WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

«ГУ НИИ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО РАМН На правах рукописи МЕДЖИДОВА МАРИНА ГУДОВНА Выявление маркеров цитомегаловируса у новорожденных и детей раннего возраста. Развитие апоптоза при ...»

-- [ Страница 2 ] --

г- контрольная культура. внутриклеточной локализации этих антигенов (166). В контрольных культурах окрашивание МКА не наблюдалось. С помощью иммуноцитохимического анализа было выявлено, что в двух культурах, инфицированных в состоянии покоя с последующей стимуляцией 15% ЭТС и без стимуляции, количество клеток, содержащих белки IЕ-р72 и рр65, достоверно не отличалось в течение развития ЦМВИ (рис.11а, б). Так, уже через 3 часа после проникновения вируса в обеих популяциях число IE-p72- и рр65-положительных клеток составляло около 70% и 50% от общего числа клеток, соответственно. Доля фибробластов, окрашенных МКА к IE-p72 и рр65, постоянно возрастала и достигала почти 100% через1-2 суток после заражения. Однако было обнаружено различие в динамике выявления позднего белка gB в этих популяциях (рис.11а, б). В культуре, стимулированной ростовыми факторами, через 6 часов после заражения 16,3% клеток содержали вирусный гликопротеин, в то время как Рис. 11а. Экспрессия вирусных белков в клетках ФЛЭЧ, инфицированных ЦМВ в состоянии покоя (Go) с последующей стимуляцией сывороточными ростовыми факторами.

Количество окрашенных клеток, % 100 80 60 40 20 1/ 1/ 1/ Время после заражения, сут.

Инфицированные клетки ФЛЭЧ, окрашенные с помощью МКА к IE-p72 Инфицированные клетки ФЛЭЧ, окрашенные с помощью МКА к pp65 Инфицированные клетки ФЛЭЧ, окрашенные с помощью МКА к gB Рис. 11б. Экспрессия вирусных белков в клетках ФЛЭЧ, инфицированных ЦМВ в состоянии покоя (Go) без последующей стимуляции сывороточными ростовыми факторами.

120 Количество окрашенных клеток, % 100 80 60 40 20 1/ 1/ 1/ Время после заражения, сут. Инфицированные ФЛЭЧ, окрашенные с помощью МКА к IE-p72 Инфицированные ФЛЭЧ, окрашенные с помощью МКА к pp65 Инфицированные ФЛЭЧ, окрашенные с помощью МКА к gB Рис. 11в. Экспрессия вирусных белков в клетках ФЛЭЧ, инфицированных ЦМВ в фазе синтеза ДНК (S).

120 Количество окрашенных клеток, % 100 80 60 40 20 1/8 1/4 1/ Вре мя после зараже ния, сут.

Инфицированные клетки ФЛЭЧ, окрашенные с помощью МКА к IE-p72 Инфицированные клетки ФЛЭЧ, окрашенные с помощью МКА к pp65 Инфицированные клетки ФЛЭЧ, окрашенные с помощью МКА к gB на этот же срок в не стимулированной популяции их доля составила менее 1% (0,7%). В первой популяции через 24 часа уже около половины клеток (48%) были окрашены МКА к gB, а через 48 часов - 74,4%. В не стимулированной культуре эти показатели были равны 18,0% и 55,7%, соответственно. Но на 3-е сутки течения инфекции в обеих культурах было выявлено одинаковое максимальное (около 100%) количество клеток, содержащих поздний вирусный белок. В фибробластах, зараженных в S-периоде, динамика накопления вирусных антигенов существенно отличалась от таковой для культур, инфицированных в покое (рис. 11 в). При инфицировании делящихся клеток через 3 часа после адсорбции вируса количество фибробластов, содержащих вирусный белок IE-p72, составило только 1,4% от общего числа клеток, в то время как в клетках, инфицированных в G0, около70%. Окрашивание МКА к IE-p72 половины клеток в популяции (52%) отмечалось на 1 сутки, а более 90% - только на 4 сутки после заражения. что на 48 часов позднее, чем при заражении покоящихся клеток. Первые клетки, содержащие ранний вирусный белок р65, были обнаружены через 6 часов после заражения, их доля составила 1,4%. На этот же срок в клетках, зараженных в покое, более 50% фибробластов были окрашены МКА в рр65. Максимальное количество (99%) рр65-положительных клеток в этой культуре также наблюдалось позднее на 2-3 суток по сравнению с культурами, инфицированными в покое. Наблюдалось отставание и в синтезе позднего белка gB. Так, только через 24 часа после заражения были обнаружены первые клетки (7,1%), окрашенные МКА к gB. На 3-е сутки течения ЦМВИ 50% клеток содержало вирусный гликопротеин, а 98% - на 7 сутки после заражения. Эти показатели для культур, инфицированных в стадии G0 с последующей стимуляцией и без стимуляции, составили 24 и 72, 48 и 72 часа, соответственно. Таким образом, полученные данные показали, что наиболее эффективно экспрессируются все группы вирусных белков (сверхранние, ранние и поздние) в клетках, зараженных в состоянии покоя с последующей стимуляцией 15% ЭТС. В покоящихся клетках, не стимулированных ростовыми факторами, происходит отставание синтеза поздних белков. В фибробластах, зараженных в S-фазе, синтез IE, E и L вирусных белков существенно замедлен по сравнению с культурами, инфицированными в состоянии покоя. Полученные результаты свидетельствуют о том, что развитие ЦПД вируса зависит от эффективности синтеза вирусных белков. Зависимость продукции вируса от состояния клеток в момент заражения. Одним из основных показателей развития вирусной инфекции является уровень продукции инфекционно активного вируса. Для того, чтобы выяснить, как влияет физиологическое состояние клеток в момент заражения на урожай ЦМВ, проводили определение титра вируса в вируссодержащих жидкостях (ВСЖ) от трех видов инфицированных культур. ВСЖ отбирали на 2-е. 3-е, 4-е, 5-е сутки, а от клеток, инфицированных в S-периоде, дополнительно на 9-е сутки после заражения. Результаты представлены на рис.12. Первые инфекционные вирусные частицы (титр 4,4 lg) были выявлены через 48 часов после начала ЦМВИ в ВСЖ от культуры, зараженной в состоянии покоя без последующей стимуляции сывороткой. В ВСЖ от двух других клеточных популяций вновь синтезированный вирус был обнаружен через 72 часа после заражения. Максимальная продукция ЦМВ наблюдалась на 5 сутки после заражения. В культуре, инфицированной в G0 без стимуляции, выход вируса составил 7,2 lg и в 100 раз превышал этот показатель (5,2 lg) в культуре, находящейся в момент заражения в состоянии покоя, но с последующей стимуляцией ростовыми факторами. Наименьший урожай вируса был выявлен в фибробластах, зараженных в S-фазе клеточного цикла, и составил 3,9 lg. Возможно, наименьшая продукция ЦМВ в этой культуре связана с тем, что на 5-е сутки после инфицирования в этой популяции фибробластов ЦПД вируса и синтез поздних белков не достигали максимально возможного значения (рис.7, 11в). Поэтому от фибробластов, инфицированных в S-фазе, была исследована ВСЖ на 9 сутки после заражения. К этому сроку в популяции наблюдалось поражение всего монослоя фибробластов, и почти все клетки содержали поздние вирусные белки (рис.7, 11в). Было установлено, что к 9-м суткам титр вируса несколько возрастал и составил 4,2 lg, однако не превышал урожая ЦВМ в остальных клеточных популяциях (рис.12). Рис.12. Продукция ЦМВ в клетках ФЛЭЧ, инфицированных в различных фазах клеточного цикла.

8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 9 Время после заражения, сут.

Титр вируса [Lg (БОЕ/мл)] Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе Go с последующей стимуляцией ростовыми факторами. Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе Go без стимуляции ростовыми факторами. Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе S.

Таким образом, совокупность полученных данных позволяет заключить, что не выявлено корреляции между синтезом вирусных белков, развитием ЦПД и продукцией инфекционного вируса. В культуре ФЛЭЧ, инфицированной в G0 с последующей стимуляцией ростовыми факторами, наиболее быстрое развитие ЦПД и эффективный синтез белков не сопровождались максимальным выходом урожая вируса. Но и наиболее медленное течение инфекции не способствовало увеличению титра вируса в клетках, зараженных в фазе синтеза ДНК. Максимальный выход вновь синтезированного инфекционного вируса был получен при заражении клеток, находящихся в покое и не стимулированных к делению, а минимальный – при заражении делящихся фибробластов. В дальнейшем для того, чтобы охарактеризовать процессы гибели ЦМВ-инфицированных фибробластов, определяли динамику экспрессии ряда генов и белков, участвующих в апоптозе, а также выявляли маркеры программированной гибели клеток. 6.2. Транскрипционная активность гена, кодирующего рецептор Fas. Один из путей апоптоза реализуется через взаимодействие физиологических индукторов с клеточными рецепторами, предназначенными для включения программы апоптоза. К ним относится рецептор CD95, или Fas. Известно, что накопление Fas-Ag сигнализирует о развитии процессов апоптоза в клетке (123). Для того чтобы охарактеризовать изменение транскрипционной активности вариантом гена Fas определяли уровень мРНК уровень полуколичественным ОТ-ПЦР. Конститутивный активности гена был изучен в фибробластах, находящихся в состоянии покоя и в S-периоде клеточного цикла. Данные электрофореза ПЦР-продуктов в агарозном геле представлены на рис. 13а. В материале, полученном из покоящихся клеток, специфические ДНК-амплификаты Fas размером 532 н.п. выявлялись при максимальном разведении 1:10, в пробе от пролиферирующих фибробластов – при разведении 1:1000. Количественное определение показало, что уровень мРНК в делящихся клетках более чем в 100 раз превышает этот показатель в покоящихся фибробластах. Влияние ЦМВ на транскрипционную активность гена Fas определяли в двух популяциях фибробластов, в которых наблюдалось наибольшее различие в развитии ЦПД вируса и в сроках гибели клеток. Это фибробласты, инфицированные в состоянии покоя с последующей стимуляцией ростовыми факторами, и клетки, находящиеся в момент заражения в фазе синтеза ДНК. Культуры были исследованы через 48 часов после проникновения вируса в клетки. Результаты анализа ОТ-ПЦР продуктов мРНК отражены на рис. 13б,в Полученные данные свидетельствуют, что под действием ЦМВ в покоящихся клетках уровень транскрипции мРНК Fas снижался примерно в 10 раз (Рис.13в Дорожки 1,2). В то время как, в клетках, инфицированных в Sпериоде, наблюдалось увеличение активности гена Fas по сравнению контрольной, незараженной культурой (рис. 13б Дорожки 1.2). Рис. 13. Сравнение уровней транскрипции мРНК Fas-Ag в клетках ФЛЭЧ, зараженных ЦМВ в состоянии покоя Go и синтеза ДНК (Sпериод).

2М 500 а б в а) Количественное определение мРНК Fas-Ag до заражения ЦМВ: фаза Go дорожки 1-3 (дорожка 1 –кДНК без разведения, дорожка 2 – кДНК 1/10, дорожка 3 – кДНК 1/100);

фаза S дорожки 1-8 (дорожка 4 –кДНК без разведения, дорожка 5 – кДНК 1/10, дорожка 6 – кДНК 1/100, дорожка 7 – кДНК 1/1000, дорожка 8 – кДНК 1/10000). б,в) Количественное определение мРНК Fas-Ag через 48 часов после заражения ЦМВ: (б) фаза S, дорожка 1- контроль незараженной культуры, дорожка 2- заряженные клетки ФЛЭЧ, в разведении кДНК 1/1000;

(в) фаза Go дорожка 1- контроль незараженной культуры, дорожка 2- зараженные клетки ФЛЭЧ, в разведении кДНК 1/100, М – маркер ДНК-лестница 100-1000 н.п. Электрофорез ОТ-ПЦР продуктов в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием.

Таким образом установлено, что ЦМВ модулирует транскрипционную активность гена Fas в фиброластах человека, и регуляция уровня мРНК зависит от пролиферативной активности клеток в момент заражения. Экспрессия антиапоптозного белка Bcl-2 в ЦМВ-инфицированных фибробластах. Другой путь реализации апоптоза в клетках, зараженных вирусами, связан с повреждением митохондриальных мембран. Этот процесс регулируется белками семейства Bcl, которые обладают как антиапоптозными, так и проапоптозными свойствами. Представляло интерес определить влияние ЦМВ на экспрессию антиапоптозного белка Bcl-2 в фибробластах, инфицированных в различных пролиферативных состояниях. Для этого проводили иммуноцитохимическое окрашивание инфицированных и контрольных клеток с помощью МКА к Bcl-2 в различное время после проникновения вируса, начиная с 3 часов. Полученные результаты представлены на рис. 14. В культуре, инфицированной в G0 с последующей стимуляцией сывороточными ростовыми факторами, белок Bcl-2 не был выявлен в течение первых 6-ти часов после заражения. Однако уже к 12 часам около 90% клеток содержали антиапоптозный белок. Через 24 часа инфекции и вплоть до гибели фибробластов все клетки культуры были окрашены МКА к Bcl-2. Подсчет клеток, содержащих Bcl-2 в культуре, инфицированной в G0 без стимуляции, показал, что первые окрашенные фибробласты появились только через 24 часа после заражения, и их количество составило 5,5%. На 2-е сутки доля Bcl-2-положительных клеток возросла до 70%, а к 3-м суткам все фибробласты содержали этот клеточный белок в количестве, достаточном для определения иммуноцитохимической реакции. В культуре, инфицированной в S-периоде, также как и в двух других популяциях окрашенные клетки были обнаружены через 24 часа после заражения, но их доля составила 1% от общего количества клеток. В этой культуре максимальное число фибробластов, содержащих Bcl-2, было достигнуто на 5 сутки ЦМВИ. В контрольных (не инфицированных) фибробластах параллельное окрашивание МКА к Bcl-2 не выявило антигенсодержащих клеток. Полученные данные показали, что в фибробластах, зараженных ЦМВ, повышается уровень антиапоптозного белка Bcl-2. Динамика экспрессии клеточного белка зависит от физиологического состояния клеток в момент заражения и коррелирует с развитием ЦПД вируса.

Рис. 14. Экспрессия белка Bcl-2 в ЦМВ-инфицированных фибробластах, находящиеся в момент заражения в различных пролиферативных состояниях.

Количество клеток, окрашенных МКА к Bcl-2, % 80 60 40 20 1/ 1/ 1/ Время после заражения, сут Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе Go с последущей стимуляцией ростовыми факторами Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе Go без стимуляции ростовыми факторами Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе S а – инфицированные клетки;

б – контрольные клетки.

Влияние инфицированных ЦМВ на транскрипционную может быть активность с гена, кодирующего белок Bcl-2. Увеличение уровня белка Bcl-2 в ЦМВфибробластах связан повышением транскрипционной активности гена, кодирующего этот белок. Для проверки этого предположения в зараженных и контрольных клетках определяли уровень мРНК Bcl-2 методом ОТ-ПЦР. Для исследования были выбраны две ЦМВ-инфицированные культуры, которые в наибольшей степени различались друг от друга по динамике выявления белка Bcl-2. Это культура ФЛЭЧ, инфицированная в состоянии G0 с последующей обработкой сывороточными ростовыми факторами, и фибробласты, находящиеся в момент заражения в стадии синтеза ДНК. Результаты сравнительного анализа ОТ-ПЦР продуктов мРНК Bcl-2 в фибробластах, инфицированных в состоянии G0 и S, представлены на рис. 15. В агарозных гелях показаны специфические ДНК-амплификаты Bcl-2 размером 209 н.п. с материалом от контрольных и зараженных культур, полученном через 6, 12 и 48 часов после адсорбции вируса. Конститутивный уровень активности гена Bcl-2 в покоящихся фибробластах более чем в 10 раз превышал установленный уровень в клетках, находящихся в стадии синтеза ДНК (рис. 15а, дорожки 2,4). Под воздействием сывороточных ростовых факторов непролиферирующие контрольные клетки входили в клеточный цикл, и через 6, 12 и 48 уровень транскрипции мРНК Bcl-2 снижался до уровня, наблюдаемого в пролиферирующих клетках (рис. 15в, дорожки 2,4,6). В зараженных фибробластах, инфицированных в состоянии покоя, было выявлено не менее чем 10-кратное увеличение активности гена Bcl-2 по сравнению с уровнем в контрольных культурах на всех сроках исследования (рис.15в, дорожки 3,5,7). Максимальный уровень транскрипции гена был зарегистрирован начиная с 12 часов после заражения. На этот же срок в культуре было обнаружено 88% клеток, содержащих белок Bcl-2 (рис. 14).

Рис. 15. Изменение уровня экспрессии мРНК Bcl-2 в клетках ФЛЭЧ, зараженных ЦМВ в состоянии покоя Go и синтеза S-период.

