WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 ||

«4 МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. Ломоносова _ ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ На правах рукописи УДК 547.992.2 Ковалевский Дмитрий Валерьевич ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ МЕТОДАМИ ...»

-- [ Страница 2 ] --

- разделение сигналов протонов карбоксильных, фенольных и спиртовых гидроксильных групп при помощи регистрации ПМР-спектров ГФК в ДМСО-d6, в условиях замедленного в шкале времени ЯМР протонного обмена в данном растворителе. - разделение сигналов О-Н протонов функциональных групп и С-Н протонов углеродного скелета в спектре ГФК в ДМСО-d6 путем сдвига первых в слабое поле в условиях ускорения процессов обмена при добавлении дейтеротрифторуксусной кислоты. - устранение мешающего определению подвижных протонов влияния влаги при помощи предварительного осушения препаратов ГФК и ДМСО-d6 и последующего приготовления образцов для ПМР-спектроскопии в условиях высокого вакуума. - расчет суммарной интенсивности сигналов протонов ГФК путем сопоставления спектров в ДМСО-d6 и 0.1 М NaOD/D2O. Выбор ДМСО-d6 в качестве растворителя был обусловлен двумя причинами. Во первых растворимость ГФК в в ДМСО-d6 максимальна для органических растворителей. Это позволяет уменьшить сигнал остаточных протонов растворителя в спектре ПМР и повысить точность интегрирования. Вторая причина залючалась в том, что сигнал остаточных протонов ДМСО, в отличие от ДМФА (который также позволяет наблюдать в 75 спектре разделенные сигналы протонов карбоксильных, фенольных и спиртовых групп), не перекрывается с сигналами подвижных протонов. В случае же перекрывания протонов ДМСО одновременно с сигналами скелетных и подвижных протонов ГФК, для определения всех типов протонов в областях перекрывания необходима совместная обработка трех спектров, что негативно сказывается на точности определения.

Общая характеристика спектров.

Согласно вышеизложенной схеме были получены спектры ПМР препаратов ГФК в ДМСО-d6, в ДМСО-d6 с добавкой CF3COOD и в 0.1 М NaOD/D2O. На рис. 2.10 приведен типичный набор таких спектров, полученный для препарата HMG. Отнесение сигналов в этих спектрах дано в табл.2.5. Как видно из таблицы, в спектрах ГФК можно выделить сигналы - протонов углеродного скелета: ароматических (CAr-H), протонов карбогидратных, спиртовых и метоксильных фрагментов (CHn-O), алифатических в -положении к карбоксильной группе или ароматическому кольцу (-CHn), и алифатических, находящиеся к указанным группам не ближе, чем в -положении (CHn).

- подвижных протоны функциональных групп: COOH, CAr-OH, CAlk-OH;

Как видно из рис. 2.10а и Табл. 2.7, в спектрах ГФК в ДМСО-d6 сигналы ароматических CAr-H протонов перекрываются c сигналами протонов фенольных OHгрупп CAr-OH, а пик остаточных протонов ДМСО частично закрывает область -CHn протонов алифатических фрагментов. Сигналы подвижных протонов спиртовых групп CAlk-OH перекрываются с сигналами скелетных CHn-O - протонов карбогидратных фрагментов.

а) ДМСО-d б) ДМСО-d6 + CF3COOD в) 0.1М NaOD/D2O Рис.2.10. Спектры ПМР препарата HMG в ДМСО-d6 (a), в ДМСО-d6 с добавкой CF3COOD (б), и в 0.1М NaOD/D2O (в).

77 Таблица 2.7. Отнесение сигналов в спектрах ПМР ГФК в различных растворителях. Спектр 16.5-11.5 11.5- Спектральные области, м.д.

6-4.48 4.48-3.2 3.2-2.05 2.05-0. ДМСО-d COOH CAr-OH +CAr-H CAr-H CAlk-OH+ CHn-O CHn-O -CHn+ДМСО CHn ДМСО-d6 + CF3COOD 0.1М NaOD/D2O COOH -CHn+ДМСО CHn – CAr-H HDO* CHn-O* -CHn CHn * пики частично перекрываются.

Непосредственное наблюдение сигналов подвижных протонов возможно при помощи Н-1Н EXSY двумерной спектроскопии.

Данная методика позволяет регистрировать корреляционные сигналы связанных спиновых систем благодаря ядерному эффекту Оверхаузера или химическому обмену.

Рис. 2.11. Двумерный спектр 1Н-1Н EXSY препарата FA3 в ДМСО-d6. В спектре 1Н-1Н EXSY ГФК в ДМСО-d6 (рис. 2.11) благодаря замедленному обмену можно наблюдать корреляционные пики СООН и спиртовых ОН групп в области 5/12. 78 м.д., спиртовых и фенольных ОН в области 4.5/8 м.д., а также СООН и фенольных ОН при 8/12.5 м.д. Помимо этого можно отметить выраженные сигналы иона аммония при 7 м.д., дающие корреляционные пики как с карбоксильными, так и со спиртовыми группами. Следует отметить низкую интенсивность корреляционных сигналов протонов фенольных гидроксилов, которая может свидетельствовать об отличающейся для этих групп скорости протонного обмена. При добавлении дейтеротрифторуксусной кислоты в спектре происходят следующие изменения (рис. 2.10б). Интенсивность группы сигналов в области 16.5-14 м.д. возрастает за счет уменьшения интенсивности областей 11.5-6 м.д. и 6-3.2 м.д., а также добавления остаточных протонов CF3COOD. В связи с ускорением процессов обмена протоны спиртовых и фенольных гидроксилов дают с остаточными протонами кислоты общий пик, смещенный в слабое поле из-за наличия избытка кислоты. При условии полноты сдвига сигналов подвижных протонов в областях 11.5-6 и 6-4.48 остаются только сигналы скелетных протонов CAr-H и CHn-O, соответственно. Интенсивность сигналов алифатических протонов (часть которых по-прежнему закрыта пиком остаточных протонов ДМСО) остается неизменной. В спектре ГФК в 0.1М NaOD/D2O (рис. 2.10в), химический сдвиг остаточных протонов растворителя (4.8 м.д.) существенно отличается от такового для ДМСО-d6 (2.49 м.д.). Это позволяет наблюдать сигналы -CHn протонов ГФК в области 3.2 - 2.05 м.д., закрытой в спектре в ДМСО-d6 сигналами остаточных протонов растворителя. При этом в спектре ПМР ГФК в 0.1М NaOD/D2O все подвижные протоны входят в пик HDO (6-4.48 м.д.), частично закрывающий область CHn-O-протонов.

Схема расчета распределения водорода в структуре ГФК из данных спектроскопии ПМР Сопоставление спектров в ДМСО-d6 и ДМСО-d6 с добавкой CF3COOD открывает возможность раздельного определения вклада скелетных и подвижных протонов в интегральные интенсивности интервалов 11.5-6 и 6-3.2 в спектре ГФК в ДМСО-d6 (рис. 2.10а). Для проведения такого сопоставления необходимо выполнить нормирование интегральных интенсивностей данных областей спектров на интенсивность сигналов областей, остающихся неизменными в данных условиях. Необходимость данной процедуры вызвана тем, что общее количество протонов в образце увеличивается за счет добавления остаточных протонов CF3COOD. В качестве реперных областей можно использовать СНn, -CHn, или всю алифатическую область. С нашей точки зрения, использование для этой цели области 2.05 - 3.2 м.д. более обосновано, так как в данной 79 спектральной области находится выраженный пик остаточных протонов ДМСО. В связи с этим указанная область характеризуется меньшей зависимостью результатов интегрирования от корректности фазирования и установки нулевой линии. Формулы для расчета относительных содержаний подвижных и скелетных протонов в данных областях приведены ниже.

DMSO DMSO+CF I 11.5-6 I 3.2-2.05 3COOD H = I DMSO+CF3COOD DMSO 1 11.5-6 3.2 2. CAr OH C Ar (2.6) (2.7) C Alk OH DMSO DMSO+CF3COOD I 6-3.2 I 3.2-2.05 CH n O = I DMSO+CF3COOD DMSO 1 6-3.2 3.2 2. где IDMSO и IDMSO+CF3COOD - относительные интенсивности данных спектральных диапазонов в спектрах в ДМСО-d6 и ДМСО-d6 с добавкой CF3COOD, соответственно. Применение описанной выше процедуры нормирования позволяет рассчитать соотношения CAr-OH/CAr-H и CAlk-OH/CHn-O. Однако из-за присутствия остаточных протонов ДМСО-d6 в обоих спектрах невозможно вычислить абсолютные количества соответствующих протонов в структуре ГФК. Данную проблему можно решить путем сопоставления спектров в ДМСО-d6 и NaOD/D2O, вычисляя отношение интенсивностей сигналов -CHn-протонов и остаточных протонов ДМСО, перекрывающихся в первом спектре. При этом нормирование проводится на область CHn-протонов, которая не изменяется при переходе от одного растворителя к другому: H DMSO D2O I DMSO I 3.2-2.05 = 1- 2.05-0.5 DMSO D2O - CH n I 2.05-0.5 3.2 2. (2.8) Описанная процедура дает возможность вычесть из спектра в ДМСО-d6 сигнал остаточных протонов растворителя и рассчитать абсолютные величины содержаний каждого из рассмотренных типов протонов в структуре ГФК. Таким образом, для ПМР-исследования ГФК была предложена схема эксперимента и обработки результатов, представленная на рис. 2.12.

80 Спектр в NaOD/D2О Спектр в ДМСО-d6 с добавкой CF 3 COOD Спектр в ДМСО-d Нормирование на область 0 – 2.05 м.д.

Нормирование на область 2.05 - 3.2 м.д.

Суммарный интеграл протонов ГФК C Ar- H / C Ar-O H C H n-O / C Al -O H Расчет COO H, C Ar-O H, C Ar- H, C Al -O H, C H n-O, C Al – H Рис. 2.12. Схема расчета распределения водорода в структуре ГФК. При использовании ДМСО-d6 высокой изотопной чистоты, характеризующегося постоянством изотопного состава (например, использовавшегося в данной работе ДМСОd6 производства фирмы Merck, 99.95 ат.%D) можно избежать необходимости регистрации спектров в NaOD/D2O. В этом случае долю сигналов остаточных протонов ДМСО в интегральной интенсивности спектра можно рассчитать как ДМСО= (mДМСО* HДМСО) / (mДМСО* HДМСО +mГФК*HГФК) соответственно;

(2.9) где mДМСО и mГФК – массы внесенного ДМСО-d6 и навески препарата ГФК, HДМСО и HГФК – массовое содержание протонов в ДМСО-d6 и ГФК, соответственно.

В условиях нашего эксперимента – навеска ГФК 15 мг с содержанием водорода 3.5– 5% и количестве ДМСО-d6 0.7 мл 99.95 ат.%D – сигнал остаточных протонов ДМСО мог составлять от 2 до 3.5% общей интенсивности спектра. Справедливость такого способа расчета была подтверждена при сравнении результатов расчета распределения водорода по формуле (2.9) с данными полученными при расчете по схеме (рис. 2.12), основанной на сопоставлении спектров в ДМСО-d6 и NaOD/D2O. Результаты расчетов совпадали в пределах погрешности интегрирования (~5% от величины).

Проверка полноты разделения сигналов подвижных и скелетных протонов при добавлении CF3COOD.

Предложенная схема расчета базируется на предпосылке о полноте разделения сигналов подвижных и скелетных протонов при добавлении CF3COOD и отсутствии в этих условиях обмена для С-Н протонов. Для доказательства этой предпосылки были проведены эксперименты на модельных соединениях, в качестве которых были выбраны 2,4-дигидроксибензойная кислота (содержащая COOH, CAr-OH и CAr-H протоны) и полидекстран (CAlk-OH и CHn-O). В спектре 2,4-дигидроксибензойной кислоты в отсутствие CF3COOD (рис. 2.13а) наблюдались три сигнала подвижных протонов при 12.2 м.д. (СООН), 11.3 м.д. (орто-OH) и 10.3 м.д. (пара-OH). При последовательном добавлении аликвотных частей (10 мкл) кислоты эти сигналы смещались в слабое поле (рис. 2.13б), и в итоге сливались в один пик при 13.4 м.д. (рис. 2.13в). При этом рассчитанная по приведенной выше схеме доля фенольных протонов в области 11.5 - 6 м.д. составила 40%, что точно соответствует теоретическому значению. В спектре полидекстрана присутствовало несколько пиков спиртовых ОН-протонов в области 4.2 - 5.2 м.д., которые при добавлении CF3COOD аналогичным образом смещались в область слабого поля (рис. 2.14). Расчет по схеме, предложенной для количественного анализа ПМР-спектров ГФК показал, что доля спиртовых протонов в суммарном интеграле полидекстрана составляет 32.5%, что хорошо согласуется с расчетным значением для идеальной структуры полидекстрана (30%).

а б в Рис. 2.13. ПМР спектры 2,4-дигидроксибензойной кислоты: а) в ДМСО-d6, b) в ДМСО-d6 + 20 мкл CF3COOD, с) в ДМСО-d6 + 40 мкл CF3COOD.

а б Рис. 2.14. ПМР спектры полидекстрана: а) в ДМСО-d6, b) в ДМСО-d6 + 20 мкл CF3COOD Таким образом, эксперименты на модельных соединениях подтвердили, что 1) в спектрах в ДМСО-d6 протоны COOH, CAr-OH и CAlk-OH находятся в медленном (в шкале времени ЯМР) обмене, что позволяет проводить раздельное интегрирование их сигналов;

2) При добавлении избытка CF3COOD ускорение протонного обмена вызывает количественный переход сигналов подвижных протонов в слабое поле и позволяет провести определение перекрывавшихся с ними сигналов скелетных протонов. Корректность предложенного метода разделения этих сигналов была также проверена для одного из препаратов ГФК - HMG. Для этой цели были сопоставлены количество протонов, обменивающихся на дейтерий при взаимодействии с D2O, и количество протонов, сигналы которых сдвигаются в слабое поле при добавлении CF3COOD. Был получен спектр в ДМСО-d6 препарата ГФК, предварительно подвергнутого дейтерообмену с D2O (рис. 2.15). Из сопоставления такого спектра со спектром препарата HMG без дейтерообмена (рис. 2.10а) были рассчитаны соотношения 84 CAr-OH/CAr-H и CAlk-OH/CHn-O, которые составили 0.48 и 0.38, соответственно. (Нормирование проводилось на интегральную интенсивность области CHn - протонов.) Рассчитанные соотношения были сопоставлены с полученными при расчете по уравнениям (2.6, 2.7), которые для этого препарата составили 0.45 и 0.37, соответственно. Такое хорошее совпадение свидетельствует о том, что при добавлении CF3COOD к раствору ГФК в ДМСО-d6 сдвиг претерпевают только сигналы подвижных протонов, а положение и интенсивность сигналов скелетных протонов ГФК не изменяются.

