WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ...»

-- [ Страница 2 ] --

Таблица 5. Результаты взаимодействия белка с ферментом в зависимости от концентрации белка Серии парата С-1 С-2 С-3 пре- Показатели 2,5 Rz Активность Rz Активность Rz Активность 0,19 1:25 0,28 1:50 0,22 1:25 Концентрация белка, мг/мл 5 10 0,52 1:600 0,39 1:400 0,50 1:800 0,50 1:6 00 0,38 1:400 0,50 1: Примечание: Rz - показатель соотношения экстинции при спектрофотометрии пероксидазы хрена при длине волны 403 нм и белка при 280 нм. Полученные конъюгаты исследовали на активность, специфичность и чувствительность. Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике M.Clark и A.Adams (1977) в “сэндвич”-варианте ИФА, оптимизируя некоторые параметры. В работе использовали полистироловые планшеты для иммунологических реакций Красноярского завода. Планшеты сенсибилизировали туберкулёзными иммуноглобулинами в концентрации 100 мкг/мл в объеме 0,1 мл КББ рН 9,5, инкубировали 3 часа при температуре 37 0C. Несорбированные иммуноглобулины удаляли, в лунки вносили по 0,1 мл туберкулёзного водорастворимого антигена с концентрацией белка 0,1 мг/мл, инкубировали 1 час при температуре 37 0С. Несвязавшиеся антигены удаляли, планшеты промывали 5-кратно по 34 мин 0,05 % раствором твин-20 в ФСБ и просушивали. Затем вносили по 0,1 мл разведенного пероксидазного конъюгата от 1:100 до 1:800, инкубировали 1 час при температуре 37 0С. После промывки добавляли по 0,1 мл свежеприготовленного субстрат-индикаторного раствора (0,1 М раствор лимонной кислоты с 0,2 М раствором натрия фосфорнокислого однозамещенного рН 5,0 в присутствии 0,006 % перекиси водорода и ортофенилендиамина в концентрации 0,4 мг/л) и инкубировали 10 мин при температуре (22 +4) 0С без доступа света. Для остановки реакции использовали 2 М раствор серной кислоты. Результаты реакции учитывали визуально и на фотометре ПЭО ФЭК при длине волны 492 нм путем определения оптической плотности (ОП) проб, находящихся в лунках планшета. Результаты считали положительными, если ОП исследуемого образца в 2 и более раз превосходила среднее значение ОП отрицательных контролей. Рабочий титр разработанных нами иммунопероксидазных туберкулёзных конъюгатов всех изготовленных серий составил 1:400–1:800 с соответствующими штаммами. Чувствительность конъюгатов по водорастворимым антигенам – 50 – 100 нг/мл. Все серии полученных конъюгатов для ИФА дали отрицательные результаты с гетерологичными штаммами (таблица 6), что свидетельствовало об их специфичности. Кроме того, для оценки чувствительности и специфичности конъюгатов в качестве тест-объектов использовали взвеси клеток туберкулёзных штаммов. За рабочее разведение конъюгата принимали такое максимальное разведение последнего, при котором в ИФА выявлялось минимальное количество клеток возбудителя при отсутствии окрашивания контроля. Чувствительность иммунопероксидазных конъюгатов по корпускулярным антигенам составила 5х10 4 – 1х10 5 м.к./мл (таблица 6). Лабораторные испытания экспериментальных серий иммунопероксидазных конъюгатов показали, что они отвечают ОМБТ, предъявляемым к таким препаратам (таблица 7). На основе полученных препаратов были сконструированы тестсистемы для экспресс-диагностики возбудителя туберкулёза, состоящие из 1 ампулы иммуноферментного конъюгата, 1 ампулы положительного контроля (взвесь туберкулёзного микроба)- м.к./мл, 1 ампулы иммуноглобулинов туберкулёзных и необходимых ингредиентов для постановки ИФА (ФСБ, твин-20, БСА, 2 М раствора серной кислоты, ортофенилендиамина, таблетки гидроперита (перекись водорода). Таблица 6. Результаты по определению активности, чувствительности и специфичности иммунопероксидазных конъюгатов №№ пп Серии иммунопероксидазных конъюгатов Наименование С-1 С-2 С-3 штаммов микроор- рабо- чувстви- рабочий чувстви- рабочувстганизмов чий тельтитр тельчий вительтитр ность ность титр ность м.к./мл м.к./мл м.к./мл 1/800 1х10 5 1/600 5х10 4 M. tuberculosis hu- 1/600 5х10 4 manus Н 37 RA 1/600 1х10 5 1/400 5х10 4 1/600 1х105 BCG Отр. Отр. Отр. M. кansasii Yoss Отр. Отр. Отр. М. intracellulare #2 Отр. Отр. Отр. Nocardia brasiliensis Отр. Отр. Отр. Br. melitensis 16-M, 565, Rev-1, Br. abortus 544;

19-BA,345, Br. suis 1330;

508, 6 Salmonella typhi 818, Отр. Отр. Отр. 4446 Отр. Отр. Отр. Streptococcus faecalis Staphylococcus epidermidis Listeria monocytogenes 1 –7 серотип Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр.

1. 2. 3. 4. 5. 6- 17-18 19. 20 21- Таблица 7. Характеристика иммунопероксидазных конъюгатов Критерии оценки 1 Внешний вид Растворимость Прозрачность Цветность раствора рН Потеря в массе при высушивании Rz – количественное соотношение фермент /белок Активность Чувствительность 2 Серии 3 компактная пористая таблетка белого цвета в 1 мл дистиллированной воды в течение 1 мин. раствор прозрачен бесцветный или слегка желтоватого цвета 7,2 7,1 7,4 2,2 2,3 2,1 0,52 1:600 5х10 4 0,48 1:800 1х10 5 0,43 1:800 1х На первом этапе конструирования иммуноферментного конъюгата провели подбор оптимальных условий получения препарата, в качестве лиганда используя иммуноглобулины туберкулёзные, полученные из адсорбированной сыворотки. Второй этап работы - оптимизация постановки анализа. Третий этап - конструирование тест-систем для экспресс-диагностики. Одной ампулы с препаратом в объеме 0,1 мл с активностью-1:600 достаточно для проведения 300 иммуноферментных анализов с дубликатом. Таким образом, в результате проведённых исследований получены высокоактивные (до 1:800), специфичные (отсутствуют перекрёстные реакции с гетерологичными штаммами) иммуноферментные конъюгаты, позволяющие выявлять МТБ от 5х10 4 - 1х10 5 м.к./мл. 4.2. Получение липосом и липосомально-иммунопероксидазного конъюгата Липосомы получали из фосфолипидов и ганглиозидов, выделенных из мозга к.р.с., а в последнее время из мозга свиньи (ТУ 9154-00-018970802004), не являющегося потенциально опасным при губчатой энцефалопатии животных (коровье бешенство). Разработанная биотехнология выделения сырья для приготовления липосом включала следующие этапы: 1. Головной мозг животного в количестве 1000 г гомогенизировали в 4000 мл охлаждённого до минус 20 0С ацетона, периодически перемешивая в течение 12 ч. Суспензию фильтровали на воронке Бюхнера, осадок вновь суспендировали в 2000 мл охлаждённого ацетона в течение 4 часов и повторно фильтровали на воронке Бюхнера. 2. Для извлечения фосфолипидов и ганглиозидов полученный осадок экстрагировали 2000 мл смеси хлороформ - этанол (1:1) при встряхивании на шуттеле в течение 1 ч при температуре 20 0С. На этом этапе мы использовали указанную экстрагирующую смесь в отличие от традиционной, высокотоксичной смеси, включающей хлороформ и метанол.

Если традиционный метод выделения фосфолипидов требует удаления экстрагирующего раствора на роторном испарителе, то нами фосфолипиды осаждались из него при добавлении 1,5-2 объёмов охлаждённого (-20 0С) ацетона. При этом осаждался и холестерин, необходимый для стабилизации липосом в процессе их приготовления. Данный способ выделения фосфолипидов защищён патентом РФ № 2192265 от 10.10.2002. 3. Осадок фосфолипидов, собранный при фильтровании, высушивали при комнатной температуре до постоянного веса. Выход препарата составил 1,4 % от массы исходного сырья. В дальнейшем препарат растворяли в хлороформе (50 мг/мл) и хранили в сосуде с притёртой пробкой в темноте под подушкой инертного газа (азота) при температуре 4 0С. Для предотвращения перекисного окисления липидов в процессе приготовления липосом в их хлороформный раствор вносили 0,05 % -токоферола. 4. При внесении в надосадочную жидкость, образующуюся после изоляции из органической смеси фосфолипидов, дополнительно охлаждённого ацетона до 5 объёмного соотношения, в осадок выпадала фракция ганглиозидов, также используемая нами при конструировании липосом. Способ получения ганглиозидов защищён патентом РФ № 2195296 от 27.12.2002. Высушенный осадок ганглиозидов растворяли в хлороформе (50 мг/мл) и хранили в условиях, аналогичных хранению фосфолипидов. Разработанная биотехнология выделения фосфолипидов и ганглиозидов представлена на рис. 7. Хроматографическое изучение полученного препарата фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Силуфол» в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (65:25:4) с использованием в качестве свидетелей тест-наборов стандартов фосфолипидов и холестерина показало наличие в нём преимущественно фосфотидилхлолина, фосфотидилсерина, фосфотидилинозита и холестерина, которые выявлялись при прокрашивании парами йода (Кейтс М., 1975).

Головной мозг животного Гомогенизация +ацетон Гомогенат Обезвоживание и уда+Хлороформэтанол (2:1) ление растворимых в ацетоне липидов Осадок удаляется Экстракт +1,5-2 объёма ацетона Надосадок (ганглиозиды, растворимые в ацетоне липиды) Осадок (фосфолипиды, холестерин) +ацетон до 5 объёмов к хлороформо-этанольному экстракту Осадок (ганглиозиды) растворение в хлороформе Раствор фосфолипидов (50 мг/мл) растворение в хлороформе Раствор ганглиозидов (50 мг/мл) Суммарный раствор фосфолипидов и ганглиозидов (20:1), стабилизированный добавлением 0,05 % -токоферола Рисунок 7. Биотехнологическая схема выделения фосфолипидов и ганглиозидов из головного мозга животных Липосомы получали методом «выпаривания в обращённой фазе» согласно методическим рекомендациям «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом» (2000 г.), используя в качестве сырья для их приготовления хлороформные растворы фосфолипидов и ганглиозидов в соотношении 20:1.

С этой целью в хлороформную смесь указанных липидов дополнительно вносили хлороформ до достижения липидной концентрации 30 мг/мл. К 3 мл этого раствора добавляли 1 мл водной фазы в виде 0,01 М ФСБ рН 7,2, содержащего 0,01 % хлористого кальция. Для исключения негативного влияния ультразвука на липиды, которые при этом интенсивно окисляются, полученную смесь перемешивали в течение 10-12 мин на скоростной мешалке до образования стойкой эмульсии типа «вода в масле». Затем эмульсию упаривали в вакууме на роторном испарителе при температуре нагревающей жидкости 45 0С, не допуская кипения и вспенивания смеси, до полного удаления органической фазы. В дальнейшем колбу снимали с испарителя, к образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М ФСБ рН 7,2 и интенсивно встряхивали в присутствии стеклянных бус до образования гомогенной структуры липосом. Контроль образования и размеров липосом осуществляли с помощью электронного микроскопа при инструментальном увеличении х 5000-50000. Для этого на сетку-подложку, покрытой формваровой плёнкой, с помощью бактериологической петли наносили взвесь полученных липосом, предварительно разводя их 0,01 М ФСБ рН 7,2 до получения суспензии, хорошо просматривающейся при электронной микроскопии. После нанесения взвеси на сетку избыток удаляли фильтровальной бумагой. Липосомы, находящиеся на сетке, контрастировали 1 % водным раствором уранилацетата, который наносили бактериологической петлёй. В результате изучения полученных препаратов на электронном микроскопе были обнаружены липосомы со средним размером 150-300 нм, который рассчитывали по формуле: D = ( n · DV / n )1/3 · К-1, где D – средний диаметр липосом в препарате (мкм);

DV – средний размер липосом в каждой группе (мкм);

n – число липосом в каждой группе;

К – коэффициент увеличения, включая инструментальное увеличение микрофотографий. Полученные липосомы были использованы в качестве «твёрдой» фазы при получении иммуноферментного препарата для диагностики МТБ. Кова лентно фиксируясь на поверхности мембраны липосом, фермент и иммуноглобулин резко снижают способность к конформационным изменениям структуры своих молекул под воздействием повышенной температуры, изменениях рН среды и т.д. Всё это способствует повышению стабильности и увеличению срока годности диагностической системы. Для получения диагностикума мы предварительно активировали пероксидазу хрена. С этой целью (5 ±0,1) мг пероксидазы хрена растворяли в 1 мл раствора натрия углекислого кислого в концентрации 0,3 моль/л, добавляли 0,025 мл 0,32 % раствора формалина. Смесь перемешивали на мешалке в течение (30±5) мин при температуре (22 ±4) С и добавляли 1 мл раствора перйодата натрия в концентрации 0,04 моль/л, продолжая перемешивать в течение (30±5) мин при температуре (22 ±4) С. Далее вносили 1,0 мл раствора этиленгликоля в концентрации 0,16 моль/л (для снижения поверхностного натяжения), осторожно перемешивая в течение (60±5) мин при температуре (22 ±4)0С. В конце процедуры препарат активированной пероксидазы должен быть жидким, прозрачным, без запаха, зеленоватокоричневой окраски. Активированную пероксидазу переносили в диализный мешок и диализовали против 1 л 0,01 М КББ рН (9,55 ±0,05), в течение (19±1) ч на мешалке при температуре 2-8 0С в холодильной камере. Данная процедура приводила к образованию альдегидных групп в углеводной части фермента пероксидазы. В дальнейшем на наружной мембране липосом последовательно фиксировали пероксидазу хрена и туберкулёзные иммуноглобулины класса G. С этой целью к 5 мг окисленной перйодатным методом пероксидазы добавляли 1 мл суспензии липосом в 0,01 М КББ рН 9,5, содержащей 18 мг липидов.* Суспензию подвергали в течение 1 мин ультразвуковой обработке, обеспечивающей эффективный контакт поверхности липидной мембраны липо*

Работа выполнялась совместно со с.н.с. СтавНИПЧИ Зайцевым А.А., гл.спец. Диковой С.П. и гл.спец. Головченко Т.В.

сом с ферментом, после чего смесь инкубировали при комнатной температуре 1 ч. Ковалентное связывание липосом с ферментом осуществлялось за счёт части активированных групп пероксидазы и аминогрупп, присутствующих в молекулах ганглиозидов, встроенных в мембрану липосом при их приготовлении. Несвязавшуюся пероксидазу удаляли хроматографически, используя колонку 100х12 мм с сефадексом G-100, уравновешенную 0,01 М КББ рН 9,5. В первом пике экстрагировались активированные ферментом липосомы, во втором – несвязавшийся фермент. Фракции первого пика объединяли и к ним добавляли туберкулёзные иммуноглобулины Ig G в количестве от 2,5 до 10 мг/мл. Фиксацию иммуноглобулинов на поверхности липосом с иммобилизированной пероксидазой хрена проводили при температуре (22+4) 0С, помешивая на шуттеле в течение 1-24 ч и стабилизировали 5 мг боргидрида в холодильнике при температуре (4-6) 0С. При этом иммуноглобулины за счёт свободных аминогрупп связывались с оставшимися свободными альдегидными группами углеводной части пероксидазы. Для очистки конъюгата от несвязавшихся иммуноглобулинов использовали гель-хроматографию. Коньюгат наносили на колонку 100х12 мм с сефадексом G-100, уравновешенную ФСБ в концентрации 0,1 моль/л, рН (7,2+0,1). В результате происходило фракционирование исходной смеси молекул на зоны в зависимости от их размеров. Поэтому в первом пике (свободном объёме колонки) выходил конъюгат, далее несвязавшиеся иммуноглобулины. Элюцию проводили тем же буферным раствором, фракции собирали по 2,0 мл и исследовали поглощение каждой фракции визуально по мутности раствора и на спектрофотометре при двух длинах волн – 280 и 403 нм. Фракции, имеющие отношение А403/А280, равное 0,4-0,5, объединяли и к готовому препарату добавляли до 1 % БСА. Установлено, что наиболее высокочувствительный липосомальный иммуноферментный диагностикум был получен при концентрации белка им муноглобулинов 5 мг/мл и времени их инкубации с липосомальным ферментным конъюгатом 2 ч (рис.8). Для увеличения срока годности препарат разливали в ампулы, замораживали и лиофилизировали в течение (18 ±2) ч до конечной температуры 25 0С. В готовом препарате контролировали физико-химические (растворимость, цветность, прозрачность, потерю в массе при высушивании) и иммунологические свойства (активность, специфичность, чувствительность) после лиофилизации и в процессе хранения в течение 2 лет (срок наблюдения). Чувствительность и специфичность конъюгата определяли в ИФА аналогично способу, описанному выше, с гомологичными и гетерологичными штаммами.