1 2 3 4 М 1 2 3 4567 М 1 2 34 567М 400 а б в а) Количественное определение мРНК Bcl-2 до заражения ЦМВ: фаза Go дорожки 1,2 (дорожка 1 –кДНК без разведения, дорожка 2 – кДНК 1/10);

фаза S дорожки 3,4 (дорожка 3 –кДНК без разведения, дорожка 4 – кДНК 1/10);

М – маркер ДНК-лестница 100-1000 н.п. б,в) Количественное определения мРНК Bcl-2 на различные сроки после инфицирования, в фазе S, кДНК без разведения (б) и в фазе Go, разведение кДНК 1/10 (в): до заражения – дорожка 1;

6 ч после заражения- дорожки 2,3;

12 ч после заражения – дорожки 4, 5;

48 ч после заражения – дорожки 6, 7;

М – маркер ДНКлестница 100-1000 н.п. Четные дорожки – контрольные клетки, нечетные – зараженные ЦМВ. Электрофорез ОТ-ПЦР продуктов в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием. Размер ПЦР-продукта Bcl-2 209 н.п.

В ходе исследования в активно пролиферирующих контрольных фибробластах также были обнаружены изменения транскрипционного уровня Bcl-2. К 12 часам наблюдения было выявлено снижение активности гена по сравнению с его активностью в исходной культуре (рис. 15б дорожка 4). Однако к 48 часам уровень мРНК Bcl-2 был восстановлен до первоначального транскрипционная (рис.15б активность дорожка 6). Под действием ЦВМ гена Bcl-2 достоверно не изменялась относительно исходного уровня в контрольной популяции. Небольшое увеличение количества мРНК было выявлено через 48 часов после заражения (рис.15в Дорожка 7). В этот период с помощью иммуноцитохимического окрашивания фибробластов.

было обнаружено около 20% Bcl-2-положительных Таким образом, полученные данные показали, что конститутивный уровень мРНК гена Bcl-2 не менее чем в 10 раз выше в покоящихся фибробластах по сравнению с пролиферирующими. В течение первых 48 часов после заражения ЦМВ эффективно индуцирует транскрипционую активность гена Вcl-2 в фибробластах, инфицированных в состоянии G0, и незначительно повышает транскрипционный уровень гена в клетках, зараженных в состоянии активной пролиферации. 6.3. Выявление цитоплазматического цитохрома С в зараженных клетках. В клетках, погибающих путем апоптоза, может нарушаться целостность митохондриальных мембран в мембран. В результате клеток повреждения митохондриальных цитохром С, цитоплазму одним из высвобождаются факторов.

растворимые белки межмембранного пространства. К ним относится который является апоптогенных Представляло интерес исследовать наличие цитохрома С в цитоплазме ЦМВинфицированных фибробластов. Выявление цитохрома С проводили с помощью иммуноцитохимического анализа с использованием МКА. В контрольных фибробластах наблюдали слабую окраску в виде крупных гранул. В инфицированных клетках было зарегистрировано более интенсивное диффузное окрашивание, равномерно распределенное по всей цитоплазме клетки (рис. 16а). По результатам исследования других авторов диффузное окрашивание при выявлении цитохрома С свидетельствует о транслокации белка из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму вследствие нарушения целостности мембран (Arnoult et al., 2002). Под действием ЦМВ в инфицированных культурах наблюдалось увеличение количества клеток с цитоплазматической локализацией цитохрома С. На рис. 16 графически отражены полученные результаты. Динамика выявления клеток, с диффузным характером окрашивания, была сходна для трех исследуемых культур, инфицированных в различных пролиферативных состояниях.

Рис.16. Освобождение цитохрома С из митохондрий в цитоплазму клеток ФЛЭЧ, инфицированных в различных пролиферативных состояниях.

Количество клеток с цитоплазматической локализацией цитохрома С, % 100 80 60 40 20 0 1/8 1/4 1/2 1 2 3 4 5 7 Время после заражения, сут Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе Go c последующей стимуляцией ростовыми факторами Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе Go без стимуляции ростовыми факторами Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе S а – инфицированные клетки;

б – контрольные клетки.

Существующие различия касались только сроков появления первых клеток с высвобожденным цитохромом скорости прироста их количества. В культуре клеток, инфицированных в покое и стимулированных ростовыми факторами, первые диффузно окрашенные клетки (4% от общего количества клеток) были выявлены через 6 часов после инфицирования. В фибробластах, инфицированных в G0 без стимуляции, и в клетках, зараженных в S-периоде, цитохром С был обнаружен в цитоплазме клеток через 24 часа после заражения. Доля диффузно окрашенных фибробластов в этих популяциях составила 4,5% и 4,1% от общего числа клеток, соответственно. Во всех трех культурах количество клеток с цитоплазматической локализацией цитохрома С возрастало в процессе развития ЦМВИ. В двух популяциях, инфицированных в состоянии G0, почти все фибробласты содержали цитохром С в цитоплазме на 3-е сутки после проникновения вируса. В клетках, находящихся в момент инфицирования в S-периоде, этот показатель был достигнут через 8 суток после заражения. Таким образом, полученные результаты показали, что заражение ЦМВ клеток ФЛЭЧ приводит к освобождению цитохрома С из межмембранного объема митохондрий в цитоплазму. Развитие ЦПД вируса сопровождается увеличением количества клеток с цитоплазматической локализацией этого проапоптозного фактора. Выявление Высвобождение каспазы-3 цитохрома С в в инфицированных цитоплазму фибробластах. каскад запускает протеолитической активации эффекторных каспаз, в том числе каспазы-3. В связи с этим в дальнейших экспериментах было исследовано влияние ЦМВИ на активацию каспазы-3. Для этого проводили иммуноцитохимическое окрашивание поликлональными АТ, взаимодействующими с активированной каспазой-3. Полученные результаты отражены на рис. 17. инфицированной в стадии В культуре, Рис.17. Активация каспазы-3 в клетках ФЛЭЧ, инфицированных ЦМВ в различных пролиферативных состояниях.

100 80 60 40 20 Количество клеток, окрашенных МКА к активированной каспазе-3, % 1/ 1/ 1/ Время после заражения, сут Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе Go с последующей стимуляцией ростовыми факторами. Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе Go без стимуляции ростовыми факторами. Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе S.

а – инфицированные клетки;

б – контрольные клетки.

G0 с последующей стимуляцией ростовыми факторами, достоверное количество клеток с активной каспазой-3 было зарегистировано через 12 часов после заражения. Их доля составила 7,1% от общего числа клеток. Однако уже через 24 часа инфекции все клетки культуры были окрашены АТ к каспазе-3. В популяции клеток, зараженных в состоянии покоя и не стимулированных 15% ЭТС, первые окрашенные клетки также были обнаружены через 12 часов после адсорбции вируса, но их количество было значительно меньше и составляло 1,6%. К 24 часам, как и в предыдущей культуре, почти во всех фибробластах этой популяции (92,5%) была обнаружена активная форма каспазы-3. В культуре, инфицированной в фазе S, прирост количества окрашенных клеток был замедленный по сравнению с двумя другими клеточными популяциями. Через 24 часа после проникновения вируса только в 0,7% клеток была обнаружена активная форма каспазы-3. На 2-е сутки число окрашенных клеток увеличилось до 4,9%. К 5-м суткам треть клеток содержала выявляемый белок, и только через 7 дней после заражения почти все фибробласты культуры (97,2%) были окрашены АТ к каспазе-3. В контрольных культурах ни на один из исследованных сроков не было обнаружено клеток, содержащих каспазу-3 (рис. 17). Таким образом под действием ЦМВ в зараженных фибробластах происходит протеолитическая активация каспазы-3. Динамика появления каспазы-3 коррелирует с динамикой высвобождения цитохрома С в цитоплазму и развитием вирусного ЦПД в инфицированных культурах. Выявление на нуклеосомные межнуклеосомной фрагменты мембран фрагментации Кроме ДНК. Каспаза- вызывает активацию каспаз-зависимой ДНКазы, которая разрезает хроматин (151). того, повреждение G, также митохондриальных том, что в высвобождает клетках эндонуклеазу нарушается каспаза-3, участвующую в фрагментации ДНК (150). Результаты, свидетельствующие о ЦМВ-инфицированных мембран и целостность позволили митохондриальных активируется предположить, что в под действием вируса происходит межнуклеосомная фрагментация клеточной ДНК. Для проверки этого предположения клетки от трех вариантов ЦМВ-инфицированных культур были окрашены с помощью модифицированного метода TUNEL. В качестве контрольной культуры были использованы фибробласты, обработанные индукторами апоптоза, ФНО совместно с ЦГМ. Известно, что эти вещества вызывают фрагментацию клеточной ДНК (101). Полученные результаты показали, что на протяжении всего инфекционного периода в ЦМВ-инфицированных фибробластах количество клеток с фрагментированной ДНК не превышало 1-2% при изучении трех исследуемых культур (рис. 18). В то время как в фибробластах, обработанных ФНО и ЦГМ, уже через 24 часа после воздействия доля окрашенных клеток составила 23% от общего числа клеток в популяции. Рис.18. Выявление межнуклеосомальных разрывов ДНК методом TUNEL в фибробластах инфицированных ЦМВ и в фибробластах обработанных ФНО и ЦГМ.

а – фибробласты, инфицированные ЦМВ в состоянии Go с последующей обработкой ростовыми факторами, 4-е сутки после заражения;

б – фибробласты, обработанные циклогексимидом (30 мг/мл). фактором некроза опухоли (50мг/мл) совместно с Полученные данные свидетельствуют о том что, несмотря на повреждение митохондриальных мембран и на активацию эффекторной каспазы-3 в ЦМВ-инфицированных фибробластах не происходит межнуклеосомной фрагментации клеточной ДНК. 6.4. Влияние ЦМВИ на структуру цитоскелета. К многочисленным субстратам для цистеиновых каспаз относятся белки цитоскелета. С помощью иммуноцитохимичекого окрашивания с использованием фаллоидина и МКА к -тубулину были изучены два основных компонента цитоскелета, микрофиламенты и микротрубочки. Было обнаружено, что в ЦМВ-инфицированных культурах снижается количество микрофиламентов и происходит дезорганизация актиновых волокон. Об этом свидетельствовало появление в фибробластах, инфицированных вирусом окрашивания диффузного характера при использовании фаллоидина (рис 19). В контрольных клетках разрушение актиновых микрофиламентов не было обнаружено. Динамика выявления клеток с диффузным характером окрашивания для трех вариантов зараженных культур представлена на рис 19. Первые клетки с нарушением структуры микрофиламентов наблюдались уже через 6 часов в культуре, инфицированной ЦМВ в фазе G0 с последующей стимуляцией 15% ЭТС. Их доля от общего числа клеток составляла 4%. В популяции покоящихся фибробластов без стимуляции сывороткой единичные клетки (1%) с диффузным окрашиванием были выявлены через 12 часов после заражения. При инфицировании клеток в Sпериоде фибробласты с измененной структурой микрофиламентов (27%) были зарегистрированы начиная с 1 суток инфекции. В ходе вирусной инфекции доля клеток с диффузным характером окрашивания нарастала и достигала почти 100% к 2, 3 и 5 суткам инфекции в трех инфицированных популяциях, соответственно.

Рис.19. Количество клеток с диффузным характером окрашивания микрофиламентов.

Количество клеток с диффузным характером окрашивания фаллоидина, % 100 80 60 40 20 1/ 1/ 1/ Время после заражения, сут Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе Go с последующей стимуляцией ростовыми факторами. Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе Go без стимуляции ростовыми факторами. Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе S.

а – контрольные клетки;

б – инфицированные клетки.

Окрашивание инфицированных клеток МКА к -тубулину не выявило достоверных различий в организации сети микротрубочек в клетках контрольных и инфицированных популяций на протяжении всего периода исследования вплоть до гибели зараженных клеток. Таким образом, установлено, что под действием ЦМВ в фибробластах человека происходит дезорганизация микрофиламентов актина. Динамика выявленных нарушений цитоскелета коррелирует с развитием ЦПД вируса. В отличие от микрофиламентов микротубулярная структура устойчива к влиянию ЦМВ и не изменяется в ходе инфекции (рис. 20).

Рис. 20. Фибробласты, окрашенные МКА к -тубулину для выявления микротрубочек.

а – контрольные клетки;

б – инфицированные клетки.

Обсуждение Цитомегаловирусная инфекция является часто встречающейся перинатальной инфекцией и одной из наиболее опасных для новорожденных, так как может вызывать генерализованное поражение внутренних органов и нарушать постнатальное развитие инфицированного ребенка. По данным отечественных и зарубежных специалистов от 0,5 до 5% детей появляются на свет с врожденной цитомегаловирусной инфекцией (15;

95). Около 90% детей, у которых после рождения обнаруживается ЦМВ, являются бессимптомными носителями, 5-15% из них относятся к группе риска, у этих детей в дальнейшем наблюдаются различные нарушения, главным образом, поражение головного мозга и слуха (36;

95;

155). Диагностика ЦМВИ у новорожденных и детей раннего возраста часто представляет сложную задачу из-за отсутствия специфической клинической симптоматики клиническую лабораторной и в связи с особенностями количество не иммунной современных только системы методов новорожденных. За последние пятнадцать лет было разработано и внедрено в практику большое диагностики, позволяющих верифицировать этиологический агент (идентификация самого вируса, его генома или антигенов) и обнаруживать серологические маркеры иммунного ответа (специфических антител), но и определить стадии инфекционного процесса (изучение активности репликации вируса, определение анти-ЦМВ-АТ раздельно IgM и IgG и индекса авидности IgG). Однако эффективность и информативность указанных методов неодинаковы для диагностики ЦМВИ у новорожденных и детей раннего возраста. Так же несмотря на многочисленные исследования, к настоящему времени еще не разработано четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию новорожденных и детей раннего возраста с подозрением на ЦМВИ. Все эти факторы побудили нас провести комплексное исследование ЦМВИ у новорожденных и детей раннего возраста с помощью БКМ, ПЦР и методов серодиагностики.

В группу обследованных из 31 детей вошли недоношенные и маловесные новорожденные, у которых отмечались клинические симптомы перинатального инфицирования: ранняя желтуха, гемморагический синдром, нарушение гемодинамики, увеличение размеров печени и/или селезенки, изменение в клиническом увеличение анализе крови (анемия, в крови нейтропения, билирубина, тромбоцитопения), концентрации печеночных трансаминаз. Масса детей при этом составляла в среднем 1515+189 г, гестационный возраст - 31+4 недели, 21 ребенок родился до 32 недели гестации (67,7%). Уже на первой неделе жизни у 25 детей из 31 был выявлен ЦМВ при исследовании образцов крови и мочи, что составило 81%. Обнаружение ЦМВ лабораторными методами у ребенка на первой недели жизни свидетельствует о внутриутробной передаче вируса от матери к ребенку (187). При наличии клинических симптомов ЦМВИ в этом случае ставится диагноз внутриутробная ЦМВИ. Таким образом, можно сказать что у 81% недоношенных и маловесных новорожденных с клиническими симптомами перинатального инфицирования была выявлена внутриутробная ЦМВИ. Высокая частота встречаемости ЦМВ у недоношенных и маловесных новорожденных в отличии от доношенных отмечалась и другими исследователями (157). У 8 детей (32%) (табл.№1), 6 из которых были с гестационным возрастом не более 32 недель, было выявлено наибольшее содержание ЦМВ в биологических жидкостях с помощью БКМ и/или ПЦР. При анализе клинических образцов БКМ было определено 25 и более антигенсодержащих клеток на 2,5х105 клеток ФЭЧ, что соответствует более 100 инфекционным вирусным частицам в 1 мл исследуемого образца. По результатам ПЦР было определено более 2000 копий/мл вирусной ДНК. У 17 детей количество вирусной ДНК не превышало 1000 копий/мл и методом БКМ было выявлено в среднем 1-3 антигенсодержащих клеток на препарат.

