WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 ||

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СТАВРОПОЛЬСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ На правах рукописи ДЖАНАЕВ Вячеслав Феликсович РАЗРАБОТКА ...»

-- [ Страница 2 ] --

Золь серебра получали восстановлением азотнокислого серебра боргидридом натрия. Для этого к 5 мл 0,05% водного раствора боргидрида натрия одномоментно приливали равный объем 0,02% водного раствора азотнокислого серебра. Перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин. При конструировании диагностикума использовали комплексный трепонемный антиген. Наиболее эффективно стабилизировал золь серебра антиген в количестве 375 мкг на 10 мл золя. Исходя из этого, для приготовления диагностикума к 1 мл антигена (375 мкг белка) при постоянном интенсивном перемешивании добавляли 5 мл золя серебра. После 10-минутного перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре в раствор добавляли следующую порцию золя – 3 мл, а спустя 10 мин – еще 2 мл золя и 2 мл 10 % водного раствора БСА (для блокирования свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера). Через 30 мин перемешивания диагностикум стабилизировали внесением равного объема 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 1 % БСА, 10% НЛС и 0,04% азида натрия. Приготовляемый препарат дополнительно интенсивно встряхивали в течение 30 минут, разливали в ампулы ШПВ-6 по 2 мл. Срок хранения диагностикума – 6 месяцев. Постановку реакции осуществляли традиционным для дот-иммуноанализа способом. Сыворотки крови разводили забуференным физиологическим раствором (ЗФР) рН 7,2 с 0,5% БСА в 200 раз и титровали путем двухкратного разведения до необходимой концентрации в планшете для иммунологических реакций. Каждое разведение сывороток наносили на твердофазный носитель в объеме 1 мкл в виде линейно расположенных точек. В качестве такового мы апробировали НЦМ для электрофореза «Bio-Rad», «Millipor», «Serva» и мембранные фильтры«Amicon», «Millipor», «Sinpor»и «Владипор» с различным размером пор, исходя из того, что прочность связывания ими антител и их сорбционная емкость может быть неоднозначна.

Проведенные испытания показали, что наименее пригодными оказались мембранные фильтры «Amicon», «Millipor» и «Владипор».Хорошими характеристиками обладали НЦМ и мембранные фильтры «Sinpor» (достаточная сорбционная емкость и прочность связывания наносимого материала). После нанесения исследуемого материала (1 мкл) на мембрану мы испытали несколько режимов иммобилизации: 20,30,40 мин при (20±1) 0С, 10,15,20 мин при 37 0С. Все режимы сорбции были приемлемы, для дальнейшей работы нами избран режим: 10 мин при 37 0С. Мембрану после фиксации материала помещали в чашку Петри и однократно промывали ЗФР. Затем подложку заливали ЗФР, содержащим 1 % БСА, блокируя таким образом на ней свободные участки связывания в течение 10-15 мин при комнатной температуре. После двукратного промывания ЗФР мембрану помещали на 5-10 мин в раствор диагностикума, затем тщательно (трехкратно по 2-3 мин) промывали ЗФР и однократно - дистиллированной водой. Визуализацию результатов реакции проводили погружением мембраны в раствор проявителя на 5-8 мин. Проявитель выбирали по проявляющему веществу: амидол, гидрохинон, глицин, метол, фенидон в разных сочетаниях. Всего нами было апробировано 14 составов проявителей для каталитического усиления сигнала серебряного золя. Результаты испытаний показали, что проявители, содержащие метол, развивали высокую оптическую плотность: исследуемые сыворотки крови, содержащие специфические антитела, проявлялись в виде серокоричневых пятен различной интенсивности в зависимости от количественного содержания антител. В то же время остальные проявители давали светлые, малоконтрастные отложения. В связи с этим в экспериментах мы использовали проявитель, содержащий метол. Используя сконструированный иммунодиагностикум, исследовано в ДИА с коллоидным серебром 215 проб сывороток крови больных различными формами сифилиса, 55 – обследуемых на сифилис. Контрольной группой служили сыворотки крови 70 лиц, свободных от сифилитической инфекции. Эти же сыворотки параллельно оценивались в МР. Результаты испытаний несомненно свидетельствуют о высокой чувствительности разработанного диагностикума. Так, у 157 (73%) больных обнаруживались антитрепонемные Ат в титрах 1:400, у 58 (27%) человек – 1:800, в то же время как из 215 больных, обследованных в МР, лишь у 165 (77,3 %) больных отмечен положительный результат. Из 55 больных обследуемых на сифилис у 40 (72%) титр сывороток в ДИА был равен 1:400, у 5 (9%) – 1:800, у 10 (18,2%) - отрицательный результат. Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном у 45,7% обследуемых (25 человек) была отрицательной. Специфичность иммунодиагностикума на основе коллоидного серебра подтверждена при исследовании 70 сывороток крови лиц, свободных от сифилитической инфекции. Таким образом, нами сконструирован высокочувствительный и высокоспецифичный иммунодиагностикум для ДИА с использованием комплексного трепонемного антигена, меченного частицами коллоидного серебра. Этот тест, в сравнении с традиционными серологическими реакциями на сифилис, более чувствителен, экспрессен, экономичен и свидетельствует о перспективности использования ДИА со специфическим антигеном трепонем, меченным коллоидным серебром, в качестве экспрессного ультрамикрометода лабораторной диагностики сифилиса.

ВЫВОДЫ 1. Впервые представлен многолетний анализ заболеваемости сифи лисом в Республике Северная Осетия-Алания, выявивший её высокий уровень и тенденцию к распространению в отдельных районах Республики, что диктует необходимость проведения массовых, скрининговых профилактических обследований населения с привлечением надежных экспрессных методов лабораторной диагностики. 2. Подобран эффективный комплекс последовательных манипуляций, позволивший получить высокоспецифичный комплексный трепонемный полноценный антиген, явившийся высококачественным сырьем при конструировании препаратов для иммунодиагностики сифилиса. 3. Получен трепонемный суспензионный диагностикум на основе полиакролеиновой матрицы и комплексного антигена, обеспечивающий высокую чувствительность, специфичность, демонстративность, воспроизводимость реакции агглютинации латекса. 4. Впервые отработаны методические подходы для конструирования диагностикума с применением коллоидного серебра в качестве маркера трепонемного антигена и детекции в ДИА специфических антител. ДИА пригоден для исследования на сифилис клинического материала, характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, экспрессностью, простотой выполнения, демонстративностью. 5. Лабораторные и клинические испытания разработанных суспензионных антигенных диагностикумов для РАЛ и дот- иммуноанализа показали по ряду параметров свое превосходство над традиционными серологическими реакциями и перспективность их использования в качестве скринирующих тестов на сифилис.

6.

Сочетание РАЛ и дот-иммуноанализа позволяет серологически верифицировать сифилис практически у 100 % пациентов и рекомендовать их применение в составе нового комплекса реакций на сифилис.

Pages:     | 1 ||



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.