Чувствительность, м.к/мл 2,5 104 2,4 105 2,3 107 2,2 108 2,1 109 Н А 1 2 4 Время, ч Рисунок 8. Зависимость чувствительности липосомального иммуноферментного диагностикума от времени иммобилизации туберкулёзных иммуноглобулинов Биотехнологическая схема получения липосомального иммуноферментного диагностикума представлена на рисунке 9.

Пероксидаза хрена 0,32 % формалин Инкубация 30 мин на мешалке Инкубация 30 мин при встряхивании Инкубация 60 мин при встряхивании Диализ против 0,01 М КББ, рН 9,5 Активированный раствор пероксидазы хрена УЗДН обработка мин при 22 кГц 1 0,04 М раствор перйодата натрия 0,16 М раствор этиленгликоля Липосомы Гель-фильтрация Инкубация 2 ч при встряхивании Стабилизация путём добавления боргидрида Гель-фильтрация Контроль Rz, активности, специфичности Добавление БСА до 1 % и лиофилизация Иммуноглобулины Рисунок 9. Биотехнологическая схема получения липосомального иммуноферментного диагностикума В таблице 8 представлены результаты анализов физико-химических свойств и чувствительности препарата. Разработанные препараты удовлетворяют требованиям нормативных документов, а их стабильность превосходила традиционные иммуноферментные конъюгаты. Таблица 8. Свойства лиофилизированного липосомального иммуноферментного диагностикума в процессе хранения Серия Потепрепа- ря в рата массе при высушивании 1 2, Срок наблюдения 1 год Растворимость и внешний вид Чувствитель ность 1,5 года Растворимость и и внешний вид Чувствитель ность 2 года (срок наблюдения) Растворимость и внешний вид Чувствитель ность 1 мин 1х 2 2,6 2, Раствор белого цвета 1 мин 5х104 Раствор белого цвета 1 мин 1х105 Раствор белого цвета 1 мин Раствор белого цвета 1 мин Раствор белого цвета 1 мин Раствор белого цвета 1х 1 мин 1х105 Раствор белого цвета 1 мин 5х104 Раствор белого цвета 1 мин 1х105 Раствор белого цвета 5х104 1х Таким образом, в результате проведённых исследований разработана биотехнология изготовления иммобилизованного ферментного препарата, значительно увеличивающая его стабильность. Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций: «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденных Первым зам. министра здравоохранения РФ, Главным Государственным санитарным врачом России Г.Г. Онищенко 06.04.2000 г. На Федеральном уровне утвержден нормативный документ (НД): технические условия (ТУ) 9154-00-01897080-2004 на фосфолипиды для получения липосом. Утверждены зам. Главного Государственного санитарного врача РФ Е.Н. Беляевым (Письмо № 12 ФЦ/ 2514 А от 19. 08. 2004 г).

На учрежденческом уровне утвержден регламент на липосомальную основу для получения диагностических, лекарственных и косметических препаратов (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 4 от 20.04.04).

ГЛАВА 5. Получение туберкулёзных суспензионных диагностикумов. 5.1. Биотехнология изготовления латексного диагностикума Реакция агглютинации латекса (РАЛ) известна давно. Данная реакция по своему механизму аналогична реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), но химические свойства латексных микроносителей относительно постоянны и поддаются более легкой и точной характеристике по сравнению с поверхностными структурами наружной мембраны эритроцитов, которые широко варьируют в зависимости от многих условий, таких как пол, возраст, гормональный статус животного-продуцента, время взятия крови, источника выделения и методов предварительной обработки. Поэтому латексные микроносители обеспечивают более воспроизводимые результаты по сравнению с эритроцитами и могут с успехом их дополнять или заменять в методах иммуноанализа. Преимущество латексных (полиакролеиновых) систем перед другими микросферами обеспечивается наличием альдегидных групп на поверхности латексных частиц, легко образующих ковалентную связь с аминогруппами белков. При выполнении настоящего раздела работы перед нами стояли следующие задачи: оптимизировать условия иммобилизации лигандов на синтетический носитель (использовав иммуноглобулины из адсорбированных туберкулёзных сывороток, подобрав количественные, температурные, временные параметры и рН при сенсибилизации);

разработать условия стабилизации, подобрать рН и разводящую жидкость, необходимую при постановке реакции агглютинации латекса (РАЛ). Для приготовления иммуноглобулиновых диагностикумов использовали агглютинирующие туберкулёзные кроличьи сыворотки, адсорбировали их иммобилизованными на магноиммуносорбентах гетерологичными водорастворимыми антигенами, как описано ранее, и фракционировали иммуноглобулины каприловым методом.

Латексную основу – акролар К (ТУ 6-69-10-1824-88) получали из института биоорганической химии им. Шемякина. Латекс окрашен в малиновый цвет, со средним диаметром частиц (1,2±0,1) мкм. Для сенсибилизации матрицы использовали иммуноглобулины туберкулёзные с концентрацией белка от 100 до 1000 мкг/мл. Лиганд соединяли с 2 мл 2% полимерного носителя. К этим смесям добавляли 2 мл забуференного физиологического раствора рН (7,2±0,1). Сенсибилизацию проводили в течение 1, 3, 6, 9, 12 часов при температуре (24±4) 0С, 37 0С и 50 0С на магнитной мешалке *. Далее суспензию осаждали центрифугированием при 5 000 g в течение 4-5 минут и дважды отмывали от несвязавшегося лиганда забуференным физиологическим раствором рН (7,2±0,1). Осадок суспендировали в белковом стабилизаторе (растворённом 1:50) до концентрации 0,2 % с 0,1 % формалина. Оптимальная нагрузка иммуноглобулинов составляла 400 мкг/мл (при увеличении нагрузки белка отсутствовал отрицательный контроль, при уменьшении - снижалась чувствительность), время сенсибилизации 6 ч, температура – 50 0С (рис. 10).

Чувствительность, м.к./мл 10 140 10 9 100 7 10 80 10 105 60 10 0 3737 C C 50500C C 24240C C 20 3 10 0 1022 10 1 3 6 9 Время, ч Рисунок 10. Зависимость чувствительности латексного диагностикума от времени и температуры сенсибилизации лиганда *Работа выполнялась совместно со с.н.с. СтавНИПЧИ Зайцевым А.А.

Диагностическую ценность препаратов оценивали в реакции агглютинации латекса (РАЛ) в U- образных микропланшетах. В качестве разводящей жидкости использовали белковый стабилизатор (состоящий из 1 части белка куриного яйца, 4 частей раствора натрия двууглекислого, нейтрализованного 1 Н раствором соляной кислоты) с твин-80. Перед употреблением белковый стабилизатор разводили в 50 раз на 0,9 % растворе хлорида натрия, рН (7,2±0,1) и смешивали с твин-80 до конечного разведения последнего 1:80 000. Подбор концентрации детергента (твин –80) очень важен, так как при его увеличении чувствительность диагностикума снижалась, а при уменьшении концентрации твин- 80 отсутствовал отрицательный контроль. На постановку реакции влияние оказывал рН разводящей жидкости. При уменьшении рН до 5,0 уменьшалась активность препаратов, при увеличении рН до 9,0 отсутствовал отрицательный контроль. Постановку РАЛ микрометодом проводили следующим образом: в 8 рядов полистироловой пластины дозаторами вносили по 0,05 мл разводящей жидкости. Дозатором или иглой микротитратора, имеющей головку объемом 0,05 мл, в первые лунки 7 рядов добавляли исследуемый материал, а в первую лунку 8 ряда – взвесь микробных клеток в концентрации 5х м.к./мл. Де лали последовательные двукратные разведения переносом по 0,05 мл из одной лунки в другую по 7-ю лунку включительно. Из последних лунок по 0,05 мл удаляли. 8-е лунки использовали для контроля диагностикума. Затем во все лунки добавляли по 0,025 мл диагностикума полиакролеинового (латексного) иммуноглобулинового 0,2 % концентрации. Содержимое пластины осторожно встряхивали до получения гомогенной суспензии и оставляли при комнатной температуре на (2,5+ 0,5) ч. Учет результатов (по феноменам "зонтик", "пуговка") предварительно учитывали через (2,5 + 0,5) ч, а окончательно - через 16 - 18 ч. Результат РАЛ считали положительным, когда полиакролеиновые микросферы выпадали на дно лунок равномерным слоем в виде «зонтика», занимая не менее 2/ диаметра сферической поверхности дна лунки. При отрицательном результате полиакролеиновые микросферы выпадали на дно лунки в виде "пуговки" или узкого колечка с ровным краем. В контрольных лунках результат должен быть отрицательным. При контроле чувствительности диагностикумов иммуноглобулиновых в планшетах использовали взвеси микобактерий туберкулёза в концентрациях от 5х107 до 1,95х105 м.к./мл. В результате постановки реакции новлено, что чувствительность разработанных диагностикумов устасоста вила 3,9х105 - 7,8х105 м.к./мл. При изучении специфичности в РАЛ на гетерологичных штаммах (в концентрации 1х107 и ниже) перекрёстных реакций не выявлено. Проведенные исследования показали, что по чувствительности и специфичности полученные препараты в реакции агглютинации латекса удовлетворяют требованиям нормативных документов. Изготовлено 5 серий диагностикумов туберкулёзных полиакролеиновых (латексных) иммуноглобулиновых. При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с соавт.(1969), в серии опытов титр РАЛ t равен 5,2 х105 м.к./мл (+14,1 %;

-12,3 %). Таким образом, проанализировав литературные данные и проведя экспериментальные исследования биотехнологии изготовления туберкулёзных латексных иммуноглобулиновых диагностикумов, нами отработаны оптимальные условия, включающие использование иммуноглобулинов для сенсибилизации из адсорбированных туберкулёзных сывороток, нагрузку иммуноглобулинов -400 мкг/мл;

время сенсибилизации 6 часов при температуре 50 0С и рН раствора при сенсибилизации и постановке анализа - 7,2±0,1. 5.2. Разработка биотехнологии получения алюмосиликатного диагностикума В последние годы медицина обогатилась новыми методами исследований, в которых используются новейшие достижения биотехнологии, одним из которых является разработка и внедрение иммобилизованных биосистем.

Приобретение последними биоспецифических качеств достигается путём иммобилизации в структуре или на поверхности матрицы различных лигандов (иммуноглобулинов, бактериальных клеток или их антигенов и т.д.). Адсорбция лигандов на данных системах зависит от химического строения сорбентов и условий иммобилизации, которая, осуществляясь на твёрдых носителях, приводит к значительному повышению термической устойчивости и стабильности лигандов. Для получения иммуносорбентного препарата для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза изучены условия сенсибилизации матрицы антителами, стабилизации сенсибилизированных суспензий и стандартизации полученных диагностикумов. В работе использовали типичные штаммы возбудителя туберкулёза, из биомассы которых извлекали антигенные комплексы, используя их для получения иммунных сывороток (по схеме Е.Н. Афанасьева, 2000 г.) и постановки реакций как описано ранее. Первостепенной задачей при разработке иммунносорбентных диагностикумов является выбор матрицы с оптимальными характеристиками по отношению к фиксируемым биомолекулам. Нами выбран алюмосиликат, так как для данного кремнезема характерна высокая реакционная способность поверхностных групп при взаимодействии со многими веществами. Введение в матрицу красителя обуславливает цветовой эффект, в результате чего повышается наглядность серологического теста. В качестве красителя использовали аурамин. Следующей задачей был выбор способа активирования матрицы для иммобилизации лиганда и достижения агрегативной устойчивости суспензии. Для данной цели нами использовано поверхностно-активное вещество (ионный детергент)- вторичный алкилсульфат натрия, благодаря которому предотвращается сближение частиц, их агрегирование.

Нами сконструированы иммуносорбентные диагностикумы, представляющие собой активированную вторичным алкилсульфатом натрия матрицу, состоящую из алюмосиликата и аурамина. Лигандом служили иммуноглобулины, выделенные из агглютинирующих иммунных туберкулёзных адсорбированных сывороток. В результате получены иммобилизованные системы, которым присущи положительные свойства неорганических матриц: гидрофильность, жесткость остова, химическая и микробиологическая устойчивость, отсутствие набухаемости в растворах, значительная адсорбционная емкость, отсутствие токсичности. Нами изучены закономерности иммобилизации антител и условия, при которых они проявляют иммунологическую активность в суспензиях. Технология приготовления диагностикума состояла в следующем: к 100 мг алюмосиликата добавляли 50 мг аурамина и готовили 2 % суспензию в 0,1 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ), рН (7,2+0,2). Далее проводили активирование матрицы, добавляя 0,1 мл вторичного алкилсульфата натрия, инкубировали 30, 60, 120, 240 мин при температуре 24 0С, 37 0С, 50 0С. Для иммобилизации использовали иммуноглобулины туберкулёзные в концентрации от 1 до 10 мг/мл, в объёме 5 мл, которые инкубировали от 2 до 18 часов, отмывали от несвязавшихся антител и красителя 0,1 М ФСБ, рН (7,2+ 0,2), центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. Осадок растворяли в 0,9 % растворе натрия хлорида с 1 % бычьего сывороточного альбумина до 1 % взвеси диагностикума и добавляли формалин до 1 %. Количественное соотношение красителя и алюмосиликата (1:2) оптимально. При исследовании влияния рН буферного раствора во время иммобилизации, установлено, что при увеличении кислотности снижается процент связывания сенситина. Увеличение рН реакционного раствора до 10 приводит к ложноположительной агглютинации. В результате подбора параметров установлено, что для оптимальной иммобилизации достаточной является концентрация белка 1,5 мг/мл, время иммобилизации - 2 час при температуре (26 + 4) 0С, рН при сенсибили зации матрицы и постановки РСА - 7,0. Зависимость чувствительности препарата от времени и рН представлена на рис.11. Постановку реакции суспензионной агглютинации (РСА) осуществляли на стекле. В качестве положительного контроля использовали взвесь туберкулёзного микроба в концентрациях: 5х107;

2,5х107;

1,25х107;

6,25х106;

3,125х106;

1,56х106;

7,8х105;

3,9х105 м.к./мл. В качестве отрицательного контроля использовали 0,9 % раствор натрия хлорида.

Чувствительность, м.к./мл 104 80 105 60 106 40 107 20 108 109 30 60 120 5 рН Время, мин Рисунок 11. Влияние температурного, временного факторов и рН на чувствительность суспензионного диагностикума при его изготовлении На предметное стекло с отрицательным контролем наносили 2 капли (0,05 мл) 0,9 % раствора натрия хлорида, рН (6,8+0,2) и 1 каплю (0,025 мл) диагностикума суспензионного туберкулёзного иммуноглобулинового. На предметные стёкла с положительным контролем наносили по 2 капли микробной взвеси и по 1 капле соответствующего диагностикума. Капли тщательно перемешивали и при лёгком покачивании предметного стекла наблюдали в течение 1-5 мин в косопроходящем свете за изменением структуры суспензии. В отрицательном контроле агглютинация отсутствовала (рис. 12а), в то время как на стёклах со взвесями туберкулёзного микроба наблюдалось полное просветление жидкости с крупнозернистыми хлопьями, т.е. чёткая агглютинация (рис. 12б). Чувствительность суспензионных диагностикумов составила 7,8 х 105 -1,56х106 м.к./мл по корпускулярным антигенам, при отсутствии агглютинации с гетерологичными штаммами. Лиофилизация препаратов осуществлена на лиофильной установке LZ9С в течение 18 часов, вакууме 10 Па, конечной температуре продукта 25 0С. В результате установлено, что препарат стабилен в течение 1 года (срок наблюдения) без потери специфической активности. Разработанная биотехнология получения туберкулёзного алюмосиликатного диагностикума обеспечивает получение сорбентов заданного состава, строения и эффективное выявление возбудителя туберкулёза.