Рис. 2.15. Спектр препарата HMG после дейтерообмена в ДМСО-d6. Количество добавляемой кислоты, обеспечивающее полный сдвиг подвижных протонов в область слабого поля, было определено при последовательном добавлением аликвотных частей (10 мкл) CF3COOD к раствору препарата ГФК в ДМСО-d6. Установлено, что при массе ГФК 15 мг для большинства препаратов полнота сдвига достигается при внесении 20 мкл кислоты. При дальнейшем добавлении кислоты в области спектра 10.5–0.5 м.д. изменений не происходит. Однако для препаратов HBWN и T7, характеризовавшихся наибольшей зольностью (7-12%), внесение 20 мкл CF3COOD оказалось недостаточно. По-видимому, это связано с образованием солей с зольными компонентами ГФК. В данном случае происходит неполный сдвиг подвижных протонов в слабое поле и их общий широкий сигнал наблюдается при 8-11 м.д. (Рис. 2.16) Для достижения полноты сдвига дополнительно вносили 20 мкл CF3COOD.

Рис. 2.16. Спектры ПМР препарата SWM4 при последовательном добавлении аликвотных порций CF3COOD. а) в ДМСО-d6, b) в ДМСО-d6 + 20 мкл CF3COOD, с) в ДМСО-d6 + 40 мкл CF3COOD. Следует отметить возможные источники систематических ошибок при определении содержания основных типов протонов ГФК вышеописанным методом. Во-первых, определяемое содержание протонов спиртовых гидроксилов может быть завышено в связи с присутствием в растворителе следовых количеств воды, поскольку при регистрации спектров ГФК в ДМСО-d6 слабый сигнал таких количеств HDO неотличим от сигналов спиртовых ОН 86 протонов. Для предотвращения возникновения значительных погрешностей необходимо проводить оценку содержания влаги в чистом растворителе, регистрируя его спектр ПМР. Сигнал HDO в спектре использовавшегося в данной работе DMSO-d6 составлял около 2 % от сигнала остаточных протонов растворителя. Поскольку сигнал спиртовых ОН протонов ГФК составлял от 50 до 100% от сигнала остаточных протонов растворителя, в результате ошибка в определении спиртовых ОН групп могла достигать 2 - 4% (отн). Во-вторых, присутствие в препарате ГФК ионов металлов, обусловленное неполным обессоливанием, влечет за собой недоопределение карбоксильных групп, находящихся в солевой форме. Анализ состава зольности использовавшихся препаратов ГФК показал, что содержание металлов не превышало 0.0005 моль на моль водорода, что могло вызывать недоопределение до 6% карбоксильных групп. Следует отметить, что высокозольные препараты ГФК плохо растворяются в ДМСОd6, что ограничивает возможность применения разработанного метода.

2.3.2. Распределение водорода в структуре ГФК В соответствии с изложенной выше схемой было охарактеризовано распределение водорода в структуре 21 препарата ГФК различного происхождения. Результаты интегрирования соответствующих спектров приведены в Приложении 4. Результаты расчетов содержания протонов различных типов в образцах ГФК приведены в табл. 2.8. В этой же таблице приведены значения параметров СAr-H/СAlk-H (где СAlk-H = CHn-O+CHn+-CHn) и СAr-OH/СArH. Первое из этих соотношений обычно используется [70] как показатель обогащенности ГФК ароматическими структурами. Второй параметр был предложен нами как одна из характеристик окисленности ароматических колец.

Таблица 2.8. Распределение водорода в препаратах ГФК различного происхождения по данным спектроскопии ПМР. Препарат ГФК HBW HBWNd HMG FA1N FA3N T5 T6 T7 T10 HTL TTL HTO FMX-8 FIX-8 FG1FA HO10FA AGK AHA SEL BS1FA SWM4 Доля протонов, % CAr-OH СHn-O CAlk-OH -CHn ГК дерново-подзолистых почв 7 27.5 9 15.5 7 29 6 17 ГК чернозема 8.5 22 6.5 17 ФК дерново-подзолистых почв 7.5 24 8 19 8 27 8 17 ГФК торфа 5 30 9 18 10 29 9 14 9 30 9 13 10.5 30 8 14 8 32 9 14 9 29.5 8.5 16 8 34 9 15 ГФК природных вод 5 28 8 19 8 29 7 18 4 28 9 21 9 29 9 15 ГФК бурого угля 6.5 13 0 20.5 8.5 19.5 1 19 Прочее 7 32.5 11.5 14 8.5 29 6 16 8 36 14 12 Соотношения CAr-H/CAlk-H CAr-OH/CAr-H 0.52 0.58 0.43 0.88 0.84 0.50 0.65 0.56 0.78 0.62 0.69 0.67 0.71 1.07 0.62 0.82 0.28 0.44 0.56 0.71 0.89 0.22 0.18 0.37 0.13 0.16 0.15 0.28 0.29 0.23 0.21 0.21 0.19 0.10 0.12 0.09 0.18 0.41 0.33 0.21 0.20 0. СООН 9 8 11 13 13.5 8 9.5 10 9 8 9 7 12 12.5 11 11 14 12 10.5 14.5 CAr-H 13.5 12 20 8.5 9.5 10 15.5 16 13.5 13 13 12 7 7.5 6.5 11 23 19.5 12.5 12 CHn 18.5 21 15 20 17 20 13 13 15 16 15 15 21 18 20.5 16 23 20.5 12 14 88 Как следует из таблицы, содержание карбоксильных групп в исследованных препаратах ГФК составляло от 7 до 14.5%. При этом ФК почв, ГФК поверхностных вод и угля характеризовались более высоким содержанием этих групп по сравнению с ГФК торфа и ГК почв. Результаты ПМР-определения карбоксильных групп были сопоставлены с имеющимися для ряда препаратов величинами, полученными при помощи кальцийацетатного метода и pK-спектроскопии [16] (Табл. 2.9). Для проведения сопоставления содержание карбоксильных групп было пересчитано в мэкв/г с использованием данных элементного анализа согласно следующей формуле: COOH(мэкв/г) = COOH(ПМР, %)H(эл.ан., мэкв/г) (2.10) Таблица 2.9. Сопоставление результатов определения карбоксильных групп методами титриметрии и спектроскопии ПМР. Препарат ГФК T5 T6 T7 T10 HTL SEL Содержание СООН-групп, мэкв/г ПМР 3.0 3.3 3.0 3.8 3.5 4.0 Ca-Ac 3.1 3.1 2.9 3.1 4.0 3.9 pK-спектр 3.0 2.7 2.5 6.0 3.9 4. Как видно из таблицы, большинство результатов удовлетворительно согласуются между собой. Содержание ароматических протонов было максимально для обоих препаратов ГФК угля и чернозема (HMG). Минимальное содержание незамещенных ароматических структур наблюдалось в случае ГФК природных вод и ФК почв. Соотношение скелетных протонов CArH/СAlkH также было максимально в случае препаратов угля и HMG (0.330.41), минимально для ГФК природных вод и ФК почв (0.09-0.19), а для остальных препаратов находилось в диапазоне 0.15–0.28 (Табл. 2.8). Соотношение CArOH/CAr-H, также различалось для этих групп препаратов. Оно изменялось антибатно соотношению CArH/СAlkH со значимой при р=0.99 обратной корреляцией (r=-0.71). Этот факт может свидетельствовать об увеличении окисленности ароматического ядра при уменьшении доли ароматического углерода в структуре ГФК.

89 Содержание карбогидратных CHnO протонов было максимальным для препаратов торфяных ГФК. При этом их содержание коррелирует с содержанием спиртовых гидроксилов (r=0.75). Соотношение количеств этих протонов в структуре ГФК составляет от 3:1 до 4:1. На этом основании можно предположить, что основная часть спиртовых групп входит в состав полисахаридных фрагментов ГФК. Препараты ГФК угля практически не содержат спиртовых ОН-групп. По-видимому, все СHn-O протоны в них относятся к метоксильным группам. При рассмотрении алифатической части ГФК обнаружено, что для всех исследованных препаратов вне зависимости от источника происхождения и величины соотношения CArH/СAlkH около 50% алифатических протонов находится в составе -CHn групп. Это указывает на общий принцип строения алифатической части ГФК, для которой, по-видимому, нехарактерно наличие незамещенных длинноцепочечных алифатических фрагментов. Таким образом, разработанный метод позволил охарактеризовать количество основных протонсодержащих функциональных групп и распределение скелетных протонов в структуре ГФК. Сопоставление этих данных с полученными при помощи определяемых характеристик структуры ГФК.

С спектроскопии ЯМР открывает возможности для расчета ряда непосредственно не 2.5. Расчет фрагментного состава ГФК 2.5.1. Схема расчета фрагментного состава ГФК из данных спектроскопии ЯМР 1Н и 13С Как было показано в 2.1-2.4, все исследованные препараты ГФК обладают единым набором основных структурных фрагментов. В связи с этим расчет относительного содержания таких фрагментов позволяет количественно охарактеризовать структуру ГФК различного происхождения. В качестве основных структурных фрагментов использовали карбонильные (СC=O), карбоксильные (СCOOH) и сложноэфирные (СCOOR) группы;

атомы углерода ароматических колец с соответствующими заместитетлями: незамещенные (СArH), С-замещенные (СAr-C), связанные с гидроксильной (СAr-OH) и алкоксильной (СAr-OR) OCH3), группами;

вторичные (СCH-OH) и первичные (СCH2-OH) спиртовые фрагменты, метоксильные группы (С ацетальные фрагменты (СO-Alk-O) и несвязанные с гетероатомами алифатические фрагменты (CAlk). Содержание СC=O, СO-Alk-O, и СAlk рассчитывали непосредственно из данных 13С ЯМР спектроскопии. Содержание остальных фрагментов было рассчитано из сопоставления данных спектроскопии 13С и 1Н ЯМР при использовании соотношения H/C из результатов элементного анализа согласно уравнениям (2.11-2.14). Как было указано выше, использованные нами методы не позволяют достоверно различить кислород- и азотсодержащие функциональные группы, поэтому все гетероатомы в структуре ГФК принимались за кислород, т.е. амиды рассматривались совместно со сложноэфирными группами, алифатические амины - со спиртами, и т.д. Поскольку разработанный ПМР метод позволяет определить количество свободных СООН групп, а спектроскопия С ЯМР предоставляет данные о суммарном содержании СООН+COOR, то количество сложноэфирных групп рассчитывается как: СCOOH = HCOOH (ПМР) / Н/С(эл.ан.) СCOOR = (CCOOR+COOH)(С-13) - HCOOH (ПМР) / Н/С(эл.ан.) (2.11) Аналогичный расчет может быть выполнен для определения содержания ОН- и ORзамещенных ароматических атомов углерода: СArOH = HArOH (ПМР) / Н/С(эл.ан.) СArOR = CAr-O (С-13) - HArOH (ПМР) / Н/С(эл.ан.) (2.12) Также из сопоставления результатов спектроскопии ЯМР 13С и 1Н можно рассчитать содержание незамещенных и С-замещенных ароматических атомов углерода:

91 СArH = HArH (ПМР) / Н/С(эл.ан.) СArC = CAr(C-13) - HArH (ПМР) / Н/С(эл.ан.) (2.13) Для расчета содержания фрагментов, входящих в состав гетерозамещенных алифатических структур - ССНОН, ССН2ОН, СОСН3 - решали следующую систему уравнений:

{ ССНОН + ССН2ОН + СОСН3 = СAlk-O(С-13) (2.14) 2/5ССНОН + ССН2ОН = CAlk-OH(ПМР) / Н/С(эл.ан.) ССНОН + 2ССН2ОН + 3СОСН3 = CHn-O(ПМР) / Н/С(эл.ан.) - СO-Alk-O(С-13) Результаты расчета по уравнениям (2.14) в целом удовлетворительно согласуются с результатами интегрирования диапазонов 55-60, 60-67 и 67-108 м.д. использованный расчет предпочтительнее в связи с С ЯМР спектров, погрешностью где находятся сигналы соответствующих фрагментов однако, с нашей точки зрения, высокой интегрирования перекрывающихся уширенных пиков в 13С спектре. Также были рассчитаны атомные соотношения H/C в ароматических, алифатических и карбогидратных фрагментах, позволяющие определить среднюю степень замещения ароматических колец и разветвленности алифатической части молекул. (H/C)Ar = HAr(ПМР) / (CAr(C-13) + CAr-O(C-13)) / Н/С(эл.ан.) (H/C)Alk = (CHn + -CHn) (ПМР) / CAlk(C-13) / Н/С(эл.ан.) (H/C)Alk-O = CHn-O(ПМР) / CAlk-O(C-13) / Н/С(эл.ан.) Рассчитанный фрагментный состав препаратов ГФК приведен в табл. 2.10. Косвенная проверка корректности проведенных расчетов была выполнена при помощи вычисления атомных соотношений O/C из полученных структурных данных и сопоставления с рассчитанными из результатов элементного анализа (рис. 2.17). Атомные соотношения вычисляли из структурных данных по уравнению O/C=2СCOOH+3/2СCOOR+СArOH+1/2СArOR+4/5(СCHOH+СO-Alk-O)+1/2СCH3O+СCH2OH (2.15) (2.16) 0. O/Cрасч 0. r =0. 0. 0. 0. 0. 0.40 0.4 0.45 0.5 0.55 0. O/Cэл.ан.