По литературным данным обнаружение более 10 инфицированных клеток на 2х105 клеток свидетельствует о высоком риске заболеваний ЦМВИ. (187). Учитывая высокий процент детей с ЦМВИ важно было проследить динамику течения ЦМВИ. С этой целью повторно нами были обследованы 23 ребенка. У большинства детей (16 из 23), у которых ЦМВ был выявлен в биологических жидкостях, вирус сохранялся в течение всего периода обследования, и его количество оставалось приблизительно на одинаковом уровне. Однако у 3-х детей (табл.№1) количественные показатели вирусных маркеров в образцах крови и/или мочи значительно снизились. При повторном обследовании 6-ти детей, у которых не был выявлен ЦМВ в первую неделю жизни, у 3-х в образцах крови была обнаружена инфекционная активность вируса, соответствующая 5-15 инфекционных частицам в 1 мл крови. Возможно, у этих новорожденных с течением времени произошло накопление вируса, полученного от матери. В литературе имеются многочисленные сведения об отсроченном проявлении внутриутробной бессимптомной ЦМВИ в виде серьезных осложнений (36;

155). Не исключено также, что инфицирование этих детей произошло уже в неонатальном периоде. Таким образом, количественными методами БКМ и ПЦР у 28 из 31 детей были обнаружены прямые маркеры ЦМВ, что составило 90%. Все вышеизложенное свидетельствует о том, что положительные результаты, полученные при исследовании крови и мочи любым из двух методов, позволяют объективно установить факт инфицирования ребенка на момент рождения, однако однократного обследования недостаточно для постановки диагноза острой инфекционной болезни у всех инфицированных детей. Выявление ЦМВ с помощью количественных вариантов БКМ и ПЦР показало, что при исследовании образцов крови и мочи совпадение результатов двух методов составило 55,1% и 48%, соответственно. При сравнительном анализе результатов исследования клинических образцов было установлено, что БКМ обнаруживал чаще ЦМВ, чем ПЦР, как в образцах крови (35 против 23 положительных образцов), так и в образцах мочи (30 против 10 положительных образцов). При этом различия результатов анализа образцов мочи статистически достоверны. Отрицательные результаты ПЦР в образцах мочи, в которых ЦМВ был выявлен с помощью БКМ, возможно, связаны с присутствием в моче ингибиторов ПЦР (103). Недавно опубликованы данные по количественной оценке ЦМВ в образцах крови и мочи у новорожденных (111). Авторы показали, что число копий вирусной ДНК в образцах крови в 183 раза меньше, чем в образцах мочи (2,3х103 копий/мл и 4,2х105 копий/мл, соответственно). Это означает, что при исследовании образцов мочи вероятность обнаружения ЦМВ значительно выше, чем при анализе крови. Именно этим, по-видимому, объясняется тот факт, что при диагностических скрининговых обследованиях новорожденных и детей раннего возраста в крупных диагностических центрах Западной Европы исследуются именно образцы мочи. В случае когда, положительные результаты ПЦР наблюдались при отрицательных результатах БКМ, возможно, объясняются выявлением ДНК ЦМВ в дефектных вирусных частицах, не обладающих инфекционной активностью, Положительные что соответствует БКМ литературным выявленные при данным (104). результаты отрицательных результатах ПЦР, можно объяснить большей чувствительностью БКМ (11). О различной чувствительности сравниваемых методов свидетельствуют также литературные данные (11;

145). Так в работе Cattaneo E показано что чувствительность БКМ и метода ПЦР составляет 95,2% и 97,8%, а специфичность 99,5% и 97,7% соответственно, при этом положительная предсказуемость методов составляет 97,5% и 88,2%, а негативная 99,0% и 99,6% соответственно (61). В работах Guerra B. с соавторами также указывается, что при анализе одних и тех же клинических образцов чувствительность качественного и количественного вариантов ПЦР различается и составляет 100% и 75%, соответственно (108). количественный ПЦР (108).

При этом показано, что 100% предсказуемостью ЦМВИ обладают только БКМ и Таким образом, можно заключить, что оптимальными методами для диагностики ЦМВИ у новорожденных недоношенных и маловесных детей являются количественные варианты БКМ и ПЦР. Известно, что клинические проявления ЦМВИ у новорожденных зависят от состояния иммунитета матери. С целью уточнения состояния специфического гуморального иммунитета обследованных новорожденных детей дополнительно были использованы серологические методы диагностики: тИФА, определение индекса авидности специфических АТ, иммуноблоттинг (ИБ). Сыворотки 30 детей были исследованы на наличие специфических анти-ЦМВ АТ в реакции тИФА и реакции иммуноблота. АТ IgG в высоких титрах были обнаружены у всех 30 детей. Только у 1-го (№1) из 23 детей обследованных на присутствие в сыворотках анти-ЦМВ IgM, были выявлены АТ класса M к белкам с Мм 28кДа, 52кДа, 65кДа и 38 кДА. В литературе имеются сведения о том, что выявление АТ класса М, взаимодействующих с вирусным белком р38, свидетельствует об остром инфекционном процессе (138). БКМ у этого ребенка в моче было выявлено более 500 вирусных частиц в 1 мл. Результаты ПЦР также были положительными. Таким образом, наличие IgM в сыворотке данного ребенка свидетельствовало об острой ЦМВИ. Невысокая частота выявления АТ класса М у новорожденных отмечалась также другими авторами (81;

171). Это связано с тем, что способность продуцировать IgM зависит от срока гестации и от функционирования иммунной системы. Имеются сведения о том, что 50% новорожденных с признаками ЦМВИ не способны продуцировать анти-ЦМВ IgM АТ (81;

171).

Учитывая относительно низкий индекс авидности (ИА) 0,51, который был выявлен в сыворотке этого ребенка и возраст ребенка на момент исследования (одна неделя), можно с высокой вероятностью предположить, что анти-ЦМВ IgG в сыворотке ребенка имели материнское происхождение. А из возраста гестации ребенка (25 недель), можно заключить, что заражение матери произошло в первый триместр беременности. Хорошо известно, что инфицирование беременных женщин в течение первого триместра наиболее часто приводит к внутриутробному инфицированию плода (42;

91). Полученные серологические данные и результаты БКМ и ПЦР позволяют заключить, что у данного новорожденного наблюдалась острая форма внутриутробной ЦМВИ, вероятно, вследствие первичного ЦМВинфицирования матери в первый триместр беременности. В 29 сыворотках из 30, изученных методом тИФА, были выявлены только анти-ЦМВ IgG. В реакции ИБ у большинства детей (70%) был определен широкий репертуар анти-ЦМВ IgG, АТ реагировали с 10-27 вирусными белками с М.м. от 14 кДа до 200 кДа (рис.5б). В сыворотках 8-ми детей (30%) были обнаружены АТ, взаимодействующие с 4-8 белками М.м. 28 -160 кДа (рис.5в). Анализ данных ИБ с результатами БКМ и ПЦР показал, что как при узком, так и широком спектре анти-ЦМВ IgG у большей части детей (75% и 68%, соответственно) были выявлены небольшие количества копий ДНК и низкая инфекционная активность вируса. Таким образом, данные ИБ не позволяют однозначно судить о вирусной нагрузке и активности инфекционного процесса у недоношенных новорожденных детей. Авидность анти-ЦМВ IgG была определена в сыворотках 21 ребенка. Сравнительный анализ ИА и выявление прямых маркеров ЦМВИ позволило установить, что у 15 из 20 детей с высоко авидными АТ результаты ПЦР и БКМ были или отрицательными, или содержание инфекционно активного вируса и вирусной ДНК в крови и в моче этих детей находилось на низком уровне. Это означает, что высокая авидность IgG анти-ЦМВ коррелирует с низкой вирусной нагрузкой и слабой инфекционной активностью ЦМВ.

Исходя из полученных данных можно предположит, что высокоавидные материнские АТ защищают в первую неделю жизни большую часть новорожденных от развития ЦМВИ. Важно отметить, что из 6 детей у которых не был обнаружен ЦМВ в первую неделю жизни, при повторном обследовании у 3-х были выявлены положительные результаты ПЦР и БКМ. Среди них дети, в сыворотках которых присутствовали высокоавидные IgG, направленные к широкому спектру белков ЦМВ. Возможно, что для проявления активности ЦМВ у новорожденных важную роль играет не только авидность и репертуар материнских недоношенных IgG АТ, содержащихся в сыворотке доля ребенка, но и нейтрализующие свойства этих АТ. Однако надо учитывать, что у новорожденных детей АТ, обладающих нейтрализующими свойствами, зависит от возраста гестации. Так, только к 34 неделям гестации 99% нейтрализующих материнских АТ достигают сыворотки плода (170). Очевидно, что для недоношенных новорожденных интерпретация серологических данных осложняется особенностями их иммунной системы, материнским происхождением и свойствами АТ класса G, недостаточной способностью или отсутствием выработки АТ класса М. Совокупность полученных результатов позволяет сделать несколько выводов: 1) У 90% недоношенных и маловесных детей с клиническими симптомами перинатального инфицирования количественными методами БКМ и ПЦР были обнаружены прямые маркеры ЦМВ. 2) Широко применяемый в лабораторной практике метод тИФА для качественного определения анти-ЦМВ IgG и IgM не позволяет охарактеризовать компетентность специфического иммунного ответа у новорожденных детей в связи с присутствием материнских АТ и с незрелостью иммунного ответа детей;

3) Метод иммуноблота, обладающий высокой специфичностью, может служить подтверждающим тестом для выявления анти-ЦМВ АТ. Однако прямой корреляции между спектром АТ в сыворотках недоношенных новорожденных и обнаружением прямых маркеров ЦМВ не выявлено;

4) Низкая авидность IgG АТ (ИА<0,6) в крови новорожденных позволяет предположить время инфицирования матери и, следовательно, предусмотреть меры предупреждающие развитие ЦМВИ. Высокая авидность АТ (ИА>0,6) способствует предотвращению развития ЦМВИ;

Серологические методы не всегда позволяют адекватно оценивать состояние иммунной системы новорожденных детей с ЦМВИ. В связи с этим представлял интерес оценить эффективность методов серодиагностики при ЦМВИ у детей раннего возраста, у которых, как известно идет процесс замещения материнских АТ собственными, а также провести сравнительный анализ информативности выявления прямых маркеров и анти-ЦМВ АТ. Нами было обследовано 33 ребенка в возрасте от одного месяца до одного года (в среднем от 4-х до 7-и месяцев), которых разделили на две группы: на детей имеющих клинические признаки ЦМВИ (первая группа) и на детей неспецифической клинической симптоматикой (вторая группа). Дети, составившие первую из двух изученных групп (всего 20 детей), имели следующие клинические симптомы: гепатомегалию, спленомегалию, врожденную катаракту, затяжную желтуху и др. Во вторую группу вошли 13 детей с неспецифической клинической симптоматикой в частности, с пороками сердца, задержкой психомоторного развития неясного генеза. У всех детей первой группы были выявлены один или несколько маркеров ЦМВИ (табл. №2 и №3). От 18 детей из этой группы были проанализированы сыворотки на присутствие специфических АТ к ЦМВ. Результаты тИФА показали что в сыворотке у 1-го ребенка были выявлены только АТ класса M (№5). У 8 детей обнаружили как анти-ЦМВ IgM, так и IgG, а анти-ЦМВ IgG при отсутствии IgM были определены в сыворотках у (50,0%) из 18 обследованных детей. По мнению Коченгина С. А. и соавторов обнаружение анти-ЦМВ IgM АТ в присутствии IgG, может свидетельствовать как и об острой первичной инфекции, так и о процессе реактивации недавно перенесенной ЦМВИ (9). В случае же обнаружения только IgM АТ у ребенка №5 можно с уверенностью сказать о первичной ЦМВИ. Взаимодействие АТ класса IgG с индивидуальными вирусными белками, установленное с помощью ИБ, показало, что в сыворотках большинства детей этой группы (77,8%;

14 из 18 обследованных) присутствуют АТ, реагирующие с 1-3 белками с М.м. 28 кДа, 38 кДа и 43 кДа или 72 кДа. Согласно существующим данным обнаружение у ребенка антиЦМВ IgG к 1-3 белкам свидетельствует о недавнем инфицировании ЦМВ. Таким образом, из полученных результатов можно сделать вывод об информативности данных ИБ для анти-ЦМВ IgG при оценке стадии (ранняяпоздняя) и формы (первичная-вторичная) инфекционного процесса у детей раннего возраста. Известно, что низкоавидные АТ персистируют в сыворотке крови в течение примерно 20 недель после первичной инфекции, затем авидность IgG АТ увеличивается и остается высокой в течение всей жизни (144). определения авидности продолжительности (ИА) анти-ЦМВ IgG, инфицирования который и Для дифференциации прочность первичной инфекции от вторичной в сыворотках 15 детей определяли индекс характеризует связывания АТ с вирусными белками (таблица №2). У одного ребенка (№17) АТ имели низкий ИА (0,28). Взаимодействие сыворотки этого ребенка в реакции ИБ выявило IgG только к одному белку р28. У 2-х детей были выявлены АТ со средним значением ИА (0,43 и 0,58), и в этом случае АТ были направлены к небольшому количеству белков ЦМВ (№4 и №6 ). На основании этих данных можно было заключить, что 3 детей с ИА < 0,6 и узким спектром анти-ЦМВ были инфицированы в течение ближайшего полугодия. Оказалось, что ребенок с ИА 0,28 был обследован в возрасте 4-х месяцев, два других (с ИА 0,43 и 0,58) – в возрасте 7-ми месяцев. Эти данные позволяют с высокой вероятностью предположить, что заражение детей ЦМВ произошло после рождения. У остальных 12 (80%) детей АТ IgG обладали относительно высоким ИА, который составил в среднем 0,78, что свидетельствует о вторичной инфекции. При исследовании 13 сывороток детей, без специфических клинических симптомов (2-я группа), было установлено, что 46% детей не содержали специфических АТ к ЦМВ. Специфические IgG в высоких титрах были определены у 7 детей (54%). Значения ИА для выявленных АТ были высокими и составляли в среднем 0,80+0,11. Спектр анти-ЦМВ IgG во всех сыворотках был широким и включал АТ, взаимодействующие с белками М.м. 28 кДа, 38 кДа, 55 кДа, 65 кДа и 72 кДа. Только у одного ребенка были обнаружены АТ к 2-м вирусным белкам – р28 и р38. Таким образом, на основании полученных нами результатов можно сделать вывод о том, что ИА в совокупности с данными ИБ позволяет определить у детей раннего возраста продолжительность инфицирования, дифференцировать первичную инфекцию от реактивации и характеризовать компетентность специфического иммунного ответа. Для верификации ЦМВИ у детей обеих групп были использованы методы ПЦР и БКМ. У 65,0% детей из первой группы была выявлена ЦМВИ с помощью БКМ и/или ПЦР. У всех детей, у которых обнаружили тот или иной вирусный маркер, был выявлен узкий спектр АТ класса IgG (к 1-3 белкам). У одного ребенка (№14) с признаками ЦМВИ при первичном обследовании не был обнаружен инфекционно активный вирус. В то же время в сыворотке было обнаружено высокое содержание анти-ЦМВ IgG к широкому спектру вирусных антигенов (М.м. 28 38 кДа, 55 кДа, 65 кДа и 75 кДа) и невысокое значение ИА (0,61). Данные серологического анализа в совокупности с клиническими симптомами давали основания для повторного обследования этого ребенка. Через месяц результаты БКМ были положительными при анализе как образцов крови, так и свидетельствовало об активной форме ЦМВИ. Во второй группе помощью БКМ и/или ПЦР ЦМВИ была выявлена только у 3 детей, что составило 23%. Следует отметить, что у всех детей не был второй группы БКМ инфекционно активный вирус в крови мочи, что обнаружен. Отсутствие прямых маркеров вируса у большинства детей этой группы (77%) (табл. №3), по-видимому, можно объяснить высокой активностью анти-ЦМВ IgG, предотвращающих проявление ЦМВИ. Из полученных данных можно заключить, что для детей из 2-ой группы было характерно отсутствие в сыворотках IgМ АТ, наличие высоко авидных IgG, направленных к 4-м и более вирусным белкам, и отсутствие инфекционно активного вируса в крови. Таким образом, сопоставление данных тИФА, ИБ, авидности и БКМ показало, что обнаружение высоко авидных IgG АТ и 4-6 полос в ИБ чаще коррелирует с отсутствием активности вируса в крови. Присутствие IgM, низкие показатели авидности IgG и 1-3 полосы в ИБ чаще коррелируют с положительными результатами БКМ и ПЦР как в моче, так и в крови. Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать заключение, что для верификации ЦМВИ у новорожденных и детей раннего возраста необходимо комплексное обследование, включающее помимо серологических методов выявление прямых маркеров ЦМВ. При этом БКМ позволяет в короткие сроки определить в организме больного ребенка инфекционную активность ЦМВ. Обращают на себя внимание расхождение результатов исследования двух лабораторных методов – БКМ и ПЦР. Эти два диагностических подхода характеризуют различные стороны инфекционного процесса: с помощью БКМ в биологическом материале можно выявить инфекционно активный вирус, а с помощью ПЦР – вирусную ДНК.

