках: «+» — немного;

«++» — больше, чем «+»;

«+++» — больше, чем «++».

нии (фолдинге) МНС. Как и все трансмемб ранные белки, MHC-I гликозилированы;

места гликозилиро вания — 86, 176, Asn 256.

MHC-I связывает пептиды длиной 8—10 аминокислотных остатков, фиксируя пептид по обоим концам молекулы — С и N. Молекулы МНС разных вариантов связывают пептиды с определенными остатками аминокислот в так назы ваемых якорных позициях: это С-концевой остаток, 2-й или 5-й с N-конца. Важно, что каждый конкретный аллельный вариант молекулы МНС связывает пептиды с данными, а не другими якорными остатками аминокислот. Другой аллельный вариант МНС имеет химическое сродство к иным якорным остаткам аминокислот. Поэтому важно посчитать, сколько же вариантов МНС имеет каждый отдельный человек, так как только на те пептиды, которые способны связать МНС особи, данная особь потенциально способна развить защитный иммун ный ответ. Если же некий антиген не связывается ни с од ним вариантом МНС из тех, которыми располагает особь, то против этого антигена не будет иммунного ответа, организм беззащитен перед таким антигеном. Отсюда понятно, что ге нетический контроль иммунного ответа сильно зависит не только от генов, специально экспрессирующихся в лимфоци тах и антигенпредставляющих клетках, но и от генов, эксп рессирующихся во всех клетках организма, — МНС. Исклю чение составляют безъядерные зрелые эритроциты: на них нет ни MHC-I, ни МНС-П.

Белки МНС-П (II класса) представляют собой мембран - y < MHC-II 5.7. Структура молекул MHC-I и II (схема).

Молекулы MHC-I — трансмембранные гетеродимеры:

-цепь большая, имеет три внеклеточных домена. «Клефт» для связывания пептида формируют два терминальных домена «-цепи и размера, не с ассоциирована ее называют микроглобулином. Молекулы также трансмембранные гетеродимеры.

Полипептидные а- и равновелики, обе пенетрируют мембрану, у обе их по два внеклеточных домена и «клефт» для связывания пептидов формируют внешние домены обеих цепей. 1 — пептид-антиген в комплексе с молекулами MHC-I;

2 — пептид-антиген в комплексе с молекулами МНС-П.

ные молекулы — гетеродимеры из двух трансмембранных гли копротеинов: (мол. масса 34 000) и (мол. мас са 29 000). Внеклеточная часть каждой цепи имеет два домена.

Пептидсвязывающий клефт (cleft) формируют совместно и \-домены и в отличие от «клефта» MHC-I «клефт» MHC II открыт с обеих сторон (рис. 5.7). Стереохимическая откры тость «клефта» МНС-П позволяет связывать более длинные пептиды, чем в случае MHC-I, — до 30 остатков аминокис лот. Однако чаще всего из комплексов с удается диссоциировать пептиды размером 13—17 остатков аминокис лот. Якорные остатки для большинства изученных аллельных вариантов находятся в позициях 1;

4;

6 и 9.

5.7. Механизмы образования комплексов пептидов-антигенов с молекулами главного комплекса В любой эукариотической клетке есть две «зоны», или, как их принято называть от английского, компатменты. Одна зона связана с внешней внеклеточной средой и это зона мембран ных структур и везикул, включающая в себя аппарат Гольд жи, эндоплазматический ретикулум, лизосомы, эндосомы и фагосомы. Пептиды, образующиеся в данной зоне, обслужи синтезируемые клеткой молекулы МНС-П. Происхожде ние пептидов везикул внеклеточное: они образуются в резуль тате протеолиза белков, захваченных клеткой посредством эн доцитоза или фагоцитоза. Эндосомы, или фаголизосомы, сли ваются с мембранными структурами, на которых фиксируют ся вновь синтезированные на полирибосомах молекулы а- и -цепей МНС-П и еще одна так называемая инвариантная полипептидная цепь — П. Эта «прикрывает» МНС-П от связывания с пептидами внутри эндоплазматического ре тикулума и в дальнейшем обеспечивает экспозицию молекул МНС-И внутрь везикул — эндосом, или фаголизосом. Комп лекс из 3 тримеров в эндоплазматическом ретикулуме удерживается связью с кальнексином. В мембранных внутри клеточных структурах есть специальный компартмент М-Н-С (МНС class II compartment), в который физически упираются эндосомы и лизосомы с поглощенным внеклеточным содер жимым. И только с участием пептида молекула МНС-Н при нимает правильную продвигается к мембране и экспрессируется на ней. «Чистые» молекулы МНС I и II класса на мембране клетки не экспрессируются. Если клетка не рас полагает достаточным количеством чужого пептидного мате риала, то молекулы МНС-П связывают короткий фрагмент, образующийся при протеолитическом расщеплении инвариант ной цепи — CLIP (class II linked peptide).