0.65 0. Рис. 2.17. Сопоставление рассчитанных из фрагментного состава соотношений О/C с данными элементного анализа. Дробные коэффициенты в уравнении (2.16) возникают в связи с тем, что кислород эфирных структур относится сразу к двум различным фрагментам. Коэффициент 5/6 соответствует соотношению О/C в полисахаридных циклах, в которые входит основная часть СCHOH и СO-Alk-O фрагментов. Вычисленные значения дают значимую при p=0.99 корреляцию с данными элементного анализа (r2=0.61). В то же время из рисунка можно видеть, что вычисленные значения несколько ниже экспериментально определенного содержания кислорода. Доля недоопределенного кислорода составляет около 4%. Это может быть вызвано обсуждавшимся в п 2.3.1. возможным недоопределением карбоксильных групп методом ПМР при анализе зольных образцов. Величина погрешности определения СООН-групп приблизительно соответствует доле недоопределенного кислорода.

2.5.2. Характеристика закономерностей строения ГФК различного происхождения на основании фрагментного состава Как следует из таблицы 2.10, рассчитанные содержания структурных фрагментов для разных препаратов ГФК изменяются в достаточно широком диапазоне. Однако можно отметить ряд закономерностей, проявляющихся при анализе характеристик структуры препаратов, сгруппированных в зависимости от источника происхождения. Максимальное содержание карбоксильных групп характерно для препаратов ФК почв, ГФК природных вод и ГК угля. Эти же препараты Таблица 2.10. Фрагментный состав препаратов ГФК различного происхождения Шифр CO 1.0 2.0 2.0 3.0 3.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 3.0 3.0 2.0 3.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 3.0 2. COOH 9.0 8.2 9.6 13.0 14.2 8.4 8.9 9.6 8.9 7.9 8.6 7.3 13.5 14.2 12.6 11.0 13.1 12.0 10.8 14.7 10. COOR 8.0 6.8 5.4 7.0 3.8 7.6 5.1 7.4 7.1 7.1 6.4 5.7 5.5 3.8 3.4 7.0 2.9 3.5 7.2 2.3 6. CAr-OH 7.0 7.1 7.4 7.5 8.4 5.3 9.4 8.7 10.4 7.9 8.6 8.4 5.6 9.1 4.6 9.0 6.1 8.5 7.2 8.6 8. HBW HBWNd HMG FA1N FA3N T5 T6 T7 T10 HTL TTL HTO FMX-8 FIX-8 FG1FA HO10FA AGK AHA SEL BS1FA SWM CAr-OR CAr-H CAr-C CH3O CH-OH ГК дерново-подзолистых почв 5.0 13.4 18.6 3.0 14.3 5.9 12.3 17.7 4.5 12.9 ГК чернозема 3.1 17.5 28.0 3.0 7.5 ФК дерново-подзолистых почв 4.5 8.5 13.5 3.0 13.5 3.6 10.0 19.0 3.5 13.0 ГФК торфа 4.7 10.5 17.5 3.0 16.0 4.6 14.6 23.4 3.0 12.5 6.3 15.4 18.6 4.0 11.0 4.6 13.4 19.6 4.0 11.5 6.1 12.9 18.1 4.0 14.0 4.4 12.4 19.6 3.5 13.5 4.6 12.6 18.4 5.0 15.8 ГФК природных вод 5.4 7.9 17.1 5.0 10.0 2.9 8.5 17.5 5.5 8.5 4.4 7.4 17.6 3.0 15.5 4.0 11.0 19.0 3.0 13.5 ГК угля 3.9 21.5 26.5 4.0 0.0 4.0 19.5 23.5 6.0 0.0 Другое 5.8 12.9 19.1 4.0 15.0 2.4 12.2 25.8 5.5 8.5 3.4 9.7 16.3 2.0 22. CH2OH 2.7 2.6 1.5 2.5 2.5 3.0 2.5 2.0 2.5 3.0 3.0 3.2 4.0 4.0 4.5 4.0 0.0 1.0 3.0 2.0 6. CAlk 18.0 20.0 15.0 24.0 19.0 23.0 14.0 15.0 16.0 17.0 17.0 16.0 24.0 23.0 26.0 17.5 21.0 21.0 14.0 15.0 13. H/CAlk 1.88 1.94 1.87 1.62 1.88 1.74 1.82 1.67 1.79 1.74 1.75 1.96 1.87 1.78 1.82 1.78 1.94 1.88 1.92 2.03 1. H/CAr 0.30 0.29 0.27 0.25 0.26 0.29 0.26 0.30 0.28 0.28 0.26 0.30 0.25 0.26 0.25 0.26 0.35 0.35 0.30 0.25 0. H/CAlk-O 1.37 1.48 1.60 1.26 1.49 1.44 1.52 1.70 1.65 1.51 1.41 1.48 1.65 1.83 1.39 1.42 3.04 2.79 1.53 1.84 1. 94 характеризуются наблюдается значимая более пр низким р=0.99 содержанием обратная СCOOR-фрагментов. между При этом корреляция содержанием карбоксильных и сложноэфирных групп (r=-0.68). В случае фенольных гидроксилов и их эфиров не удается установить такой закономерности, все препараты характеризуются довольно близкими содержаниями данных функциональных групп. Однако, отношения ССООН/ССOOR и СArOH/СArOR характеризуются значимой при р=0.95 корреляцией (r=0.53). По-видимому, данные отношения изменяются однонаправленно и могут служить характеристикой глубины протекания гидролитических процессов. Все исследованные препараты содержат от 2 до 6% метоксильных групп. Наиболее вероятным источником таких групп являются продукты деградации лигнинов. Однако при сопоставлении СОСН3 и СArOR характеризуются значимой при p=0.95 корреляцией (r=0.53). По-видимому, это объясняется присутствием в структуре ГФК значительных количеств эфиров карбоксильных групп, как ариловых, так и метиловых. Для определения количества полисахаридных структур было проанализировано распределение СAlk-O - углерода в молекулах ГФК. Для ГФК ПД почв и торфа содержание карбогидратных CСНОН, ацетальных СO-Alk-O и первичных спиртовых CСН2ОН фрагментов соотносятся в среднем как 4:1:1 и в ряду препаратов изменяются симбатно. В связи с этим был сделан вывод о принадлежности всех ССНОН и ССН2ОН фрагментов в этих препаратах к полисахаридным циклам. Напротив, для препаратов ГФК природных вод до 50% спиртовых групп не относятся к полисахаридам. Содержание полисахаридов в структуре ГФК близко для ГФК торфа и речных вод, ГК и ФК дерново-подзолистых почв. Содержание полисахаридов в препарате ГК чернозема HMG существенно ниже. В структуре ГК угля практически весь углерод CAlk-Oфрагментов относится к метоксильным группам. Аномально высоким содержанием полисахаридов характеризуется препарат SWM-4 (ГФК донных отложений торфяных болот). Высокая обратная корреляция между о содержанием что полисахаридов и ароматических структур свидетельствует том, повышение содержания ароматических фрагментов в структуре ГФК в значительной степени обуславливается отщеплением периферийных полисахаридных фрагментов. Атомные соотношения (H/C)Ar, характеризующие замещенность ароматического скелета ГФК, изменяются в довольно узких пределах от 0.25-0.28 для препаратов природных вод и фульвокислот почв до 0.35 в случае ГК угля. От 30 до 44% атомов углерода ароматических колец представлено С-замещенными, а 17-35% - О-замещенными (табл. 2.11). Таким образом, характер 95 замещения «среднего» ароматического кольца для исследовавшихся препаратов ГФК описывается следующим образом: 2.6 С-замещенных, 1.7 О-замещенных и 1.7 незамещенных атомов углерода. Содержание алифатических фрагментов выше для ГФК природных вод и ГК угля, в то время как их наименьшее количество обнаружено в ГФК торфа. Таблица 2.11. Параметры, характеризующие замещение ароматических колец Препарат СAr-C/СAr СAr-H/СAr СAr-O/СAr Препарат СAr-C/СAr СAr-H/СAr СAr-O/СAr HBW HBWNd SEL HMG BS1FA FA1N FA3N T5 T6 T7 T 2.5 2.5 2.5 3.0 3.2 2.4 2.8 2.8 2.7 2.3 2. 1.8 1.7 1.7 1.9 1.5 1.5 1.5 1.7 1.7 1.9 1. 1.6 1.8 1.7 1.1 1.3 2.1 1.8 1.6 1.6 1.8 1. HTL TTL HTO FMX-8 FIX-8 FG1FA HO10FA SWM4 AGK AHA Среднее 2.4 2.6 2.5 2.9 2.8 3.1 2.6 2.6 2.7 2.5 2.6±0. 1.7 1.7 1.7 1.3 1.3 1.3 1.5 1.5 2.2 2.1 1.7±0. 1.9 1.7 1.8 1.8 1.9 1.6 1.8 1.9 1.0 1.4 1.7±0. Для выявления закономерностей строения ГФК различного происхождения на основании данных по фрагментному составу были предложены характеристические параметры, описывающих наиболее существенные различия структуры ГФК. Их выбор осуществляли таким образом, чтобы учесть основные процессы трансформации структуры ГФК в процессе гумусообразования. Согласно литературным данным [8, 12] основными процессами трансформации структуры ГФК являются гидролиз, в результате которого происходит отщепление полисахаридной периферии и распад сложных эфиров, и окисление ароматического скелета. С нашей точки зрения, согласующейся с изложенной в [12], структуру ГФК целесообразно рассматривать, выделяя две основные части: ароматический скелет ГФК, наименее затрагиваемый процессами трансформации, и полисахаридную периферию, подверженную гидролизу. Соотношение этих частей в структуре ГФК в значительной степени определяет свойства этих соединений.

98 В связи с этим в качестве характеристических параметров нами предложено использовать отношение содержания полисахаридных СS и ароматических фрагментов ГФК СS/(СArH+СArC+СAr-O), уменьшение которого свидетельствует об увеличении степени гумификации, отношение ССООН/СCOOR как характеристику глубины протекания гидролитических процессов, а также отношение СAr-O/(СArH+СArC+СAr-O), позволяющее судить о степени окисленности ароматических колец. Средние характеристические параметры для групп препаратов в зависимости от их источника происхождения приведены на рис. 2.18.

4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 ГК бурого угля ГК чернозема ГК П почв Д CCOOH/CCOOR (СAr-O/(СAr-H+СAr-C+СAr-O) CS/(СAr-H+СAr-C+СAr-O) ГФК торфа ГФК вод ФК почв Рис. 2.18. Характеристические параметры структуры ГФК различного происхождения. Наивысшими значениями показателя СAr-O/(СAr-H+СAr-C+СAr-O) характеризуются препараты ГФК природных вод и ФК почв, меньшая окисленность ароматического каркаса характерна для ГФК торфа и ГК почв, а препараты ГК бурого угля и черноземов характеризуются наименьшими значениями этого параметра. В этом же ряду снижается соотношение СS/(СAr-Н+СAr-С+СAr-O). Между этими показателями наблюдается значимая при р=0.99 корреляции (r2=0.68). Соотношение CCOOH/CCOOR резко отличается для разных групп препаратов, составляя 1.1-1.8 для ГК почв и ГФК торфа, 1.7-3.8 для ФК почв и ГФК природных вод и 3.5-4.5 для ГК угля. Аномально высокое (6.4) значение этого соотношения для препарата BS1FA, выделенного из почвенного раствора, указывает на то, что эти вещества обогащены отщепленными при гидролизе низкомолекулярными фрагменты полисахаридной периферии ГК почв. Для установления значимости структурных различий между препаратами ГФК основных природных источников данные по их структуре были подвергнуты кластерному 99 анализу. Для расширения выборки в нее были включены препараты ГК дерновоподзолистых, серых лесных почв и черноземов, ФК дерново-подзолистых почв, ГФК торфа и природных вод и ГК бурых углей. В качестве структурных характеристик при этом использовали распределение углерода по данным Результаты кластерного анализа приведены на рис. 2.19.

HBW HBP HBG TTL HTL HO10FA HBWND HGP SEL T4 HTO HGW T7 T10 T6 FA1N FMX-8 FIX-8 T5 FG1FA FA3N T1 HS HMG HST AGK AHA 0.00 0.05 0. С ЯМР спектроскопии.