Для уточнения расхождения результатов БКМ и ПЦР, в ходе данной работы, дополнительно был проведен сравнительный анализ одних и тех же образцов методами БКМ и ПЦР в 3-х независимых ПЦР-лабораториях (табл. № 4). При сравнении данных БКМ с результатами ПЦР, полученными в 3-х лабораториях, частота выявления ЦМВ оказалась неодинаковой. Так, совпадение данных двух ПЦР-лабораторий (№1 и №2) с БКМ составляло 88% и 87%, соответственно, тогда как с лабораторией №3 – 72%. ПЦР, выполненная в лабораториях №1 и №2, обнаружила ЦМВ в большем количестве образцов, чем БКМ (8 и 7 положительных образцов против 1 и 4, соответственно). Напротив, в лаборатории №3 ДНК ЦМВ была выявлена в 1 образце против 6 БКМ-положительных. Так же был проведен сравнительный анализ между двумя ПЦР лабораториями. В связи с этим, 64 клинических образца были изучены одновременно ПЦР, выполненной в лабораториях №1 и №2. Отрицательные результаты совпали для 51 образца (80%). Дополнительно ДНК ЦМВ была выявлена в лаборатории №1 в 9 случаях, при исследовании материала в лаборатории №2 - в 4-х образцах. При сравнении результатов, полученных в двух ПЦР-лабораториях, было выявлено, что в основном совпадение отмечалось при отрицательных результатах, полученных двумя методами. В многочисленных литературных данных показано, что результаты ПЦР выполненные в разных лабораториях часто не совпадают (55;

127;

215). Согласно опубликованным данным чувствительность коммерческих наборов может различаться в 100 раз (55). Вероятно, это объясняется различной чувствительностью тест-систем ПЦР, используемых в лабораториях. Это зависит от применяемых праймеров, количества циклов амплификации ДНК. В связи с этим необходимо вводить методы стандартизирующие тестсистемы, используемые в клинических лабораториях. Суммируя данные этого раздела работы, можно заключить, что в реальной лабораторной практике следует использовать два метода обнаружения прямых маркеров ЦМВ - ПЦР и БКМ. Комбинация этих двух методов позволяет достигнуть максимальной чувствительности и специфичности выявления ЦМВ в клиническом материале. Тяжесть клинической симптоматики ЦМВИ во многом определяется антивирусным гуморальным и клеточным иммунным ответом. Определение специфических антител нередко помогает адекватно охарактеризовать стадии инфекционного процесса и прогнозировать риск развития неонатальтной патологии. При этом детекция антивирусных антител в значительной степени зависит от качества тест-систем. Это, в первую очередь, связано с различным составом антигенов, которые могут включать инактивированный вирус, натуральные вирусные белки или рекомбинантные белки. Следовательно, важной задачей является выбор тест-систем, сочетающих высокую чувствительность и специфичность. В связи с этим представляло интерес сравнить результаты выявления анти-ЦМВ антител классов IgM и IgG, полученных с помощью нескольких тест-систем, представленных на Российском рынке. Для этого 37 сывороток матерей и новорожденных были изучены на присутствие анти-ЦМВ класса M с использованием 3-х диагностических наборов: 1- тест-система «ВектоЦМВ-IgM–стрип» (Россия,), 2 – «Enzygnost Anti-CMV/IgM» (Германия) и 3 – «CYTOMEGALY-VIRUS HUMAN-ELISAIgM-Antibody-Test» (Германия). Проведенные исследования показали, что наименьшей чувствительностью обладает диагностический набор «ВектоЦМВ-IgM–стрип». Кроме низкой чувствительности относительно двух других тест-систем «ВектоЦМВ-IgM–стрип» продемонстрировал и более слабую специфичность, так антитела IgM данной тест-системой были выявлены в том образце сыворотки, в котором две другие тест-системы не обнаружили анти-ЦМВ IgM. Результаты сравнения импортных наборов между собой показали совпадения положительных результатов только для 2х образцов сывороток. Полученные данные позволяют заключить, что совпадения результатов выявления анти-ЦМВ IgM во всех трех тест системах наблюдалось только при отрицательных результатах (28 из 37 сывороток), что составило 75,7%. Сравнения детекции анти-ЦМВ класса G проводили в 4-х тест-системах: 1 – «ЦМВ-скрин» (Биосервис, Россия), 2 - «ВектоЦМВ-IgG–стрип» (ВекторБест, Россия), 3 - «CYTOMEGALY-VIRUS HUMAN-ELISA-IgG-AntibodyTest» (HUMAN, Германия), 4 - «Enzygnost Anti-CMV/IgG» (ВEHRING, Германия). Согласованность результатов во всех системах наблюдалась в 62,2% случаев (23 из 37 образцов). Чувствительность используемых наборов варьирует от 86,2 до 100%, специфичность – от 0 до 100%. Оптимальное соотношение чувствительности и специфичности, продемонстрировала тестсистема ЦМВ, система «Enzygnost выпускаемые Anti-CMV/IgG». немецкой По данным, Behring, опубликованным обладают №5). в зарубежной литературе, известно, что наборы для определения антител к фирмой высокой специфичностью (143). Не менее эффективно выявляет анти-ЦМВ IgG тест«ВектоЦМВ-IgG–стрип» (Таблица Наибольшую чувствительность при низкой специфичности обнаружения специфических антител класса G продемонстрировала тест-система «ЦМВ-скрин» (ВекторБест, Россия). В последнее время в лабораторной диагностике ЦМВИ все большее распространение приобретает метод выявления низкоавидных антител IgG. В связи с этим представляло интерес изучить способность 4-х тестсистем выявлять недавнюю инфекцию. В работе были использованы перечисленные тест-системы. Полученные данные продемонстрировали различную способность используемых тест-систем выявлять низкоавидные антитела. Согласованность результатов 4-х коммерческих наборов наблюдалась в 30,8% случаев. Из 39 сывороток, исследованных в наборе фирмы «Биосервис», только в одном образце были выявлены низкоавидные анти-ЦМВ, что составило 2,6%. Результаты исследования показали, что данные, полученные с помощью наборов Российских производителей, существенно отличаются от данных, полученных с помощью тест-систем «CYTOMEGALY-VIRUS HUMAN-ELISA-IgG-Antibody-Test» и «Enzygnost Anti-CMV/IgG». Так, при использовании тест-системы «ВектоЦМВ-IgG– стрип» было выявлено в 2,5-5,0 раз больше сывороток, содержащих низкоавидные антитела. Возможно, это объясняется тем, что рекомбинантный белок, примененный в этой тест-системе в качестве антигена, чувствителен к действию детергента, обработка которым необходима для выявления авидности IgG. Не исключено также, что связывание высокоавидных антител к ЦМВ с рекомбинантным антигеном менее прочно, чем с натуральным, чем и объясняются ложнопозитивные результаты. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что результаты серологических исследований зависят от качества используемых тест-систем. Анализ результатов показал, что эффективное выявления анти-ЦМВ как IgM, так и IgG обеспечивает тест-система фирмы Behring. Не уступает им по чувствительности и специфичности тест-система фирмы «ВЕКТОР–БЕСТ» («ВектоЦМВ-IgG–стрип» (Россия, Новосибирск) при определении анти-ЦМВ IgG. Наибольшую специфичность немецкие следует том, что выявления низкоавидных антител продемонстрировали В заключение о тест-системы отметить, что «CYTOMEGALY-VIRUS полученные данные у HUMAN-ELISA-IgG-Antibody-Test» и «Enzygnost Anti-CMV/IgG». свидетельствуют лабораторная диагностика ЦМВИ новорожденных и детей раннего возраста является сложной задачей. Частота выявления маркеров ЦМВ у новорожденных и детей раннего возраста с подозрением на ЦМВИ зависит от возраста ребенка, инфицированности матери, времени заражения в процессе развития, компетентности иммунной системы. Выбор метода лабораторного обследования и тест-системы для его осуществления зачастую имеют решающее значение для постановки и подтверждения диагноза. Полноценная диагностика у новорожденных и детей раннего возраста возможна только при сочетании не менее 2-х методов выявления прямых маркеров ЦМВ (ПЦР и БКМ) и 2-х серологических тестов (определение противовирусных IgM и авидности IgG). Важность повторного лабораторного обследования ребенка с подозрением на ЦМВИ в первые месяцы жизни связана с предотвращением тяжелых патологических последствий и своевременным принятием решения о назначении специфической терапии.

Внутриутробная передача ЦМВ плоду с последующей первичной инфекцией в раннем и позднем периоде беременности обычно приводит к серьезным неврологическим нарушениям, включающим потери слуха, атрофии глаз, церебральной гипоплазии, микроцефалии, гидроцефалии. Индукиця апоптоза под влиянием ЦМВИ может вносить существенный вклад в нарушения в развитии плода, служить важным фактором в этиологии ряда заболеваний новорожденных и детей раннего возраста. Изучение процессов нарушения программированной гибели клеток может помочь раскрыть механизмы, лежащие в основе ЦМВ-ассоциированной патологии в эмбриональном развитии и неврологических дефектах новорожденных и детей раннего возраста. Однако многие вопросы, касающиеся молекулярных и клеточных механизмов воздействия ЦМВ на программированную гибель клеток, остаются не выяснеными. В настоящее время большая часть работ посвящена изучению устойчивости ЦМВ-инфицированных клеток к различным индукторам апоптоза (26;

101;

133;

232). В связи с этим, внимание исследователей направлено на выяснение механизмов повреждения процессов апоптоза в инфицированных клетках, на поиск индивидуальных вирусных белков, обладающих способностью подавлять гибель клеток (31;

100;

101;

186;

202). Вместе с тем, другие авторы указывают на способность ЦМВ индуцировать апоптоз в зараженных клетках, о чем свидетельствуют данные об обнаружении маркеров апоптоза в ЦВМ-инфицированных тканях и в клетках, экспрессирующих вирусные белки (26;

69;

113;

201).

Непосредственные доказательства индукции апоптоза под действием ЦМВ были получены при изучении мутантных вирусов с делециями по генам, кодирующим известные вирусные супрессоры программированной гибели клеток, vMIA и vICA (100;

186). Однако исследованию клеточных генов, регулирующих гибель ЦМВ-инфицированных клеток, уделено недостаточное внимание. Апоптоз и деление клеток являются процессами, регуляция которых обусловлена изменением экспрессии и активности одних и тех же генов и кодируемых ими белков. Под контролем транскрипционных факторов, к которым относятся E2F-1 и NF-kB, экспрессируются гены, белковые продукты которых участвуют как в апоптозе, так и в клеточной пролиферации (56;

64;

98;

117;

198). Повышенная экспрессия антионкогена р53 останавливают продвижение по клеточному циклу и индуцируют программированную гибель клеток (35). Антиапоптозный белок Bcl-2 препятствует выходу клеток из состояния покоя (76). Циклин Д1, являющийся ключевым регулятором клеточного цикла, также обладает способностью контролировать развитие апоптоза (39). Имеющиеся данные дают гибели. Pанее несколькими группами авторов было установлено, что ЦМВ приводит к остановке деления инфицированных клеток, по-разному влияя на прохождение клеточного цикла в зависимости от пролиферативного состояния клеток в момент заражения. При заражении покоящихся клеток ЦМВ стимулирует вступление клеток в S-фазу, но препятствует прохождению фазы синтеза и останавливает клетки в раннем S-периоде (57). Заражение клеток в S-периоде ингибирует синтез клеточной ДНК и приводит к увеличению продолжительности S-фазы. Однако клетки способны основание предполагать о взаимосвязи и взаимозависимости механизмов реализации пролиферации и программированной клеточной завершить репликацию ДНК и вступить в митоз, после чего они необратимо блокируются в метафазе (19;

53). Обнаружено, что продолжительность периода, в течение которого инфицированные клетки сохраняют жизнеспособность, различается и зависит от стадии клеточного цикла в момент заражения (19;

195). Так, первые признаки гибели клеток, инфицированных в состоянии покоя с высокой МИ (1 БОЕ/кл.), отмечаются уже в течение первых суток после заражения ЦМВ, а через 48-72 часа течения инфекции погибает около 50% клеток популяции. При инфицировании пролиферирующих клеток с такой же МИ клетки сохраняют жизнеспособность в течение, по крайней мере, 5-6 дней (19). Эти данные позволяют предположить, что негативная регуляция клеточной пролиферации и снижение жизнеспособности клеток под действием ЦМВ связана с индукцией процессов апоптоза в инфицированных фибробластах. Возможно, что активация программированной клеточной смерти зависит от пролиферативного состояния клеток в момент заражения. В связи с этим представляло интерес изучить экспрессию ряда проапоптозных и апоптозных клеточных генов и белков, выявить характерные маркеры программированной клеточной гибели в динамике инфекционного процесса в ЦМВ-инфицированных фибробластов человека, находящихся в момент заражения в различных пролиферативных состояниях. Для сравнительного анализа влияния ЦМВ на гибель клеток, находящихся в момент заражения в различных фазах клеточного цикла, была проведена серия экспериментов с фибробластами, синхронизированными в стадиях Gо и S. Клетки, зараженные в состоянии покоя (Gо), были разделены на две популяции. В одну из клеточный культур после адсорбции вируса вносили свежую ростовую среду с 15% ЭТС. Другую популяцию ФЛЭЧ после заражения ЦМВ культивировали в среде с 0,2% ЭТС. Начиная с 3-х часов после заражения вплоть до гибели клеток, прослеживали морфологические изменения в инфицированных культурах. Сравнительный анализ показал, что вирусное ЦПД наиболее эффективно развивается в клетках, зараженных в стадии G с последующей стимуляцией сывороточными ростовыми факторами (рис.7). В этой же культуре гибель клеток была зарегистрирована раньше (5-е сутки после заражения), чем в других инфицированных популяциях (рис.8). В клетках, инфицированных в состоянии покоя, но без последующей стимуляции к делению, гибель всех фибробластов наблюдалась на 7-е сутки инфекции, а в популяции, клетки которой находились в момент заражения в S-фазе, - только на 10 сутки после адсорбции вируса. Полученные данные согласуются с ранее опубликованными результатами, свидетельствующими о более быстром наступлении развития вирусного ЦПД в покоящихся инфицированных фибробластах по сравнению с пролиферирующими (195). Однако в этом исследовании не было прослежено развитие ЦПД на протяжении всего инфекционного периода и не были определены сроки гибели зараженных клеток. Кроме того, авторы не исследовали клетки, зараженные в состоянии покоя и не стимулированные ростовыми факторами, то есть в состоянии наиболее приближенном к физиологическим условиям взрослого организма. Использование пропидием и метода прижизненного синим окрашивания что йодистым от трипановым показало, независимо пролиферативной активности и при любом варианте заражения в клетках, инфицированных ЦВМ, не нарушается целостность цитоплазматической мембраны на протяжении всего периода исследования. Даже в терминальной стадии инфекции на 5-е, 7-е и 10-е сутки после заражения соответствующих клеточных популяций не более 12% клеток окрашивались прижизненными красителями. обнаружило фрагментации Изучение апоптозные клеток на морфологии тельца, мембранные открепившихся везикулы фибробластов продукты представляющие собой с внутриклеточным содержимым (рис. 9). Таким образом, исследование морфологии и жизнеспособности ЦМВинфицированных фибробластов показало, что в культуре ФЛЭЧ, инфицированной в состоянии покоя с последующей стимуляцией сывороточными ростовыми факторами, быстрее развивается вирусное ЦПД и раньше наступает гибель клеток (5-е сутки после заражения) по сравнению с другими исследованными популяциями. Наименее эффективно ЦПД развивается в клетках, находящихся в момент заражения в стадии синтеза ДНК, и гибель этих клеток зарегистрирована позднее - на 10-е сутки течения инфекции. Анализ целостности мембран инфицированных фибробластов позволяет заключить, что под действием ЦВМ клетки погибают путем апоптоза независимо от пролиферативного состояния клеток в момент заражения. Мы предположили, что зарегистрированные различия в эффективности развития ЦПД и сроках гибели клеток связаны с разной степенью экспрессии вирусных белков в исследуемых культурах. Для проверки этого предположения выявляли наличие сверхраннего (IE1-р72), раннего (pp65) и позднего (gB) вирусных белков в инфицированных клетках. Сверхранние, ранние и поздние белки наиболее эффективно экспрессировались в фибробластах, инфицированных в покое с последующей стимуляцией ростовыми факторами. Уже через 3 часа после инфицирования 68% и 50% клеток культуры содержали белок IE1-p72 и рр65, соответственно, а через 6 часов более 16% клеток синтезировали gB (рис. 11а). В клетках ФЛЭЧ, находящихся в момент заражения в Gо и не стимулированные 15%ЭТС, динамика накопления IE1-p72 и рр65 не отличались от таковой в предыдущей культуре. Однако задерживался синтез позднего глипопротеина. Через 6 часов после заражения количество клеток, содержащих gB, в этой популяции было в 20 раз меньше, чем в первой популяции и не превышало 0,2% (рис. 11б). Наименее эффективный синтез вирусных белков наблюдался в фибробластах, инфицированных в состоянии пролиферации. В этой культуре клетки, содержащие белки IE1-p72, рр65 и gB, были выявлены через 3 часа, 6 часов и 24 часа после проникновения вируса и их доля составляло 1,4%, 1,4% и 7%, соответственно (рис.11в).