а б Рисунок 12. Реакция суспензионной агглютинации на стекле (а – отрицательная, без контакта с антигеном;

б – резко положительная, с взвесью туберкулёзного микроба) Испытано 5 серий туберкулёзного диагностикума в 5 повторностях. Диагностикумы проверены в РСА на стекле с гомо- и гетерологичными штаммами (таблица 9). При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с соавт.(1969), в серии опытов титр РСА t равен 0,92х106 м.к./мл (+7,2 %;

-6,7 %). Чувствительность разработанных диагностикумов соответствует чувствительности диагностикумов латексных иммуноглобулиновых в реакции агглютинации латекса (РАЛ). При этом учет результатов РСА на стекле возможен через 1-3 мин, а окончательный результат РАЛ через 16 - 18 ч.

Таблица 9. Результаты сравнительной характеристики чувствительности диагностикумов туберкулёзных латексного и алюмосиликатного Штаммы микроорганизмов Реакции Чувствительность РАЛ, Чувствительность РСА, м.к./мл м.к./мл Серия-1 Серия-2 Серия-1 Серия-2 2 3 4 3,9 х 105 3,9 х 105 О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный 3,9 х 105 7,8 х 105 О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный 7,8 х 105 7,8 х 105 О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный 7,8 х 105 7,8 х 105 О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный О т р и ц ательный M. tuberculosis humanus Н 37 RA BCG М. intracellulare, M. кansasii Yoss Nocardia brasiliensis B.abortus 544, 19BA, 345;

B. melitensis 16M, 565, Rev-1, B. suis 1330, 508, 6 Salmonella typhi 818, 4446 Streptococcus faecalis Staphylococcus epidermidis, aureus АССТ 25923 Listeria monocytogenes 1 -7серотип Таким образом, преимущество алюмосиликатного туберкулёзного диагностикума заключается в простоте постановки РСА и быстроте получения результатов.

ГЛАВА 6. Конструирование магнитоуправляемых иммуносорбентов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза 6.1. Разработка метода селективного концентрирования возбудителя туберкулёза на магноиммуносорбенте с последующей постановкой иммуноферментного анализа. Основное требование, предъявляемое к современным методам экспрессанализа - выявление низких концентраций патогенного агента в максимально короткие сроки с высокой специфичностью. В последнее время актуальным является разработка и применение магносорбентов, благодаря которым упрощаются, ускоряются все этапы исследований при высокой чувствительности препаратов и возможности автоматизации учёта реакций. Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степенью чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твёрдой фазы, которая должна сохранять иммунологические свойства и стабильность, обладать минимальной активностью неспецифически связывать компоненты анализируемой системы и быть удобной при разделении фаз. Целью наших исследований было конструирование тест-системы диагностической магноиммуносорбентной (МИС) туберкулёзной для иммуноферментного анализа (ИФА) В работе использовали изготовленные нами (глава 4) иммунопероксидазные конъюгаты туберкулёзные с активностью 1:400-1:800, аффинные туберкулёзные магноиммуносорбенты, полученые по способу И.В. Жарниковой с соавт. (1999), оптимизируя параметры, применительно к данной инфекции. Нами разработана биотехнология приготовления органокремнезёмного магносорбента на основе окиси железа (III) и алюмосиликата. Модифицирование поверхности осуществляли в присутствии полимера - декстрана и поверхностно-активного вещества - вторичного алкилсульфата натрия. На основе проведенных исследований рекомендованы следующие оптимальные условия получения алюмосиликатных магносорбентов: весовое соот ношение компонентов синтеза окиси железа, декстрана, алюмосиликата 2:2:1;

время гелеобразования 2 часа (при увеличении времени удлиняется процесс синтеза магносорбента, уменьшается размер его пор, что приводит к снижению степени иммобилизации лиганда в порах сорбента), значение рН гелеобразования -7,0. При возрастании количества окиси железа в композиционной смеси происходит увеличение размера радиуса пор сорбента и уменьшение удельной поверхности МС. Декстран оказывает стабилизирующий эффект за счёт образования вокруг частиц геля сольватных оболочек в связи с возникновением комплексов между электронодонорными атомами кислорода молекул органического вещества и силанольными группами кремнеземных корпускул. Алюмосиликат – пористый кремнезёмный носитель обладает активной поверхностью в отношении белков, проявляя механическую, микробиологическую и химическую устойчивость. Далее проводили иммобилизацию специфических туберкулёзных иммуноглобулинов на МС (данные препараты без потери специфической активности хранятся в течение 3 лет (срок наблюдения). В качестве «сшивающего» агента нами использовано поверхностно-активное вещество (ПАВ)-вторичный алкилсульфат натрия, при этом прочность связи антител с магносорбентом повышается за счёт создания дополнительных связей, которые образуются между активными группами белка, полиглюкина (декстрана) и вторичного алкилсульфата натрия (рис.13). R2 R1-C-OSO3Na + NН 2 -АТ HOH АТ-NH3 –O-SO3 -CH_ R1 + NaOH H R2 Рисунок 13. Схема получения МИС с помощью вторичного алкилсульфата натрия Для иммобилизации использовали различную концентрацию белка иммуноглобулинов (0,5-10 мг/мл). Исследования показали, что концентрация белка иммуноглобулинов 2,0 мг/мл является оптимальной для полного насыщения антителами сорбента в объеме 0,4 мл 10 % взвеси. При увеличении концентрации белка адсорбционная емкость МИС снижалась. Вероятно, это объясняется факторами стерического характера. Оптимальными факторами, способствующими получению МИС, являются: время иммобилизации 2 часа при значении рН раствора иммуноглобулинов (6,0 - 7,0) и температуры в интервалах (22 + 4) оС и (37 + 1) оС. Методы получения МИС просты и технологичны, исключают применение токсичных веществ, изготовлены из отечественных экологически чистых компонентов. Полученные МИС характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической и микробиологической устойчивостью. Сконструированные МИС были использованы при экспресс-диагностике возбудителя туберкулёза. Эксперименты проводили с чистыми культурами туберкулёзного микроба. Из культур микобактерий готовили взвеси с концентрациями от 1х101 до 1х109 м.к. в 1мл. Во флаконы вносили по 1 мл взвеси соответствующей концентрации микобактерий и по 0,2 мл 10 % суспензии туберкулёзного магноиммуносорбента, инкубировали в течение 30 – 60 мин при комнатной температуре, затем тщательно отмывали забуференным физиологическим раствором, вносили по 200 мкл рабочего разведения пероксидазного коньюгата и инкубировали при температуре (22+4) 0С или (37±1) 0С в течение 15, 30 и 60 мин. Промывали 0,1 М фосфатно –солевым буфером с твин-20 не менее 6 раз, используя постоянный магнит, поднося его к стенке флакона, в результате чего МИС оказывались фиксированными магнитным полем. После чего во флаконы вносили по 200 мкл хромогенной смеси. Через 1 – 2 мин (когда надосадочная жидкость слегка желтела в отрицательном контроле) содержимое флаконов переносили в микропланшеты и останавливали реакцию 50 мкл стоп-реагента (2М раствором серной кислоты). Для учета результатов производили измерение оптической плотности на приборе "Мультискан" при длине волны 492 нм. Ответ считали положительным при превышении оптической плотности опытного раствора над контрольным (без контакта с антигеном) в 2 и более раза. Аналогично проводили иммуноферментный анализ и в модельных опытах на нестерильной воде в объёме 500 мл, контаминированной различными концентрациями туберкулёзных микобактерий. Суспензии пропускали через устройство, удерживающее МИС магнитным полем. МИС после контакта с пробой тщательно промывали, снимали с ловушки, помещали во флакон и проводили ИФА по вышеописанному методу. Отрицательным контролем служили МИС, не контактировавшие с антигеном. В обоих опытах получены положительные результаты при наличии в объеме пробы (1 мл и 500 мл) 0,5х102-1х102 м.к. и выше. Результаты проведённых исследований показали, что чувствительность ИФА одинакова при исследуемых температурных режимах (22+4) 0С и (37±1) 0С. Другим важным параметром являлся временной режим. Установлено, что равновесный процесс между антигеном и МИС наступал через 30 мин, а между образовавшимся комплексом сорбент- антитело - антиген с конъюгатом через 15 мин. Важным являлось количество отмывок после контакта с конъюгатом, так как при отмывке меньше 6 раз ухудшалась специфичность реакции, т.е. наблюдались фоновые значения оптической плотности в отрицательном контроле. Для сравнения полученного диагностикума с традиционным методом постановки ИФА использовали полистироловые планшеты, сенсибилизированные туберкулёзными иммуноглобулинами в течение 18 ч, после чего проводили анализ в соответствии с методикой M.Clark и A. Adams (1977) в "сэндвич"варианте ИФА. Чувствительность ИФА в данном случае составила 5х104 - 1х10 5 м.к./мл. При этом время постановки ИФА с применением МИС составило 1-1, ч, а традиционным методом, учитывая 18 часовую сенсибилизацию планшет, около 20 ч. Если объём исследуемой пробы при использовании стандартных планшет не превышает 0,2 мл, то при применении МИС он неограничен (в нашем случае он равнялся 500 мл). Результаты контроля специфической активности и специфичности туберкулёзного МИС представлены в таблице 10. Для контроля специфичности использовали штаммы культур гетерологичных микроорганизмов, из которых готовили взвеси с концентрацией от 1х106 до 1х10 2м. к. в пробе. Разработанная диагностическая система отличалась высокой специфичностью, не давая положительных результатов с гетерологичными микроорганизмами (таблица 10). Таблица 10. Результаты контроля специфической активности и специфичности туберкулёзного МИС в ИФА в сравнении с традиционным методом ИФА Вид микроорганизма M. tuberculosis humanus Н 37 RA BCG М. intracellulare Nocardia brasiliensis B.abortus 544, 19-BA, 345 B. melitensis 16M, 565, Rev-1 B. suis 1330, 508, 6 Listeria monocytogenes 1 -7серотип МИС в ИФА Традиционный метод ИФА Концентрация м.к. в пробе 104 103 102 106 105 104 103 Показатель оптической плотности: опыт/отрицательный контроль 5,9 4,9 4,8 4,9 4,8 4,1 2,4 1,5 1,1 0,1 4,6 1,0 0,7 0,5 0,7 0,7 0,5 4,5 0,2 0,3 0,21 0,32 0,3 0,21 4,4 0,16 0,25 0,16 0,24 0,25 0,16 4,3 0,15 0,12 0,12 0,11 0,12 0,12 4,2 0,1 0,1 0,09 0,1 0,1 0,09 2,3 1,2 1,1 1,3 1,2 1,1 1,3 2,2 1,1 1,0 1,2 1,1 1,1 1,2 1,4 1,0 0,9 1,1 1,0 0,9 1,1 1,0 0,9 0,8 1,0 0,9 0,8 1,0 0,07 0,7 0,7 0,9 0,9 0,8 0, При использовании стандартного иммуноферментного метода имеются следующие недостатки, которые отсутствуют в предложенной тест-системе в связи с использованием магнитоуправляемого магносорбента с включёнными антителами: 1) для исследования берётся ограниченный 0,2 мл объём исследуемого материала (т.к. объём лунки – 0,4 мл), в то время как при использовании магноиммуносорбента объём неограничен;

2) время постановки иммуноферментного анализа около 20 часов, включая 18-ти часовую сенсибилизацию, а время проведения анализа с магноиммуносорбентами – 1-1,5 ч, 3) чувствительность иммуноферментного метода 5х104 - 1х10 5 м.к./мл по корпускулярному антигену, а чувствительность представленной тест-системы составляет 1x102 м.к./мл. Таким образом, при использовании МИС в ИФА отпадала необходимость в полистироловых планшетах, становилось возможным проведение анализа проб неограниченного объёма, сокращалось время сенсибилизации твёрдой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок её хранения. Время проведения непосредственно анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА. Нами проведены исследования по определению активности иммуноглобулиновых МИС жидких в ИФА в процессе их хранения. При закладке опыта активность МИС составляла 100 м.к. в пробе, опыт превышал отрицательный контроль (без контакта с антигеном) в 3 и более раз. Через 12 месяцев после проведения повторного контроля диагностикумов были получены аналогичные результаты. Такие исследования проводили каждый год в течение 3 лет (срок наблюдения). Препараты сохраняли свои физико-химические свойства и специфическую активность в течение всего срока наблюдения и оставались механически прочными, химически стабильными, устойчивыми к действию микроорганизмов (таблица 11). При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с соавт. (1969), в серии опытов титр ИФА t равен 0,8х10 2 м.к./мл (+8,7 %;

-8,0 %). Нами приготовлено 5 серий тест – систем магноиммуносорбентных для диагностики возбудителя туберкулёза в иммуноферментном анализе (ИФА), в Таблица 11. Показатели качества туберкулёзных МИС в зависимости от срока хранения Номер серии Дата и коннаименование троля препарата 3 2002 2003 МИС тубер- 2004 кулёзные 2005 1 С-1 Прозрачность при стоянии 4 Бесцветная прозрачная надосадочная жидкость, осадок чёрного цвета Показатели качества Специфическая активность Цветность при взбалты- Штаммы Чувствивании микроорганиз- тельность в мов ИФА, м.к. в пробе 5 6 7 Взвесь чёрно- M. tuberculosis го цвета с humanus Н 37 магнитными RA включениями, 0,5-1х102 без приз- BCG наков конгломерации которые входят: туберкулёзные магноиммуносорбенты -10 % взвесь, 3 ампулы по 2 мл;

положительный контроль - обеззараженные клетки микобактерий туберкулёза 1х10 9 м.к./мл, 1 ампула -1 мл;

иммунопероксидазный конъюгат с активностью 1:400-1:800 и все ингредиенты, необходимые для постановки ИФА (ФСБ, БСА, твин –20, цитратный буфер, хромоген, гидроперит, стоп-реагент). Кроме стандартного метода ИФА, нами разработан и модифицированный способ его постановки, обеспечивающий упрощение, сокращение времени анализа при высокой чувствительности метода. Сущность модификации при постановке анализа заключалась в том, что в качестве твёрдой фазы используются магносорбенты с иммобилизованными антителами (эту операцию можно провести заранее и хранить данные препараты без потери специфической активности в течение 3 лет (срок наблюдения). Постановку ИФА осуществляют в наконечниках от дозаторов, шприцах или маленьких колонках, внося туда 2 мл 10 % взвеси аффинных МИС. В дальнейшем через МИС пропускают исследуемый материал, а через сорбент с отрицательным контролем - фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) с твин-20. За 2 – 5 мин через МИС, взаимодействуя с антителом, прикреплённым к магносорбенту, проходит антиген, находящийся в исследуемом материале, формируя комплекс антитело-антиген (АТ-Аг). МИС промывают 1 мл ФСБ-твин и вносят 0,2 мл рабочего разведения туберкулёзного иммунопероксидазного конъюгата, который, проходя через МИС, взаимодействует с комплексом АТ-Аг. Далее колонку промывают 5 мл ФСБ-твин. Для визуализации реакции через сорбент пропускают 0,2 мл субстрат-индикаторного раствора и учитывают результаты через 1-2 мин на сканирующем приборе «Мультискан» при 492 нм, добавив в окрашенный раствор стоп-реагент. Ответ считают положительным, если оптическая плотность опытного раствора превосходит оптическую плотность контрольного в 2 и более раза. В результате проведённых опытов было установлено, что показания оптической плотности опытных образцов превышали показания отрицательного контроля более чем в 5 раз, что говорит о положительном результате реакции. Данный метод позволяет обнаружить микобактерии в пределах 1х102 - 1х10 3 м.к. в пробе, при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами, что свидетельствует о специфичности метода. Таким образом, при использовании МИС в модифицированном ИФА отпадает необходимость в полистироловых планшетах. Пористая структура магносорбента оптимальна для образования иммунохимического комплекса антиген-антитело, исключает внутридиффузионное торможение при проведении анализа. Высокую чувствительность ИФА с применением МИС можно объяснить тем, что для такого фермента как пероксидаза, используемого при изготовлении иммуноферментного конъюгата, металл, входящий в структуру МИС, повышает каталитическую функцию энзима (Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1982). В качестве иммунопероксидазного конъюгата для выявления МТБ использовали также его липосомальную форму, получение и свойства которой описано в главе 4. Данный препарат применен при постановке ИФА с МИС. Схема постановки анализа представлена на рис. 14. После контакта МИС с антигеном во флаконы вносили по 0,2 мл туберкулёзного липосомально-иммунопероксидазного конъюгата в его рабочем разве дении, инкубировали при температуре (22 ±4) C в течение 15-20 мин и про мывали 5-6 раз 0,1 М ФСБ с твин-20. Во все флаконы вносили хромогенную смесь. Через 1-2 мин надосадочную жидкость из флаконов дозатором переносили в планшет по 0,10-0,15 мл и останавливали реакцию, внося по 0,05 мл раствора серной кислоты в концентрации 4 моль/л. Визуально регистрацию результатов оценивали по изменению интенсивности окраски смеси от оранжево-желтого цвета (опытные) до слабо желтого (контрольные). При инструментальном учете на фотометре оптическую плотность хромогенной смеси измеряли при длине волны 492 нм.