ГК ПД и Л почв, ГФК торфа ГФК пресных вод, ФК почв ГК черноземов ГК бурого угля 0. 0. Степень различия Рис. 2.19. Классификация препаратов ГФК при помощи кластерного анализа. Как видно из рисунка, можно выделить 4 группы препаратов с достоверными различиями структуры. При этом полученное распределение по кластерам в основном соответствует распределению препаратов по источникам происхождения. Обращает на себя внимание сходство структуры ФК почв и ГФК природных вод. Это может служить указанием на высокий вклад ФК почв в формирование ГФК природных вод за счет их вымывания из почв и поступления в водоемы с грунтовыми водами. Сходную структуру также имеют ГК ПД и Л почв и ГФК торфа. Структура препаратов ГК черноземов и бурых углей существенно отличается от остальных препаратов. Таким образом, кластерный анализ продемонстрировал, что структура ГФК различных природных источников статистически различна. Исходя из полученных данных по фрагментному составу можно указать на некоторые общие закономерности образования ГФК из растительных остатков и их генезиса в различных природных средах. ГФК торфа по своей структуре наиболее близки к растительным остаткам. На это указывает как высокое содержание полисахаридных включений, так и низкое значение 100 показателей гидролизованности СCOOH/СCOOR и СArOH/СArOR. Довольно сходны с ними ГК дерново-подзолистых и серых лесных почв. При переходе к ГК черноземов наблюдается увеличение доли ароматических фрагментов, происходящее преимущественно за счет отщепления полисахаридов, и возрастание процессов как окисленности ароматических и колец, так и доли свободных СCOOH/СCOOR функциональных групп (за счет гидролиза сложных эфиров). Параллельное протекание отщепления полисахаридов увеличения соотношения подтверждает высказанное в работе [12] предположение, что полисахаридные фрагменты связаны с ароматической частью ГФК сложноэфирными связями. ГФК природных вод и близкие им по структуре ФК почв представляют собой наиболее высокоокисленные вещества. Для этих препаратов наблюдается минимальное содержание незамещенного водорода ароматических структур. Доля свободных карбоксильных и фенольных групп в них значительно превышает аналогичные параметры для ГК почв. Окисление затрагивает и алифатическую часть молекул, результатом чего является присутствие значительного количества спиртовых гидроксилов, не относящихся к полисахаридным фрагментам. Характеристики структуры этих классов ГФК (довольно высокое содержание полисахаридов и алифатических фрагментов и низкое ароматических) не позволяют предполагать, что они представляют собой гумусовые кислоты этого ряда, подвергшиеся более глубокому гидролизу. По нашему мнению, более корректно рассматривать эти вешества как находящийся в динамическом равновесии сложный композит, включающий в себя помимо сильно гидролизованных остатков ароматических скелетных фрагментов ГК также и отщепляемые при их гидролизе периферийные единицы. С этой точки зрения данные препараты должны быть наиболее неоднородны по фрагментному составу. В то же время при рассмотрении структуры ФК почв и ГФК природных вод следует учитывать особенности метода их выделения, включающего сорбцию на амберлите XAD8. При этом более высокой степенью извлечения обладает гидрофобная часть ГФК, а для наиболее гидрофильной части сорбция может быть неполной. Подтверждением данного тезиса является более высокое содержание алифатических структур в таких препаратах. ГК угля представляют собой отдельный класс ГФК в связи с особенностями их образования в условиях недостатка кислорода. Отличительной особенностью этих соединений является низкая окисленность и высокая гидролизованность структуры. Эти препараты характеризуются практически полным отсутствием карбогидратной периферии и самым высоким среди исследованных препаратов соотношением COOH/COOR.

Сопоставление полученных данных по фрагментному составу с гипотетическими структурными формулами ГФК.

Полученные характеристики структуры ГФК различного происхождения были сопоставлены с приводимыми в литературе гипотетическими структурными формулами (глава 1.1). Структура, приводимая в работе [66] для ФК речных вод (рис. 1.11), хорошо описывает полученное нами распределение углерода между ароматической и алифатической частями молекул и характеристики окисленности ароматического ядра, однако, содержание карбогидратных фрагментов по нашим данным вдвое выше. Кроме того, рассмотренная структура представляет собой один из предельных случаев, в связи с тем, что в ней отсутствует водород ароматических колец. Кроме того, существенно переоценена роль кетонных групп в структуре ФК. Структурная формула ФК почв (Schnitzer) [50] (рис. 1.8) близка к рассмотренной выше, но отличается от нее более низким содержанием алифатических фрагментов, что вызывает несколько худшее согласование с полученными результатами. Структурная формула ГК почв (Stevenson) [32] (рис. 1.7) в связи с высоким содержанием в ней ароматических структур была сопоставлена с данными, полученными для ГК черноземов, имеющих сходные параметры строения углеродного скелета. Степень замещения водорода ароматических колец и соотношения СAlk/СAr для этой структуры в целом близки к полученным в нашей работе. Следует отметить крайне низкую окисленность предлагаемой структуры, что, по-видимому, обусловлено недоучетом роли карбоксильных групп. С другой стороны, предлагаемая структура характеризуется исключительно высоким содержанием СAr-O фрагментов, превышающим наблюдавшиеся нами как минимум в 1.5 раза. Крайне высокое содержание хинонных групп также плохо согласуется с полученными нами экспериментальными данными. Структурная формула ГК почв Драгунова [64] (рис. 1.6), будучи на основании близости элементного состава и содержания ароматических структур сопоставлена с данными, полученными для ГК дерново-подзолистых почв, неудовлетворительно согласуется с ними. В первую очередь, это связано с практически полным отсутствием в этой структурной формуле карбоксильных групп. Приводимое автором содержание хинонных групп превышает максимально определенное нами для ГК почв в 5 раз. Данная структура характеризуется также не наблюдавшимся среди исследованных нами препаратов крайне высоким содержанием незамещенных ароматических атомов углерода. Содержание алифатических фрагментов в предлагаемой формуле занижено по сравнению с данными 13С ЯМР спектроскопии.

102 Гипотетическая структурная формула негидролизуемого скелета ГК почв, приводимая в [60] (рис. 1.10), хорошо согласуется с полученными данными об окисленности структуры и характере замещения ароматических колец. В то же время в данной формуле приводится чрезмерно высокое содержание алифатических структур. Высокое отношение COOH/COOR, нехарактерное для ГК почв, в данном случае оправдано, т.к. автор приводит данные о веществе, подвергшемся глубогому гидролизу. Структурная формула ГК почв, приводимая в работе [65] (рис. 1.9), описывает полученные нами данные наилучшим образом. Данные о распределении углерода, характере замещения различных фрагментов, окисленности и степени гидролизованности структуры хорошо совпадают с полученными в настоящей работе. Однако следует отметить некоторое завышение содержания полисахаридных фрагментов за счет алифатической части структуры. Кроме того высокое содержание азота в приводимой формуле в целом нехарактерно для ГК почв [18]. *** Таким образом, рассчитанный фрагментный состав позволил охарактеризовать основные закономерности строения ГФК. На заключительном этапе работы была исследована применимость данных по фрагментному составу для генерации структурных дескрипторов с целью их использования при установлении количественных соотношений структура-свойство. Для этой цели данные по фрагментному составу были использованы для установления взаимосвязи между структурой ГФК, с одной стороны, и гельхроматографическими характеристиками и детоксицирующими свойствами ГФК по отношению к тяжелым металлам, с другой стороны.

2.6. Применение данных по фрагментному составу ГФК для установления зависимостей структура - свойство 2.6.1. Установление взаимосвязи между структурой и гель-хроматографическими характеристиками ГФК.

Гель-хроматография является традиционным методом определения молекулярных масс (ММ) ГФК. Экспериментально определяемой величиной при этом служит хроматографический коэффициент распределения Kd, характеризующий объем пор геля, доступный для молекул данного размера. Расчет ММ из Kd осуществляется из калибровочной зависимости, получаемой для стандартных веществ. Необходимым условием правильного определения молекулярных масс при использовании этого метода является структурная идентичность анализируемого вещества и калибровочного стандарта. Однако, в связи со сложностью и нерегулярностью строения ГФК выбор структурного аналога затруднителен и на сегодняшний день для этих веществ не существует подходящих калибровочных стандартов. В качестве таковых используют полидекстраны (полисахариды) и различные полиэлектролиты (полиакриловые, полиметакриловые и полистиролсульфоновые кислоты). Различия в структуре ГФК и калибровочного стандарта могут существенно изменять поведение вещества в условиях гель-хроматографического эксперимента и приводить в результате к значительным погрешностям в определении молекулярных масс. Данные погрешности обуславливаются двумя противонаправленными факторами, возникающими за счет взаимодействия с гелем: электростатическим отталкиванием, вызывающим завышение определяемых молекулярных масс, и динамической сорбцией, занижающей получаемые значения. Для минимизации возникающих погрешностей нами был предложен способ количественного Kd = Kd0+Kd учета структурных различий, основанный на (2.17), представлении экспериментально определяемого Kd в виде: где Kd0 - "идеальный" коэффициент распределения, которым характеризовалось бы вещество со структурой, идентичной калибровочному стандарту, и Kd - поправка на структурные различия, являющаяся функцией структурных параметров. В качестве калибровочных стандартов нами были использованы полидекстраны. Такой выбор был обусловлен тем, что для данного класса соединений взаимодействие с гелем минимально.

104 Величина Kd была определена экспериментально для ряда низкомолекулярных веществ, моделирующих основные структурные фрагменты ГФК. Сопоставляя ее с рассчитанной из калибровочного уравнения по полидекстранам величной Kd0, по разности определяли соответствующую поправку Kd. Экпериментально определенные Kd и рассчитанные Kd0 использовавшихся соединений приведены в приложении. На основании регрессионного анализа данных по Kd и фрагментному составу выбранных низкомолекулярных соединений было получено уравнение связи между Kd и структурой анализируемого вещества. Для этого структура использованных низкомолекулярных соединений была описана фрагментным и элементным составом в терминах, аналогичных используемым при описании структуры ГФК (глава 2.5). Полученная зависимость Kd от параметров структуры анализируемого вещества имела следующий вид:

Kd = 0.21 -1.24СArOH +0.35CCOOH -0.18C/O +0.07C/H Kd расч 0. (2.18) 0. r2=0. 0. Kd эксп 0 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0. -0. -0. -0. Рис. 2.20. Сопоставление экспериментально полученных и рассчитанных согласно (2.18) величин Kd для низкомолекулярных модельных соединений.

100000 ММ, дальтон 10000 1000 100 10 1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Полиакриловая кислота экспериментальная расчетная без коррекции Kd 0. 100000 MM, дальтон 10000 1000 100 10 1 0 0.1 0. Полиметакриловая кислота экспериментальная расчетная без коррекции 0.3 0.4 0.5 0. Kd 0. 100000 MM, дальтон Полистиролсульфоновая кислота экспериментальная расчетная без коррекции 0 0.1 0.2 0.3 0. Kd 0. Рис. 2.21. Применение метода расчета для определения молекулярных масс полиэлектролитов. Соответствие рассчитанных согласно уравнению (2.18) и экспериментально определенных Kd проиллюстрировано на рис. 2.20. Наибольшие отклонения от калибровочного графика наблюдались в случае карбоновых кислот (снижение доступного объема за счет электростатического отталкивания от геля) и соединений, содержащих фенольную группу (увеличение коэффициента распределения за счет динамической сорбции). Данные отклонения весьма значительны, что не позволяет пренебрегать такими взаимодействиями при исследовании 106 молекулярно-массового распределения ГФК, в структуре которых присутствуют как те, так и другие фрагменты. Полученные данные показали возможность удовлетворительной применимости полученного уравнения связи для области калибровочного графика, соответствующей низким значениям молекулярных масс. Однако в случае ГФК для расчета ММ более важной представляется область высоких молекулярных масс (Kd = 0-0.2). В связи с этим применимость полученного уравнения в высокомолекулярной области была исследована на модельных полимерах полиакриловых (PA), полиметакриловых (PMA) и полистиролсульфоновых (PSS) кислотах. Проведенные эксперименты показали хорошую применимость полинома для описания Kd высокомолекулярных соединений (рис. 2.21). Как видно из рисунка, молекулярные массы поликислот, определяемые из калибровочного уравнения по полидекстранам, примерно на порядок выше истинных. Введение поправки на структурные различия значительно улучшает результаты определения при определении молекулярных масс полиэлектролитов, свидетельствуя об адекватности способа корректировки, при этом получаемые значения наиболее близки к реальным величинам в области больших молекулярных масс.

ГК П Д и Л почв ГФК торфа ГФК бурого угля Mw, дальтон 25000 20000 15000 10000 5000 ГФК природных вод Рис. 2.22. Средние молекулярные массы ГФК различного происхождения.

! - без корректировки, " - скорректированные на структурные различия.

При помощи данного метода были рассчитаны средние молекулярные массы препаратов ГФК. Влияние корректировки на определяемые молекулярные массы препаратов ГФК различного происхождения показано на рис. 2.22. Как видно из рисунка, молекулярные массы препаратов ГФК возрастают в ряду от ГФК природных вод до ГК бурых углей. Скорректированные молекулярные массы оказались на 1-4 тысячи дальтон ниже непосредственно определенных из калибровки по полидекстранам.

ГК черноземов ФК почв 2.6.2. Исследование взаимосвязи между структурой ГФК и их детоксицирующими свойствами по отношению к тяжелым металлам.

Полученные данные по фрагментному составу ГФК различного происхождения были использованы для установлении взаимосвязи с детоксицирующими свойствами ГФК по отношению к тяжелым металлам. Для этой цели были проведено исследование исследование детоксицирующих свойств ГФК различного происхождения. Характеристики детоксицирующего действия были сопоставлены со структурными дескрипторами, рассчитанными на основании данных по фрагментному составу ГФК. Детоксицирующие свойства ГФК были исследованы по отношению к трем опасным для природных экосистем тяжелым металлам - меди, кадмию и свинцу. Для проведения исследования были выбраны представители 4-х основных классов гумусовых кислот - ГК почв (HBW), ГФК торфа (HTL), ГФК речных вод (FMX8) и ФК морских вод (FSW). Препарат ФК морских вод и данные о его структуре были предоставлены NAOML (Miami, USA). В работе был использован метод альгологического биотестирования в водной среде с использованием в качестве биотеста культуры одноклеточных водорослей Chlorella vulgaris, в качестве тест-функции использовалась фотосинтетическая активность, измеряемая при помощи регистрации быстрой флуоресценции. Для оценки детоксицирующего действия ГФК была введена величина «коэффициент детоксикации» (D), соответствующая относительному изменению токсичности данной концентрации металла в присутствии ГФК, и рассчитываемая как R0 ( Rd Rd + t ) 100%, (2.19) D = 1 Rd ( R0 R t ) где R R0 Rd Rt Rd+t поскольку фотосинтетическая активность в контрольных экспериментах - тестируемая среда как без токсиканта, так и без детоксиканта;

в присутствии детоксиканта;

в присутствии токсиканта;

при совместном присутствии токсиканта и детоксиканта. эффект изменения фотосинтетической активности водорослей под Данная формула позволяет вычленить собственно детоксицирующий эффект, воздействием самих гумусовых кислот при таком способе расчета исключается.

108 Для выбранных тяжелых металлов были определены концентрационные диапазоны токсического действия, от полного отсутствия токсичности по отношению к тест-объекту до полного подавления фотосинтеза водоросли в условиях эксперимента (рис 2.19). Для проведения экспериментов по исследованию детоксицирующей способности гумусовых кислот были выбраны концентрации, вызывающие полное подавление фотосинтетической активности водорослей (50 мкг/л Cu2+, 800 мкг/л Cd2+, 2 мг/л Pb2+).