Полученные данные свидетельствуют, что степень проявления патологического действия ЦМВ на клетки находится в зависимости от динамики накопления вновь синтезированных вирусных белков. Быстрая инициация синтез сверхранних белков ЦМВ в покоящихся клетках отмечалась ранее другими авторами (90). Опубликованные результаты динамики выявления IE белков совпадают с данными, полученными в этой работе. Эффективная экспрессия вирусных белков в покоящихся клетках, у которых недостаточное количество компонентов, необходимых для синтез вирусных белков и для репликации вирусной ДНК, связана со способностью ЦМВ активировать клеточные факторы, необходимые для осуществления белкового и нуклеинового синтеза и индуцировать вхождение покоящихся клеток в S-фазу клеточного цикла (125;

128). Сходная динамика накопления IE и E белков в клетках, инфицированных в состоянии покоя с последующей стимуляцией 15% ЭТС и без стимуляции, позволяет высказать предположение о том, что степень индукции внутриклеточных процессов под влиянием ЦМВ настолько высока, что введение дополнительных стимулов в виде сывороточных факторов не приводит к увеличению скорости синтеза вирусных белков. Однако в культуре без стимуляции наблюдается отставание во времени появления позднего белка gB, являющегося индикатором репликаци вирусной ДНК. Вероятно, при внесении 15% сыворотки вводятся дополнительные факторы, способствующие синтезу вирусной ДНК. Существенные различия в сроках синтеза вирусных белков в пролиферирующих клетках можно объяснить несовместимостью репликации клеточной ДНК и синтеза сверхранних белков ЦМВ, как было установлено Fortunato E.A. с соавторами (90). Авторами были получены данные, свидетельствующие о том, что инициация репликации клеточной ДНК предотвращает экспрессию сверхранних генов ЦМВ. В свою очередь, отсроченный синтез IE белков, необходимый для начала репликативного цикла вируса, влечет за собой выявленное отставание экспрессии ранних и поздних вирусных белков в фибробластавх, инфицированных в стадии синтеза ДНК (S-периоде). Неожиданные результаты были получены при определении продукции инфекционно активного вируса в исследуемых культурах. Время появления вновь синтезированных эффективно вирионов и их в количество, покоящихся выраженное клетках, в не бляшкообразующих единицах в 1 мл, свидетельствует о том, что ЦМВ наиболее реплицируется стимулированных ростовыми факторами (рис. 12). Титр вируса в ВСЖ от этой культуры составил 7,2 lg. В то время как продукция вируса в фибробластах, инфицированных в Gо с последующей стимуляцией и зараженных в состоянии пролиферации, не превышала 5,2 lg и 4,2 lg, соответственно. Можно предположить, что в культуре, инфицированной в Gо и культивируемой с 15% ЭТС, экспрессия белков и синтез вирусной ДНК протекает столь интенсивно, что это приводит к нарушению процессов формирования полноценных вирионов, и вероятно, ВСЖ содержит значительную долю дефектных вирусных частиц. В культуре активно пролиферирующих фибробластов низкая продукция вируса может быть связана конкуренцией между синтезом вирусных и клеточных макромолекул, которая возникают вследствие того, что вирус использует репликативный механизм клетки (166). Подтверждением этого являются полученные нами результаты динамики накопления вирусных белков. Полученные данные позволяют заключить, что репликация ЦМВ зависит от пролиферативного состояния клеток в момент заражения. Максимальная продукция наблюдается в покоящихся фибробластах, в клетках наиболее приближенных по внутриклеточным процессам к клеткам взрослого организма. Возможно, что этот результат является еще одним свидетельством приспособления репликативного цикла вируса к внутриклеточному окружению in vivo. Гибель ЦВМ-инфицированных клеток может реализовываться через различные механизмы регуляции клеточных белков и может являться результатом подавления экспрессии проапоптозных белков и/или индукцией функциональной активности антиапоптозных белков. В связи с этим, представило интерес изучить экспрессию ряда белков и генов, кодирующих белки, участвующие в регуляции процессов гибели клеток и обладающих как проапоптозными, так и апоптозными свойствами. Известно, что в ЦМВ-инфицированных клетках Fas-индуцируемый апоптоз ингибируется посредством связывания вирусного белка vICA с прокаспазой-8 (202). В тоже время, было установлено, что ЦМВ может использовать другой подход для предотвращения гибели клетки-хозяина, а именно, снижение транскрипционной активности гена fas и экспрессии FasAg на поверхности инфицированных клеток (70;

216). Для того, чтобы выяснить, различается ли модуляция активности гена fas под влиянием ЦМВ в клетках, инфицированных в покое и в стадии синтеза ДНК, был определен уровень мРНК гена fas полуколичественным вариантом ОТ-ПЦР. Интересные данные были получены при сравнительном анализе конститутивного уровня мРНК Fas-Ag в фибробластах, находящихся в состоянии G0 и в фазе синтеза ДНК (рис. 13). Оказалось, что транскрипционная активность гена fas в пролиферирующих клетках не менее чем в 100 раз превышает таковую в покоящихся фибробластах. Различие в конститутивном уровне мРНК в пролиферирующих и покоящихся клетках, очевидно, представляет собой колебание физиологического уровня экспрессии гена fas. Возможно, что в делящихся клетках транскрипция гена fas индуцируется под действием ядерного фактора NF-kB, активность которого повышается под влиянием митогенных стимулов (64). Кроме того, в пролиферирующих клетках активированы транскрипционные факторы семейства E2F, в том числе E2F1, который стабилизирует и активирует белки р53 и р73 (116). Повышение уровня р53 и р73 сопровождается индукцией транскрипционной активности гена fas и увеличением экспрессии Fas-Ag на клеточной поверхности (117;

216).

Под влиянием ЦМВ регуляция активности гена fas была не однонаправленной. В пролиферирующих клетках вирус индуцировал транскрипцию Fas, а в фибробластах, инфицированных в состоянии G0 с последующей стимуляцией ростовыми факторами, подавлял, как было установлено по уровню мРНК через 48 часов после заражения (рис. 13). Совокупность имеющихся в литературе данных свидетельствует о том, что при ЦМВИ, с одной стороны, повышается внутриклеточный уровень белка р53 и стимулируется активность транскрипционных факторов NF-kB и E2F, приводящих к увеличению экспрессии гена fas. С другой стороны, вирусные белки подавляют транскрипционную активность белка р53 и увеличивают активацию N-p73, который ингибирует функции белка р73 и, следовательно, р73-зависимую индукцию экспрессии гена fas (216). Вследствии этого вновь синтезированные белки ЦМВ способны негативно регулировать р53 и р73 индукцию экспрессии гена fas. Возможно, что в фибробластах, инфицированных в покое, эффективное накопление вирусных белков способно нейтрализовать активирующий эффект транскрипционных факторов NF-kB и E2F и подавлять активность гена fas. Полученные данные совпадают с результатами других авторов о достоверном снижении уровня мРНК Fas-Ag в ЦМВ-инфицированных клетках эпителия и нейробластомы через 48 часов после заражения (33;

216;

70). В клетках, инфицированных в S-фазе, синтез вирусных белков менее эффективен и, вероятно, на момент исследования содержание вирусных белков не достаточно для подавления активирующего действия NF-kB и E2F1 и ингибирования активности белков р53 и р73. В результате в клетках, инфицированных в стадии синтеза ДНК, транскрипционная активность гена Fas более чем в 10 раз выше по сравнению с контрольными. Очевидно, что регуляция активности гена fas и экспрессии Fas-Ag на клеточной поверхности ЦМВ-инфицированных клеток играет существенную роль в реализации цитотоксической активности эффекторных клеток иммунной системы. Предполагают, что вирусиндуцированное снижение рецептора Fas на поверхности зараженнх клеток является одним из механизмов латенции ЦМВ. Вместе с тем, обнаруженное нами повышение транскрипционной активности гена fas при заражении пролиферирующих клеток может быть причиной разнообразных эмбриопатических изменений в активно делящихся клетках плодов и новорожденных. Таким образом, полученные результаты указывают на то, что при ЦМВИ активность гена Fas модулируется как при заражении покоящихся, так и пролиферирующих клеток. Однако в клетках, находящихся в момент заражения в состоянии покоя, ЦВМ негативно регулирует транскрипционную активность гена fas, в отличие от регуляции в клетках, инфицированных в фазе синтеза ДНК, по крайней мере, в течение 48 часов после заражения. Трансмембранный белок Bcl-2 играет ключевую роль в ингибировании митохондриального пути развитии апоптоза и защищает клетку от широкого спектра цитотоксических агентов (76). Имеются немногочисленные данные о влиянии ЦМВИ на экспрессия Bcl-2. Ряд авторов обнаружили увеличение антиапоптозного белка в ЦМВ-инфицированных клетках эндотелия, аденокарциномы и нейробластомы (40;

72;

113). C другой стороны, при исследовании несколько типов мононуклеарных клеток перифрической крови было установлено, что уровень Bcl-2 не изменяется или снижается под действием ЦВМ (123). Изучение Bcl-2 в диплоидных фибробластах человека до настоящей работы не проводилось. Вероятно, это связано с существующей точкой зрения о том, что в ЦМВ-инфицированных клетках антиапоптозную функцию клеточного белка Bcl-2 осуществляет белок вируса vMIA (101). Однако в настоящее время установлено, что вирусный митохондриальный ингибитор апоптоза взаимодействует только с белком Bax, в то время как Bcl-2 обладает способностью ингибировать проапоптозную активность целого ряда белков (Bak, Noxa, Puma, Bim и другие), участвующих в пермеабилизации митохондриальных мембран (76).

В связи с этим представляло интерес выяснить влияние ЦМВ на экспрессию Bcl-2 в фибробластах человека. Определение белка Bcl-2 с помощью иммуноцитохимического окрашивания показало, что заражение вирусом цитомегалии индуцирует синтез антиапоптозного белка в клетках ФЛЭЧ (рис. 14). Наиболее эффективно накопление белка происходило в клетках, инфицированных в состоянии Gо с последующей стимуляцией ростовыми факторами. В этой культуре уже через 12 часов после заражения около 90% клеток содержали Bcl-2. В культурах, зараженных в стадиях Gо без последующей стимуляции и в S-периоде, накопление Bcl-2 протекало медленнее. Однако почти все клетки в этих популяциях были окрашены МКА к Bcl-2 на 3-е и на 5-е сутки после абсорбции вируса, соответственно. Сравнительный анализ полученных данных позволил предположить, что на уровень экспрессии антиапоптозного белка Bcl-2 в ЦМВ-инфицированных клетках влияет эффективность синтеза вирусных белков. Более того, на основании полученных данных о том, что две культуры ФЛЭЧ, инфицированные в состоянии покоя, отличались только по динамике накопления позднего белка gB и продемонстрировали различную экспрессия Bcl-2, можно заключить, что уровень Bcl-2 зависит от синтеза поздних вирусных белков. В пользу клетках этого предположения свидетельствуют обработки результаты, полученные Cinatl J. с соавторами, о подавлении синтеза Bcl-2 в ЦМВ-инфицированных нейробластомы после ганцикловиром, являющимся ингибитором репликации вирусной ДНК и синтеза поздних вирусных белков (72). Определение мРНК bcl-2 с помощью полуколичественного варианта метода ОТ-ПЦР через 6-48 часов после заражения показало, что в ЦМВинфицированных фибробластах экспрессия белка Bcl-2 нарастает параллельно изменению транскрипционной активности гена. Так, в культуре, инфицированной в состоянии покоя с последующей стимуляцией 15% сывороткой, максимальное количество кДНК выявлялось, начиная с 12 часов после заражения (рис. 15). В этот же период в культуре было обнаружено 88% клеток, содержащих белок Bcl-2 (рис.14). В культуре, инфицированной в фазе S, обнаружение первых клеток, окрашенных при МКА к Bcl-2, сопровождалось стимуляцией транскрипционной активности гена. Интересные данные были получены исследовании транскрипционной активности гена bcl-2 в контрольных культурах. Было определено, что в клетках, находящихся в стадии Gо, конститутивный уровень кДНК Bcl-2 в 10 раз превышал установленный уровень в делящихся фибробластах (рис.15). Эти результаты согласуются с данными, полученными Leicht с соавтороми, о повышении уровня мРНК bcl-2 в фибробластах через 30 минут после удаления сыворотки (148). Вероятно, увеличение экспрессии гена bcl-2 играет защитную роль при индукции апоптоза лишением ростовых факторов. Стимуляция к делению покоящихся клеток сопровождалась снижением экспрессии гена, что очевидно обусловлено вхождением фибробластов в клеточный цикл. Выявленные колебания уровня мРНК bcl-2 в контрольных пролиферирующих клеток, возможно, связаны с изменением экспрессии гена при прохождением фибробластов различных фаз клеточного цикла. Однако для доказательства этого предположение требуется дополнительные исследования. Таким образом, под действием ЦМВ в фибробластах человека индуцируется транскрипция и трансляция гена Bcl-2. Наибольший в стимулирующий эффект проявляется в клетках, инфицированных состоянии покоя с последующей стимуляцией сывороточными ростовыми факторами. Можно заключить, что в ЦМВ-инфицированных фибробластах не менее двух белков могут препятствовать нарушению целостности митохондриальных мембран в процессе программированной гибели клеток: один из них вирусный белок vMIA, другой – клеточный Bcl-2, экспрессия которого индуцируется ЦМВ. Среди апоптогенных факторов важную роль играет цитохром С, высвобождении которого из межмембранного простанства митохондрий совместно с другими проапоптозными белками запускает протеолитическую активацию цистеиновых каспаз, к которым относится каспаза-3 (115). Выявление этих маркеров апоптоза в трех исследуемых популяциях инфицированных фибробластов обнаружило общую закономерность. Цитоплазматическая локализация цитохрома С и последующая активация каспазы-3 быстрее проявлялись в клетках, инфицированных в состоянии Gо и стимулированных 15% ЭТС. В клетках ФЛЭЧ, инфицированных в покое не стимулированных ростовыми факторами, увеличение количество клеток, содержащих проапоптозные маркеры, задерживалось относительно этих показателей в первой популяцией. Наиболее замедленная динамика обнаружения маркеров наблюдалась в клетках, находящихся в момент заражения в S-фазе. (рис. 16, 17). Полученные результаты о накоплении клеток с цитоплазматической локализацией цитохрома С и активированной каспазой-3 коррелируют с кинетикой гибели инфицированных фибробластов и зависят от пролиферативной активности клеток в момент заражения и от присутствия митогенных факторов. Программированная гибель клеток сопровождается разрушением белков цитоскелета, являющихся субстратом эффекторных каспаз, к которым относится каспаза-3 (115). Обнаружение активация каспазы-3 в зараженных фибробластах побудило к изучению влияния вируса на фибриллярные и микротубулярные структуры клеток. Иммуноцитохимические исследование выявили нарушения организации микрофиламентов под действием ЦМВ, которые проявлялись в разрушении актиновых волокон (рис. 19). Во всех трех исследуемых популяциях, динамика накопления фибробластов с диффузным характером окрашивания фаллоидина совпадало с увеличением количества клеток, содержащих каспазу-3, (рис. 19 и 17). Известно, что микрофиламенты играют ключевую роль в поддержании клеточной структуры, в связи с этим дезорганизация волокон сопровождалась нарушением их морфологии (утрата веретеновидной формы, округление), откреплением от ростовой поверхности и гибелью ЦМВ-инфицированных фибробластов. Дезорганизация микрофиламентов в ЦМВ-инфицированных эмбриональных фибробластах человека отмечалась ранее другими авторами (150). Однако в этой работе не было прослежено взаимосвязи между активацией процессов программированой гибели клеток и нарушением целостности микрофиламентов. В отличие от актиновых волокон сеть микротрубочек достоверно не изменялось в зараженных клетках по сравнению с контрольными. Устойчивость микротубулярных структур к индукторам апоптоза ранее отмечалась другими авторами (80). Можно предположить, что в тубулиновых белках, входящих в состав микротрубочек экранированы и/или отсутствуют сайты протеолитического воздействия каспаз. Таким образом, под действием клеточного ЦМВ цитоскелета. разрушаются Динамика микрофибриллярные структуры дезорганизации актиновых волокон совпадает с активацией эффекторной каспазы-3 в инфицированных фибробластах и коррелирует с изменением морфологии клеток. Особый интерес представляют данные об отсутсвии межнуклеосомальных разрывов ДНК в фибробластах, зараженных вирусом. Даже в терминальной фазе инфекции количество клеток, положительно окрашенных с помощью метода TUNEL, не превышало 1-2%. Другие исследователи также не выявляли разрывы ДНК с помощью TUNEL в ЦМВ инфицированных клетках (70). Вместе с тем, было обнаружено, что ФНОиндуцированный апоптоз сопровождается высокой частотой обнаружения клеток ФЛЭЧ с нуклеосомными разрывами ДНК. Полученные данные свидетельствуют о том, что в исследуемых фибробластах человека могут реализовываться механизмы, приводящие к разрывам ДНК. Однако в условиях ЦМВИ процессы, приводящие к межнуклеосомным разрывам клеточной ДНК блокируются, что, вероятно, является способом защиты вируса от преждевременной гибели зараженных в клеток. Возможно, ингибирование межнуклеосомных разрывов ЦМВ-инфицированных клетках связано с вирусной индукцией экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), предотвращающего повреждение ДНК (85). Кроме того, взаимодействие вирусного сверхраннего белка IE1-p72 c хроматином и раннего вирусного белка рUL69 с клеточным полипептидом hSPT6, регулирующим структуру хроматина, могут стабилизировать ДНК инфицированных клеток (227). В тоже время известно, что ЦМВ приводит к выраженному генотоксическому эффекту в инфицированных клетках, проявляющемуся в виде конденсации хроматина одновременно с его фрагментацией, как было установлено при изучении интерфазных и митотических ЦМВ-ифицированных клеток различного происхождения (53;

87). Подтверждением опубликованных данных о фрагментации хроматина под действием ЦМВ является выявление нами апоптозных телец в культуре инфицированных фибробластов, а также обнаружение Bystrevskaya с соавторами патологических митозов с фрагментированными хромосомами (53) Важно отметить, что аномальные митотические клетки не были меченны с помощью TUNEL. Вероятно, при ЦМВИ повреждение хроматина обусловлено не межнуклеосомными разрывами активированных клеточных нуклеаз, а связано с участием дополнительных факторов, действие которых направлено на другие мишени. Имеются данные о том, что ядерный белок Acinus и апоптоз-индуцирующий фактор обладают способность индуцировать конденсацию хроматина и вызывать разрезание ДНК на большие фрагменты (194;

213). Однако роль этих белков в нарушении хроматина в ЦМВ-инфицированных фибробластах не определена. Таким образом, ЦВМ индуцирует повреждение хроматина, которе не связана с межнуклеосомальной фрагментацией ДНК. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что заражение ЦМВ запускает внутриклеточные механизмы апоптоза, одновременно положительно полноценной индуцируемых регулируя репликации процессов антиапоптозные и продукции в находится процессы вируса. для от достижения факторов, Эффективность зависимости контролирующих пролиферативную активность инфицированной клетки.