Взаимодействие МИС с Аг 30- 60 мин при температуре (22+4) 0С Отмывка от несвязавшегося Аг 0,1 М ФСБ с твин-20 Адсорбция липосомально-иммунопероксидазного конъюгата 15 мин при температуре (22+4) 0С Отмывка от несвязавшегося конъюгата 0,1 М ФСБ с твин-20 Выявление активности после контакта с субстратной смесью в течение 1-2 мин Количественный учёт ферментативной реакции Рисунок 14. Схема постановки ИФА с использованием МИС и липосомально-иммунопероксидазного конъюгата Чувствительность препарата при выявлении МТБ была не ниже 1х10 2 м.к. в пробе, при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами бактерий. Для увеличения срока годности препарат разливали в ампулы, замораживали и лиофилизировали в течение (18 ±2) ч до конечной температуры С. В готовом препарате контролировали физико-химические свойства (раство римость, цветность, прозрачность, потерю в массе при высушивании), а также иммунологическую активность, специфичность, чувствительность после лиофилизации и в процессе хранения в течение 3 лет (срок наблюдения). Данные представлены в таблице 12.

Таблица 12. Результаты наблюдения за липосомально-иммунопероксидазным конъюгатом после лиофилизации в процессе хранения Серия Потепрепа- ря в рата массе при высушивании 1 2 3 2,6 2,6 2, Срок наблюдения 1 год Растворимость и внешний вид Чувствительность в ИФА с МИС 1,5 года Растворимость и и внешний вид Чувствительность в ИФА с МИС 3 года (срок наблюдения) Растворимость и внешний вид Чувствительность в ИФА с МИС 1х102 1 мин Раствор белого цвета 1 мин 5х101 Раствор белого цвета 1х102 1 мин Раствор белого цвета 1 мин 1х102 Раствор белого цвета 1 мин 5х101 Раствор белого цвета 1 мин 1х102 Раствор белого цвета 1 мин 1х102 Раствор белого цвета 1 мин 5х101 Раствор белого цвета 1 мин 1х102 Раствор белого цвета Учитывая, что липосомальный туберкулёзный иммуноферментный диагностикум при использовании в качестве твёрдой фазы МИС позволял в ИФА обнаруживать МТБ в гораздо меньшем количестве, чем при постановке традиционной реакции в полистироловых микропланшетах, т.е. обладал большей чувствительностью, нами было получено 5 серий этих диагностических тестсистем. В полученный набор входят: лиофильно высушенный липосомальноиммуноперооксидазный конъюгат, 0,1 мл в ампуле;

взвесь туберкулёзного микроба 109 м.к./мл (положительный контроль);

туберкулёзный МИС (10 % взвесь)2 ампулы по 2 мл, необходимые ингредиенты для постановки ИФА (ФСБ, БСА, твин-20, стоп-реагент- по 1 флакону, 0-фенилендиамин-2 флакона и таблетка гидроперита).

Таким образом, нами разработана биотехнология изготовления магноиммуносорбентных диагностикумов и на их основе сконструированы диагностические тест – системы для проведения сочетанного метода детекции микроорганизмов в иммуноферментном анализе, подобраны условия постановки ИФА с МИС. Установлено, что туберкулёзные магноиммуносорбенты в жидком виде стабильны без потери физико-химических и иммунологических свойств в течение 3 лет (срок наблюдения). ИФА с применением МИС характеризуется высокой чувствительностью (1х102 м.к. в пробе), специфичностью, быстротой постановки реакции (1-1,5 ч), стоимостью в 1,5 раза ниже традиционного ИФА (таблица 13). При этом отпадает необходимость применения сенсибилизированных микропланшет. При использовании разработанной липосомально-иммунопроксидазной тест-системы повышается срок годности препарата в 2 раза при сохранении его физикохимических и каталитичесих свойств. Таблица 13. Технико-экономическое обоснование методов МИС с ИФА Анализы Коли Время чест- поЗараво ста- ботана- нов- ная ли- ки, ч плата зов применения сочетанных Стоимость 10 анализов, руб 423,58 319, учёта 18 ча традиционный ИФА сочетанный Статьи затрат Начис- Сы- Обо- Наклад ления рьё ирудо- ные на зар. мате- вание расхоплату риады (35,8%) лы (90%) п 3* 1135,8 48,62 45,0 19,2 223,76 78,6 28,14 42,0 19,2 151, Примечание: * Время постановки традиционных анализов ИФА без совой сенсибилизации планшет.

На основании сконструированных препаратов и проведённых исследований разработаны методические рекомендации «Применение магноиммуносорбентов для выявления микобактерий туберкулёза», одобренные Ученым Советом Ста НИПЧИ (протокол № 3 от 3.03.05) и утвержденные директором института. Со ставлены нормативные документы: регламент производства и инструкция по применению на тест-систему диагностическую липосомально- иммуноперооксидазную для выявления антигена возбудителя туберкулёза иммуноферментным методом, рассмотренные на Учёном Совете СтавНИПЧИ (протокол № 3 от 3.03.05 г) и утвержденные директором института. 6.2. Разработка метода селективного концентрирования возбудителя туберкулёза на магноиммуносорбенте с последующей постановкой количественного иммунофлуоресцентного анализа В последние годы при выявлении МТБ широко применяют люминесцентную микроскопию. Этот метод значительно увеличивает диагностическую эффективность микроскопических исследований. Быстрота обнаружения МТБ, простота флюорохромирования делает его доступным для практических лабораторий. Преимущество метода люминесцентной микроскопии состоит в том, что она позволяет просматривать в короткий срок больше полей зрения, чем при обычной микроскопии с иммерсионной системой, при этом удаётся быстрее и в большем количестве выявлять МТБ. Люминесцентная микроскопия с применением аурамина позволяет увеличить процент находок на 8 % по сравнению с методом флотации и на 17 % по сравнению с прямой бактериоскопией мазка (Приказ МЗ РФ № 558, 1978). Метод бактериоскопии мазка с окраской люминесцентными красителями, в частности аурамином, основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. Этим методом можно исследовать любой материал, кроме мочи, в котором могут присутствовать трудно дифференцируемые при такой окраске сапрофиты (Приказ МЗ РФ № 558, 1978). Другим важным преимуществом метода люминесцентной микроскопии является способность обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по методу Ци ля-Нильсена (Методические указания МЗ РФ «Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001). При окраске микобактерий аурамином возможны ложноположительные результаты в результате некачественного обесцвечивания мазка с сохранением некоторыми сапрофитными бактериями оранжевой окраски. Микроскопические исследования (окраска по Цилю-Нильсену и аурамином) не позволяют дифференцировать микобактерии комплекса Mуcobacterium tuberculosis от нетуберкулёзных (атипичных микобактерий) микобактериозов. Используя эти методы, можно только сделать заключение о наличии или отсутствии кислотоустойчивых микобактерий (приказ МЗ РФ № 109. Приложение №11, 2003). При внутривидовой дифференциации бактерий наиболее перспективными являются методы диагностики, основанные на образовании комплекса антигенантитело, особенно в связи с возможностью использования в иммунофлуоресценции твёрдых носителей (Стоев К.Г. с соавт., 1981;

Подзолкова Г.Г. с соавт., 1989 и т.д.). Нами апробирован данный метод с применением магноиммуносорбентов для обнаружения антигенов возбудителя туберкулёза и определены оптимальные параметры постановки КИФА, чувствительность и специфичность метода. Эксперименты проводили с чистыми культурами туберкулёзного микроба. Из культур готовили взвеси с концентрациями от 1х101 до 1х109 м.к/мл. Во флаконы вносили по 1 мл взвеси соответствующей концентрации микобактерий и по 0,2 мл 10 % суспензии туберкулёзного магноиммуносорбента. Смесь инкубировали в течение 15, 30, 60 мин при температурах (22±4) 0С и (37±1) °С, затем гранулы МИС отмывали 0,9 % раствором хлорида натрия рН 7,2, используя для сепарации постоянный магнит, удерживающий МИС на внутренней стенке флаконов. В дальнейшем к МИС добавляли 200 мкл раствора иммуноглобулинов G туберкулёзных флуоресцирующих (полученных нами при конъюгации иммуноглобулинов из адсорбированной туберкулёзной сыворотки путём фракционированния каприловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969) с ФИТЦ (C21H11NO5S) по методу X.Шторц (Stortz, 1987) и инкубировали 15, 30, 60 мин при (22±4) 0С и (37±1) С. Сорбент отмывали вышеуказанным способом 2-3 раза забуференным физиоло гическим раствором и 1 раз дистиллированной водой. Контролем служили гранулы МИС, не контактировавшие с исследуемым материалом и окрашенные флуоресцирующими иммуноглобулинами. Исследуемые опытные и контрольные взвеси в объеме 20 мкл наносили на предметное стекло и микроскопировали. Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служил люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяли источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный В7-76. Рабочее напряжение составляло 800 – 900 В, увеличение объектива х40 и окуляра х10. Применялись возбуждающие светофильтры БС-8-2, СЗС-7-2, ФС-1-6. Диаметр зонда фотометрической насадки составил 0,5 мм. После обнаружения в поле зрения гранул сорбента закрывали полевую диафрагму и снимали цифровые показания уровня свечения 10-15 гранул на вольтметре. Определяли среднеарифметические значения величины флуоресценции опытных (рис. 15), контрольных гранул и пространства между ними – фона.

Рисунок 15. Люминесцентная микроскопия магноиммуносорбента с фиксированными на нём МТБ. Увеличение х Интенсивность флуоресценции магноиммуносорбента (М) представляла собой разницу между среднеарифметическими показателями уровня свечения гранул и фона: (М)= М гранул – М фона. За положительные принимались результаты, при которых уровень флуоресценции опытных гранул в 2 и более раз превышал авт, 1989). Для оценки способности туберкулёзных МИС концентрировать на своей поверхности специфический антиген приготавливали пробы водопроводной воды объёмом 500 мл, куда вносили МТБ в количестве 101, 102, 103, 104, 105 м.к. В дальнейшем эти пробы пропускали через МИС, находящиеся в специальной «ловушке» и удерживающиеся в ней магнитным полем. Общая схема постановки КИФА представлена на рисунке 16.

Взаимодействие МИС с антигеном 30 мин при температуре (22+4) оС Отмывка МИС от несвязавшегося антигена забуференным физиологическим раствором рН 7,2 Взаимодействие комплекса МИС-антиген с туберкулёзными иммуноглобулинами флуоресцирующими 15 мин при температуре (22+4) 0С Отмывка МИС от несвязавшегося компонента Количественный учет КИФА аналогичный показатель контрольных (Владимцева И.В. с со Рисунок 16. Схема постановки количественного иммунофлуоресцентного анализа с использованием в качестве твёрдой фазы МИС. МИС после контакта с пробой промывали 100 мл забуференного физиологического раствора рН 7,2, помещали во флакон и проводили КИФА по вы шеописанному методу. Контролем служили туберкулёзные МИС, неконтактировавшие с антигеном. МТБ во всех случаях были выявлены при наличии в пробах 1х102 м.к. и выше. Аналогично контролировали специфичность диагностической системы, используя гетерологичные штаммы (таблица 14). В результате установлено отсутствие перекрёстных реакций. В процессе отработки различных условий проведения анализа установлено, что чувствительность КИФА была одинаковой при исследуемых температурных режимах сорбции антигена на МИС- (22+4) 0С и (37±1) 0С, а для контакта сорбента с антигеном и окрашивания образовавшегося комплекса флуоресцирующими иммуноглобулинами было достаточно 15-30 мин инкубации. Таблица 14. Результаты изучения специфической активности и специфичности туберкулёзных МИС в КИФА 1 серия Штаммы 2 серия Концентрация м.к. в пробе 3 серия M. tuberculosis humanus Н 37 RA BCG 3,8 4,3 1,5 4,3 4,1 1,7 3,6 3,7 M. аvium D4 ER 4,7 4,3 1,6 4,8 4,3 1,5 4,7 4,2 М. intracellulare 0,9 0,6 0,6 0,7 0,7 0,6 0,9 0,6 Nocardia brasiliensis 0,6 0,9 0,7 0,6 0,9 0,9 0,8 0,9 B.abortus 544, 19-BA, 0,7 0,8 0,7 0,7 0,8 0,7 0,8 0,7 345* B. melitensis 16M, 565, 0,9 0,8 0,9 0,8 0,9 0,8 0,9 0,6 Rev-1* B. suis 1330, 508, 6* 0,8 0,9 0,8 0,9 0,8 0,9 0,7 0,9 Listeria monocyto0,9 0,9 0,9 0,8 0,6 0,9 0,7 0,8 genes 1 -7серотип* Отрицательный 0,9 0,8 0,6 0,9 0,6 0,8 0,6 0,8 контроль Примечание *- представлены средние данные для возбудителей инфекций 105 102 101 105 102 101 105 102 101 Отношение уровня флюоресценции опытных гранул к контрольным 4,5 4,0 1,7 3,6 3,9 1,5 3,9 4,1 1,2 1,9 1,9 0,8 0,7 0,8 0,8 0,7 0,7 0, Из таблицы следует, что отношение уровней флюоресценции опытных МИС в 2 раза выше по сравнению с контрольными, не контактирующими с ан тигеном, а также с сорбентами, обработанными гетерологичными штаммами. Данная диагностическая система позволяет выявлять возбудитель туберкулёза в концентрации 0,5х102 - 1х102 м.к./пробе. При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с соавт.(1969) в серии опытов чувствительность КИФАt равна 0,82х102 м.к./мл (+7,9 %;

-7,3 %). Нами приготовлено 5 серий тест – систем МИС для диагностики возбудителя туберкулёза в КИФА, в которые входят 3 амп. по 2 мл. туберкулёзных МИС -10 % взвесь;

положительный контроль - обеззараженные клетки микобактерий туберкулёза, 1х10 9 м.к./мл, 1 ампула - 1 мл;

иммуноглобулины туберкулёзные флуоресцирующие сухие – рабочее разведение 1:16 – 1:64 – 1 амп-0,5 мл. При проведении технико-экономического обоснования применения сочетанных методов МИС с КИФА установлены явные преимущества данного метода перед традиционной иммунофлюоресцентной реакцией (таблица 15). Таблица 15. Технико-экономическое обоснование применения сочетанных методов МИС с КИФА Анализы К Коли- Вречество мя поста анализов новки, ч Статьи затрат Зара- Начис- Сы- Обобот- ления рьё и рудоная на зар. мате- вание плата плату риалы (35,8%) Накладные расходы (90 %) Стоимость 10 анализов, руб тради2 109,2 39,09 28,1 21,3 177,92 375,61 РИФ ционный 1 78,6 28,14 19,9 24,8 136,29 287,63 сочетан- 10 КИФА ный Таким образом, нами разработана биотехнология изготовления туберкулёзных МИС, на их основе сконструированы диагностические тест – системы для проведения сочетанного метода детекции возбудителя туберкулёза в КИФА и оптимизированы параметры постановки этой реакции. Данный метод обеспе чивает селективное концентрирование МТБ на сорбенте, обладает высокой чувствительностью (0,5х102 - 1х102 м.к./в пробе), в 1000 раз превышающую чувствительность общепринятой РИФ, специфичностью и отличается быстротой постановки реакции (1-1,5 ч). При этом реакция учитывается не только визуально, но и инструментально в условных единицах по показаниям вольтметра.