R/R0, % 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 CCu, мкг/мл R/R0, % 100 80 60 40 20 CCd, мкг/мл Рис 2.23. Диапазоны токсического действия Cu2+, Cd2+ и Pb2+. В присутствии ГФК токсическое воздействие всех исследованных металлов на водоросли значительно снижается. Для исследованных препаратов ГФК были получены концентрационные зависимости детоксицирующего действия (рис. 2.20.).

100 80 60 40 20 СГФК, мг/л 0 D,% 100 80 60 D,% 100 80 D,% СCu= 50 мкг/л 40 20 СCd= 800 мкг/л СГФК, мг/л 0 5 10 15 - СPb= 2 мг/л СГФК, мг/л 0 5 10 15 20 0 20 Рис. 2.24. Детоксикация тяжелых металлов препаратами ГФК различного происхождения. Для сопоставления детоксицирующего действия препаратов ГФК была использована величина ДК50 - концентрация ГФК, вызывающая 50% снижение токсичности металла. Как следует из полученных данных, исследованные препараты можно расположить в следующий ряд по величине их детоксицирующего потенциала: ГФК торфа > ГФК речных вод ГК почв >> ФК морских вод. ГФК торфа и ГК почв, а также ГФК речных вод оказались довольно близки по детоксицирующей способности, вызывая полное снятие токсического эффекта уже при концентрациях 10-20 мг/л. В то же время ФК морских вод обладают менее выраженным детоксицирующими свойствами, не вызывая полного снятия токсичности металлов во всем диапазоне исследованных концентраций. Для выявления взаимосвязи между детоксицирующими свойствами и структурными характеристиками ГФК полученные величины ДК50 были подвергнуты корреляционному анализу совместно с фрагментным составом ГФК. Максимальные значения коэффициентов корреляции были получены для параметров, отражающих обогащенность ГФК ароматическими структурами с СООН и ОН заместителями. Это подтверждает предположение о высоком вкладе салицильных фрагментов в комплексообразование ГФК 110 с металлами. По-видимому, повышение количества салицилатных фрагментов в молекулах ГФК вызывает прочное связывание в комплекс и снижает концентрацию токсичной для водоросли свободнорастворенной формы металлов. Таблица 2.12. Коэффициенты корреляции между ДК50 и параметрами структуры ГФК. (COOH+ArOH)*CAr (COOH+ArOH)*CAr ДК50(Cu) ДК50(Cd) ДК50(Pb) 0.99 0.98 0.99 CAlk-O 0.93 0.70 0.95 CS CAr 0.65 0.94 0. 2.6.2. Исследование взаимосвязи между структурой ГФК и их детоксицирующими свойствами по отношению к тяжелым металлам.

Полученные данные по фрагментному составу ГФК различного происхождения были использованы для установлении взаимосвязи с детоксицирующими свойствами ГФК по отношению к тяжелым металлам. Для этой цели были проведено исследование исследование детоксицирующих свойств ГФК различного происхождения. Характеристики детоксицирующего действия были сопоставлены со структурными дескрипторами, рассчитанными на основании данных по фрагментному составу ГФК. Детоксицирующие свойства ГФК были исследованы по отношению к трем опасным для природных экосистем тяжелым металлам - меди, кадмию и свинцу. Для проведения исследования были выбраны представители 4-х основных классов гумусовых кислот - ГК почв (HBW), ГФК торфа (HTL), ГФК речных вод (FMX8) и ФК морских вод (FSW). Препарат ФК морских вод и данные о его структуре были предоставлены NAOML (Miami, USA). В работе был использован метод альгологического биотестирования в водной среде с использованием в качестве биотеста культуры одноклеточных водорослей Chlorella vulgaris, в качестве тест-функции использовалась фотосинтетическая активность, измеряемая при помощи регистрации быстрой флуоресценции. Для оценки детоксицирующего действия ГФК была введена величина «коэффициент детоксикации» (D), соответствующая относительному изменению токсичности данной концентрации металла в присутствии ГФК, и рассчитываемая как R0 ( Rd Rd + t ) 100%, (2.18) D = 1 Rd ( R0 R t ) где R R0 Rd Rt Rd+t поскольку фотосинтетическая активность в контрольных экспериментах - тестируемая среда как без токсиканта, так и без детоксиканта;

в присутствии детоксиканта;

в присутствии токсиканта;

при совместном присутствии токсиканта и детоксиканта. эффект изменения фотосинтетической активности водорослей под Данная формула позволяет вычленить собственно детоксицирующий эффект, воздействием самих гумусовых кислот при таком способе расчета исключается. Для выбранных тяжелых металлов были определены концентрационные диапазоны токсического действия, от полного отсутствия токсичности по отношению к тест-объекту 112 до полного подавления фотосинтеза водоросли в условиях эксперимента (рис 2.19). Для проведения экспериментов по исследованию детоксицирующей способности гумусовых кислот были выбраны концентрации, вызывающие полное подавление фотосинтетической активности водорослей (50 мкг/ Cu2+, 800 мкг/л Cd2+, 2 мг/л Pb2+).

R/R0, % 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 CCu, мкг/мл R/R0, % 100 80 60 40 20 0 0 500 1000 1500 2000 CPb, мкг/мл 50 R/R0, % 100 80 60 40 20 CCd, мкг/мл Рис 2.19. Диапазоны токсического действия Cu2+, Cd2+ и Pb2+. В присутствии ГФК токсическое воздействие всех исследованных металлов на водоросли значительно снижается. Для исследованных препаратов ГФК были получены концентрационные зависимости детоксицирующего действия (рис. 2.20.).

100 80 60 40 D,% 100 80 D,% СCu= 50 мкг/л СГФК, мг/л 40 20 СCd= 800 мкг/л СГФК, мг/л 0 5 10 15 0 D,% 100 80 60 ГФК торфа - СPb= 2 мг/л СГФК, мг/л 0 5 10 15 20 ГФК0 речных вод ГК почв ФК морских вод 20 Рис. 2.20. Детоксикация тяжелых металлов препаратами ГФК различного происхождения. Для сопоставления детоксицирующего действия препаратов ГФК была использована величина ДК50 - концентрация ГФК, вызывающая 50% снижение токсичности металла. Как следует из полученных данных, исследованные препараты можно расположить в следующий ряд по величине их детоксицирующего потенциала: ГФК торфа > ГФК речных вод ГК почв >> ФК морских вод. ГФК торфа и ГК почв, а также ГФК речных вод оказались довольно близки по детоксицирующей способности, вызывая полное снятие токсического эффекта уже при концентрациях 10-20 мг/л. В то же время ФК морских вод обладают менее выраженным детоксицирующими свойствами, не вызывая полного снятия токсичности металлов во всем диапазоне исследованных концентраций. Для выявления взаимосвязи между детоксицирующими свойствами и структурными характеристиками ГФК полученные величины ДК50 были подвергнуты корреляционному анализу совместно с фрагментным составом ГФК. Максимальные значения коэффициентов корреляции были получены для параметров, отражающих обогащенность ГФК ароматическими структурами с СООН и ОН заместителями. Это подтверждает 114 предположение о высоком вкладе салицильных фрагментов в комплексообразование ГФК с металлами. По-видимому, повышение количества салицилатных фрагментов в молекулах ГФК вызывает прочное связывание в комплекс и снижает концентрацию токсичной для водоросли свободнорастворенной формы металлов. Таблица 2.13. Коэффициенты корреляции между ДК50 и параметрами структуры ГФК. (COOH+ArOH)*CAr (COOH+ArOH)*CAr ДК50(Cu) ДК50(Cd) ДК50(Pb) 0.99 0.98 0.99 CAlk-O 0.93 0.70 0.95 CS CAr 0.65 0.94 0. 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 3.1. Материалы и оборудование.

Растворители для спектроскопии 13С ЯМР В качестве растворителя для спектроскопии 13С ЯМР приготавливали 0.1 M раствор NaOH квалификации ч.д.а. в D2O производства ТОО "Изотоп" изотопной чистоты 99.5% D. В качестве внутреннего стандарта для спектроскопии (натриевая соль 3-триметилсилил-1-пропан-сульфокислоты).

С ЯМР использовали DSS Растворители для спектроскопии ПМР Диметилсульфоксид-d6 производства фирмы “Изотоп” сушили над CaH2 в течение 24 ч. при перемешивании с последующим вакуумным переносом. Затем ДМСО-d6 разливали по разбиваемым ампулам в атмосфере азота в количестве, необходимом для приготовления одного образца для снятия спектра (0.7 мл). Содержание воды проверяли по спектру ПМР, интегральная интенсивность пика воды составлял не более 8 % от интеграла пика ДМСО. Изотопная чистота ДМСО-d6 составляла 99.5% атомных.

Диметилсульфоксид-d6 производства фирмы Merck, в ампулах по 0.7 мл, изотопной чистоты 99.95 % атомных, содержал не более 0.02% воды и его осушка не производилась.

Дейтероксид, D2O а) Для проведения дейтерообмена препаратов ГФК использовали D2O производства ТОО "Изотоп" изотопной чистоты 99.5% атомных. б) В качестве растворителя для регистрации ПМР спектров использовали D2O фирмы Aldrich изотопной чистоты 99.996 атомных %, предварительно расфасованный в разбиваемые ампулы по 0.7 мл на вакуумной установке.

Дейтерированный гидроксид натрия, NaOD представлял собой 40% раствор NaOD в D20 производства фирмы Aldrich изотопной чистоты 99+ атомных %.

Дейтерированная трифторуксусная кислота CF3COOD производства фирмы “Изотоп” изотопной чистотой 98.5 атомных %. В качестве модельных соединений для спектроскопии ПМР использовали 2,4дигидроксибензойную кислоту квалификации "хч" и полидекстран производства фирмы "Polymerservice", ММ=4300 без дополнительной очистки. Для культивирования культуры водоросли Chlorella vulgaris использовали среду Тамия, состав которой приведен в табл. 3.1. рН среды Тамия доводили 0.1М КОН (чда) до величины 6.6 - 6.8. Для проведения токсикологических экспериментов в качестве токсикантов использовали CuSO4, CdSO4 и Pb(NO3)2 марки "чда".

116 Таблица 3.1. Приготовление культивационной среды Тамия Компонент KNO3 MgSO4 *7H2O KH2PO4 ЭДТА FeSO4*7H2O H3BO3 MnCl2*4H2O ZnSO4*4H2O MoO3 NH4VO3 Концентрация, г/л 5 2.5 1.25 0.037 3*10-3 2.76*10-3 1.81*10-4 2.24*10-5 1.75*10-5 2.3*10- 3.2. Выделение препаратов ГФК.

Препараты ГФК речных вод FMX-8 и FIX-8 были выделены сорбцией на смоле Амберлит ХАД-8 из вод р. Москва (район г.Звенигород), и р. Истра (выше Истринского водохранилища), соответственно по методике [Данченко,18]. Отфильтрованную и подкисленную концентрированной HCl до рН 2 речную воду пропускали через колонку со смолой до насыщенно-желтого окрашивания смолы (около 500 л.). Скорость пропускания составляла около 5 л/час. Затем колонку промывали дистиллированной водой до отрицательной реакции на Сl--ион по 0.1 М AgNO3 и десорбировали ГФК 0.1 М NaOH. Щелочной экстракт обессоливали пропусканием через катионит КУ-2-8 в Н-форме (рН полученных таким образом растворов составил 2.95-3.4). Катионит КУ-2-8 переводили в Н-форму пропусканием через колонку 30-кратного по объему количества 1М HCl. Препараты ГФК в твердой форме получали при упаривании обессоленных растворов на ротационном испарителе. Использованные в работе препараты ГК и ФК почв, а также препарат HTW были предоставлены кафедрой общего земледелия и охраны почв факультета Почвоведения МГУ. Препараты ГФК торфа, а также FWME-4, SWM-4 и SEL, были предоставлены лабораторией физической органической химии Химического факультета МГУ. Препараты BS1FA, FG1FA и HO10FA были предоставлены кафедрой водной химии Института им. Энглера и Бунте Технического университета Карлсруэ (Германия). В работе также были использованы коммерческие препараты ГФК торфа (НПО “Биолар”) и ГК бурых углей производства фирмы Aldrich и АО "Спецбиотех". Препарат ФК морских вод был предоставлен NAOML (Miami, USA). Полный перечень препаратов ГФК приведен в таблице 2.1.

117 Для элементного анализа и ЯМР-спектроскопии использовали твердые препараты ГФК, для гель-хроматографии и токсикологических экспериментов - обессоленные растворы, точный титр которых определяли упариванием аликвотной части раствора и высушиванием над P2O5 до постоянного веса.

Элементный состав препаратов ГФК определяли на двух элементных анализаторах: модель-1106 фирмы Carlo Erba Strumentazione (Италия) и модели СHN–O– Rapid-Gerдt фирмы Heraeus (ФРГ).

Определение молекулярной массы ГФК. Для определения молярной массы ГФК использовали гель TOYOPEARL-50HW(S) (Япония). Для элюирования ГФК использовали 0.028 М фосфатный буфер (рН 6.8). В качестве калибровочных веществ использовали полидекстраны (молекулярная масса 830, 4400, 9900, 21400, 43500, 2000000 дальтон).

3.3. Регистрация спектров ЯМР Спектры 13С ЯМР ГФК регистрировали в 10-мм ЯМР-ампуле на приборе VXR- фирмы Varian при рабочей частоте 100 МГц. Ширина развертки спектра составляла около 26000 Гц, время регистрации сигнала спада свободной индукции (ССИ) 0.6 с, интервал между импульсами (Td) от 1 до 8 с, при ширине импульса 45°, длительность накопления спектра 8 - 16 часов. В качестве внутреннего стандарта использовали DSS (натриевую соль 3-триметилсилил-1-пропансульфокислоты). Фурье-преобразование Гц.