Наиболее выраженная активность большинства изученных про и антиапоптозных белков (Bcl-2, цитохрома С, каспазы-3) выявлена в клетках, инфицированных в состоянии покоя и стимулированных сывороточными ростовыми факторами. В клетках, находящихся в момент заражения в фазе синтеза ДНК, вирус-индуцированные опубликованных данных изменения и задерживаются и проявляются позднее. Анализ апоптоза в результаты в собственных от исследований позволили предложить гипотетическую модель регуляции ЦМВ-инфицированных фибробластах зависимости пролиферативного состояния клеток и присутствия ростовых факторов. Взаимодействие клеточных, вирусных и внеклеточных факторов представлено в схематической форме на рис. 21. Под воздействием митогенных стимулов в клетках, находящихся в состоянии пролиферативного покоя, повышается уровень транскрипции и трансляции гена белка р53 и индуцируется активность факторов транскрипции E2F, которые играют важнейшую роль в выходе клеток из состояния покоя и вступления в S-фазу клеточного цикла (98;

109). Вместе с тем, E2F1, относящийся к семейству белков E2F, обладает способностью индуцировать 167). апоптоз посредством что положительного свойства регулирования р53 и E2F-1 активности генов Araf-1, p53, p73 и ряда других проапоптозных белков (98;

Предполагают, проапоптозаные нейтрализуются действием ядерного фактора NF-kB и факторов роста (98;

109). В результате клетки вступает в цикл деления. При взаимодействии вируса с клеточной мембраной и проникновения его в клетку дополнительно стимулируются белки E2F1, NF-kB и р53 (168;

224;

230). Вновь синтезированные IE белки ЦМВ также положительно влияют на активность фактора E2F1 (89;

235). Очевидно, это приводит к Вирусные факторы Клеточные факторы Внеклеточные факторы Взаимодействие с плазмолеммой (gB);

проникновение в клетку (рр71) Ростовые факторы IE E2F рр71 Р53 IE и другие белки NF-kB vMIA Апоптоз Активирование Ингибирование Рис. повышенной экспрессии E2F1, которая запускает процесс апоптоза. Данные о том, что повышение экспрессии E2F1 индуцирует апоптоз получены Kowalik (137). T.F.с соавторами при изучении покоящихся Вероятно, антиапоптозные механизмы фибробластов, вновь инфицированных рекомбинантным аденовирусом, содержащим кДНК E2F1 запускаемые синтезируемыми вирусными vMIA и клеточными митохондриальными Bcl2 белками, а также внеклеточными ростовыми факторами не способны блокировать индукцию апоптоза. Вследствие этого при заражении фибробластов, находящихся в состоянии покоя с последующей стимуляцией сывороточными ростовыми факторами, наблюдается быстрая активация проапоптозных факторов и быстрая гибель клеток. В клетках, инфицированных в состоянии покоя, но не стимулированных 15% ЭТС, не происходит повышенной экспрессии E2F1 из-за отсутствия активирующего влияние ростовых факторов. Вследствие этого, процессы, приводящие к программированной клеточной гибели, индуцируются менее эффективно. В клетках, инфицированных в стадии синтеза ДНК, наличие митогенных стимулов и активация проапоптозных факторов при взаимодействии вируса с плазмолеммой, возможно, не достаточно для запуска апоптозных механизмов. Усиление проапоптозных механизмов гибели клетки начинается только после синтеза вирусных белков. Однако их экспрессия задерживается в клетках, находящихся в Sфазе (90). В результате проапоптозые и антиапоптозные процессы в клетках, инфицированный в состоянии активной пролиферации наступают позднее, чем в покоящихся клетках. Таким образом, совокупность полученных данных свидетельствует о зависимости ЦМВ-индуцированного апоптоза от пролиферативного состояния клеток. Для детального выяснения механизмов взаимосвязи деления и программированной гибели в клетках, инфицированных ЦМВ, необходимы дальнейшие исследования.

Выводы 1. Выявление ЦМВ в клинических образцах от новорожденных и детей раннего возраста показало, что наиболее информативным и чувствительным является быстрый культуральный метод. Частота выявления инфекционной активности ЦМВ составила 68% и оказалась более высокой, чем с помощью ПЦР (41%). 2. У недоношенных и маловесных новорожденных с клиническими симптомами перинатального инфицирования прямые маркеры ЦМВ выявляются значительно чаще, в 90% случаев. 3. Впервые установлено, что через 48 часов после заражения ЦМВ индуцирует транскрипционную активность гена fas в клетках, инфицированных в состоянии активной пролиферации. При заражении покоящихся клеток с последующей стимуляцией ростовыми факторами уровень мРНК гена fas снижается. 4. Впервые установлено, что в ЦМВ-инфицированных фибробластах повышается экспрессия мРНК антиапоптозного гена bcl-2 и белка Bcl-2. В клетках, инфицированных в состоянии пролиферативного покоя с последующей стимуляцией ростовыми факторами, повышенный уровень мРНК гена bcl-2 и белка Bcl-2 наблюдается через 6-12 часов, в то время как в клетках инфицированных в стадии синтеза ДНК, - через 48 часов. 5. Активация каспазы-3 и транслокация цитохрома С в большинстве ЦМВинфицированных фибробластов (90%) наблюдается на 3-е сутки при заражении клеток в состоянии покоя с последующей стимуляцией ростовыми факторами и на 7-е сутки при заражении клеток в фазе синтеза ДНК. 6. Заражение ДНК. 7. В ЦМВ-инфицированных фибробластах индукция процессов апоптоза зависит от пролиферативного состояния клеток в момент заражения. В фибробластах, инфицированных в состоянии пролиферативного покоя, программированная гибель клеток развивается достоверно быстрее, чем в делящихся клетках.

ЦМВ приводит к повреждению хроматина, при этом генотоксический эффект ЦМВ не связан с межнуклеосомальными разрывами СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 1. Аракелов С.А., Сонькина А.А., Мартынова В.Н., Исаченко В.А., Стаханова В.М Иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу цитомегалии (ЦМВ) // - В кн.: Герпесвирусные инфекции (диагностика и лечение). Под ред. Баринский И.Ф., Бикбулатова Р.М., М, 1990, С.82-86. 2. Виноградская Г.Р., Новикова Л.Н., Башмакова М.А. Оптимизация ПЦР для обнаружения цитомегаловируса в моче новорожденных. //Вопросы вирусологии.-1994.-Т.4.- С.171-174. 3. Гришаев М.П. Цитомегаловирусная инфекция и ее лабораторная диагностика. // Новости Вектор-Бест.- 1996.- №1. 4. Иванова Л.А., Мартынова В.Н., Чешик С.Г. и др. Диагностика различных форм цитомегаловирусной инфекции с помощью определения специфических антител класса IgM, IgG методом иммунофлюоресценции / В кн.: Герпесвирусные инфекции (диагностика и лечение). Под ред. Баринский И.Ф., Бикбулатова Р.М.- М. 1990.- С.77-81 5. Кудашов Н.И., Помелова В.Г., Зубков В.В. Клинико-иммунологические критерии диагностики герпесвирусной инфекции новорожденных. // Российский вестник перинатологии и педиатрии.- 1998.- №5.- С. 12-18. 6. Каражас Н.В. Цитомегаловирусная инфекция – типичный представитель оппортунистических инфекций. // Российские медицинские вести.- 1997.- №2.С.35-38. 7. Коровина Н., Заплатников А., Чебуркин А. и др. / Пособие для врачей. // Москва.-1999.- С.27-32. 8. Коровина Н.А., Заплатников А.Л., Чебуркин А.В. и др. Цитомегаловирусная инфекция у детей раннего возраста (Клиника, диагностика, современные возможности терапии). // Руководство для врачей.- М. Медпрактика-М. 2001.- С. 64. 9. Коченгина С.М., Теплова С.Н., Русанова Н.Н. и др. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей первых месяцев жизни. // ЖМЭИ.2000.- №2.- С.116-118.

10. Меджидова А.А. Выявление белков цитомегаловируса в клетках и тканях плодов и умерших детей. Патологическое действие цитомегаловируса на клеточный цикл и структуры митотического аппарата. // Автореф. кан. биол. наук. – М. 2002.- C. 25. 11. Меджидова А.А., Нисевич Л.Л., Федорова Н.Е. и др. Сравнение эффективности лабораторных методов выявления цитомегаловируса в аутопсийном материале // ЖМЭИ. – 2002. - Т.2. - С.63-69. 12. Меджидова М. Г, Федорова Н. Е., Кущ А. А. Повышение эффективности выявления инфекционно активного цитомегаловируса в клинических образцах. // Международный конгресс " Прогрессивные научные технологии для здоровья человека".- Феодосия.- 8-9 Июня 2003.- с 102-104. 13. Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., и др. Врожденные вирусные инфекции и маловесные дети. // Вопросы современной педиатрии.- 2002.- том 1.- №4.- С. 9-13. 14. Ожегов А.М., Мякишева Л.С. Распространенность цитомегаловирусной инфекции у детей. // Рос. педиатр. журнал.- 1999.- №3.- С. 16-18. 15. Самохин П.А. Цитомегаловирусная инфекция у детей. - М. Медицина.- 1987.С.160. 16. Сравнительная оценка специфических методов лабораторной диагностики цитомегаловирусной инфекции / Сонькина А.А., Мартынова В.Н., Иванова Л.А., Аракелов С.А., Стаханова В.М., Чешик С.Г. В кн.: Герпесвирусные инфекции (диагностика и лечение). Под ред. Баринский И.Ф., Бикбулатова Р.М.М.- 1990.- С.72-76. 17. Пустовойт Б., Герман Ф., Макарова Н. и др. / Динамика иммунного ответа при первичной ЦМВИ и при реактивации цитомегаловируса у больных после аллотрансплантации органов. // Вопросы вирусологии.- 2001.- №3.-С.23-29. 18. Соколова Т.М., Бибикова О.В., Быстров Н.С. и др. Экспрессия генов системы интерферона и клеточного апоптоза в пробах крови человека. // Вопросы вирусологии.- 2005.- Т.50.- Nо 1.- С.19-23.

19. Федорова Н.Е., Меджидова А.А., Меджидова М.Г., Кущ А.А. Блок клеточной пролиферации и патология митоза в клетках, инфицированных цитомегаловирусом: роль периода клеточного цикла в момент заражения. // ДАН.- 2003.- Т.392.- С.552-555. 20. Шабалдин А.В., Балянова Л.А., Казакова Л.М. и др. Применение полимеразной цепной реакции в диагностике внутриутробных инфекций у плодов и новорожденных. // Педиатрия.- 2000.- №3.- С. 38-41. 21. Шахгильдян В.И. Цитомегаловирусная инфекция. // Новый медицинский журнал.- 1997.- №2.- С. 2-6. 22. Шахгильдян В.И., Шипулина О.Ю., Каражас Н.В. и др. / Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов.// Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2001.-№1.- С.36-39. 23. Шипулина О.Ю., Шахгильдян В.И., Шипулин Г.А., и др. Полимеразная цепная реакция в диагностике цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов. // Вопросы вирусологии.- 1998.- №2.- С. 91-95. 24. Adair R, LiebischGW, Colberg-Poley AM. Complex alternative processing of human cytomegalovirus UL37 pre-mRNA. // J Gen Virol.- 2003.- V.84.- P.3353–3358. 25. Alcami, A., and U. H. Koszinowski. Viral mechanisms of immune evasion. // Trends Microbiol.- 2000.-V.8.- P.410-418. 26. Allart S, Martin H, Detraves C, et al. Human cytomegalovirus induces drug resistance and alteration of programmed cell death by accumulation of deltaN-p73alpha. // J Biol Chem.- 2002.-V.277.- P.29063–29068. 27. Anders DG, Kacica MA, Pari G, et al. Boundaries and structure of human cytomegalovirus oriLyt, a complex origin for lytic-phase DNA replication. // J. Virol.1992.-V.66.- P.3373–3384. 28. Anders DG, McCue LA. The human cytomegalovirus genes and proteins required for DNA synthesis. // Intervirology.- 1996.- V.39.- P.378–388.

29. Andoniou CE, Andrews DM, Manzur M, et al. A novel checkpoint in the Bcl-2regulated apoptotic pathway revealed by murine cytomegalovirus infection of dendritic cells. // J Cell Biol.- 2004.- V.166.- P.827–837. 30. Arase H, Mocarski ES, Campbell AE, et al. Direct recognition of cytomegalovirus by activating and inhibitory NK cell receptors. // Science.- 2002.- V.296.- P.1323–1326. 31. Arnoult D, Bartle LM, Skaletskaya A, et al. Cytomegalovirus cell death suppressor vMIA blocks Bax- but not Bak mediated apoptosis by binding and sequestering Bax at mitochondria. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2004.- V.101.- P.7988–7993. 32. Baccard-Longere M., Freymuth F., Cointe D., et al. Multicenter evaluation of a rapid and convenient method for determination of cytomegalovirus immuniglobulin G avidity // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunilogy. – 2001. - V.8. - P.429-431. 33. Baillie J, Sahlender DA, Sinclair JH. Human Cytomegalovirus Infection Inhibits Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-alpha) Signaling by Targeting the 55-Kilodalton TNF-alpha Receptor. // J Virol.- 2003.- V.77.- P.7007–7016. 34. Baldick, C. J. and Shenk, T. Proteins associated with purified human cytomegalovirus particles. // J Virol.- 1996.- V.70.- P.6097– 6105. 35. Balint E., Vousden K.H. Activation and activities of the p53 tumor suppressor protein. // British Journal of Cancer.- 2001.- V.85.- P.1813-1823. 36. Barbi M., Binda S., Caroppo S., et al. A wider role of congenital cytomegalovirus infection in sensorineural hearing loss // Pediatr. Infec. Dis. – 2003. - V.22. - P.39-42. 37. Beg AA, Baltimore D. An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alphainduced cell death. // Science.- 1996.- V.274.- P.782–784. 38. Benco D.M., Gibson W. Primate cytomegalovirus glycoproteins lectin-binding properties and sensitivities to glycosidases. // J. Virol.-1986.-V.59.-P.703-713. 39. Biliran H., Wang Y., Banerjeev S., et at. Overexpression of cyclin D1 promotes tumor cell growth and confers resistance to cisplatin-mediated apoptosis in an elastase-myc transgene-expressing pancreatic tumor cell line. // Clin Cancer Res.- 2005.- V.11(16).P.6075-6086.

40. Billstrom Schroeder M, Christensen R, Worthen GS. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. // J Clin Virol.2002.- V.25.- P.149–157. 41. Bitsch A., Kirchner H., Dupke R., Bein G. Cytomegalovirus transcripts in peripheral blood leukocytes of actively infected transplant patients detected by reverse transcription polymerase chain reaction // J. Infect. Dis.-1993.-V.167.-P.740-743. 42. Bodeus M., Van Ranst M., Bernard P. et al. Anticytomegalovirus IgG avidity in pregnancy: prospective study // Fetal Diagnosis Therapy. – 2002. - V.17. - P.362-366. 43. Boeckh M, Huang M, Ferrenberg J, Stevens-Ayers T, Stensland L, Nichols WG, Corey L Optimization of quantitative detection of cytomegalovirus DNA in plasma by real-time PCR. // J Clin Microbiol.- 2004.- V.42.- No.3.- P.1142-1148. 44. Boeckh M., G. Boivin. Quantitation of cytomegalovirus: methodologic aspects and clinical applications // Clinical Microbiol. Rewiews.- 1998.- V.11.- No. 3.- P.533–554 45. Bold R.J., Termuhlen P.M., McConkey D.J. Apoptosis, cancer and cancer therary. // Surg, Oncol.- 1997.- V.6.- P.133-142. 46. Brandt J.A., Kettering J.D., Lewis J.E. Immunity to human cytomegalovirus measured and compared by complement fixation, indirect fluorescent-antibody, indirect hemagglutination and enzyme-linked Microbiol.-1984.- V.19.-P.147-152. 47. Braud V.M., Tomasec P., Wilkinson G.W. Viral evasion of natural killer cells during human cytomegalovirus infection. // Curr Top Microbiol Immunol.- 2002.- V.269.P.117–129. 48. Bresnahan W.A., Boldogh I., Thompson E.A., et al. Human cytomegalovirus inhibits cellular DNA synthesis and arrests productively infected cells in late G1. // Virilogy.1996.- V.224.- p.150–160. 49. Bresnahan W. A., and Shenk T. UL82 virion protein activates expression of immediate early viral genes in human cytomegalovirusinfected cells. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000.- V.97.- P.14506– 14511. 50. Britt W.J., Auger D. Synthesis and processing of the envelope gp55-116 complex of human cytomegalovirus. // J. Virol.- 1986.-V.58.-P.185-191.

immunosorbent assays.