ГЛАВА 7. Изучение диагностической ценности разработанных диагностикумов и тест-систем для выявления антигена возбудителя туберкулеза Для получения положительных результатов клинического применения разработанных диагностических препаратов и тест-систем при выявлении МТБ необходимо иметь чёткое представление о специфике выявляемого заболевания, его локализации в организме человека, о свойствах возбудителя микобактерий туберкулёза, методах подготовки исследуемых материалов, так как от совокупности знаний этих составляющих зависит качество диагностики. Существует многообразие форм туберкулёзной инфекции, наиболее распространёнными являются: туберкулёз внутригрудных лимфатических узлов;

диссеминированный;

милиарный;

кавернозный туберкулёз;

туберкулёз медиастинальных лимфоузлов. Туберкулёз внутренних лимфатических узлов - вариант первичного туберкулёза. Процесс у человека развивается на фоне нарушения иммунной системы. Поражаются прикорневые лимфатические узлы преимущественно средней доли правого лёгкого, язычкового сегмента, а также бронхопульмональные лимфатичесие узлы верхних долей лёгких. Патологоанатомическая характеристика процесса сходна с казеозным лимфаденитом в первичном туберкулёзном комплексе. Дисcеминированный туберкулёз характеризуется лимфогематогенным распространением инфекции, начинается с поражения лимфатического сосуда и завершается в стенке кровеносного сосуда. Данный вид туберкулёза отличается хроническим течением и развивается на базе скрытого течения инфекции. При данной форме очаги в лёгких имеют различную величину и возраст, часть из них прогрессирует, часть рубцуется или кальцинируется, что свидетельствует о длительном волнообразном течении процесса. Очаги инфекции отличаются кортикоплевральной локализацией, симметричностью поражений, продуктивной тканевой реакцией, могут быть мелкими, средними и крупными. Наблюда ется развитие сетчатого пневмосклероза, эмфиземы, лёгочного сердца. Нераспознанные и нелеченные формы диссеминированного туберкулёза через фазу инфильтративной вспышки с распадом могут трансформироваться в деструктивные формы туберкулёза. Кавернозный туберкулёз характеризуется наличием изолированно сформированной каверны со слабо развитым фиброзным слоем и отсутствием в окружающей ткани выраженного склероза и очагов-отсевов. Его исходной формой может быть инфильтративный, очаговый, диссеминированный туберкулёз и туберкулёма. Каверна располагается обычно в более глубоких отделах лёгкого. Большое значение в прогрессировании каверны имеет состояние дренирующих бронхов, в стенках которых формируется казеозный эндомезо- и панбронхит. Больные данной формой туберкулёза могут умереть от лёгочного кровотечения или других осложнений. Фиброзно-кавернозный туберкулёз лёгких является результатом прогрессирования большинства форм первичного или вторичного периодов болезни, характеризуясь формированием в органе одной или несколько каверн с широким фиброзным слоем на фоне распространённого очагового склероза и очагов-отсевов различного генеза. При длительном хроническом течении фиброзно-кавернозного туберкулёза возрастают процессы фиброзирования и очаговой эмфиземы лёгких. Туберкулёз медиастинальных лимфоузлов - интоксикационный синдром в сочетании с кальцинацией лимфоузлов, продуктивным кашлем, выделением микобактерий. Основные методы диагностики в настоящее время- рентгенологический и бронхоскопический. У больных с тяжёлым течением лёгочного туберкулёза первично нарушается функция соединительной ткани лёгкого, развивается мезенхимопатия, сопровождающаяся повышением проницаемости гистогематического поражением терминальных бронхиол. барьера, В связи с этим, при туберкулёзе перспективны медико-биологические исследования соединительной ткани и микроциркуляторного русла лёгких в неблагоприятных условиях биосферы для жизни, при нейроэндокринных стреccах, иммуносупрессивном лечении и т.д. (Ерохин В.В. с соавт., 1996). Данные, представленные Чутаевым Ю.П. с соавт. (1996) показывают, что положительная реакция на пробу Манту среди больных туберкулёзом лёгких составляет 67,7 %, кониотуберкулёзом – 52,4 %, силикотуберкулёзом –38,7, неспецифическими заболеваниями органов дыхания (пневмония, хронический бронхит, абсцесс лёгкого)- 50 %, здоровых людей- 33,3 %. Как видно из представленных данных, проба Манту не в полной мере выявляет заболевание туберкулёзом при наличии ложноположительных результатов у здоровых людей. Выявление антигенов возбудителя туберкулёза крайне затруднительно. Известны случаи, когда в группе больных фиброзно-кавернозным туберкулёзом только в фазе распада впервые выявлялся антиген (Хоменко А.Г., 1992). Для внелёгочного туберкулёза на фоне широчайшего полиморфизма бактерий характерны малая частота обнаружения возбудителя в патологическом материале и невозможность воспользоваться данными рентгенологической картины на ранних этапах заболевания. L. K. Surkova et.al. (2003) представлены исследования по изучению поражённых туберкулёзом очагов и установлено, что положительный ответ при исследовании секционного материала на МТБ был в 25 % случаев, при которых отмечался отрицательный результат изучения мокроты. Длительный латентный период и поздняя манифестация симптомов вызывают трудности диагностики. Таким образом, контроль над туберкулезом среди населения требует хорошо организованных программ по скринингу и лечению (Miranda A.G., 2003). Целью наших исследований являлось максимально возможное лабораторное выявление возбудителя МТБ у наиболее эпидемически опасной категории пациентов среди лиц, обратившихся в Краевой клинический противотуберку лёзный диспансер г.Ставрополя с подозрительным в отношении туберкулёза клиническими или рентгенологическими симптомами. С этой целью были сконструированы принципиально новые тест-системы, которые позволяют значительно повысить эффективность выявления возбудителя туберкулёза, по сравнению с существующими методами, что было подтверждено клиническими испытаниями. Обследование людей проводили, оценивая следующие основные параметры, по которым больных подразделяли на группы:

- лица, имеющие соответствующую симптоматику со стороны органов дыхания (наличие в течение 3 нед. и более продуктивного кашля с выделениями слизистой, слизисто-гнойной мокроты или мокроты с прожилками крови);

- лица, имеющие выявленные лучевыми методами изменения в лёгких, подозрительные на туберкулёз;

- лица из контакта с больными туберкулёзом, выделяющие микобактерии и имеющие соответствующие симптомы заболевания;

- лица с подозрением на внелёгочные формы туберкулёза;

Особенно важны выделение и идентификация возбудителя при наблюдении за больными туберкулёзом с неудовлетворительными результатами стандартного курса химиотерапии, у которых возбудителями заболевания могут быть лекарственно-устойчивые формы микобактерий или нетуберкулёзные микобактерии (возбудители микобактериозов). Изучив формы туберкулёза, место локализации антигенов и истории болезни больных туберкулёзом, мы подошли к решению задачи подготовки проб исследуемого материала. Сбор, хранение, транспортировку и работу с диагностическим материалом (моча, мокрота) проводили согласно приказу МЗ РФ № 109, приложение № 10 от 21.03.2003. Постановку РАЛ, РСА, ИФА проводили аналогично описанному в соответствующих главах диссертации. Селективное концентрирование анти гена возбудителя туберкулёза на МИС с последующей постановкой экспрессанализов (ИФА и КИФА) осуществляли в два этапа (рис. 17): 1 этап- селективное концентрирование. В каждый флакон с исследуемым материалом (мокрота, ресуспендированная в 10 кратном объёме забуференного физиологического раствора рН 7,2;

моча, объёмом 1-10 мл) вносили по 0,5 мл 10% ресуспендированного МИС и инкубировали при комнатной температуре в течение 30-40 мин. Далее, удерживая МИС при помощи постоянного магнита на дне флакона, выливали жидкость, к осадку МИС добавляли 10 мл фосфатносолевого буферного раствора (ФСБ), перемешивали встряхиванием и переносили в бактериологическую пробирку или флакон. Таким образом промывали МИС 5-6 раз, удаляя отмывочный раствор, удерживая МИС при помощи магнита;

2 этап- исследование МИС в ИФА и КИФА (методика описана в главе 6).

2 ИФА КИФА Исследуемый материал Отмывка МИС Рисунок 3. Схема проведения экспресс-анализов при выявлении антигенов МТБ с применением МИС Обозначения: 1 – гранулы МИС туберкулёзные;

2- туберкулезный антиген;

3 – постоянный магнит.

Для обеспечения селективного концентрирования антигенов МТБ из проб больных большого объёма (мокрота, разведённая забуференным физиологическим раствором рН 7,2;

моча) использовали туберкулёзные МИС, помещённые в проточную магнитную ловушку, через которую пропускали исследуемые жидкости, регулируя скорость их протекания зажимом (рис.18). Меняя местами колбы, можно многократно пропускать через ловушку исследуемую пробу, достигая максимального концентрирования микобактерий и их антигенов на МИС. После этого систему промывали 100 мл забуференного физиологического раствора рН 7,2, тем самым обеспечивая отмывание МИС от посторонних примесей и несвязавшихся компонентов. В дальнейшем из ловушки извлекали МИС, на поверхности которого за счёт реакции антиген- антитело фиксировались микобактерии туберкулёза и его антигены, и помещали в колбу или пробирку для проведения исследований в ИФА и КИФА.

4 2 Рис. 18. Исследование проб с использованием проточной магнитной ловушки с МИС Обозначения: 1 - колба с иследуемой пробой;

2 - зажим;

3 - проточная магнитная ловушка с МИС;

4 - соединительные трубки;

5 – колба для приема пробы.

Тестирование микобактерий осуществлено методами: РАЛ, РСА, ИФА, МИС с ИФА и КИФА. Было исследовано 286 проб клинического материала (моча, мокрота) от больных различными формами туберкулёза из краевого клинического противотуберкулёзного диспансера, 12 проб материала от больных с нетуберкулёзными заболеваниями и 11 проб от здоровых людей, у которых исследовали мочу и слюну (табл.16). Таблица 16. Результаты исследования клинического материала (моча, мокрота) на наличие в нём МТБ и его антигенов Клиническая форма Диссеминированный ТБ лёгких (мокрота) Фиброзно-кавернозный ТБ лёгких (мокрота) Инфильтративный (мокрота) ТБ лёгких 33 48 21 22 21 24 почек 26 26 16 12 11 286 15 17 12 2 186 (65 %) 16 17 12 1 189 (66 %) 20 20 14 1 217 (76 %) 23 24 15 1 260 (91 %) 23 24 15 1 260 (91 %) 18 35 13 12 14 17 17 34 14 14 15 18 18 39 14 16 18 21 23 45 20 20 20 22 22 47 21 20 20 МИС+ МИС + Кол- РСА РАЛ ИФА ИФА КИФА во проб Количество положительных результатов 24 25 15 18 14 18 17 20 23 25 23 Очаговый ТБ лёгких (мокрота) Кавернозный ТБ почек (моча) Туб.коксит (моча) Туб.спондилит (моча) Туб.иридоцикл. (моча) Инфильтративный (моча) ТБ увеит (моча) Неспецифические заболевания (онкология, пиелонефрит и т.д.) Здоровые люди Всего больных ТБ ТБ ТБ муж. пол. органов (моча) Примечание. В скобках указано количество положительных проб на наличие специфических антигенов у больных туберкулёзом в процентах Методики постановки этих реакций и система учёта положительных результатов приведены в главах 5 и 6. Как видно из таблицы, используя комплекс разработанных препаратов и методов (РСА, РАЛ, ИФА, ИФА с МИС, КИФА с МИС), можно проводить качественную диагностику туберкулёза, обнаруживая у больных специфические туберкулёзные антигены. Максимальный процент выявления этих антигенов при исследовании больных достигнут с помощью сочетанных методов, использующих МИС с ИФА и КИФА. Анализ полученных данных позволил установить, что использование адсорбированной туберкулёзной сыворотки при конструировании диагностических препаратов даёт возможность диагностировать заболевание туберкулёзом у людей, дифференцируя его от другой патологии. С помощью ИФА и КИФА, где в качестве твёрдой фазы используются МИС с иммобилизованными антителами против антигенов Муcobacterium tuberculosis, показано, что антиген возбудителя туберкулёза выявляется в мокроте, моче туберкулёзных больных в 91 % случаев и не обнаруживается у здоровых людей. Указанные методы превосходят по информативности РСА, РАЛ и традиционный ИФА, проводимый в полистироловых планшетах. Это связано с тем, что при использовании МИС с ИФА и КИФА специфический антигенный материал концентрируется на сорбенте из проб большого объёма. Недостаточная чувствительность традиционного ИФА (5х104-1 х 105 м.к./мл), как отмечают некоторые исследователи, связана с нестандартностью адсорбционной поверхности планшет из полистирола, что приводит к непрочному связыванию АТ и их адсорбции на этапах иммуноферментного анализа. Отсутствие 100 % специфичности разработанных диагностических систем объясняется тем, что, хотя при их изготовлении использована туберкулёзная сыворотка, адсорбированая гетерологичными антигенами на твёрдом носителе (это несомненно повысило специфичность анализа), однако полного удаления из неё гетерологичных иммуноглобулинов, вероятно, не произошло, так как, род микобактерий составляет более 100 видов (Методические рекомендации МЗ РФ, 1992), которые содержат общие антигены с большим количеством нетуберкулёзных микобактерий и других микроорганизмов, например, с Nocardia, Brucella, Listeria и т.д.

В настоящее время усложнилась также микробиологическая и серологическая диагностика туберкулёза из-за часто встречаемых атипичных микобактерий, изменившейся биологии возбудителя (морфология, ферментативная активность, биологические свойства) вследствии широкого применения разнообразных противотуберкулёзных препаратов. Обобщая преимущества данных тест-систем, следует отметить, что разработанные новые диагностические средства для выявления возбудителя туберкулёза на основе МИС позволяют обнаруживать корпускулярные и растворимые антигены возбудителя при их низкой концентрации в материале (50-100 микробных клеток в пробе), проводить исследования с пробами большого объёма. Эти системы относятся к средствам экспресс-диагностики туберкулёза, т.к. позволяют получить результат через 1-1,5 ч после начала исследования. Немаловажным является и тот факт, что туберкулёзный МИС не теряет своих физикохимических и иммунологических свойств при хранении на протяжении 3 лет (срок наблюдения). В табл. 17 представлены сравнительные данные методов диагностики туберкулёза, используемые в настоящее время в клинической практике и разработанные нами. Таблица 17. Сравнение методов диагностики туберкулёза № Метод Время де- Выявляеп/п текции мость 72 ч 67 % 1. Туберкулинодиагностика 2. 3. 4. 5. 6.

7. 8. Культивирование МТБ Микроскопия (флуоресцентная с аурамином) РСА РАЛ ИФА ИФА с МИС КИФА с МИС 1-3 мес. 2,5 ч 5 мин 2ч 3 ч* 1-1,5 ч 1-1,5 ч 0,5-14 % 14 % 65 % 66 % 76 % 91 % 91 % Литературный источник Чутаев Ю.П. с соавт, 1996 Клименко М.Т. с соавт, 1987 Канюк А.Н., 1995 Собственные данные *- без учёта 18 часовой сенсибилизации планшет Как видно из таблицы, наиболее эффективными методами для диагностики возбудителя туберкулёза являются ИФА и КИФА с МИС, которые отличают ся высокой чувствительностью, специфичностью и непродолжительным сроком проведения анализа. При этом обнаружение туберкулёзных антигенов возможно у больных с различной локализацией патологического процесса при взятии материала на исследование у них бесконтактным способом (моча, мокрота).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Каждую минуту в мире от туберкулёза умирают четыре человека. В России в 2004 г. зарегистрировано около 102,9 тыс. больных с установленным впервые активным туберкулёзом, а показатель по сравнению с 2003 г. увеличился на 3,3 %, достигнув 71,7 на 100 тыс. населения. Среди детей до 14 лет также выросла заболеваемость на 3,8 %. Больные туберкулёзом органов дыхания составляют 95,6 % из числа всех зарегистрированных случаев заболевания туберкулёзом (Ильин И.А., 2005). В связи с неблагоприятной обстановкой по туберкулёзу в Российской Федерации в последние годы (Онищенко Г.Г. 2003) и недостаточным качеством диагностических препаратов, основные направления медицинской биотехнологии предусматривают расширение возможностей диагностики микобактерий туберкулёза за счёт появления новых экспрессных высокоспецифичных, чувствительных, доступных методов и препаратов, что способствует оперативному эпидемиологическому анализу и формированию целенаправленных противоэпидемических и медицинских противотуберкулёзных мероприятий. Увеличение заболеваемости туберкулёзом, вызванным МТБ и нетуберкулёзными микобактериями, повышает значимость их индикации и идентификации, что крайне важно для проведения подходящей антибактериальной терапии. В настоящей работе представлены результаты научно-методических разработок биотехнологии медицинских иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза. Производство диагностических препаратов представляет собой единую биотехнологическую систему, которая складывается из последовательных стадий и операций, количество и особенности которых зависят от вида производимой продукции.