Спектры ПМР регистрировали на спектрометре VXR-400 фирмы Varian на рабочей выполнялось с предварительным экспоненциальным взвешиванием сигнала ССИ с константой времени, эквивалентной уширению линий частоте 400 MГц. Ширина развертки спектра составляла около 8000 Гц (от -3 до 17 м.д.), время регистрации сигнала ССИ - 2 с, ширина импульса 17°, число импульсов для накопления спектра - 512. В качестве внутреннего стандарта использовали сигнал остаточных протонов дейтерорастворителя (ДМСО). При регистрации спектров в D2O в качестве внутреннего стандарта использовали DSS (натриевая соль 3-триметилсилил-1-пропансульфокислоты). Фурье-преобразование выполняли с предварительным экспоненциальным взвешиванием сигнала ССИ с константой времени, эквивалентной уширению линий 1 Гц.

Спектры DEPT и QUAT С ЯМР растворов ГФК в 0.1М NaOH/D2O регистрировали в 5-мм ампулах на приборе фирмы "Bruker" при рабочей частоте 75 МГц в Институте Экологической Химии (IOC) Центра по Охране Окружающей Среды и Здоровья Человека (GSF), Мюнхен, ФРГ. При регистрации спектров использовались 118 импульсные последовательности DEPT и QUAT, входящие в комплект программного обеспечения фирмы "Bruker". Ширина развертки спектров составляла около 35000 Гц. Отнесение сигналов проводили по химическому сдвигу внутреннего стандарта DSS. Обработку одномерных спектров проводили на персональном компьютере с использованием программ NUTS и WINNMR.

Двумерные спектры ЯМР регистрировали в 5 мм ампулах на спектрометре фирмы "Bruker" с рабочей частотой 500 МГц для ядер 1H в Институте Экологической Химии (IOC) Центра по Охране Окружающей Среды и Здоровья Человека (GSF), Мюнхен, ФРГ. Регистрация двумерных спектров ЯМР проводилась с использованием стандартных импульсных последовательностей COSY, TOCSY, EXSY, и CPMG, входящих в состав пакета программного обеспечения фирмы “Bruker”. Обработку двумерных спектров ЯМР проводили на рабочей станции “Silicon Graphics” с использованием программы XWINNMR.

Приготовление образцов для регистрации спектров 13С ЯМР Образцы для регистрации спектров ЯМР 13С готовили растворением навески 100 мг твердого препарата ГФК в 3.5 мл 0.1М NaOH в D2O.

Приготовление образцов ГФК для регистрации спектров ПМР.

Все работы по подготовке образцов для анализа во избежание попадания следов воды в образец проводились в отсутствие доступа воздуха на вакуумной установке. Осушение препаратов ГФК проводилось в высоком вакууме (<5*10-2) при 45°C в течение 6 часов. Для приготовления образцов использовались 5 мм пирексовые ЯМР-ампулы с подпаянным шлифом. Приборы для осушения и растворения препаратов ГФК показаны на рис. 3.1.

Приготовление образцов ГФК для регистрации спектров ПМР в ДМСО-d Навеску 15 мг ГФК помещали в 5 мм ЯМР-ампулу 5, припаянную к широкой трубке 4 с перетяжкой и шлифом, предварительно откачанную на вакуумной установке и прогретую. Затем в трубку помещали разбиваемую ампулу 3 с 0.7 мл ДМСО-d6, после чего трубку через кран подсоединяли к вакуумной установке. Сушку образца проводили в течение 6 часов при 45оС, после чего кран перекрывали, трубку снимали и встряхивали, разбивая ампулу с ДМСО. Растворитель перетекал в ампулу для ЯМР, которую после этого отпаивали. Время растворения различных препаратов ГФК в зависимости от зольности препарата составляло от 1 до 48 часов.

Приготовление образцов ГФК для регистрации спектров ПМР в ДМСО-d6 с предварительным дейтерообменом Образец ГК массой 15 мг помещали в прибор для дейтерообмена 2, предварительно высушенный под вакуумом, туда же помещали разбиваемую ампулу 1 с 0.7 мл ДМСО-d6. Сушку образцов проводили в течение 6 часов при 45оС на вакуумной установке. Затем быстро добавляли 1 мл D2O в прибор для обмена и снова подсоединяли его к вакуумной установке для удаления воздуха. В связи с неполным растворением препарата дейтерообмен проводили в течение трех дней в отсутствие доступа воздуха при перемешивании на магнитной мешалке. Затем воду отгоняли на вакуумной установке, сушили образец в течение 6 часов, после чего разбивали ампулу с ДМСО-d6, и происходило растворение образца. Раствор переливали в ампулу 3, которую отпаивали и помещали в трубку 4 с припаянной 5 мм ЯМР-ампулой 5 и шлифом, трубку подсоединяли через кран к вакуумной установке и откачивали. Затем кран перекрывали, ампулу 4 с раствором ГК разбивали встряхиванием и раствор перетекал в ампулу для ЯМР, которую потом отпаивали по перетяжке.

Приготовление образцов ГК для регистрации спектров ЯМР в ДМСО-d6 в присутствии CF3COOD Для регистрации ПМР спектров ГФК в ДМСО-d6 в присутствии CF3COOD ампулу с раствором ГФК в ДМСО вскрывали и микропипеткой добавляли 20 мкл CF3COOD, после чего регистрировали спектр.

Приготовление образцов ГК для регистрации спектров ЯМР в 0.1M NaOD/D2O При регистрации спектров ПМР в NaOD/D2O для уменьшения интенсивности сигнала HDO препараты ГФК подвергали предварительному дейтерообмену. Для этого навеску ГФК массой 15 мг помешали в прибор для дейтерообмена 2, предварительно высушенный под вакуумом, туда же помещали разбиваемую ампулу 1 с D2O высокой чистоты. Осушка образцов проводили в течение 6 часов при 45оС на вакуумной установке. Затем быстро добавляли 1 мл D2O и 5 мкл 40% NaOD в прибор для обмена, и снова подсоединяли его к вакуумной установке для удаления воздуха. Дейтерообмен проводили в течение 12 часов в отсутствие доступа воздуха. Потом воду отгоняли на вакуумной установке и образец сушили в течение 6 часов, после чего разбивали встряхиванием ампулу с D2O высокой чистоты. Раствор сливали в ампулу 3 и ее отпаивали. Ампулу с раствором помещали в трубку 4 с припаянной ЯМР-ампулой 5 и шлифом, трубку подсоединяли через кран к вакуумной установке и откачивали. Затем кран перекрывали, ампулу с раствором ГК разбивали встряхиванием, и раствор перетекал в ЯМР-ампулу, которую потом отпаивали.

2 Рис. 3.1. Приборы для приготовления образцов. 1. Разбиваемая ампула с растворителем. 2. Объем дла проведения реакции. 3. Разбиваемые ампулы. 4. Стеклянная трубка для разбивания ампулы 3. 5. Ампула для ЯМР.

3.3. Методика токсикологических экспериментов.

Культивирование тест-объекта В качестве объекта токсикологических исследований служила культура зеленой водоросли Chlorella vulgaris. Культивирование интенсивной культуры хлореллы (термофильный штамм) осуществляли на 20% -ной среде Тамия в термостатируемых культиваторах емкостью 200 мл, при температуре 35°С, с продувкой увлажненным воздухом, при освещенности 30 Вт/кв.м (люминесцентные лампы типа ЛДЦ-40) и рН 6.6-6.8. Перед тестированием водоросли разращивали в течение суток. Начальная плотность посадки - 500 тыс. кл./мл. К концу суток плотность клеток была не менее 10 млн. кл./мл.

Методика токсикологического эксперимента Интенсивную культуру хлореллы после суточного выращивания освобождали от культуральной среды и концентрировали центрифугированием в течение 3-х минут при скорости 5000 об./мин. Полученную суспензию водорослей пересеивали на 10% -ную среду Тамия, не содержащую фосфатов, ЭДТА и микроэлементов, добавляли токсиканты и гумусовые вещества в требуемых концентрациях. Объем исследуемых проб составлял 100 мл, начальная плотность культуры - 500 тыс. кл./мл. Остальные условия проведения опытов (освещенность, температура, рН, продувка увлажненным воздухом) были теми же, что и при выращивании культуры.

Регистрация тестовых параметров Для оценки состояния водорослей использовали параметры быстрой флуоресценции. Выход быстрой флуоресценции измеряли при помощи 2-х лучевого импульсного флуориметра. Измерения проводили в момент начала эксперимента, через 2 и через 4 часа. Интенсивность постоянной флуоресценции (Fо), которая отражает излучательные потери энергии возбуждения при миграции ее к открытым реакционным центрам, измеряли при освещении адаптированных к темноте образцов слабыми импульсами света. Интенсивность максимальной флуоресценции (Fm) при восстановленном первичном хинонном акцепторе измеряли аналогичным образом, но при дополнительном облучении образцов действующим светом в присутствии 10-5 М диурона. Относительный выход переменной флуоресценции, характеризующий квантовую эффективность первичной фотосинтетической реакции, рассчитывали как Fv/Fm, где Fv = Fm - Fo. У лабораторной культуры хлореллы в оптимальных условиях отношение Fv/Fm обычно составляет 0.75 - 0.80, и снижается при нарушениях фотосинтеза. У мертвых клеток Fv/Fm = 0.

ВЫВОДЫ 1. Количественно охарактеризован детальный фрагментный состав ГФК вод, почв, торфа и угля. Определены общие закономерности строения и установлены достоверные структурные различия ГФК указанных основных природных источников. Показано, что в структуре ГФК торфа и почв спиртовые гидроксилы в основном принадлежат полисахаридным фрагментам, а в ГФК пресных вод до 50% этих групп не входит в состав полисахаридов. Показано, что содержание сложноэфирных групп в ГК выше, чем в ФК. 2. Разработана схема расчета детального фрагментного состава ГФК, основанная на комплексном анализе данных 1Н и происхождения: СС=О, ССООН, ССООR, СArOH, СArOR, СArH, CArC, CO-Alk-O, ССНОН, ССН2ОН, СОСН3, CAlk 3. Разработан метод количественной характеристики распределения водорода С ЯМР спектроскопии. Предложен набор из структурных фрагментов, позволяющих детально описать структуру ГФК различного функциональных групп и углеродного скелета ГФК 1. 4. Экспериментально обоснованы оптимальные условия регистрации количественных ЯМР спектров ГФК. 5. Предложен способ использования данных по фрагментному составу для корректировки результатов гель-хроматографического определения молекулярных масс ГФК. 6. Установлена взаимосвязь структуры и детоксицирующих свойств ГФК по отношению к Cu2+, Cd2+, Pb2+.

С ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ Автор выражает глубокую признательность:

• Сотрудникам кафедры биофизики Биологического факультета МГУ д.б.н. Маторину Д.Н., д.б.н. Венедиктову П.С. и к.б.н. Вавилину Д.В. за оказанную помощь в организации токсикологических экспериментов.

• Сотруднику Института Экологической Химии (IOC), Мюнхен, Германия, Dr. N. Hertkorn за оказанную помощь в постановке двумерных ЯМР экспериментов и обсуждению полученных результатов.

• Сотруднику кафедры общего земледелия и охраны почв факультета почвоведения МГУ к.б.н. Лебедевой Г.Ф. за предоставленные препараты гумусовых кислот почв. А также организациям, оказавшим финансовую поддержку при выполнении данной работы:

• Robert Havemann Scholarship • Российскому Фонду фундаментальных исследований (гранты №96-04-49838 и №98-0333186а), • Госкомитету Российской федерации по высшему образованию (грант в области фундаментальных проблем охраны окружающей среды и экологии №4-26).

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Кононова М. М. Органическое вещество почвы. М., Изд-во МГУ, 1963. Орлов Д. С. Химия почв. М., Изд-во МГУ, 1992, 259 c. Орлов Д. С. Свойства и функции гуминовых веществ. В сб.: Гуминовые вещества в биосфере. М., Наука, 1993, с. 16-27. Rashid M.A. Geochemistry of marine humic compounds. Springer-Verlag, Oxford, 1985, 243 p. Линник П.Н., Набиванец Б.И. Формы миграции металлов в пресных поверхностных водах. Гидрометеоиздат. Л., 1986, 268 с. Schnitzer M., Khan S.U. Humic substances in the environment. N.Y., Marcel Decker, 1972, p. 12-17. Орлов Д. С. Гумусовые кислоты почв. М., Изд-во МГУ, 1974, 287 с. Stevenson F.J.//Geochemistry of Soil Humic Substances. In: Humic substances in soil, sediment and water. Aiken G.R., McKnight D.M., Wershaw R.L., MacCarthy P. (Eds.), N.Y., John Wiley & Sons, 1985, p. 13-52.

9.

Humic substances and their role in the environment. Rep. of Dahlem workshop, Berlin, 1987. John Wiley & Sons Limited. S. Bernhard. Dahlem Konferenzen. 1988, р. 133-148.

10. Bollag J.-M., Mayers K.//Sci. Total Environ., 1992, v. 117/118, p. 357-366. 11. Ziechman W.//Huminstoffen. Problemen, Methoden, Ergebniss. Weicheim: Chemie, 1980, 480 p. 12. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. Изд-во МГУ, М., 1990, 325 с. 13. Нефтепродукты: методы испытаний. Ч.1.-М., изд. стандартов, 1977, 379 с. 14. Coal Science. Corbaty M.L., Larsen J.W., Wender I., Academic Press, N.Y., 15. Кушнарев Д.Ф. Количественная спектроскопия ядерного магнитного резонанса природного органического сырья и продуктов его переработки. Дисс. докт. хим. наук. Иркутск, 1997, 267 с. 16. Данченко Н.Н. Функциональный состав гумусовых кислот: определение и взаимосвязь с реакционной способностью. Дисс. канд. хим. наук., Москва, 1997, 138 с. 17. Huffman E.W.D., Stuber Jr. and H. A. Analytical Methodology for Elemental Analysis of Humic Substances. In: Humic substances in soil, sediment and water Aiken G.R., McKnight D.M., Wershaw R.L., MacCarthy P. (Eds.), John Wiley & Sons. N.Y., 1985, p. 433-455.