// J.

Clin.

51. Britt WJ, Mach M. Human cytomegalovirus glycoproteins. // Intervirology.- 1996.V.39.- p.401–412. 52. Browne E.P., Shenk T. Human cytomegalovirus UL83-coded pp65 virion protein inhibits antiviral gene expression in infected cells. // Proc Natl Acad Sci.- 2003.V.100.-No.20.- P.11439-11444. 53. Bystrevskaya V. B., Lobova T. V., Smirnov V. N., et al. Centrosome injury in cells infected with human cytomegalovirus. // J. Struct. Biol.- 1997.- V.120.- P.52–60. 54. Caliendo A. M., Yen-Leberman B., Babtista J., et al. Comparison of Molecular Tests for Detection and Quantification of Cell-Associated Cytomegalovirus DNA. // J. Cl. Microbiology.- 2003.- V.41.- No.8.- P. 3508-3513. 55. Caliendo A.M., Kirsten G.St., Allega J. et al. Distinguishing Cytomegalovirus (CMV) Infection and Disease with CMV Nucleic Acid Assays. // Journal of Clinical Microbiology, May 2002, p. 1581-1586, Vol. 40, No. 56. Campbell K.J., Rocha S., Perkins N.D. Active repression of antiapoptotic gene expression by RelA(p65) NF-kappa B. // Mol Cell.- 2004.- V.13.- P.853–865. 57. Castillio J. P., Kowalika, T. F. / HCMV infection modulating the cell cycle and cell death. // International Reviews of Immunology.-2004.- V.23.- P. 113-139. 58. Castillio J. P., Kowalika, T. F. Human cytomegalovirus immediate early proteins and cell growth control. // Gene.- 2002.- V.290.- P.19–34. 59. Castillo J.P., Yurochko A.D., Kowalik T.F. Role human cytomegalovirus immediateearly proteins in cell growth control. // J.Virol.- 2000.- V.74.- P.8028-8037. 60. Castillo JP, Kowalik TF. HCMV infection: Modulating the cell cycle and cell death. // Int Rev Immunol.- 2004.- V.23.- p.113–139. 61. Cattaneo E, Zavattoni M, Baldanti F, et al. Diagnostic value of viral culture, polymerase chain reaction and western blot for HIV-1 infection in 218 infants born to HIV-infected mothers and examined at different ages. // New Microbiol.- 1999.V.22.- No.4.- P.281-91. 62. Cebulla C.M., Miller D.M., Zhang Y. et al. Human cytomegalovirus disrupts constitutive MHC class II expression. // J. Immunol.- 2002.- V.169.- P.167-176.

63. Chee, M. S., Bankier A.T., Beck S. et al. Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD169. // Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 1990-. V.154.- P.125–170. 64. Chen F., Castranova V., Shi X. New insights into the role of nuclear factor-kB in cell growth regulation. // American Journal of Pathology.- 2001.- V.159.- P.387-397. 65. Cheng EH, Wei MC, Weiler S, et al. BCL-2, BCL-X(L) sequester BH3 domain-only molecules preventing BAX- and BAK-mediated mitochondrial apoptosis. // Mol Cell 2001.- V. 8.- P.705–711. 66. Cherrington J.M., Khoury E.L., Mocarski E.S. Human cytomegalovirus ie2 negatively regulates alpha gene expression via a short target sequence near the transcription start site. // J.Virol.-1991.-V.65.-P.887-896. 67. Child S. J., Hakki M., De Niro K. L. et al. Evasion of cellular antiviral responses by human cytomegalovirus TRS1 and IRS1. Journal of virology., 2004.- V.78.- № 1.- P. 197-205 68. Chin K.C., Cresswell P. Virepin (cig5), an IFN-inducible antiviral protein protein directly induced by human cytomegalovirus. // Proc. Natl. Acad. Sci.- 2001.- V.98(26).- P.15125-15130. 69. Chio S.H., Liu J.H., Chen S. et al. Apoptosis of human retina abd retinal pigment cells induced by human cytomegalovirus unfection. // Ophthalmic Res.- 2002.- V.34, P.7782. 70. Chiou S.H., Liu J.H., Hsu W.M., et al. Up-regulation of Fas ligand expression by human cytomegalovirus immediate-early gene product 2: a novel machanism in cytomegalovirus-induced apoptosis in human retina. // J. Immunology.- 2001.V.167.- P. 4098-4103. 71.Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal. biochem.- 1987.- V.162.- P.156159. 72.Cinatl J.Jr., Cinatl J., Vogel J.U., et al. Persistent human cytomegalovirus infection induces drug resistance and alteration of programmed cell death in human neublastoma cells. // Cancer Res.- 1998.- V.15.- P.367-372.

73. Colberg-Poley AM, Patel MB, Erezo DP, et al. Human cytomegalovirus UL37 immediate-early regulatory proteins traffic through the secretory apparatus and to mitochondria. // J Gen Virol.- 2000.- V.81.- P.1779–1789. 74. Colberg-Poley AM. Functional roles of immediate early proteins encoded by the human cytomegalovirus UL36-38, UL115-119, TRS1/IRS1 and US3 loci. // Intervirology.- 1996.- V.39.- 350–360. 75. Compton T. An Immortalized human fibroblasts cell line is permissive for human cytomegalovirus infection. // J. Virol.-1993.-V.67.-P.3644-3648. 76. Cory S, Huang DC, Adams JM. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. // Oncogene.- 2003.- V.22(53).- P.8590-607. 77. Datts S.R., Brunet A., Greenberg M.E. Cellular survival: a play in tree Akts. // Genes. Dev.- 1999.- V.13.- P.2905-2927. 78. Deng Y,Wu X. Peg3/Pw1 promotes p53-mediated apoptosis by inducing Bax translocation from cytosol to mitochondria. // Proc Natl Acad Sci.- 2000.- V.97.P.12050–2055. 79. Distfano A.L., Alonso A., Fabin Martin et al. Human Cytomegalovirus: detection of congenital and perinatal infection in Argentina. // BMC Pediatrics.- 2004.- 4:11 doi:10.1186/1471-2431-4-11 80. Domnina L.V., Ivanova O.Y., Cherniak B.V. et al. Effects of the ingibitors of dynamics of cytosceletal structures on the development of apoptosis induced by the tumor necrosis factor. // Biokhimiya.- 2002.- V.67 81. Donner C., Leisnard C., Content J., et al. Prenatal diagnosis of 52 pregnancies at risk for congenital cytomegalovirus infection // Obstet. Gynecol. – 1993. - V.82. - P.481486. 82. Erster S, Mihara M, Kim RH, et al. In vivo mitochondrial p53 translocation triggers a rapid first wave of cell death in response to DNA damage that can precede p53 target gene activation. // Mol Cell Biol.- 2004.- V.24.- P.6728–6741.

83. Ertl P.F., Powell K.L. Physical and functional interaction of human cytomegalovirus DNA polymerase and its accessory protein(ICP36) expressed J.Virol.-1992.-V.66.-P.4126-4133. 84. Foghsgaard L, Jaattela M. The ability of BHRF1 to inhibit apoptosis is dependent on stimulus and cell type. // JVirol.- 1997.- V.71.- P.7509–7517. 85. Fortunato EA, Spector DH. p53 and RPA are sequestered in viral replication centers in the nuclei of cells infected with human cytomegalovirus. // J Virol.- 1998.- V.72.P.2033–2039. 86. Fortunato, E. A., Spector, D. H. Regulation of human cytomegalovirus gene expression. // Adv Virus Res.- 1999.- V.54.- P.61–128. 87. Fortunato, E. A., and D. H. Spector. Viral induction of site-specific chromosome damage. // Rev. Med. Virol.- 2003.- V.13.- P.21–37. 88. Fortunato, E. A., McElroy, A. K., Sanchez V., et al. Exploitation of cellular signalling and regulatory pathways by human cytomegalovirus. // Trends Microbiol.- 2000.V.8.- P.111 – 119. 89. Fortunato, E. A., Sommer, M. H., Yoder, K., et al. Identification of domains within the human cytomegalovirus major immediate-early 86-kilodalton protein and the retinoblastoma protein required for physical and functional interaction with each other. // J Virol 1997.- V.71.- P.8176– 8185. 90. Fortunato, E. A., Sanchez V., Yen J.Y. et al. Nnfection of cells with cytomegalovirus during S phase resalts in a blockade to immediate-early gene expression that can be overcome by inhibition of the proteasome. J Virol 2002.- V.76.- No11.- P.5369-5379. 91. Fowler R.B., Stagno S., Pass R.F., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status // N. Engl. J. Med. – 1992. - V.326. P.663-667. 92. Francisci D, Tosti A, Baldelli F, et al. The pp65 antigenaemia test as a predictor of cytomegalovirus-induced end-organ disease in patients with AIDS. // AIDS.- 1997.V.11.- P.1341-1345. in insert cells. // 93. Furman M.H., Ploegh H.L., Tortorella D. Membrane-specific, host-derived factors are required for US2and US11-mediated degradation of binding maojr histocompatibility complex class I molecules. // P.3258-3267. 94. Furnari B.A., Poma E., Kowalik T.E., et al. Human cytomegalovirus immediateearly gene 2 protein interacts with itself and with several novel cellular proteins // - J. Virol..-1993.-V.67.-P.4981-4991. 95. Gaytant M.A., Steegers E.A., Semmekrot B.A., et al. Congenital cytomegalovirus infection: review of the epidemiology and outcome // Obstet. Gynecol. Surv. – 2002. V.57. - P.245-256. 96. Gibson W. Structural and nonstructural proteins of strain Colburn cytomegalovirus. // Virology.-1981.- V.111.-P.516-537. 97. Gibson W. Structure and assembly of the virion. / /Intervirology.- 1996.- V.39.P.389-400. 98. Gilberg M.J., Riddell S.R., Plachter B., Greenberg P.D. Cytomegalovirus selectively block antigen processing and presentation of its immediate–early gene prudact, Nature, 1996, V.383, P.720-722. 99. Gleaves C.A., Hursh D.A., Meyers J.D. Detection of human cytomegalovirus in clinical specimens by centrifugation culture with Clin. Microbiol.-1992.-V.30.-P.1045-1048. 100. Goldmacher V.S. Cell death suppression by cytomegalovirusrs. // Apoptosis.- 2005.V.10.- P.251-263. 101. Goldmacher VS, Bartle LM, Skaletskaya A, et al. A cytomegalovirus-encoded mitochondria-localized inhibitor of apoptosis structurally unrelated to Bcl-2. // Proc Natl Acad Sci.- 1999.- V.96.- 12536–12541. 102. Goldmacher VS. Cell death suppressors encoded by cytomegalovirus. // Prog Mol Subcell Biol.- 2004.- V.36.- P.1–18. 103. Grangeot-Keros L., Cointe D. Diagnosis and prognostic markers of HCMV infection // J. Clin. Virol. – 2001. - V.21. - P.213-221.

J. Biol. Chem.- 2002.- V.277. a nonhuman cell-line. // J.

104. Grefte A., Blom N., Van Der Giessen M., et al. Ultrastructural analysis of circulating cytomegalic cells in patients with active cytomegalovirus infection: evidence of virus production and endothelial origin. // J. Infect. Dis.- 1993.- V.168.- P.1110-1118 105. Gretch D.R., Gehrz R.C., Stinski M.F. Characterization of a human cytomegalovirus glycoprotein complex (gcII). // J. Virol.-1988.-V.69.- P.1205-1215. 106. Gretch, D.R., Kari, B., Rasmussen, L., et al. Identification and characterization of three distinct families of glycoprotein complexes in the envelopes of human cytomegalovirus. // J Virol.- 1988.- V.62.- P.875– 881. 107. Griffiths, P. D., Panjwani, D. D., Stirk, P. R., et al. Rapid diagnosis of cytomegalovirus infection in immunocompromised patients by detection of early antigen fluorescent foci. // Lancet.-1984.- P.1242–1245. 108. Guerra B, Lazzarotto T, Quarta S, et al. Prenatal diagnosis of symptomatic congenital cytomegalovirus infection. // Am J Obstet Gynecol.- 2000.- V.183(2).P.476-82. 109. Guo M., Hay B.A. Cell proliferation and apoptosis. // Current Opinion in Cell Biology.- 1999.- V.11.- P.745-752 110. Hagemeier C., Walker S.M., Sissons P.J., et al. The 72K IE1 and 80K IE2 proteins of human cytomegalovirus independently trans-activate the c-fos, c-myc and hsp70 promoters via basal promoter elements // J. Gen. Virol.-1992.-V.73.-P.2385-2393. 111. Halwachs-Baumann G., Genser B., Pailer S., Engele H., Rosegger H.,Schalk A., Kessler H.H., Truschnig-Wilders M. Human cytomegalovirus load in various body fluids of congenital infected newborns. // J. Clin. Virol.- 2002.- V.25.- P.S81-87. 112. Hamzeh FM, Lietman PS, Gibson W, et al. Identification of the lytic origin of DNA replication in human cytomegalovirus by a novel approach utilizing ganciclovirinduced chain termination. // J Virol.- 1990.- V.64.- P.6184–6195. 113. Harkins L, Volk A.L., Samanta M, et al. Specific localisation of human cytomegalovirus nucleic acids and proteins in human colorectal cancer. // Lancet.2002.- V.360.- P.1557–1563.

114. Hayajneh WA, Colberg-Poley AM, Skaletskaya A, et al. The sequence and antiapoptotic functional domains of the human cytomegalovirus UL37 exon 1 immediate early protein are conserved in multiple primary strains. // Virology.- 2001.V.279.- P.233–240. 115. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis. // Nature.- 2000.- V.407(6805).P.770-776. 116. Hershko T., Chaussepied M., Oren M., Ginsberg D. Novel link between E2F and p53: proapoptotic cofactors of p53 are transcriptionally upregulated by E2F. // Cell Death and Differentiation.- 2005.- V.12.- P.377-383. 117. Hickman E.S., Moroni M.C., Helin K. The role of p53 and pRB in apoptosis and cancer. // Current Opinion in Genetics & Development.- 2002.- V.12.- P.60-66. 118. Honess R.W., Roizman B. Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis. I. Cascade regulation of the synthesis of three groups of virus proteins. // J. Virol.-1974.V.14.- P.8-19. 119. Horacek J., Brucek P., Otova B. Detection of nuclear cytomegalovirus antigen in cell-culture as compared to classical virus isolation. // Acta Virol.- 1991.- V.35.P.187-189. 120. Huang E.S., Kowalik T.F. The pathogenicity of human cytomegalovirus: an overview. - In book: Molecular aspects of human cytomegalovirus diseases, ed. by Becker Y., Darai G.- 1993.- P.3-45. 121. Huang E.S., Pagano J.S.. Nucleic acid hybridization technology and detection of proviral genomes. // Methods Virol.- 1977.-V.6.- P.457-497. 122. Irmiere A., Gibson W. Isolation of human cytomegalovirus intranuclear capsid, characterization of their protein consituents, and demonstration that the B-capsid assembly protein is also abundant in noninfectious enveloped particles // J. Virol.1985.- V.56.- P.277-283. 123. Ito M., Watanabe M., Ihara T., et al. Immunol.- 1995.- V.160.- P.173-177. Fas antigen and bcl-2 expression on lymphocytes cultured with cytomegalovirus and varicella-zoster virus antigen. // Cell 124. Iskenderian AC, Huang L, Reilly A, et al. Four of eleven loci required for transient complementation of human cytomegalovirus DNA replication cooperate to activate expression of replication genes. // J Virol.- 1996.- V.70.- P.383–392. 125. Jault M. F., Jault J.-M., F. Ruchti, et al. Cytomegalovirus infection induceshigh levels of cyclins, phosphorylated Rb, and p53, leading to cell cyclearrest. // J. Virol.1995.- V.69.- P.6697–6704. 126. Johnson D. C., Hegde N. R. Inhibition of the MHC class II antigen presentation pathway by human cytomegalovirus. // Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 2002.V.269.- P.101-115. 127. Kaiser l, Perrin L, Halaya K, et al. Improved monitoring of cytomegalovirus infection after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation by an ultrasensitive plasma DNA PCR assay. // J. Cl. Microbiology.- 2002.- V.40(1).- P. 4251-4255. 128. Kalejta R. F., Bechtel J.T., Shenk T., Mutations that abolish the ability of HCMV pp71 protein to induce DNA synthesis in quiescent cell do not affect its ability to accelerate G1 phase cell cycle progression. // J Virol.- 2003.- V.77.- P.3451-3459. 129. Kanich R.E., Craighead J.E. Human cytomegalovirus infection of cultured fibroblasts. II. Viral replicative sequence of a wild and an adapted strain. // Lab. Invest.-1972.-V.27.-P.237-282. 130. Kari B., Gertz R. Characterization of cytomegalovirus glycoproteins in a family of complexes designated gC-II with murine monoclonal antibodies. // Arch. Virol.1990.-V.112.-P.55-65. 131. Kari B., Gehrz R. A human cytomegalovirus glycoprotein complex designated gCII is a major heparin-binding component of the envelope. // J. Virol.-1992.-V.66.P.1761-1764. 132. Keisari, Y. A colorimetric microtiter assay for the quantitation of cytokine activity on adherent cells in tissue culture. // J. Immunol. Methods.- 1992.- V.146.-P.155-161. 133. Kim J., Kwon Y.J., Park E.S., et al. Human cytomegalovirus (HCMV) IE1 plays role in resistance to apoptosis with etoposide in cancer cell line by Cdk2 accumulation. // Microbiol Immunol.- 2003.- V.47.- P.959–967.