При получении качественных диагностических препаратов необходимо выделить из микробных биомасс высокоочищенные активные и специфические антигенные комплексы, применяемые при иммунизации животных и в качестве положительного контроля в тест-системах, подобрать схему иммунизации животных, получить специфические иммунные сыворотки, отработать параметры биотехнологии изготовления диагностических систем. При всём многообразии способов извлечения специфических антигенов из микробных клеток необходимо было подобрать комплекс биотехнологических операций, который бы позволил изолировать в достаточном количестве для производственных целей полноценные в антигенном отношении фракции из МТБ. Для этого была использована водно-солевая экстракция МТБ и других бактерий. По данным ряда исследователей (Вейнблат В.И., 1971;

Афанасьев Е.Н., 1986 и др.), такие экстракты обладают сложным макромолекулярным составом и в них обнаруживаются в тех или иных количествах большинство присутствующих у бактерий антигенов. Водорастворимые туберкулёзные антигены изолировали комплексным методом: водно-солевой экстракцией, ультразвуковой и механической дезинтеграцией, осаждением антигенов сульфатом аммония. Полученный препарат содержал не менее 20 мг/мл белка и формировал зоны преципитации в РИД с иммунной сывороткой в разведении 1:32 – 1:64. Для получения туберкулёзных иммунных сывороток нами апробированы различные схемы иммунизации. При получении агглютинирующих сывороток, в которых в основном присутствуют иммуноглобулины класса М, использовали «короткую» схему иммунизации (Афанасьев Е.Н., 2000) с иммунокорректорами - тималином и циклофосфаном;

при получении преципитирующих сывороток, в которых превалируют иммуноглобулины класса G, - применяли «длинную» схему (Тюменцева И.С., 1994) с иммунокорректором феракрилом. Использование иммунокорректоров позволило повысить эффективность иммунизации при незначительном расходе антигенного материала и существенном повышении титров специфических антител (до 1:600 в РНИФ и 1:64 в РИД).

В связи с тем, что антигенный спектр микобактерий туберкулёза имеет много общего с представителями родов Nocardia, Brucella, Listeria и некоторыми нетуберкулёзными микобактериями, идентификация МТБ и его дифференциация крайне важна для практического здравоохранения и проведения подходящей антибактериальной терапии. Для конструирования эффективных туберкулёзных диагностических препаратов необходимы высокоспецифические иммунные сыворотки, нуждающиеся в удалении из них перекрёстно реагирующих антител. Для этих целей наилучшим способом является использование аффинного сорбента, представляющего собой гетерологичные антигены, ковалентно закреплённые на твёрдой матрице. Очистка иммунной сыворотки происходит за счёт биоспецифического взаимодействия между антигенами, закрепленными на матрице, и антителами, подлежащими удалению. Результаты предыдущих исследователей и наш собственный опыт показали, что сорбция корпускулярными антигенами существенно понижает специфические титры антител и делает непригодным сырьё для дальнейшего использования из-за появления в нём экстрагируемого из бактериальных клеток материала, применение же для этих целей полиакриламидных сорбентов базируется на применении высокотоксичных импортных реактивов и довольно трудоёмка. В связи с этим, мы впервые для данных целей использовали разработанный аффинный сорбент с магнитными свойствами, где в качестве твердой фазы выступает кремнезем-алюмосиликат. МС готовили при соотношении компонентов (Fe2O3, декстран, алюмосиликат) - 2:2:1 соответственно;

время гелеобразования - 2 ч, значение рН гелеобразования - 7,0. Активирование сорбента производили методом окисления, используя перхлорат натрия. Для придания магносорбенту аффинных свойств на его поверхность иммобилизовали лиганды - водорастворимые антигены (2,5 мл с концентрацией белка 2 мг/мл), полученные из гетерогенных штаммов микроорганизмов (Brucella abortus 19, Nocardia brasiliensis, M. intracellulare # 23, M.

кansasii Yoss), дающих перекрёстные реакции с иммунными сыворотками. Оп тимальными факторами, способствующими получению МИС, являются: время иммобилизации антигенов на МС – 2 ч при значении рН 6 - 7 и температура 24 - 37 0С. Методы получения иммуносорбентов просты и технологичны, исключающие применение токсичных веществ. Полученные МИС характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической и микробиологической устойчивостью, не подвержены набуханию. Использование отечественных экологически чистых компонентов, их дешевизна, простота технологии изготовления свидетельствуют МИС. При сорбции туберкулёзной иммунной сыворотки данный антигенный МС, взаимодействуя с соответствующими иммуноглобулинами, освобождал сыворотку от неспецифических антител на одном этапе, сохраняя первоначальную специфическую активность нативных иммунных сывороток. Магнитные свойства иммуносорбента позволяли значительно упростить процесс отделения его от жидкой фазы в магнитном поле и исключить процесс длительного центрифугирования. Проведённые исследования дают основание утверждать, что применение алюмосиликатных антигенных МИС позволяет проводить качественную иммуносорбцию, сохраняя активность и специфичность иммунных сывороток. При этом не происходит попадания в сыворотку антигенного материала, в ней отсутствуют комплексы «антиген-антитело», появляющиеся в материале при сорбции корпускулярными антигенами и мешающие в дальнейшем созданию специфических диагностических систем, титры специфических антител не снижаются и конечный продукт является качественным сырьем для дальнейшей работы. Данный сорбент можно регенерировать и многократно использовать. Из сорбированной туберкулёзной сыворотки иммуноглобулины выделяли с помощью каприловой кислоты по методу G. Steibuch, R. Andran (1969). о достоинствах алюмосиликатных Варьируя количеством используемых компонентов, рН растворов, температурой и временем проведения реакций, выделенные туберкулёзные иммуноглобулины конъюгировали с ферментом пероксидазой, липосомами, латексом, алюмосиликатом, органокремнезёмной матрицей, содержащей оксид железа, получая соответственно иммунопероксидазный конъюгат для ИФА, диагностикумы для РАЛ, РСА и МИС. Для ковалентного связывания пероксидазы с туберкулёзными иммуноглобулинами использовали метод перйодатного окисления углеводной части фермента (Р.К.Nakane, А.Kawaоi, 1974). Сформировавшиеся при этом альдегидные группы образовывали ковалентную связь с аминогруппами антител. Очистку конъюгата от непрореагирующих компонентов осуществляли на колонке с сефадексом G-100, после чего его лиофилизировали. Полученный препарат был стабилен без потери активности в течение 1 г. Рабочий титр полученных иммунопероксидазных туберкулёзных конъюгатов составил 1:4001:800. В иммуноферментной реакции, в которой в качестве твёрдой фазы применяли стандартные планшеты, чувствительность конъюгата по водорастворимым антигенам составила 50-100 мкг/мл, по возбудителю туберкулёза – (5х1041х105 м.к./мл). С гетерологичными штаммами диагностикум не взаимодействовал, что говорит о его специфичности. В результате проведённой сорбции сыворотки крови от гетерологичных антител и чётко отработанных параметров конъюгации лиганда и маркёра получены высокоэффективные (1:600), специфичные (отсутствуют перекрёстные реакции с гетерологичными штаммами) иммуноферментные конъюгаты. На основе полученных препаратов была сконструирована тест-система для экспресс-диагностики возбудителя туберкулёза, состоящая из 1 ампулы иммуноферментного конъюгата, 1 ампулы положительного контроля (обеззараженная взвесь туберкулёзного микроба)- 1х109 м.к./мл, 1 ампулы иммуноглобулинов туберкулёзных и необходимых ингредиентов для постановки ИФА (ФСБ, твин-20, БСА, стоп-реагента - 4 М раствора серной кислоты, хромогена - ортофенидендиамина, таблетки гидроперита). Одной ампулы с препаратом в объеме 0,1 мл, с активностью-1:600 достаточно для исследования 300 проб в ИФА. Ферменты с лабильной структурой молекулы даже в охлаждённом состоянии при 4 0С имеют ограниченный срок хранения, который удаётся увеличить при придании им определённой жёсткости в процессе иммобилизации энзимов на твёрдофазные носители. В качестве такого носителя использовали липосомы, которые получали из фосфолипидов и ганглиозидов, выделенных из мозга к.р.с., а в последнее время из мозга свиней, не являющегося потенциально опасным при губчатой энцефалопатии животных (коровье бешенство). Разработанная биотехнология выделения сырья для приготовления липосом (ТУ 9154-00-01897080-2004) включала измельчение и обезвоживание мозга животных ацетоном, экстрагирование из него фосфолипидов и ганглиозидов смесью хлороформ-этанол (1:1) и дробное осаждение указанных липидсодержащих фракций ацетоном. Данные способы выделения фосфолипидов и ганглиозидов защищены патентами РФ № 2192265 от 10.10.2002 и № 2195296 от 27.12.2002. Методом тонкослойной хроматографии в препарате фосфолипидов обнаружены в основном фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфотидилинозит, а также холестерин. Полученные препараты растворяли в хлороформе в конечной концентрации 50 мг/мл и смешивали фосфолипиды и ганглиозиды в соотношении 20:1, добавляя туда антиоксидант – 0,5 % -токоферол. Этот липидный раствор использовали для приготовления липосом методом «выпаривания в обращённой фазе» в соответствии с методическими рекомендациями «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденными Главным Государственным санитарным врачом России Г.Г. Онищенко. 06.04.2000 г. В результате получены липосомы, идентифицированные при электронной микроскопии, размером 150-300 нм. При получении липосомального иммуноферментного диагностикума предварительно активировали (5+0,1) мг пероксидазы хрена по методике, описанной выше. В результате в углеводной части молекулы пероксидазы формировались альдегидные группы, обеспечивающие фиксацию фермента к мембране липосом за счёт аминогрупп ганглиозидов и последующую за этим иммобилизацию туберкулёзных иммуноглобулинов на сформировавшемся комплексе с участием оставшихся свободных альдегидных групп фермента. С этой целью к 5 мг окисленной пероксидазы добавляли 1 мл суспензии липосом в 0,01 М КББ рН 9,5, содержащей 18 мг липидов, смесь подвергали кратковременной ультразвуковой обработке. После удаления несвязавшейся на липосомах пероксидазы путём хроматографии на колонке с сефадексом G-100, уравновешенной 0,01 М КББ рН 9,5, к препарату добавляли туберкулёзные иммуноглобулины G в оптимальном количестве (5 мг/мл). Смесь инкубировали 2 ч при температуре (22+4) 0С и несвязавшиеся иммуноглобулины отделяли от липосомального конъюгата хроматографически на колонке с сефадексом G-100, уравновешенной 0,1 М ФСБ рН (7,2+0,1). В лиофилизированном состоянии туберкулёзный липосомальный иммуноферментный препарат по чувствительности и специфичности не отличался от туберкулёзного иммуноферментного конъюгата и сохранял все свои свойства в течение 2 лет (срок наблюдения), в 2 раза превышая срок хранения туберкулёзного иммуноферментного диагностикума. Нами осуществлена разработка биотехнологии изготовления латексных (полиакролеиновых) диагностикумов для выявления возбудителя туберкулёза. Латексы выбраны в качестве носителей, так как их химические свойства относительно постоянны и поддаются точной характеристике. Наличие альдегидных групп на их поверхности позволяет легко образовывать ковалентную связь с аминогруппами белков. Таким образом, проанализировав литературные дан ные и проведя экспериментальные исследования, направленные на повышение технологичности производства латексных диагностикумов, нами были отработаны оптимальные условия их изготовления. Для сенсибилизации использовали иммуноглобулины класса М из адсорбированных туберкулёзных сывороток при их оптимальной нагрузке -400 мкг/мл (при увеличении количества иммобилизованного лиганда отсутствовал отрицательный контроль, а при уменьшении – снижалась чувствительность диагностикума). Время сенсибилизации составило 6 ч при температуре - 50 0С и рН среды – (7,2+0,1). При уменьшении времени сенсибилизации, температуры и рН среды до 5 снижалась чувствительность препарата, при увеличении рН до 9,0 - отсутствовал отрицательный контроль. Чувствительность разработанных диагностикумов в РАЛ с возбудителем туберкулёза составила 3,9х105-7,8х105 м.к./мл при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами. С целью получения диагностикума, обнаруживающего возбудитель туберкулёза в течение нескольких минут, была использована алюмосиликатная кремнезёмная матрица с пористой структурой, обладающая высокой сорбционной активностью. Твёрдофазный краситель окрашивали аурамином в весовом соотношении 2:1 и активировали вторичным алкилсульфатом натрия. Были подобраны оптимальные параметры биотехнологии подготовки твёрдофазного носителя и иммобилизации на него туберкулёзных иммуноглобулинов класса М, выделенных из адсорбированной сыворотки. Оптимальными параметрами при этом были следующие: концентрация белка иммуноглобулинов -1,5 мг/мл, время иммобилизации - 2 ч при температуре (26+4) 0С. При исследовании влияния кислотности буферного раствора во время сенсибилизации, установлено, что при увеличении кислотности снижается процент связывания сенситина. Увеличение рН реакционного раствора до 10 приводит к ложноположительной агглютинации. Оптимальный рН при сенсибилизации матрицы и постановки РСА - 7,0.

Данный диагностикум в РСА на стекле, взаимодействуя с туберкулёзным антигеном, формировал крупнозернистые хлопья с просветлением жидкости. С гетерологичными штаммами бактерий агглютинации диагностикума не наблюдалось. Чувствительность сконструированных диагностикумов суспензионных иммуноглобулиновых туберкулёзных в РСА на стекле составила 7,8 х 105 1,56х106 м.к./мл, что соответствует чувствительности диагностикумов латексных иммуноглобулиновых в реакции агглютинации латекса (РАЛ). При этом предварительный учет РСА на стекле возможен через 1-3 мин, а окончательный результат РАЛ (макрометод)- 16- 18 ч. Таким образом, преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции и быстроте получения результатов. Основные требования, предъявляемые к современным методам экспрессанализа, заключаются в выявлении низких концентраций патогенного агента в максимально короткие сроки с высокой специфичностью. В последнее время для этих целей нашли применение магноиммуносорбенты, благодаря которым упрощаются, ускоряются все этапы исследований при высокой чувствительности диагностических препаратов и наличия возможности автоматизации учёта реакций. Цель наших исследований – конструирование тест-системы диагностической магноиммуносорбентной туберкулёзной для иммуноферментного анализа. Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степенью чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твёрдой фазы, которая должна сохранять иммунологические свойства и стабильность в иммобилизованном состоянии, обладать минимальной неспецифической адсорбцией и быть удобной при разделении фаз. Нами разработана биотехнология изготовления органокремнезёмного магносорбента на основе алюмосиликата и окиси железа (III). Модифицирова ние его поверхности осуществляли в присутствии полимера - декстрана и поверхностно-активного вещества - вторичного алкилсульфата натрия. На основе проведенных исследований рекомендованы следующие оптимальные условия получения алюмосиликатных магносорбентов: весовые соотношение компонентов синтеза окиси железа, декстрана, алюмосиликата 2:2:1, время гелеобразования 2 ч (при увеличении времени удлиняется процесс синтеза магносорбента, уменьшается размер его пор, что приводит к снижению степени иммобилизации лиганда в порах сорбента), значение рН гелеобразования 7,0. Далее проводили иммобилизацию специфических туберкулёзных иммуноглобулинов G на МС (данные препараты без потери специфической активности хранятся в течение 3 лет (срок наблюдения). В качестве сшивающего агента нами использовано поверхностно-активное вещество - вторичный алкилсульфат натрия, при этом прочность связи антител с магносорбентом повышается за счёт создания дополнительных связей, которые образуются между активными группами белка, полиглюкина (декстрана) и вторичного алкилсульфата натрия. Исследования показали, что концентрация белка иммуноглобулинов 2,5 мг/мл является оптимальной для полного насыщения антителами сорбента в объеме 0,4 мл 10 % взвеси. При увеличении концентрации белка адсорбционная емкость МИС снижалась. Оптимальными факторами, способствующими получению МИС, являются: время иммобилизации 2 часа при значении рН раствора иммуноглобулинов 6-7 и температуры (22 + 4) 0С и (37 + 1) 0С. Методы получения МИС просты и технологичны, исключают применение токсичных веществ, диагностикумы изготовлены из отечественных экологически чистых компонентов. Полученные МИС характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической, микробиологи ческой устойчивостью и сохраняют специфическую активность в течение 3 лет (срок наблюдения). МИС сохраняли способность концентрировать на своей поверхности бактериальные клетки возбудителя туберкулёза, которые затем выявляли с помощью ИФА. В опытах на чистых культурах возбудителя туберкулёза получены положительные результаты при наличии в объеме пробы 0,5х102 - 1х102 м.к. и выше. При этом данное количество микробных тел могло присутствовать в 1 или 500 мл исследуемых проб. Если объём этих проб был большим (500 мл), то данную пробу пропускали через МИС, удерживаемый в специальной ловушке магнитным полем, что обеспечивало концентрацию МТБ на МИС. В дальнейшем сорбент обрабатывали туберкулёзным иммуноферментным конъюгатом, отмывали от несвязавшихся компонентов реакции, вносили субстрат-индикаторный раствор, по изменению цвета которого проводили учёт реакции. Результаты проведённых исследований показали, что чувствительность ИФА одинакова при исследуемых температурных режимах (22+4) 0С и (37±1) 0С. Другим важным параметром являлся временной режим. Установлено, что равновесный процесс между туберкулёзным антигеном и МИС наступал через 30 мин, а между образовавшимся комплексом и конъюгатом - через 15 мин. Важным являлось количество отмывок МИС после контакта с конъюгатом. При отмывке МИС меньше 6 раз ухудшалась специфичность реакции, т.е. наблюдались фоновые значения оптической плотности в отрицательном контроле. Разработанная диагностическая система отличалась высокой специфичностью, не давая положительных реакций с гетерологичными микроорганизмами с концентрацией 1х102-1х106 м.к. в исследуемой пробе. Для сравнения полученного диагностикума с традиционным методом постановки ИФА использовали полистироловые планшеты, сенсибилизированные туберкулёзными иммуноглобулинами в течение 18 ч, далее проводили анализ в соответствии с традиционной методикой. Чувствительность ИФА в данном случае составила 5х104 - 1х м.к./мл. При этом время постановки ИФА с применением МИС - 1-1,5 ч, а традиционным методом, учитывая 18 ч сенсибилизацию планшет, около 20 ч. Если объём исследуемых проб при использовании стандартных плашек не превышает 0,2 мл, то при использовании МИС он не ограничен. В качестве иммунопероксидазного конъюгата для выявления МТБ использовали также его липосомальную форму. Данный диагностикум обнаруживал фиксированные на МИС за счёт специфической реакции «антигенантитело» МТБ в количестве 1х10 2 м.к. в пробе при отсутствии реакций с гетерологичными штаммами бактерий. Таким образом, при использовании МИС в ИФА отпадала необходимость в полистироловых планшетах, сокращалось время сенсибилизации твёрдой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твёрдой фазы;