126 18. Rice J.A., MacCarthy P.//Org. Geochem., 1991, v. 17, N. 5, p. 635-648. 19. Perdue E.M. // Geochim. Cosmochim. Acta. 1984, v. 48, p. 1435-1442. 20. Harvey G.R., Boran D. A., Tokar J.M. // Mar. Chem., 1983, N. 12, p. 119-132. 21. Buffle J., Altmann R.S.//Geochem. Cosmochim. Acta, 1988, v. 52, p. 1505-1508. 22. Stuermer D. H., Payne J. R.//Geochem. Cosmochim. Acta, 1976, v. 40, p. 1109-1114. 23. Wilson M.A., Philip R.P., Gillam A.H., Tate R.R. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1983, v. 47, p. 497-502. 24. Wilson M. A., Gillam A. H., Collin P. J. // Chem. Geol., 1983, v. 60, N. 3-4, p. 181-201. 25. Stuermer D. H., Peters K.E., Kaplan I.R. // Geochim. Cosmochim. Acta. 1978, v. 42, p. 989-997. 26. Piotrowicz S.R., Harvey G.R., Boran D.A. еt al. // Marine Chem., 1984, v. 14, p. 333-346. 27. Van Krevelen D.W. // Fuel, 1950, v. 29, p. 269-284. 28. Visser S.A. // Environ. Sci. Technol., 1983, v. 17, N. 7, p. 412-417. 29. Abbt-Braun G., Schmiedel U., Frimmel F.H. // Vom Wasser, 1990, B. 75, S. 59-73. 30. Beyer L. // Z. Pflanzenernahr. Bodenk., 1996, v. 159, p. 527-539. 31. Stevenson F.J., Goh K. M. // Soil Sci., 1972, v. 113, N. 5, p. 334-345. 32. Stevenson F.J. Humus chemistry. Genesis, composition, reactions. N.Y., Wiley Interscience, 1982, p. 221-237. 33. Драгунов, С.С. Методы исследования гумусовых веществ. Труды почв. инст. им. Докучаева, 1951, т. 38, с. 86-98. 34. Brunelot J., Adrian P., Rouiller J., Guillet B., Andreux F. // Chemosphere, 1989, v. 19, N. 8/9, p.1413-1419. 35. Piccolo A., Camici L. // Int. J. Environ. Anal. Chem., 1990, v. 41, p. 65-69. 36. Right J.R., Schnitzer M.//Trans. 7th Intern. Congr. Soil Sci., 1960, v. 2, p. 120-123. 37. Stevenson F. J., Butler I. H. A., In: Organic Geochemistry, New York: 1969, p. 534-535. 38. Schnitzer M., Desjardins J.G. // Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 1970, v. 34, p. 77-79.

127 39. Herbert B.E., Bortsch M., Novak, J.M. // Environ. Sci. Technol., 1993., v. 27, p. 398-403. 40. Ruffaldi R., Schnitzer M. // Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 1972, v. 36, N. 1, p. 301-305. 41. Wright, J.R., Schnitzer M. // Nature, 1959, v. 184, No. 4697, p. 1462-1463. 42. Кухаренко Т.А. // Хим. Тверд. Топл., 1937, т. 8, N 9, c. 803-813. 43. Кухаренко Т.А. // Хим. Тверд. Топл., 1937, т. 8, N 12, c. 1064-1072. 44. Сысков К.И. // Хим. Тверд. Топл., 1936, т. 7, N 6, c. 566-574. 45. Gillam A.H., Riley J.P. // Anal. Chim. Acta, 1982, v. 141, p. 287-299. 46. Schnitzer M.,Gupta U.C. // Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 1965, v. 29, p. 274-278. 47. Arsenie I., Boren H., Allard B. // Sci. Total Environ., 1992, v. 116, p. 213-220. 48. Noyes T.I., Leenheer J.A. Proton Nuclear Magnetic Resonance Studies of Fulvic Acid from the Suwannee River. In: Humic substances in the Suwannee river, Georgiaa: Interactions, properties, and proposed structures. Eds: Averett R.C., Leenheer J.A., McKnight D.M., and Thorn K.A. U.S. Geological survey water-supply paper 2373, 1994, p. 129-139. 49. Herzog, H.;

Burba, P.;

Buddrus, J. // Fresenius J. Anal.Chem., 1996, v. 354, N. 3, p. 375-377. 50. Ephraim J.H., Boren H., Arsenie I., Pettersson C., Allard B. // Sci. Total Environ., 1989, v. 81/82, p. 615-624. 51. Schnitzer M., Desjardins J.G. // Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 1962, v. 26, p. 362-368. 52. Perdue E.M. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1984, v. 48, p. 1435-1442. 53. Norwood, D.L. Critical comparison of structural implications from degradative and nondegradative approaches. In: Humic substances and their role in the environment, Eds: Frimmel, F.H. and Christman, R.F., John Wiley & Sons Limited, 1988, p. 133-148. 54. Ogner G. // Soil Sci., 1970, v. 110, N 2, p. 86. 55. Hayashi T., Nagai T. // Soil Sci. Plant Nutr., 1962, v. 8, N. 4, p. 22. 56. Clark F.E., Tan K.H. // Soil Biol. Biochem., 1969, v. 1, p. 75. 57. Зырин Н.Г., Овчинникова М.Ф., Орлов Д.С. // Агрохимия, 1964, N. 4, с. 168. 58. Григорьева Е.А., Кухаренко Т.А. // Методы анализа и контроля производства в химической промышленности. 1968, т. 13, с. 10. 59. Kumada K. Chemistry in soil organic matter. Tokyo, 1988.

128 60. Schulten H.-R. A chemical structure for Humic Acid. Pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry and pyrolysis-soft ionization mass spectrometry evidence. In: Humic Substances in the Global Environment and Implications on the Human Helth. Eds: Senesi N., Miano T.M., Elsevier Science B.V., 1994, p. 43-56. 61. Pauli F.W. Soil fertility. L., 1967. 62. Felbeck G.T. // Soil Sci., 1971, v. 111, N. 1, p. 42. 63. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. // Труды Тюменского СХИ, 1970, т. XIV, с. 131. 64. Ziechmann, W. Evolution of structural models from consideration of physical and chemical properties. In: Humic substances and their role in the environment, edited by Frimmel, F.H. and Christman, R.F. John Wiley & Sons Limited, 1988, p. 113-132. 65. Kleinhempel D. // Albrecht-Thaer-Archiv., 1970, Bd. 14, H. 1, S. 3-14. 66. Humic substances in the Suwannee river, Georgiaa: Interactions, properties, and proposed structures. Averett R.C., Leenheer J.A., McKnight D.M., and Thorn K.A. (Eds.) U.S. Geological survey water-supply paper 2373, 1994. 67. Shin H.S., Moon H. // Soil Sci., 1996, v. 161, N. 4, p. 250-256. 68. Stuermer D.H., Paine J.R. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1976, v.40, p. 1109-1114. 69. Ricca G. and Severini F. // Geoderma, 1993, v. 58, p. 233-244. 70. Skjemstad J.O., Frost R.L., Barron P.F. // Austr. J. Soil Res., 1983, v. 21, p. 539. 71. Wershaw R.L. In: Humic Substances in Soil, Sediment and Water. Eds. G.R. Aiken, D.M. McKnight, R.L. Wershaw and P. MacCarthy. Wiley, N.Y., 1985, p. 561-582. 72. Wilson, M.A. NMR techniques and applications in geochemistry and soil chemistry, Ch.8. Humic substances. Oxford, Pergamon Press, 1987, p. 182-216. 73. Wilson M.A. In: Humic Substances in Soil and Crop Sciences: Selected Readings. Ed P. MacCarthy, Madison, USA, 1990, p. 221-260. 74. Sotak C.H., Dumoulin C.L., Levy G.C. // Anal. Chem., 1983, V 55, p. 782-787. 75. Михайленко В.И., Михальчук В.В. // Ж. Прикл. Спектр., 1987, т. 46, N. 4, с.535-543. 76. Preston C.M., Schnitzer M. // J.Soil Sci., 1987, v. 38, p. 667-678. 77. Wilson M.A., Pugmire R.J. and Grant D.M. // Org.Geochem., 1983, v. 5, N. 3, p. 121-129.

129 78. Swift R.S., Leonard, R.L., Newman R.H. and Theng B.K.G. // Sci.Total Environ., 1992, v. 117/118, p. 53-61. 79. Malcolm R.L., Kennedy K., Ping C.L., Michaelson G.J. In: Soils and global change. Eds: Lal R., Kimble J., Levine E., Stewart B.A., Fractionation, characterization and comparison of bulk soil organic substances and water-soluble soil interstitial organic constituents in selected of Alaska. 1995, p 315-327. 80. Wilson M.A., Heng S., Goh K.M., Pugmire R.J. and Grant D.M. // J. Soil Sci., 1983, v. 34, p. 83-97. 81. Newman R.H., Tate K.R., Barron P.F. and Wilson M.A. // J. Soil Sci., 1980, v. 31, p. 623631. 82. Cook R.L., Langford C.H. // Environ. Sci. Technol., 1998, v. 32, p. 719-725. 83. Frund R. and Ludemann H.-D. // Sci.Total Environ., 1989, v. 81/82, p. 157-168. 84. Lobartini J.C. and Tan K.H. // Soil Sci.Soc.Amer.J., 1988, v. 52, p. 125-130. 85. Schnitzer M. and Preston C.M. // Soil Sci.Soc.Amer.J., 1986, v. 50, p. 326-331. 86. Lobartini J.C., Tan K.H., Rema J.A., Gingle A.R., Pape C. and Himmelsbach D.S. // Sci.Total Environ., 1992, v. 113, p. 1-15. 87. Malcolm R.L. Variations between humic substances isolated from soils, stream waters and groundwaters as revealed by 13C NMR spectroscopy. In: Humic substances in soil and crop science. Eds. P. MacCarthy, C.E. Clapp, R.L. Malcolm and P.R. Bloom. 1990, p. 13-37. 88. Hatcher P.G., Rowan R. and Mattingly M. // Org.Geochem., 1980, v. 2, p. 77-85. 89. Krosshavn M., Bjorgum J.O., Krane J. and Steinnes E. J. // Soil Sci., 1990, v. 41, p. 371-377. 90. Preston C.M. and Schnitzer M. J. // Soil Sci., 1987, v. 38, p. 667-678. 91. Preston C.M. and Blackwell B.A. // Soil Sci., 1985, v. 139, N. 1, p. 88-96. 92. Stearman G.K., Lewis R.J., Tortorelli L.J. and Tyler D.D. // Soil Sci. Soc. Amer. J., 1989, v. 53, p. 744-748. 93. Zech W. et al. // Z.Pflanzenernahr.Bodenk. 1997, v. 160, p. 563-571. 94. Piccolo A., Campanella L. and Petronio B.M. // Soil Sci. Soc. Amer. J., 1990, v. 54, p. 750756. 95. Ricca G. and Severini F. // Geoderma, 1993, v. 58, p. 233-244.

130 96. Conte P., Piccolo A., Van Lagen B., Buurman P. and De Jager P.A. // Geoderma, 1997, v. 80, p. 339-352. 97. Wilson M.A., Vassallo A.M., Perdue E.M. and Reuter J.H. // Anal. Chem., 1987, v. 59, p. 551-558. 98. Preston C.M. and Schnitzer M. // Soil Sci. Soc. Amer. J., 1984, v. 48, p. 305-311. 99. Watanabe A., Tsutsuki K. and Kuwatsuka S. // Sci. Total Environ., 1989, v. 81/81, p. 195-200. 100. Choudhry G.G. and Webster, G.R.B. // Toxicol. Environ. Chem., 1989, v. 23, p. 227-242. 101. Frund R, Haider K. and Ludemann, H.-D. // Z. Pflanzenernahr. Bodenk., 1994, p. 29-35. 102. Zech W., Ziegler F., Kogel-Knabner I. and Haumaier L. // Sci. Total Environ., 1992, v. 117/118, p. 155-174. 103. Wilson M.A. and Goh K.M., // J. Soil Sci., 1983, v. 34, p. 305-313. 104. Knulst J.C., Boershke R.C., Loemo S. // Environ. Sci. Tech., 1998, v. 32, N 1, p. 8-12. 105. Wilson M.A., Gillam A.H. and Collin P.J. // Chem.Geology, 1983, v. 40, p. 187-201. 106. Sohn M.L. // Org.Geochem., 1985, v. 8, N. 3, p. 203-206. 107. Wilson M.A., Heng S., Goh K.M., Pugmire R.J. and Grant D.M. // J. Soil Sci., 1983, v. 34, p. 83-97. 108. Malcolm R.L., MacCarthy P. // Environ Sci. Technol., 1986, v. 20, p. 904-911. 109. Wershaw R.L., Mikita M.A. and Steelink C. // Environ.Sci.Technol., 1981, v.15, N. 12, p. 1461-1463. 110. Steelink, C., Wershaw, R.L., Thorn, K.A. and Wilson, M.A. Application of liquid-state NMR spectroscopy to humic substances. In: Humic Substances II. In Search of Structure, edited by Hayes, M.H.B., MacCarthy, P., Malcolm, R.L. and Swift, R.S. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore: John Wiley & Sons, 1989, p. 281-309. 111. Ernst R.R. // Adv. Magn. Res., 1966, v. 2, p. 1-35. 112. Sotak C.H., Dumoulin C.L., Levy G.C. // Anal. Chem., 1983, v. 55, N 4, p. 782-787. 113. Hoult D.I., Chen C.N., Eden H., Eden M. // J. Magn. Res., 1983, v. 51, N 1, p. 110-117. 114. Pearson G.A. // J. Magn. Res., 1977, v. 27, N 2, p. 265-272.