134. Kouzarides T., Bankier A.T., Satchwell S.C., et al. An immediate early gene of human cytomegalovirus encodes a potential membrane glycoprotein./ / Virology.1988.- V.165.- P.151–164. 135. Kovacs A., Weber M.L., Burns L.J, et al. Cytoplasmic sequestration of p53 in cytomegalovirus-infected human endothelial cells. // Am J Pathol.- 1996.- V.149.P.1531–1539. 136. Kovacs A.S., Churchill M.A., Wood D., et al. Molekular and epidemiologic evaluations of a cluster of cases of Menetrier’s disease associated with cytomegalovirus // Pediatrics Infectious Disease Journal (R).- 1993.- V. 12.- №12.- P. 1011-1014. 137. Kowalik T., DeGregori J., Schwarz J.K. 1995.-V.69.-P.2491-2500. 138. Kraat Y.J., Stals F.S., Chistiaans M.H., et al. IgM antibody detection for 38 (ppUL80a) and 150 (ppUL32) kDa proteins by immunoblotting: the earliest parameter for acute cytomegalovirus infection in renal transplant recipients. // J. Med. Virol. 1996. - V.48. - P.289-294. 139. Krueger A, Baumann S, Krammer PH, et al. FLICE nhibitory proteins: Regulators of death receptor-mediated apoptosis. // Mol Cell Biol.- 2001.- V.21.- P.8247–8254. 140. Kyritsis C., Gorbulev S., Hutschenreiter S., et al. Molecular mechanism and structural aspects of transporter associeted with antigen processing inhibition by the cytomegalovirus protein US6. // J.Biol. Chem.- 2001.- V.276.- P.48031-48039. 141. Landolfo S, Gariglio M., Gribaudo G., et al. The human cytomegalovirus. // Pharmacology & therapeutics.- 2003.- V.98.- P.269-297. 142. Landry M.L., Ferguson D. Comparison of quantitative cytomegalovirus antigenemia assay with culture methods and correlation with clinical disease. // J. Clin. Microbiol.-1993.- V.31.- P.2851-2856. 143. Lazzarotto T., Brojanac S., Maine G.T. et al. Search for cytomegalovirus-specific immunoglobulin M: comparison between a new western blot, conventional western E2F1 overexpression in quiescent fibroblasts leads to induction of cellular DNA synthesis and apoptosis. // J. Virol. blot, and nine commercially available assays. // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunilogy.- 1997.- V.4 (4).- P.483-486. 144. Lazzarotto T., Varani S., Gabrielli L., et al. New advances in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection // Intervirology. – 1999. - V.42. - P.390-397. 145. Lazzarotto T., Varani S., Guerra B., et al. Prenatal indicators of congenital cytomegalovirus infection // Journal of Pediatrics.- 2000.- V.137. No.1 146. Lee J.Y., Irmiere A., Gibson W. Primate cytomegalovirus assembly: evidence that DNA packaging occures subsequent to B-capsid assembly. // Virology.-1988.V.167.- P.87-96. 147. Lee S., Yoon J., Park B., et al. Structural and functional dissection of human cytomegalovirus US3 in binding maojr histocompatibility complex class I molecules. // J.Virol.- 2000.- V.72.- P.11262-11269. 148. Leicht M., Marx G., Karbach D., et al. Mechanism of cell death of rat cardiac fibroblasts induced by serum depletion. // Mol Cell Biochem.- 2003.- V.251.- P.119126. 149. Levrevo M., De Laurenzi V., Costanzo A., et al. The p53/p63/p73 famaly of transcription factors: overlapping and distinct functions. // J. Cell Science.- 2000.V.113.- P.1661-1670. 150. Lin M.F., Wei G.Q., et al. Huang H.,Human cytomegalovirus induces alteration of beta-actin mRNA and microfilaments in human embryo fibroblast cells. // J Zhejiang Univ Sci.- 2004.- V.5(6).- P.733-737. 151. Liu ZG, Hsu H, GoeddelDV, et al. Dissection of TNF receptor 1 effector functions: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-kappaB activation prevents cell death. Cell 1996;

87: 565–576 152. Lukas D.M., Manuppello J.R., Alwine J.C. Transcriptional activation by the human cytomegalovirus immediate-early proteins: reguirements for simple Virol.-1994.-V.68.-P5184-5193. promoter structures and interaction with multiple components or transcription complex. // J.

153. Maeda-Takekoshi F., Takekoshi M., Tanaka S.. Expression of the immediate early antigens of human cytomegalovirus is responsible for virus proliferation;

an intracellular immunization approach. // J. Exp. Clin. Med.- 1992.- V.17.- P.75-83. 154. Maeda-Takekoshi F., Takekoshi M., Tanaka S. Expression of the immediate early antigens of human cytomegalovirus is responsible for virus proliferation;

an intracellular immunization approach. //Tokai. J. Exp. Clin. Med.-1992.-V.17.-P.75-83. 155. Malinger G., Lev D., Zahalka N., et al. Fetal cytomegalovirus infection of the brain: the spectrum of sonographic findings // AJNR (Am. J. Neuroradiol.). – 2003. - V.24. P.28-32. 156. Margolis M.J., Pajovic S., Wong E.L., et al. Interaction of the 72-kilodalton human cytomegalovirus IE1 gene product with E2F1 coincides with E2F-dependent activation of dihydrofolate reductase transcription. // J Virol.- 1995.- V.69.- P.7759– 7767. 157. Maschmann J., Yamprecht K., Dietz K., et al. Cytomegalovirus infection of extremely low-birth weight infants via breast milk // Clinical Infection Deseases, 2001.- V.33.- P.1998-2003. 158. Masse M.J., Messerle M., Mocarski E.S.. The location and sequence composition of the murine cytomegalovirus replicator (oriLyt). // Virology.-1997.-V.230.- P.350– 360. 159. Mavinakere M.S., Colberg-Poley A.M. Dual targeting of the human cytomegalovirus UL37 exon 1 protein during permissive infection. // J Gen Virol.2004.- V.85.- P.323–329. 160. McCormick A.L., Smith V.L., Chow D., et al. Disruption of mitochondrial networks by the human cytomegalovirus UL37 gene product viral mitochondrion-localized inhibitor of apoptosis. // J. Virol.- 2003.- V.77.- P.631–641. 161. McGavran M.H., Smith M.G. Ultrastructural, cytochemical and microchemical observations on cytomegalovirus (salivary gland virus) infection of human cells in tissue culture. // Exp Mol Pathol.- 1965.- V.4.- P.1–10.

162. McVoy, M. A., Adler, S. P. Human cytomegalovirus DNA replicates after early circularization by concatemer formation, and inversion occurs within concatemer. // J Virol.- 1994.- V.68 1040–1051. 163. Meyer J.D., Ljungman P., Fisher L.D. Cytomegalovirus excretion as a predictor of cytomegalovirus disease after marrow transplantation: importance of cytomegalovirus viremia. // J. Infect. Dis.- 1990.- V.162.- P/373-380. 164. Mocarski E.S. Cytomegalovirus: biology and replication. // In book: The human herpesviruses. Ed. by Roizman B., Whitley R.J., Lopez C., New York.- 1993.- P.173226. 165. Mocarski ES, Liu AC, Spaete RR. Structure and variability of the a sequence in the genome of human cytomegalovirus (Towne strain). // J Gen Virol.- 1987.- V.68.P.2223–2230. 166. Mocarski, E. S., & Courcelle, C. T. Cytomegalovirus and their replication. // In book: Fields Virology Ed. by D. Knipe, P. Howley.- 2001.- P.2629– 2673. 167. Moroni M.C., Hickman E.S., Lazzerini D. E., et al. Apaf-1 is a transcriptional target for E2F and p53. // Nature cell biology.- 2001.- V. 3.- P.552-558. 168. Muganda P, Mendoza O, Hernandez J, et al. Human cytomegalovirus elevates levels of the cellular protein p53 in infected fibroblasts. // J Virol.- 1994.- V.68.- P.8028– 8034. 169. Murphy, E.A., Streblow, D.N., Nelson, et al. The human cytomegalovirus IE86 protein can block cell cycle progression after inducing transition into the S phase of permissive cells. // J Virol.- 2000.- V.74.- P.7108– 7118. 170. Mussi-Pinhata M.M., Pinto P.C., Yamamoto A.Y., et al. Placental transfer of naturally acquired maternal cytomegalovirus antibodies in term and preterm neonates // J. Med. Virol. – 2003. - V.69. - P.232-239. 171. Nelson C.T., Demmler G.J. Cytomegalovirus infection in the pregnant mother, fetus and newborn infant // Clin. Perinatol. – 1997. - V.24. - P.151-160. 172. Nielsen S.L., Sorensen I., Andersen H.K. Kinetics of specific immunoglobulins M, E, A and G in congenital, primary and secondary cytomegalovirus infection studied by antibody-capture enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol. – 1988. Vol.26. - Р.654-661. 173. Novotny, J., Rigoutsos, I., Coleman, D., et al. In silico structural and functional analysis of the human cytomegalovirus(HHV5) genome. // J Mol Biol.- 2001.V.310.- P.1151–1166. 174. O’Brien V. Viruses and apoptosis. // J Gen Virol.- 1998.- V.79(Pt 8).- P.1833–1845. 175. Pajovic S., Wong E.L., Black A.R., Azizkhan J.C. Identification of a viral kinase that phosphorylates specific E2Fs and pocket proteins. // Mol. Cell. Biol.- 1997.V.17.- P. 6459-6464. 176. Patterson CE, Shenk T. Human cytomegalovirus UL36 protein is dispensable for viral replication in cultured cells. // J Virol.- 1999.- V.73.- P.7126–7131. 177. Perol Y., Caro V., Mazeron M.C. Cytomegalovirus antigenemia assay: therapeutic usefulness and biological significance. // Nouv Rev Fr Hematol.- 1993.- V.35(1).P.95-98. 178. Peter M.E., Heufelder A.E., Hengartner M.O. Advances in apoptosis research. // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1997.- V.94.- P.12736-12737. 179. Pignatelli S., Monte D., Zini N. et. al. Immunoelectron microscopy analysis of HCMV gp UL73 (gN) localization. // Arch. Virol.- 2002.- Vol. –147(6).- P.12471256. 180. Plachter B., Jahn G. Cytomegalovirus diagnostics: standard procedures perspectives. // Biotest Bulletin.-1990.- V.4.- P.107-118. 181. Poma E., Kowalik T., Zhu L., et. al. The human cytomegalovirus IE1-72 protein interacts with the cellular p107 protein and relieves p 107-mediated transcriptional repression of an E2F-responsive promoter. // J.Virol.-1996.- Vol.-70.- P. 7867-7877. 182. Poncet D., Larochette N., Pauleau A.L., et al. An anti-apoptotic viral protein that recruits Bax to mitochondria. // J Biol Chem.- 2004.- V.279.- P.22605–22614. 183. Powers J.T., Hong S., Mayhew C.N., et al. E2F1 uses the ATM signaling pathway to induce p53 and Chk2 phosphorylation and apoptosis. // Mol. Cancer Res.- 2004.V.2.- P.203-214.

and 184. Prichard M.N., Duke G.M., Mocarski E.S. Human cytomegalovirus uracil DNA glycosylase is required for the normal temporal regulation of both DNA synthesis and viral replication. // J Virol.- 1996.- V.70.- P.3018–3025. 185. Raftery M.J., Schwab M., Eibert S.M., et al. Targeting the function of mature dendritic cells by human cytomegalovirus;

a multilayered viral defense strategy. // Immunity.- 2001.- V.15.- P.997-1009. 186. Reboredo M., Greaves R.F., Hahn G. Human cytomegalovirus proteins encoded by UL37 exon 1 protect infected fibroblasts against virus-induced apoptosis and are required for efficient virus replication. // J Gen Virol.- 2004.- V.85.- P.3555–3567. 187. Revello M.G., Gerna G. Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant // Clin. Microbiol. Rev. – 2002. V.15. - P.680-715. 188. Roby C., Gibson W. Characterization of phosphoptoreins and protein kinase activity of virions, noninfectious enveloped particles and dense bodies of human cytomegalovirus. // J. Virol.-1986.-V.59.-P.714-727. 189. Roizman B., Sear A.E. Herpes simplex viruses and their replication. - In book: Virology, Ed. by Fielda B.N., Knipe D.M., Chanock R.M., Hirsch M.S., Melnick J.L., Monath T.P., New York.- 1990.- P.1795-1841. 190. Romanowski M.J., Shenk T. Characterization of the human cytomegalovirus irs1 and trs1 genes: A second immediate-early transcription unit within irs1 whose product antagonizes transcriptional activation. // J Virol.- 1997.- V.71.- P.1485–1496. 191. Rosen P.P. Cytomegalovirus infection in cancer patients. // Pathol. Annu.-1978.V.13.- P.175-208. 192. Roulston A., Marcellus R.C., Branton P.E. Viruses and apoptosis. // Annu. Rev. Microbiol.- 1999.- V.53.- P.577-628. 193. Ruger B, Klages S, Walla B, et al. Primary structure and transcription of the genes coding for the two virion phosphoproteins pp65 and pp71 of human cytomegalovirus. // J Virol.- 1987.- V.61.- P.446–453.

194. Sahara S., Aoto M., Eguchi Y. et al.

Acinus is a caspase-3-activated protein required for apoptotic chromatin condensation. // Nature.- 1999.- V.401.- P.168-173. 195. Salvant B.S., Fortunato E.A., Spector D.H. Cell cycle dysregulation by human cytomegalovirus: influence of the cell cycle phase at the time of infection and effects on cyclin transcription. // J. Virol.- 1998.- V.70.- P.7867-7877. 196. Sarisky R.T., Hayward G.S. Evidence that the UL84 gene product of human cytomegalovirus is essential for promoting oriLyt-dependent DNA replication and formation of replication compartments in cotransfection assays. // J Virol.- 1996.V.70.- P.7398–7413. 197. Scaffidi C, Fulda S, Srinivasan A, et al. TwoCD95(APO-1/Fas) signaling pathways. // Embo J.- 1998.- V.17.- P.1675–1687. 198. Schmitz M.L., Mattioli I., Buss H., et al. NF-kB: a multifaceted transcription factor regulated at several levels. // Chem. Bio. Chem.- 2004.- V.5.- P.1348-1358. 199. Scorrano L., Oakes S.A., Opferman J.T., et al. BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum Ca2+: A control point for apoptosis. // Science.- 2003.V.300.- P.135–139. 200. Simmen K., Singh J., Mattias B. et. al. Global modulation of cellular transcription by human cytomegalovirus is initiated by viral glycoprotein B. // PNAS.-2001.-V.98.P.7140-7145. 201. Sindre H., Rollag H., Olafsen M.K., et al. Human cytomegalovirus indudes apoptosis in the hematopoietic cell line MO7e. // APMIS.- 2000.- V.108.- P.223-230. 202. Skaletskaya, A., Bartle, L. M., Chittenden, T., et al. A cytomegalovirus-encoded inhibitor of apoptosis that suppresses caspase-8 activation. // Proc Natl Acad Sci.2001.- V.98.- P.7829–7834. 203. Smith J.D., DeHarven E. Herpes simplex virus and human cytomegalovirus replication in WI-38. II. An ultrastructural study of viral penetration. // J. Virol.-1974.V.14.- P.945-956. 204. Smyth M.J., Kelly J.M., Sutton V.R., et al. Uclocking the secrets of cytotoxic granule proteins. // J. Leukocyte Biol.- 2001.- V. 20.- P.18-29.

Pages:     | 1 || 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.