время проведения непосредственно анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА. Учитывая, что липосомальный туберкулёзный иммуноферментный диагностикум при использовании в качестве твёрдой фазы МИС позволял в ИФА обнаруживать МТБ в гораздо меньшем количестве, чем при постановке традиционной реакции в полистироловых микропланшетах, т.е. обладал большей чувствительностью, нами было получено 5 серий этих диагностических систем. В полученный набор входят: лиофильно высушенный липосомальноиммуноперооксидазный конъюгат-0,1мл -1 ампула;

обеззараженная взвесь туберкулёзного микроба 1х109 (положительный контроль)- 0,5 мл-1 ампула;

туберкулёзный МИС (10 % взвесь)-по 2мл-2 ампулы и все необходимые ингредиенты для постановки ИФА (ФСБ, БСА, твин-20, стоп-реагент –по 1 флакону, хромоген-ортофенилендиамин-2 флакона и таблетка гидроперита).

Таким образом, нами разработана технология изготовления туберкулёзных магноиммуносорбентных диагностикумов и на их основе сконструированы диагностические тест – системы для проведения сочетанного метода детекции микроорганизмов в иммуноферментном анализе, подобраны условия постановки ИФА с МИС. Установлено, что туберкулёзные магноиммуносорбенты в жидком виде стабильны без потери физико-химических и иммунологических свойств в течение 3 лет (срок наблюдения). ИФА с применением МИС обладает высокой чувствительностью (1х102 м.к. в пробе), быстротой постановки реакции (1-1,5 ч), что подтверждено многочисленными испытаниями. При этом отпадает необходимость использования сенсибилизированных микропланшет. При использовании разработанной липосомально-иммунопроксидазной тестсистемы повышается срок годности препарата в 2 раза. На основе полученных экспериментальных данных разработаны методические рекомендации «Применение магноиммуносорбентов для выявления микобактерий туберкулёза», одобренные Ученым Советом СтавНИПЧИ (протокол № 3 от 3.03.05) и утвержденные директором института. Составлены нормативные документы: регламент производства и инструкция по применению на тест-систему диагностическую липосомально- иммуноперооксидазную для выявления антигена возбудителя туберкулёза иммуноферментным методом, рассмотренные на Учёном Совете СтавНИПЧИ (протокол № 3 от 3.03.05 г) и утвержденные директором института. В последние годы при выявлении микобактерий туберкулёза широко применяют люминесцентную микроскопию. Этот метод значительно увеличивает диагностическую эффективность микроскопических исследований. Быстрота обнаружения микобактерий, простота флуорохромирования делает его доступным для практических лабораторий. Люминесцентная микроскопия с применением аурамина позволяет увеличить процент находок на 8 % по сравнению с методом флотации и на 17 % по сравнению с прямой бактериоскопией мазка (Приказ МЗ РФ № 558, 1978). Метод бактериоскопии мазка с окраской люми несцентными красителями, в частности аурамином, основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. Этим методом можно исследовать любой материал, кроме мочи, в котором могут быть трудно дифференцируемые при такой окраске сапрофиты (Приказ МЗ РФ № 558, 1978). Другим важным преимуществом метода люминесцентной микроскопии является способность обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по методу Циля-Нильсена (Методические указания МЗ РФ «Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001). При окраске микобактерий аурамином возможны ложноположительные результаты в процессе некачественного обесцвечивания мазка, что может привести к сохранению некоторыми сапрофитными бактериями оранжевого цвета. Микроскопические исследования (окраска по Цилю-Нильсену и аурамином) не позволяют дифференцировать микобактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis от нетуберкулёзных (атипичных микобактерий) микобактериозов. На основе этих методов можно только сделать заключение о наличии или отсутствии кислотоустойчивых микобактерий (приказ МЗ РФ № 109. Приложение №11, 2003). Наиболее перспективными являются методы диагностики, основанные на образовании комплекса антиген-антитело, особенно в связи с возможностью использования в иммунофлуоресценции твёрдых носителей (Стоев К.Г. с соавт., 1981;

Подзолкова Г.Г. с соавт., 1989 и т.д.). С этой целью из адсорбированной туберкулёзной сыворотки путём фракционирования каприловой кислотой были выделены иммуноглобулины, которые метили флуоресцирующим маркером (ФИТЦ) по общепринятой методике. Они использованы в сочетании с магноиммуносорбентами для обнаружения антигенов возбудителя туберкулёза, были определены также оптимальные параметры постановки количествен ного иммунофлуоресцентного анализа (КИФА), чувствительность и специфичность метода. В опытах на чистых культурах и в модельных опытах на воде, контаминированной различными концентрациями туберкулёзных микроорганизмов, получены положительные результаты при наличии в объеме пробы 1х102 м.к. и выше, при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами. Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служил люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой типа ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяли источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный типа В7-76. В процессе отработки различных условий проведения анализа установлено, что чувствительность КИФА была одинаковой при исследуемых температурных режимах сорбции антигена на МИС- (22+4) 0С и (37±1) 0С, а для контакта сорбента с антигеном и окрашивания образовавшегося комплекса антиген-антитело флуоресцирующими иммуноглобулинами было достаточно 15-30 мин инкубации. Нами приготовлено 5 серий тест – систем МИС для диагностики возбудителя туберкулёза в КИФА, в которые входят 3 ампулы по 2 мл туберкулёзных МИС-10 % взвесь;

положительный контроль - обеззараженные клетки микобактерий туберкулёза, 1х10 9 м.к./мл, 1 ампула -1 мл;

иммуноглобулины туберкулёзные флуоресцирующие сухие – рабочее разведение 1:16 – 1:64 – 1 амп – 0,5 мл. Таким образом, нами разработана биотехнология изготовления магноиммуносорбентных диагностикумов и на их основе сконструированы диагностические тест – системы для проведения сочетанного метода детекции возбудителя туберкулёза в количественном иммунофлуоресцентном анализе, оптимизированы параметры постановки КИФА. Данный метод позволяет осуществлять селективное концентрирование МТБ на сорбенте, обладает, высокой чувствительностью (0,5х102 - 1х102 м.к./пробе), значительно превышающую чувст вительность общепринятой РИФ, возможностью быстро, в течение 1-1,5 ч учитывать реакцию не только визуально, но и инструментально (в условных единицах по показаниям вольтметра). Разработанные диагностические препараты и тест-системы для выявления микобактерий туберкулёза испытаны не только в лабораторных условиях, но и в условиях клиники. Для получения положительных результатов клинических испытаний диагностических препаратов необходимо иметь чёткое представление о специфике выявляемого заболевания, его локализации в организме человека, о свойствах возбудителя микобактерий туберкулёза, методах подготовки исследуемых материалов, так как от совокупности знаний этих составляющих зависит качество диагностики. Выявление антигенов возбудителя туберкулёза крайне затруднительно. Известны случаи, когда в группе больных фиброзно-кавернозным туберкулёзом только в фазе распада впервые выявлялся антиген (Хоменко А.Г., 1992). Для внелёгочного туберкулёза на фоне широчайшего полиморфизма бактерий характерны малая частота обнаружения возбудителя в патологическом материале и невозможность воспользоваться данными рентгенологической картины на ранних этапах заболевания. Целью наших исследований являлось максимально возможное выявление антигенов МТБ у наиболее эпидемически опасной категории пациентов, обратившихся в Краевой клинический противотуберкулёзный диспансер г. Ставрополя с подозрительными в отношении туберкулёза клиническими или рентгенологическими симптомами. Сбор, хранение, транспортировку и работу с диагностическим материалом (моча, мокрота) проводили согласно приказу МЗ РФ № 109, приложение № 10 от 21.03.2003. Проведено тестирование микобактерий и их антигенов в материале от больных разными методами: РАЛ, РСА, ИФА, МИС с ИФА и КИФА.

Было исследовано 11 проб от здоровых людей (контроль) и 286 проб клинического материала (моча, мокрота) от больных из краевого клинического противотуберкулёзного диспансера, у которых диагноз туберкулёз (диссеминированный ТБ лёгких, фиброзно-кавернозный ТБ, очаговый ТБ, ТБ мужских половых органов и т.д.) дифференцировался с неспецифическими заболеваниями (онкологическими, пневмонией, хроническим бронхитом, и т.д - всего 12 человек). При постановке РСА, РАЛ, ИФА (традиционным методом на плашках) выявляемость туберкулёзных антигенов в моче и мокроте больных составила 65 %, 66%;

76 % соответственно, при постановке ИФА и КИФА с МИС - 91 %. Все разработанные диагностикумы дали отрицательный результат при исследовании мочи и мокроты здоровых людей. Таким образом, используя комплекс разработанных препаратов и методов (РСА, РАЛ, ИФА, ИФА с МИС, КИФА с МИС), можно проводить качественную диагностику туберкулёза. Максимальный процент выявления микобактерий туберкулёза при исследовании больных был получен с помощью сочетанных методов ИФА и КИФА с МИС. При сравнении результатов иммуноферментных анализов традиционного с использованием полистироловых плашек и сочетанного с применением МИС установлено, что результаты исследований значительно различаются. За счёт селективного концентрирования на своей поверхности туберкулёзных антигенов, присутствующих в моче и мокроте больных, возможности концентрирования этих антигенов из проб большого объёма и более высокой чувствительности МИС с ИФА и КИФА обнаруживал положительные результаты в 91% случаев, в отличие от традиционного ИФА, при использование которого в этих же пробах туберкулезный антиген выявлялся в 76% случаях. В таблице 18 приведены сравнительные данные по времени постановки реакции, сроках сохранности твердой фазы с иммобилизированными туберкулёзными иммуноглобулинами, чувствительности традиционного ИФА и сочетанного использования ИФА и КИФА с МИС.

Таблица 18.

Сравнительная характеристика сочетанных экспресс-анализов традиционных и Традиционные экспресс-анализы Анализы Время постановки, ч Исследуемые объекты ЧисЗатая грязнё кульнные тура объекты внешней среды Чувствительность, м.к. в мл. 20 дн. 5х10 4 1х10 5 Срок годности сенсибил. твёрдой фазы Анализы Экспресс-анализы с МИС (сочетанные) Время постановки, ч Срок Исследуемые объекты годности сен- Чистая Загрязсибил. кульнённые твёрдой тура объекты фазы внешней среды Чувствительность, м.к. в объёме пробы ИФА 1 3г (срок наблюдения) 3г (срок наблюдения) 0,5х1021х10 2 0,5х1021х10 2 1х10 ИФА РИФ 5х10 1х10 КИФА 1х10 Обобщая преимущества данных тест-систем следует отметить, что нами получены принципиально новые диагностические препараты для выявления возбудителя туберкулёза, позволяющие обнаруживать с высокой чувствительностью (1х10 2 м.к. в пробе) антигены возбудителя при их низкой концентрации в материале, проводить исследования проб большого объёма, освобождаться от неспецифических компонентов реакции за счёт тщательного промывания МИС, фиксированных в магнитном поле. Данные системы относятся к средствам экспресс-диагностики туберкулёза, т.к. позволяют получить результат через 1-1,5 ч после начала исследования. Немаловажным является и то, что туберкулёзный МИС не теряет своих физико-химических и иммунологических свойств (чувствительность и специфичность) при хранении на протяжении 3 лет (срок наблюдения).

Анализ полученных данных позволил установить, что использование адсорбированной туберкулёзной сыворотки при конструировании диагностических препаратов по разработанной биотехнологии даёт возможность получать различные специфические и чувствительные диагностикумы для выявления возбудителя туберкулёза в модельных объектах и у больных людей. В итоге проведённых исследований подтверждены основные методологические подходы к разработке, изучению и производству различных иммунопрепаратов для диагностики возбудителя туберкулёза. Составлена блок-схема производства и исследования данных препаратов (рис. 19). 1 этап 2 этап Анализ и обобщение литературных данных, исследование выбранных сырьевых объектов Выбор и анализ сырья для конструирования диагностических препаратов: 1. Разработка методов извлечения полноценных бактериальных антигенов. 2. Отработка схем иммунизации и иммуносорбции туберкулёзной сыворотки крови. Выбор и анализ конъюгирующих компонентов (ферментов, красителей, матриц). Изучение их свойств (чистоты, активности, сорбционной ёмкости, структурных характеристик) Выбор оптимальных технологий конъюгирования лигандов (антигенов и иммуноглобулинов), маркёров (отработка временных, температурных параметров, величины рН, концентрации белка, состава и свойств буфера, количественных соотношений компонентов) и производство диагностических препаратов, а также тест-систем для выявления возбудителя туберкулёза Стандартизация препаратов по физико-химическим (прозрачность, цветность) и иммунологическим показателям (активность, специфичность, чувствительность) 3 этап 4 этап 5 этап Рисунок 19. Блок-схема производства и исследования туберкулёзных диагностических препаратов В процессе научно-методических разработок созданы новые латексные (для РАЛ), иммуноферментные (для ИФА) диагностикумы, сконструированы новые препараты алюмосиликатные (суспензионные для РСА), липосомальноиммуноферментные (для ИФА), магноиммуносорбентные (для ИФА, КИФА), позволяющие выявлять возбудитель туберкулёза, его антигены в объектах внешней среды и в клиническом материале. Использование селективного концентрирования возбудителя на МИС с последующим проведением экспрессанализа расширяет возможности индикации возбудителя туберкулёза за счёт высокой чувствительности (1х102 - 5х101 м.к./в пробе, объём которой практически не ограничен), позволяет получать результаты анализа в короткие сроки (11,5 ч), даёт возможность проведения и завершения анализов без выделения культуры, при использовании только нативного материала, что способствует оперативному эпидемиологическому анализу и формированию целенаправленных противотуберкулёзных медицинских мероприятий.