131 115. Shoolery J.N. // Progress in NMR spectroscopy. 1977, v. 11, p. 79-83. 116. Thiault B., Messerman M. // Org. Magn. Reson., 1976, v. 8, N 1, p. 28-33. 117. Ernst RR, Morgan R.E., // Mol. Phys., 1971, v. 26, N 1, p. 49-74. 118. Noggle J.H., Schirmer R.E. The nuclear Overhauser effect. NY, Academ. Press, 1971, 259 p. 119. Knight S.A. // Chem. Ind., 1967, N 45, p. 1920-1923. 120. Conte P., Piccolo A., Van Lagen B., Buurman P. and De Jager P.A. // Geoderma, 1997, v. 80, p. 327-338. 121. Freeman R., Pachler K.G.R., La Mar G.N. //J. Chem Phys., 1971, v. 55, N 9, p. 4586-4593. 122. Levy G.C., Komorovsky R.A. // J. Am. Chem. Soc., 1974, v. 96, N 3, p. 678-681. 123. Смирнов М.Б., Крапивин А.М. Методика анализа углеводородных фрагментов высших фракций нефти с помощью спектроскопии ЯМР. В: Методы исследования состава органических соединений нефти и битумоидов. 1985, с. 138-181. 124. Kinchesh P, Powlson D.S., Randall E.W. //Europian J. Soil Sci., 1995, v.46, pp. 125-138. 125. Frund R., Guggenberger G., Haider K., et al. Z. Pflanzenernaehr. Bodenkd. // 1994, v. 157, p. 175-186. 126. Alemany L.B., Grant D.M., Pigmure R.J., Alger T.D. and Zilm K.W.// J. Am.Chem.Soc., v. 105, p. 2133-2141. 127. Alemany L.B., Grant D.M., Pigmure R.J., Alger T.D. and Zilm K.W.// J. Am.Chem.Soc., v. 105, p. 2142-2147. 128. Wilson M.A., Pugmire R.J, Grant D.M. // Org. Geochem., 1983, v. 5, p. 121-129. 129. Hatcher P.G. // Org. Geochem., 1987, v. 11, p. 31-39. 130. Frund R., Ludemann H.-D. // Sci. Total Environ., 1989, v. 81/82, p.157-168. 131. Earl W.L., Wershaw R.L., Thorn K.A.//J. Magn. Res., 1987, v. 74, p. 264-274. 132. NMR of Humic Substances and Coal - Techniques, Problems and Solutions. Eds. Wershaw R.L., Mikita M.A., Lewis Publishers, Chelsea, 236 p. 133. Ruggiero P., Interesse F.S., Sciacovelli O. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1979. v. 43., p. 1771-1775. 134. Ishiwatari R. // Chem. Geol., 1973., v. 12, p. 113-126. 135. Wilson M.A., Gillam A.H., Collin P.J. // Chem. Geol. 1983,. v. 40, p. 187-201.

132 136. Wilson M.A., Collin P.J., Tate K.R. // J. of Soil Sci., 1983, v. 34, p. 297-304. 137. Yonebayashi K., Hattori T. // Soil Sci. Plant Nutr., 1989, v. 35, p. 383-392. 138. Kawahigashi M. Fujitake N. Takahashi T. // Soil Sci. Plant Nutr., 1996, v. 42, p. 355-360. 139. Ruggiero P., Interesse F.S., Sciacovelli O. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1979, v.43, v. 1771-1775. 140. Ruggiero P., Sciacovelli O., Testini C., Interesse F.S. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1978, v. 42, p. 411-416. 141. Wershaw R.L. In: Humic Substances in Soil, Sediments, and Water. N.Y.: Wilev Interscience., 1985, p. 561-578. 142. Luedemann H.-D., Lentz H., Ziechmann W. // Erdoel und Kohle, 1973, v. 26, p. 506-509. 143. Ruggiero P., Interesse F.S., Cassidei L., Sciacovelli O. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1980, v. 44, p. 603-609. 144. Leenheer J.A., Noves T.I. In: Humic Substances II. John Wiley & Sons Ltd., 1989, p. 257279. 145. Lambert J., Buddrus J. // Magn. Reson. Chem., 1996, v. 34, №. 4, p. 276-282. 146. Kanitskaya L.V., Rokhin A.V., Gogotov A.F., Kushnarev D.F., Kalabin G.A. // Chem. Sustainable Develop., 1996, N. 4, p. 281-288. 147. Kanitskaya L.V., Ivanova N.V., Gorokhova V.G., Babkin V.A. // Chem. Sustainable Develop., 1996, N. 4, p. 275-280. 148. Two-Dimensional NMR Spectroscopy Eds. Croasmun W. R., and Carlson R. M. K., WILEY-VCH, Weinheim, 1996. 149. Buddrus J., Burba P., Herzog H., Lambert J. // Anal. Chem., 1989, p. 628-631. 150. Schmitt-Kopplin, P., Hertkorn, N:, Schulten, H.-R., Kettrup, A. // Environ. Sci. Technol., 1998, v. 32, p. 2531-2541. 151. Buffle J., Altmann R.S. // Geochem. Cosmochim. Acta, 1988, v. 52, p. 1505-1508.

Приложение 1.

Фрагментный состав ГФК различного происхождения по литературным данным (спектроскопия 13С ЯМР в растворе). СC=O СCOOH СAr-O СAr СAlk-O СAlk Источник ГК дерново-подзолистых и серых лесных почв 35 88 22 -"27 -"35 -"40 18 26 89 47 12 21 -"37 20 28 -"32 18 23 -"35 20 30 -"7 27 22 24 90 29 24 25 91 6 26 16 43 92 7 31 17 34 -"7 27 22 32 -"4 30 17 39 -"5 24 21 39 -"4 27 20 40 -"5 22 19 43 -"4 22 18 46 -"8 32 17 32 -"3 22 18 47 -"7 27 19 36 -"22 15 53 84 32 32 28 -"34 24 33 -"33 26 29 -"55 16 16 -"36 27 23 -"38 25 22 -"57 12 10 93 7 26 28 31 94 8 29 32 21 -"8 33 21 28 -"8 27 24 24 -"23 32 22 95 36 30 17 96 5 22 27 32 67 9 32 20 26 -"7 29 20 31 -"22 15 53 84 32 32 28 -"34 24 33 -"55 16 16 -"33 26 29 -" 16 20 16 28 16 3 22 9 11 12 11 11 10 10 11 12 10 12 11 8 9 12 13 15 15 22 6 8 8 11 22 17 14 14 13 10 8 9 13 12 134 14 15 12 13 0 22 14 15 24 27 29 24 4 15 12 13 1 1 20 21 7 7 15 6 6 7 11 8 16 12 4 6 33 16 21 8 8 37 41 33 7 22 5 33 25 11 15 17 17 18 17 36 38 37 41 27 25 ГК черноземов 19 20 ФК почв 24 22 35 48 49 36 39 30 42 25 22 57 19 20 16 70 24 24 ГФК почв 46 41 17 43 21 27 31 28 21 23 22 32 26 27 18 27 22 23 18 24 17 15 19 32 26 38 18 26 -"-"84 -"67 98 89 -"-"-"99 -"-"90 91 84 -"100 -"67 103 83 66 105 67 66 90 106 -"88 77 67 -"100 -"-" 18 19 9 7 11 6 15 12 3 1 1 1 9 9 12 36 ГК природных вод 42 18 21 21 ФК природных вод 24 21 28 20 20 13 25 16 27 15 ГФК торфа 33 30 51 ГК углей 47 9 44 9 32 16 42 6 39 13 17 25 48 44 135 Фрагментный состав ГФК различного происхождения по данным спектроскопии 13С ЯМР в твердом теле. СC=O 10 20 4 9 10 7 14 15 13 16 15 18 16 31 11 8 9 12 13 15 15 12 13 9 7 10 11 10 10 8 6 9 9 10 12 8 11 8 6 9 8 19 18 7 3 16 18 СCOOH СAr-O СAr СAlk-O СAlk Источник ГК дерново-подзолистых и серых лесных почв 26 64 77 25 22 33 78 7 24 27 21 79 19 43 29 80 15 44 30 80 27 81 3 19 22 34 82 14 47 24 83 11 49 25 -"16 50 22 -"41 31 12 -"27 49 10 -"16 51 15 -"62 12 11 -"33 22 14 -"22 15 53 84 32 32 28 -"34 24 33 -"33 26 29 -"55 16 16 -"36 27 23 -"38 25 22 -"37 19 32 -"41 20 26 -"39 38 85 39 42 -"37 38 -"33 39 -"34 43 -"34 41 -"41 39 -"37 47 -"36 43 -"37 42 -"38 36 -"32 36 -"38 39 -"33 39 -"37 41 -"33 51 -"35 42 -"35 39 -"34 48 86 45 37 -"48 45 -"46 51 -" 136 19 18 10 5 6 6 7 2 1 4 6 3 21 32 4 9 19 18 5 6 5 8 8 7 4 11 15 7 10 5 9 10 5 11 11 11 6 6 7 7 8 5 8 9 6 7 9 9 10 10 12 14 16 21 22 24 4 7 21 22 23 23 18 23 22 21 25 16 17 16 15 14 15 13 9 18 20 20 22 18 23 34 7 2 29 4 6 10 13 13 19 26 26 13 16 18 15 15 13 14 13 18 42 11 25 27 42 31 14 51 55 20 30 34 27 33 30 27 71 23 19 24 20 ГК черноземов 19 24 31 27 27 20 ФК почв 32 34 20 29 12 21 35 8 55 61 58 45 41 29 25 25 ГФК почв 11 29 16 46 56 49 54 45 42 54 39 44 39 56 56 48 42 58 55 45 40 57 54 49 49 49 30 27 26 25 23 18 30 27 17 16 20 18 22 16 18 18 13 22 22 23 20 22 21 35 16 19 18 23 30 18 28 24 25 22 24 29 36 20 25 34 42 19 19 22 20 23 -"-"-"87 -"-"-"97 -"87 -"-"96 95 79 82 -"-"87 -"-"-"-"-"-"101 -"102 -"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-" 137 10 5 5 7 13 14 4 3 10 15 3 8 14 9 9 10 32 29 30 36 4 6 16 14 18 17 30 9 8 8 10 9 7 8 10 10 16 9 10 28 32 23 26 29 49 28 26 37 45 26 24 17 21 19 20 19 16 49 60 58 55 49 48 ГК природных вод 11 38 24 29 24 14 18 18 19 22 34 21 -"-"-"-"-"-"104 79 88 -"-"-"87 -"-"-"104 79 87 -"-"-"107 108 -"-"-"-"-"-"-"-"-"-"-" 7 7 8 7 4 5 11 5 9 9 6 5 5 5 6 6 3 5 6 6 9 6 16 17 14 16 14 19 17 17 18 22 17 26 14 ФК природных вод 12 35 18 30 19 23 23 17 ГФК торфа 51 ГК углей 13 12 11 14 12 6 11 10 15 8 12 23 30 23 26 32 22 37 41 31 39 13 43 39 51 41 41 32 45 45 30 21 44 Приложение Интегральная интенсивность сигналов (%) в спектрах ПМР препаратов ГФК в ДМСО-d6 Препарат ГФК HBW HBWN SEL HMG BS1FA FA1N FA3N T5 T6 T7 T10 HTL TTL HTO SWM4 FMX-8 FIX-8 FG1FA HO10FA AGK AHA 16.5-11.5 8.6 6.4 5.0 5.0 13.4 12.4 12.8 4.4 5.3 6.3 8.4 7.3 7.0 5.5 9.5 11.4 8.4 9.3 10.5 13.3 11.4 Спектральная область, м.д. 11.5-6 6-3.2 3.2-2.05 19.5 34.7 19.7 16.0 28.6 13.0 9.9 28.8 43.4 13.1 13.1 58.0 14.8 32.4 14.7 15.2 30.4 23.1 16.6 33.3 21.2 9.0 23.4 43.8 13.4 23.2 44.3 20.4 48.1 11.0 23.0 40.4 10.6 17.7 42.5 12.5 20.2 40.8 12.6 21.2 40.3 11.1 16.2 47.5 16.4 11.4 34.2 23.1 17.9 38.7 13.0 7.2 21.2 15.7 19.0 36.1 19.3 28.0 12.4 24.5 26.6 19.5 23.1 2.05-0.5 17.6 35.9 12.9 10.8 24.7 19.0 16.2 19.3 14.9 14.2 17.5 20.1 19.4 22.1 10.5 20.0 22.0 46.5 15.2 21.9 19. 139 Интегральная интенсивность сигналов (%) в спектрах ПМР препаратов ГФК в ДМСОd6 с добавкой CF3COOD. Препарат Спектральная область, м.д. ГФК 11.5-6 6-3.2 3.2-2.05 2.05-0.5 16.9 34.4 25.6 23.1 HBW 13.9 26.7 15.7 43.7 HBWN 9.6 26.2 48.9 15.3 SEL* 10.0 11.0 66.8 12.2 HMG 13.3 39.1 17.6 30.0 BS1FA 11.1 31.4 31.4 26.1 FA1N 12.6 35.8 29.1 22.5 FA3N 7.2 20.7 51.6 20.5 T5 9.1 20.7 53.6 16.5 T6 16.6 46.0 15.6 21.9 T7* 17.7 45.3 14.7 22.3 T10 13.6 43.5 17.1 25.8 HTL 15.6 42.0 19.2 23.2 TTL 13.9 36.6 18.4 31.1 HTO 12.3 49.3 23.3 15.1 SWM4 8.8 35.0 30.0 26.3 FMX-8 13.1 38.8 17.5 30.6 FIX-8 5.6 20.0 18.6 55.8 FG1FA 14.5 38.2 26.3 21.1 HO10FA 27.2 15.4 30.2 27.2 AGK 23.4 23.4 28.7 24.6 AHA * добавлено 40 мкл CF3COOD Интегральная интенсивность сигналов (%) в спектрах ПМР препаратов ГФК в NaOD/D2O после H-D обмена. Препарат ГФК T7 TTL HMG FIX- Спектральная область, м.д. 9.5-6 12 14 21 9 6-4.48 30 27 15 32 4.48-3.2 27 32 26 27 3.2-0.5 31 27 38 Приложение 3.

Pages:     | 1 ||



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.