В наслоении пептида на МНС-П участвует еще одна молеку ла — HLA-DM. HLA-DM на какое-то время стабилизирует пу стые молекулы МНС-И (без пептида). Отсюда понятно, по чему представление антигена именно молекулами осу ществляется при развитии защитных иммунных реакций на внеклеточные и везикулярные инфекции. Поскольку комплексы антигенов-пептидов с молекулами распознают исклю чительно Т-лимфоциты, то и в защите от внеклеточных и везикулярных инфекций главную роль играют реакции, обеспе чиваемые именно CD4 Т-лимфоцитами (рис. 5.8).

Вторая «зона» в клетке — зона цитозоля — неструктури рованного мембранами внутриклеточного содержимого. Цито золь непосредственно сообщается через крупные ядерные поры с содержимым ядра. В ядре идут процессы транскрип ции РНК с ДНК (как нормальные клеточные, так и вирус ные при вирусных инфекциях клеток). РНК из ядра транспор тируется для трансляции белка в цитозоль на полирибосомы, и для фолдинга (принятия правильной конформации) белков под контролем шаперонов («катализаторов» принятия поли пептидной цепью биологически значимой конформации) полипептидные цепи направляются в специальные участки эндоплазматического ретикулума. Лишние, испорченные, не правильно конформированные белки постоянно расщепляют ся в цитозоле так называемыми протеасомами. — Рис. 5.8. Строение клетки и «зоны обслуживания» молекулами MHC-I и II (схема).

— зона (или мембранных структур клетки (везикулы, эндо ретикулум, аппарат Гольджи), эта зона непосредственно со общается с внеклеточной средой;

2 — зона (или компартмент) цитозоля непосредственно сообщается с внутриядерным содержимым;

3 — протеасомы в 4 — фагосомы;

5 — фаголизосомы сливаются с везикулами, содержащими несконформированные молекулы МНС-И;

6 — комплекс МНС II — пептид «внеклеточного» происхождения экспрессирован на мембране клет ки;

7 — несконформированные молекулы MHC-I в зоне досягаемости пепти дов — продуктов протеасом;

8 — комплекс MHC-I — пептид «внутриклеточного» происхождения экспрессирован на мембране клетки.

это комплексы из 28 субъединиц, каждая из которых имеет молекулярную массу 20 000 или 30 000. Два из 3 вариантов субъединиц протеасом — LMP2 и LMP7 — кодируются генами, расположенными внутри комплекса Протеасомы осуществляют зависимую от убиквитина (ubiquitin) деградацию белков цитозоля. И именно пептиды, образующиеся в результате работы протеасом, поступают в «поджидающие» их в нужном месте эндоплазматического ре тикулума еще несконформированные молекулы всту пая в связь с пептидом, молекулы принимают био логически правильную конформацию и направляются для экспрессии на клеточную мембрану. Исследование мутаций и генетических дефектов, приводящих к иммунодефицитным состояниям, выявило зависимость представления антигена молекулами MHC-I от двух полипептидов и ТАР-2 (Transporters associated with antigen processing).

В мембране эндоплазматического ретикулума эти два полипеп тида формируют гетеродимер, ориентированный гидрофобны ми участками в полость ретикулума, а АТФ-связывающими доменами — в сторону цитозоля. Именно они доставляют пептиды для связывания с молекулами ТАР имеют сродство к пептидам с гидрофобными или остат ками аминокислот на С-конце. Гены ТАР-1 и ТАР-2 распо ложены внутри комплекса МНС.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.