ВЫВОДЫ 1. Сочетанное использование водно-солевой экстракции, механической и ультразвуковой дезинтеграции позволило выделять из обеззараженных ацетоном микобактерий туберкулёза полноценные антигенные комплексы с серологической активностью 1:32-1:64 в реакции иммунодиффузии с туберкулёзной сывороткой. Данная биотехнология оказалась пригодной для изолирования антигенов из близкородственных возбудителю туберкулёза в серологическом отношении микроорганизмов. 2. При получении высокоактивных туберкулёзных иммунных сывороток для иммунизации кроликов применяли выделенные антигенные комплексы с иммуномодуляторами феракрилом, тималином и циклофосфаном. Специфическая активность полученных сывороток в непрямой реакции иммунофлуоресценции достигала 1:400 –1:600, а в реакции иммунодиффузии –1:32-1:64. 3. Удаление из туберкулёзных иммунных сывороток перекрёстно реагирующих антител с помощью магнитных сорбентов с ковалентно фиксированными на их поверхности антигенами гетерологичных штаммов обеспечило получение сырья, пригодного для конструирования различных диагностических препаратов. 4. Разработанная биотехнология изготовления липосомальных туберкулёзных иммунопероксидазных конъюгатов обеспечила получение высокочувствительного, специфического диагностикума, отличающегося повышенной стабильностью при хранении по сравнению с традиционным иммунопероксидазным конъюгатом. 5. Впервые осуществлена научная разработка биотехнологии производства серии высокоспецифических диагностических препаратов и иммобилизованных систем для выявления возбудителя туберкулёза и его антигенов в искусственно контаминированных пробах и в клиническом материале от больных (моча, мокрота). 6. Чувствительность разработанного туберкулёзного латексного диагностикума в реакции агглютинации латекса (РАЛ) составила 3,9х10 5-7,8х105 м.к./мл, а алюмосиликатного туберкулёзного диагностикума в реакции суспензионной агглютинации (РСА) на стекле- 7,8х105-1,56х106 при учёте результатов РАЛ через 16-18 ч, а РСА – через 1-3 мин. В клиническом материале (моча, мокрота) у больных туберкулёзом специфические антигены микобактерий выявлены в РАЛ в 66 % случаев, в РСА- в 65 %. 7. Туберкулёзные магнитные иммуносорбенты, полученные по разработанной биотехнологии, способны селективно концентрировать на своей поверхности микобактерии туберкулёза, его антигены из исследуемых проб большого объёма, включая клинический материал от больных туберкулёзом, и выступать в качестве твёрдой фазы при осуществлении иммуноферментного и количественного иммунофлуоресцентного анализов, обеспечивающих с высокой специфичностью выявление туберкулёзного микроба в течение 1-1,5 ч с чувствительностью 1х102 м.к./пробе. 8. В клиническом материале (моча, мокрота) у больных различными формами туберкулёза специфические антигены микобактерий при использовании туберкулёзных магнитных иммуносорбентов в сочетании с иммуноферментным и количественным иммунофлуоресцентным методами выявлены в 91 %, что подчёркивает высокую диагностическую ценность разработанных препаратов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Проводить извлечение антигенного материала путём водно-солевой экстракции, механической и ультразвуковой дезинтеграции для получения активных антигенных комплексов микобактерий туберкулёза. 2. Для повышения специфичности сыворотки проводить их иммуносорбцию от гетерологичных антител с помощью аффинных магноиммуносорбентов, полученных иммобилизацией с гетерологичными антигенами, что упрощает и ускоряет процесс очистки. 3. При конструировании суспензионных латексных и алюмосиликатных диагностикумов необходимо опытным путём подбирать нагрузку лиганда, временные и температурные параметры. 4. При получении магноиммуносорбентов для ИФА и КИФА использовать в качестве носителя - алюмосиликат, модификатора - полиглюкин, активатора - вторичный алкилсульфат натрия. 5. Проводить селективное концентрирование на магноиммуносорбенте туберкулёзных антигенов из объектов внешней среды и клинического материала, используя постоянный магнит, магнитные ловушки, с последующей постановкой ИФА, КИФА. Для постановки анализов следует использовать флаконы, пробирки, планшеты. 6. Для получения положительных результатов клинических испытаний препаратов необходимо иметь чёткое представление о специфике выявляемого заболевания, его локализации в организме человека, о свойствах возбудителя микобактерий туберкулёза, правильно проводить подготовку и сбор исследуемых материалов, так как от совокупности знаний этих составляющих зависит качество диагностики.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абелян В.А., Африкян Э.Г. Иммобилизация циклодекстрин-гликозил трансферозы и характеристика полученного биокатализатора // Журн. прикладная биохимия и микробиол. - 1992. - Том 28 №2. - С. 205-209. 2. Адамов А.К. Свойства антител, фиксированных на частицах, и перспективы применения их в микробиологии. Сообщение VI // Журн. микробиол. – 1965. - № 2. - С. 100-105. 3. 4. 5. Адамов А.К., Агафонов В.И. Суспензионные антитела и иммуносорбенАксёнова В.А. Эпидемическая ситуация по туберкулёзу у детей в Алексеев В.В., Быкова О.И., Голосеев Ю.А. и др. Обоснование требоваты. – М. - 1969. - 175 с. России// Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. - №8. - С. 57. ний к люминесцирующим иммуноглобулиновым препаратам, предназначенным для количественного иммунофлуоресцентного анализа // Особо опасные инфекции на Кавказе. - Ставрополь, 1987. - С.12-14. 6. 7. Алексеев П. Названы социально значимые заболевания/ Мед. газета. Аленкина Т.В., Данилина И.В. Применение иммуносорбентов для и перспективы: Материалы юбилейной науч.№100. - 17.12. 2004 повышения специфичности диагностических сывороток // Эпидемиологическая безопасность. Итоги 8. практ.конф., посвящённой 50-летию СтавНИПЧИ.- Ставрополь, 2002. - С.8-10. Алесковский В.В., Юффа А.Я. Модифицирование поверхности неорганическими соединениями // Журнал Всес. Хим. общ. Им. Д.И.Менделеева.1989.- № 3.- С.317-324. 9. 10. Андреев Л.В., Склифас А.К. Биохимия и биофизика микроорганизмов.Архангельский Н.И., Сихарулидзе А.И. Способ диагностики туберкулёГорький, 1997.- №5.- С.3-9. за. А. с. №1171038. Бюл.№29 от 07.08.85.

11.

Афанасьев Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): Автореф. дис. … докт. мед. наук. – Ростов, 2000. – 45 с. 12. Афанасьев Е.Н., Таран И.Ф., Тюменцева И.С. Антигенная структура бруцелл. Сообщ. I. Сравнительная оценка методов выделения водорастворимых антигенов бруцелл.– Ставрополь, 1986. – 16с. – Деп. в ВИНИТИ, № 6635-В86. 13. 14. 15. Базиков И.А. Разработка новых препаратов для экспрессных методов диБелиловский Е.М. Развитие государственной системы мониторинга Белиловский Е.М., Борисов С.Е., Дергачёв А.В., Гордина А.В., Марьина агностики сифилиса: Дис. …докт. мед. наук. – Ставрополь, 2000. – 200 с. туберкулёза, // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. - №8. - С. 58. Н.С., Матвеева М.Б. Заболеваемость туберкулёзом в России: её структура и динамика // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. - №7. - С. 4-11. 16. 17. Бельская Н.А., Митина В.С., Вейнблат В.И. Микрометод фракционироБендикене В.Г., Песлякас И.Г., Веса В.С. Хроматография сериновых вания и идентификация белков // Лаб. дело. – 1972. - № 10. – С.514-616. протеаз на хитине и его производных // Прикладная биохимия и микробиол. 1981. –Т. 17, №3. - С. 441-447. 18. Березин В.Б., Лахтин В.М., Ямсков И.А. Аффинный хроматографический сорбент, содержащий группировки конканавалина А, иммобили-зованного 19. 20. комплексообразованием с кобальтом // Прикладная биохимия и микробиол. - 1995. - Т.31, N 4. - С.400-404. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.- М., 1982. – С.92. Борисенко О.В., Жарникова И.В., Макрушникова А.И., Таран В.И.

Разработка новой магнитоуправляемой твёрдофазной иммуноферментной системы для диагностики туберкулёза у людей // X итоговая научная конференция молодых учёных и студентов. Ставрополь.Изд.: СГМА, 2002, С. 21. 22.

Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. Брыкалов А.В. Получение биопрепаратов на основе методов аффинной М.- 2002.- С.437- 441. сорбции и иммобилизации: Дисс.... докт. химич. наук. - Санкт-Петербург, 1993. - 330 с. 23. углей 24. Брыкалов А.В. Сорбенты на основе кремнеземов и активированных в биотехнологии и медицине // Материалы конф. химиков Сев.Кавказа.- Нальчик, 1991.- С.185-186. Брыкалов А.В., Кобанкова А.Н. Синтез и исследование компазиционных хитозанкремнезёмных сорбентов биомедицинского назначения // Современные достижения биотехнологии: Материалы 2-ой Всеросс.науч.-техн.конф. - Ставрополь, 12-13 сентября 2002 г. – Т1. - С.135-136. 25. Брыкалов А.В., Ковальков В.И., Тельбух В.П. и др. Способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов. Патент № 1084300 А С 12 №11/14 от 27.08.1982. 26. 92. 27. 28. Василенко Н.Ф., Кронгауз И.В., Лопаткин О.Н. и др. Способ получения Вейнблат В.И., Каминский В.В., Орлова Л.С. Иммунодискэлектрофорез туляремийного антигена / А. с. № 1425910 от 22.05.1988. антигенов чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. – Саратов, 1971. – Вып. 4(26). – С.196-200. 29. Вишневская Е.Б., Бобченок А.П., Мельникова Н.Н. и др. Идентификация L- форм микобактерий туберкулёзного комплекса с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) // Проблемы туберкулёза.-2001. - №3. - С.38-39. 30. Владимцева И.В. Научно-методические аспекты приготовления и использования магнитоуправляемых иммобилизованных микробиологических систем: Автор.... докт. биол. наук. - Ставрополь, 2002. - 39 с. Бусеев А.И., Ефимов И.П. Словарь химических терминов.-М.,1971.- С.

31.

Владимцева И.В., Плеханова Н.Г., Смирнова В.И., Закревский В.И. Кон струирование диагностической тест-системы на основе магносорбентов и липосом // ЖМЭИ. – 1990. - №10. – С.103-106. 32. Власов Г.С., Салов В.Ф., Торчилин В.П., Бердичевский В.Р. Липисомы и перспективы их использования в прикладной иммунологии // ЖМЭИ. – 1982. №8. – С.12-19. 33. Водолазова А.М., Никитина Л.Н. Электрофоретическая характеристика осаждения иммуноглобулинов // Биологические престадии риванолового 34.

параты и иммунологическая реактивность организма. - Томск, 1981. - С.14-15. Гавенский С. Д., Ефременко В. И., Климова И. М. и др. Применение магнитных сорбентов для концентрирования и выделения чумного микроба из объектов внешней среды (нестерильная почва) // Современ. методы диагност. ООИ и способы их применения. - Методич. пособие Саратов, 1991. - С.35-40. 35. Гавенский С.Д., Пушкарь В.Г. Жизнеспособность микроорганизмов в магнитных иммуносорбентах //Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний: Тез.докл.науч.-практ. конф. 60 лет противочумной службы Кавказа. - Ставрополь, 1995. - С. 116-118. 36. Гаврилова Е.М., Дзантиев Б.В., Егоров А.М. Иммуноферментный анализ: Тез.докл.3-го Всес.науч.симпоз. "Получение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине"-Л., 1980. - С.37-38. 37. Гайда А.В., Староверов С.М. Модифицироранные кремнезёмные в биотехнологии // Журн. Всесоюзного хим. общества носители 38.

им.Менделеева.- 1989. - Т34. № 3. - С. 356-363. Герстунбергер М.Р., Сухоруков Г.Б., Радченко И.Л. и др. Новый метод получения биополимерных микрокапсул для создания лекарственных средств // Биотехнология- состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Междун. Конгресса. - М, 2002. - С.54.

39. 40.

Гинзбург А.Л. Генодиагностика инфекционных заболеваний // Журн. Гонтарь И.П., Зборовский И.А., Александров А.В и др. Иммуномодули микробиол. - 1998. - №3. - С.86-95. рующий эффект магносорбентов в терапии реавматических заболеваний // Y Российский национальный конгресс “Человек и лекарство”: Тез. докл. – 1998. – С.35. 41. Гучетль Е.В., Пономарёва Л.П. Опыт определения противотуберкулёзных антител в краевом противотуберкулёзном диспансере Краснодара // Клиническая лабораторная диагностика. - 2002. - №9. - С.36 42. Дмитриев Г.А., Киселёва Т.А. Применение ИФА для серодиагностики сифилиса // Актуальные вопросы дерм. и венер.: Сб.тр. юбил конф., посвящ. 5летию созд.кож. и вен. болезней педиатр. фак.РГМУ - М., 1997. - С.36-37. 43. Домарадский И.В. Проблемы перекрёстного иммунитета// Проблемы туберкулёза.-1994. - №1. - С.13-17. 44. Драбкина Р. Микробиология туберкулёза.М., 1963.-255с. 45. Дюга Г., Пенни К. Биоорганическая химия. – М.,1983. - С. 348, 352. 46. Дячина М.Н., Лукин Ю.В., Зубов В.П. и др. Микротитрационный вариант реакции латекс-агглютинации в диагностике лепры // Клин.лабат.диагн. 1995. - №2. - С.24-26. 47. 48. Елистратов Г.Д., Волчанова М.И., Малыгин И.В., Гирда Т.В. Способ Елистратов Г.Д., Волчанова М.И., Малыгин И.В., Шолошов А.П., получения сорбента // БИПМ.-№ 3. –2004.- С. 629. Стрелков В.П., Гнутов В.Г., Григорьев Г.А., Гаськов Д.Г. Способ получения сорбента // БИПМ.-№ 3. –2004.- С. 629. 49. Ерохин В.В. Сотрудничество Российских фтизиаторов с международными организациями // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.2003. - №8. - С. 57. 50. Ерохин В.В., Земекова В.С., Уварова О.А., Казак Т.И., Суркова Л.К., Ариэль Б.М., Краснов С.А. Паталогоанатомическая диагностика прогресси рующих форм туберкулёза лёгких в связи с новой клинической классификацией // Проблемы туберкулёза.- 1996. - №4. - С. 32-36. 51. Ерохин Е.П. Метод пассивной агглютинации полимерных дисперсий для диагностики легионеллеза // Журн. микробиол. – 1991. - № 11.- С. 41-43. 52. Ефременко В.И. Липосомы. Монография.- Ставрополь, 1999.-236. 53. Ефременко В.И. Магнитоуправляемые иммобилизованные системы в микробиологическом мониторинге природных очагов и объектов внешней среды на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней // Журн. микробиол. – 1997. - №2. - С.102-106. 54. Ефременко В.И., Брыкалов А.В., Жарникова И.В. Новые препараты для диагностики и ветеринарно-санитарного мониторинга // Пища. Экология. Человек : Тез.докл. междун. научн.-технич. конф. - Москва, 1995. - С. 206. 55. Ефременко В.И., Климова И.М., Трофимов Е.Н.. Магнитный иммуноферментный анализ антигенов чумного микроба // Журн. микробиол. - 1989. № 7. - С.62-66. 56. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Василенко Н.Ф. и др. Разработка технологической линии производства в методах иммуноанализа микроорганизмов: Заключительный отчет о НИР, инв. № 02.9.70001181.– Ставрополь,1996. – 96 с. 57. Жарникова И. В., Брыкалов А. В., Тюменцева И. С. и др. И. Разработка твердофазной реакции иммунофлюоресценции (PИФ) на основе композиционных магноиммуносорбентов // Соврем. достиж. биотехнол.: Тез.докл. Первой конф. Северо-Кавказ. региона. - Ставрополь, 1995.- С. 87- 88 58. Жарникова И.В. Методологические подходы и разработка биотехнолопрепаратов для диагностики инфекционных керамический носитель с маггии иммунобиологических 59.

особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей Авт. док. дис…2005. Жарникова И.В. Структурированный нитным материалом для иммобилизации антител // Биотехнология.- 2004. №1.- С.71-79.

60.

Pages:     | 1 || 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.